CN103613657A

CN103613657A - 缩短肽链的Exendin4及其基因工程应用

Info

Publication number: CN103613657A
Application number: CN201310625913.8A
Authority: CN
Inventors: 孙玉琨
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-11-28
Filing date: 2013-11-28
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2033-11-28
Also published as: CN103613657B

Abstract

本发明属于多肽基因工程综合技术，涉及缩短肽链的Exendin4及其基因工程应用。本发明首次揭示了一种缩短肽链的Exendin4(1-34)变体，还应用该变体成功地进行了基因工程生产，为糖尿病患者提供一个高效、廉价的治疗糖尿病的药物。

Description

缩短肽链的Exendin4及其基因工程应用

技术领域

本发明属于多肽基因工程综合技术；更具体地，本发明涉及缩短肽链的Exendin4及其基因工程应用。

背景技术

中国是世界上糖尿病大国之一，2012年糖尿病患者9000万，其中90%为2型糖尿病，迫切需要高效、廉价的抗糖尿病药物的治疗。

英国的UKPDS对现有的6种抗糖尿病药物评价如下：没有一个能阻止胰脏β-细胞，不断进行性地凋亡，不能恢复β-细胞的功能，不能阻止糖尿病综合征的发生，心脏病，肾衰竭(Diabetes，1995，44，1249)。美国NIH的报告指出，尽管严格控制血糖，糖尿病患者心脏病死亡率仍高于非糖尿病患者2-4倍。这些结果说明，需要能阻止β细胞凋亡，增加β-细胞总量的治疗药物。

目前，一些新一代的抗糖尿病多肽已经进入中国，包括Eli-Lilly的Extendin4(39aa)，丹麦Novo Nordisk的liraglutid(31aa-C16脂肪酸衍生物)，法国Sanofi的GLP lyxumia(44aa)。这些药物代谢产物为氨基酸，随着血糖的降低至正常，停止作用，不产生低血糖休克，较为安全，减少跟踪进行血糖测定的麻烦。还能增加β-细胞总量，增加胰岛素分泌和敏感性等。但是，这些多肽药物都是化学合成品，合成过程需要经过30-44步完成，价格十分昂贵，每人每年约需花费2万元医药费。

Exendin4是一条长度为39aa的多肽。尽管Exendin4已经被研究多年，然而美国FDA在2005才正式批准其作为临床药物。从临床数据看，Exendin4比glargin，liraglutid，lyxumia，GLP-1临床效果好，Exendin4维持降血糖时间相对比GLP-1长，用药剂量比GLP-1低，注射次数比GLP-1少。

但是，Exendin4肽链比较长，具有免疫原性，终身用药对于健康极其不利。并且，Exendin4的基因工程难度比较大，基因工程量产困难。为了除去免疫原性，需要缩短肽链长度，但NIH的报告指出；Exendin4C-端9个氨基酸残基一个也不能少，都是必需的(Regulatory Peptides2003，vol.114，153-158)。上述问题给Exendin4的临床应用带来极大阻碍。

因此，本领域非常有必要进行进一步的抗糖药物的研究和改良，研发出副作用更低且更为廉价的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供缩短肽链的Exendin4及其基因工程应用。

在本发明的第一方面，提供一种缩短肽链的Exendin4变体，该Exendin4变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的另一方面，提供一种编码所述的缩短肽链的Exendin4变体的多核苷酸，该多核苷酸的SEQ ID NO:2中第16-117位所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的重组表达载体中包括12拷贝的所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种重组宿主细胞，所述的宿主细胞中包含有所述的重组表达载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸；较佳地，整合12拷贝的所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的重组宿主细胞是大肠杆菌细胞；优选地是JM103或JM109。

在本发明的另一方面，提供一种重组表达所述的缩短肽链的Exendin4变体的方法，所述的方法包括：培养所述的重组宿主细胞，从而表达所述的缩短肽链的Exendin4变体。

在一个优选例中，所述表达方法中，培养基含：蛋白胨20g/L，酵母抽提物10g/L，K₂HPO₄·3H₂O12g/L，NaH₂PO₄·3H₂O2g/L，50%甘油7ml/L；

培养条件：37℃，搅拌速度500rpm，PH6.5～7.5，通气量30L/min。发酵过程中不断取液，离心后称重，在Log phase中期加入IPTG，终浓度0.3mM，继续发酵4小时后停止发酵；4000rpm离心收集菌体；

收集的菌体在冷却条件下，利用超声波破碎菌体。离心分离包涵体，再经2M尿素洗涤一次；

之后，用20mM Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.0)将包涵体溶解；在表达获得的肽为12拷贝的情况下，还包括：按照100g湿重包涵体加1-10mg的比例加入Clostripain，30℃，保温，从而切割为单拷贝的Exendin4变体；

之后，将获得的产物进行制备型HPLC纯化。

在本发明的另一方面，提供所述的缩短肽链的Exendin4变体的用途，用于制备改善或治疗糖尿病(包括2型糖尿病)的药物。

在本发明的另一方面，提供一种用于改善或治疗糖尿病的药物，所述的药物包括：所述的缩短肽链的Exendin4变体，以及药学上可接受的载体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、序列的串联方法的示意图。

图2、对照组以及缩短肽链的Exendin4给药组c57BL/6小鼠在不同时间点的血糖维持情况。

图3、体外血浆中截短型Exendin4的稳定性研究，以GLP-1作为对照。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示了一种缩短肽链的Exendin4(1-34)变体，其从Exendin4的C端截短5个氨基酸。本发明人还应用该变体成功地进行了基因工程生产，为糖尿病患者提供一个高效、廉价的治疗糖尿病的药物。

美国NIH曾经报告指出：Exendin4C-端9个氨基酸残基一个也不能少，都是必需的(Regulatory Peptides2003，vol.114，153-158)。然而，本发明人分析了NIH的报告结论，认为该结论是在in vitro实验基础上作出的，并不能完全反映体内实际状况。在试管中利用胰岛瘤细胞，测定多肽与受体的结合能力(IC50)，cAMP合成(EC50)和胰岛素的合成，却忽略了多肽在体内的稳定性问题，因此对其结论，需要验证。本发明人建立了具有临床实际意义的in vivo评价测试方法，合成一系列不同长度的Exendin4多肽，测定其维持降血糖时间，确定缩短肽链的极限。除降血糖之外，还检查Exendin4的其它药理功能，如恢复胰岛素第一相分泌，降空腹血糖功能，提高胰岛素的敏感性等。最终确定了C端截短5个氨基酸的Exendin4在体内具有良好的降糖活性。

促胰岛素分泌肽

促胰岛素分泌肽(Exendin-4)是一种最初发现于Heloderma suspectum(Gila畸形突变体)唾液分泌物中的多肽，其与哺乳动物胰高血糖素样肽家族的一些成员相似，与GLP-1的在氨基酸序列上具有46%的同源性。天然的Exendin-4多肽具有如下所示的氨基酸序列：

HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS-NH2

如本发明所用，“缩短肽链的Exendin4变体”是指C端截短5个氨基酸的Exendin4多肽；较佳地，其20位氨基酸是K，第34位是R。

作为本发明的最优选方式，所述的缩短肽链的Exendin4变体具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，其编码基因具有SEQ ID NO:2中第16-117位所示的核苷酸序列。

本发明所述的“缩短肽链的Exendin4变体”，较佳地其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。此外，在SEQ ID NO:1基础上，部分位点上还可以进行适当的氨基酸的替换，例如，如下序列：HGEGT FTSDL SKQME EEAVK LFIEW LKNGGPSSR，其中，第14位：M或L；第27位：K或R；第34位：R或G。

缩短肽链的Exendin4变体的表达

在获得了编码本发明新重组蛋白的DNA序列之后，将其克隆入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的重组蛋白。

在本发明中，可选用本领域已知的各种原核表达载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新重组蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括大肠杆菌细胞。作为本发明的更优选的方式，本发明适用的菌株为采用大肠杆菌(E.coli)；优选地是JM103或JM109。E.coli细胞在重组表达后，细胞内包括结构蛋白、功能蛋白、外源蛋白。其中结构蛋白，功能蛋白，为了生存与繁殖，它的组成，含量不会变，只有表达的外源蛋白，有多有少，上限在30%左右，改变重组表达载体和其他因素，对提高产能影响不多，这是由E.coli细胞所决定的。

将重组质粒转化宿主细胞可以采用本领域常用的方法。在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明重组蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出重组蛋白；然后再分离出表达的重组蛋白。

为了进一步提高宿主细胞的表达量，可以对本发明的重组蛋白的编码序列进行改造，例如采用宿主细胞使用频率较多的密码子，以提高表达水平，消除不利于基因转录及翻译的序列。

在构建本发明的重组表达载体时，本发明人发现，多个完整表达单元克隆到一个质粒中，并不能显著提高产量，因为表达产物中仍然含有大量载体蛋白。因此，本发明人采用了多肽基因12拷贝串联重组表达的策略，使得表达产物中载体蛋白含量显著少。本发明人采用的这一拷贝数可使表达的蛋白产物形成稳定的包涵体，对于较大规模的发酵是有利的，能够得到最优的表达效果。在获得重组表达的产物后，应用Clostripain进行切割，使得串联的蛋白产物被切断为单拷贝目的多肽。

本发明还优化了发酵方法，最优的方法如下：

培养基含：蛋白胨20g/L，酵母抽提物10g/L，K₂HPO₄·3H₂O12g/L，NaH₂PO₄·3H₂O2g/L，50%甘油7ml/L；

之后，将获得的产物进行制备型HPLC纯化。

缩短肽链的Exendin4变体的用途及其组合物

本发明提供了所述缩短肽链的Exendin4变体的用途，其可被用于制备治疗糖尿病的组合物。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.0001-10wt%)的所述的缩短肽链的Exendin4变体，以及药学上可接受的载体。

本发明的组合物可直接用于糖尿病的治疗。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

通常，可将本发明的重组蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

本发明的组合物含有安全有效量的所述的重组蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、截短型Exendin4及其串联设计

单拷贝截短型Exendin4的氨基酸序列如下：

HGEGT FTSDL SKQME EEAVK LFIEW LKNGG PSSR(SEQ ID NO:1)

设计的编码序列如下(SEQ ID NO:2)：

GAATTC(EcoRI)AGATCT(Bgl II)CGT CAC GGT GAA GGT ACC TTCACC TCT GAT CTG TCT AAA CAG ATG GAA GAA GAA GCG GTT AAACTG TTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGT GGT CCG TCT TCT CGTGGATCC(Bam HI)TGA GTCGAC(Sal I)

序列的串联方法如下(示意图如图1)：

(a)PCR扩增获得的上述SEQ ID NO:2序列的扩增产物，以EcoRI/SalI双酶切后，插入到经过BamHI和SalI双酶切的pUC18质粒的相应位点中，得到“含有1拷贝SEQ ID NO:2序列的表达质粒”。

(b)以BglII和SalI双酶切上述SEQ ID NO:2序列的扩增产物，插入到以BamHI和SalI双酶切的“含有1拷贝SEQ ID NO:2序列的表达质粒”，得到“含有2拷贝SEQ ID NO:2序列的表达质粒”。

(c)以BglII和SalI双酶切切下“含有2拷贝SEQ ID NO:2序列的表达质粒”中的2拷贝SEQ ID NO:2序列，插入到以BamHI和SalI双酶切的“含有2拷贝SEQ ID NO:2序列的表达质粒”，得到“含有4拷贝SEQ ID NO:2序列的表达质粒”。

(d)以BglII和SalI双酶切切下“含有4拷贝SEQ ID NO:2序列的表达质粒”中的4拷贝SEQ ID NO:2序列，插入到以BamHI和SalI双酶切的“含有4拷贝SEQ ID NO:2序列的表达质粒”，得到“含有8拷贝SEQ ID NO:2序列的表达质粒”。

(e)以4拷贝SEQ ID NO:2序列再次插入到“含有8拷贝SEQ ID NO:2序列的表达质粒”的BamHI和SalI酶切位点，得到“含有12拷贝SEQ ID NO:2序列的表达质粒”，其中包括以下DNA序列(SEQ ID NO:3)：

GAATTC AGATCT CGT CAC GGT GAA GGT ACC TTC ACC TCT GAT CTGTCT AAA CAG ATG GAA GAA GAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTGAAA AAC GGT GGT CCG TCT TCT CGT GGATCT CGT CAC GGT GAA GGT ACCTTC ACC TCT GAT CTG TCT AAA CAG ATG GAA GAA GAA GCG GTT AAA CTGTTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGT GGT CCG TCT TCT CGT GGATCT CGTCAC GGT GAA GGT ACC TTC ACC TCT GAT CTG TCT AAA CAG ATG GAA GAAGAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGT GGT CCG TCTTCT CGT GGATCT CGT CAC GGT GAA GGT ACC TTC ACC TCT GAT CTG TCTAAA CAG ATG GAA GAA GAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTGAAA AAC GGT GGT CCG TCT TCT CGT GGATCT CGT CAC GGT GAA GGT ACCTTC ACC TCT GAT CTG TCT AAA CAG ATG GAA GAA GAA GCG GTT AAA CTGTTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGT GGT CCG TCT TCT CGT GGATCT CGTCAC GGT GAA GGT ACC TTC ACC TCT GAT CTG TCT AAA CAG ATG GAA GAAGAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGT GGT CCG TCTTCT CGT GGATCT CGT CAC GGT GAA GGT ACC TTC ACC TCT GAT CTG TCTAAA CAG ATG GAA GAA GAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTGAAA AAC GGT GGT CCG TCT TCT CGT GGATCT CGT CAC GGT GAA GGT ACCTTC ACC TCT GAT CTG TCT AAA CAG ATG GAA GAA GAA GCG GTT AAA CTGTTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGT GGT CCG TCT TCT CGT GGATCT CGTCAC GGT GAA GGT ACC TTC ACC TCT GAT CTG TCT AAA CAG ATG GAA GAAGAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGT GGT CCG TCTTCT CGT GGATCT CGT CAC GGT GAA GGT ACC TTC ACC TCT GAT CTG TCTAAA CAG ATG GAA GAA GAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTGAAA AAC GGT GGT CCG TCT TCT CGT GGATCT CGT CAC GGT GAA GGT ACCTTC ACC TCT GAT CTG TCT AAA CAG ATG GAA GAA GAA GCG GTT AAA CTGTTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGT GGT CCG TCT TCT CGT GGATCT CGTCAC GGT GAA GGT ACC TTC ACC TCT GAT CTG TCT AAA CAG ATG GAA GAAGAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGT GGT CCG TCTTCT CGT GGATCC TGAGTC GAC

上述串联方法中，巧妙地应用了酶切位点，其中，BglII的限制性位点是-A↓GATCT-，BamHI的限制性位点是-G↓GATCC-，序列杂交后可形成-GGATCT-。由于-GGATCT-的上下游均均是CGT(参见SEQ ID NO:3)，可以编码Arg，因此可以由Clostripain实现切割，不发生氨基酸的残留。

将上述制备的“含有12拷贝SEQ ID NO:2序列的表达质粒”在冷却条件下与CaCl₂处理的感受态大肠杆菌(E.coli)(JM109)混合，冰浴进行30分钟，移至42℃水浴中保持2分钟，冰浴中冷却，涂板，37℃。挑选转化克隆。

实施例2、发酵生产

1、发酵

应用50L发酵罐，装入发酵液30L。

10L发酵液中，含：蛋白胨200g，酵母抽提物100g，K₂HPO₄·3H₂O120g，NaH₂PO₄·3H₂O20g。120℃灭菌30分钟，冷却备用。另外，分别灭菌：20%(w/v)MgSO₄，50%(v/v)甘油。

开始发酵，将100ml的MgSO₄，200ml甘油，Ampicillin(50μg/ml)及培养过夜的种子溶液500ml，加入到发酵罐中，及适量消泡剂。

发酵条件：37℃，搅拌速度500rpm，PH6.5～7.5，通气量30L/min。发酵过程中不断取液，离心后称重，在Log phase中期加入IPTG，终浓度0.3mM，继续发酵4小时后停止发酵。4000rpm离心收集菌体。

2、细胞破碎、包涵体分离纯化

冷却条件下，利用超声波破碎菌体。离心分离包涵体，再经2M尿素洗涤一次，低温保存，备用。

3、裂解

将包涵体溶解，20mM Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.0)，按照100g湿重包涵体加1-10mg的比例加入Clostripain，30℃，保温，过程中用HPLC跟踪分析裂解是否完全。

4、HPLC纯化

经制备型HPLC/C18柱，0.1%三氟乙酸水溶液/含0.1%三氟乙酸的乙腈，连续梯度洗脱，分离。

5、冷冻干燥

HPLC溶液经过减压蒸发<50℃，除去乙腈，冷冻干燥得到产品。

6.物理化学分析

产品经过质谱分析，氨基酸序列测定，序列正确，与原始设计相符。

7.单拷贝融合表达与串联表达的比较

将单拷贝的SEQ ID NO:2序列插入到pET32(+)的多克隆位点中，获得单拷贝融合表达质粒，转化大肠杆菌，筛选获得重组细胞。采取与前述串联表达相同的发酵条件进行表达，将表达结果与串联表达的结果进行比较。结果如表1。

表1

	单拷贝融合表达(g/L)	串联表达(g/L)
			细胞湿重	20	150
细胞干重	4	30
			细胞总蛋白	2	15
目的多肽含量	0.05	3.0

实施例3、缩短肽链的Exendin4生物活性测定

1、降血糖的维持时间

取c57BL/6小鼠，分成两组，一组为对照组，一组为缩短肽链的Exendin4给药组。给药组早上空腹时(即0小时)给予缩短肽链的Exendin42μg/只。两组小鼠分别在0、2、4小时三个时间点腹部皮下注射20%(w/v)葡萄糖，每只小鼠每次注射200μl。观察小鼠体内血糖维持情况。

结果如图2。可见，给予缩短肽链的Exendin4之后，小鼠的血糖维持在8mmol/L以下，血糖可获得良好的控制。

2、对db/db小鼠的降空腹血糖的效果

7只db/db小鼠(8周龄，体重约20g)每天用缩短肽链的Exendin4皮下注射(s.c.)2次，每次5μg/只，每10天检测空腹血糖(FBG)水平。结果显示，7只小鼠中6只血糖发生了降低。结果如表2。

表2

3、体外血浆中截短型Exendin4的稳定性

抽取大鼠血浆2ml，置于试管中。将本发明制备的截短型Exendin44mg加入到上述血浆中，37℃保温，观察截短型Exendin4在血浆中的变化。不同时间取样0.2ml，加乙醇1.0ml沉淀蛋白，离心取上清液，进行HPLC分析。同时，以相同量的GLP-1加入到血浆中，观察其变化。

结果如图3。可见截短型Exendin4在血浆中可较长时间保持较高的活性，至8小时还保留40%生物活性。而GLP-1则是较为短效的。

4、对alloxan破坏胰岛的小鼠的治疗效果

取昆明小白鼠通过尾静脉注射四氧嘧啶两次。第一次剂量为80mg/kg，第二次为160mg/kg，制备alloxan破坏胰岛的小鼠。三天后测定血糖并腹部皮下给药(pi.)。对照组注射生理盐水，截短型Exendin4组(Ex组)每天注射两次，每次0.1μg，速效胰岛素(lispra)组每天两次，每次1μg。测定空腹血糖如表2说明。Ex用药15天后能使4/6诱导的糖尿病小鼠恢复正常，如表3。

表3

由表3数据可知，Exendin4对于糖尿病小鼠具有显著的治疗作用，67%的截短型Exendin4给药小鼠在用药15天后仍然能保持血糖正常。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种缩短肽链的Exendin4变体，其特征在于，该Exendin4变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种编码权利要求1所述的缩短肽链的Exendin4变体的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的SEQ ID NO:2中第16-117位所示的核苷酸序列。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体包含权利要求3所述的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，其中包括12拷贝的权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中包含有权利要求3或4所述的重组表达载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸；较佳地，整合12拷贝的权利要求2所述的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞是大肠杆菌细胞；优选地是JM103或JM109。

7.一种重组表达权利要求1所述的缩短肽链的Exendin4变体的方法，其特征在于，所述的方法包括：

培养权利要求5或6所述的重组宿主细胞，从而表达权利要求1所述的缩短肽链的Exendin4变体。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，培养基含：蛋白胨20g/L，酵母抽提物10g/L，K₂HPO₄·3H₂O12g/L，NaH₂PO₄·3H₂O2g/L，50%甘油7ml/L；

之后，用20mM Tris-HCl缓冲液将包涵体溶解；在表达获得的肽为12拷贝的情况下，还包括：按照100g湿重包涵体加1-10mg的比例加入Clostripain，30℃，保温，从而切割为单拷贝的Exendin4变体；

之后，将获得的产物进行制备型HPLC纯化。

9.权利要求1所述的缩短肽链的Exendin4变体的用途，用于制备改善或治疗糖尿病的药物。

10.一种用于改善或治疗糖尿病的药物，其特征在于，所述的药物包括：权利要求1所述的缩短肽链的Exendin4变体，以及药学上可接受的载体。