WO2011043530A1 - Ｇｌｐ-1 유사체의 융합체, 및 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Ｇｌｐ-1 유사체의 융합체, 및 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2011043530A1
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유승범
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조흥수
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(주)알테오젠
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/575—Hormones
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Definitions

  • the present invention relates to a fusion of a GLP-1 analog and a composition for preventing or treating diabetes containing the same as an active ingredient.
  • Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) is a hormone consisting of 30 amino acids, made from prohormones called proglucagon in L-cells of the intestine.
  • the proglucagon is converted into GLP-1 by the prohormone convertase 2 in the pancreas and by GLP-1 and GLP-2 by the prohormone convertases 1 and 3 in the intestine and brain (Kieffer et al. , Endocr Rev 1999, 20 , 876-913).
  • GLP-1 intracellular mechanism of action is mainly in the beta-cells of the pancreatic islets where the GLP-1 receptor is present.
  • GLP-1 which has reached beta cells in the islets, binds to the GLP-1 receptor.
  • GLP-1 receptors activated by the binding of GLP-1 activate the intracellular proteins of several different pathways, resulting in the effect of GLP-1.
  • the first pathway sensitizes the G protein to increase the activity of adenylyl cyclase.
  • concentration of cAMP (cyclic AMP) in the cell is increased, and protein kinase A (PKA) sensitized by cAMP is activated to induce phosphorylation of the CAMP resposive element binding protein (Dalle et al., J Biol Chem 2004, 279 , 20345-20355).
  • Phosphorylated CRE binding protein migrates into the nucleus to increase transcription of the gene with the CRE binding site to the promoter.
  • the insulin gene is a representative gene
  • the IRS-2 gene which is known to be involved in the proliferation of the PDX-1 gene and beta cells involved in the synthesis and differentiation of insulin, also increases the transcription. IRS-2 plays a role in promoting beta cells' compensatory proliferation, hyperactivity and survival in the beta cells (Doyle et al., Pharmacol Ther 2007, 113 , 546-593).
  • the second pathway cleaves and releases the extracellular portion of betacellulin via cSRC after binding to the receptor, thereby binding to epidermal growth factor receptor (EGFR) to activate the receptor, thereby proliferating beta cells.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • the epidermal growth factor receptor activates phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) in cells and thereby activates Akt, protein kinase B (PKB), and protein kinase C (PKC).
  • PI3K phosphatidylinositol-3-kinase
  • Akt protein kinase B
  • PKC protein kinase C
  • Phosphorylation induces translocation into the nucleus to increase transcription of genes associated with proliferation of beta cells by PDX-1.
  • GLP-1 translocates the cytoplasmic part of the notch associated with the differentiation or proliferation of cells to the nucleus, thereby increasing the transcription of genes involved in the proliferation of beta cells, thereby inhibiting cell proliferation and death. It is said to be.
  • GLP-1 has a variety of biological properties such as promoting insulin secretion in beta cells, inhibiting glucagon secretion in alpha cells, delaying gastric emptying, inhibiting food intake, inhibiting gastric emptying, inhibiting gastric or intestinal exercise, enhancing glucose use and inducing weight loss. Induce effect.
  • GLP-1 has been shown to prevent pancreatic beta cell degeneration induced by type II diabetes and non-insulin dependence diabetes mellitus (NIDDM). It is known that it can act as a recovery of insulin secretion ability.
  • NIDDM non-insulin dependence diabetes mellitus
  • GLP-1 is considered to be a very effective substance in the treatment of type 2 diabetes (Todd et al., Eur J Clin Invest 1997, 27 , 533-536; Drucker et al., J Clin Invest 2007, 117 , 24-32).
  • GLP-1 lacks its own activity, and the two cleaved naturally occurring peptides GLP-1 (7-37) OH and GLP-1 (7-36) NH 2 are rapidly removed in vivo and thus have a half-life in vivo. Has become very short and the usefulness of the therapy involving the GLP-1 peptide has been limited.
  • endogenously produced dipeptidyl peptidase-IV DPP-IV removes GLP- by removing the N-terminal histidine (7) and alanine (8) residues of GLP-1. 1 peptide is inactivated, and this is known to be the major cause for short in vivo half-life.
  • DPP-IV inhibitors eg, P93 / 01, NVP-LAF237, NVP DPP728, 815541A, 823093, MK-0431, etc.
  • GLP-1 receptor agonists or GLP -1 analogues eg, exendin, liraglutide, GLP-1 / CJC-1131, etc.
  • GLP-1 analogues eg, exendin, liraglutide, GLP-1 / CJC-1131, etc.
  • Exendin-4 is a well known GLP-1 analogue, and exendin-4 is a substance found in saliva of the American Gila monster that has ⁇ 53% sequence homology with GLP-1. Having glycine (Gly) than alanine (Ala) interferes with the degradation of DPP-IV, resulting in resistance, and has a longer half-life. Enhance. The half-life of exendin-4 in humans is approximately 30 minutes after intravenous administration and approximately 2-3 hours after subcutaneous administration (Eng et al., J Biol Chem 1992, 267 , 7402-7405; Parkes et al., Drug Dev). Res , 2001, 53 , 260-267).
  • GLP-1 analogs or DPP-IV inhibitors As mentioned above, previously focused on the development of GLP-1 analogs or DPP-IV inhibitors as a way to extend the half-life of GLP-1. Specifically, many studies have been reported on DPP-IV resistant GLP-1 analogues with chemical modifications or amino acid substitutions, the latter being mainly in the N-terminal region of GLP-1 containing alanine (Ala) at position 2 Substitution of amino acids avoids proteolytic degradation by DPP-IV. In addition, methods have been attempted to attach macromolecules, such as albumin or immunoglobulin heavy chains (IgG-Fc), commonly found in serum, to GLP-1.
  • macromolecules such as albumin or immunoglobulin heavy chains (IgG-Fc), commonly found in serum
  • albumin fusion to GLP-1 has been shown to activate GLP-1 receptor-dependent signaling along with decreased blood glucose levels in baby hamster kidney cells (Baggio et al., Diabetes 2004, 53, 2492). -2500), a fusion protein (GLP-1 / IgG-Fc) fused mouse IgG-Fc to human GLP-1 expressed in COS-7 cells is protected from rapid degradation by human DPP-IV in vivo, It has been shown to increase the half-life of GLP-1 in serum (Kumar et al., Gene Therapy. 2007, 14, 162-172).
  • ligaslutide a GLP-1 analogue that attaches fatty acid chains to specific positions of GLP-1 and increases its retention time by reacting with albumin in the body (Agers ⁇ et al., Diabetologia , 2002, 45 , 195). -202) has been commercialized with FDA approval as a once daily injection formulation.
  • GLP-1 attachment of macromolecules, such as immunoglobulin heavy chains (IgG-Fc) or fatty acids to GLP-1, increases the half-life of GLP-1 to some degree but cannot completely inhibit the degradation of DPP-IV.
  • the GLP-1 fusion material in which two N-terminal amino acids are cleaved by DPP-IV may be present as foreign substances in the body and may exhibit undesirable physical properties.
  • the inventors of the present invention have studied the fusion of GLP-1 analogs with resistance to DPP-IV and excellent biological stability, while the N-terminus of GLP-1 is expanded by alanine (Ala) or glycine (Gly).
  • a fusion of a GLP-1 analogue was prepared by fusion of a -1 analogue with a molecule that increases half-life in the body, and the fusion of the GLP-1 analogue interferes with the degradation of DPP-IV and thus has resistance to DPP-IV, and blood glucose It confirmed that the reduction effect was excellent, and completed this invention.
  • the present invention seeks to provide a fusion of a GLP-1 analogue wherein the N-terminus of GLP-1 fuses a GLP-1 analogue expanded by alanine (Ala) or glycine (Gly) with a molecule that increases half-life in the body.
  • alanine Al
  • Gly glycine
  • the present invention is to provide a composition for the prevention or treatment of diabetes mellitus containing the fusion of GLP-1 analogs as an active ingredient.
  • the present invention is intended to provide a method by which alanine (Ala) or glycine (Gly) is expanded at the N-terminus of GLP-1 so that the blood sugar drop of the fusion is further increased when fused with a molecule that increases the half-life in the body. do.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of analyzing the GLP-1 analogue / IgG-Fc fusion of the present invention by SDS-PAGE.
  • FIG. 2 is a diagram showing the change in fluorescence using a fluorescence spectrophotometer to determine whether the N-terminus expansion of GLP-1 by alanine or glycine (Gly) interferes with the degradation of DPP-IV [(A) AMC alone, (B) HA-AMC, (C) AHA-AMC, (D) GHA-AMC].
  • Figure 3 is a diagram showing the hypoglycemic effect in mice administered the GLP-1 analog / IgG-Fc fusion of the present invention.
  • the present invention provides a fusion of a GLP-1 analogue wherein the N-terminus of GLP-1 fuses a GLP-1 analogue extended by alanine (Ala) or glycine (Gly) and a molecule that increases half-life in the body.
  • alanine Al
  • Gly glycine
  • the present invention also provides a composition for the prevention or treatment of diabetes mellitus containing the fusion of GLP-1 analogs as an active ingredient.
  • the present invention provides a method by which alanine (Ala) or glycine (Gly) is expanded at the N-terminus of GLP-1 to further increase the blood sugar drop of the fusion when it is fused with a molecule that increases the half-life in the body. .
  • the fusion of the GLP-1 analogue according to the present invention is characterized in that the N-terminus of GLP-1 fuses a GLP-1 analogue extended by alanine (Ala) or glycine (Gly) with a molecule that increases the half-life in the body. .
  • the molecule that increases the half-life in the body includes, but is not limited to, one selected from the group consisting of immunoglobulin heavy chain (IgG-Fc), immunoglobulin (IgG), albumin, transferrin and polyethylene glycol.
  • immunoglobulin heavy chain IgG-Fc
  • immunoglobulin IgG
  • albumin IgG
  • transferrin polyethylene glycol
  • Fusions of GLP-1 analogs according to the present invention may be represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the fusion of the GLP-1 analogue according to the present invention is extended by alanine (Ala) or glycine (Gly) at the N-terminus of GLP-1, thereby interfering with the degradation of DPP-IV and having resistance to DPP-IV. , Blood sugar lowering effect is excellent.
  • the fusions of GLP-1 analogs according to the invention can be usefully used for the prevention or treatment of diabetes, in particular type 2 diabetes.
  • composition of the present invention may contain at least one known active ingredient having a prophylactic or therapeutic effect of diabetes together with a fusion of a GLP-1 analog.
  • composition of the present invention may be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or more of these components, if necessary.
  • other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage is based on the weight, age, sex and health of the patient. The range varies depending on the diet, the time of administration, the method of administration, the rate of excretion and the severity of the disease.
  • the daily dose of the fusion of the GLP-1 analog is about 100-100,000 ⁇ g, preferably about 200-50,000 ⁇ g, and more preferably administered once or several times a day.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, hormonal therapy, drug therapy and biological response modifiers for the prevention or treatment of diabetes.
  • AGLP-1 was synthesized by Fmoc solid phase peptide synthesis (SPPS) using ASP48S (Peptron, South Korea), and purified by reversed phase HPLC using Vydac Everest C18 column (250 mm ⁇ 22 mm, 10 ⁇ m). At this time, the peptide was eluted with acetonitrile linear gradient containing 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid, the molecular weight of the purified peptide was confirmed by LC / MS (Agilent HP1100 series).
  • GGLP-1 was prepared by the same method as described above.
  • Human IgG-Fc sequences encoding 234 amino acids were amplified by PCR from the pOPGFc plasmid with the following primers; Forward primer 5'- GGATCC gctagc GAGCCCAAATC -3 '(BamHI site underlined, sites NheI linker sequence, and the N- terminal portion of the IgG-Fc in boldface type in lower case) and the reverse primer 5'- GCGGCCGC TCATTTACCCGGAGA -3' (NotI site underline, and C-terminal portion of bold type IgG-Fc). PCR products were arrayed and subcloned into the BamHI and NotI sites of the pSGHV0 vector generating constructs of pSGHV0-Fc.
  • GLP-1 with alanine at the N-terminus was subjected to forward primer 5'- CTCGAG ACCATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTTTTGGTAGCAACAGCTACAGATGTCCACTCCgct CATGCTGAAGGGACCTTT- 3 ' Part).
  • PCR products digested with XhoI and NheI were subcloned with the pSGHV0-Fc vector. The accuracy of the fusions in the expression vectors was confirmed by DNA sequencing.
  • AGLP-1 / IgG-Fc fusion prepared in 1 was confirmed using Chinese hamster ovary cells (CHO K1). CHO K1 cells were incubated in 10% FBS (Fetal Bovine Serum), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) with antibiotics at 5% CO 2 , 37 ° C. under humid conditions. One day before introduction of the AGLP-1 / IgG-Fc fusion, cells were inoculated at a concentration of 1 ⁇ 10 6 in a 100 mm culture dish.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media
  • IMDM IMDMve's modified dulbecco's medium
  • AGLP-1 / IgG-Fc fusion was purified using AKTA Prime FPLC (GE Healthcare). Specifically, was equilibrated with 5ml Protein A-Ceramic HyperD ® ( Pall corporation, USA) column PBS (10mM sodium phosphate, 0.15M NaCl , pH 7.2). After loading the sample, the column was washed thoroughly with equilibration buffer and eluted with 0.1M glycine pH 2.8 buffer, neutralized with 1M Tris pH 8.0 solution. Purified AGLP-1 / IgG-Fc fusions were dialyzed with PBS and concentrated with Vivaspin 6 (GE Healthcare, USA).
  • Human IgG-Fc sequences encoding 234 amino acids were amplified by PCR from the pOPGFc plasmid with the following primers; Forward primer 5'- GGATCC gctagc GAGCCCAAATC -3 '(BamHI site underlined, sites NheI linker sequence, and the N- terminal portion of the IgG-Fc in boldface type in lower case) and the reverse primer 5'- GCGGCCGC TCATTTACCCGGAGA -3' (NotI site underline, and C-terminal portion of bold type IgG-Fc). PCR products were arrayed and subcloned into the BamHI and NotI sites of the pSGHV0 vector generating the constructs of pSGHV0-Fc.
  • GLP-1 having glycine at the N-terminus was converted to forward primer 5'- CTCGAG ACCATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTTTTTTGGTAGCAACAGCTACAGATGTCCACTCCgga CATGCTGAAGGGACCTTT- 3 ' Part).
  • PCR products digested with XhoI and NheI were subcloned with the pSGHV0-Fc vector. The accuracy of the fusions in the expression vectors was confirmed by DNA sequencing.
  • GGLP-1 / IgG-Fc fusion was purified using AKTA Prime FPLC (GE Healthcare) in the same manner as in Example 3 above.
  • the purified AGLP-1 / IgG-Fc fusion and GGLP-1 / IgG-Fc fusion were analyzed by SDS-PAGE.
  • the AGLP-1 / IgG-Fc fusion and GGLP-1 / IgG-Fc fusion of the present invention were confirmed to have a molecular weight of about 33 kDa.
  • Human IgG-Fc sequences encoding 234 amino acids were amplified by PCR from the pOPGFc plasmid with the following primers; Forward primer 5'- GGATCC gctagc GAGCCCAAATC -3 '(BamHI site underlined, sites NheI linker sequence, and the N- terminal portion of the IgG-Fc in boldface type in lower case) and the reverse primer 5'- GCGGCCGC TCATTTACCCGGAGA -3' (NotI site underline, and C-terminal portion of bold type IgG-Fc). PCR products were arrayed and subcloned into the BamHI and NotI sites of the pSGHV0 vector generating constructs of pSGHV0-Fc.
  • human GLP-1 To express human GLP-1 extracellularly, it was amplified by PCR from human glucagon cDNA (OriGene Technologies, Inc., USA) with the following primers comprising the signal sequence of IgG; Forward primer 5'- CTCGAG ACCATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTTTTGGTAGCAACAGCTACAGATGTCCACTCC CATGCTGAAGGGACCTTT -3 '(XhoI site underlined, IgG signal sequence, and the N- terminal portion of GLP-1 in boldface type), and the reverse primer 5'-GAAATCTC GCTAGC TCCTCGGCC -3' ( NheI site underlined, and the C-terminal portion of GLP-1 in bold type.
  • PCR products digested with XhoI and NheI were subcloned with the pSGHV0-Fc vector. The accuracy of the fusions in the expression vectors was confirmed by DNA sequencing.
  • the GLP-1 / IgG-Fc fusion was purified using AKTA Prime FPLC (GE Healthcare) in the same manner as in Example 3 above.
  • AMC had maximum emission at 440 nm and maximum excitation at 350 nm. Fluorescence emission of HA-AMC was blue-shifted compared to AMC alone. However, fluorescence emission from His-Ala-AMC was restored to the normal spectrum of AMC when HA-AMC was incubated with DPP-IV for 1 hour at 37 ° C. This suggests that the peptide bond between His-Ala and AMC was broken. In addition, when AHA-AMC and GHA-AMC were incubated with DPP-IV, it was confirmed that the AHA-AMC and GHA-AMC had no effect on the fluorescence emission. This indicates that peptide bonds between Ala-His-Ala (AHA) and AMC or Gly-His-Ala (GHA) and AMC interfere with DPP-IV degradation.
  • AHA Ala-His-Ala
  • GHA Gly-His-Ala
  • the GLP-1 analogue according to the present invention has a resistance to DPP-IV by interfering with the degradation of DPP-IV.
  • N-terminal amino acid sequence analysis of the GLP-1 analog before and after DPP-IV treatment was performed with a protein sequencer (Applied Biosystems Inc., USA). Specifically, AGLP-1 prepared in Preparation Example 1 was reacted with human DPP-IV (Sigma, USA) at 37 ° C. for 4 hours, and then loaded into a Prosorb ® sample preparation cartridge (Applied Biosystems, Inc., USA). The protein sequencer (Procise491, Applied Biosystems, Inc., USA) was placed in the N-terminal amino acid sequence analysis of the GLP-1 analog. As a comparative group, GLP-1 was purchased from Sigma (USA).
  • GLP-1 degraded two N-terminal amino acids by DPP-IV action, while AGLP-1 did not change the N-terminal amino acid sequence before and after DPP-IV treatment.
  • the GLP-1 analog of the present invention has a resistance to DPP-IV by interfering with the degradation of DPP-IV.
  • the AGLP-1 / IgG-Fc fusions and GGLP-1 / IgG-Fc fusions prepared in Examples 1 and 2 were In the same manner as in method 1, N-terminal amino acid sequence analysis of the GLP-1 analog / IgG-Fc fusion before and after DPP-IV treatment was performed.
  • the GLP-1 / IgG-Fc fusion prepared in Comparative Example 1 was used.
  • the GLP-1 / IgG-Fc fusion was degraded by N-terminal two amino acids by DPP-IV action, while the AGLP-1 / IgG-Fc fusion and GGLP-1 / IgG-Fc fusion were There was no change in the N-terminal amino acid sequence before and after DPP-IV treatment.
  • the fusions of the GLP-1 analogs of the present invention have resistance to DPP-IV by interfering with the degradation of DPP-IV.
  • db / db mice Five 10-week-old db / db mice were prepared as experimental animals and fasted 15 hours before the start of the experiment.
  • the AGLP-1 / IgG-Fc fusion prepared in Example 1 was administered once intraperitoneally of db / db mice at a dose of 100 nmol / kg.
  • PBS phosphate buffer solution
  • glucose was intraperitoneally administered at a dose of 1.5 g / kg, and the blood glucose meter was measured at 0, 10, 20, 30, 60, 90 and 120 minutes. ), Blood glucose was measured.
  • mice administered with a fusion of the GLP-1 analog of the present invention is shown in FIG. 3.
  • the GLP-1 / IgG-Fc fusion administration group and the AGLP-1 / IgG-Fc fusion administration group showed a hypoglycemic effect, and in particular, the hypoglycemic effect of the AGLP-1 / IgG-Fc fusion was GLP. It was found to be larger than the -1 / IgG-Fc fusion.
  • the fusion of the GLP-1 analogue according to the present invention is extended by alanine (Ala) or glycine (Gly) at the N-terminus of GLP-1, thereby interfering with the degradation of DPP-IV and having resistance to DPP-IV. , Blood sugar lowering effect is excellent.
  • the fusions of GLP-1 analogs according to the invention can be usefully used for the prevention or treatment of diabetes, in particular type 2 diabetes.

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Abstract

본 발명은 GLP-1 유사체의 융합체, 및 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 GLP-1 유사체의 융합체는 GLP-1의 N-말단이 알라닌(Ala) 또는 글리신(Gly)에 의해 확장됨으로써, DPP-Ⅳ의 분해작용을 방해하여 DPP-IV에 대한 저항성을 가지며, 혈당 강하 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 GLP-1 유사체의 융합체는 당뇨병, 특히 제 2형 당뇨병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＧＬＰ-1 유사체의 융합체, 및 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 GLP-1 유사체의 융합체, 및 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1; GLP-1)은 30개의 아미노산으로 구성된 호르몬으로, 장의 L-세포에서 프로글루카곤(proglucagon)이라는 전구호르몬으로부터 만들어진다. 이 프로글루카곤은 췌장에서는 전구호르몬 전환효소 2(prohormone convertase 2)에 의해 글루카곤으로 되고, 장과 뇌에서는 전구호르몬 전환효소 1 및 3에 의해 GLP-1, GLP-2 등으로 변환된다(Kieffer et al., Endocr Rev 1999, 20, 876-913).
GLP-1의 세포 내 작용기전에 대한 연구는 주로 GLP-1 수용체가 존재하는 췌도의 베타세포에서 이루어진다. 췌도의 베타세포에 도달한 GLP-1은 GLP-1 수용체에 결합한다. GLP-1의 결합에 의해 활성화된 GLP-1 수용체는 몇 가지 다른 경로의 세포 내 단백질을 활성화시켜 GLP-1의 효과를 나타내게 된다.
첫 번째 경로는 G 단백질을 감작시켜 아데닐일시클라제(adenylyl cyclase)의 활성도를 증가시킨다. 이에 의해 세포 내 cAMP(cyclic AMP)의 농도가 증가되고, cAMP에 의해 감작되는 단백질키나제 A(PKA)가 활성화되어 CRE 결합단백질(cAMP resposive element binding protein)의 인산화를 유도한다(Dalle et al., J Biol Chem 2004, 279, 20345-20355). 인산화된 CRE 결합단백질은 핵내로 이동하여 프로모터에 CRE의 결합위치를 가진 유전자의 전사를 증가시킨다. GLP-1의 처치에 의해 전사가 증가되는 유전자 중 대표적인 것이 인슐린 유전자이며, 인슐린의 합성과 분화에 관련된 PDX-1 유전자와 베타세포의 증식과 관련이 있다고 알려진 IRS-2 유전자도 전사가 증가된다. IRS-2는 베타세포에서 외부 환경에 대한 베타세포의 보상적 증식과 기능항진 및 생존을 증진시키는 역할을 한다(Doyle et al., Pharmacol Ther 2007, 113, 546-593).
두 번째 경로는 수용체에 결합 후 cSRC를 통해 베타셀룰린(betacellulin)의 세포외 부분을 분할 및 유리시키며, 이에 의해 표피성장인자수용체(EGFR)와 결합하여 수용체를 활성화시키고, 이를 통해 베타세포의 증식을 유도하게 된다. 즉, 표피성장인자수용체는 세포 내의 포스파티딜이노시톨-3-키나제(PI3K)를 활성화시키고 이에 의해 Akt나 단백질키나제 B(PKB), 단백질키나제 C(PKC)를 활성화하는 경로를 통해 세포질 내의 PDX-1 단백질을 인산화시켜 핵 내로의 전위를 유도해 PDX-1에 의해 베타세포의 증식과 연관된 유전자의 전사를 증가시킨다.
상기 경로 외에도 최근 연구결과에 따르면, GLP-1이 세포의 분화나 증식과 관련된 notch의 세포질 내 부분을 핵으로 전위시켜 베타 세포의 증식과 관련된 유전자의 전사를 증가시켜 세포의 증식과 사멸억제에 관련된다고 한다.
GLP-1은 베타세포에서의 인슐린 분비 촉진, 알파세포에서의 글루카곤 분비 억제, 위배출 지연, 음식물 섭취 억제, 위공복 억제, 위 운동 또는 장 운동 억제, 글루코오스 사용 증진 및 체중 감량 유도와 같은 다양한 생물학적 효과를 유도한다. 또한, GLP-1은 제 2형 당뇨병인 인슐린 비의존성 진성 당뇨병(type Ⅱ diabetes, non-insulin dependence diabetes mellitus, NIDDM)이 진행됨에 따라 유발되는 췌장 베타세포 퇴화의 예방 및 신생 베타세포의 생성 촉진에 의한 인슐린 분비능의 회복 등의 작용을 할 수 있는 것으로 알려져 있다. 특히, GLP-1은 식후 혈당을 떨어뜨리는데 효과적이며, 혈당이 정상이거나 낮을 경우에는 인슐린이나 글루카곤에 거의 영향이 없어 저혈당증 관련 위험을 수반하지 않는다. 뿐만 아니라, 혈당 강하제인 술폰요소제(sulfonylurea) 등의 장기 복용에 따른 췌장 내 베타세포의 사멸 및 괴사 등의 부작용을 수반하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서, GLP-1은 제 2형 당뇨병의 치료에 있어서 매우 유효한 물질로 생각된다(Todd et al., Eur J Clin Invest 1997, 27, 533-536 ; Drucker et al., J Clin Invest 2007, 117, 24-32).
그러나 GLP-1은 자체 활성이 불충분하고, 2가지의 절단된 자연 발생 펩티드인 GLP-1(7-37)OH 및 GLP-1(7-36)NH2가 생체 내에서 빠르게 제거되어 생체 내 반감기가 매우 짧아지므로 GLP-1 펩티드가 관여하는 요법의 유용성이 제한되어 왔다. 특히, 내생적으로 생성된 디펩티딜 펩티다제-Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ; DPP-Ⅳ)는 GLP-1의 N-말단 히스티딘(7번) 잔기와 알라닌(8번) 잔기를 제거함으로써 GLP-1 펩티드를 불활성화시키며, 이것이 짧은 생체 내 반감기에 대한 주요 원인인 것으로 알려져 있다. 즉, DPP-Ⅳ에 의한 분해로부터 생긴 GLP-1의 짧은 반감기(t1/2 < 2분)는 인슐린-저항성 제 2형 당뇨병의 치료를 위한 GLP-1의 적용을 방해한다(Deacon et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1995, 80, 952-957).
따라서, DPP-Ⅳ 저해제(예를 들어, P93/01, NVP-LAF237, NVP DPP728, 815541A, 823093, MK-0431 등)를 사용하여 GLP-1의 분해를 억제하거나 GLP-1 수용체 작용물질 또는 GLP-1 유사체(예를 들어, 엑센딘, 리라글루타이드, GLP-1/CJC-1131 등)를 이용하여 생물학적 활성을 유지하면서 GLP-1 펩티드의 소실 반감기를 연장시키거나 신체로부터 펩티드 제거율을 감소시키기 위한 다양한 접근법이 시도되어 왔다(Drucker et al., Lancet, 2006, 368, 1696-1705; Green et al., J Endocrinol 2004, 180, 379-388; Hinke et al., J Biol Chem 2004, 279, 3998-4006).
GLP-1 유사체로는 엑센딘-4가 잘 알려져 있으며, 엑센딘-4는 GLP-1과 ~53% 서열 상동성을 갖는 아메리카 독도마뱀(Gila monster)의 침에서 발견된 물질로, 2번 위치에 알라닌(Ala)보다 글리신(Gly)을 가짐으로써 DPP-Ⅳ의 분해작용을 방해하여 저항성을 가지게 되고 보다 긴 반감기를 갖게 되어 췌장 베타세포의 GLP-1 수용체에 결합하여 글루코오스에 의한 인슐린 분비효과를 증강시킨다. 인간에서 엑센딘-4의 반감기는 정맥투여 후 대략 30분이며, 피하투여 후 대략 2~3시간이다(Eng et al., J Biol Chem 1992, 267, 7402-7405; Parkes et al., Drug Dev Res, 2001, 53, 260-267).
상기한 바와 같이, 종전에는 GLP-1의 반감기를 연장시키기 위한 방법으로 GLP-1 유사체 또는 DPP-Ⅳ 저해제의 개발에 촛점을 맞추었다. 구체적으로는, 화학적 변형 또는 아미노산 치환을 갖는 DPP-Ⅳ 저항 GLP-1 유사체에 관하여 많은 연구가 보고되었으며, 후자는 주로 2번 위치에 알라닌(Ala)을 포함하는 GLP-1의 N-말단 영역에서 아미노산의 치환에 의하여 DPP-Ⅳ에 의한 단백질 가수분해 퇴화 (proteolytic degradation)를 피한다. 또한, 혈청에서 일반적으로 발견되는 알부민 또는 면역글로불린 중쇄(IgG-Fc)와 같은 거대분자를 GLP-1에 부착하는 방법이 시도되었다. 예를 들어, GLP-1에 알부민 융합은 BHK 세포(baby hamster kidney cells)에서 혈당치 감소와 더불어 GLP-1 수용체-의존성 신호전달을 활성화시키는 것으로 나타났고(Baggio et al., Diabetes 2004, 53, 2492-2500), COS-7 세포에서 발현된 인간 GLP-1에 마우스 IgG-Fc를 융합한 융합 단백질(GLP-1/IgG-Fc)은 생체 내에서 인간 DPP-Ⅳ에 의한 빠른 분해로부터 보호되고, 혈청 내 GLP-1의 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다(Kumar et al., Gene Therapy. 2007, 14, 162-172).
최근에는, GLP-1의 특정 위치에 지방산 사슬을 부착하여 이 물질이 체내에서 알부민과 반응함으로써 체내 유지 시간을 늘린 GLP-1 유사체인 리라글루타이드 (Agersφ et al., Diabetologia, 2002, 45, 195-202)가 1일 1회 주사 제형으로 FDA의 허가를 받아 상용화되기도 하였다.
그러나, GLP-1에 면역글로불린 중쇄(IgG-Fc) 또는 지방산과 같은 거대분자를 부착시킬 경우 GLP-1의 체내 반감기는 어느 정도 증가되지만 DPP-Ⅳ에 대한 분해작용을 완전히 저해할 수 없다. 또한, DPP-Ⅳ에 의하여 N-말단의 아미노산 2개가 절단된 GLP-1 융합 물질은 오히려 체내에서 이물질로 존재하며 바람직하지 않은 물성을 나타낼 수 있다.
따라서, DPP-Ⅳ에 대한 분해작용을 방해하여 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 가지면서 약물의 체내 반감기를 증가시켜 생물학적 안정성이 우수한 GLP-1 유사체의 융합체의 개발의 필요성이 요구되고 있다.
본 발명자들은 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 가지면서 생물학적 안정성이 우수한 GLP-1 유사체의 융합체에 대해 연구하던 중, GLP-1의 N-말단이 알라닌(Ala) 또는 글리신(Gly)에 의해 확장된 GLP-1 유사체와 체내 반감기를 증가시키는 분자를 융합시킨 GLP-1 유사체의 융합체를 제조하였으며, 상기 GLP-1 유사체의 융합체가 DPP-Ⅳ의 분해작용을 방해하여 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 가지며, 혈당 감소 효과를 우수하게 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 GLP-1의 N-말단이 알라닌(Ala) 또는 글리신(Gly)에 의해 확장된 GLP-1 유사체와 체내 반감기를 증가시키는 분자를 융합시킨 GLP-1 유사체의 융합체를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 GLP-1 유사체의 융합체를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 GLP-1의 N-말단에 알라닌(Ala) 또는 글리신(Gly)을 확장시킴으로써, 이를 체내 반감기를 증가시키는 분자와 융합시켰을 때 그 융합체의 혈당 강하가 더욱 증가되는 방법을 제공하고자 한다.
도 1은 본 발명의 GLP-1 유사체/IgG-Fc 융합체를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 알라닌(Ala) 또는 글리신(Gly)에 의한 GLP-1의 N-말단의 확장이 DPP-Ⅳ의 분해 작용을 방해하는지를 형광분광광도계를 이용하여 형광 변화를 측정한 도이다[(A) AMC 단독, (B) HA-AMC, (C) AHA-AMC, (D) GHA-AMC].
도 3은 본 발명의 GLP-1 유사체/IgG-Fc 융합체를 투여한 마우스에서의 혈당 강하 효과를 나타낸 도이다.
본 발명은 GLP-1의 N-말단이 알라닌(Ala) 또는 글리신(Gly)에 의해 확장된 GLP-1 유사체와 체내 반감기를 증가시키는 분자를 융합시킨 GLP-1 유사체의 융합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 GLP-1 유사체의 융합체를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 GLP-1의 N-말단에 알라닌(Ala) 또는 글리신(Gly)을 확장시킴으로써, 이를 체내 반감기를 증가시키는 분자와 융합시켰을 때 그 융합체의 혈당 강하가 더욱 증가되는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 GLP-1 유사체의 융합체는 GLP-1의 N-말단이 알라닌(Ala) 또는 글리신(Gly)에 의해 확장된 GLP-1 유사체와 체내 반감기를 증가시키는 분자를 융합시킨 것을 특징으로 한다.
상기 체내 반감기를 증가시키는 분자는 면역글로불린 중쇄(IgG-Fc), 면역글로불린(IgG), 알부민, 트랜스페린 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 GLP-1 유사체의 융합체는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시될 수 있다.
본 발명에 따른 GLP-1 유사체의 융합체는 GLP-1의 N-말단이 알라닌(Ala) 또는 글리신(Gly)에 의해 확장됨으로써, DPP-Ⅳ의 분해작용을 방해하여 DPP-IV에 대한 저항성을 가지며, 혈당 강하 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 GLP-1 유사체의 융합체는 당뇨병, 특히 제 2형 당뇨병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 GLP-1 유사체의 융합체와 함께 당뇨병의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 GLP-1 유사체의 융합체의 일일 투여량은 약 100~100,000㎍, 바람직하게는 약 200~50,000㎍이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물은 당뇨병의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제조예 1 : GLP-1 유사체의 제조
1. 알라닌(Ala)이 N-말단에 확장된 GLP-1 유사체의 제조(AGLP-1)
AGLP-1은 ASP48S(펩트론, 대한민국)를 사용하여 Fmoc SPPS(solid phase peptide synthesis)에 의해 합성하였고, Vydac Everest C18 column(250㎜×22㎜, 10㎛)을 사용하여 역상 HPLC로 정제하였다. 이때, 펩티드는 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토니트릴 선형 구배(linear gradient)로 용출시켰고, 정제된 펩티드의 분자량은 LC/MS(Agilent HP1100 series)로 확인하였다.
2. 글리신(Gly)이 N-말단에 확장된 GLP-1 유사체의 제조(GGLP-1)
GGLP-1은 상기 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
실시예 1 : AGLP-1/IgG-Fc 융합체(서열번호 2)의 제조
1. AGLP-1/IgG-Fc 융합 플라스미드의 제작
234 아미노산을 암호화하는 인간 IgG-Fc 서열을 하기 프라이머와 함께 pOPGFc 플라스미드로부터 PCR로 증폭하였다; 정방향 프라이머는 5'-GGATCCgctagcGAGCCCAAATC-3'(BamHI 사이트 밑줄, 소문자의 NheI 사이트 링커 서열, 및 굵은 활자 타입의 IgG-Fc의 N-말단 부분) 및 역방향 프라이머는 5'-GCGGCCGC TCATTTACCCGGAGA-3'(NotI 사이트 밑줄, 및 굵은 활자 타입의 IgG-Fc의 C-말단 부분). PCR 산물을 배열하고 pSGHV0-Fc의 구조물을 생성하는 pSGHV0 벡터의 BamHI 및 NotI 사이트로 서브클론하였다.
N-말단에 알라닌(Ala)을 갖는 GLP-1을 정방향 프라이머 5'-CTCGAGACCATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTTTTGGTAGCAACAGCTACAGATGTCCACTCCgctCATGCTGAAGGGACCTTT-3'(XhoI 사이트 밑줄, IgG 시그널 서열, Ala 사이트 소문자, 및 굵은 활자 타입의 GLP-1의 N-말단 부분)로 증폭하였다.
XhoI와 NheI로 증해된 PCR 산물을 pSGHV0-Fc 벡터로 서브클론하였다. 발현벡터 내 융합체의 정확도를 DNA 서열분석으로 확인하였다.
2. AGLP-1/IgG-Fc 융합체의 발현
차이니즈 햄스터 난소세포(CHO K1)를 이용하여 상기 1에서 제조한 AGLP-1/IgG-Fc 융합체의 발현을 확인하였다. CHO K1 세포를 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 항생제를 포함한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)에서 5% CO2, 37℃에서 습한 조건 하에 배양하였다. AGLP-1/IgG-Fc 융합체를 도입하기 하루 전, 100㎜ 배양접시에 세포를 1x106 농도로 접종하여 배양하였다. FBS와 항생제가 없는 800㎕의 DMEM과 5㎍의 AGLP-1/IgG-Fc 융합체를 혼합하여 상온에서 1분동안 유지한 후, 20㎍의 PEI(Polyethylenimine, Linear, Polysciences Inc(Cat. No:23966, MW~25,000))와 혼합하여 10~15분 정도 상온에서 방치하였다. 하루 전 배양했던 세포를 PBS로 씻어내고 새로운 배양액 6㎖의 DMEM을 첨가한 후, 10~15분 동안 상온에서 방치한 AGLP-1/IgG-Fc 융합체를 이 배양접시에 첨가하여 형질전환시켰다. 형질 전환 후 12~16시간에 PBS로 씻어내고 배양배지를 혈청이 없는 IMDM(Iscove's modified dulbecco's medium) 배지로 교환하였다. 3일 마다 배양배지를 모으고, 10분 동안 6000xg에서 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 3일 및 6일의 순화 배지(conditioned medium)를 단백질 정제를 위해 모았다.
3. AGLP-1/IgG-Fc 융합체의 정제
AKTA Prime FPLC(GE Healthcare)를 이용하여 AGLP-1/IgG-Fc 융합체를 정제하였다. 구체적으로는, 5㎖ Protein A-Ceramic HyperD®(Pall corporation, 미국) 컬럼을 PBS(10mM sodium phosphate, 0.15M NaCl, pH 7.2)로 평형을 유지하였다. 시료를 로딩한 후, 컬럼을 평형 완충액으로 충분히 세척하고 0.1M 글리신(pH 2.8) 완충용액으로 용출시켰고, 이때 1M Tris(pH 8.0) 용액으로 중화시켰다. 정제된 AGLP-1/IgG-Fc 융합체는 PBS로 투석하였고, Vivaspin 6(GE Healthcare, 미국)로 농축하였다.
실시예 2 : GGLP-1/IgG-Fc 융합체(서열번호 3)의 제조
1. GGLP-1/IgG-Fc 융합 플라스미드의 제작
234 아미노산을 암호화하는 인간 IgG-Fc 서열을 하기 프라이머와 함께 pOPGFc 플라스미드로부터 PCR로 증폭하였다; 정방향 프라이머는 5'-GGATCCgctagcGAGCCCAAATC-3'(BamHI 사이트 밑줄, 소문자의 NheI 사이트 링커 서열, 및 굵은 활자 타입의 IgG-Fc의 N-말단 부분) 및 역방향 프라이머는 5'-GCGGCCGC TCATTTACCCGGAGA-3'(NotI 사이트 밑줄, 및 굵은 활자 타입의 IgG-Fc의 C-말단 부분). PCR 산물을 배열하고 pSGHV0-Fc의 구조물을 생성하는 pSGHV0 벡터의 BamHI 및 NotI 사이트로 서브클론하였다.
N-말단에 글리신(Gly)을 갖는 GLP-1을 정방향 프라이머 5'-CTCGAGACCATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTTTTGGTAGCAACAGCTACAGATGTCCACTCCggaCATGCTGAAGGGACCTTT-3'(XhoI 사이트 밑줄, IgG 시그널 서열, Gly 사이트 소문자, 및 굵은 활자 타입의 GLP-1의 N-말단 부분)로 증폭하였다.
XhoI와 NheI로 증해된 PCR 산물을 pSGHV0-Fc 벡터로 서브클론하였다. 발현벡터 내 융합체의 정확도를 DNA 서열분석으로 확인하였다.
2. GGLP-1/IgG-Fc 융합체의 발현
차이니즈 햄스터 난소세포(CHO K1)를 이용하여 상기 1에서 제조한 GGLP-1/IgG-Fc 융합체의 발현을 상기 실시예 1의 2와 동일하게 하여 확인하였다.
3. GGLP-1/IgG-Fc 융합체의 정제
AKTA Prime FPLC(GE Healthcare)를 이용하여 GGLP-1/IgG-Fc 융합체를 상기 실시예 1의 3과 동일하게 하여 정제하였다.
상기 정제된 AGLP-1/IgG-Fc 융합체 및 GGLP-1/IgG-Fc 융합체를 SDS-PAGE로 분석한 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 AGLP-1/IgG-Fc 융합체 및 GGLP-1/IgG-Fc 융합체는 약 33 kDa의 분자량을 가짐을 확인하였다.
비교예 1 : GLP-1/IgG-Fc 융합체(서열번호 1)의 제조
1. GLP-1/IgG-Fc 융합 플라스미드의 제작
234 아미노산을 암호화하는 인간 IgG-Fc 서열을 하기 프라이머와 함께 pOPGFc 플라스미드로부터 PCR로 증폭하였다; 정방향 프라이머는 5'-GGATCCgctagcGAGCCCAAATC-3'(BamHI 사이트 밑줄, 소문자의 NheI 사이트 링커 서열, 및 굵은 활자 타입의 IgG-Fc의 N-말단 부분) 및 역방향 프라이머는 5'-GCGGCCGC TCATTTACCCGGAGA-3'(NotI 사이트 밑줄, 및 굵은 활자 타입의 IgG-Fc의 C-말단 부분). PCR 산물을 배열하고 pSGHV0-Fc의 구조물을 생성하는 pSGHV0 벡터의 BamHI 및 NotI 사이트로 서브클론하였다.
인간 GLP-1을 세포외로 발현시키기 위하여, IgG의 시그널 서열을 포함하는 하기 프라이머와 함께 인간 글루카곤 cDNA(OriGene Technologies, Inc., USA)로부터 PCR로 증폭하였다; 정방향 프라이머는 5'-CTCGAGACCATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTTTTGGTAGCAACAGCTACAGATGTCCACTCCCATGCTGAAGGGACCTTT-3'(XhoI 사이트 밑줄, IgG 시그널 서열, 및 굵은 활자 타입의 GLP-1의 N-말단 부분), 및 역방향 프라이머는 5'-GAAATCTCGCTAGC TCCTCGGCC-3'(NheI 사이트 밑줄, 및 굵은 활자 타입의 GLP-1의 C-말단 부분).
XhoI와 NheI로 증해된 PCR 산물을 pSGHV0-Fc 벡터로 서브클론하였다. 발현벡터 내 융합체의 정확도를 DNA 서열분석으로 확인하였다.
2. GLP-1/IgG-Fc 융합체의 발현
차이니즈 햄스터 난소세포(CHO K1)를 이용하여 상기 1에서 제조한 GLP-1/IgG-Fc 융합체의 발현을 상기 실시예 1의 2와 동일하게 하여 확인하였다.
3. GLP-1/IgG-Fc 융합체의 정제
AKTA Prime FPLC(GE Healthcare)를 이용하여 GLP-1/IgG-Fc 융합체를 상기 실시예 1의 3과 동일하게 하여 정제하였다.
실험예 1 : GLP-1 유사체의 DPP-Ⅳ에 대한 저항성 예측
본 발명에 따른 GLP-1 유사체의 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 예측하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로는, C-말단에 AMC가 결합된 3종류의 펩티드[His-Ala-AMC(HA-AMC), Ala-His-Ala-AMC(AHA-AMC), 및 Gly-His-Ala-AMC(GHA-AMC)]를 합성하고 동결건조하였다. 500㎕의 50mM Tris·Cl, 1mM EDTA, pH 8.0에서 100μM의 AMC-결합된 3종류의 펩티드를 37℃에서 1시간 동안 DPP-Ⅳ와 함께 배양하였다. AMICO-Bowman Series 2(AB2) 형광분광광도계를 이용하여 365~535㎚와 여기 파장 350㎚ 사이에서 형광 변화를 측정하였다.
결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, AMC는 440㎚에서 최대 방출 및 350㎚에서 최대 여기를 가졌다. HA-AMC의 형광 방출은 단독의 AMC에 비해 청색이동 되었다(blue-shifted). 그러나, HA-AMC를 37℃에서 1시간 동안 DPP-Ⅳ와 함께 배양한 경우 His-Ala-AMC로부터 형광 방출은 AMC의 정상 스펙트럼으로 회복되었다. 이것은 His-Ala와 AMC 사이의 펩티드 결합이 끊어졌다는 것을 암시하는 것이다. 또한, AHA-AMC와 GHA-AMC를 DPP-Ⅳ와 함께 배양한 경우에는 AHA-AMC와 GHA-AMC의 형광 방출에 아무런 영향을 끼치지 않았음을 확인하였다. 이것은 Ala-His-Ala(AHA)와 AMC 또는 Gly-His-Ala(GHA)와 AMC 사이의 펩티드 결합이 DPP-Ⅳ 분해 작용을 방해한다는 것을 가리킨다.
상기 결과에 의하여, 본 발명에 따른 GLP-1 유사체는 DPP-Ⅳ의 분해작용을 방해하여 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 갖는다는 것을 예측할 수 있다.
실험예 2 : GLP-1 유사체의 융합체의 DPP-Ⅳ에 대한 저항성
1. GLP-1 유사체의 DPP-Ⅳ에 대한 저항성
본 발명의 GLP-1 유사체를 DPP-Ⅳ와 배양한 후, 단백질 서열분석기(Applied Biosystems Inc., 미국)로 DPP-Ⅳ 처리 전·후의 GLP-1 유사체의 N-말단 아미노산 서열 분석을 수행하였다. 구체적으로는, 상기 제조예 1에서 제조한 AGLP-1을 인간 DPP-Ⅳ(Sigma, USA)와 37℃에서 4시간 반응시킨 후 Prosorb® sample preparation cartridge(Applied Biosystems, Inc., 미국)에 로딩하고, Protein sequencer (Procise491, Applied Biosystems, Inc., 미국)에 위치시킨 후 GLP-1 유사체의 N-말단 아미노산 서열 분석을 수행하였다. 비교군으로는 GLP-1을 Sigma(미국) 사로부터 구입하여 사용하였다.
결과는 표 1에 나타내었다.
표 1
DPP-Ⅳ GLP-1 AGLP-1
반응 전 His-Ala-Glu-Gly-Thr Ala-His-Ala-Glu-Gly
반응 후 Glu-Gly-Thr-Phe-Thr Ala-His-Ala-Glu-Gly
표 1에 나타난 바와 같이, GLP-1은 DPP-IV 작용에 의해 N-말단 2개의 아미노산이 분해되었으나, AGLP-1은 DPP-Ⅳ 처리 전·후에 있어 N-말단 아미노산 서열의 변화가 없었다. 따라서, 본 발명의 GLP-1 유사체는 DPP-Ⅳ의 분해작용을 방해하여 DPP-IV에 대한 저항성을 가진다는 것을 알 수 있다.
2. GLP-1 유사체의 융합체의 DPP-Ⅳ에 대한 저항성
본 발명에 따른 GLP-1 유사체의 융합체의 DPP-Ⅳ에 대한 저항성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1 및 2에서 제조한 AGLP-1/IgG-Fc 융합체 및 GGLP-1/IgG-Fc 융합체를 상기 1의 방법과 동일하게 하여 DPP-Ⅳ 처리 전·후의 GLP-1 유사체/IgG-Fc 융합체의 N-말단 아미노산 서열 분석을 수행하였다. 비교군으로는 비교예 1에서 제조한 GLP-1/IgG-Fc 융합체를 사용하였다.
결과는 표 2에 나타내었다.
표 2
DPP-Ⅳ GLP-1/IgG-Fc AGLP-1/IgG-Fc GGLP-1/IgG-Fc
반응 전 His-Ala-Glu Ala-His-Ala Gly-His-Ala
반응 후 Glu-Gly-Thr Ala-His-Ala Gly-His-Ala
표 2에 나타난 바와 같이, GLP-1/IgG-Fc 융합체는 DPP-Ⅳ 작용에 의해 N-말단 2개의 아미노산이 분해되었으나, AGLP-1/IgG-Fc 융합체 및 GGLP-1/IgG-Fc 융합체는 DPP-Ⅳ 처리 전·후에 있어 N-말단 아미노산 서열의 변화가 없었다. 따라서, 본 발명의 GLP-1 유사체의 융합체는 DPP-Ⅳ의 분해작용을 방해하여 DPP-IV에 대한 저항성을 가진다는 것을 알 수 있다.
실험예 3 : GLP-1 유사체의 융합체의 생체 내 활성 실험(복강내 당부하 검사)
본 발명에 따른 GLP-1 유사체의 융합체가 마우스에서 혈당 강하 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 하기와 같은 복강내 당부하 검사를 수행하였다.
실험동물로 10주령의 db/db 마우스를 5마리를 준비하고, 실험 개시 15시간 전에 절식시켰다. 상기 실시예 1에서 제조한 AGLP-1/IgG-Fc 융합체를 100nmol/㎏의 투여량으로 db/db 마우스의 복강 내에 단회 투여하였다. 대조군으로는 PBS(인산염완충용액)를 사용하였다. 시험물질 투여 후 각각 30분, 12시간, 24시간 경과한 다음 포도당을 1.5g/㎏의 투여량으로 복강 투여하였고, 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120 분에 혈당계(올메디쿠스, 대한민국)를 이용하여 혈당을 측정하였다.
본 발명의 GLP-1 유사체의 융합체를 투여한 마우스에서의 혈당 강하 효과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, GLP-1/IgG-Fc 융합체 투여군과 AGLP-1/IgG-Fc 융합체 투여군은 혈당 강하 효과를 나타내었으며, 특히, AGLP-1/IgG-Fc 융합체의 혈당 강하 효과가 GLP-1/IgG-Fc 융합체 보다 더 크게 나타남을 확인하였다.
본 발명에 따른 GLP-1 유사체의 융합체는 GLP-1의 N-말단이 알라닌(Ala) 또는 글리신(Gly)에 의해 확장됨으로써, DPP-Ⅳ의 분해작용을 방해하여 DPP-IV에 대한 저항성을 가지며, 혈당 강하 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 GLP-1 유사체의 융합체는 당뇨병, 특히 제 2형 당뇨병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (7)

  1. GLP-1의 N-말단이 알라닌(Ala) 또는 글리신(Gly)에 의해 확장된 GLP-1 유사체와, 체내 반감기를 증가시키는 분자를 융합시킨 GLP-1 유사체의 융합체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 체내 반감기를 증가시키는 분자는 면역글로불린 중쇄 (IgG-Fc), 면역글로불린(IgG), 알부민, 트랜스페린 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 GLP-1 유사체의 융합체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 GLP-1 유사체의 융합체는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 GLP-1 유사체의 융합체.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 GLP-1 유사체의 융합체를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 당뇨병은 제 2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. GLP-1의 N-말단에 알라닌(Ala) 또는 글리신(Gly)을 확장시킴으로써, 이를 체내 반감기를 증가시키는 분자와 융합시켰을 때 그 융합체의 혈당 강하가 더욱 증가되는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 반감기를 증가시키는 분자는 면역글로불린 중쇄(IgG-Fc), 면역글로불린(IgG), 알부민, 트랜스페린 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, 융합체의 혈당 강하가 더욱 증가되는 방법.
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