HU229218B1 - Glp-1 fusion proteins - Google Patents

Glp-1 fusion proteins Download PDF

Info

Publication number
HU229218B1
HU229218B1 HU0302529A HUP0302529A HU229218B1 HU 229218 B1 HU229218 B1 HU 229218B1 HU 0302529 A HU0302529 A HU 0302529A HU P0302529 A HUP0302529 A HU P0302529A HU 229218 B1 HU229218 B1 HU 229218B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
xaa
glp
glu
lys
asp
Prior art date
Application number
HU0302529A
Other languages
English (en)
Inventor
Wolfgang Indianapolis Glaesner
Radmilla Indianapolis Micanovic
Sheng-Hung Rainbow Carmel Tschang
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22954069&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU229218(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HUP0302529A2 publication Critical patent/HUP0302529A2/hu
Publication of HUP0302529A3 publication Critical patent/HUP0302529A3/hu
Publication of HU229218B1 publication Critical patent/HU229218B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)

Description

A találmány tárgyát a glukagon-szerű peptídek képezik, olyan fehérjékhez fúzionáltatva, amiknek az a hatásuk, hogy meghosszabbítják a peptídek felezési idejét. A fúziós fehérjék arra használhatók, hogy a nem-inzulin dependens cukorbetegséget, valamint számos más különböző állapotot kezeljenek vele.
S. B. G, & K. ύχγνο-ö;
G χ ' ' - ' vo N *>
♦ ♦
GLP1 fúziós fehérjék
A jelen találmány tárgyát a glukagon-szerű peptidek képezik, beleértve azok analógjait és származékait, olyan fehérjékhez fúzionáltatva, amiknek az a hatásuk, hogy meghosszabbítják a peptidek felezési idejét. A fúziós fehérjék arra használhatók, hogy a nem-inzulin dependens cukorbetegséget, valamint számos más különböző állapotot kezeljük vele.
A glnkagonszerű. peptíd-1 (GLP-1) 37 aminosavból álló pepiid, amit a táplálék elfogyasztásának hatására a bél L-sejtjei szekretálnak. Azt találták, hogy az inzulin szekréciót stimulálják (inzulinotróp hatás), ezzel így a sejtek glükóz felvételét okozzák, és a szérum glükóz színijét: csökkentik {Moj.sov: int. 3. Peptide Protein Research, 90, 333-343 (1992)]. Azonban a GLP-1 (1-37) csak kissé aktív, A 6. és 7. pozíció közötti endogén hasítás egy hatékonyabb, biológiailag aktívabb GLP-1(7-37)OH pepiidet eredményez. Számos GLP-1 analóg és származék ismert, ezeket a továbbiakban „GL.P~1 vegyületek” néven említjük. Ezek közé a GLP1 analógok közé tartoznak az Exendinefc, amik a GILA-óriás mérgében találhatók. Áz Exendinek szekvencia-homolögiát mutatnák, a természetes GLP-1-gyei, kötődnek a GLP-1 receptorhoz, és a GLP-1 (7~37)OH-nak tulajdonított számos aktivitásért felelős íranszdukciós kaszkádot inici álnak,
A GLP-1 vegyületeknek számos különböző fiziológiásán szignifikáns aktivitásuk van. A GLP-1-ről kimutatták például, :*Χ hogy stimulálja az inzulin felszabadulását, csökkenti a glukagon szekrécióját, gátolja a gyomor-ürítést, és javítja a glükózhasznosítást fNauck, M.A. és mtsai: Díabetologia 36, 741-744 (1993); Gutniak, M, és mtsai: The New England Journal of Medicine 326, 1316-1322 (1992); Nauck, M..A* és mtsai: J. Clinic. Invest. 91, 301-307 (1993)j.
A GLP-l tűnik legígéretesebbnek a nem-inzulin-dependens cukorbetegség (NÍDDM) kezelésében. A piacon számos orális gyógyszer van, amivel az NlDDM-hez kapcsolódó inzulin rezisztenciát lehet kezelni. Ahogy azonban a betegség előrehalad, a betegeknél meg kell változtatni az inzulin felszabadulását stimuláló kezelést, és végül olyan kezelésre kell áttérni, aminek során inzulint injekcióznak he. Azonban a jelenleg az inzulin felszabadulását stimuláló gyógyszerek okozhatnak hípoglikémlát is, ugyanúgy, mint az inzulin aktuális beadása. A GLP-1 aktivitását azonban a vér glükőzszintje szabályozza. Ha a szint egy bizonyos határérték alá csökken, akkor a GLP-1 nem aktív. Ezért a hipoglikémiának nem merül fel a GLP-1-gyei végzett kezeléshez kapcsolódó kockázata.
Azonban a GLP-1 peptxdekre alapuló kezelés hasznossága korlátozott, gyors kiürülése és rövid felezési ideje miatt. Például a GLP-1(7-37) felezési ideje szérumban csak 3-5 perc. A GLP-1(736) amid körülbelül 50 percig hat, ha szubkután adjuk be. Még az endogén proleázos hasításra rezisztens analógoknak és származékoknak sem elég hosszú a. felezési idejük ahhoz, hogy el lehessen kerülni azt, hogy 24 óra alatt többször he kelljen adni <· φ χ-β őket. Egy terápiás ágens gyors kiürülése kényelmetlen azokban az esetekben, amikben arra van szükség, hogy az ágens magas vérszintjét hosszú ideig fenntartsuk, mivel ekkor az ágens ismételt beadása lehet szükséges. Emellett egy hosszan ható vegyület különösen fontos azoknak a cukorbetegeknek, akiknél a korábbi kezelési mód. csak orális gyógyszerbeadást jelentett. Ezeknél a betegeknél gyakran nag-on nehéz időszakot jelent egy olyan kezelési módra való áttérés, ami a gyógyszer többszöri in·· jekciőzását foglalja magában.
A jelen találmány megoldja azokat a problémákat, amik ahhoz kapcsolódnak, ha egy rövid plazma felezési idejű vegynletefc kell beadni. A jelen találmány szerinti vegyületek olyan GLP-1 vegyületek, amik egy másik, hosszú keringési felezési idejű fehérjéhez vannak fúzionáltatva, azaz például egy immunglobulin vagy albumín Fc részéhez.
Á kis terápiás peptídeket általában nehéz manipulálni, mivel szerkezetüknek a legkisebb változtatása is érintheti stabilitásukat és/vagy biológiai aktivitásukat. Ez különösen igaz a jelenleg fejlesztett GLP-1 vegyületekre is. Például a GLP-1(7-37} hajlamos konformációs változásokra, amiknek során egy elsődlegesen alfa hélix struktúrából egy elsődlegesen béta-lemez struktúrába alakul át. Ez a béta. lemez aggyegálódott anyagot eredményez, amiről azt gondolják, hogy inaktív. Ez különösen akkor váratlan, ha figyelembe vesszük, hogy milyen nehéz a GLP-1(737)ÖH-val önmagában dolgozni, és a kis GLP 1 pepiidhez viszonyítva milyen nagy a kapcsolt fúziós partner.
Λ «♦
Λ jelen találmány szerinti vegyületek közé tartoznak azok a heterológ fúziós fehérjék, amik tartalmaznak egy első polipeptidet, egy N-terminálissal, valamint egy C-terminálist, ami egy második polipeptidhez van fúzíonállatva, aminek van egy fi-terminálísa és egy C-terminálisa, és az első polipeptíd egy GLP-1 vegyület, és a második polipeptidet az alábbi csoportból választhatjuk ki;
a) humán albumin;
b) humán albumin analógok; és e) a humán albumin fragmenseí, és az első polipeptíd C-terminálisa a második polipeptíd N--termi nálisához van fűzlonáltatva,
A jelen találmány szerinti vegyületek közé tartoznak azok a heterológ föziós fehérjék, amik tartalmaznak egy első polipeptidet, egy N-tenninálissal, és a C-terminálisuk egy második polipeptidhez van fűzlonáltatva, ennek van N-tennináhsa és C-termi náiisa, amiben az első polipeptíd egy GLP-1 vegyület, a második polipeptidet pedig az alábbi csoportból választhatjuk ki:
a) humán albumin;
b) humán albumin analógok; és
c) a humán alhumin fragmenseí, és az első polipeptíd C-termínálisa a második polipeptíd ^-terminálisához van fózionáltatva egy peptid línkeren keresztük Az az előnyős, ha a peptid linkért az alábbi csoportból, választjuk ki:
a) egy glíeinben gazdag pepiid;
♦/:.. .·** χ* φ « * 9 ♦ *ΦνΧ
Μ egy peptid, aminek a szekvenciája a kővetkező: (GlyGty-Gly-Cdy-Serírs, amiben n értéke 1, 2, 3, 4, 5 vagy 6; és
c) egy peptid, aminek a szekvenciája a következő: (GlyGly-Gly-Gly-Serja.
A jelen találmány szerinti további vegyületek közé tartoznak a heterolőg fúziós fehérjék, amik tartalmaznak egy első polipeptidet, egy N-terminálissal, és a C-terminálisuk egy második polipeptidhez van fózlonáltatva, ennek van N-terminálisa és C-terminálisa, amiben az első polipeptid egy GLP-1 vegyület, a második polipeptidet pedig az alábbi csoportból választhatjuk ki:
a) egy immunglobulin Fc része;
b) egy immunglobulin Fc részének az analógja; és
c) egy immunglobulin Fc részének fragmensei, és az első polipeptid C-terminálisa a második polipeptid N-termínálisához van fúzíonáltatva egy peptid linkeren keresztül. Az az előnyös, ha a peptid linkért az alábbi csoportból választjuk ki:
a) egy glicinhen gazdag peptid;
b) egy peptid, aminek a szekvenciája a következő: [GlyGly-Gly-Gly-Serjn, amiben n értéke 1, 2, 3, 4, 5 vagy 6; és
e) egy peptid, aminek a szekvenciája a következő: [GfyGly-Gly-Gly-Seria.
Általában az az előnyős, ha a heterolőg fúziós fehérje részét képező GLP-1 vegyület maximum 6 olyan aminosavat tartalmaz, amik elférnek a GLP-1(7-37)0«, a GLP-1(7-36)OH vagy Exendln-4 ♦«.·«* megfelelő aminosavaitóL Az még előnyösebb, ha a GLP-1 vegyület maximum 5 olyan aminosavat tartalmaz, amik eltérnek a GLP1(7-37)OH, a GLP-1{7-36}OH vagy Exendín-4 megfelelő amino savaitól. Az a legelőnyösebb, ba a GLP-1 vegyület maximum 4, 3 vagy olyan aminosaval tartalmaz, amik eltérnek a GLP-1(737jOH, a GLP-! (7~3ó)GH vagy Exendin-4 megfelelő aminosavaitól. Előnyösen a beterológ fúziós fehérje részét, képező GLP-1 vegyűletben a 8-as pozícióban glieín vagy valin van.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az itt ismertetett beterológ fúziós fehérjét kódoló pohnukleotidok, az ezeket a poiinukleotidokat tartalmazó vektorok, valamint az itt ismertetett vektorokkal transzfektált vagy transzformált gazdasejtek. A jelen találmány tárgyát képezi továbbá a beterológ fúziós fehérje előállítási eljárása, ami a következő lépéseket tartalmazza; az itt ismertetett polínukleotidot olyan körülmények között írjuk át és fordítjuk le, amely körülmények között a beterológ fúziós fehérje kimutatható mennyiségben expresszálódik.
A jelen találmány tárgyát képezi továbbá a vér glükóz szintjének normalizálására szolgáló eljárás, egy erre a kezelés szoruló emlősben, azzal jellemezve, hogy egy itt ismertetett heterológ fúziós fehérjéből terápiásán hatásos mennyiséget adunk be.
A jelen találmányt tovább illusztráljuk az alábbi ábrák alapján is.
1, ábra: Az IgGl Fe aminosav szekvencia, ami tartalmazza a csukló régiért, és a CH2 valamint a CH.3 doméneket
X
2. ábra: A humán szérunt-albumin amínosav szekvenciája.·
3. ábra: A. SDS-PAGE gél, és ugyanannak a gélnek az immunblottja, ami az IgG-Fc és GLP-1 -Fc fúziós fehérjék molekulasúlyát illusztrálja (1. sáv: molekulasúly standardok; 2. sáv: tisztított Fc; 3. sáv: hamisan transzfektált közeg; 4. sáv: Val8GbP-l-Fc; 5. sáv: Exendm-4-Fe). B. SDS-PAGE gél, és ugyanannak a gélnek az immunblottja, ami a humán HSA és a GLP-lHSA fúziós fehérjék molekulasúlyát illusztrálja (1. sáv: molekulasúly standardok; 2. sáv: tisztított HSA; 3. sáv: hamisan transzfektált közeg; 4, sáv: VaF-GLP-l-HSA; 5. sáv: VaF-GLP-l-fGiyGly-Gty-Gly-Setijs-'HSA; 6. sáv: Exendin-4-HSA; 7. sáv: Exendin4-{Gly-Gly-Gly-Gly-Serj3-HSA.
4. ábra: A tisztított Fc, albumát és GLP-1 fúziós fehérjék SDS-PAGE gélje (1. sáv: molekulasúly standardok; 2. sáv: tisztított Fc; 3. sáv: Val8-GLP~ 1-Ec; 4. sáv: Exendin-4-Fc; 5. sáv: molekulasúly standardok; 6. sáv: Val8-GLP-1-HSA; 7. sáv: Exendin-4HSA; 8. sáv: Exendin-4-^Gly-Gly-Gly-Gly-Ser|3-HSA.
5. ábra: Expresszlós klónozó vektor, ami tartalmazza az 1. ábrán bemutatott Fc régiókat.
6. ábra: Expresszdos klónozó vektor, ami tartalmazza a. 2. ábrán bemutatott albumin szekvenciát
7. ábra: Expresszlós klónozó vektor, ami tartalmaz egy 15 anainosavból álló linkért, leolvasási keretben füzionáltatva, valamint a 2. ábrán bemutatott albumin szekvencia S' végét.
♦ »* ♦
«*<
*♦.*·«
8. ábra: A GLP-· 1 fúziós fehérjék in felró dózis-hatás aktivitása.
9. ábra: A GLP-1 Fc és HSA fúziós fehérjék farmakokinetíkája.
10. ábra: Áz Exendín~Pe~re adott glükodinámiás válasz két normális, éheztetett kutyában.
11. ábra: Exendín-Fc-re adott ínzulinotróp válasz két normális, éheztetett kutyában.
12. ábra: Egy humán ÍgGl Fc régiót kódoló DNS szekvencia.
13. ábra: Egy humán albumin fehérjét kódoló DNS szekvencia.
A jelen találmány szerinti heterológ fúziós fehérjék tartalmaznak egy GLP-1 vegyületet, humán albuminhoz, humán albumin analóghoz, egy humán albumin fragmenshez, egy immunglobulin Pe részéhez, vagy' egy immunglobulin Fc része egy fragmenséhez fúzionáltatva. A GLP-1 vegyüiet C-terminálisát fúziónáltathatjuk közvetlenül, vagy egy peptid línkeren keresztül egy albumin vagy Fc fehérje N-terminálisához. Ezek a heterológ fúziós fehérjék biológiailag aktívak, és a természetes GLP-1-hez viszonyítva megnőtt a felezési idejük.
Az az előnyős, ha a GLP-1 vegyületek,. amik a heterológ fúziós fehérje egy részét képezik, olyan polipeptidek, amik körülbelül 25-39 természetes vagy nem-természetes aminosavat tartalmaznak, amik elég homológiával rendelkeznek a természetes GLP-1(7-37}OH-val, oly módon, hogy ínzulinotróp aktivitást
ΦΦΦ X φ φ* * mutatnak, a hasnyálmirigyben a béta-sejteken a GLP-1 receptorhoz kötődnek. Egy GLP-1 vegyüiet tipikus esetben tartalmaz olyan polipeptidet, ami a GLP-1(7-37}OH, a GLP-1 (7-37)OH analógja, a GLP- 1(7-37}0H fragmense vagy a GLP-1(7-37)OH analóg fragmense aminosav szekvenciájával rendelkezik,. A GLP-1 (737)OH aminosav szekvenciáját az 1, számú szekvenciavázlafon mutatjuk he:
9 9 10 II 12 13 14 15 16 17
His Alá Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Ser iyr Leu Glu Gly Gin Alá Alá Lys Glu Phe
30 31 32 33 34 35 36 37
He Alá Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly (1. számú, szekvencia)
A szakterületen elfogadott módon a GLP-1(7-37)OH N-terraínálisa kapja a 7~es sorszámot, a C-terminális a 37-es sorszámot. A polípeptidhen a többi aminosav ennek megfelelően van jelölve, amint az az 1. számú szekvenelavázlaton látható. Például a 12-es pozíció a fenilalanin, a 22-es pozíció a glicin.
Á GLP-1 vegyületek közé tartoznak a „GLP-1 íragmensekL a GLP-1 fragmens egy olyan polipeptid, amit a GLP-1(7-37)ÖH, annak analógja vagy származéka egy vagy több aminosavának az N-termínálisról és/vagy a C-terminálisról való eltávolításával kapunk. A GLP-1(7~37)OH leírására használt, nomenklatúra használható a GLP-1 fragmensekre Is. Például a GLP-1(9-36)OH egy ** ' * « • .« fo, :··, ; ,· ·-· ** ♦*·· olyan GLP-1 fragmenst jelöl, amit ügy kapunk, hogy az N-terminálísról két aminosavat, és a C~terminálísrŐl egy aminosavat távolítunk el A fragmensben tevő aminosavakat ugyanúgy jelöljük, mint ahogy a GLP-l f?~3?)0H aminosavaknak megfelelő számokat alkalmazzuk. Például a GLP-1 (9-36 jOB-ban az N-terminális giut&raínsav a 9~es pozícióban van; a 12-es pozíciót fenilalanín foglalja el; a 22-es pozíciót a glicin foglalja el, ugyanúgy, mint a GLP-l(7-37)OH-ban. Például a GLP-1(7-36)OH esetében a GLP-1(7-37)ÖH 37-es pozíciójában tevő glicin ki van vágva,
Á GLP-l vegyületek közé tartoznak azok a poiipeptidek, amikben egy vagy több aminosavat adunk hozzá a GLP-1(737)OH, fragmenseí vagy analógjai ^-terminálisához és/vagy C~ terminálisához, Az az előnyös, ha az ilyen típusú GLP-l vegyületek maximum körülbelül 39 aminosavat tartalmaznak. A Jut erjesztett” GLP-1-ben az aminosavakat ugyanúgy számozzuk, mint az GLP-1(7-37jOH megfelelő amínosavait. Például egy GLP1 vegyútetnek, amit úgy kaptunk, hogy a GLP-1(7-37)0« N-terminálisához két aminosavat adtunk hozzá, az N-terminálisa az 5ős pozícióban van; és egy GLP-l vegyúletnek, amit úgy kaptunk, hogy a GLP-1(7-37)0« C-termináiisáboz egy vagy több amínosavat adtunk, a. C-ferminálísa a 3S-as számot kapja, így a 12-es pozíciót fenílalanin foglalja el, a 22 -es pozíciót, glicin foglalja el mindkét ilyen „kiterjesztett GLP-l vegyütetekben, ugyanúgy mint a GLP~lf7-37jOH-bam Egy kiterjesztett GLP-l vegyület 1-6os aminosavai előnyösen ugyanazok, vagy a konzervatív helyettesítései a GLP-1(7-37)0« megfelelő pozíciójában tevő amínosavaknak felelnek meg. Egy kiterjesztett GLP-1 vegyület 38-45~ós aminosavai előnyösen ugyanazok, vagy a konzervatív helyettesítései a. glukagon vagy az Exendin~4 megfelelő pozíciójában levő amínosavaknak.
A jelen találmány szerinti vegyületek közé tartoznak a „GLP-1 analógok”. Egy GLP-1 homológ elegendő homológiát mutat a GLP~l(7~37jGH~hoz, vagy a GLP-1(7~37)OH egy fragmenséhez, oly módon, hogy az analógnak inzulinotrőp aktivitása van, Á GLP-1 analóg aminosav szekvenciája előnyösen ugyanaz, mint a GLP-1 (7-37 jöH-nak vagy fragmensének, úgy módosítva, hogy egy, két, három, négy vagy öt aminosav eltér a GLP-1(737)OH, vagy a GLP-1(7-37}OH fragmense megfelelő pozícióiban levő aminosavaktól, A GLP-1 vegyületek leírására itt használt nomenklatúrában a helyettesítő amínosavat és pozícióját a kiindulási struktúra előtt jelezzük. Például a Glu22' GLP-1.(7-37)011 egy olyan GLP-1 vegyületet jelöl, amiben a GLP-1(7-37)OH 22-es pozíciójában normális körülmények között levő gliein helyett glutaminsav van; a VaP-GLP22- GLP-I(7~37)OH egy olyan GLP-1 vegyületet jelöl, amiben a GLP-1 (7 -37JOH 8-as pozíciójában normális körülmények között levő alanín, és a 22-es pozíciójában normális körülmények között levő gliein helyett valin illetve glutaminsav van,
A jelen találmány szerinti GLP-1 vegyületek közé tartoznak a „GLP-1 származékok”. A GLP-1 származékot úgy definiáljuk, mint egy olyan molekulát, ami egy GLP-1 vagy GLP-1 analóg aminosav szekvenciájával rendelkezik, de emellett egy vagy több
Ii * ♦♦ .
φ* *·» V Ó « ,· η» : »* amínosav oldalláncában, az alfa szénatomján, a terminális arninocsoportján, vagy a terminális karbonsav csoportján kémiai módosítások varrnak. Bgy kémiai módosítás lehet, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, kémiai egységek hozzáadása, űj kötések létrehozása, és kémiai egységek eltávolítása. Az aminosav oldalláncokon végrehajtott módosítások közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a lizin epszilon aminocsoportjának az acilezése, az argínin, hísztidin vagy lizin Nalkilezése, a giutaminsav vagy aszparaginsav karbonsav részének alkilezése, és a glutamin vagy aszparagin dezamínálása. Az Nterminális módosításai közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a dez-amino, N-alacsony szénatomszámü alkíl, Mbdi-alaesony szénatomszámú alkíl, és N-acil módosítás. A C-termináhs módosításai közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az amid, alacsony szénatomszámü alkílamid, a dialkilamid és az alacsony szénatomszámú alkilészter módosítás. Az alacsony szénatomszámü alkilcsoport C1-C4 alkilcsoport. Emellett, egy vagy több oldallánc vagy terminális csoportot védőcsoportok védhetnek, amik a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára ismertek. Egy aminosav aha-szénatomja lehet mono- vagy dímetilezett.
Bármelyik GLP-1 vegyület lehet egy jelen találmány szerinti heterológ fúziós fehérje része, mindaddig, amíg a GLP-1 vegyület maga képes kötődni és jelet adni a GLP-1 receptoron keresztül. A GLP-1 receptorkötés és jeladás in rttro esszékkel vizsgálható, például olyanokkal, amiket az BP 619,322 számú szabadalmi lesíz * *·* j* ·*$· * ** * *
A # * * * »»♦ St * ·* * < .«á»· < * ·** ♦*·* az 5,120,712 számú Amerikai Egyesült Államokírtak le, számos aktív GLP-1 származék' Ismert, és ezek közül az anal lehet a jelen találmány szerinti ε részé. A találmány tárgyát a szakterületen ismeri új 1 analógok és szár g es
frag-
ísmert GLP-1 a GLP-1(7-34) és a GLP-l(7-35), a GLP~1{7~36), a GLNP- GLP-l(7-37), a D-Ghri-GLP-1(7-37), a Thri*~Lys*s- GLP-l(7-37) és a Lysps- GLP~Í{7~37). A GLP-1 analógokat, azaz például a GLP-1 (7-34)et és a GLP~l(7-35)-őt az 5,118,666 számú
M aktivitással rendelkeznek, szintén ismertek, lás ismeri biológiailag aktív GLP-1 vegyületeket is leírtak a (Hoffman és mtsai: 5,977,071 számú Amerikai és mtsai:
5,545,618 számú Amerikai Egyesült ÁHamok-be leírás; Adelhorst és mtsai: Journal of B;
6275 (1994)1.
M analógokat tartalmazza (2. számú székvencia
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
ΦΦ « κ »*
ΦΦΦ *** φ * φ < φ $ * Φ φφφ φφφ
Xaa Xaa. Gly Xaa Phe Thr Xaa 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Tjr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe 30 31 32 33 34 35 36 37 33 39
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
42 43 44 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa (2, számú sí a S-as
Alá, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, a 9-es
Xaa jelentése a 11-es
Glu, Asp, vagy Lys; a 14-es , vagy Lys;
Ser, Leu, Ile, val,
Ser, Alá, Gly, Thr, Leu, Ile,
Xaa jelentése a 16-os
Tyr, Glu Asp, vagy Lys
Xaa jelentése a 17-es p or Lys; a 18-as
Glu, Asp, Lys, Trp or Tyr a 19-es vagy Lys;
a 2Ö-as pozícióban Leu, Alá, Gly, Ser, Thr, Val, Glu, Asp Met, lys,
Val, Alá, Gly, Ser, Thr,
Thr.
·, Thr, Leu, He, Val,
Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gin, vagy Tyr;
ΙΕ
Xaa jelentése a 2.1-es pozícióban Glu, Asp, vagy Lys
Xaa jelentése a. 22-es pozícióban Glv, Alá, Ser, Thr, Leu, He, Val, Gin, Asp Trp vagy Lys;
Xaa jelentése a 23-as pozícióban Gin, Asn, Arg, Glu, Asp, vagy Lys;
Xaa jelentése a 24-es pozícióban Alá, Giy, Ser, 'Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu Asp, vagy Lys;
Xaa jelentése a 25~ös pozícióban Ála, Giy, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp vagy Lys;
Xaa jelentése a 2ó~os pozícióban Lys, Arg, Gin, Glu, Asp, vagy His;
Xaa jelentése a 27-es pozícióban Len, Glu, Asp, vagy Lys;
Xaa jelentése a 30-as pozícióban Ála, Giy, Ser, Thr, Leu, He, Val,
Glu, Asp vagy Lys;
Xaa jelentése a 31 -es pozícióban Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp, vagy Lys;
Xaa jelentése a 32-es pozícióban Leu, Giy, Alá, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp vagy Lys;
Xaa jelentése a 33-as pozícióban Val, Giy, Alá, Ser, Tbr, Leu, Be, Glu, Asp vagy Lys;
Xaa jelentése a 34~es pozícióban Asn, Lys, Arg, Glu, Asp, vagy His;
Xaa jelentése a 35-ös pozícióban Giy, Alá, Ser, Tbr, Leu, Be, Val, Glu, Asp vagy Lys;
Xaa jelentése a 36-os pozícióban Giy, Arg, Lys, Glu, Asp, vagy
Xaa jelentése a 37-es pozícióban Pro, Gly, Alá, Ser, Thr, Leu, Ile,
Vaj, Glu Asp, vagy Lys, vagy ki van vágva;
Xaa jelen tése a 38-as pozícióban Ser, Arg, Lys, Gin, Asp, vagy
His, vagy ki van vágva;
Xaa jelentése a 39~es pozícióban Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, vagy
His, vagy ki van vágva;
Xaa jelentése a 40-es pozícióban Gly, Asp, Glu, vagy Lys, vagy ki van vágva;
Xaa jelentése a 41-es pozícióban Alá, Phe, Trp, iyr, Gin, Asp, vagy Lys, vagy ki van vágva;
Xaa jelentése a 42~es pozícióban Ser, Pro, Lys, Glu, vagy Asp, vagy ki van vágva;
Xaa jelentése a 43~as pozícióban Ser, Pro, Glu, Asp, vagy Lys, vagy ki van vágva;
Xaa jelentése a 44-es pozícióban Gly, Pro, Glu, Asp, vagy Lys, vagy ki van vágva;
Xaa jelentése a 45-ös pozícióban Ála, Ser, Val, Gin, Ásp, vagy
Cys, vagy ki van vágva;
azzal a feltétellel, hogy ha a 37-es, 38-as, 39-es, 40-es, 41 -es, 42-es, 43-as vagy 44-es pozícióban levő aminosav ki van vágva, akkor attól az aminosavtől kezdve az összes aminosav szintén ki van vágva.
Az az előnyős, ha a 1 általános képletű GLP-1 vegyület hatnál kevesebb olyan aminosavat tartalmaz, ami eltér a GLPlf7~3?|OH vagy az Exendin-4 megfelelő aminosavaitók Az még előnyösebb, ha ötnél kevesebb aminosav tér el a GLP-1 (7-37}QH «« φφ »«»« ««· ί
X Φ Λ, X * * * φ «Φφ * X ♦ * φ X #
ΦΦφ φ X» φ φφ φ »Φ χ φφφ vagy az Exendin-4 megfelelő aminosavaitót Az még ennél is előnyösebb, ha négynél kevesebb aminosav tér el a GLP~1(?-37)OH vagy az Ezendin-4 megfelelő aminosavaitóL
A jelen találmány szerinti GLP-l vegyületek közé tartoznak a I általános képletü vegyület származékai, azaz például a C-1-6észter vagy amid, vagy a C-l-6-alkilamid, vagy a C-l-6dialkilamid. A WO99/43706 számú szabadalmi leírásban ismertetik a 1 általános képletü GLP-l vegyületek származékait, ezt a továbbiakban teljes egészében referenciának tekintjük. AI általános képletü vegyületnek a WO99/43706 számú szabadalmi leírás szerinti származékai, valamint a származékok eltávolítása után kapott vegyületek is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.
A GLP-l vegyületek egy másik előnyben részesített csoportja a 11 általános képletü GLP-l analógokat tartalmazza (3, számú szekvencia):
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Xaa Leu Glu Xaa Xaa Alá Xaa Xaa Phe
30 31 32 33 34 35 36 37
Ile Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa R 11 általános képletü vegyület (3, számú szekvencia) amiben «« »
**
X* $ * 4
9«» sí.
Xaa jelentése a 7~es pozícióban L-hisztidin, D-hisztídin, dezamino-hísztidin, 2~amino-hisztidin? p-hldroxi-hisztidin, homohísztidin, á-fluorometil-hísztídin vagy a-mehl-hlsztidin;
Xaa jelentése a 8-as pozícióban Gly, Ala, Val, Leu, ile, Ser, vagy Tfez;
Xaa jelentése a 9-es pozícióban Thr, Ser, Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Glu, vagy H;
Xaa jelentése a 11-es pozícióban. Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys, vágj” His;
Xaa jelentése a 12~es pozícióban His, Trp, Phe, vagy Tyr;
Xaa jelentése a 16-os pozícióban Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe,
Asp, Val, Tyr Glu, vágj’' Ala;
Xaa jelentése a 18-as pozícióban His, Pro, Asp, Glu, Arg, Ser, Ala, vagy Lys;
Xaa jelentése a 2X ~es pozícióban Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg, vagy Cys;
Xaa jelentése a 23-as pozícióban His, Asp, Lys, Glu, Gin, vagy Arg;
Xaa jelentése a 24-es pozícióban Glu, Arg, Ala, vagy Lys;
Xaa. jelentése a 26-os pozícióban Trp, Tyr, Phe, Asp, Lys, Glu, vagy His;
Xaa jelentése a 27-es pozícióban Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg. vagy Lys;
Xaa jelentése a 30-as pozícióban Ala, Glu, Asp, Ser, vagy' His;
Xaa jelentése a 31-es pozícióban Asp, Glu, Ser, Thr. Arg, Trp, vagy Lys;
1?.
Xaa jelentése a 33-as pozícióban Asp, Arg, Val, Lys, Alá, Gly vagy Glu;
Xaa jelentése a 34-es pozícióban Glu, Lys, vagy Asp;
Xaa jelentése a 35-ös pozícióban Thr, Ser, Lvs, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly Pro, His, vagy Glu;
Xaa jelentése a 36-os pozícióban Thr, Ser, Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg, Glu, vagy His;
R jelentése a 37~es pozícióban Lys, Arg, Thr, Ser, Gin, Asp, Trp, Tyr, Phe His, Gly, Gly-Pro, vagy ki van vágva.
A GLP-1 vegyöletek egy másik előnyben részesített csoportja a III általános képletű GLP-1 analógokat tartalmazza (4. számú szekvencia):
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Xaa Xaa Glu Gly Xaa Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Ser Tyr Leu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Phe 29 30 31 32 33 34 35 38 37 Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa R
III általános képletű vegyület (4. számú szekvencia)
Xaa jelentése a 7~es pozícióban L-hisztídín, D-hisztidin, dezamxno~hisztídin, 2-amíno-hísztídin, β-hldroxi-hisztídin, homohísztidin, a-fluorometíl-hisztidin vagy u-meld-hísztidin;
Xaa jelentése a 8-as pozícióban Gly, Alá, Val, Leu, He, Ser, vagy Thr;
Xaa jelentése a 11-es pozícióban Asp, Glu, Arg, Thr, .Alá, Lys, vagy Hi s;
2C
Xaa jelentése a 12-es pozícióban His, Trp, .Phe, vagy Tyr;
Xaa jelentése a ló~os pozícióban ben, Ser, Thr, Trp, His, Phe,
Asp, Val, Tyr, Glu, vagy Alá;
Xaa jelentése a 22-es pozícióban: Giy, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg vagy Lys;
Xaa jelentése a 23-as pozícióban His, Asp, Lys, Glu, vagy Gin; Xaa jelentése a 24-es pozícióban Glu, His, Alá, vagy Lys;
Xaa jelentése a 25-ós pozícióban; Asp, Lys, Glu vagy His;
Xaa jelentése a 27-es pozícióban Alá, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, vagy Lys;
Xaa jelentése a 30-as pozícióban Alá, Glu, Asp, Ser, vagy His;
Xaa jelentése a 33-as pozícióban Asp, Arg, Val, Lys, Alá, Giy vagy
Glu;
Xaa jelentése a 34-es pozícióban Glu, Lys, vagy Asp;
Xaa jelentése a 35-ös pozícióban Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Giy, Pro, His, vagy Glu;
Xaa jelentése a 3ö-os pozícióban Arg, Glu, vagy His;
R jelentése a 37-es pozícióban Lys, Arg, Tbr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe His, Oly, Gly-Pro, vagy ki van vágva.
A GLP-1 vegyületek egy másik előnyben részesített csoportja a IV általános képletű GLP-1 analógokat tartalmazza (5. számú szekvencia):
8 9 10 11 12 13 1.4 15 16 17
Xaa Xaa Glu Oly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Ser Tyr Leu Glu Xaa Xaa Ála Alá Xaa Glu Phe
30 31 32 33 34 35 36 37 He Xaa Trp Leu Val Lys Xaa Arg R
IV általános képletű vegyület (5. számú szekvencia} amiben:
no-hisztidin, 2-ammo-hisMidin, β-hidroxi-hisztidxn, homohisztidin, a-fluorometil-hisztidin vagy a-metíl-hisztídm;
Xaa jelentése a 8-as pozícióban Gly, Alá, Val, Leu, lle, Ser, Met, vagy Thr;
Xaa jelentése a 12-es pozielóban His, Trp, Phe, vagy Tyr;
Xaa jelentése a 16-os pozícióban Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe,
Asp, Val, Tyr, Gin, vagy Alá;
Xaa jelentése a 22-es pozícióban: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg vagy Cys;
Xaa jelentése a 23~as pozícióban His, Asp, Lys, Glu, vagy Gin; Xaa jelentése a 26-os pozícióban: Asp, Lys, Glu vagy His;
Xaa. jelentése a 30-as pozícióban Alá, Glu, Asp, Ser, vagy His;
Xaa jelentése a 35-os pozícióban Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr,
Phe, Asp, Glv, Pro, His, vagy Glu;
R jelentése a 37-es pozícióban Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp,
Trp, Tyr, Phe His, Gly, Gly-Pro, vagy ka van vágva.
A GLP-1 vegyületek egy másik előnyben részesített csoportja a V általános képletü GLP-1 analógokat tartalmazza (6, számú szekvencia):
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Xaa Xaa Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Φ φ * X *** φ φ
* *«
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Sex* lyr Leu Glu Xaa Xaa Xaa Alá Lys Glu Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Ile Xaa Trp Leu Val Lys Gly Arg R
V általános képletű vegyüiet (6. számú szekvencia)
Xaa jelentése a 7-es pozícióban L-hlsztídin, B-hisztidín, dezamlno-hlsztidin, 2-amino-hÍsztidin, β-bldroxi-hisztidln, homohisztídín, a-fluorometíl-hisztidin vagy a-metil-hisztidin;
Xaa jelentése a 3~as pozícióban Gly, Alá, Val, Leu, Ile, Ser vagy Thr;
Xaa jelentése a 22-es pozícióban: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg vagy Cy s;
Xaa jelentése a 23-as pozícióban His, Asp, Lys, Glu, vagy Gin;
Xaa jelentése a 30-as pozícióban Alá, Glu, Ásp, Ser, vagy His;
R jelentése a 37-es pozícióban Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp,
Trp, Tyr, Pbe, His, Gly, Gly-Pro, vagy ki van vágva.
A L II, 111, IV és V általános képletű, előnyben részesített
GLP-1 vegyületek olyan GLP-1 analógokat, a GLP-1 analógok fragmenseit tartalmazzak, amikben az analógok vagy íragmensek a 8-as pozícióban az alanintől eltérő amlnosavat tartalmaznak (8as pozíció analógok). Áz az előnyös, ha ezek a 8-as pozíció analógok a természetes GLP-1(7-37)OH megfelelő aminosavaival Összehasonlítva egy vagy több további változást tartalmaznak a 9-es, 11-es, 12-es, 16-os, 18-as, 22-es, 23-as, 24-es, 26-os, 27es, 30-as, 3 l-es, 33-as, 34-es, 35-ös, 36-os és 37-es pozícióban. Az is előnyös, ha ezekben az analógokban a természetes GLP25 χφφφ ** «Γ Φφφφ ♦ •φ»
1(7~37)ΟΗ vagy a GLP-1{7-67)OH természetes aminosavaihoz viszonyítva hat, vagy annál kevesebb változás van, Az inkább előnyben részesített analógokban 5 vagy kevesebb változás van a természetes GLP-I|7-37)OH vagy a GLP-1 (7~67}QH természetes aminosavaihoz viszonyítva, vagy 4 vagy kevesebb változás van a természetes GLP-1(7-37)OK vagy a GLP-1(7~67|OH természetes aminosavaihoz viszonyítva. Az még előnyösebb, ha ezekben az analógokban 3 vagy kevesebb változás van a természetes GLP1(7-37)ÖH vagy a GLP-1 (7~67)OH természetes aminosavaihoz viszonyítva. Az a legelőnyösebb, ha ezekben az analógokban 2 vagy kevesebb változás van a természetes GLP-1(7-37)OH vagy a GLP--1 (7-ő?)OH természetes aminosavaihoz viszonyítva.
.Kiderült, hogy a 11, III, IV és V általános képletü vegyületeknek kisebb a hajlamuk aggregátumok képzésére és oldhatatlan formák kialakítására. Ez is fontos egy fúziós fehérje összefüggésében, amiben a viszonylag kis GLP-1 pepiidnek meg kell tartania az aktív konformációját, annak ellenére, hogy egy nagyobb fehérjéhez van fúzionáltatva. A jelen találmány szerinti fúziós fehérjékben előnyben részesített 11, III, IV és V általános képletü vegyületek GLP-1 analógokat vagy a GLP-1 analógok fragmenseit tartalmaznak, amikben a 22-es pozícióban levő glieint, és előnyösen a 8-as pozícióban levő alanint egy másik aminosav helyettesíti,
Ka a 22-es pozícióban aszparaginsav, glutaminsav, orgiáin vagy lizín van, akkor a 8-as pozícióban előnyösen glicin, vaiin, leucín, izoleucin szerin, treonín vagy melionin van, még előnyö24 sebben valin vagy glicin. Ha a 22-es pozícióban egy szulfonsav, azaz például ciszteins&v van, akkor a 8-as pozícióban előnyösen glicin, valin, lenéin, ízoleuein, szerin, treonin vagy metionin van, még előnyösebben valin vagy glicin van.
Más előnyben részesített GLP-1 vegyület lehet a IV általános képletü GLP-1 analóg (5. számú szekvencia), amiben az analógok a GLP-X(7~37)0H szekvenciájával rendelkeznek, azzal a különbséggel, hogy a 8-as pozícióban levő aminosav előnyösen glicin, valin, leueín, ízoleuein, szerin, treonin vagy metionin, még előnyösebben valin vagy glicin, és a 30-as pozícióban glutaminsav, aszparagjnsav, szerin, vagy hisztidin van, még előnyösebben glutaminsav.
Más előnyben részesített GLP-1 vegyület lehet a IV általános képletü GLP-1 analóg (5. számú szekvencia), amiben az analógok a GLP-1 (7-37)0H szekvenciájával rendelkeznek, azzal a különbséggel, hogy a 8-as pozícióban levő aminosav előnyösen glicin, valin, lencin, ízoleuein, szerin, treonin vagy metionin, még előnyösebben valin vagy glicin, és a 37-es pozícióban hiszridm, lizin, arginin, treonin, szerin, glutaminsav, aszparagínsav, triptofán, tirozin, íenilalanin és még előnyösebben hísztidín.
Más előnyben részesített GLP-1 vegyület lehet a IV általános képletü GLP-1 analóg (5. számú szekvencia), amiben az analógok a GLP-1(7-37)011 szekvenciájával rendelkeznek, azzal a különbséggel, hogy a 8-as pozícióban levő aminosav előnyösen glicin, valin, leueín, ízoleuein, szerin, treonin vagy metionin, még előnyösebben valin vagy glicin, és a 22-es pozícióban glutamin* *
X *** χφ* ΦΧ* ** **
η.
*♦ * sav, lizin, aszparaginsav vagy arginín van, és még előnyösebben glutaminsav vagy lizin van, és a 23-as pozícióban lizin, arginin, glutaminsav, aszparaginsav és hisztidin van, még előnyösebben lizin vagy glutaminsav van.
Más előnyben részesített GLP-1 vegyüiet lehet a V általános képletű GLP-1 analóg (6. számú szekvencia), amiben az analógok a GLP-1(7-37)OH szekvenciájával rendelkeznek, azzal a különbséggel, hogy a 8-as pozícióban levő amínosav előnyösen glicin, valin, leucin, izoleucbi, szerin, treonin vagy metíonin, még előnyösebben valin vagy glicin, és a 22-es pozícióban glutaminsav, lizin, aszparaginsav vagy arginin van, és még előnyösebben glutaminsav vagy lizin van, és a 27-es pozícióban alanin, lizin, arginin, tríptofán, tirozin, fenilalanin vagy hisztidin van, még előnyösebben alanin van.
Más előnyben részesített GLP-1 vegyüiet lehet a II általános képlet GLP-1 analóg, amiben az analógok a GLP-1(7-37)OH szekvenciájával rendelkeznek, azzal a különbséggel, hogy a. 8-as pozícióban, és az alábbi csoportból választva egy, kettő vagy három amínosav eltér a természetes GLP~lf7-37)ÖH megfelelő pozíciójában levő aminosavaktób 9-es pozíció, 11-es pozíció, 12-es pozíció, 16-os pozíció, 18-as pozíció, 22-es pozíció, 23-as pozíció, 24-es pozíció, 26-os pozíció, 27-es pozíció, 3ö-as pozíció, 31-es pozíció, 33-as pozíció, 34-es pozíció, 35-ös pozíció, 36-os pozíció és 37-es pozíció.
Más, előnyben részesített H általános képletű vegyületek a következők lehetnek: Val«-GLP-Í(7-37)OH, Gly8-GLP-1 (726
Φ* ί » *
φφ * *
X * ♦ ·*»* φ ΐ φφ-χ ** φ ♦» φφ φ ·♦ » Κ *
Λ« #***'
37)ΟΗ, Ο lu^-GLP-1(7-37)0«, Asp22~GbP~ 1(7-37)0«, Arg33·· GLP-1 {7-37)0«, Lys33-OLP-1(737)0«, Cys22-GLP-1(7-37)OH, Vals-Glu22~GLP-1 (7-37)0«, VaP-Asp^-GLP-1(7-37)0«, VaPΑγ§?2_Ο£Ρ-1(7~37)Ο«, VaH-Lys^-GLP- 1(7-37)0«, Va«-Cys22GLP -1 (7-37)0«, GlyS-Glu^-GLP-1 (7-37)00, Gly«-Asp22-OLP1(7-37)0«, Glys-Arg22-GLP-1(7-37)0«, Gl.y«-Lvs22-<
37)0«, Giy* ,,~22
1(7-36)0«,
-GLP-1(7-37)0«, Glu22GLP~l(7
J22-GLP-1 (7-36)0«, Lys22-GLP-l (7M (7-36)00, Val»-Glu22-GLP 1 (7-36)0«,
L, Val»-Arg22-GLP-1(7-36)0«, Val®-Cys22-GLP~1 (7-36)0«, Gly«-G lu222-GLP-l (7-36)0«, Gly8-Arg22-GLP~
G lys-Lys22-GLP- 1 <7-3 6)0«, Gly8-Cys22-GLP-1 (736) 0«, Lys23-GLP-1(7-37)0«, Val«-Lys23-GLP-1(7Gíy8~tys23~GLP-1(7-37)0«, His2*-GLP-1 (7-37)0«, Val GLP-1 (7-37)00, GlyS-Oiá^-GLP-1 (7-37)0«, Lys2M3LPX (737) 0«, ValS;~Lys24-GLP-1(7-37)0«, Gly»-Lys23-GLP-1(737)0«, Glu30--GLP-1(7-37)0«, Va«-Glu3«-GLP-1(7-1
Gly8-G lu30~GLP-1 (7-37)0«, Asp3*
GLP 1 (7-37)0«, G.lys-Asp30-GLP-1 (7-37)0«, Gln3»-GLP~1 (7 37)00, VaP-G 1 n3»~ GLP-1 (7-37)0«, GlyS-G 1 n3»- GLP-17 37)0«, Tyr3»·· GLP-1(7-37)0«, Va«~Tyr3»-GLP-1 (7-37)0«, Gly3 Tyr3»-GLP~1(7-37)0«, Ser3«-GLP-1(7-37)0«, Va«-Ser3»-GLP 1 (7-37)0«, Glys-Ser^-GLP-1 (7-37)0«, «is3»-GLP-1(7-37)0« VaF-His3»~G LP1-(7-37)0«, Giy3- 0is3»-GLP- 1 (7-37)00,
GLP-1 (7-37)0«, ¥&ls~Gíu34-GLP-1 (7-37)0«, Gly«-Glu3
7-37)0«, VaP-Asp30Gin34φ* **** *» φφ » * * * * * *
Α ♦ * 4*β» ;♦.*. φφ* ** ***
1(7-3 i, Aia34-GLP~ 1(7-37)00, VaF-Ala^-GLP-1(7-37)1 GLP-1 (7-37)0.0, G ly^- GLP-1 (7-37)00, VaF-Gíy^.. 1 (7-37) OH ? Glys-G ly2<GLP-1 {7-37)00, A1 a3S-GLP-1 (737)00, Vals-AIa3S-GLPl(7-37)00, Gly»-Ala3s-GLP-1 (7-37)
Lys35-GLP~ 1 (7-37)00, VaO-Lys33-GLP~ 1 (7-37)OH, Gly^-Lys3»1(7-37)00, His35-GLP-1(7-37)00 VaO-Hís3®~<
37)00, Gly8-O.isss~GLP~ 1(737)00, Pnps-GLP-1(7-37)00, VaOPro35-GLP-1(7-37)00, Gly®~Pro3S_QLP-1 (7-37)00, GIu3s~GLP1(7-37)00 VaÍ8-Glu35~GLP-1(737)00, GIy&-GÍu35-GLP-1 (737)00, Yals~Ala27~GLP~1 (7-37)00, VaP-Ois^-GLP-1 (7-37)00, Vals~Glu22-Lys23~GLP~1(7-37)00, VaO-Glu22~Glu23~GLP-l{737)00, Va>~Glu22~A 1 a22~GLP~1(7-37)00, VaF~G lyM-Lys^GLP-1 (7-37)00, V&P-Ois^-GLP-1 (7-37)00, Gly®-Ois32-GLP1(7-37)00, ¥als-Glu22-Al a27-OLP-lf7-37)OH, Gly3-Gln22Ala27-GLP-~1 (7-37)00, VaO-Lys22-G Iu23-GLP~1 (7-37)00, és Oly»-Lys22-G 1 u23-GLP-1 (7-37)00.
A jelen találmány szerinti GLP-1 analógok és szármaja a VI álla t tartalmazza (7. számú szekvencia)
-x-GIu-GIyíö-Tfer-Phe-Thr-Ser-Ásprs-Val-Ser Ser-Tyr~Leu20~y -Gly-GIn-Ála-Ala25~Lys- z Phe~Ile-Ala3ö-Trp-Leu-Vai-Lys-Gly35“Argvegyölet (7. számú sze amiben
Rí -et a következő csoportból választhatjuk ki: L-hísztidin, D-hisz>hisztiáin, 2-amin.o-hísztídin, 3-1
2£ «χ χ»** ♦*
A * » 4* ,* ♦'», s*% «»♦ **
X* * homohisztidín, u-fluoromedl-hisztidin és a-metil-bisztidin; X-et a kővetkező csoportból választhatjuk ki; Alá, Gly, Val, Thr, lle és alfa-metil-Aia; Y-t a következő csoportból választhatjuk ki: Glu, Gin, Alá, Thr, Ser, és Gly; Z-í a következő csoportból választhatjuk ld: Glu, Gin, Alá, Thr, Ser és Gly; és Rs jelentése Gly-OH.
A jelen találmányban való alkalmazás céljára előnyben ré szesített GLP-1 vegyületek egy másik csoportját a WO 91/11457 számú szabadalmi leírásban ismertették, és Ide lényegében a GLP-l|7-34), a GLP-I(7~35), a GLP-l{7-36) vagy a GLP-lf7~37) tartozik, vagy ezek amid formája, és ezek győgyászatilag elfogadható sóformája, és legalább egy, az alábbi csoportból választható módosítással rendelkeznek;
aj a 26-os és/vagy 34-es pozícióban levő lizin helyettesítése glicinnel, szerinnel, ciszteinnel, treoninnal, aszparagínnal, glutaminnal, tirozinnal, alaninnal, valinnal, ízoleucinnal, leucínnai, metíonínnal, fenilalaninnal, argininnal vagy D-lizinnel; vagy a 36-os pozícióban levő argínin helyettesítése glicinnel, szerbinél, ciszteinnel, treoninnal, aszparagínnal, glutaminnal, tirozinnal, alaninnal, valinnal, ízoleucinnal, leucinnal, metíonínnal, fenilalaninnal, lizinnel vagy D-argininnel;
bj a 3 l-es pozícióban levő tríptofán helyettesítése egy oxidációra rezisztens aminosawal;
e) legalább az egyik alábbi helyettesítéssel: valin helyett tirozin a 16-os pozícióban; szerin helyett lizin a 18-as pozícióban; giutaminsav helyett aszparaginsav a 2l-es pozícióban; glícin helyett szerín a 22-es pozícióban; glutamin helyett argínin a 232ζ ** * / ; ,* χ-’ ** **·* as pozícióban; atanin helyett arginín a 24-es pozícióban; lízin helyett glutamin a 26-os pozícióban; és
d) legalább az egyik alábbi helyettesítéssel: a 8-as pozícióban levő alanin helyettesítése glícinnel, szerinnel vagy ciszteínnel; a 9-es pozícióban levő glutaminsav helyettesítése aszparaginsavval, glicínnel, szerinnel, ciszteinnel, treoninnal, aszparaginnal, glutaminnal, tirozinnal, alaninnal, valínnal, izoleucinnal, leucinnal, metioninnal vágj?· fenilalaninnal; a. 10-es pozícióban levő glícin helyettesítése szerinnel, ciszteinnel, treoninnal, aszparagínnal, glutaminnal, tírozínnal, alaninnal, valínnal, izoleucinnal, leucinnal, metioninnal vagy fenilalaninnal; és a 15-os pozícióban levő aszparaginsav helyettesítése glutanúnsawal; és
e) a 7-es pozícióban levő hísztidin helyettesítése glicinnel, szerinnel, ciszteinnel, treoninnal, aszparaginnal, glutaminnal, tírozínnal, alaninnal, valinnal, izoleucinnal, leucinnal, metioninnal vagy fenilalaninnal, vagy a hísztidin D- vagy N~ acilezett vagy alkílezett formáival; aholis az a), b), d) és e) helyettesítésekben a helyettesített aminosavak adott esetben lehetnek D-formájúak, és a 7-es pozícióban helyettesített aminosavak adott esetben lehetnek N-acílezett vagy N-alkilezett forrnájúak.
Mivel a dipeptídil-peptidáz IV (DPP IV) enzim lehet felelős a beadott GLP-1 gyors in vivő megfigyelt inaktiválásáért (lásd például Mentlein, R. és mtsai: European Journal of Biochemístry 214, 829-835 (1993)), előnyben részesítjük azokat a GLP-1 analógokat és származékokat, amik egy fúziós fehérjében védve vannak a DPP IV 'aktivitásától., és azokat a fúziós fehérjéket.
3€ amikben a GLP-1 vegyület Gly«~GLP-l(7-37)OH, a VaP-GLP-l(737)OH, a-metü~AÍa®~GLP-í(7~37)OH vagy GIy«-Gto21-GLP-1(737)ÖH, még inkább előnyben részesítjük.
A jelen találmányban való felhasználás céljára előnyben részesített GLP-1 vegyületek egy másik előnyben részesített csoportja az 5,512,549 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírásban ismertetett Vll általános képletű (8. számú szekvencia) vegyuletekből áll, amit kifejezetten referenciának tekintünk az alábbiakban.
Rí Alá Glu Giy10
Tbr Phe Tbr Ser Áspis Val Ser Ser Tyr Leu2ö
Glu Giy Gta Alá Ala2S Xaa Glu Phe Ile Alá30
Trp Leu Val Lys Gly3S Arg R3
R2
VII általános képletű vegyület (8. számú szekvencia) amiben
E7~et az alábbi csoportból választjuk ki: 4-ímidazopropionrl, 4ímidazoacetil vagy 4-imidazo-aía dimetil-acetil; R2-ei az alábbi csoportból választjuk kí: Ce-Cro egyenes szénláncü aeilcsoport, vagy hiányzik; R3-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gly-OH vagy NLb; és Xaa lehet Lys vagy Arg.
A jelen találmányban való felhasználás céljára még inkább előnyben részesített IV általános képletű vegyületek azok. amikben Xaa jelentése Arg, és R2 jelentése Ck-Cio egyenes szénláncú aeilcsoport. A jelen találmányban való felhasználás céljára még inkább előnyben részesített IV általános képletű vegyületek
ΦΦ azok, amikben Xaa jelentése Arg, R2 jelentése Cg-Cío egyenes szénláncű acilesoport, és R3 jelentése Gly-OH. A jelen találmányban való felhasználás céljára előnyben részesített további IV általános képletű vegyületek azok, amikben Xaa jelentése Arg, R2 jelentése C&~Cio egyenes szénláncú acilcsoport, R3 jelentése GlyOH és R1 jelentése 4-ímidazopropionil csoport,
A GLF-l vegyületek előnyösen olyan GLP-1 analógokat tartalmaznak, amikben az ilyen analógok vagy fragmensek gerince a 8-as pozícióban az alanintől eltérő amínosavat tartalmaz (8-as pozíciós analógok), A gerinc a 7-es pozícióban tartalmazhat még L-hisztídíni, D-bisztidint, vagy a hísztidin módosított formáit, azaz például dezaminóhisztidínt, 2-amino-hisztidínt, β-bídroxihisztidint, homobisztidint, a-llnorometil-bísztidint vagy a-metílhisztídint, Az az előnyös, ha ezek a 8-as pozíciós analógok a természetes GLP-1(7-37)ÖH megfelelő aminosavaihoz viszonyítva egy vagy több változást tartalmaznak a 12-es, 16-os, I8~as, 19es, 20-as, 22-es, 2S-ös, 27-es, 3Ö-as, 33-as és 37-es pozícióban. Az még előnyösebb, ha ezek a 8-as pozíció analógok természetes GLP-1(7--37)OR megfelelő aminosavaihoz viszonyítva egy vagy több változást tartalmaznak a 16-os, 18-as, 22-es és 33-as pozícióban.
Egy előnyben részesitett megvalósítási mód szerint a GLP-1 analóg olyan GLP-1 (7-37)OH molekula, amiben a 12-es pozícióban levő aminosav triptofán vagy tírozin lehet. Az még előnyösebb, ha a 12-es pozícióban levő helyettesítés mellett a 8-as pozícióban levő amínosavat glícinnel, valínnal, leucínnal, izolen32
-cínnal, szerinnel, treonínnal vagy metíonínnal helyettesítjük, még előnyösebben valinnal vagy glicinnel. Az még előnyösebb, ha a 12-es és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 22-es pozíciót glutaminsawal helyettesítjük.
Egy másik előnyben részesített megvalósítási mód szerint a GLP-1 analóg egy olyan GLP-1(7-37)OH molekula, amiben a 16os pozícióban levő aminosavat a következők közül választjuk ki: triptofán, izoleucin, leucin, fenilalanin vagy tirozin. Az még előnyösebb, ha a 16-os pozícióban végzett helyettesítés mellett a 8as pozícióban levő aminosavat glicinnel, valinnal, leucinnal, izoleucinnal, szerinnel, treonínnal vagy mefioninnal helyettesítjük, még előnyösebben valinnal vagy glicinnel. Áz még előnyösebb, ha a 16-os és S-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 22-es pozíciót glutaminsawal helyettesítjük. Az is előnyős, ha a 16-os és 8~as pozícióban végzett helyettesítés mellett a 30-as pozícióban levő aminosavat glutaminsawal helyettesítjük. Az is előnyös, ha. a 16-os és 8~as pozícióban végzett helyettesítések mellett a 37~es pozícióban levő aminosavat hísztidinnel helyettesítjük.
Egy másik, előnyben részesített megvalósítási mód. szerint a GLP-1 analóg egy olyan GLP-1(7-37)ÖH molekula, amiben a 1.8as pozícióban levő aminosavat. a kővetkező csoportból választhatjuk ki: triptofán, tirozin, fenilalanin, lizin, leucin vagy izoleucin, előnyösen tnptofán, tirozin és izoleucin. Az még előnyösebb, ha a 18-as pozícióban végzett, helyettesítés mellett a 8-as pozícióban levő aminosavat glicinnel, valinnal, leucinnal, izoleu32 einnal, szerinnel, treoninnal vagy metionínnal helyettesítjük, még előnyösebben valinnal vagy glidnnel. Az még előnyösebb, ha a 18-as és 8~as pozícióban levő helyettesítések mellett a 22-es pozíciót glutaminsavval helyettesítjük. Az még előnyösebb, ha a 18a.s és 8-as pozícióban levő helyettesítéseit mellett a 30-as pozíciót glutaminsavval helyettesítjük. Az is előnyös, ha a 18-as és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 37-es pozíciót hisztidinnel helyettesítjük.
Egy másik, előnyben részesített megvalósítási mód szerint a GLP-1 analóg egy olyan GLP-1 (7-37)OH molekula, amiben a 19es pozícióban levő aminosavat a következő csoportból választhatjuk ki: triptofán vagy femlalanin, előnyösen femlalanin. Az még előnyösebb, ha a 19-as pozícióban végzett helyettesítés mellett a 8-as pozícióban levő aminosavat glieínnel, valinnal, leucinnal, izoleucinnal, szerinnel, treoninnal vagy metíoninnal helyettesítjük, még előnyösebben valinnal vagy glieínnel. Az még előnyösebb, ha a 19-es és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett, a 22-es pozíciót glutaminsavval helyettesítjük, Az még előnyösebb, ha a 19-es és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a. 30 as pozíciót glutaminsavval helyettesítjük. Az is előnyös, ba a 19-es és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 37-es pozíciót hisztidínnel helyettesítjük.
Egy másik, előnyben részesített megvalósítási mód szerint a GLP-1 analóg egy olyan GLP-1(7-37)OH molekula, amiben a 20as pozícióban levő aminosavat a következő csoportból választhatjuk ki: fenilalanin, tirozln vagy triptofán. Az még előnyösebb, ha a 2G~as pozícióban, végzett helyettesítés mellett a 8-as pozícióban levő aminosavat glicinnel, váltanál, leucinnal, ízoleucinnal, szertanéi, treoninnal vagy metioninnal helyettesítjük, még előnyösebben váltanál vagy ghcinnel. Az még előnyösebb, ha a 20-as és 8~as pozícióban levő helyettesítések mellett a 22-es pozíciót gtataminsavval helyettesítjük. Az még előnyösebb, ha a 20as és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 30-as pozíciót gtataminsavval helyettesítjük. Az is előnyös, ha a 20-as és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 37-es pozíciót hisztidinnel helyettesítjük.
Egy másik, előnyben részesített megvalósítási mód szerint a GLP-1 analóg egy” olyan GLP-1(7-37)OH molekula, amiben a 25ős pozícióban levő aminosavat a következő csoportból választhatjuk ki: valin, izoleueta és leneín. Az még előnyösebb, ha a 25ös pozícióban végzett helyettesítés mellett a 8-as pozícióban levő aminosavat glicinnel, váltanál, leucinnal, izoleucinnal, szertanéi, treoninnal vagy metioninnal helyettesítjük, még előnyösebben váltanál vagy glictanel. Az még előnyösebb, ha a 25-ös és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 22-es pozíciót glntamtasawal helyettesítjük. Az még előnyösebb, ha a 25-ös és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 30-as pozíciót gtatamtasawal helyettesítjük. Az is előnyős, ha a 25-ös és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 37~es pozíciót hisztidinnel helyettesítjük.
Egy másik, előnyben részesített megvalósítási mód szerint a GLP-1 analóg egy olyan GLP 1(7-37)OH molekula, amiben a 27es pozícióban levő aminosavat a kővetkező csoportból választhatjuk kk izoleucin vagy alanín. Az még előnyösebb, ha a 27-es pozícióban végzett helyettesítés mellett a 8-as pozícióban levő aminosavat glícinnel, valinnal, leucinnal, izoleucinnal, szerinnel, treoninnal vagy metioninnal helyettesítjük, még előnyösebben valinnal vagy glicinnel. Az még előnyösebb, ha a 27-es és 8~as pozícióban levő helyettesítések mellett a 22-es pozíciót glutammsawal helyettesítjük. Az még előnyösebb, ha a 27-es és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 3ö~as pozíciót glutaminsawal helyettesítjük. Az is előnyős, ha a 27-es és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 37-es pozíciót hisztidinnel helyettesítjük.
Egy másik, előnyben részesített, megvalósítási mód szerint a GLP-1 analóg egy olyan GLP~1(7-37)GH molekula, amiben a 33a,s pozícióban levő aminosav izoleucin. Az még előnyösebb, ha a 33-as pozícióban végzett helyettesítés mellett a 8-as pozícióban levő aminosavat glicínnel, valinnal, leucinnal, izoleucinnal, szerinnel, treoninnal vagy metioninnal helyettesítjük, még előnyösebben valinnal vagy glícinnet Az még előnyösebb, ha a 33-as és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 22-es pozíciót glutaminsawal helyettesítjük. Az még előnyösebb, ha a 33-as és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 30-as pozíciót glutaminsawal helyettesítjük. Az ís előnyős, ha a 33-as és 8-as pozícióban levő helyettesítések mellett a 37-es pozíciót hisztidinnel helyettesítjük.
3( «» «»<♦ «ί «* « *« 41« *«**
A GLP-1 vegyületek az alábbi pozíciók közül egyben vagy több-ben rendelkezne! módosításokkal: 8. 12, 16, 18, 19, 20, 22, 25, 27, 30, 33 és 37. Ezek a GLP-1 vegyületek megnőtt potenciát mutatnak a GLP-l(7~37)OH-val összehasonlítva, és a IX általános képletű mninosav szekvenciát tartalmazzák (12. számú szekvencia).
Xaa? Xaag Gin Gly Thr Xaais Thr Ser Asp Xaaie Ser
Xaajg Xaa aj Xaaao Gin Xaaaa Gin Alá Xaa^s Lys Xaagr
Phe lle Xaaso Trp Leu Xaasa Lys Gly Arg Xaau IX általános képletű vegyület {12. számú szekvencia) amiben:
Xaa7 jelentése: L-hisztidin, D-hisztídin, dezamino-hisztidin, 2amino-hisztidin, β-hidroxí-hlsztidine, homobisztidin, afluorometil-hisztídin, vagy a-metil-hisztidin;
Xaas jelentése: Alá, Gly, Val, Leu, lle, Ser, or Thr;
Xaan jelentése : Phe, Trp, vagy Tyr;
Xaai& jelentése: Val, Trp, lle, Leu, Phe, vagy Tyr;
Xaais jelentése: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, lle, Len, Val;
Xaai9 jelentése; Tyr , Trp , vagy Phe ;
Xaaao jelentése Leu, Phe, Tyr, vagy Trp;
Xaaaa jelentése: Gly, Gin, Asp, vagy Lys;
Xaass jelentése: Alá., Val, lle, vág}? Len;
Xaaa? jelentése: Glu, He, vagy Alá;
Xaazo is : Alá vagy Glo
Xaa.33 jelenlése: Val, vagy lle; és
Xaas? jelentése: Gly, His, NHa, vagy’· hiányzik.
» ««»« « '5».1 ί* . ·χ^ χ. # fc-TO φ«**
Néhány előnyben részesített, IX általános képletü GLP-l vegyületet sorolunk lel az alábbiakban; GLP- .1(7-37)00, GLP1 (7-36)-0%, Gly8-GLP-1(7-37)0% Gly8~GLP~1(7-36)0%, Val8GLP-1 (7-37)0% Val«-GLP~1 (7~S6)NH2, Leu8-GLP~ 1(7-37)00, Len8~GLP~l (7-36 )N%, lle8-GLP-l (7-37 )Q% IJe8-GLP~ 1(7-36) NH2, Ser8-GLP-1(7-37) OH, Ser»-GLP~1|7-36)NH2, Thr8-GLP-1 (7-37)00, Thr8-GLP~1 (7-36)NO2, Val»-Tyr * 2~GLP~ 1 (7-37)00, Vals--Tyr12-GLP-1( 7-36)NH2, Val8-Tyri&-GLP-1(7-37)00, Val»Tyr^-GLP-1 (7-36)NH2, VaP-Glu22-GLP~ 1(7-37)00, VaF-Glu22GLP-1(7-36)0%, Gly8~Glu->2-GLP-1(7-37) OH, Gly8-Glu22-GLP~ 1(7-36)NH2j V&)8-Asp22-GLP~ 1(7-37)00, ya«~A8p22~GLP~l(730)NH2, GIy8~Ásp22-GLP-1(7-37)00, Gly8-Asp22~GLP-1 (736)NO2, Vsls-Lys22-GLP-1 (7-37)OH,
36)0%, Gly8Lys22-GLP-1 (7-37)00,
36)N%, Leu8-G 1U22-GLP-1 (7-37)00,
36)NH2, lle8-G lu22-GLP-1(7-37)00,
36)N%, Leu8-Asp22~GLP-1(7-37)0%
36) 0%, he8-Asp22-GLP-1(7-37)00, Ile8-Ásp22~GI,P-1 {7~36)NB2, Len»-Lys22-GLP-1(7-37)00, Leu»-Lys22~GLP- 1(7-36)XH2j ile8Lys22-GLP~ 1 (7-37)00, lle8-Lys22-GLP~ 1 (7-36)NO2, Ser»-Glu^.GLP-1(7-37)00, Ser8-Glu22~GLP-1 (7-36)NO2, Thr8-Ghí22~GLP~ 1 (7-37)00, Thr8-Glu22-GLP-1 (7-36)0%, Ser8Ásp22-GLP~ 1 (737) 00, Ser»-Asp22-GLP-1 <7-36)«%, Thr8~Asp22~GLP~ 1 (737)00, Th.r8-Asp22-GLP-1 (7-36)NH2, Ser8-Lys22-GLP~1(737)00, Ser®-Lys22-GLP~M 7-36) NH2, Thr»-Lys22-GLP~ 1(7-37) OH, Thr8-Lys22~GLP~l(7-36)NB2, Glu22~GLP· 1(7-37)00, Gíu22Val8-Lys22~GLP-l(7Gly8-Lys22-GLP~1(7~
Leu8~Gln22-GLP-l(7ne8-Glu22~GLP-1(7Leu»- Asp22_GLP~ 1(7se
GLP-1 (7-36) ««2, Asp22_GLP-1 (7-37)0«, Asp22-GLP- 1 (7-36) NHa, Lys22-GLP-1 (7-37)OH, Lys22-GLP~!(7-36)NHS, Val«-Ala27GLP-1 (7-37)0«, Va«-Glu22-Ala27~GLP-1 (7-37)0«, VaF-GIu30GLP-1(7-37)0«, ¥al8'Glu30-GLP- 1 (7-36)«%, GlyS-Glu3«-GLP1(7-37) OH, Gly8-Glu30-GLP-l<7~36)N«2, Leu8-Glu3»~GLP-1(737)0«, Leus~Gln3ö~GL-P~ 1(7-36)N%, Iie«-Glu38-GLP~1(737)0«, Oe^-Glu30-GLP-1 (7-38)«%, Ser8-Glu38-GLP~1 (7-37)0«, Sers-Gluso-GLP-1 (7-36}N%, Thr^'Gln^o-GLP-1 (7-37)0«, Thr»~ Glu3ö-GLP-1(7-36)«%» Val»-«is3?-GLP~ 1(7-37)0% VaF-His27GLP-1(7-36)«%» Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH, Gly«-«is37-GLP1 (7-36)«%, LeiF-HÍs37~GLP-1 (7-37)0% Leu®-His37-GLP-1 (736) N%, He8-His37-GLP~ 1 (7-37)0«, Ue«-HIs37-GLP-1 (7-36)«%, Sers~His37-GLP~l (7-37)0«, Ser»-His^-GLP-1(7-36)«%, Thr®His3?-GLP-1(7-37) OH, ThF-«is37-GLP- l(7~36)«Hz>
~ ” veet, ami több helyettesítést tartalmaz, olyan GLP-1(7-37)0« .lehet, amiben a 8-as pozíció valin vagy glicin, a 22-es a 16-os pozíció tirozín, leucin vagy triptofán, a 18-as pozíció tirozín, triptofán vagy ízoleucin, a 25-ös pozíció valin, es a 33-as pozíció Ízoleucin. Más előnyös GLP-1 vegyület
Glu22 GLP-1 (7-37)0% VaF-Tyr^-Phe^-GLP-1 (7-37)0«, VaFTyr-Glu22-GLP~ 1 (7-37)0«, VaF-Trp^_Glu22-GLP-1 (7-37)0«, Va«-Leu^-Glu22-GLP-1 (7-37)0% Va lMle*8~Glu22~GLP~1 (737) 0«, V&F-Phe36-G.lu22~GLF-1(7-37)0«; V^lsTr^w..
»*«* »»♦*
GLP-1(7-37)01-1, VaP--Tyr5S-Glu22-GLP-·1(7~3?)ΟΗ, VaH-Phe GIu22-GLP~l{7-37)OH, és VaI8-ne^-Glu22-GLP-l(7-37)OH.
A jelen találmány szerinti GLP-1 vegyületek közé tartoznak az Exendin vegyületek is. Az Exendín-3 és az Exendin-4 biológiailag aktív peptidek, amiket először a Halodermitadae gyík mérgéből. Izoláltak, és kimutatták, hogy kötődik a GLP-1 receptorhoz, valamint stimulálja a cAMP-dependens H s' termelést az emlős fali sejtekben. Mind az Exendin-3, mind az Exendin-4 39 amínosavbol állő pepiid, amik körülbelül 53%--bán homológok a GLP-1-gyei A GLP-1 aktivitás potens agonistáiként hatnak. Érdemes megjegyezni, hogy az Exendinnek egy N-terminálisán csonkított származéka, ami Exendin (9-39 aminosav) néven ismert, az Bxendin-3, az Exendin-4 és a GLP-1 inhibitora.
Egy Exendin vegyület tipikus esetben tartalmaz egy polipeptidet; aminek az aminosav szekvenciája az Exendin-3, Exendin-4, vagy annak fragmense vagy származéka aminosav szekvenciáját tartalmazza. Az Exendin-3-at és Exendin-4-et az 5,424,286 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetik.
Az Exendin-3 aminosav szekvenciáját a 9. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be:
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
His Ser Asp Giy Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Lys Gin Met Glu Glu Glu Alá Val Arg Len Phe
30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 <
X X
ΦΧ φ * » * ♦ lle Glu Trp Leu Lys Ásn Gly Gly Pro Ser Ser
41 42 43 44 45
Gly Ála Pro Pro Pro Ser (9. számú szekvencia)
Áz Excndin-4 aminosav szekvenciáját a 10. számú szekvenoiavázlaton mutatjuk be:
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
His Glu Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Lys Gin Met Glu Glu Glu Ála Val Arg Leu Phe
30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 lle Glu Trp Leu Lys Ásn Gly Gly Pro Ser Ser 40 41 42 43 44 45
Gly Ála Pro Pro Pro Ser (10. számú szekvencia)
A GLP-l vegyületek közé tartoznak azok az Exendin fragmensek ís, amik olyan poiipeptidek, amiket az Exendin vagy egy Exendin analóg N-terminálisán és/vagy C-terminálisán levő aminosavak közül egynek vagy többnek az eltávolításával kapunk. Emellett a GLP-l vegyületek közé tartoznak azok az Exendin poiipeptidek is, amiket egy vagy több aminosavnak az Exendin vagy' egy Exendin analóg ^-terminálisához és/vagy C-terminálisálioz való hozzáadásával kapunk. Az ilyen típusú vegyületek körülbelül maximum 45 aminosavból állnak.
A GLP-l vegyületek közé tartoznak az „Exendin analógok*. Egy Exendin analóg elegendő homológiát mutat az Exendin-441 gyei, az Exendín-3-mal, vagy annak iragmensével, oly módon, hogy az analóg .inzulinotróp aktivitással rendelkezik. Áz Exendin fragmensek és/vagy analógok aktivitás ín aííro esszékkel becsülhető meg, azaz például olyanokkal, amiket az EP 619,3.22 számú szabadalmi leírásban és az 5,120,712 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetnek.
Egy Exendin analóg előnyösen az Exendin-4, vagy annak fragmense aminosav szekvenciájával rendelkezik, úgy módosítva, hogy egy, kettő, három, négy vagy őt aminosav tér el az Exendin4 vagy az Exendin~4 fragmense megfelelő pozíciójában levő aminosavtöh Az Exendin vegyületek jelölésére az alábbiakban használt nomenklatúrában jelezzük a helyettesítő aminosavat és annak pozícióját a kiindulási struktúra előtt. Például a ValsExendin-4 jelölés egy olyan Exendin vegyüíetet jelöl, amiben az Bxendln~4-ben normális körülmények között a 8-as pozícióban található glicin valinnal van helyettesítve.
A GLP-1 vegyületek egy másik csoportja a VIII általános
8 9 10 11. 12 13 14 15 16 17
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Alá Xaa Xaa Xaa Phe
30 31 32 33 34 35 36 37 lle Xaa Trp Leu Xaa Xaa Gly Xaa R
VIII általános képletü vegyük! fi t. számú szekvencia) amiben:
4$ «ΦΧ ΧΦ**
Xaa jelentése a 7~es pozícióban L-hisztidín, D-hísztidin, dezamino-hisztidln, 2-amino-hlsztidín, β-hidroxi-hisztidin, homobísztldin, a-fluorometil-hisztídin vagy a-metil-hisztidin;
Xaa jelentése a 8-as pozícióban Gly, Alá vagy Val;
Xaa jelentése a lö-os pozícióban ben vagy Val;
Xaa jelentése a 18-as pozícióban Lys vagy Ser;
Xaa jelentése a 19-es pozícióban Gin vagy Tyr;
Xaa jelentése a 20-as pozícióban Met vagy Leu;
Xaa jelentése a 22-es pozícióban Glu vagy Gin;
Xaa jelentése a 23-as pozícióban Glu vagy Gin;
Xaa jelentése a 25-ös pozícióban Val vagy Alá;
Xaa jelentése a 2ó-os pozícióban Arg vagy Lys;
Xaa jelentése a 27~es pozícióban Leu, vagy Glu;
Xaa jelentése a 38-as pozícióban Glu vagy Alá;
Xaa jelentése a 33-as pozícióban Val, vagy Lys;
Xaa jelentése a 34-es pozícióban Asn, vagy Lys;
Xaa jelentése a 36~os pozícióban Gly, vagy Arg; és a 37-es pozícióban levő R jelentése Gly, Pro, Pro-Ser-Ser-Gly-AlaPro-Pro-Pro-Ser, vagy hiányzik. Az ebbe a nembe tartozó 18 különböző faj aktivitását a 6. táblázatban adjuk meg.
A jelen találmányban jól használható további Exendín analógokat a WO 99/25728 számú szabadalmi leírásban (Beeley és munkatársai), WO 99/25727 számú szabadalmi leírásban (Beeley és munkatársai), a WO 98/05351 számú szabadalmi leírásban (Young és munkatársai), a WO 99/40788 számú szabadalmi leírásban (Young és munkatársai), a WÖ 99/0744 számú
X *«««
43:
««« * ♦ «λ» *#* szabadalmi leírásban (Beeley és munkatársai) és a WO 99/43708 számú szabadalmi leírásban (Knudsen és munkatársai) írják le.
A jelen találmány szerinti GLP-1 fúziós fehérjék tartalmazhatnák glikozilezési helyeket, A glíkozilezés egy kémiai módosítás, amiben cukor egységeket adunk a fehérje specifikus pontjaihoz. A fehérjék glikozilezése szerepet játszik az érő fehérje helyes töltésében, es stabilitásában, és a fehérjét a sejt felszínére képes irányítani, ami végűi a fehérje szekrécióját eredményezi. Az a legfontosabb, hogy a glíkozilezés befolyásolja számos fehérje in távo kiűrúlési sebességét. A cukrok, lehetnek O-kapcsolt vagy N-kapcsolt cukrok. Az O-kapcsolt cukrok általában a szerin és treonín hídroxi-csoportjának oxigénjéhez kapcsolódnak, míg az N-kapcsolt cukrok az aszparagin amid nitrogénjéhez kapcsolódnak. Az N-glikozfiezése konszenzus helye az Asn XI X2, amiben XI jelentése Pro kivételével bármilyen aminosav, X2 jelentése pedig Ser vagy Thr.
Á GLP-1 vegyületek általában ín vívó nem glikozileződnek; azonban érdekes módon azok a jelen találmány szerinti GLP-1 fúziós fehérjék, amik' egy olyen GLP-1 vegyületet tartalmaznak, aminek a C-terminálisa fuzionál egy Pc szekvenciához, glíkozilezve vannak a C-terminális extenzió utolsó szerinjén (SSGAFPPS*), és az Fc N-terminális régiója 11-es pozíciójában levő treonínon (AEPKSCDKTHT^CPPC , .
Heterolőg Pc fúziós fehéri ék
V
Az előzőkben Ismertetett GLP-1 vegyületek közvetlenül, vagy egy pepiid Hnkeren keresztül fürionáltathatök egy immunglobulin Fc részéhez.
Az immunglobulinok olyan molekulák, amik diszulfidhidakkal összetartott polipeptid láncokat tartalmaznak, tipikus esetben két könnyű láncot és két nehéz láncot tartalmaznak. Az egyes láncokban az egyik dómén (V) rendelkezik egy variábilis amínosav szekvenciával, ami a molekula ellenanyag specifitásátől függ. A többi doménnek (Cj meglehetősen állandó a szekvenciája, ami az ugyanabba az osztályba tartozó molekulákban közös.
A továbbiakban egy immunglobulin Fc része szakkifejezés jelentése az, amit az immunológia területén általában a szakkifejezésnek tulajdonítanak. Specifikusan, ez a szakkifejezés egy olyan ellenanyag fragmensre vonatkozik, anit úgy kapunk, hogy az ellenanyaghői eltávolítjuk a két antigén-kötő régiót (a Fab fragmenseket). Á Fab fragmensek eltávolításának egyik módja az, ha az immunglobulint papain proteázzal emésztjük. Tehát az Fc rész mindkét nehéz lánc konstans régiójának körülbelül azonos méretű fragmenseiből keletkezik, amik nem-kovalens kölcsönhatások és díszulfid-hidak révén asszociálödnak. Az Fc régió tartalmazhatja a csukló régiókat, és a CH2 és CH3 doméneken keresztül kiterjedhetnek az ellenanyag C-terminálisáha. A humán és egér immunglobulinok reprezentatív csukló régiói negtaláih&tók a szakirodalomban jAntibody Engmeering, A Pracfical Guide, szerk.: Borrehaeck, C.A.K., W.H. Freeman and Go. (1992), amely publikációt a továbbiakban referenciaként •X * * <» ο «
V * * t»*« * **» χ
X ».ν «
»4Wx *$♦ kezelünk). Az Pc rész tartalmazhat még egy vagy több glikozilezési helyet. Egy reprezentatív Pc fehérje aminosav szekvenciája, ami tartalmaz egy csukló régiót, CH2 és CH3 domént, és egy Nglikozílezési helyet a 82-es pozícióban, az 1 < ábrán látható.
A humán immunglobulin Pc régióknak őt különböző típusa van, különböző hatással és farmakokinetikai tulajdonságokkal; IgG, IgA, IgM, IgD és IgE. A szérumban legnagyobb mennyiségben az ÍgG fordul elő. Emellett bármelyik immunglobulin közül az IgG-nek a leghosszabb a felezési ideje szérumban (23 nap). Más immunglobulinoktól eltérően, az ÍgG hatékonyan recírkulálődik egy Pc receptorhoz való kötődés után, Négy IgG alosztály van (Gl, G2, G3, és 04), amiknek különböző , efyáduí-uk vagy funkciójuk. A Gl, G2 és G3 kötődhet a Clq-boz és fixálja a komplementet, míg a G4 nem képes erre. Még tatkor is, ha a G3 hatékonyabban képes kötni a Clq-t, mint a Gl, a Gl hatékonyabb a komplement-vezérelt sejtlizis befolyásolásában. A G2 nagyon kis hatékonysággal képes kötni a komplementet. Az IgGben a Clq kötőhely a GH2 dómén G-terminális régiójánál található.
Az összes ígG alosztály képes kötődni az Pc receptorokhoz (CD 16, CD 32, CD64), a Gl és G3 aktívabb, mint a G2 és a G4. Az IgG Pc receptort kötő régiója a CH2 dómén csukló- és C-terminális régiójában található csoportokból alakul ki.
Az IgG mind monomer, mind dimer formában létezik, amiket egy J-lánc tart össze. Az IgÁ a második legnagyobb mennyiségben előforduló lg a szérumban, de felezési ideje csak 6 x^. 99 ** ’ « * ν * * Φ Φ ΦΦ . Φχ» ΛΦ-. * *
Φ * Φ Φ $ *2ν« W **α **»* #»* nap. Az IgA~nak három εφΑάοκχ és funkciója van. Kötődik egy IgA specifikus receptorhoz a makrofágokon és eozinofilokon, ami meghajtja a fagöcitőzist illetve a degranuiáciőt. Képes a komplement fixálására is, egy ismeretlen alternatív biosdntézis úton. keresztül· .Az IgM pentamer vagy hexamer formában expresszálódik, amiket egy J-láne tart össze. Az IgM felezési ideje szérumban 5 nap. Gyengén kötődik a Clq-hoz, a CH3 doménjében levő kötőhelyen keresztül. Áz IgD felezési Ideje három nap szérumban. Az nem ismert, hogy ennek az Ig~nak milyen ebkkíom és funkciója van. Az IgE egy monomer lg, és felezési Ideje szérumban 2,5 nap. Az IgE két Fe receptorhoz kötődik, ami vezérli a degranuiáciőt és pro-gyulladásos ágensek felszabadulását eredményezi.
A kívánt In. mw hatástól függően a jelen találmány szerinti heterolőg fúziós fehérjék tartalmazhatják bármelyik előzőkben ismertetett izotípust, vagy tartalmazhatnak mutált Fc régiókat, amikben a komplement és/vagy Fc receptor kötési funkciók megváltoztak. Tehát a jelen találmány szerinti heterolőg fúziós fehérjék tartalmazhatják egy immunglobulin teljes Fe részét, egy immunglobulin Fc részének iragmensét, vagy ezek analógját, egy GLP-1 vegyulethez fúzíonáltatva.
A jelen találmány szerinti fúziós fehérjék lehetnek egyláncú fehérjék, vagy tóbbláncú polipeptidek formájában. Két vagy több Fc fúziós fehérjét úgy állíthatunk elő, hogy diszulfid-hidakon keresztül lépnek kölcsönhatásba, amik természetes körülmények között alakulnak ki az Fc régiók kozott. Ezek a multimerek lehet’ ♦ *«* » » »:♦« .»·* *· ***’ nek homogének a GLP-1 vegyüiet szempontjából, vagy tartalmazhatnak különböző GLP-1 vegyületeket, a fúziós fehérje Fc része N-terminálisán fúzionáltatva.
A fúziós fehérje végső struktúrájától függetlenül az Fc vagy Fc-szerü régiónak azt a célt kell szolgálnia, hogy meghosszabbítsa az N-terminálison fúzionáltatott GLP-1 vegyüiet in feoo plazma felezési idejét. Emellett a füzionáltatott GLP-1 vegyületnek meg kell tartania valamennyit a biológiai aktívitásábői. A felezési idő növekedése demonstrálható a 7. példában bemutatott módszerrel» amiben a fúziós fehétje felezési idejét hasonlítjuk össze a GLP-1 vegyületnek magának a felezési idejével. A biológiai aktivitást a szakterületen ismert in feao és ín feírn módszerekkel határozhatjuk meg. A reprezentatív biológiai esszéket a ó., 8. és 9. példában ismertetjük.
Mivel az IgG proteolizissel előállított Fc régiójának ugyanaz az ín fenő felezési ideje, mint az intakt IgG molekulának, és a Fab fragmensek gyorsan lebomlanak, az a vélemény alakult ki, hogy a felezési idő meghosszabbításához releváns szekvencia a CH2 és/vagy CH3 doménekben van. Emellett a szakirodalomban közölték, hogy a nagy affinitású Fc receptorhoz vagy a Clq-hoz nem kötődő IgG variánsok katabolikus sebessége nem különböztethető meg a kffnduiásí vad-típusú ellenanyag kíürülésí sebességétől, jelezve ezzel, hogy a katabolikus hely nem azonos azzal a hellyel, ami az Fe receptorhoz vagy a Clq-hoz való kötődésben vesz részt (Wawrzynczak és mtsai: Molecular Immunology 29, 221 (1992)f A rágcsáló Fc régiót használó helyspeeifikus mutage4g » *· *X nézte vizsgálatok azt sugallják, hogy a katabolikus sebességet található.
Ezeknek a vizsgálatoknak az alapján az Fc régiók a katabolifcus helyen módosíthatók, hogy optimalizáljuk a. fúziós fehérjék felezési idejét. Az az előnyős, ha a jelen találmány szerinti, fúziós fehérjékhez használt Fc régiók egy IgGl vagy IgG4 Fc régióból származhatnak. Az még előnyösebb, ha. az Fc régió az lgG4, vagy az igG4-boI származik. Az IgG Fc régió mind a CH2, mind a CHS régiót tartalmazza, beleértve a csukló régiót is.
Heterolög albnmin fúziós fehérjék
Az előzőkben ismertetett GLP-l vegyületek albuminhoz, vagy annak analógjához, fragmensébez, vagy származékához fúzionáltatbatók közvetlenül, vagy egy peptid linkeren keresztül.
A jelen találmány szerinti fúziós fehérjék részét képező albumin fehérjék általában származhatnak bármilyen fajból klónozott albnminbőh Azonban a humán albnmin és fragmenseit részesítjük előnyben, hogy csökkentsük annak kockázatát, hogy a fúziós fehérje immunogén legyen az emberekben. A humán szérum-albumin (HSA) egyetlen, nem-glikozilezett polipeptíd .láncból áll, aminek molekulasúlya 66,500. A humán szérumalbumin aminosav szekvenciáját a 2. ábrán mutatjuk be fMeloun és mtsai: FEBS Letters 58, 136 (1975); Behrens és mtsai: Fed. Proc. 34, 591 (1975); Lawn és mtsai; Nucleíc Ácids Research 9, 6102-6114 (1981); Mingheití és mtsai: Journal of Biologícal
Chemistry 261,. 6747 (1986)j, Az. albumin számos különböző polimorf variánsát valamint analógját és fragmensét írfák le [Weltkamp és mtsai: Ann. Hűm, Génét. 37, 219 (1973)). Például az BP 322,094 számú szabadalmi leírásban a bejelentők a HSA különböző rövidebb formáit ismertetik. Ezek közül a fragmensek közül megemlítünk néhányat: HSA (1-373), HSA (1-383), HSAfl389), HSA(1~369) és HSÁ(1~419), valamint az 1-369 és 1-419 közötti fragmensek. Az BP 399,666 számú szabadalmi leírásban olyan albumin fragmenseket ismertetnek, amik tartalmazzák a HSA(l-177}-et és a RSA(l-200j-at, valamint a HSA(1-177) és HSA(1-200) közötti fragmenseket.
Az nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerinti heterológ fúziós fehéijék közé tartoznak azok a GLP-1 vegyületek, amik bármilyen albumin fehérjéhez vannak kapcsolva, beleértve azokat a fragmenseket, analógokat és származékokat, amikben az ilyen fúziós fehérje biológiailag aktív, és a. plazmában hosszabb a felezési ideje mint a GLP-1 vegyúletnek önmagában. Tehát nem szükséges, hogy a fúziós fehérje albumin részének a. plazma felezési ideje azonos legyen a természetes humán albumínéval. Az olyan fragmensek, analógok és származékok ismertek vagy előállíthatok, amiknek hosszabb a felezési idejük, vagy a felezési idejük a természetes humán albumin és a számunkra érdekes GLP-1 vegyület felezési ideje között van..
A jelen találmány szerinti heterológ fúziós fehérjék közé tartoznak azok a fehérjék is, amik konzervatív amínosav helyettesítéseket tartalmaznak a fúziós fehérje GLP-1 vegyületében, se $
<XS Λ *
Φ,-ή.
és/vagy Fc vágj® albumín részében. A „konzervatív helyettesítés® jelentése egy aminosav helyettesítése egy másik aminosawal, aminek ugyanakkora a nettó elektromos töltése, és a megközelítő mérete valamint alakja, Áz alifás vagy helyettesített alifás arninosav oldalláneokkal rendelkező aminosavak hozzávetőlegesen azonos méretűek, ha az oldalláncúkban levő szén- és heteroatomok össz-száma maximum néggyel tér el. Körülbelül ugyanaz az alakjuk, ha oldalláncúkban az elágazások száma maximum eggyel tér eí Az oldalláncúkban fenil- vagy helyettesített fenil csoportokat tartalmazó aminosavakat azonos méretűnek és alakúnak tekintik, Ha a későbbiekben külön nem specifikáljuk másképpen, akkor a konzervatív helyettesítéseket előnyösen természetes annnosavakkal hajt juk végre.
Azonban a továbbiakban az „aminosav* szakkifejezést a legszélesebb értelemben használjuk, ide tallóznak a természetes aminosavak, valamint, a nem-természetes aminosavak, beleértve az aminosav analógokat és származékokat. Az utóbbiak közé tartoznak az aminosav egységet tartalmazó molekulák. Á szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, ennek a széles körre kiterjedő definíciónak a fényében, hogy ha az alábbiakban aminosavra hivatkozunk, akkor ez lehet például természetes proteogén L-aminosav; D-aminosav, kémiailag módosított arninosav, azaz például aminosav analógok és származékok, természetes nem-proteogén aminosavak, azaz például a norleucín, βalanín, ornítin, GABA, stb; és kémiailag szintetizált vegyületek, amikről a. a szakterületen ismert, hogy az aminosavak tulajdonSí ságalra jellemzőek. A továbbiakban a wproteogén* szakkifejezés arra utal, hogy az aminosav beépíthető egy pepiidbe, poiípeptidhe vagy fehérjébe egy sejtben, a meíabolikus hioszintézis úton keresztül.
A nem-természetes arninosavak, beleértve a szintetikus nem-természetes arninosavak, helyettesített arninosavak, vagy egy vagy több D-aminosav beépítése a jelen találmány szerinti heterológ fúziós fehérjékbe számos különböző módon előnyös lehet. A D-aminosavat tartalmazó fehérjék, stb. megnőtt in vibuvagy in fonó stabilitással rendelkeznek, az L-aminosavakat tartalmazó párjukkal összehasonlítva. Tehát a peptidek, stb. konstrukciója, D-aminosavak beépítése, különösen hasznos leheti, ha nagyobb mtraceünláris stabilitás kívánatos vagy szükséges. Pontosabban, a D-peptidek, stb. rezisztensek az endogén peptádázokra és proteázokra, ezzel m nioo jobb biológiai hozzáférhetőséget és hosszabb élettartamot biztosítanak a molekulának, ha az ilyen tulajdonságok kívánatosak. Emellett a D-peptídeket, stb. nem lehet hatékonyan processzálni a fő hisztokompatibílitási komplex Π-es osztályra korlátozott bemutatásához T segítő sejtekhez, és ezért kevésbé valószínű, hogy humorálís immunválaszokat indukálnak a teljes szervezetben.
A jelen találmány szerinti különböző polipeptídek struktúra/ funkció elemzése mellett számos más faktor is van, amiket figyelembe lehet venni, ha a helyettesítéshez aminosavakat választunk ki. Az egyik faktor, amit figyelembe lehet venni az ilyen változtatások végrehajtásánál, az arninosavak hídropátiás indexe.
»*·»’
Φ φ*« φ * Κ φ ΦΦ
A hidropátiás aminosav index fontosságát az interaktív biolő^ai funkció egy fehérje számára való biztosításában Kyte és Doolittie tárgyalta {Kyte és Doolittie: Journal of Moiecular Bíology 157, 105-132 (1982)), Az elfogadott, hogy az aminosavak relatív hidropátiás karaktere hozzájárul a keletkező fehérje szekunder struktúrájához. Ez viszont befolyásolja a fehérjének .más molekulákkal, azaz például enzimekkel, szubsztrátokkal, receptorokkal, ligandumokkal, DMS-sel, ellenanyagokkal, antigénekkel, stb, való kölcsönhatását, A hídroíobieitási és töltési jellemzők alapján az egyes aminosavakhoz a következő hidropátiás indexet rendelték hozza: ízoleuein (+4,5); valin (4-4,2); lencin (4-3,8); fenilalanin (4-2,8); cisztein/cisztin (+2,5); metionin. <4-1,9); alanin (4-1,8); glícin (-0,4); treonin (-0,7); szerin (-0,8); triptofán (-0,9); tirozín (-1,3); prolin (-1,6); hisztidin (-3,2); glutamát/glutamin/aszpartát/aszparagín (-3,5); lizin (-3,9); és arginin (-4,5),
Amint az a szakterületen ismert, egy pepiidben, polipeptidben vagy fehérjében bizonyos aminosavak helyettesíthetők más, hasonló hidropátiás indexszel vagy értékkel rendelkező aminosavakkal, és ez egy olyan pepiidet, stb. eredményez, aminek hasonló, vagy éppen jobb a biológiai aktivitása. Az ilyen változtatások végrehajtásakor az az előnyös, ha a ±2-n belüli hidropátiás indexszel rendelkező amínosavat használunk helyettesítésre. Azok még előnyösebb helyettesítések, amikor az aminosavak hidropátiás indexe ±l-en belül van. Azok a legelőnyösebb helyettesítések, amiknél az aminosavak hidropátiás indexe ±0,5ón belül van,
Sí χφ * Κ X
A hasonló aminosavak a hidrofilitás alapján is helyettesíthetők. Az 5,554,101 számú Amerikai Egyesült Áüamok-belí szabadalmi leírásban leírják, hogy egy fehérje legmagasabb lokális átlagos hrdroSlitása, amit a szomszédos aminosavak hidrofilitása vezérel, korrelál a fehérje biológiai tulajdonságaival. Az egyes aminosavakhoz az alábbi hidrofilitási értékeket rendelték hozzá; arginin/lizm (+3,0); a szpartát/glu tárn át (+3,0 ±1); szerín (±0,3); aszparagín/glutamin (+0,2); glieín (0); treonin (-0,4); prolin (-0,5 + 1); alanin /hisztidin (-0,5); eisztem (-1,0); metlonin (-1,3); valin (1,5); leumn/ízoleucín (-1,8); tirozln (-2,3); fenilalanin (-2,5) és triptofán (-3,4). Tehát egy peptídben, polipeptídben vagy fehérjében egy aminosav egy másik, hasonló hidrofilitási értékkel rendelkező aminosawal helyettesíthető, és még ekkor is a kapott peptid, stb. hasonló biológiai aktivitással rendelkezik, azaz megtartja a helyes biológiai funkcióját. Az ilyen változások létrehozásakor előnyösen azokat az aminosavakat helyettesítjük egymással, amiknek a hidropátiás indexe ±2-n belül van, azokat inkább előnyben részesítjük, amiknek a hídropátiás indexe +l-en belül van, és leginkább azokat részesítjük előnyben, amiknek a hídropátiás indexe ±0,5őn belül van.
Amint azt az előzőkben ismertettük, a jelen találmány szerinti fúziós fehérjékben végzett aminosav helyettesítések az aminosav öldallánc sznhsztifuensek relatív hasonlóságán alapulhatnak, azaz például a hidrofobításukon, hidrofilításukon, töltésükön, méretükön, stb. Emellett a helyettesítések alapulhatnak a szekunder struktúrához való hajlamok alapján. Például egy « 4>
helikáüs aminosavat egy olyan aminosavval helyettesíthetünk, amik megőrzi a heiikális struktúrát. Azokat a helyettesítéseket, amik figyelembe veszik az előzőkben említett jellemzőket, azzal a céllal, hogy konzervatív aminosav helyettesítéseket kapjunk, amik a jelen találmány szerinti peptidekhen csendes változásokat eredményeznek, annak az osztálynak a tagjai közül választhatjuk ki, amihez a természetes aminosav tartozik, Áz aminosavak az alábbi négy csoportra oszthatók: 1) savas aminosavak; 2) bázikus aminosavak; 3) semleges poláros aminosavak; és ) semleges apoláros aminosavak.
A jelen találmány szerinti heterológ fúziós fehérjék előállításának általános módszerei
Bár a jelen találmány szerinti heterológ fúziós fehérjéket szá mos különböző eljárással előálithatjuk, mégis a rekombínáns módszereket előnyben részesítjük. A jelen találmány céljaira, amint azt az alábbiakban ismertetjük és levédjűk, az alábbi általános molekuláris biológiai szakkifejezéseket és rövidítéseket defini áljuk, A szakkifejezések és rövidítések jelentése a normális jelentés, hacsak, külön nem jelezzük az eltérést. Például a „°C” Celsius fokot, jelent; a „mmol* jelentése millimól. vagy milhmőlok*; a „mg* jelentése milligramm; a „pg* jelentése mikrogramm; a „ml vagy mL* jelentése milliliter; és a ,,μ! vagy μΙΑ jelentése míkroliter, Az aminosavak rövidítését a 37 C.P.R. § 1,822 fb) (2) (1994) azonosítójú szakirodalomban találhatjuk meg.
A „bázispár* vagy „hp” szakkifejezés jelentése a továbbiakban DNS vagy RNS. Az A, C, G, T rövidítések a dezoxiribonukleozidok (dezoxtjadenozia, (dezoxi)citídin, (dezoxijguasiozin, és ümidin 5'~ monofoszfát formájának felelnek meg, ha DNS molekulában fordulnak elő. Az U, C, G és A rövidítések az uridin, eiiidin, guanozín és adenozin ribonukleozidok 5'-m.onofoszfát formáinak felelnek meg, ha RNS molekulában fordulnak elő. Á kétszálú DNSben a házíspár az A-nak T-vel, illetve a C-nek G~ve.l való párosításának felel meg. Egy DNS/RNS-ben a beteroduplex bázispár az A-nak U-val illetve a C-nek G-vel való párosításának felel meg. (Lásd a „komplementer* defíníciőját, infraj.
A DNS „emésztése” vagy ^restrikciója* szakkifejezés jelentése a DNS-nek egy restrikciós enzimmel való emésztését jelenti, ami a DNS-oek csak bizonyos szekvenciáinál működik. Az itt használt különböző restrikciós enzimek kereskedelmi forgalomban vannak, és reakciókörülményeik, kofaktoraik, és más igényeik a szakterületen jártas szakember számára ismertek. Az egy adott enzimhez megfelelő puffer és szubszírát mennyiséget a gyártó speeihkálja, vagy könnyen megtalálható a szakirodalomban.
A „ligálás* szakkifejezés két kétszálú nukleinsav fragmens közötti foszfodiészter kötés kialakításának eljárására vonatkozik. Hacsak másképpen nem határozzuk meg, a ligálást ismert pufferekkel és körülmények között hajthatjuk végre egy DNS igazzal, azaz például aT4 DNS ligázzal.
A „plazmid® szakkifejezés jelentése extrakromoszómális (általában) on-replikáeíóra képes genetikai elem. Á plazmídokat általaSí
-S.X bán kis „p* betűvel jelzik, amit. számok és/vagy betűk követnek. Az itt említett kiindulási plazmidok vagy kereskedelmi forgalomban vannak, vagy korlátozás nélkül hozzáférhetők, vagy a publikált eljárások alapján, előállíthatok a hozzáférhető plazmidokböl. Emellett az ismertetettekkel ekvivalens plazmidok ismertek a szakirodalomban, és a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvalóak.
A „rekombináns DNS klónozó vektort szakkifejezés jelentése a továbbiakban bármilyen autonóm replikációra képes plazmid, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a plazmidokat és fágokat, amik tartalmaznak egy DNS molekulát, amihez egy vagy több további DNS szegmens kapcsolható hozzá, vagy már hozzá van kapcsolva,
Á „rekombináns DNS expresszíos vektort szakkifejezés jelentése a továbbiakban bármilyen rekombináns DNS klónozó vektor, amiben a beépített DNS transzkripciójának szabályozására egy promoter van.
A „transzkripció* szakkifejezés jelentése az a folyamat, aminek során egy DNS nukleotid szekvenciájában tárolt információ egy komplementer RNS szekvenciába megy át,
A „transzfekció* szakkifejezés jelentése egy expresszlós vektor felvétele egy gazdasejt által, attól függetlenül, hogy bármilyen kódoló szekvencia expresszálődik vagy nem, zl transzfekcíó számos módszere ismert a szakterületen jártas szakember számára, például a kaleium-foszfátos ko-precípítáciő, a liposzóma transzfekcíó és az elektroporáció. A sikeres transzfekcíó általában arról ismerhető fel, hogy a bevitt vektor működésének bármilyen jele megtalálható a gazdasejtben.
A „transzformáció* szakkifejezés jelentése DNS bejuttatása egy szervezetbe, oly módon, hogy a DNS replikációra képes, akár extrakromoszőmális elemként, akár a kromoszómába integrálódva. A bakteriális és eukarióta gazdaszervezetek transzformálásának módszerei jói ismertek a szakterületen , és ezek közül a módszerek közül számosat, azaz például a sejtmag mjekciözást, protoplaszt fúziót vagy a kaletumos kezelést összefoglaltak a szakkönyvekben (Sambrook és mtsaí: Molecular Cloníng: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1989)}. Ha a DNS élesztőbe valő juttatásáról van szó, akkor általában a transzfekciő helyett a transzformáció szakkifejezést használják.
A „transzláció* szakkifejezés jelentése a továbbiakban az a folyamat, aminek során a hírvivő RNS (mRNS) genetikai információját használjuk arra, hogy egy polipeptid lánc szintézisét specifikáljuk és vezéreljük.
A „vektor* szakkifejezés jelentése egy nukleinsav vegyület, amit a sejtek transzfektálására és/vagy transzformálására használunk a génmanipuláció során, és ami megfelelő fehérjemolekuláknak megfelelő polinukleotid szekvenciákat hordoz, amik megfelelő kontroll szekvenciákkal kombinálva specifikus tulajdonságokat biztosítanak a transzfektálandó és/vagy transzformálandó gazdasejtnek. A plazmidok, vírusok és bakteriofágok alkalmas vektorok. A mesterséges vektorokat úgy állítjuk elő, hogy a külön*··♦'♦ φ
φ« se φφ X Φ * »« φ bőző forrásokból származó DNS molekulákat restrikciós enzimek és ligázok segítségével elvágjuk és egymáshoz illesztjük. A „vektor* szakkifejezés jelentése a továbbiakban lehet rekombináns DNS klónozó vektor és rekombináns DNS expressziös vektor is.
A Jcomplementer” vagy «komplementaritás* szakkifejezés jelentése a továbbiakban olyan bázíspárokra (purinokra és pirimidínekre) vonatkozik:, amik hídrogénkőtésekkel asszociálódnak kétszálú nuklemsavvá. A következő bázisok komplementerek: guanin és cítozin; adenin és tímin; valamint adenin és uracit
A „hibridizáció* szakkifejezés jelentése a továbbiakban az az eljárás, aminek során egy nukleinsav egyik szála bázispárosodás révén kötődik egy komplementer szálhoz. A két nem-azonos, de nagyon hasonló komplementer nnkleinsavak hibridizálása során használt körülmények a két szál komplementaritásának mértékétől és hosszától függően változnak. Ezek a technikák és .körülmények jól Ismertek a szakterületen, jártas szakember számára.
Az „izolált aminosav szekvencia* szakkifejezés jelentése bármilyen aminosav szekvencia, konstruált vagy szintetizált, ami lokalizációjában eltér a természetes szekvenciától.
Az „izolált DNS vegyület* szakkifejezés jelentése bármilyen RNS vagy DNS szekvencia, konstruált vagy szintetizált, ami lokalizációjában eltér a természetes szekvenclátóL
A „primer* szakkifejezés jelentése egy nukleinsav fragmens, ami iniciálé szübsztrátként működik az enzimatíkus vagy szintetikus hosszabbítás során.
•φφ φ
φφφ ami a DNS RNS-sé való átírását katalizálja.
A „próba” szakkifejezés jelentése olyan nukleinsav vegyüiet, vagy annak fragmense, ami egy másik nukleinsav vegyűlettel híbridizálódik.
A hibridizációs reakciók „szigorúságát” a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember könnyén meghatározhatja, és általában egy tapasztalati úton végzett számítás, ami függ a próba hosszától, a mosás hőmérsékletétől és a sókoneentrációtől. Általában a hosszabb próbákhoz magasabb hőmérséklet szükséges a helyes illeszkedéshez., míg a rövidebb próbákhoz alacsonyabb hőmérséklet szükséges a helyes illeszkedéshez. A hibridizáció általában a denaturált DNS-nek attól a képességétől függ, hogy képes-e újra illeszkedni, ha a környezetében az olvadáspontja alatti hőmérsékleten komplementer szálak vannak jelen. Minél nagyobb a próba és a hibridizálódó szekvencia közötti kívánt homológja, annál magasabb a használható relatív hőmérséklet, Ennek az az eredménye, hogy a viszonylag magasabb hőmérsékletek a reakciókat szigorúbbakká teszik, míg az alacsonyabbak nem. A hibridizációs reakciók szigorúságának további részleteit és magyarázatát megtalálhatjuk a szakkönyvekben jCurrent Protocols ín Molecular Biology. szerk.: Ausubel és mtsai, Greene Públishing és Wiley-lnterseience: New York 11995)].
A „szigorú körülmények” vagy a „nagyon szigorú, körülmények* definícióját ebben a leírásban az alábbiak szerint adhat6Í.
¢4 ** φ * * * . ♦*« *** ? * * »
juk meg: 1) alacsony ionerősséget és magas hőmérsékletet alkalmaz a mosáshoz, azaz például 15 mmol/1 nátrium-klorid/ 1,5 mmol/1 nátrium-cítrát/0,1% nátrium-dodecil-szulfát 50 °Con; 2) a hibridizáció során egy denaturáló ágenst, azaz például formamidot alkalmaz, például 50 térfogat/térfogat % formamidot és 0,1% szarvasmarha szérum-albumin/0,1% ficoil/0,1% pofirinilpirrolidon/50 mmol/1 nátriumfoszfát puffért (pH~6,5), és 750 mmol/1 nátrium-klorid/75 mmol/1 nátrium-eitrátot, 42 °C; vagy 3) 50% formamidot, SXSSC-t (750 mmol/1 nátrium-klorid, 75 mmol/1 nátrium-cifrát), 50 mmol/1 nátriumfoszfátot (pH-6,8), 0,1% nátrium-piroíoszfátot, 5X Denhardt oldatot, ultrahanggal besugárzott, lazacsperma DNS-t (50 pg/ml), 0,1% SDS-t és 10% dextrán-szulfátot alkalmaz 42 °C-on, és a mosásokat 42 °C~on végzi 0,2X SSC (30 mmol/1 nátrÍom-klorid/3 mmol/1 nátrinmcitrát) és 50% formamid összetételű oldattal, ezt követi egy nagy szigorúságű mosás, amihez EDTA-t tartalmazó 0, IX SSC-t használ 55 °C-on.
A „közepesen szigorú körülmények” definícióját is megtaláljuk a. szakkönyvekben (Sambrook és mtsai: Moleeular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)], ide tartozik az előzőkben ismertetetteknél kevésbé szigorú mosó oldatok és hibridizációs körülmények (azaz például hőmérséklet, ionerősség és SDS%) alkalmazása,. A közepesen szigorú körülmények egyik példája a következő: éjszakán át való inkubálás 37 °C~on, a következő összetételű oldatban: 28% formamid, 5X SSC (750 mmol/1 nátrium63 *·* φ φ ««« *** kiorid, 75 mmol/1 nátríum-eitrát}, 50 mmol/1 nátriumfoszfát (pH-7,6), 5X Denhardt oldat, 10% dextránszulfát és 20 mg/ml denaturált, nyírt lazacsperma DNS, ezt követi a szurok mosása IX SSC-ben körülbelül 37-50 °C hőmérsékleten. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogyan kell beállítani a hőmérsékletet, az íonerósséget, stb., hogy igazodjon a különböző faktorokhoz, azaz például a próba hosszához és hasonlókhoz.
A „PCR” rövidítés jelentése a széles kórben ismert polimeráz láncreakció, amiben a hőstabil DNS polimerázt alkalmazzák.
A „vezérszekvencia® szakkifejezés jelentése olyan aminosav szekvencia, ami enzimatikusan vagy kémiailag eltávolítható, a számunkra érdekes polipeptid előállítása céljából
A „szekréciós szignálszekveneia” szakkifejezés jelentése olyan aminosav szekvencia, ami általában jelen van egy nagyobb polipeptid N-terminális régiójában, és az a funkciója, hogy iniciálja a szóban forgó polipeptid asszociációját a sejtmembrán kompartmentjeivel mint például az endoplazmatikus retikulummal, valamint a szóban forgó polipeptid szekrécióját a plazma membránon keresztül.
A jelen találmány szerinti heterolőg fúziós fehérjéket kódoló DNS készítése
A vad-típusú albumin és immunglobulin fehérjéket különböző forrásokból szerezhetjük be. Ezeket a fehérjéket megkaphatjuk például egy cDNS könyvtárból, amit olyan szövetből vagy sejtekből készítettek, amik a számunkra érdekes ο:
ΦΦ ***♦ *♦· 4'* &♦* *** ti.
mRNS-t kimutatható szinten expresszálják. A könyvtárak átvizsgálhatok: a számunkra érdekes fehérje publikált DNS vagy fehérjeszekvenciája. alapján tervezett próbákkal. Az immunglobulin nehéz lánc vagy könnyű lánc konstans régiókat Ismertetik a szakirodalomban (Adams és mtsai: Bioebemistry 19, 2711-2719 (1980); Goughet és mtsai: Bioebemistry J9, 2702-2710 (1.980); Dolby és mtsai: Froeeedíngs of the National Academy of Sciences, VSA 77, 6027-6031 (1980); Rice és mtsai: Froeeedíngs of the National Academy of Sciences, USA 79, 7862-7862 (1982); Falkner és mtsai: Natúré 298, 286-288 (1982); Morrlson és mtsai: Arrnnal Review of immunology 2 239-256 (1984)]. Az albumin fehérje- és DNS szekvenciáit is ismertetik a szakirodalomban [Meloun és mtsai: PEBS Letters 58, 136 (1975); Behrens és mtsai: Fed. Proc. 34, 591 (1975); Lawn és mtsai: Nucleic Acids Research 9, 6102-6114 (1981);Minghetti és mtsai: Journal of Bioiogieal Ghemístiy 261, 6747 (1986)).
Egy eDNS vagy genomiális könyvtár egy kiválasztott próbával való átvizsgálását standard módszerekkel hajthatjuk végre [Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2, kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1989)]. Egy albumin! vagy immunglobulint kódoló gén izolálásának alternatív módja a PCR módszer alkalmazása [Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Bieííenbach és mtsai: PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold «» »♦*« *· . .» ♦ ¢4 XX Λ** ** *4 * ’ ί *
XX» χ.**Χ
SpringHarbor Laboratory Press, NY (1995)]. A PCP primereket a publikált szekvenciák alapján tervezhetjük meg.
.Általában egy adott fajból klónozott, teljes hosszúságú vadtípusú szekvencia szolgálhat templátként analógok, fragmensek, és származékok készítése során, amik megtartják azt a képességüket, hogy a plazmában hosszabb felezési időt biztosítanak a fúziós fehérje részét képező GLP-1 vegyületnek. Azt részesítjük előnyben, ha a jelen találmány szerinti heterológ fúziós fehérjék Fc és albumin része a természetes humán szekvenciából származhat, azzal a céllal, hogy csökkentsük a fúziós lekérjék potenciális ímmunogenitásának kockázatát emberekben.
Pontosabban, az az előnyös, ha a jelen találmány szerinti fúziós fehérje immunglobulin része az immunglobulinnak csak egy Fc fragmensét tartalmazza. Attól függően, hogy egy bizonyos hatásra vagy funkcióra szükség van-e, valamint a fúziós fehérje szerkezeti jellemzőitől függően egy Fc fragmens tartalmazhatja a csukló régiót, a CH2 és CH3 doménekkel együtt, vagy ezek valamilyen más kombinációját. Ezek az Fc fragmensek polimeráz láncreakció technikákkal állíthatók elő, olyan primereket. használva, amiket arra terveztünk, hogy hihridizálődjanak a szekvenciákhoz amik a fragmens kívánt végének felelnek meg. Hasonlóképpen, ha az albumin fragmenseíre van szükség, akkor olyan polimeráz láncreakció primereket tervezünk, amik komplementerek a belső albumin szekvenciákkal. A polimeráz láncreakció primerek úgy is megtervezhetők, hogy restrikciós enzim hasítási helyeket hozzunk létre, ami megkönnyíti az expressziós vektorokba való klónozást.
A jelen, találmány szerinti GLP-1 vegyűleteket kódoló DNS számos különböző módszerrel előállítható, beleértve azokat a klónozási módszereket, amiket az előzőkben ismertettünk, valamint a DNS kémiai szintézisét is. A kémiai szintézis vonzó lehet, mivel a kódolt peptid rövid. A GLP-1 aminosav szekvenciáját, valamint a preproglnkagon gén szekvenciáját is publikálták fhopez és mtsai; Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 80, 5485-5489 (1983); Bek és mtsai; Natúré 302, 716-713 (1983); Heinrich G, és mtsai: Bndoerinol. 115, 2176-2181 (1984); Ghíglíone, M. és mtsai: Diabetología 27, 599-600 (1984)]. Tehát a természetes GLP-1 vegyületekhez és azok íragmenseihez primerek tervezhetők,
Bgy fúziós fehérjét kódoló gén azután úgy állítható elő, hogy egy GLP-1 vegyületet kódoló DNS-t leolvasási keretben lígálunk egy albumint vagy Fe fehérjét kódoló DNS-hez. Á GLP-1 vegyületet kódoló gén és az albumint vagy az PC fehérjét kódoló gén is leolvasási keretben illeszthető a línper pepiidet kódoló DNS-set
A jelen találmány szerinti heterológ fúziós fehérjék in vívó funkciója és stabilitása optimalizálható, kisméretű peptid linkerek hozzáadásával, aminek az a célja, hogy megakadályozzuk a potenciálisan nem-kívánatos dómén kölcsönhatásokat. Bár ezek a linkerek potenciálisan bármilyen hosszúak lehetnek, és az aminosavak bármilyen kombinációját tartalmazhatják, az az előnyös, ha a szükségesnél nem hosszabbak, hogy megakadályozzuk a nem-kívánt dómén kölcsönhatásokat és/vagy optimalizáljuk a biológiai aktivitást és/vagy stabilitást. A linkereknek általában nem szabad tartalmazniuk rendkívül nagy térkitöltésű oldallánccal rendelkező amincsavakat, vagy olyan amincsavakat, amik valószínűleg szignifikáns szekunder struktúrát visznek be. Az az előnyös, ha a hnker szerinben-glicinben gazdag, és hossza 30 aminosavnál kisebb. Az még előnyösebb, ha a linket hossza nem több 20 aminosavnál. Az még előnyösebb, ha a linket hossza nem több 15 aminosavnát Egy előnyben részesített linket a Gly-Gly-Gly-Gly-Ser szekvencia ismétlődéseit tartalmazza. Az az előnyös, ha ebből a szekvenciából 2-6 ismétlődik. Az még előnyösebb, ha ebhói a szekvenciából 3-4 ismétlődik,
A vad-típusú GLP-1-et, az albumint, és az Fc polipeptidet, valamint ezek fragmensét kódoló DNS mutáltatható, vagy a ligálás előtt, vagy a teljes fúziós fehésjét kódoló cDNS környezetében, A szakterületen számos különböző mutagenezis technika ismert. Például egy mutagén polimeráz láncreakcióé módszer szálátfedés! extenzíót alkalmaz, azzal a céllal, hogy specifikus aminosav szekvenciát hozzon létre a megfelelő fehérjében. Ehhez a polimeráz láncreakciós módszerhez négy primőrre van szükség, kettő az előrevivő orientációban (A és C primerek), és kettő a fordított orientációban (B és D primerek). Egy mutált gén a vadtípusú templátről két eltérő fázisban amphfikálődik. Az első reakció a gén két félben amplifikálja a gént, egy A->C reakciót hajtva végre, majd egy külön C->D reakciót, aholis a B és a C primerek a gének mutáltatni kívánt területét célozzák be. Ha ezeket
X
6έ * * φ. * a printereket a megcélzott területhez illesztjük, akkor rossz illeszkedéseket tartalmaznak azoknál a bázisoknál, amiket meg akarunk változtam. Ha az A~>B és C- >.D reakciók teljesen lejátszódtak, akkor a reakeiotermékeket izoláljuk és a felhasználáshoz összekeverjük, az A->D reakció templátjaiként. Azután ez a reakció eredményezi a teljes mutált terméket.
Ha a teljes fúziós fehérjét kódoló gént előállítottuk, akkor az egy megfelelő expresszios vektorba klónozható. A jelen találmány szerinti GLP-1 fúziós fehérjék előállítására használható specifikus stratégiákat az 1. példában ismertetjük.
Általános módszerek a jelen találmány szerinti heterológ fúziós fehérjék rekombináns expressziólához
Gazdasejteket transzfektálunk vagy transzformálunk az itt ismertetett expressziős vagy klónozó vektorokkal a heterológ fehérjetermelés céljából, majd hagyományos táptalajon tenyésztjük őket, a táptalajt úgy módosítva, hogy az indukálja a promotereket, szelektálja a transzformánsokal, vagy amplffikálja a kívánt szekvenciákat kódoló géneket, A tenyésztési körülményeket, azaz például a táptalajt, a hőmérsékletet, a pH-t és a hasonlókat a. szakterületen jártas szakember fölösleges kísérletezés nélkül ki tudja választani. Á sejttenyészetek produktivitásának maximalizálására használható elvek, protokollok és gyakorlati technikák megtalálhatók a szakirodalomban (Mammalian Cell Biotechnology: Á Pra.cti.cal Approach, szerkz ML Butler, IRL Press (1991); Sambrook és mtsai: Molecular Cloning:
A Laboratory Manual; 2, kiadás, Coid Spring Harbor Press, Coid Spring Harbor, N.Y. (1989)), A transzfekcíós módszerek a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára ismertek, ilyen például a CaP04 és az elektroporáció, Az emlős gazdasejt rendszer transzformálásának általános aspektusait a 4,399,216 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertették. Az élesztőkbe való transzformációt tipikus esetben a szakirodalomban ismertetett módon hajtjuk végre (van Sálingen és mtsai: Journal of Bacteriology 136(2), 946-7 (1977); Hsi&o és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 76(8), 3829-3833 (1979)). Azonban a DNS-nek a. sejtekbe való bejuttatására szolgáló más módszerek, azaz például sejtmag mikroínjekciózas, az elektroporáció, a bakteriális protoplaszt fúzió intakt sejtekkel, vagy polikabonok, azaz például polybrene vagy polyomíthine, is használhatók. Az emlős sejtek transzformálására szolgáló különböző technikák megtalálhatók a szakirodalomban (Keown és mtsai: Metbods in Enzymology 185, 527537 (1990); Mansour és mtsai: Natúré 836(61971, 348-352 (1988)].
A vektorokban levő nukleinsav (azaz például DNS) klónozására vagy expresszálására alkalmas gazdasejtek lehetnek prokariöták, élesztő, vagy magasabbrendű eukarióta sejtek. A megfelelő prokariöták közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az eubaktériumok, azaz például a Gram-negatív vagy Gram-pozitív szervezetek, például az Entemböcteriaceae, mint például az EschericMa eofiL A különböző δ?
<· * * * Λ · ***
Escherichiu ooS sejtek bárki számára hozzáférhetők, azaz például az Escherichia colt M.M294 Κ12 törzs (ATCC 3 1.446); az Eschenchái coö XI 776 törzs (ATCC 3. 1.357); az Escheriehia cofí W3 110 (AYCC 27.325} és az Escfazricfáa coli K5 772 (ATCC 53.635). Más megfelelő prokarióta gazdasejtek lehetnek még például az Enferobneíeriaceue, mint például az Eschenchia, azaz például az EschnricAín eo&, az Enterobaeter, Erwinla, Klebsiella, Proteus, Salmoneüa, azaz például Solmonefia ipphímurium, a Serrafia, azaz például a Serrado mnrcescens és a Shigefla, valamint a hacillusok, mint például a Soridus subfiKs és a Buridus föcfoemförmzs (azaz például a Baridus áchera/ormís 4 1, amit az 1989. április 12-én publikált DD266, 7 10 leírásban ismertetnek), a Pseudbmonas, azaz például a Pseudomonns acmpínoso. és a Síreptompces. Ezek a példák csak illusztrációk, és nem korlátozó jellegűek. A W3110 egy különösen előnyben részesített gazdaszervezetet vagy kiindulási gazdaszervezet, mivel ez egy általános gazdatörzs a rekombínáns DNS termék fermentációkban. Á gazdasejt előnyösen minimális mennyiségű proteolítikus enzimet szekretál. A W3 110 törzs például úgy módosítható, hogy genetikai mutációt hajtson végre a gazdaszervezet számára endogén fehérjékben, ilyen gazdaszervezet például az Escherichia coli W3110 1.A2 törzs, ami tartalmazza a teljes ronA genotípust; az Escherichiu coli W3 110 9E4 törzs, ami tartalmazza a komplett ton4 ptr3 genotípust; az· Esehmchío coli W3110 27C7 törzs (ATCC 55,244), ami tartalmazza a komplett tonA, ptr3 pboA El 5 (argP-lac) 169 degP om.pT/can' genotípust; az Escherichia coli
ŐS
W31 lö 40B4 törzs, ami egy 37D6 törzs, ami tartalmaz egy nemkanamicin rezisztens degP deiéciós mutációt; és egy Bscherichza coli törzs, ami a 4,946,783 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírásban (kibocsátva 1990, augusztus 7.) ismertetett mutáns periplazmatikus proteázt tartalmaz. Egy másik változat szerint a klónozás ín riuo módszerei, azaz például polimeráz láncreakció vagy más nukleinsav polimeráz reakciók alkalmasak.
A prokarióták mellett az eukarióta mikroorganizmusok, azaz például a fonalas gombák vagy az élesztők is használhatók klónozó vagy expresszáló gazdaszervezetnek a fúziós fehérje vektorokhoz. A Sacchurom.yces cerevisíoe egy általánosan használt alacsonyabb rendű eukarióta gazdaszervezet mikroorganizmus. A többiek közé tartozik például a Sehmosaccíwomyces pombe (Beach és Nurse: Natúré 290, 140-3 (1981); az EF 139,383 számú szabadalmi leírás (publikálva. 1995. május 2.); a Muyveromyces gazdaszervezetek (4,943,529 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Fleer és mtsai: Bio/Technology 9(10), 968-975 (1991)], azaz például a .Elupocrompcos iaeíís (MW98-8C, CBS683, CBS4574) (de
Louvencouri és mtsai: Journal of Bacteriology 154(2); 737-742 (1983)|; a fiupuerompcas/rngüís (ATCC 12,424), a iűupnerompces hulpurieus (ATCC 16,045), a Supnerompces wiekeramü (ATCC 24,178), a ATnpvommpcos waltií (ATCC 56,500), a Elupiícrompoes drosophdurum (ATCC 36.906) (Van den Berg és mtsai: Bio/Technology 8(2), 135-9 (1990)); a Alapverompccs íhemotoferans és a. Elupaerompces maroanus; a yarrowia (EP
402,226); a Hcbinpastoris (EP 183,0701 [Sreekrishna és mtsai.: J, Basic. Microbiot 28(4), 265-78 (1988)); Candida, Tnehodermn masai (BP 244, 234), a Aeurospom arassa (Case és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 76(10), 5259-5263 (1979)); a Schwanniomyces, azaz például a
Sehuonniompees ocridcntués (EP 394,538, 1990. október 31.); és a fonalas gombák, azaz például a Neurospora, a Penicíllium, a Tolypoeladium (Wö 91/00357, publikálva 1991. január lö.) és Áspergdlus gazdaszervezetek, azaz például az AsperpiHas niper (Ballance és mtsai: Biochemical and Biophysical Research Communications 112(1), 284-9 (1983); Tilburn és mtsai: Gene 26(2-3), 205-21 (1983); Yelton és mtsai: Proceedings of tbc National Academy of Sciences, USA 81(5), 1470-4 (1984)), és az Asper^&es niper (Kelly és Hynes: EMBO Journal 4(2), 475-9 (1985)} A metilotrof élesztőket az alábbi nemekből választhatjuk ki: Hansenula, Candida, Kleeckera, PScbia, Saceharomuces, Torulopsis és Rhodotorula. Az élesztő ezen osztályának specifikus fajait a szakirodalomban sorolják fel. (C. Antony: The Biocbemistry of Methylotrophs 269 (1982)}.
A jelen találmány szerinti fehérjék expressziójához használt megfelelő gazdasejtek tóbbsejtes szervezetekből származnak. A gerinctelen sejtek közé tartoznak a rovarsejtek, azaz például a Drosophila S2 és a Spodoptera sp,, a Spodoptera bigbS, valamint a növénysejtek. A használható emlős gazdasejtvonalak közé tartoznak az aranybörcsőg petefészek (CHO) és a COS sejtek. A specifikusabb példák közé tartozik a majom vese CV1 vonal, V40-nel «ί >«<» X * ♦ v#
X ‘ * * * X
transzformálva (COS-7, ATCC CRL 1651); humán embrionális vesesejtvonal (293 vagy 293 sejtek, szuszpenziős tenyészetben való növekedésre szubklónozva; Graham és mtsai: J. General Vírology 36(1), 59-74 (1977)); aranyhorcsőg petefészek sejtek/DHFR (CHO; Urlanb és Chasin: Rroceedings of the National Academy of Sciences, USA 77(7); 4216-20 (1980)] egér sertoli sejtek (TM4, Biot Repród. 23(1), 243-52 (1930)]; humán tüdőseitek (W138. ATCC CCL 75); humán májsejtek (Hep G2, HB 8065); és egér emlőtumor (MMT 060562, ATCC CCL51). A megfelelő gazdasejtek kiválasztását a szakterületen jártas szakember ismereteihez tartozónak tekintjük.
A jelen találmány szerinti fúziós fehérjéket közvetlenül rekombináns módszerekkel lehet előállítani, vagy olyan fehérjeként, ami tartalmaz egy szignálszekvenciát vagy további szekvenciákat, amik specifikus hasítási helyet tartalmaznak az érett fúziós fehérje N-terminálisán. A szignálszekveneia általánosságban a vektor komponense lehet, vagy a fúziós fehérjét kódoló DNS része, ami a vektorba van beépítve. Á szignálszekvencia lehet prokariőta szignálszekvencia, amit például az alábbi csoportból választhatunk ki: alkaiíkus foszfatáz, penícillmáz, Ipp, vagy hőstabil enterotoxín II vezérszekvenciák. Az élesztőből váló szekréció esetében a szignálszekveneia lehet például az élesztő ínvertáz vezérszekvencia, az alfa-faktor vezérszekvencia (beleérti ve a Gucchuronu/ces és ©.«faktor vezérszekvencíákat, ez utóbbit az 5,010,182 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetik), vagy a savas fesz75 fatáz vezérszekvencia, a Candída alhictms glukoamíláz vezérszekvencia (EP 362,179). vagy a WG 90/13646 számú szabadalmi leírásban ismertetett szignál. Áz emlős sejtben való expresszió sarán az emlős szignálszekvenciát használhatjuk a fehérje szekréciójának irányítására, azaz például az azonos vagy rokon fajok által szekretált polipepridekból származó szignálszekvenciákal, valamint a virális szekréciós vezérszekvenciákat.
Mind az expressziős, mind a klónozó vektorok tartalmaznak egy olyan nukleinsav szekvenciát, ami lehetővé teszi, hogy a vektor a kiválasztott gazdasejtek közül egyben vagy tőbh-hen replikálódjom Ezek a szekvenciák számos különböző baktérium, élesztő és vírus esetében jól ismertek. A pBR322 plazmidből származó replikációs origó a legalkalmasabb a legtöbb Gram-negatív baktérium esetében, a 2 μ-os plazmid replikációs origója használható élesztőben, és a különböző virális replikációs origók (SV40, polióma, adenovírus, VSY vagy BPV) jól használhatók az emlős sejtek klónozó vektoraiban.
Az expressziós és klónozó vektorok tipikus esetben tartalmaznak egy szelekciós gént, amit szelekciós markernek is neveznek. A tipikus szelekciós gének olyan fehérjéket kódolnak, amik a) antibiotikumok vagy más toxinok, azaz például ampícil-lin, neomieín, metotrexát vagy teíraciklin elleni rezisztenciát biztosítanak, b) antotrőfia deficíencíát komplemenfálnak, vagy c) olyan kritikus tápanyagokat biztosítanak, amik nem hozzáférhetők a komplex táptalajból, ilyen például a Baeillusok számára a D-alanin raeemáz.
-r
Az emlős sejtekhez megfelelő szelekciós markerek egyik példái azok, amik lehetővé teszik azoknak a sejteknek az azonosítását, amik kompetensek a fúziós fehérjét kódoló nukleinsav felvételére, ilyen például a DHFR vagy a timidin kináz. Egy megfelelő gazdasejt, amikor a vad-típusú DHFR-t használjuk, a CHO sejtvonal, ami a DHFR aktivitásban defieiens, előállítását és szaporítását a szakirodalomban közölték (Uriaufo és Chasin: Prooeedings of the National Aeademy of Sciences, USA 77(7), 4216-20 (1980)]. Egy élesztőben használható alkalmas szelekciós gén a trpl gén, ami az élesztő Yrp7 plazmidjában van (Stihncomb és mtsai: Natúré 282 (5734), 39-43 (1979); Kingsman és mtsai: Gene 7(2), 141-152 (1.979); Tschumper és mtsai; Gene 10(21, 157-66 (1980)). A trpl gén egy szelekciós markert biztosít egy mutáns élesztötőrzshöz, ami nem képes triptofánon szaporodni, ilyen például az ATCC No. 44076 vagy PERC! (Jones, Genetlcs 85, 23-33 (1977)].
Az expressziós és klónozó vektorok általában tartalmaznak egy promotert, működés szempontjából egy fúziós fehérjét kódoló nukleinsav szekvenciához kapcsolva, hogy irányítsa a mRNS szintézisét. A különböző potenciális gazdasejtek által felismert promoterek jól ismertek. A prokariőta gazdaszervezetekben való alkalmazásra alkalmas promoterek köze tartozik a béta-laktamáz és a laktőz promofer rendszer fChang és mtsai: Natúré 275(56811; 617-24 (1978); Goeddei és mtsai; Natúré 281(5732), 544-8 (1.979)1, az alkalikus foszfatáz egy triptofán (up) promoter rendszer (Goeddei: Nucleíc Acids Research 8(18), 4057-74 (1980);
V > Μ χ / «β«φ φφ
ΕΡ 36,776, publikálva 1981. szeptember 30.és a hibrid promoterek, azaz például a tat promoter (deBoer és mtsai: Proeeedings of the National Academy of Sciences, USA 30(1), 21-5 (1933)]. A bakteriális rendszerekben használható promóterek tartalmaznak még egy Shine-Dalgarno (S.D,) szekvenciát, működés szempontjából a fúziós fehérét kódoló DNS-hez kapcsolva.
Az élesztő gazdaszervezetekben használható megfelelő promoter szekvenciák közé tartozik például a 3~foszfoglíeerokináz (Hitzeman és mtsai: Journal of Biological Chemistry 2551241; 12073-80 (1980)], vagy más glikolitikus enzimek (Hess és mtsai: J, Ádv. Enzyme Reg. 7» 149 (1968); Holland: Biochemistry 17(231» 4900-7 (1978)}, azaz például az enoláz, a gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, a hexokináz, a piruvát dekarhoxiláz, a íbszfofruktokináz, a glükóz-6-foszfát ízomeráz, a 3-foszfoglicerát mutáz, a piruvát kínáz, a triőzfoszfát ízomeráz, a foszfoglnköz izometáz és a glűkokináz.
Más élesztő promóterek, amik indukálható promóterek, és azzal a további előnnyel rendelkeznek, hogy a transzkripciót a növekedési körülmények szabályozzák, az alkohol dehidrogenáz 2, az izoeitokróm C, a savas foszfatáz, a nitrogén metabolizmushoz kapcsolódó degradatív enzimek, a metaJlotioneín, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, valamint a maltőz és galaktöz hasznosításért felelős enzimek promoter régiói. Az élesztő expresszióban alkalmazható megfelelő vektorokat és promolerekei az EP 73,657 számú szabadalmi leírásban ismertetik. A fúziós fehérjét kódoló mRNS transzkripcióját a vektorokról emlős gazdasejtekben szabályozhatják például a vírusok, azaz példán! a. polióma vírus, a csirkehimlő vírus, az adenovírus (azaz például az Adenovírus 2), a. szarvasmarha papillómavírus, a szárnyas szarkóma vírus, a citomegalovirus, egy retrovirus, hepatitisz B vírus és SV4Ö vírus genomjáből származó promoterek, a heterológ emlős promoterek, azaz például az aktin promoter vagy egy immunglobulin promoter, és a hősokk promoterek, azzal a feltétellel, hogy az ilyen promoterek kompatibilisek a gazdasejt rendszerrel
Egy fúziós fehérjét kódoló polinnkleotid transzkripciója magasabhrendű eukaríőtákban fokozható, ha egy fokozó szekvenciát építünk a vektorba. A fokozok cisz-hato DNS elemek, méretük általában 10-300 bázispár, amik a promoterre hatnak, fokozva ezzel a transzkripcióját. Az emlős génekből (glofein, elasztáz, albumin, a-ketoprotein és inzulin) számos fokozó szekvencia ismert. Tipikus esetben azonban egy eukarióta sejt vírusából származó fokozót lehet használni. Ilyen például az SV40 fokozó a replikáeiős origó késői oldalán (lÖÖ-270-es bázispár), a citomegalovirus korai promoter fokozó, a polióma fokozó a replikáeiős origó késői oldalán, és az adenovírus fokozok. A fokozót a fúziós fehéqét kódoló szekvenciához viszonyítva 5' vagy 3' irányba építhetjük be, de előnyösen a promoterhez viszonyítva 5' irányban található.
Az eukarióta gazdasejtekben (élesztő, gomba, rovar, növény, állat, ember vagy más többsejtes szervezetből szánnazó sejtmagos sejtek) használt expressziós vektorok tartalmaznak olyan szekvenciákat is, amik szükségesek a transzkripció leállításához és az mRNS stabilizálásához. Ezek a szekvenciák általában elérhetők az eukarióta vagy virálís DNS-ek vagy cDNS-ek 5, néha a 3' nem-transzlálódő régióiból. Ezek a régiók tartalmaznak olyan nukleotid szegmenseket, amik poliadenilezett fragmensként fordítódnak le a fúziós fehérjét kódoló mRNS nemtranszlálődó részében.
Egy fúziós fehérje különböző formái nyerhetők ki a tenyésztő táptalajból, vagy a gazdasejt lizátumaibót Ha membránhoz kötött, akkor a membránból szabadítható fel. megfelelő detergens oldat (azaz például Triton-X 100) használatával, vagy enzimatikus hasítással. Egy fúziós fehérje expressziőjában használt sejtek különböző fizikai vagy kémiai eszközökkel roncsolhatok, azaz például fagyasztási-olvasztási ciklusokkal, ultrahangos besugárzással, mechanikai roncsolással vagy a sejteket lizálő
A jelen találmány szerinti heterólőg fúziós fehérjék tisztítása
Ha a jelen találmány szerinti heterólőg fúziós fehérjék már expresszálődtak a megfelelő gazdasejtben, akkor az analógok izolálhatok és tisztíthatok. A megfelelő tisztítási eljárásokban például az alábbi eljárások használhatók: frakcionálás karboximetilcellulózon; gélszűrés, például Sephadex G-75-őn; anioncserélő gyanta, például DEAE vagy Mono-Q; kationcserélő, azaz például CM vagy Mono-S; protein A sepharose az olyan szennyeződések, mint például az IgG eltávolítására; íémkelát-képző oszlopok, a ♦»»·* polipeptid epitop-jelzeti. formáinak megkötésére; fordított fázisú HPLC; kromatofőkuszálás; szílikagéi; etaoolos kiesapás; és ammőnium-szulfátos kicsapás.
A fehérje tisztítására számos különböző módszer használható, és ezek a módszerek a szakterületen ismertek, és a szakirodalomban publikálták őket (Deutscher: Methods in Enzymology 182, 83-9 (1990); Scopes: Protein Purffieatíon; Principles and Practice, Springer Verlag, NY (1982)j. Á kiválasztott tisztítási lépés függ a használt eljárás természetétől, és az előállított fúziós fehérjétől. Például egy Pc fragmenst tartalmazó fúziós fehérjét hatékonyan tisztíthatunk egy Protein A vagy Protein G affinitás mátrix használatával. Alacsony vagy magas ρΗ-jú pufferek használhatók a fúziós fehérjének az affinitás mátrixról való eluálására. Az enyhe elúciós körülmények segítenek megakadályozni a fúziós fehérje irreverzibilis denaturálödását. Imidazolt tartalmazó pufferek is használhatók. A 3. példában leírunk néhány sikeres tisztítási protokollt a jelen találmány szerinti fúziós fehérjékhez.
A jelen találmány szerinti heterolőg fúziós fehérjék jellemzése
Számos különböző módszer létezik a jelen találmány szerinti fúziós fehérjék jellemzésére. Néhány ezek közül a módszerek közül: SDS-PAGE, fehérje-festési módszerekkel vagy immunblottál kapcsolva, anti-IgG vagy anti-HSÁ ellenanyagok használatával. Más módszer például a mátrix-segített lézer deszorpciős/ionízációs tömegspektroszkópia (MALDI-M8), a folyadék kromato«**♦ Φ’Φ gráfia/tómegspektroszfeópía, az izoelektromos fókuszálás, az analitikai aníoncsere, a kromatofókuszálás és a cirkuláris díkroizmus, csak hogy néhányat megnevezzünk. A heterológ fúziós fehérjék reprezentatív számát jellemeztük SDS-PAGE-val, immunhlottofással valamint fömegspektroszkópiával kapcsolva (lásd a 4. és 5. példát, valamint a 3. és 4. ábrát).
Például a 3. táblázat (lásd az 5. példát) illusztrálja a fúziós fehérjék reprezentatív számának a számított molekulasúlyát, valamint a tömegspektímszkópíával meghatározott molekulasúlyokat. Emellett a 3. és 4. ábra illusztrálja a fúziós fehérjék reprezentatív számának a molekulasúlyát, SDS-PAGE-val meghatározva. Az összes vizsgált heterológ fúziós fehérjét tranziensen expresszáltuk és szekretáltuk. Emellett, az Igx szignálszekvenciát lehasítottuk, hogy a helyes N-terminálist tartalmazó fehérjéket kapjunk.
Emellett a 3. táblázat azt illusztrálja, hogy néhány esetben a tömegspektroszkópiával meghatározott molekulasúly a vártnál nagyobb. Ez az Fc rész glíkozílezésének és a C-terminális extenziónak a következménye. A fúziós fehérjék enzimatíkus emésztését kővető fordított fázisú HPLC-vel és tómegspektroszkőpiával azonosítani lehet a cukor egységeket tartalmazó frakciókat. Ezeknek a frakcióknak azután meg lehet határozni az N-terminális aminosav szekvenciáját, hogy azonosítsuk a potenciális gkkozílezési helyeket. Például az Exendin-4~Fe (29. számú szekvencia) jellemzése azt mutatja, hogy a 39-es pozícióban levő szerin és az 50-es pozícióban levő treonín O-kapcsolt módon glikozilezett, míg *
« 44 * «·*· < Φ '« * «· ♦ *» <** a 122-es pozícióban levő aszparagin N-kapcsolt módon glikozilesett.
A GLP-1 fúziós fehérjék reprezentatív számának is megvizsgáltuk az aktivitását. Számos módszer létezik a GLP-1 aktivitás ín fetm és ín feoo kimutatására (lásd a 6., 7., 8. és 9. Példát). A 4. táblázat (6. példa) illusztrálja a számos GLP-1 fúziókhoz kapcsolódó GLP-1 receptor aktivitást. A számok a Vals-GLP~l(7~ 37)OH aktivitáshoz vannak viszonyítva. Az összes vizsgált fúziós fehérjének volt GLP-1 receptor aktivitása. Az in vitro aktivitás alacsony szintje nem szükségszerűen jelenti azt, hogy ín fenő gyenge a hatás. Mivel ezeknek a fúziós fehérjéknek jelentősen megnőtt a felezési idejük, a gyenge in feím aktivitás nem általános jelzője a gyenge ín vivő aktivitásnak. A 7. ábra és a. 7. példa illusztrálja a meghosszabbodott felezési időt, ami a jelen találmány szerinti fúziós fehérjékhez asszociálódik, Például a Vals~ GLP-í~Pc felezési ideje körülbelül 45 óra. majmokban, a Yal8GLP-I-HSÁ felezési ideje körülbelül 87 óra majmokban, a Gly8GIu22~GLP~l-€Ex-Linker~IgGl felezési ideje intravénás beadás után körülbelül 55 óra kutyákban, és a Gly^-Glu^-GLP-l-CExLinker-IgGl felezési ideje szubkután beadás után körülbelül 38 óra kutyákban.
A. jelen találmány szerinti készítmények
A fizikai stabilitás ís egy lényeges fényezője a terápiás fehérje-kiszereléseknek. A GLP-1 vegyületeket különösen nehezen lehetett előállítani és formalázni, a processzálás során fellépő
8£
Φ * X φ*. * « ♦ * φ *
ΦΆΦ <·♦♦♦ strukturális változások miatt. Néhány GLP-1 vegyület például hajlamos az aggregálódásra. Emellett kimutatták, hogy néhány GLP-1 vegyület egy oldható és aktív α-hélix formából oldhatatlan és potenciálisan inaktív β-lemez formába alakul át. A GLP-1 vegyületek nagyobb Fehérjékkel, azaz például egy ígG Fc régiójával vagy albuminnal való fúziója nemcsak úgy hat, hogy növeli a GLP-1 vegyület felezési idejét, hanem még hozzájárul a GLP-1 vegyület konformációs stabilitásához. Például a Val8-GLP-1 -linkerHSA foszfáttal pufíerelt sóoldatban majdnem 30 napig stabil 37 °C~on.
A jelen találmány szerinti heterolőg fúziós fehérjék egy vagy több töltőanyaggal szerelhetők kL A jelen találmány szerinti aktív fúziós fehérjék kombinálhatok egy gyógyászatilag elfogadható puiferrel, és a pH-t úgy állíthatjuk be, hogy elfogadható stabilitást kapjunk, és a pH-nek elfogadhatónak kell lennie a beadáshoz, azaz például a parenterábs beadáshoz is.
Adott esetben egy vagy több gyógyászatilag elfogadható antimikrobiális ágenst is beletehetünk a készítménybe. A metakrezoi és a fenol elfogadott mikrobíális ágens. Egy vagy több gyógyászatilag elfogadható sót is hozzáadhatunk, hogy beállítsuk az ionerősséget vagy tonícitást. Egy vagy több töltőanyagot is hozzáadhatunk, hogy tovább szabályozzuk a készítmény izotonicitását. Az- izotoníeitást szabályozó töltőanyag egyik példája a glícerin.Áz embernek vagy más állatnak való beadásra alkalmas gyógyászatilag elfogadható eszközök nem tartalmaznak toxikus «
«««
X * * elemeket vagy nem-kívánt szennyezőket, és nem zavarják a benne levő aktív vegyületek aktivitását.
Á jelen találmány szerinti heterológ fúziós fehérjék gyógyászatilag elfogadható sóformája használható a jelen találmányiban. A savaddíciós sók képzésére általánosan hasznait savak szervetlen savak, azaz például sósav, Ihdrogénhromid, hidrogénjodid, kénsav, foszforsav és hasonlók, vagy szerves savak, azaz például p-toluolszulfonsav, metánszulfonsav, oxálsav, p-brómfenil-szulfonsav, szénsav, borostyánkősav, cítromsav, benzoesav, ecetsav és hasonlók. Azokat a savaddíciós sókat részesítjük előnyben, amik az ásványi savakkal, azaz például sósavval és hidrogénbromiddal képződnek,
A bázis-addícíős sók közé tartoznak a szervetlen bázisokkal képzett sók, azaz például ammőnium-, vagy alkálifém- vagy alkáliföldfém hidroxidok, karbonátok, bikarbónátok és hasonlók. A jelen találmány szerinti sók készítésében előnyben részesített bázisok közé tartozik tehát a nátríum-hidroxid, a. kálium-hidroxíd, az ammőnium-hídromd, a kálium-karbonát és hasonlók.
A készítmények beadása
Á beadást végrehajthatjuk bármelyik módon, amiről az átlagos képzettségű szakorvos számára ismert, hogy hatékony. Az egyik ilyen módszer a perifériális és parenterális beadási mód. A parenterális beadási mód alatt az orvosi szakirodalomban általában azt értik, hogy egy dőzisformát steril tűvel vagy más mechanikai eszközzel, azaz például infúziós pumpával juttatnak
X ·<. ·* *'*χ 4.
be a testbe. A perifériális parenteráiis beadási mód lehet intravénás, intramuszkuláris, szubkután és intraperitoneális beadási mód.
masak még orális, rekfális, nazális vagy alsó légúti beadásra is, amik nem parenteráiis beadás módok. Ezek közül a nem-parenterális beadás módok közül az alsó légúti és az orális módot részesítjük előnyben.
A jelen találmány szerinti fúziós fehérjék arra használhatók, hogy számos különböző betegséget és állapotot kezeljünk velük. A jelen találmány szerinti fúziós fehérjék biológiai hatásukat elsődlegesen, ügy fejtik ki, hogy a „GLP-1 receptornak” nevezett receptorra hatnak. Azokat az alanyokat, akik olyan betegségben és/vagy állapotban szenvednek, amik kedvezően reagálnak a GLP-1 receptor stimulálására, vagy a GLP-1 vegyület beadására, kezelhetjük a jelen találmány szerinti GLP-1 fúziós fehérjékkel. Ezekről az alanyokról azt mondják „GLP-1 vegyületekkel való kezelésre szorulnak*, vagy „a GLP-1 receptor stimulálására szorulnak*, ide tartozik a nem-inzulin dependens cukorbetegség, az inzulin dependens cukorbetegség, a sztrók (lásd WÖ 00/16797 számú szabadalmi leírás), a szívinfarktus (lásd a WO 98/08531 számú szabadalmi leírást), az elhízást (lásd a WO 98/19698 számú szabadalmi leírást), a műtét utáni katabofíkus változásokat (lásd a 6,006,753 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást), a funkcionális díszpepszia, és az irritálható vastagbél szindróma (lásd a WO 99/64060 számú
8;
szabadalmi leírást). Ide tartoznak azok az alanyok is, amik proülaktikus kezelést igényelnek egy GLP-1 vegyülettel, azaz neminzulin dependens cukorbetegség kockázatának alanyai (lásd a WO 00/07617 számú szabadalmi leírást). A károsodott glükóztoleranciában vagy károsodott éhezés! glükózban szenvedő, alanyok, akiknek a testsúlya körülbelül 25%-kal magasabb annál a testsúlynál, ami az alany testmagasságából és testfelépítéséből következik, a részleges pankreatektómíáhan szenvedő alanyok, azok az alanyok, akiknek egyik vagy mindkét szülője nem-inzulin dependens cukorbetegségben szenved, a terhességi cukorbetegségben szenvedő alanyok, és az akut vagy krónikus hasnyálmirigy-gyulladásban alanyok nem-inzulin dependens cukorbetegség kifejlődésének kockázatával élnek.
Egy GLP-1 vegyület „hatékony mennyisége” az a mennyiség, ami a kívánt terápiás és/vagy profílaktíkus hatást biztosítja, anélkül hogy elfogadhatatlan mellékhatásokat okozna, ha egy GLP-1 receptor stímulálásra szoruló alanynak adják be. A Jdvánatos terápiás hatás” szakkifejezés jelentése egy vagy több az alábbiak közük 1) a betegséghez vagy az állapothoz kapcsolódó tűnef(ek) enyhítése; 2) a betegséghez vagy az állapothoz kapcsolódó tünetek fellépésének késleltetése; 3) a kezelés hiányával összehasonlítva megnőtt élettartam; és 4) az élet jobb minősége, a kezelés hiányával összehasonlítva. Például egy GLP-1 vegyület „hatékony mennyisége” a cukorbetegség kezelésében az a mennyiség, ami a vércukor koncentráció jobb szabályozását eredményezi, mint ami a kezelés hiányában fellép, ezzel késlel84 tetve a diabeteszes komplikációk, azaz például a retinopátia, a neuropátia vagy vesebetegség fellépését, Egy GLP-l vegyület «hatékony mennyisége” a cukorbetegség megelőzésében az a mennyiség, ami a kezelés hiányához viszonyítva késlelteti a megemelkedett véreukorszint fellépését, ami már anti-hipoglíkémiás gyógyszerekkel, azaz például szulfonii karbamiddal, tiazolidíndionokkal, inzulinnal és/vagy bíszguanídinekkel való kezelést igényel.
A fúziós fehérének az a dózisa, ami hatékonyan normalízálja egy beteg vércukorszintjét, számos különböző faktortól függ, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alany nemét, testsúlyát és életkorát, a véreukorszint szabályozására való képtelenségének a súlyosságát, a beadás módját és a biológiai hozzáférhetőséget, a fúziós fehérje farmakokinetikai profilját, a potenciáit és a kiszerelési formát.
Á jelen találmány tárgyát olyan GLP-1 vegyületek képezik, amik javított biokémiai és biofizikai tulajdonságokkal rendelkeznek, annak következtében, hogy egy albumin fehérjéhez, egy albumin fragmenshez, egy albumin analóghoz, egy Pc fehérjéhez, egy Fc fragmenshez vagy egy Pc analóghoz vannak fúzíonálíatva. Ezek a heterolőg fehérjék sikeresen expresszáltathatök gazdasejtekben, megtartják a GLP-1 receptor aktiválásához kapcsolódó jeladási aktivitásukat, és megnő a felezési idejük.
Az alábbi példákat a jelen találmány további ismertetése céljából mutatjuk be. Á jelen találmány oltalmi köre nem korlátozható csupán az alábbi példákra, A szakterületen jártas
SS szakember számára nyilvánvaló, hogy az éppen említett reagensek, berendezések, és eljárások csupán illusztrációk, és nem szándékunk, hogy ezekkel a jelen találmányt bármilyen módon korlátozzuk.
A heterolög fúziós fehérjéket kódoló DNS készítése la példa: VaF~GLP~l(7--37)~Pc-t kódoló DNS konstrukció
A humán IgGl egy Fc részét eDNS könyvtárból izoláljuk, ez tartalmazza a teljes csukló régiót, valamint a CH2 és CHS doméneket. A humán. IgGl ezen Fc részének 696 bázispáiját tartalmazó fragmenst szubklőnozunk a pJB02 emlős expresszíós vektor Nhel és Eco47IlI helyeire, ezzel előállítva a pJB02/Fc-t (lásd 5. ábra). Az Igx szekréció szignálszekvenciát kódoló DNS-t a VaP~GLP-l(7~37)-hez íúzionáltatva négy átlapoló és komplementer oligonukleotid ín ohm hibridizációjával állítjuk elő:
S'-CTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTG(12. számú szekvencia)
AAGAGGC-3' (13. számú szekvencia)
Sí:
5'-TGGTGG-3' (14. számú szekvencia)
5'-GCCTCTTCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAACTCCTTGGCGGA hibridizációs reakciót az egyes oligonukleotídokból ekvivalens mennyiséget (1 ρΜ/μΙ végkoncentráciő minden egyes oligonukleotidra) használva hajtjuk végre. Az oiigcnukleotidok elegye! 5 percig 180 ®C-on tartjuk a ligáié elegyben (50 mmol/1 TR1S-HC1 pH~7,5, lö mmol/1 MgCh, lö mmol/1 ditiotreitol, 1 mmol/1 ATP, 25 gg/ml szarvasmarba szérum-albumin), majd több mint legalább 2 óra hosszat 30 ö€~ra hűtve tartjuk.
A kapott hibridizációs terméket 2 óra hosszat szobahőmérsékleten, vagy éjszakán át 16 °C-on ligáljuk a pJ.B02/Fc vektor gerincébe, amit Nhel és Eco47IlI restrikciós enzimekkel emésztettünk. Á ligálás termékét használjuk kompetens XL-I Blue sejtek (Stratagene) transzformálására. A rekombináns plazmidokat átvizsgáljuk,, hogy tartalmazzák-e a pepiidet kódoló inszerteket, a klőnokat ricol restrikciós enzimmel emésztve (a Kozák szekvenciát és a szignálpeptid első Met csoportját kódolja), majd szekvenáljuk. A kapott, az expressziős esszéhez használt plazmid jelölése pdB02-V8- GLP-l~Fc (5. ábra).
»7 * **
1b példa: A Val8-GLP-l(7~37)-HSA-t kódoló DNS készítése
A HSA/pcDNA3J.GS plazmidot az lnvítrogen~töl vásároltuk (katalógusszám: H~M12523-pcDNA3.1/GS), és terápiáiként használtuk a humán szérom-albummt (HSA) kódoló cDNS izolálására. A HSA cDNS-t polímeráz láncreakcióval izoláljuk, amiben a vezérszekveoeíát, valamint a hat aminosavból álló pro-peptidet eltávolítjuk az 5' végről. Emellett a stopkodonokat közvetlenül hozzáadjuk a HSA-t kódoló szekvencia 3' végéhez, Végezetül a restrikciós enzim hasítási helyeket az 5' és 3' véghez kapcsoljuk hozzá, hogy megkönnyítsük a klónozást. Az Invitrogen-től vásárolt eredeti vektorban levő HSA DNS szekvencia egyetlen báziscserét tartalmazott a gén 3' régiójában (667-es pozíció), a természetes humán szekvenciával összehasonlítva. Ez a változás azt eredményezi, hogy egy Asn kodon keletkezik az Asp kodon helyett. Tehát az előzőkben ismertetett szál-átlapolós polímeráz láncreakció mutagenezis módszer használatával az ebben a pozícióban levő ködont Asp kodonra változtattuk. A kapott HSA-t kódoló DNS-t a pdB02 Nhei és Hindii! hasítási helyeire klónoztuk, igy kaptuk a pJB02-HSÁ-t (6. ábra).
A VaF-GLP-1(7-37) szekvenciához fözionáltatott IgK vezérszekvenciát az la. példában ismertetett módon állítjuk elő. Ezt. a DNS-t a pJB02-BSA Nhel és Psp.1 hasítási helyeire lígáljuk, így kapjuk a pdB02- Val«-GLP-1(7-37)-HSA-t.
le. Példa: A Vak-GLP- l(7~37)-lmker-HSA-t kódoló DNS előállítása
A pJB02-HSA vektort az Ib. példában ismertetett módon állítjuk elő. A línker szekvenciát (GGGGS)s kódoló DNS-t leolvasási keretben ligáljuk a HSA-t kódoló DNS 5* végéhez, ezzel előállítva a pJBö2~línker~HSA plazmidot (7. ábra). Az IgK vezérszekvenciát kódoló DNS a VaF-GLP-1(7-37) szekvenciához és a linker szekvencia 5* végéhez fúzíonáltatva az la. példában ismertetett módon állítjuk elő. Ezt a DNS-t ligáljuk a pJBÖ2 Nhel és BspEI hasítási helyeire, ezzel előállítva a pJB02~ VaN-GLP-1-HnkerHSÁ-t
Id. példa: Az Exendin-4-Fc-t kódoló DNS előállítása
A p3B02/Fc plazmidot az la. példában ismertetett módon állítjuk elő. Áz Exendin-4~hez fúzíonáltatott Ig& szignálszekvenciát kódoló DNS-t az alábbi átlapoló és komplementer oligonukleotidok ín iáim hibridizációjával állítjuk eló:
5'-GGAGAGGGAACCTTCACCAGCGACCTGAGCAAGCAGATGG~
AGGAGGAGGCCGTGAGACTG-3 (17. számú szekvencia) ss «φ ·»*♦ » » ♦** ♦* φφ *
5' (18. számú szekvencia) (19 . s zámú ?, számú
-3' (21. számú szekvencia)
A hibridizációs reakciót az la. példában ismertetett módon végre. A híbridizált terméket a pJBÖ2 vektorhoz ügáljuk, amit «bel és Eco471ÍI restrikciós enzimekkel emésztünk az la.
ismertetett módon, ezzel előállítva a pJBÖ2~Bxendin-4~
í.
le. példa: Az Exendin -4-Η
A pdBÖ2~HSA plazmldot az íb. példában ismertetett módon állítjuk elő. Az Ekendin-4-hez fúzionáltatott Igx szignálszekvenciát kódoló ONS~t ugyanazoknak, az Id. példában ismertetett
9C «*» #*** átlapoló és komplementer olígonukleoödoknak in tÁíro hibridizációjával állítjuk elő. Ά hibridizációs reakciókat is az előzőkben ismertetett módon hajtjuk végre. A DNS-t a pJ802~HSA Nhel és Fspl hasítási helyeire klónozzuk, ezzel előállítva a pdRÖ2~ Exendín~4-BSA-t.
f. példa: Áz Exendm-4-linker-SSA-t kódoló DNS előállítása
Á pJBÖ2-linker-HSA plazmídot az le. példában ismertetett módon állítjuk elő. Az Exendin-4-hez és a linker 5' részéhez fúzionált&tott IgK szígnálszekveneiát kódoló DNS-t az ld. példában ismertetett módon állítjuk elő. Ezt a DNS-t a pJBÖ2-linkerHSA egyedi Nhel és BspEI hasítási helyeire klónozzuk, ezzel előállítva az Exendin-4-linker-HSA-t.
lg. példa: A VaN-GLP~l/C~Ex~Ee~t kódoló DNS előállítása
A pJBÖ2-Exendin~4~Fc-t az ld. példában ismertetett módon állítjuk elő». Az Exendin-4~et kódoló DNS-t a vektorból Agei és Eco471ö restrikciós enzimekkel vágjuk ki. A Val8-GLP-1/C-ExPc-t kódoló DNS-t az alábbi átlapoló és komplementer olígonukleotidok in vám hibridizációjával állítjuk elő:
5'-CCGGTCACGTGGAGGGCACCTTCAC€TCCGACGTGTCCTCC~ (22. számú szekvencia)
(23. számú szekvencia)
ACGTGA-3 (24. számú szekvencia)
(25. számú szekvencia)
A hibridizációs reakciót az la. példában ismertetett módon hajtjuk végre. A hibridízáll terméket ligáljuk az Exendin-4 helyére a pJB02-Exendin-4-Fc expressziős vektorban, ezzel létrehozva a pJB02-Val8-GLP-1 /C-Ex~Fc~t.
Ih. példa: A VaP-Glu^-GLP-l-Fcrt kódoló DNS készítése
A pJBÖ2-Exendin-4-Fc plazmidot az Id. példában ismertetett módon állítjuk elő. Az Exendin-4-et kódoló DNS-t a vektorból Agel és Eco47IlI restrikciós enzimekkel vágju k ki. A VaF-Glu^GLP~l~et kódoló DNS-t az alábbi átlapoló és komplementer oligonukleoiidok in ritro hibridizációjával állítjuk elő:
3' κ
** * * φφ*' χ*« φΦΦ *
«* φφ számú szekvencia)
ACGTGA-3’ (29. számú szekvencia)
A hibridizációs reakciót az la. példában ismertetett módon hajtjuk végre. A hibridizációs terméket az Exendin-4 helyére ügáljuk a pJB02-Exendin-4~Fc expressziős a pJBö2-Val8-Glu22-GLP-1 -Fc-t.
li. példa: A Vals-G.lu^-GLP-1/C-Ex-Fc-t kódoló DNS előállítása A pJB02-Exendin--4-Fc plazmidot az l.d. példában ismertetett módon állítjuk elő. Az Exendín-4-et kódoló DNS-t Agel és Eco47IH restrikciós enzimekkel hasítjuk ki. A VaF-Glu22-GLPl/C-Ex-et kódoló DNS-t az alábbi átlapoló és komplementer ohgonukfcotídökkai állítjuk elő:
számú •3 »♦'«·* *
V* *
Λ»*
5'
CGGAGCCCCTCCTCCTAGC-3' (31. számú szekvencia)
ACGTGA-3' (32. számú szekvencia) (33. számú szekvencia)
A hibridizációs reakciót az la. példában ismertetett mádon hajtjuk végre. A hibridizált terméket az Exendin-4 helyére lígáljuk a p3BÖ2~Exendin-4-Pc expresszios vektorban, ezzel előállítva a pJB02-Val»-Glu22-GLF-l/C-Ex-Fc-t.
Íj. példa: A Gly«-GLP~ 1-Fc-t kódoló DNS előállítása
A p3BG2~Bxendin~4-Fc plazmidot az ld. példában ismertetett módon állítjuk elő. Az Exendín-4-et kódoló DNS-t Ágéi és Eco47IÍI restrikciós enzimekkel vágjuk ki a vektorból. A GlysGLP-l-et kódoló DNS-t az- alábbi átlapoló és komplementer olígonukleotidok ín uím hibridizációjával állítjuk elő:
S'~
Λ ..' .χ.Λ -γχ
V' ς2 4/ ói.J öj.· ' 1 s·. · ,<r . .....¾ 1¾ *<€ « <£&ΜΜβ1 *»* o
5~,
W·'· irt .. .,.·.·«<
(34. számú szekvencia) (35. számú szekvencia)
-3' á , 4 Λ*-'!
«.«íwr
S· 'WΌ3
CGTGA-3' (36. számú szekvencia) (37. számú szekvencia)
Á hibridizációs reakciót az la. példában ismertetett módon hajtjuk végre, A hibrídizált terméket az Exendin-4 helyére ii~ gáljuk a pdB02-Exendm-4-Fo expresszlós vektorba, ezzel létrehozva a pJBö2~Glys·-GLP- 1-Fc-t,
2. Példa
A. heterolőg fúziós fehérjék expressziója
Az 1. példában bemutatott DNS konstrukciók által kódolt fúziós fehérjék expresszióját úgy hajtjuk végre, hogy HEX 293EBNA sejteket (letapadó és szuszpenziós is) transzfektálunk. A sejteket megszámláljuk, majd a transzfekcíó előtt 24 órával leoltjuk. A transzfekciós koktélt úgy állítjuk elő, hogy a FuGehe™ transzfekciós reagenst (Roche Moleeular Biochemícals, #1814443) GptiMBM-mel (Gibco BRL) keverjük össze, majd 5 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, ekkor hozzáadjuk a DNSt, és a koktélt újabb 15 percig inkubáljuk. Közvetlenül a transz*φ** «χ* φ
«*
Φ X ί φ* χ·* adunk a lemezhez. Az 1. és 2. adjuk meg a transzfekciö további adatait.
A 293EBNA sejtek tranziens transzfekcíójához használt reagensek
| Szövette- nyésztő | A beoltott ί száma DNS (gg) FuGene M (ml) A nővesztő ; táptalaj térfo- j gata (ml)
| 35 mm 5*X0s 1,5 9 0,102 i 2
| 100 mm I 2*10* 12 73 0,820 10
700 cm2 | 2xítF 65 400 4,0 100 1
(RB)
2. Táblázat
A
talaj Begyűjtő közeg
DMEMF 12 3:1 Hybrítech bázis
5% PBS 1 mmol/1 Ca2+
20 mmol/l HEFES 20 mmol/1 HEPES
2 mmol/1 L-glutamin 1 gg/ml Nuselin (humán inzulin) |
50 ng/ml geneticin (G418 NEO) 1 gg/ml humán transzferrin í
50 gg/ml tobramicin 50 gg/ml tobramicin
* *** .;♦« »♦**
A kis méretben való transzfekciőhoz (35 mm -10 mm-es edények) a sejteket foszfáttal puffereit sóoldattal öblítjük, majd 24 órával a franszlekció után áttesszük a begyűjtő közegbe, majd a közeget összegyűjtjük, és több napig 24 óránként cseréljük, A nagyméretű transzfekcíők esetében (700 cm2-es forgó palackok) a forgó palackokat a transzfekciö után 48 órával foszfáttal puíferelt sóoldattal öblítjük, majd a sejteket begyűjtő közegbe tesszük. Á közeget összegyűjtjük, és legalább 10 napig 24 óránként cseréljük. Az ezután következő fehérjetisztításhoz rutinszerűen
3, Példa
A heterológ fúziós fehérjék tisztítása
a. példa: a Val8-GLP- 1-Fc tisztítása
A nagyméretű transzfekciőkból származó, körülbelül 4,5 liter kondicionált táptalajt (a fúziós fehérje expressziós szintje körülbelül 20 pg/ml) egy CUNO szűrőrendszeren szűrünk át, majd 250 ml-re töményítjük, egy ProFlux tangenciális áramlású szűrőrendszeren keresztül, 10 K-s szűrőmembránt használva. A Vals-GLP-l-Fc-t 5 ml-es HiTrap protein A oszloppal foguk be IxPBS-ben (pH~7,4), 2 ml/perc áramlási sebességgel, majd 50 mmol/1 eíIzomsávvá! (pH-3,3) eluáijuk. 1 ml-es frakciókat szedünk 4 ml !*PBS-t és 100 pl 1 mol/1 TRISZ~t (pH~8) tartalmazó csövekben,
A föziös fehérjét tartalmazó frakciókat (amit SDS-PAGEval és fordított fázisú HPLC-vel (Zorhax C8) határozunk meg)
9#
... «»<* * / :»♦ .♦*» »** egyesítjük, majd Superdex 75 60/60 oszlopra visszük l^RBS-ben (pH~7,4), 10 ml/perc áramlási sebességgel. A pozitív frakciókból 20 ml-eket veszünk csövekbe, majd ezeket egyesítjük. Az egyesített frakciókat azután C4 fordított fázisú kromatográfíának vetjük alá 0,1% TFÁ vízben, 3 ml/perc áramlási sebességgel. A VakGLP-l-Fc-t 5%B (0,1% TFA acetonitrüben) és 100% B közötti gradienssel eluáljuk 70 perc alatt. Az eluálődott frakciókat (3 ml/cső) összegyűjtjük. Az acetonitrílt vákuum-szárítással eltávolítjuk, és 1 ml vizet adunk hozzá,. A tisztított mintát (kb. 32 ml) kétszer dializáljuk 4 liter IxPBS-sel szemben (pH~7,4).
3b. példa: a VaF-GLP-l-BSA vagy a Yal8-GLP-l-línker-HSA tisztítása
Körülbelül 6,5 liter kondicionált táptalajt (a fúziós fehérje expressziós szintje körülbelül 10 pg/ml) egy CUNO szűrőrendszeren szúrunk át, majd 380 ml-re töményítjük, egy ProFiux tangeneiális áramlásű szűrőrendszert használva, 10 K-s szűrőmembránnal.
A fúziós fehérjét egy 50 ml-es Fást Flow Q oszlopon {Pharmacia} kötjük meg, 20 mmol/l TRÍSZ (pH=7,4) oldatban, 5 ml/per áramlási sebességgel. A fehérjét a következő gradiensSél eluáljuk: 0-50% 20 mmol/l TRÍSZ (pH=7,4), 1 mol/1 nátrium-kioríd 10 oszloptérfogatban, majd 100% B 2 oszloptérfogatban.
A fúziós fehérjét tartalmazó frakciókat egyesítjük, jpajd C4 fordított fázisú kromatográJiának vetjük alá 0,1% TFA vízben, 5 ml/perc áramlási sebességgel. A fúziós fehérjét 20%B (0,1% TFA **'♦* ** * / ί*·. ί*·χ
X χ-χ
XX ν'* «** ν4
X*
Χ«Χ
Χχ» **♦* acetnnítrilben) és 90% Β közötti gradienssel eluáljuk 120 perc alatt. A csövekbe 3,5 ml-es frakciókat szedünk. Az acetonitrilt vákuumszárítással távolítjuk el.
Az egyesített mintából körülbelül 9 ml-t 1 ^PBS-ben (pH~7,4) 40 ml-re hígítunk, majd 4 liter 1*PBS (pH-?,4} ellen éjszakán át dializáljnk. A mintát megszűrjük, majd a koncentrációt 280 nm-en mért abszorpcióval határozzuk meg.
3c példa: az Exendín-4-Fe tisztítása
Körülbelül 4 liter kondicionált közeget (a fúziós fehérje expressziós szintje körülbelül 8 pg/ml) színünk meg egy CUNO szűrőrendszerrel, majd 250 ml-re töményitjük egy PrnFlux tangenciális áramlása rendszerrel, 30 K-s szűrőmembránt használva.
Az Exendin~4-Fc-t egy 5 ml-es HiTrap Protein A oszloppal kötjük meg I*PBS-ben (pH~7,4), 2 ml/perc áramlási sebességgel, majd 50 mmol/1 citromsavval (013=-3,3) eluáljuk. A fúziós fehérjét tartalmazó frakciókat egyesítjük, megszüljük, majd éjszakás! át 4 liter IxPBS-szel szemben dializáljnk. A dializált mintát azután egy Supcrdcx 75 60/60 oszlopra visszük 1 χ PBSben (pH-7,4), ami 0,5 mol/1 nátrium-kloridot tartalmaz, 10 ml/perc áramlási sebességet alkalmazva. Csövenként 20 ml-es frakciókat szedünk, majd a fúziós fehérjét tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, egyesítjük és körülbelül 1 mg/ml-re koncentráljuk. A koncentrált mintákat azután egy M1LLEX-GV 0,22 um Filter Unit használatával szűrjük meg.
Φ ΦΧ** Φ * χ fc ** ζ» 4»«
3d példa: az Exendin-4-HSA és az Exendin-4-línker-HSA tisztítása
Körülbelül 1,1 liter kondicionált táptalajt (a fúziós fehérje expressziós szintje körülbelül 6 pg/ml) egy CÜNO szűrőrendszeren szűrjük meg, majd 175 ml-re töményitjük, egy ProFlux tangeneíális áramlásé. szűrőrendszer használatával, egy 30K-s szűrőmembránt alkalmazva.
A fúziós fehérjét egy 5 ml-es HiTrap Q Sepharose (Pharmacia) oszloppal kötjük meg 20 mmol/1 TRISZ-ben (pH-7,4), 2 ml/perc áramlási sebességgel. A fehérjét 0-50%-os 20 mmol/1 TR1SZ (pH-7,4), 1 mol/1 nátrinm-klorid 12 oszloptérfogatban készített gradienssel majd 4 oszloptérfogat 100%-os Elvei eluáljuk.
A fúziós fehérjét tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd C4 fordított fázisú kromatográfíának vetjük alá 0,1 %-os TEA vízben, 5 ml/perc áramlási sebességgel. A füziős fehérjét 10%B (0,1% TEA acetonitrilben) és 100%B közötti gradienssel eluáljuk, 70 perc alatt. 10 ml-es frakciókat szedünk, majd a fúziós fehéxjét tartalmazó frakciókét egyesítjük. Az acetonitrilt vákuumszárítóval távolítjuk el.
Az egyesített mintából körülbelül 8 ml-t 4 liter 1*PB8 (pH~7,4) ellen éjszakán át dializálunk, A mintát megszüljük, majd a koncentrációt 280 nm-es mért abszorpcióval határozzuk meg. A dializált mintát azután egy Superdex 75 60/60 oszlopra visszük 1 xPBS-ben (pH-7,4), ami 0,5 mol/1 .nátrium-klorídot tartalmaz, 2 ml/perc áramlási sebességet alkalmazva. Csövenként 3 ml-es frakciókat szedünk, majd a fúziós fehérjét tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, egyesítjük, töményítjük, és megszűrjük.
4, Példa
A fúziós fehérjék jellemzése SDS PAGE-val
SOS-FAGB-t, majd immunblottolást használunk mind a tisztított fúziós fehérje, mind a különböző fúziós fehérje exp~ resszíós vektorokkal transzfektált sejtekből származó kondicionált táptalaj elemzésére. Az SDS-PÁGE-t egy Növés Powerease 5OÖ rendszeren hajtjuk végre, előre kiöntött Novex 16%-os TRISZ-glicin géleken (EC6498), a futtató puifer 10* LC2675, a míntafelvivő puffét L2676. A felvitel előtt a mintákat 50 mmol/1 DTT-vel redukáljuk, majd 3-5 percig 95 C-on tartjuk.
Az SDS-PAGE gél futtatása után vizet és transzfer puffért (toTRlSZ-glicin Seprabuff (Owl Scientihc Cat. No. ER26-S) 20% metanollal) használunk az SDS-nek a gélekről való leóblítésére. Egy Novex transzfer berendezést használunk PVDF-fel (BioRad Cat, No. 162-0174) és nltrocettulőz membránokkal (BioRad, Cat. No. 1703965 vagy 1703932). A transzfert szobahőmérsékleten hajtjuk végre, 90 percig, 30-35 V feszültségen. A membránokat 1-12 óra hosszat 4 cC-on IxPBS-ben blokkoljuk, ami 0,1% Tsveen-20-at (Sigma, Cat. No. P-7949) és 5% tejet (BioRad, Cat No. 170-6404) tartalmaz. Az ellenanyagokat IxPBS r 5% tej oldatban hígítjuk, majd a biottokat ezekben az oldatokban inkubáljuk 1-2 óra hosszat, 4 C-on, Az ínkubálások között a ♦« *<»« w?
bioitokat négyszer 5 percig mossuk Ιχ-PBS és 0,2% Tween~2Ö összetételű oldattal, szobahőmérsékleten. A PBS-t vagy a GIBCO 1ÖX PBS-ből (Cat. No. 70011) állítjuk elő, ezzel 1 mmol/1 egybázisos kálium-foszfát, 3 mmol/1 kétbázisos nátriumfoszfát, 153 mmol/1 nátrium-klorid pH~7,4 összetételű oldatot kapunk, vagy a Sigma PBS zsebeiből (Cat. No. 1000-3), így 12 mmol/l nátrium-klorid, 2,7 mol/1 kálium-klorid és lö mmol/1 foszfát pH-7,4 összetételű oldatot kapunk, 25 °C-on.
A primer ellenanyagok vagy poliklonális kecske antí-lgGl vagy nyűi anti-HSA ellenanyagok. A szekunder ellenanyag vagy anti-kecske IgG HRF vagy anti-nyűl IgG HEP. A szekunder ellenanyagot 1:50ö arányban hígítjuk. A biottok előhívásához egy EC.L rendszert használunk (Amersbam Pharmacia Biofech, Cat. No. RN2108 és Cat. No. RPN1674).
A 3A ábrán a tisztított Fc fehérjét hasonlítjuk össze a p3BÖ2-Vals-GLP-l-Pc~vel és pJB02-Exendin-4-Fc-vel transzfektált sejtekből származó kondicionált táptalajjal. A mobilitás csökkenése összhangban van a fúziós fehérje GLP-1 része miatt megnövekedett mérettel. A 3B. ábra hasonlóképpen hasonlítja össze a tisztított HSA-t a pdB-VaP-GLP- < -HSA-val, a pJB-VaP-GLP-llinker-HSA-val, a p3BG2-Exendin-4-HSÁ~val vagy a pJB02~ Exendin-4-linker-HSÁ-val. A 4. ábrán a tisztított fúziós fehérje
5. Példa
A fúziós fehérjék jellemzése tömegspektroszkópiával ίο;
X Φ X ♦ * ♦♦♦ φ»X φ Φ ♦ ,,*♦ »«# «♦
Minden kísérletet egy Micromass TofSpec-2E tömegspektrométerrel végzünk el, ami Time tag Focnsíng elektronikával, egy Reflectron-nal (a 0-8000 Da peptid-tariomány elemzésére lehet használni), egy Lineáris detektorral (a magas tőmeg/jó jel elemzés során használjuk), egy Fost Aeceleration detektorral (vagy P.A.D,, a magas tömeg/rendkívül alacsony jel elemzésnél használjuk) van felszerelve. A berendezés effektív mérési útja Lineáris üzemmódban 1,2 méter, a Refieetron üzemmódban 2,3 méter. Két míkro-csatoma lemez detektort szereltünk be a lineáris és a refeklron üzemmód detektálására. A használt lézer a Laser Science Inc, VSL-337Í nitrogén lézere, ami 337 nm-en működik, másodpercenkét öt lézer impulzust ad le.
Á berendezés lineáris üzemmódban működik a szóban forgó GLP-1 fúziós fehérjék elemzése során. A lineáris detektor egy olyan berendezés, ami kimutatja azokat az ionokat, amik a MALDl-ToP-MS berendezés repülési csövében lefelé haladnak. Méri az ion túlsúlyt az időben, és a konverzióhoz jelet küld a digitalizálőba. A digitalizáló egy analóg-digitális konverter, ami lehetővé teszi, hogy a tömegspektrométerből származó jelet átvigyúk a számítógépbe, ahol egy használható m/z spektrummá alakul át.
Ionizációs mátrixként átkristályosított telített mustársav oldatot (50/50 Acn/viz és 0,1% TPA-ben hígítva) használunk. A mustársav megfelelő mátrix a IÖ kDa fölötti fehérjékhez. Megfelelő tömegű referencia fehérjéket használunk belső és külső kalibrációs fíle-okként, azzal a céllal, hogy az elemzett mintákból
10' *» a tömegeket pontosan meg tehessen határozni. Mindegyik mintát úgy elemeztük, hogy 1:2 arányú minta:mátrix hígítást használtunk. Á berendezést kiindulásként az alábbi lineáris detektor kondíciókkal indítottuk:
Forrás feszültség; 20 keV Impulzus feszültség: 3,0 Extrakeié feszültség: 20,0 keV Lézer durva; 50
Fókusz feszültség: 16,0 keV Lézer finom: 50
Lineáris detkter 3,7 keV
F xA.E»:
Ezeket a. beállításokat szükség eseten módosítjuk, hogy a legjobb jel/zaj arányt, és a legmagasabb felbontást kapjuk. A 3. táblázatban a különböző GLP-1 meg.
3.'
Fúziós fehérje Várt tömeg ÍkDa) rozott tömeg (kDa)
VaF-GLP-L-IgGl 59,08 61,94
VaI®-Glu22-GLP~1 -IgG 1 59,23 63,61
GlyS-OLP-l-IgGl 50,0 62,93
VaF'-GLP-I CEx-IgGl 60,45 65,1-65,6
VMM3iú^-GLP~l-CEx~-IgGI 60,69 65,86
Exendin~4-.I.gG 1 60,69 65,86
ΙΟ* ♦ φ
ΧΦΦ *
Μ Φ « Φ
- φ Φ Φ ♦ » * * ♦ φχ*
Val8- GLP-1 -bnker-HSA 70,70 69,89, 70,74 |
Exendin-4-H3.A 70,56 70,62 | .........-.......................
Exendin-4-linker-HSÁ 71,56 71,62 |
A CEx jelentése C-termináMs ext enzió, és a kővetkező szekvenciát tartalmazza: Ser-Ser-Gfy-Aía-Pro-Pro- Pro- Ser.
A línker Gly Gly-GIy-Gly-Ser-Gly-GIy-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-GlyGly-Ser.
6. Példa
A heterológ fúziós fehérjék aktlvitásá
A jelen találmány szerinti fúziós fehérjéknek azt a képességét, hogy a GLP-l receptort aktiválják, in vitro esszékkel becsüljük meg, amiket az EP 619,322 (Gelfand és munkatársai), valamint az 5,120,712 számú Amerikai .Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban írtak le. Ezen vegyületek aktivitásának a VaP-GLP-l (7~37)OH aktivitásával való összehasonlítását a 4. táblázatban ismertetjük. A 8. ábrán a VaI8-GLP-1 és az Exendin~4 fúziós fehérjék in. vitro dózis-hatás görbéit láthatjuk. Emellett az 5a. és 5b. táblázatban a GLP-l analógok egy nagy csoportjának ín rifro aktivitását mutatjuk be, amik egy Pe vagy egy albumin fehérjéhez lehetnek fúzlonáltatva, biológiailag aktív fúziós fehérjék előállítása céljából, Ezeket az aktivitásokat a GLP~1(7~37)OH aktivitásával hasonlítjuk össze.
4. Táblázat φ φ
A GLP-1 fúziós fehérjék ín váró aktivitása
I Fúziós fehérje Jn vám aktivitás ί (aVai8-GLP~l %-a)
VaF-GUM-IgGl 240
j_ Exendin-4-IgGl 240
VaP-GLP- l-linkenSsA
Exendin-4-HSA 20
Exendin-4-Iinker-HSA __
Exendin-4 500
Val8-Giu22-GLP- 1-IgG i 3,7
1 GlyS-GLP-i-ígGl 3,3
Val»-GLP~l-CEx-ígGl 3,3
Val8-Glu22~GLP-1 -CEx-Igöl 29 |
Gly8-Glu22~GLP~ 1 C2 -IgG 1 75
GÍy®~Glu22-GLP~1 CEx-linker-ígG 1 150
Exendín~4~€2-IgGl 250
Bxendin~44inker-IgG 1 330
Glys-GIu32~GLP~ L-CEx-iinker-HSA 4
Glys-Glu'^-GLP-1 ~CEx~lmker~IgG4 80
CEx jelentése C-termináiis extenzió, és a kővetkező szekvenciát tartalmazza: Ser-Ser-Giy-Ála-Pro-Pro-Pro-Ser.
Á linker Giy-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Giy-Giy-Ser-Gly-Gly-GlyGly-Ser.
C2 jelentése Ser-Ser-Giy-Ala-Ser-Ser-Gly-AIa.
101 '»·♦
A-fc < ΧΦ»
A 3. és 4. táblázatban megadott fúziós fehérjék aminosav szekver
-31. számú szekvencíavázlaton meg, .1
121
181
241
301
361
421
481
541
601
MVEGTFTSfíV SSYLSGQAAK EFIAWLVKGR. YEQQCPFEBH VKLVESVTSF AKYCVAÖESA CCAKÖEPSRü ECFLQHKÖDS FMLPRiVRPE YAPELLFFAK RYOAFTSCC QAAOKAAGLE AFKAWAVARX SQRFPKAEEA EVSZEVT'DLT
GDAHKSEVAH RFKDLGEENF KALVLXAFAQ ENCDRSLHTL FGOELCTvA’F LREYYGSMRS VOVMCT&FHO SEETFLKKYL YEXARRRFYF PKL.ÜELRDEG KASS&KÖRLK CASLQKFGER KVHTECCRGO LLECAOBRAD LAKYICESQS
SISSKLKECC EKFLLEKSHC IAEVCTSEMP ADLFSLAADF VSSKOVCKNY ASAKOVFEGM FÍ,YE¥AER8F OYSVVLLLRL AKTYETTLEK CCAAADPHEC YAOFBEFKP .LVEEPQNL1K QSCSZFEOin EYKFQRALLV KYTKKVPQVS TPTLVEVS'RM LGRVGSKCCK RPEAXRMPCA EOYLSWSNO LCVX.8EKTPV SDRVTXCCTE SETORRPCF.S ALSVDETYVP KSFNAETFTF 8ADICTLSEK ERQXXKQTAL VELVKHKPXA TKEQLKAVMD SFAAFVEKCC KADDKETCFA EEGKKLVAAS· Q&AEGL <13. számú szekvencia)
A VaF-GLP-l-linker-humán szérum-albumín aminosav szekvenciáját a 14. számú szekvencíavázlaton mutatjuk be.
8VEGYFTSDV S-SYLEGQftftK EFIAWLVRGR GGGGGSGGGG SGGGGSDARK SEVARRFKDL 61 GSENFSALVL IAFAÖYLQQC PFEOHVKLW EVTEFAXTCV ADESAENCÜK. SLHTLFGOKL 121 CTVATZRETY GEMASCCAKQ E.PERNECFLQ HKDONPNLPR LVRPEVDVMC TAFHOaEETF
181 LKKYLYEXAR. RHFYFYAPEE L-FF&KRYKAA FTECOQA&DK AACLLFKLDE LROEGKASSA
241 KQRLKCftS'LQ KFGER&FKAW AVARLS'QRFF KAEFAEVSKL VTDWKVKTE CCHGürLECA 301 DORADLAKYI CEKQöSISSK LKECCEKPI.L EKSHCXAEVE NÜEMPAOLPS LAADFVESKO 361 VCKSYAEAKD VFLGMFLYEY ARRRPÖYSW LLLRLAKTYE TTLERCCAAA DPHECYftKVF 421 DEFKPLVEEP QSLISQSCEL· EEQEGEYKFQ RALLVRYTKK VPQVSTPTLV EVSRNLGKVG 461 SfCCCKHPSAK RKPCAESYLS WLNÖLCVX.H SKTPVSDR7T KCCTESLVNR RPCFSALEVO 541 ETYVFKEFSA ETFTFRAÖIC Tí.SEKSRQIS KQTA6VELVK 5RF6ATKEQL KAVMOOFAAF 601 VEKCCKADOK ETCFAEESKX LVAASQAALG L (14. szásrá szekvencia}·
A Gly^-Glu22-GLP-1-CEx-linker-humán szérum-albumín aminosav szekvenciáját a 15. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.
HGEGYFVSDV SSYLEEQAAK EFXAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGG8GGGGS GGGGSW1KS
EVAHRFKOLG: EENEKALVLI AFAQlLQQCP FESEVFIVNE VTEFAOCVA DESAENCRKS
121 LHTLFGSKLC TVATUSSTYG EMASCCAKQE PERNECFLQ8 KÖDRPNLFRL VREEVDVMG.T
131 AFHDSSEtTE KSYLYEIARR HPYFYAPELX. FFAKRYXAAF TECCQAAOKA ACLLPKLÖEL
241 RDEGKASSAK QKLKCASLQK PGERAFKAWA VARESQRFPX AEFAEVSKLV TOLYEV^TEC 301 CKGOLLECAÖ DPAD1.AFYIC EWOSISSKL KECCEKPELE KSECIAEVEN OEMPAOLPSL 381 AA15FVESKOV CKNYASAKDV ELGMFLYEYA RRHPOYSWL LLRLAXVYET TLEKCCAAAD 421 PEECYAKVED EFKPLVEEPQ ELWNCSLE SQLGE'YKFGN ALLVR.YTKKV PQVSYPTLVE 481 VSRNLGKVGS KCCK8PSAKR MPCAEÖYLSV VWLCVK8& KTPV5DRV7K CCTESLWP 5-41 PCFSALKVDS TYVPEEFRAS TFTF8AÖICT' LSEKERQIKK QTALVELVKH KPEAYEEQLK 801 AVMDDFAAPV EROCK&DDKE TCFAEEGKKL VAASÖAALGL. <15. száfró szekvenciává slia-tl
Az Ekendin-4-humán szérum-albumin aminosav szekvenciáját a 16. számú szeln^encíavázlaton mutatjuk be.
HCEGTFTS'DL. SKQMEESAVR LFIOSMNGS PSSSAPPPSD AHXSSVAIW KDLGE-ENFKA öl LVL1AFAQYL QQCPFEDHVK LVNSVTEEAK TCVADSSASN CDKSLHTLFG DKLCTVATLR 121 STYGEMADCC AKQEPERSEC ELQHKDÍW& LPRLVRPEVD VMCTAFfME ET'FLKKYLYS 181 XARRHPYFYA PELLFFAKRY KAAFTZCCQA AMAACLLPK LSEERSEGKA SSAXQRLKCA 241 SLQRFGERAF KA^AVARLSQ R'FPKAEFAEV SKLWDL-TKV «TECCHGÖLL ECADDRAO1A 301 KY1CENQOS1 S.SKLKECCEK PLLEXSKC1A EVSNDESPAO LPSIAADFVE SKOVCOfYAE 381 AKOVFLGMEE YSYARRRPOY SWUXRLAK TYETTEEKCC AAAUPSECYA KVFSEFXPLV 421 EEPQNLI.KQN CEZFSQLGEY KFQNALLVRY TKKVPQVSTP TLVEVSRELG KVGSKCCK8.P 481 EAKRMP0AE8 YLSWLNQLC VLREKT'PVSO RVTKCCl'SSL VNRRPCFSAL EVDETYYFKE 541 FNAETFTFHA 81CTLSEKER Q1SKQTALVE LVKHEFKATK EQLKAWDDF AAFVEKCCKA
601 ÖDKETCFAES GKK1VAASQA ALGA (16. száísű szekvencia vázlat)
Áz Exendin-4-linker-humán szérum -albumin aminosav szekvenciáját a 17. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.
HGBGTFTSDL SKQÍÍEEEAVR LFl.OfLKNGG PS'SGAPPPSG GGGGSGGGGS GGGGSOAKSS 81 EVA8KFKDLG EENFKALVLI AFAQ U.QQCP FEOHVKLWE- VTEFAXTCVA DE3AENCERS 121 LSTLFGOKLC TVATLRETYG EMASCCAKQE FFRSECFLQ8 KDDSPNERRE VRPEVDWCT 181 AFH'DNEETFL KKYLYE1ARR HFYFYAPELL EFASRYKAAF TECCQAAÖEA ACLLPKLDEL 241 ROEGKASSAK QRLKCASLQX FGERAFKÁWA VARLSQRFPK- AEFAEVSKLV TDLTKV8TEC 381 CHGDLLEGAD OBACLAKYXC ERQSS1S3KL KECCEKPL-LS KSHCXAEWí OEMPAOLPSL 381 AAOFVESKSV CKSYAEAKBV FLGMFLYF.YA RRRPPYSWL LLPLAETYET TLEKCCAAAD 421 PH-ECYAXVFO EFKPL-VEEPQ NLÍKQMXLE EQLGEYRFON ALLVRYTKKV PQVSTPTLVS 481 VSRNLGKvGS XOCKHPEAKR MPCASOYLSV VEMQLCVLHE KTPV.SORVTK CCTESLWRR 341 .PCFSÁLEVDE- TYVFKEFSAE T'FTFHADICT LS-EXERQIKK QTALVELVKH KPKATKEQLE' 601 AVMDOFAAFY SXCCKAODKE TC'FAEESKKL VAASQAALGL (17. számú szekvenciavázlat5
Wí „V «Φ** ** « * » * «X* ♦ * * * * **
A VaIa-GLP-l-lgGl aminosav szekvenciáját a 18. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be
BVEGTFTSOV SSYLEGQAAK SFIAWLVKGR. GAEPKSCOKT' RYC'PFCFAPE. LLGGPSVFLF
PPKPKOTOU SRTPSVTCW VOVSHEDPEV KFNWVDGVE. VRRAKTKPRE EQYNSTYRVV 121 SVLTVLSQfM L8GKSYKCXV SNKALP&FIE KTXSKAKGÖP REPQYYTLPP 3RES23TKNQV 181 SETCLVXGFY RSOIAVEWSS R'GQPSNNYKT TRPVLDSOGS FYLYSKLTVf) KSRWyQGRVF 241 SCSWHEALH -NHYTQKSLSL SPGK (18. saá»ű szekveneiaváslat)
A Val8-GLPÍ-CEx-IgGl aminosav szekvenciáját a 19, számú
HVESTFT3.DV SSYLFGQAAK EFI&WLVKGR GSSGAPRPSA ZPESCDXT8T .CPPCFAPELL
GGPSVFLFPP KFZDTLMISR '1' PEVTCWVO VS8EDPEVKF WYVOGVEVH RAKTKFREEQ 121 YNS1FYRWSV FTVL.HQOULS GKFYKCRVSN KALPAPÍERT XSKAKGQPRE PQVYT'LPPSR. 181 EFM'TWVSl, TCLVKGFYPS DÍAVEWESW QPBWYKTTP PVLSS.OGSFF LYSKEWDKS 241 RVQQGNVESC SVMHEALENH YTQKSESLSP GK (19. ss.ájnü szekvenciává;: lat)
A Val8~GIu22~GLP-t~IgGl aminosav szekvenciáját a 20. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be
HVEGTFTSOV SSYEEEQAAK EFXMLVKSR GAEPKSC.OKT «TCPPCFAPE LLGGPSVFLF
FPKPKÖTWX SRTFRVTCW VOVSREOPÉV KFNWYVDGVE VfíNAKTXPRE E.QYKSTYRW 121 SVLTVLHQDW WGKEYKCXV S«8LPAPXE KTXSKAKGQP 'REPQVYTLPP SREEMTKNQV 131 SLTCLVKGFY P.SDX&VEWSS' RGÖFSRiYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVO KSWÖGNVF 241 SCSVMHE&ZH aHYTQXSLSL SPGR (20. számú sxekvencíaváslat)
A Vals-GIu22-CEx-GLP-l~lgGÍ aminosav szekvenciáját a 21. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be
HVEGTFTSDV SSYLEE.Q&AK &F.IAWLVKOK GSSGAPPPSA EPKSCOKTRT CPPCPAFEU.
GGFSVFLFPP SPKD7LMISR TFEVTCVVVE VSHSDPSVKF WYYDGVEVR RAKTKRREEö
121 YSSTYRVV3V LTVL8QDWLS GKEYKCKVSN KAX.P&PIEKT ISKAEGQPRE PQVYTLPPSR
181 EEMTKSQVSL TC'tVKG'EYPS DIRVEVESNG OPE'NNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS * *· * 9 ♦ »♦* j**. : .
....... ** *** *** »9
241 R-W-QQGNVFSC SWM5M YTQESLSLSP GR. '21. számú szekvencia vázlat?
A Glys~Glú22-GtP-l~€2~igGl aminosav szekvenciáját a 22. számú
HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFI&WLVKGR GSSG&SSGA& EPKSCDKTHT CPPCPAFEEL 61 OGPSVP1.FPP KPKOTUíXSR TPEVTCVWD· VSBEDPEVRF WYVDSVEVH' SAKTRFEESQ 121 YSSTYEVVSV LTVLHQ.DWW GREYKCRVSS KALFAPΣ EXT ISKAKGQ'PRE PQVYTLPPSR 181 ESMOTQVSL TCZWG'FYPS DIAVESESSG QPENNYXTTP PVLDSDG'SFF EYSKLTVOKS
241 RXQQGNYFSC SVMXS&UM YTQESLSGSP GS (22. számú szekvenciává»lat}
A Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-línker~IgGl aminosav
23. számú
HGSGTFT'SDV SSYLSEOAAR EFIMLVKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGS&FPKSC 61 OKTRTCPPGF APELLGG-PSV FLFPPK.PKUT LHISRTPEVT CWVDVSHED P.EVKFNWYVD 121 GVEV««KTK PREEQYN8TY RW3VLTVHI. OWLNGKEYK GKVS'KKALPA FIEKTIS.KAK 181 GQPREPQVYT LPPSKSSMTK' BQVSLTCLVK GFYPS.Ö1SVE WESNGQPERS YKTTPPVLDS .241 OGSFFLYSKE TVCKSRWQQS MVFSCSVWS AWEYTQKS' LSLSPGK {23. számú szekvenciává zlat) számú
MxUFMA aminosav mutatiuk be
HGEGTFTSDV SSYLESQAAK EFlASfLVKGR GSSGAPPPSG GGOSGGGGSG GGG3AESKYG 61 PPCPSCPAPE FLGGPSVFLF PPKPSETUU SRTPEVTCVV VOVSQK&PEV QFWYVDGVE 121 VENAKTKPRE EQFSSYYRVV SVLTVLX$DW LSGKSYKCKV SSKGEPSS1F RTISKAKGQP 181 REPQVYT1.PP SQESWXS$V SETCLVKGFY PSDIAVFVFS SGQPESRYKT TPPVLD.SÜGS 241 FFLYSRETVD KSRWySGRVF SCSVMHFAE8 SHYTQKSLSL SLGR <24. szárúi szekvenc i av á zlat)
A Glys-Giu22~GLP- l-CEx-2.1inker-IgG 1 aminosav 25. számú szekvenciavázlaton
I HGEGTFTSÖV SSYLEEQ&M EF1AWLVKGR GSSGAPPPSG GGGSSGGGSG GGGSGGGGSS
Hí
Φ* » χφ* * “.<♦* **
GGCSGGGGSA EPKSCDKTHT CPPCFAPELL· 121 VSHEDPEVKF WYVDGVEV8 EAKTKPREEQ 181 KALPAP2EKY TSKAKGQPEE PQVYT.LPRSR 241 QPERNYKTT'P PVLOSDGSFF LYSKETVDKS 381 GK (25. szái&ü szekvenciavázlat)
GGPSVFLFPP KPKSTLMISR TPEVTCWVO YSSTYRVVSV LTVLSQDWLN GSEYKGWSN EEHTSSQYSL TCEWGFYPS D1AVEWESRG RRQQGMVFSC SVMHE&LHBH YTQKSLSLSP 25. szátaű szekve-nciavázlat)
-GLP-1- 21in.ker IgGl aminosav szekvenciáját a 26.
RGSGTFT'SDV SSYLEEQOK EFIAWLVEGR GGGGGSGGGG SGO3GSGGGS SGGGGSGGGG 61 SAEPKSCOK? HYCPPCRAPB LLGGPSWLF PPKPKDTWX SS7PSVTCVV VDVSRS&PEV 121 KFWYVOGVE VHXAXTEPRE EQWSTYRW SVLTVLKQDW ANGKFYKCRV SNKALPAPIE 181 KTISKAKGQP RKPQVmPP SREEMTOQV SLTCLVKCEY PSDXAVEWES NGOFOTOKT
241 TPPVLÖSDGS FFLYSKKV& KSRWQQGRVE SCSWHEALH RHYTQKS'LSL SP.GK £26. szSríú s2-ekvenc 1 «vázlat;
számú
2CEx-IgGl aminosav be a 27.
HGEGTFTSDV SSYCEEQAAK EFIASLVKGS GSSGAPPESS SGAPPPSASP KSCDKTHTCP 61 FCPAPSLLGG PSVFX.FPPKP K8TI.MTSRTP EVTCWVDVS REÖREVKSW YVCGVEVFKA 12.1 KTKPRECQYS STYRWSVLT VLKQÖWLSGK EY.K.CKVSHKA LPAPXEKTIS KAKGÖ'PRE'PQ 181 VYTLFPSREE MTOÖVSLTC LVKGEFFS81 AVSVFSNGQE E&SYKTTPPV LOSDGSFPLY 241 SKLTVORSRW QQGSVFSCSV MREAL8SSYT QKSLS'LSPGK £27. s zássá sze.kvenciavázlat;
A GIy8-Glu22-Val2S-0e33-GLP“l-CEx-iinker-IgG.l aminosav szekvenciáját a 28. számú ssekvenciavázlaton mutatjuk be
HGEGTFTSOV SSYCEEQAVK EF1SVLIKGS SSSGAPRPSG GGGSGGGGSG GGGSAEPKSC 61 DKTHTCPPC? APELLGGPSV FLFPPERKÖT LM.TSRTPEV? CWVDVSHEO PEVKFWYVO 121 GVSVHNAKTK PREEOYMSTY RWSVLTVES QDRLNGKEYK CKVSWALPA FIEKT1SKAR 131 GQPKEPQVY? LPP3EEE»K RQVSLTCLVK GPYPSDIAVE WESNGÖFEm YKTTPPVLBS 241 DGSFFLYSKL TVOKSR^R RVFSÜSVSSE A6SN8YTQXS L3LSFÖK (28. szátó rn kvencisvá ζ 1a t;
Az Exendin-4-IgG 1 aminosav szekvenciáját a. 29. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be
KGEGTFTSOL SKCMSSSAVR LEIEWLXKGG RS3GAPPPSA ZRKSCDKTBT CPFCPAREL1 61 GGPSVFLFPP KPXDTLMISR TPEVTCWVD VSREOPEVKF WYVOGVEVM HAKTKPRESO 121 TOSTYRWSV LIVLHQDWLN GKEYRCKVSN KALFAP'ÍEKT ISK&KGQPRE PQVYTLPPSR 181 EEMTKEQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTF FVZ-OSOGSFF LYSKLTVDKS 241 'RXQQGWESC SWHFALHNH YTQSSLSLSP GK <29. szálró szekvencia)
Az Exendín-4-C2~IgG 1 aminosav szekvenciáját a 30. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be
KGEGT'FTSDL SKQMEEE&VR LFIZWLOGG PSSGASSCAA EPKSC'DOKT CPPCPAPELL· 61 GGPSVFLFFP KPKDTtMÍSR TPFVTCVWD VSHEOPEVKF mWOGVEVH NAKTKPREEQ 121 YNSTYRWSV LTVGRQD^LK CKEVSCKVSS KA1.PAPIEKT TSKAKGQPRE PQVYTLPPSR ISI EEM’iKNOVSl, TCLVKGFYPS D1AVEÍ4FSSG QFENRYKTTP FVÚSSÖSSFF LYSKLTVDKS
241 RWQQGNVFSC SVMHEALHSH YTQXSlslsf GK <30. számú szekvenciavázlat}
Az Exendín-4-.linker-lgGI aminosav szekvenciáját a 31. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be
HGEGTFTSDL: SK0MEEEA7R LFIFSLFNGS P53GAPPPSG SGGSGGSGSG GGSSAEPKSC 61 DKTHTCPPCP APELU3GPSV F.LFPPKPKOT LMI5RTP.EVT CWVWSHED PSVKFWYVP 121 GVEV8NAKTK PREEQYNSTY RW3VLTVLR QÖWLSGKSYK CKVSNKAZFA PÍEKTtSOK 181 GÖPREFQVYT ÚPPSSEEWK N0V3LTCLVK GFYPSOIAVE WSXGQPENM YKTTPPVLOS
241 DGSFFLY.SXE TVÖXSRWQQG NVFSCSWÍHE AUINHYTQKS LSLSPGK <31. sz átíró •szekvencx avázi at 5
5a. táblázat
Janiim GLP-1
GLP-1 vegyüiet aktiválás * » * * * w Λ ♦*» * ♦ ’ .♦-*.·♦ *' . w * χ»·β.« ♦··#·* ** ****** π;
««
1(7-37
GLP-1 (7-371 ín ~ 61
-1 (7-37
VaF-Alas-GLP~l (7-37)
0.021
r.
•1 (7Vai®-Tyria-GLP-1 (7-37 ) OH VaF-Glu^-GLP-1 (7-37 ) OH V&F-Ala^-GLP-l {7-37) OH Val®-Tyr^-GLP-1 ( 7-37 ) OH Val8~Lys'20-GLP-1 (7-37 ] Gln22-GLP-1 (7-37)OH
0.81
0.112
1.175
0.33
0.42 (7-37) VaF~Ser22~GLP~l (7-37 ) >22-GLP-M 7-37
0.50
0.40
Vals-GIu22~GLP-l (7-37 )
Val8-Lys22-GLP-1 (7-37 •1 (7-37) JP-Í (7-37 ) íö 1 (7-3 6)
22-GLP-l í 7-3 6
H2
Gly®-Glu22-GLP-1 ( 7-37 Val8-Lys23-GLP-1 (7-37}
14
0.53
1.0
1.07
X *
7-37) ΟΗ
0.007
1Κ > « •Λ * *♦··$* χ
* * « ♦ *·« « * «♦ *β * * ♦ * * * »*»<> #* χ *
V'aH-Lys'^-GLP-l ( 7-37 ) ΟΗ
0.02
VaR~His^~GLP~l (7-37 ) OH
1.6
Va1S~nhr^-GÍP-1 /7-37 1 OH
7-37 )
GlyM31u30-GLP-I ( 7-37) OH Vais-Glu3ö-GLP-1 (7-371 OH ^-GLP-1 ( 7-37 ) OH
1.5
0.37
0.47
0.29
0.29
0.15
-Hís3ö-GLP-1 ( 7-37 ) OH VaF-Glu33-GLP-1 ( 7-37 VaF-Ala^-GLP-1(7-37)
3LP-1 (7 -37
VaU-Glu^-GLP-1 (7-37
Val8-Pro3S-GLP-1(7-37 ) OH
VaH-His3S-GtP-1(7-37 1
Val»~Glu3s~GLP-l (7-37 ) O •1 (7-37 1 Ol
Váís-Hi5p&-GLP~I ( 7-37 ) OH
-37 1 OH
0.41
0.15
0.11
0.22
0.33
126-GLP-1(7-37
0.37
IP
Φ φ<6
ΦΦ «Γ*** ** „„ φ *
Μ X * * ν, φ ** Φ'**
Λ* * *. * ψ’»« Φ·Φ* ** φφφ ΦΦΦΦ
Vais-Lys^-Glu23-GLP-1 (7-37; VaP-OKP2· .Ala2? -GLP·· 1 (7-37) VaF-Glu^-tys^-GLP-1 (7-37
3LP-L (7-37) i^-GLP-1 (7-37
VaF-Gly^-tys^-GLP-l ( 7-37 Vais-Giy^-Prö'^-GLP-1 (7-37)
1.43
0.08
In vítro GLP-1
I vei
-1 R
Aktiválás
GLP-1 (7-37) OH 1.0
VaP-GLP-1 (7-37) OH 0.47
Glys-GLP-I (7-37) OH 0.80
; VaH-Tyr^-GLP-l (7-37) OH ........................................................................... ..... : 0.80
Vais-Tyr^-GLP-I (7-36) HH2 0.52:
Vals-Trpí2-GLP-1 (7-37) OH 0.52
VaIs-Leu16~GLP-l (7-37) OH. 0.52
Val8~VaRö~GLP~ 1 (7-37) OH ! 0.52
| VaF-TyH6-GLP-1 (7-37) OH 1.18
Glys~Gíu22-GLP-1 (7-37) OH 1.03
π;
ΦΦ *»·♦♦ φφ φ· φ».
φ φ φ ?φ φφ φ φ φφ* J**·* φ » * χ * β X φ
ΦΦΦΤΦ *φ* φφ Φ* φ Χ ΦΦ*
VaF~Leu25~GLP~l (7-37) OH
-Tvr*6-
Val8-Trp1&-Glu22-GLP~1 (7-37) OH 2,30,2.16 I
Vals-Leu16-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 2.02
ValMleí6-GIu22~GLP-l (7-37) OH 1.55
VaF-Phe^-GIu22-GLP-1 (7-37) OH 1.08
Val8~Trp^~Glu22~GLP-l (7-37) OH 1.50,3.10
VaP-Tyr^-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 2.40, 2.77 .................. ' .........................
Val®-Phe*8-Giu22-GLP~1 (7-37) OH í 0.94
VaIMlei8-GIu22-GLP-l (7-37) OH VaH-Lys*8-Glu22-GLP-l (7-37) OH Vals-Trp19-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 1.88 1.18 1.50
Val®-Phe^-Glu22-GLP-1 (7-37) OH í P b b ~-4 o j
Val8-Phe20-Glu22~GLF~l (7-37) OH
VaH--Glu2a-Leu2s5-GLP-1 (7-37) OH 1.32
VaF~Glu2Mlea5~GLP~í (7-37) OH 1.46
V&l8-GIu22-Vai2s-GLP~l (7-37) OH 2.21, 1.36
1 VaF-GkP-Mle27 -GLP-1 (7-37) OH | 0.94
.*% :**« 4 4*<
.«* **. «** ·44>
I κ
Peptid Szekvencia In rifrn aktivitás (a Val8- GLP-1(7- 37>OH %-a)
ΝΗ2 6.21
8GAPPPS-NH2 6.75, 3.25 i
HVEGTFTSDLSKfJMEEEAVRLFlAWLVKGRG 2.86
«V» ^ ** »· π;
¢4 ** «, * 9 *
X* * * **
A VaP~GLP~Ι-IgGl és a Val<WLP--l-HSA m vivő farmakokine7.
XX *
A Val®-GLP-1-IgG 1 és a Vak-GLP-1-BSA farmakokinetikai vizsgálatát cynomologous majmokban hajtottuk végre. A majmoknak 5,6 nmol/kg dózist adtunk be tisztított Val®-GLP-1IgG 1-ből vagy Val®-GLP-l-HSA-ból. A vegyuleteket intravénás boius tonnában adtuk be. Vért a dózis beadása előtt, valamint 0,083, 0,25, 0,5, 1, 4, 8, 12, 24, 48. 72, 96, 120, 144, 168 és 216 órával a dózis beadása után veszünk EDTA-t tartalmazó csövekbe. Az immnnreakfív YaF-GLP-I plazmakoncentrációját radioimmunesszével határozzuk meg, ami olyan poliklonális antíszérumot alkalmaz, ami elsődlegesen a Val®-GLP~ 1(7-37) N-terminális (7-16) régiójára specifikus. A 9. ábrán a Val®~GLP-l-IgGl és a Val®-GLP-1-HSA plazmakoncentrációját mutatjuk be, két cymomologous majomnek beadott egyetlen intravénás dózis után. Az Fo fúziós fehérje felezési ideje körülbelül 45 óra, és az albumra fúziós fehérje felezési ideje körülbelül 87 óra.
8. Példa
Az Exendin-4-lgG 1 in tévő farmakodinanukája
Két krónikusan kanűlözött normális beagle kutyát tanulmányoztunk éjszakán át való éheztetés után. Az- artériás és vénás vaszkuláris hozzáféréseket használjuk, és egy katétert szúrunk be perkután egy agyi vénába és rögzítjük. Az állatokat ketrecekbe tesszük:, majd katétereiket egy forgőgyürü/rögzítő rendszerhez kapcsoljuk. Az Exendin-4-ígGl-et tartalmazó fúziós fehérjét (11,8 pmol/l) injekciózzuk intravénásán az agyi véna katéterén keresztül. A katétert azután lö ml sőoldattal átőblit11?
'*♦ ♦ *** ** ν Λ * . »4* «·** »«·*«· ♦** *·* jük. Két órával később egy hiperglikémíás (150 mg/dm3) szőritől iniciálunk, majd 3 óra hosszat folytatjuk. Artériás vérmintákat veszünk ez alatt az ötórás periódus alatt, bogi' meghatározzuk a fúziós fehéíje, a glükóz és az inzulin plazmakoncentrációit.
Ennek a vizsgálatnak az eredményeit hasonlítjuk össze azokkal, amiket egy hasonló, korábbi vizsgálattal, amiben mindkét állat sóoldat hokist kapott szubkután, majd 3 órával később vizsgáljuk egy háromórás hipergkkémiás (150 mg/ dm3) szőritóval.
Mindkét vizsgálatsorozatban a plazma glükóz koncentrációját Beckman glükóz analizátorral határozzuk meg. A plazma inzulin koncentrációját a tinco Research, Inc. alkalmazottjai határozták meg, a laboratóriumukban kifejlesztett RIA kit használatával. Az adatokat a IÖ. és 11. ábrán mutatjuk be,
A GIv®-Glu22-GLP-l-CEx-binker-lgGl in rioo farmakokinetikája
Három normális hím beagle kutya kapott ö, 1 mg/kg Gly®GÍu22-GLF-l-CE3£-bínker-lgGl-et szubkután vagy intravénás beadással. A Gly®-Glu22-GLP~l~CEx-Linker-lgGl immunreaktivitás plazmakoncentrációit radioimmunesszével határozzuk meg, olyan mintákban, amiket mind az intravénás mind a szubkután csoportban a dózis beadása előtt 30 perccel egészen a dózis után 216 óráig veszünk. Ezeket a koncentrációkat azután arra használjuk, hogy meghatározzuk a közölt farmakokinetikai paramétereket. Az intravénáson beadott Gljri-Glu^^ GLP-l-CEx-Linker«Μ * *·♦' λΙ- ♦ »«** **** 4» *$*
12ί
IgGl átlagos eliminációd felezési ideje körülbelül 55 óra, és a testből való teljes kiürülés 1,5 ml/ó/kg. A szubkután beadott Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgGl átlagos elimináciős felezési ideje körülbelül 38 óra.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat, amiket számítógéppel olvasható formában is mellékelünk.
SZEKVENCIA LISTA < 110> Eli Lilly and Company <12O> GLF-1 fúziós fehérje <130> x-13991 <150> US 60/251,954 <15.l> 2000-06-12 <160> 35 < 170> Patent in version 3,1 <210> 1 <211> 31 ** * V** φ « « * *Χ .♦ *** *** 1 «
4·»» »»»* *» £» «'*»
22:
<213>
His Ma Slu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Sly
5 10 15
Gin Ma Alá Lys Glu Phs Ile Alá Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
25 30 <210> 2 <2ii> :
<220>
21>
;s tűk 2) <223> Xaa. a 2. Asp, vagy Lys;
Glv, Ser, Thr, Len, Ile, Val, Glu, <221 > Vegyes <222> (3) . . (3) <223> Xaa a 3.
<22O>
<221 > Vegyes tulajdonság <222> (5) , . (5) <223> Xaa az 5. pozícióban Thr, Alá, Gly, Ser, Leu, he, Val, Glu,
Asp, vagy Lys;
<220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (8)..(3) <223> Xaa a 8. pozícióban Ser, Alá, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, vagy Lys;
<221 > Vegyes tulajdonság <222> (10)..(10) <223> Xaa a 10. pozícióban Val, Alá, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu Asp, vagy Lys;
<220>
«221 > Vegyes tulajdonság <222> (11)..(11) <223> Xaa all. pozícióban Ser, Alá, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp vagy Lys;
<220>
«222» (12).412) <223» Xaa a 12. pozícióban Ser, Alá, Gly, Thr, Leu, lle, Val, Glu, Asp Lys, Trp vagy Tyr;
«220» <221> Vegyes tulajdonság <222» (13)..(13) <223» Xaa a 13. pozícióban Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gin, vagy Lys;
«220» <221» Vegyes tulajdonság <222» (14)..(14) <223» Xaa a 14. pozícióban Leu, Alá, Gly, Ser, Thr, lle, Val, Glu, Asp, Met, Lys, Trp vagy Tyr;
<220» «221» Vegyes tulajdonság <222» (15)..(15) <223» Xa.a a 15. pozícióban Glu, Ásp, vagy Lys;
<220» <221» Vegyes tulajdonság <222» (16)..(16) «223» Xaa a 16. pozícióban Gly, Alá, Ser, Thr, Leu, He, Val, Glu, Asp Trp vagy Lys;
VX
Ζ ΑΧ <220>
<221 > Vég <222> (17),.(17) <223» Xaa a 17.
ι, Asn, Arg, Glu, Asp, ys;
<221 > Vegyes tulajdonság <222> (18)..(18) <223> Xaa a 18. pozícióban Alá, Gly, Ser, Thr, Leu, He, Val, Arg, Gin Asp, vagy Lys;
Asp vagy Lys;
/es ) . . (2( a 20.
sag ?s, Arg, Gin, Glu, Asp, vagy His;
<
X «
Ϊ2ί # 99
9 9
9. * ♦ * 99 9 * * * <223> Xaa a 21, > Xaa a 24. vagy Lys;
Ser, <220>
<221> Vegyes <222> (25)..(25) <223> Xaa a 25. pozícióban Trp, Phe, Tyr, Glu, Ásp, <222> h
1> Xaa a 26.
Len, Gly, Alá, Ser, Thr, lle, Val, Glu,
Asp <220>
<223> Xaa a 2' vagy Lys;
I, Gly, Alá, Ser, Thr, Leu, lle, Glu, <220>
I2f <222>
<223> Xaa a 28.
Asn, Lys, Arg, Glu, Asp, vagy <223> Xaa a ?, Ala, Ser, Thr,
Val, Glu, <221> vegy?
Arg, Lys, Glu, Asp, vagy His;
<222> |30|. <223> Xaa a 30.
Ser, Thr, Leu. Ile,
Glu Asp, vagy Lys, vagy törölve;
<220>
<221>
<222> (32)..(32) <223» Xaa a 32, vagy törölve:
Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, vagy is;
<220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (33)..(33) <223> Xaa a 33. pozícióban Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, vagy His, vagy törölve;
<220>
<221 > Vegyes tulajdonság <222> (34)..(34) <223> Xaa a 34. pozícióban Gly, Asp, Glu, vagy Lys, vagy törölve;
<221> Vegyes tulajdonság <222> (35)..(35) <223> Xaa a 35. pozícióban Alá, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp, vagy Lys, vagy törölve;
<220>
<221 > Vegyes tulajdonság <222> (36)..(36) <223> Xaa a 36. pozícióban Ser, Pro, Lys, Glu, vagy Asp, vagy törölve;
<220>
<221> Vegyes tt <222> (37)..(37)
12Í törölve:
<220>
<221>
>2» <223>
Stíl KX
Lvs, <220>
<22!>
<222>
<223» Xaa a 39, pozícióban Alá, Ser, Val, Glu, Ásp,
<400»2
Hi.S Xaa Xaa Gly Xaa Phe Thr Xaa Ásp Xaa Xaa Xaa Caa Xaa Xaa Xaa
rs 1Ö 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe He Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 vaa Xaa Xaa Xaa
20 25 50
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
2S
<210» 3 <211> 32 <212» Fehérie <213» Mesterséges Szekvencia
Í2<
fc fc *
fc fc * fc fc * fc » ♦
fc « fc fcfc « fc « !*·$ <220>
<223> Szintetikus konstrukció <220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (1) . . (1) <223> Xaa az 1. pozícióban L-hísztidin, D-hisztidin, vagy törölve.
<220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (2)...(2) <223> Xaa a 2. pozícióban Gly, Alá, Val, Len, Ile, Ser, vagy Thr;
<220 <222> (3)..(3) <223> Xaa a 3. pozícióban Thr, Ser, Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Glu, vagy His;
<22Ö>
<221 >
<222> (5)..(5) <223> Xaa az 5.
Asp, Glu, Arg, Thr, Alá, Lys, vág?
His;
<220 <221> Vegyes
13( <222>
, Phe, vagy Tyr;
<221» Vegyes tulajdonság <222» (10)..(10) <223> Xaa a lö. pozícióban Len, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Tyr Glu, vagy Alá;
:220>
<223> Xaa a 12. pozícióban His, Pro, Asp, Gin, Arg, Ser, Alá, vagy Lys;
<221 > Vegyes tulajdonság <222» (13)..(13) <223» Xaa a 13.
Ily, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Άη= <220;
<221>
<223» Xaa a 17.
His, Asp, Lys, Glu, Glu, vagy Arg;
is:
>«>« ,*· » X * ·>·*·*. * S <220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (18)..( 18) <223> Xaa a <221 > Vegyes tulajdonság <222> (20)..(20) <223> Xaa a 20. pozícióban Trp, Tyr, Phe, Asp, Lys, Glu, vagy <220>
<22 ! > Vegyes tulajdonság <222> (21),.(21) <223> Xaa a 21. pozícióban Alá, Gin, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, vagy Lys;
<221> Vegyes tulajdonság :222> (24)..(:
<223> Xaa a 24. pozícióban Alá, Glu, Asp, Ser, vagy His;
<:22ö>
<221> Vegyes tulajdonság
ΦΧΧΦ *Φ iá:
> φ φ * φ φ φ * φ X Φ φ φ *» » * φ φ φ X X * χ Φ φ X φ φ φ »:* Χ'Χ X ·χ ♦ ♦ φ <223» Xaa a 25, pozícióban Asp, Glu, Ser, Thr, Arg, Trp, vagy <221> Vegyes tulaj<
<222» (27) . . (27) <223» Xaa a 27, pozícióban Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly, vagy Glu;
<221> Vegyes tulajdonság <222» (23),,(28) <223» Xaa a 28, pozícióban Glu, Lys, vagy Asp;
<221> Vegyes tulajdonság <222> (29),429) <223» Xaa a 29. pozícióban Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly Pro, His, vagy Glu;
<220» <221» Vegyes tulajdonság <222» (30)..(30) <223» Xaa a 30, pozícióban Thr, Ser, Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg,
Glu, vagy His;
is;
#* β
X φ** φ φ X φ X ♦ * <220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (31)..(31)
Ser,
Tyr, Phe His, Glv, vagy <220>
Xaa Gly Xaa > íaa Thr Ser Asp Xaa Sej : Xaa Xaa Leu Gl.u Oly
5 10
... ·..
Ala Xaa Xaa £ 'he He Xaa Xaa Leu Xas a Xőtcí Xaa Xaa
20 •n '-t c. A? 3C 1
<2i0> 4 <211> 32 <212>
<213> Mesterséges encia <220>
<223> Szintetikus konstrukció <221> Vegyes tulajdonság <222> (1)..(1) * X « ♦ * «
<223> Xaa az 1. pozícióban L-hisztidin, D-hísztidin, vagy törölve.
<220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (2)..(2) <223> Xaa a 2. pozícióban Gly, Alá, Val, Len, Ile, Ser, vagy Thr;
<22ö>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (5)..(5) <223> Xaa az 5. pozícióban Asp, Glu, Arg, Thr, Alá, Eys, vagy Hís;
í>
<221 > Vegyes <222> (6)..(0} <223> Xaa a 6. pozícióban His, Trp, Phe, vagy Tyr;
<22Ö>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (10)..(10) <2:23> Xaa a lö. pozícióban Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu vagy Alá;
<220>
<221> Vegyes
Ι3ϊ <222» (16)..(16) <223> Xaa a 16. ροζ: vagy Cys;
-vs, <221> Vegyes
His, Asp, Lys, Glu, vagy Gin;
<222>
Glu, vagy Lys;
<221» <222>
<223» es
9)..{1« a i vagy <;
<223» Xaa a 21, vagy Lys;
Alá, Glu, His,
Trp, Arg, <220» <· * 4*** * **
Α ♦ ❖ > ·*' * .♦*·* ♦ X * <· * * « « # « »' ««# « #** ** ** * *** <221> Vegyes tulajdonság <222> (24)..(243 <223> Xaa a 24. pozícióban Alá, Glu» Asp, Ser,, vagy His;
<220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (273..(27} <223> Xaa a 27. pozícióban Asp, Arg, Val,. Lys, Alá, Giy, vagy Glu;
<220>
<221>
<222> (28),.(28} <223> Xaa a 28.
<220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (29)..(29) <223> Xaa a 29. pozícióban Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Giy Pro, His, vagy Glu;
<220>
<221 > Vegyes tulajdonság <222> (30).,(30) <223> Xaa a 30. pozícióban Arg, Glu, vagy His;
iá:
ΥΦ ΦΦ* » φ φ φ * φ« ♦*
Φ.ΦΦ.Κ φ ΥΦ * <220» un Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, <222» (31)..(31) <223» Xaa a 31
<220» <221» Vegyes <222» (32)-432) <400» 4
Xaa Xaa Glu Gly Xaa Xaa Thr Ser Asp Xaa Sár Sex Tyr Leu Glu X'aa 1 5 IS IS
Xaa Xaa Xaa· Lys Xaa Phe lle Xaa Trp Leu Xaa. Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
SS 30 <210» 5 <211» 32 <212» <213» Mesterséges Szekvencia <220» <221» Vegyes tulajdonság <222» (1)..(1)
13?
» * « » X* » j, # Μ V »«* * * * * * · * 1* *0«φ '».♦« ** «*φ »** <223> Xaa. az 1, «220>
<221> Vegyes <222> (2)..(2) <223> Xaa a 2.
Gly, Alá, Val, Leu, Se, Ser, Met, vagy <220> <221>
<222>
<223> Xaa a <220>
<221>
<222> (10)..(10) <223> Xa a. a. 10.
Leu, Ser, Thr, Trp, His, vagy <220>
<221>
<222> (1 <223> xaa a .1 vagy Cys
Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg, <220>
13« «
φφφ
<222> (17)..(17) <223> Xaa a 17. pozícióban His, Asp, Lys, Gin, vagy Gin;
<220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (20)..(20) <223> Xaa a 20. pozícióban Asp, Lys, Glu, vagy His;
<221> Vegyes tulajdonság <222> (24)..(24) <223> Xaa a 24. pozícióban Alá, Glu, Ásp, Ser, vagy His;
<220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (29)..(29) <223> Xaa a 29. pozícióban Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Ásp, Gly Pro, His, vagy Gin;
<220>
<22.1 > Vegyes tulajdonság <222> (31 )..(31) <223> Xaa a. 31. pozícióban Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe His, Gly, vagy törölve.
Η( >»χ <220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (32)..(32) <223> Xaa a 32. pozícióban Pro va©?’ törölve.
<auu> o
Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ser T'yr Ls ?Ái Áei«3
t 5 10 13
X'Hct Alá Axá Xebrí Glu Phe 11ε Xaa Trp Leu Val Lys Xaa A: XBlS. X»5 3
20 25 30
es Szekvencia <221>
1)..(1) Xaa az vas <221 > Vegyes tulajdonság <222> (2)..(2) <223> Xaa a 2. pozícióban Gly, Alá, Val, Leu, lle, Ser, vagy Thr;
14:
χ χχ ** * ** ♦ φ χ Φ *-* * * χ*Φ ♦** * '* φ Φ φ Φ i *
Φχφ« Φ»« ** **Φ *♦* <220» <221» Vegyes tulajdonság <222» (16)..(16) <223» Xaa a 16. pozícióban Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg, vagy Cys;
<220» <221» Vegyes tulajdonság <222» (17)..(17) <223» Xaa a 17. pozícióban His, Asp, Lys, Glu, vagy <220»
Vegyes <223» Xaa a 18. pozícióban Ala, Glu, Hís, Phe, Tyr, Trp, vagy Lys;
<220» <221.» Vegyes tulajdonság <222» (24)..(24) <223> Xaa a 24. pozícióban Ala, Glu, Asp, Ser, vagy His;
<220» <221» Vegyes tulajdonság <222> (31)..(31) *'« ·»*♦* φ* «·« χ » Φ ί. X* Χ * . φφ« Φ * χ 8 χ Φ 9 * .
♦♦'«»·»♦'♦' «X «·* »♦«»· <223> Xaa a 31. pozícióban Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe His, Gly, Gly Pro, vagy törölve.
<220>
<221 > Vegyes tulajdonság <222> (32)..(32) <223> Xaa a 32. pozícióban Pro vagy törölve.
<400>6
Xaa
X3q.
Xaa -Glu Gly Thr Phe Thr Sör Asp Vei Ser Ser Tyr Lea
5 10
Xaa Alá Lys Glu Phe 1<ö X00 Trp Leu Val Lys Siy Arg
20 25 30
Glu Xaa 15
Xs>£ XöÖ
?s Szekvencia <220>
<223> Szintetikus konstrukció <220>
<221 > Vegyes tulajdonság <222> (1)..(1) <223> Xaa az I. pozícióban h-hisztidín, D-hisztidin, vagy törölve.
«Α «fc' ♦' ♦*
S * X fc
X * * » «,χ. *φ »Φ» ** φ φ X X * * xáV *»<« <221> Ve| <222> (2),.(2) <223> Xaa a 2.
?, Val, Thr, Ile, és alfa-metih <22ü>
/>
:223> Xaa a 15.
t, Alá, Thr, Ser, éa Giy;
<220>
<221> <222> ( <223> )
,.(2 a 2
Glu, Gin, Aia, Thr, Ser, és Gly;
<400> 7
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu 1 5 10
Gin Alá Alá Lys Xa® Phe Ile Alá Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 8 <211> ;· <212>
<213>
I φ Α· Χ«Φ» «φ ¥
V * X * ** «Μ *
9' — * * '♦ g*« ** » ♦ ϊίφ,
<221>
<222>
(19 <221» MOD. <222» (27).,,( <221» Vegyes <222> (30) , . ( <223» Xaa a <221»
Alá Glu Giy Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Gia Gly Gin 1 5 10 15
Alá Alá Xaa Gin Phe Ile Alá Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa 20 25 30 •0«** ** > * S fc «X* t*».· XJ»* *£* <210> 9 <211>5 <212>
<220>
Ser Asp; Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys s Gin Mst: Glu Gin
5 10 15
Alá Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Len Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 3< \
oly Is Pro Pro Pro Ser
35
<210> 10 <21.1> 39 <212>
<220>
<400> 10
His Gly Glu. Gly Thr Phe Thr Ser. Asp Leu Ser Lys Gin Met. Gin Gin
•3 10 15
Glu Alá Val Arg Leu Phe ile Glu Trp Len Lys Asn Gly Gly Pro Ser
'>ÍV A. <> 25 3 fY
Ser Glv Alá Pro Pro Pro .Se r
He
Λ * X » * * * ♦
St s > A &
.*$..*;· ** ΦΗ <>V<
<210> 11 <211> 39 <212> Fehérje <213> Mesterséges Szekvencia <223> Szintetikus konstrukció <220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (1)..(1) <223> Xaa az 1, pozícióban L-hisztidin, B-hisztidin, vagy törölve.
<220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (2)..(2) <223> Xaa a 2. pozícióban Gly, Alá, vagy Val;
<220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (10)..(10) <223> Xaa a 10. pozícióban Leu vagy,Vai;
<220>
* * ·< *** μ;
<222> (12)..(12) <223> Xaa a 12. pozícióban Lvs vagy Ser;
<222> (13)...(13) <223> Xaa a 13 <220>
<221> Vegyes </ — <*
<222> (16)..(16) <223> Xaa a 16
<220>
<221 > Vegyes tulajdonság <222> (17).,(17) <223> Xaa a 17. pozícióban Gin vagy Gin;
<221> Vegyes íula <222> (19)..(19)
<223» Xaa a 19, pozícióban Val vagy Alá;
* <222» (20) ., (20) <223» Xaa a 20. pozícióban Arg vagy Lys;
<220» <221» Vegyes tulajdonság <222» {21) ., (21) <223» Xaa a 21. pozícióban Leu vagy Glu;
<220» <221» Vegyes <222» (24) . . (2^ <223» Xaa a 24.
dóban Glu vagy Alá;
<220» <221» Vegyes tulajdonság <222» (27)..(27) <223» Xaa a 27. pozícióban Val vagy Lys;
<220» <221» Vegyes tulajdonság <222» (28).,(28) <223» Xaa a 28. pozícióban Asn vagy Lys;
:i<í <220» <222» (30) . <223> Xaa a 30
Gly vág),' Arg; és <220» <221» <222» (í <223» X an Gly, vagy Pro;
áU>
<221» Vegyes <222» (32)..(32) <223» Xaa a 32.
Ser, :221>
<222» (33)..(33) <223» Xaa a 33.
a Ser, vagy hiányzik.
<220» <221>
?es <222»
Ι5ί <22Ö>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (353.4353 <220>
<221> Vegyes <222> (36).436} <223> Xaa a 36
<222> (37),.(373 <223> Xaa a 37.
, vagy hiányzik <221> Vegyes <222> (38)..(38} <221 > Vegyes tulajdonság <222> (393.439} <223> Xaa a 39.
>> vagy :220>
is:
Φ* φ * * ***, ♦ * **
221> Vegyes '223> Xaa a 39.
<400> 11
Xaa Xaa Glu Glu Thr Phe Thr Sár Asp X&Sl Ο0ΪΓ Zv»S>-3 XöLSl. Xaa G3 ,u Xaa
I 5 10 15
Xaa Alá Xaa Xaa Phe Xls Xaa Trp Íj<í<í X3<& Uíly Xaa Xí iá Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa XHgI
<210> 12 <211> 31 <212>
<213>
<223>
<220>
vés <222> (1)..(1) <223> Xaa az
B-hísztidin, vagy <220>
<22 !>
<223> Xaa
Alá, Gly, Val, Leu, Ile, Ser, vagy is;
φ »·«'* φ φ φ
X ΦΦ •Μ·*»' »
Φ»
Φ φΦ » »χ <220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (6)..(6) <223> Xaa a 6. pozícióban Phe, Trp, vagy Tyr;
<220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (10)..(10) <223> Xaa a 10. pozícióban Val, Trp, fle, Leu, Phe, vagy Tyr;
<221> Vegyes tulajdonság <222> (12)..(12) <223> Xaa a 12- pozícióban Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, He, Leu, Val;
<220>
<221> Vegyes tulajdonság <222> (13)..(13) <223> Xaa a 13. pozícióban Tyr, Trp, vagy Phe;
<220>
<221 > Vegyes <222> (14)..(14) <223> Xaa a 14. pozícióban
Phe, Tyr, <220>
* *«φ φ φ XX <221» Vegyes tulajdonság <222» (16)..(16) <223» Xaa a 16, pozícióban Gly, Glu, Asp, vagy Lys;
<220» <221» Vegyes tulajdonság <222» (19),419) <223» Xaa a 19. pozícióban Ala, Val, lle, vagy Leu;
<220» <221» <222» (2 <223» Xaa a2L pozícióban Glu, ile, vagy 3 <220» <221» Vegyes tulajdonság <222» (24)..(24) <223> Xaa a 24. pozícióban Ala vagy Glu;
<220» <221» Vegyes tulajdonság <222» (27),427) <223» Xaa. a 27. pozícióban Val vagy lle; és <221» MOD„RES φφ
15*
ΦΦ
<223»
<40ö> 12
X&& X<iU Glu Gly Thr X&3 Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa
u. 10 15
Gin Alá X3& Lys Xaa Phe lle Les Trp· Leu Xaa Lys Gly Arg Xaa
20 25 30
<210» 13 <211» 616
<220» <223» Szintetikus konstrukció
«400» 13
His Val xx Xu Gly Thr Phe TKv' J. i *x Se r Asp Val Ser. Ser Tyr Len Glu
1 5 LÖ 1
Gin ÁJ-íS Alá Lys Ga u Phe Hu A.· a Trp Leu Val Lys Giy Arg Gly
20 25 30
Á-i.« Η .ϊ. s Lys Ser ^' 3 v> \>1U val .Alá Illa Arg Phe Lys Asp Lee Gly Glu
35 4 0 4 5
Asn PTiU Lvs Alá neu- Val Luu lle Alá Phe Alá Gin Tvr Len· Gl n
155 φ« φφφ* φ » * _ χ*Φ φ 4 «« Λ * «** » Φ »
<ί Φ * •X »
ΦΦ φφ φΐ * « * φ* ♦ * <0Φ φ φ*Φ»
Cys 65 Pro Ph^ Glu Asp Kis 70 v 3 X Lys Leu y«l Asa “} CL 1 X? Gin Val Thr Gin Phe 80:
A13 .ibys Thr Cys Val A 1 ,r; Asp Glu Ser Alá Glu Asn Cys Asp Lys Ser·
85 30 95
íjíSU His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Alá Thr Leu Arg
100 I0S 110
Gxti Thr zr«A ·- H Gly Glu Hét: Alá Asp Cys Cys Alá Lys Glu Gin Pro Glu
115 120 125
Ar g As Π- Glu Cys Phe Gla His Lys Asp Asp: Asn Pro Asn Len Pro
130 135 140
Arg L-gu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Alá Phe His Asp
η λ c; 150 155 i.SÜ
As a Glu GXu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Gin. I le J\Xa Arg
165 170 175
Kis Prc Tyr Phe Tyr Alá Pro Glu Leu Leu Phe Phe Alá Lys Arg Tvr
180 135 190
uys A<J 3 Alá Phe Thr Glu Cys cys Gin Ál a Alá Asp Lys Alá Alá Cys
195 200 205
Leu Leu Pro Lys Leu .Asp Glu Leu Arg Asp Glu uzy Lys Alá Ser Ser
210 215 220
Άι& Lys Gin Arg ueu Lys Cys Alá S^'.c Leu Gin Lys Phe CXy CXu Arg
225 230 235 340
Alá Phe Lys Als Trp Al a Val Al a Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys
24 5 250 255
Alá G<tU' Pbíí Als Glu V a 1 Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val
260: 2 65 270
His Thr Gin gf c. Cys Cys His Gly Asp LiJS'ú Len. Glu Cys Alá ? & H Asp Asp Arg
.ΔΧ 3 Asp Leu Alá Lys T y x* lle Cys Glu Asn Gin Asp Ser lle Ser Ser
290 295 300
Lys Leu Lys Glu Cys Cvs Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser Kis Cys
305 310 315 320
11« Alá Glu Val Glu Asn Asp Glu Mer. Pro Alá Asp Len Pro Ser Leu
325 330 335
Als Alá Asp Phe Val biU Ser uys Asp Val Cys Lys Asr. Tyr Alá Glu
34 0 34 5 350
Α.Ϊ, -3 f {v <: Asp VtSl Phe Leu Gly Met: Phe Leu Tyr •<31 u Tyr Alá Arg Arg
355 360 365
His Pro As ;> 'Pvr Ser V«5-l \A:ii Leu Leu Áru Leu Alá Lys Thr Tyr
370 375 380
Glu Thr Thr Leu Glu Lys CyS· r-.,« vz y s Al· a AXs Asp Pro Kis Glu C y s
iSí «»*« »· ' »' ϊ*» ;»* ** * *
X β χ #»** .-Jön
395
Tyr Alá Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Len Val Gin Glu Pro Gin
Asn Ile Lys 420 Gin Asn Cys Gin
Lys Phe Gin 4 35 As j'í Alá L<au Leu Val 4 40
Val Ser 4 50 Thr Pro Thr Val 455 Gin
Gly 465 ÍC av Λ Lyo Cys Lys 4 7 0 His Pro
C : χί Asp Tyr- Les Ser 485 Val V<$ Len
Lys Thr Pro Val 500 Ser Asp Arg Val
Va 1 A.sn Arg 515 Arg Pro Cys Phe Ser 520
Val. Pro 530 i*ys Gin Phe Asn Alá 535 Gl'u
Cys 545 Thr Leu Ser Glu Lys 550 Glu Arg
Val Gin Leu Val Lys His Lys Pro
Ax s Val Met Asp Asp Phe Alá Al a
Asp Asp Lys 5 95 G In Thr Cys Phe Áx s 600
Alá Ser Gin Alá Alá Leu Gly Len
610 615
415
Gin Leu Gly Glu Tyr
410
Leu Phe €1
425 430
Arg r,.v- Th >- Lys Lys 445 Val Pro Gin
Va 1 Ser Arg Asn Leu 460 Gi y Lys Val
Glu Alá Lys 475 A:;··::; Met Pro Cys Alá 480
Asn Gin 4 90 Leu Cys Val Lan His 4 95 Glu
Thr 505 Lys Cys Cys Thr Gin 510 Ser Lan
Alá Leu Glu Vei Asp 525 C .·. u Thr Tyr
Thr Phe Thr Phe Mis 5 4 tí Al a Asp He
Gin Ile Lys 555 rys isin Thr Alá Lg'íj 560
Lys Alá 570 Thr Lys; Glu Gin Cou 575 Lys
Phe 533 Val Glu Lys Cys Cys 590 Lys Alá
Glu Gin Gly Lys ny s Leu Val Alá
605 <210> 14 <211» 631 eh <223> Szintetikus konstrukció •fc * <400> 14
fíí s Val b.iA3 Gly Thr 5 Phe Thr Ser Asp Val 10 Ser OÁ:: X Tyr Leu GIxj 1 t G ,i y V
Gin Aj. a Aia Lys Glu Phe lie Aia Trp Leu Val byh.· Giy Arg Gly Gly
2ö 25 3 \í
Gly Gly Gly Ser Giy Giy Giy Giy Ser Gly GI y G.ly Gly Ser Asp da
35 40 45
Hx-S Lys Ser 'j ->-U Val Aia His Ars Phe Lys Asp Leu Giy Giu Glu Asn
50 55 60
Phe Lys Aia Leu Val Leu I le Aia Phe Alá Gin Tyr Lsuj Gin Gin Cys
65 70 75 30
Pro Phe Glu Asp His Vei Lys Leu. Val Asn Giu Vai. Thr Giu Phe Alá
85 90 95
Lys Thr Cys Val Aia Asp Giu Ser Aia Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu
100 105 110
His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Vai Alá Thr Leu Arg Gl.u
115 120 125
Thr /Τ’, .„. V. Gly Giu Met Aia Asp Cys Cys Alá Lys Gin Glu Pro Glu Arg
130 135 140
Asn Glu V. j/S Phe Len Gin His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Prc Arg
14 5 150 155 160
Len Val Arg Prc GÍU Vai Asp Vei Met Cys Thr Alá Phe His Asp Asn
165 170 175
Giu Glu Thr Phe Len Lys Lys Tyr Leu Tyr Giu lie Alá Arg Arg His
180 155 190
Pro Tyr Phe 1 Q k Tyr Axjíí Pro Giu Leu Leu Phe Phe Alá lys ο n s Arg Tyr Lys
Aia Alá Phe Thr Giu Cys Cys <. ,VU: Gin Aia Aia Asp Lys Alá Ara cys I,eu
210 215 220
LeU Prc Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Giu Giy Lys Aia Ser Ser Ai a
225 230 £35 Ϊ40
Lys Gin Arg Leu Lys Cy s Ai a Ser Lód Gin ·? . Phe Gly Giu Arg Aia
245 250 2 55
Phe Lys A.. a Trp Alá val A.la Arg Ser GId Arg Phe Pro Ly.s Alá
260 265 270
Giu Phe Aia Glu Val Ser Lys Leu Vő 1 Thr Asp Leu Thr Lys Vai His
275 28Ö 235
Thr Giu Cys Cys His Giy Asp Leu Leu Giu Cys Aia Asp Asp Arg Aia
230 295 300
Asp Leu Aia Lys Tyr lie Gys u In Ásd Gin Asp Ser lie Se r Lys
15) *
**
Λ* *
«ρ*;*
$ X «
>>$♦·
L£U Lys Glu Cys Cys 3:25 Gm Lys pxo Leu Leu Glu Jav Lys Ser His Cys Ile 335
ΑΧ .¾ Gin Vai Glu Asn Gin Met Pro Alá Asp Leu Pro Ser Leu Alá
340 34 3 350
Alá Asp Phe Val G.PJ Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Alá Glu Alá
355 360 365
Lys Asp Val Phe Leu Giy Μ·:5ΐ: Phe Leu Tyr Glu xp . , V- •\Sr Alá. Arg Arg His
37 Ö 375 380
Pro Asp 'Dr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Alá Lys Thx' Tyr Glu
385 390 395 400
Th.r Thr Leu G.1.X3 V - *je Cys vVS Alá Alá Alá Asp Pro His Glu cys Tyr
405 410 415
Alá Lys Val Phe Asp Gin Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gin Asn
42.0 425 4 30
Leu Ile Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Glu Glu ueu Giy Gin Tyr Lys
435 440 4 45
Phe Gin Asn Alá Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gin Val
450 455 4 60
Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Giy Lys Val Giy
4 SS 4 70 475 480
Ser Lys Cys rY«-v ’-ys Lys His Pro Glu Alá Lys Arg Met Pro Cys Alá Gin
485 4 90 4 95
Asp Tyr Leu Ser Val 7.·; 1 Leu Asa G.l e Leu Cys Val Lea His Glu Lys
500 505 510
Thr' Pro Val Ser ?VSO Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Slu Ser Leu Val
515 520 525
Asn Arg Arg Pro Cys Phe Sex· Alá Leu Glu Val Asp Gin Thr Tyr Val
530 535 540
s?ro Lys G x u Phe Asn Alá Gl u Thr Phe Thr Phe His í-i-Slp Ile Cys
845 550 5 5 5 560
Thr Len Ser Glu Lys Glu Arg Glu Ile Lys Lys Gin Thr Alá Len Val
565 570 575
G1 u Leu Val. Lys his Lys Pro Lys Alá Thr Lys Glu Gin Leu Lys Alá
588 585 590
Val Met Asp Asp Phe Al a Aie Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Alá Asp
555 600 605
Asp Lys Glu Thr Cys Ph-& A.l. Glu Gin Giy Lys Lys Len Var Alá Alá
610 615 620
Sex: Gin Al 3 AI& Leu r. : v ueu
625 630
15<
<210> 15 <211> 640 <212> Fehérje <220 <223> Szintetikus konstrukció <400 15
Hís 1 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val 10 Ser Ser Tyr 15 Γ* f ··< \y.t ól
Gin Alá Alá Lys 20 Glu Phe lle Ara Trp 25 Leu Val Lys Gly Arg Gly 30 Ser
Sex· Gly éle 55 PXO Pro Pro Ser Gly í 0 Gly Gly Gly Gxy Ser 45 Gly Gly Gly
Gly r 50 Gly Gly Gly Gly Ser 55 Asp Alá Hís Lys Ser Glu 60 Val Alá His
A.rq 65 Phe Lys Asp Leu Gly 70 Glu Glu Asn phe Lys Ála Leu 75 Val Leu lle 80
Alá Phe Alá Gin Tyr 85 Leu Gin Gin Cys Pro 90 Phe Glu Asp His Val 95 Lys
Len Val Asn GI u 100 Val Thr Glu Phe Alá 105 Lys Thr Cys Val Alá Asp 110 Glu
Sex· Alá du 115 Asn Cys ÁSp Lys Ser 120 Leu His Thx· Leu Phe 125 Gly Asp Lys
Le-u Cys 130 Thr Val Alá T'hr Leu J. '^3 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu 140 Met Ála Asp
Cys 145 Cys Alá Lys Gin Glu 150 Pro Glu Arg Asn Glu Cys .Phe 155 Leu Gin His 160
IeV S Asp Asp Asn Pro 165 Asn Leu Pro Arg Leu i í U Val Arg Pro GIa Vai 175 Asp
Val Met Cys Thr 180 Ara Phe Lís Asp Asn 185 Glu Glu Thr Phe Leu Lys 190 Lys
Tyr Le u Tyr 195 Glu X le Alá Arg Ara 20 ö Kis Pro Tyr Phe Tyr 2Q5 Alá Pro Glu
Leu Leu Phe Phe Alá Lys Á' 9 Tyr Lys .ül a Alá Phe Thr Glu Cys C ys
16Í
210 215 220
Gin jíkl ::í A-lő -£ -—'p Lys Ara Alá Cys Len Len Pro Lys Leu Asp Glu Leu
225 230 235 240
Arg Asp Glu v» .ί y .Lys * 7 Λ £ Aia Ser Sí^'í' Alá lys Gin Arg Len Lys Cys Aie
Ser Leu Gin Lys Λ» 4. .ί Phe Giy Gin Arg Ar a <· S) íz Phe Lys Aia Trp Z «.M Aia Vai Aia
260 265 270
Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys Alá Glu Phe Alá Glu Vai Ser Lys
2 7 5 280 285
Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Vai Sis Thr Glu c y Cys His Gly Asp
290 2 95 300
Leu Leu Glu Cys Aia Asp Asp Arg Aia Asp Lee Aia Lys Tyr Ile Cvs
305 310 315 320
Gi u Asn Gin Asp ile Ser Ser Lys Leu Lys 'Gru Cys Cys Glu Lys
325 330 335
Pro Leu Leu Gin Lys Ser His Cys Ile Aia Glu Val Glu Ash Asp G.lu
340 34.5 350
Met Pro Alá Asp Leu Pro Ser Leu Alá Aia Asp Phe Vai. Gin Ser Lys
355 300 365
Asp V,al Cys Lys Asa Tyr Ara Glu Aia Lys Asp Val Phe Len Gly Met
370 375 380
Phs Leu Tyr Tyr Aia Arg Arg His Pro Asp ,v„ A z A. Ser Val Val Leu
385 3 9A 395 400
Leu Leu Arg Leu Aia Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys
405 410 415
Alá .Alá Alá Asp Pro his Gin Cys Tyr Aia Lys Vai Phe Asp Glu Phe
420 425 430
Lys Pro Leu Vei Glu Glu Pro Gin .Asn Leu lie Lyw \ϊ.ιΓ1 Asn Cys Gin
435 440 Λ ,< CL hí hí S
Leu Phe Glu Gin Leu Giy Glu Tvr Lys Phe Gin Asn A λ O Leu Len Va.l
4 50 455 4 60
Arg Tyr Thr Lys Lys Vai Pro Gin Vai Ser Thr Pro Thr Leu Val. Glu
4 55 470 475 480
Vaj. Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Giy Ser Lys Cys Cys Lys Sis Pro
485 430 405
Glu Aia Lys Arg Met Pro Cys Alá Glu Asp Tyr Len Ser Val Val Leu
5Ö0 505 510
Asn χ. n Leu Cys Va 1 Leu H.i.s ah Lys Thr Pro Vai Ser Asp Arg Vai
5 IS 320 525
Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Len Var Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser
530 535 54 0
Alá Leu Glu Vai .Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Alá Gin
ló:
n« « * X * φφ
φφ
Φ* X φφφ
515 550 555 560
Thr Phe Thr Phe Mis Λ 1.3 Asp lle Cys Thr Les Ser Gru Lys Glu Arg
5 65 570 57 5
Gin Ila Lys Lys Gin Thr Ars Leu Val G x u Len Val Lys rí í S Lys Pro
580 535 530
Ly s Alá Thr Lys 1 i χ L*« Lys 600 Ahit Val. Met Asp Asp Phe Alá Alá
Phe Val _> -J x> Glu Lys pys Cys Lys ul a Asp Asp Lys Gr u 5Vj Thr cys Phe Ara
61 ö 615 620
Glu Gin '“‘ Λ t r Lys Lys Leu Val. 7\ *} -v L«..r 3 Alá Ser Gin Alá Alá Len Gr y Len
625 630 655 640
<210> 16
His Gly Gin Gl y Thr 5 Phe Se r Asp Leu 10 Ser Lys S χ n Met Giu 15 Glu
Glu ALa Val. Arg Leu Phe lle Giu 1rp Leu Lys Asn G i y G ly Pro Sör
20 23 30
Ser Gly Aia Pro Pro P.ro Ser Asp Ala Η1s Lys Ser Glu Vei Λ li.ái w-ί « »4 -X. <~S
35 40 45
Arg Phe Lys Asp IcÖD Gly r> 7 > hUu Gr a Asn Phe Lys Al a Leu Var Löu lle
Sö 55 60
Alá Phe Alá Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys
65 70 75 80
Leu Var Asn Glu Val Thr piti Phe Alá Lys Thr Cys Val Aia Asp Gl u
85 30 <1 ti 35
Sö x? Aia Glu Asn Cys Asp rya Ser Leu His Thr Leu Phe Gl y Asp Lys
100 105 110
Len cys Thr Val Ais Thr Löd .Arg Glu Thr Tyr Giy Glu Met A1.D Asp
125
Cys G ys Cys 130 Asp A1& Asp Lys Ash Gin Pro Glu Asn Pro .13 5 Leu Glu Pro Arg Arg Asn Leu Glu Vai Cys 140: Arg Phe Pro Leu rq /5 {·, Gin Vsí, His Asp
145 no 153 160
Val Met .ex.Ύ ~ oys 'PVx y Alá Phe His Asp Asn •Gi.u λΙ,λ •UJ X u Thr- Phe Leu Lys Lys
165 170 175
Tyr Leu Tyr La^.U Ile Alá Arg Arg Hí s Pro Tyr Phe Tyr Alá Pro Glu
180 185 130
Leu Leu Phe Phe Alci Lys Arg Tyr Lys Alá Alá Phe Thr Glu Cys Cys
195 200 205
Gin Ali, 3· A 2. s Asp Lys Ai <3 Alá Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu
210 215 220
Arg Asp G i. !ÍÍ Gly Lys Als Ser Sör Alá Lys GI n Atg Leu Lys Cys Alá
223 230 235 240:
Ser Leu Lys Phe Gl.y •Glu Arg Alá Phe Lys Ara Trp Al n Val Alá
245 250 255
Ar Leu. Sex: Gin Atg Phe Pro Lys Alá Glu Phe Alá Glu Val Ser Lys
2ő0 265 270
Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thx* Glu Cys Cys His Gly Asp:
275 280 2:85
Leu Leu Glu Cys Alá Asp Asp Arg Alá Asp Leu Alá Lys Tyr Ile Cys
290 295 300
bi-U. Asn Gin Asp Ser He Sör Sex: Lys L.«nn Lys Glu Cvö Cys Glu Lys
305 310 315 320
Pro bÖ'U Leu· Gl.u Lys Ser His Cys Ile Alá Glu Vai Glu Asn Zk <>¥\ Glu
325 330 335
Met Pro Alá Asp Leu P.re Ser Leu AX <3 Alá Asp Phe V >3 1 Glu Ser Lys
340 345 350
Asp Val f’VÁ Lys Asn Tyr Alá GI u Alá Lys Asp Val Phe Leu Gly Met
355 360 365
Phe Leu Tyr G.i u Tyr Alá Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val iíCU
.370 375 380
Leu Leu Atg Leu Alá Lys Thr Tyr GX.u Thr T n r Leu Glu Lys Cys Cys
385 392 385 400
Alá Alá Alá Asp Pro Hl 3 Glu Cys Tyr Alá. Lys Val Phe Asp Glu Phe
4 05 410 415
Lys Pro Leu Vei Gin Glu Pro Gin Asn Lx Ile Lys Gin Asn Cys G.iu
4 20 425 430
I&u Phe G< 1Í5 Gin Csín Gly η i '<$ Tyr Lys Phe Gin Asn A.la Leií Lnu Val
435 4 40 445
Arg Tyr Thr Cys Lys V & Λ Pro Gin Val Ser Thr Pro i>v. r Val Glu
450 4 55 4 60
16»
Φ*·Χ* .*·* φ»4Γ XX»
XX
X
X ♦·<·*·
X ♦ φ * «
♦ φΧ*Φ *
ΛΧ X X
Val 4 65 Ser Arg Asn Leu GI y 470 Lys V a 1 Gly Ser Lys 4 75 Cys Gye Lys His Pro 480
Glu Ala Lys Arg Két Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Vai Val Len
485 4 90 495
Gin Len Cys val Leu His Glu Lys Thr Pro Vai Ser Asp Arg Val
500 505 510
Thr Lys; vys Cys Thr Gr u Ser Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser
515 520 525
Ara Leu Glu Val Asp GI n Thr Tyr Vai Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu
5 3 0 g r e r n
•z -Z -u-
Thr Phe Thr Phe Hl s; lila Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Gin A t? íj
54 5 sse 555 560
Gin Ile Lys Lys G rn T‘h.2? Ala Leu Val Glu JLjÍsC Val Lys His lys Pro
565 570 575
Lys Thr Lys Glu Gin Leu Lys Ala Vai Kel. Asp Asp Phe Ar a Ala
580 S85 580
Phe Vai G 1 u Lys Cys Cys Lys Ala ήζψ Asp LVS Glu Thr Cys Phe Aia
595 600 605
Gru Sxv Gly Lys Lys Leu Val Aia Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly
610 615 620
<210> 17
<220>
<400> 17
Hís Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu
Glu Ala Vei Arg Leu Phe Ile Gin Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Glv Gly Ser Glv Gly Gly
4C?
Glv Ser Glv Glv Glv Glv Ser Asn Ala His Lys Ser Glu Val Ala His
16<' φ φ
Φ » φ φ
φφ» φ φ· φ φ * φ
φφφ *
*χ* φ
φ ν.φ φ.
X * φ
φ* φ φ***
55
Arg The Lys .Asp Leu oly <'4 <v \s a a Glu Asn Phe Lys Alá Lee Val Leu 1 .1 3£:
65 70 75 80
Alá The Alá Cl π Tyr Leu G tn Gin Cys Pro Phe Gl u Asp H i s Val Lya
30 Sí 5
Leu V a 1 Asn Lf xU Val Thr Glu Phe Alá Lys Thr Cys Val Alá Asp Gin
100 105 110
Ser Alá Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Lan Phe Gly Asp Lys
X Λ 1.20 125
Leu Cys Thr Val ki a Thr La a Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Alá Aap
13ö 135 140
Cys Cys Alá: Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Gin His
145 150 155 160
Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu vax Arg Pro Glu Val Asp
165 170 175
Val Met Cys Thr Alá Phe His Asp Asn Cl a GI u Thr Phe Lsu Lys LYS
ISO 185 190
Tyr Leu Tyr Gin Ile Ax a Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Alá Pro biU
135 200 205
Leu í.eu. Phe A.Is Lys Arg Tyr Lys Alá Alá PLa Th;r G1 u Cys Cys
210 215 220
Gin Alá Alá Asp Lys Alá Alá Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Gin Leu
225 230 235 240
Arg Asp Glu Gly Lys Alá Ser Ss r Alá nys ax.a Arg Leu Lys t^ys Alá
245 2 SÖ 265
Ser Leu Gin Lys Phe G1 y Glu Arg Aia Phe Lys Alá Trp Als Val A.la
200 265 270
Arg Lse.! Ser Gin Arg Phe Pro Lys Alá Cili Lna Alá Glu Val Ser Lys
275 280 285
Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val Hús Thr Glu Cys Cys His Gly Asp
230 235 300
Leu Leu Glu Cys Alá Asp Asp Arg Alá Asp Leu Alá Lys W\ X XX X V Λ. ile Cys
305 310 315 320
Glu Asn Gin Asp Ser Ile Ser Ser Lvs Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys
325 330 335
Pro Leu Leu Glu lys Ser His Cys lie Alá Clsá Val Glu A. Síi. Asp L la
340 34 5 350
Met Pro ALa Asp Pro Ser La a Alá Alá Asp Phe Val Cl a Ser ays
355 360 365
Asp Vei •Cys Lys .Asn Tyr Alá Glu Alá Lys Asp Ve I Phe Len Gly Met
370 37 6 380
Ph<: Leu Tyr Glu Tyr Alá Arg Arg His Pro Asp Ty r Sst Val v$i La a
* * « 4 4 '♦'«
3S5 350 4 A b* 400
Leu Arg Leu Alá Lys Thr- Tyr Glu Thr Tfer Leu S~> i , - ν?1.·Ί Lys <v. -> Cys
405 410 415
AIs Ai3 Alá .Asp Pro Glu Cys; Tyr· Aia Lvs V ·:: I Phe Asp Gin Phe
420 425 430
Lys Pro Leu Vei Gru Giu Pro Sin Asn Leu 11 e Lys Gin Asn Cys Glu
435 440 4 4 5
Leu Phe úí.í.U Glu Leu oly Cin Tyr Lys Phe Gin Asn Alá Leu Leu Val
450 •355 4 60
Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Len Vei Glu
465 470 475 480
Vo .1 Ser Arg Asn Leu Giy Lys Vei Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro
48S 4 90 4 5 5
Giu Alá Lys Arg Mát Pro Cys Aia Gr n Asp Tyr Leu Ser Val Val
500 SOS 510
Asn Gin Len Cys Val Leu His Glu Lys Thr í?XO Val Ser Asp Arg Val
515 520 525
Thr Lys Cys Cys Thr Ut 1U £ Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser
530 535 540
Alá Leu G λ ti Val Asp; Glu Thr Tyr Vő .1. Pro Glu Phe Asn Alá Giu
545 550 555 560
Thr Phe Thr Phe His Al a Asp Ile Cys Thr Leu Ser Gin Lys Giu Arg
565 570 nn c
G In. Ile uys Lys Gin ‘Τ' f\ ν' A >Αλ Áss Leu val Giu Leu Val Lys His Lys Pro
580 585 590
Lys Alá Thr Lys Glu Gin Leu Lys Alá Val Mer Asp Asp Phe Alá Aia
595 6öö 605
Phe Val Glu Lys Cys; Cys Lys Alá Asp Asp Lys; Giu Thr Cys Phe Alá
610 615 620
Glu Glu Gly Lys; Lys Len Val Alá AJ. »:í Ser Gin Alá Al a Len Gly Leu
625 630 $35 64 Ö
<210> 18 <211> 284 ί&
<22Ο>
«φ φ φ X * φφ «
.* φ* φ
His I Val Glu Giy Thr Cl •z Pns Thr Ser Asp Vei 10 Sxi.i* Ser Tyr Leu Gin 15 bt y
Gin Al. Alá Lys Lt x ti Phe Ile Alá Trp Leu Vai Lys Giy Arg Giy Alá
2 3 <L ·.! úL
Glu Pro Lys Ser Cys Asp x>ys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá
35 40 45
Pro Glu Leu Leu g! y Giy Pro Ser Vei Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
Lys Asp Thr Leu. Mát Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Val
65 70 75 30
Val. Asp Val Ser H t a Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai
85 90 95
Asp Giy Val G 2. u Val His Aso AI a Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gin
100 105 .11 ö
Tyr Asn •Ser Thr Tyr Arg Vai Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin
115 ISO 125
Asp Trp Leu Asn taV Lys Gx g Tyr Lys Cys Lys Val Ser A.sn Lys Alíít
í 30 135 140
Leu Pro AiSt Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Alá Lys Giy Gin Pro
145 150 155 ISO
Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg bl 5j G.iu Méh THr
165 170 175
Lys Asn Glu Val Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Giy Phe Tyr Pro Ser
1:0 185 190
Asp Ile Alá Vei Gin Trp Glu Ser Asn Giy Gin Pro Glu Asn Asn Tyr
105 200 205
i .· ν s TLx Thr Pro Pro V a 1 Leu Asp Ser Asp Giy Ser Phe Phe Len Tyr
210 2Í5 220
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Giy Asn Val Phe
225 230 9 33 240
S«r Cys Ser Vai Met Kis· Glu Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys
245 250 255
Se?c Les Ser Leu Ser Pro G?l y Lys
<2 !()> 19 <211 > 272
260
16;
«
X φφ X Φ
X φφφ φ
φ χφ φφφ φ
ΧΦ φφ *
φφφ φ X* Φ θ' <220>
I Val olki Gly Tnr 5 Phe Thr Ser Asp Val 10 Ser Ser Tyr Len Glu 15 Gly
Gin Alá Alá Lys Glu > A Phe He A Is Trp Len Val Lys Gly Arg Gly Ssr
Ser Gly Aj.3 35 Pro Pro Pro Ser Au u 4ö Glu Pro Lys Ser Cye 45 Aso Lys >· ixii
His Thr 50 cys Pro Pro Cys Pro 55 Alá Pro Glu Leu Leu 60 Gly Gly Pro Ser
Val es Phe Leu Phe Pro Pro 70 Lys Pro Lys Asp Thr 75 Leu Met He Ser Arg 80
Thr Pro Glu Val Thr S5 Cys Val Val Val Asp 90 Vei .Sför His Glu Asp Pro
Ci u Val Lys Phe Asr· löö Trp Tyr Val Asp 105 Gly Val Glu Val His 110 Aso Ai.s
Lys; Thr Lys 115 Pro Arg Glu G1 u Gin 12Ö Tvr Asn Ser Thx Tyr 125 Arg Val Val
Ser Val 130 íea Thr' Val Leu His 135 Asp Trp Leu Asn 14 0 Gly Lys Glu Tyr
Lys 145 cys Lys Val Ser Asn 15 0 Lys Alá Leu Pro Alá 155 Pro He Glu Lys Thr 150
lie Ser Lys 5.1 a Lys 165 Gly Gin Pro Arg Glu I 70 Pro Glu Val. Tyr Thr 175 Len
Pro Pro Ser Arg Gio 180 Glu Met. Thr uys 185 Asn Gin Vei Ser Leu 190 Thr Cys
I,eu V 3.1 Lys 195 Gly Phe Tyr Pro Ser 2Ö8 Asp He Alá Va 1 Glu 205 Trp Gin Ser
Asn oly 210 Glu Pro Glu Asr As u 213 Tyr Lys Thr Thr Pro 220 Pro Val Leu Asp
Ser 225 Asp Gly Ser Phe Phe 230 Leu Tyr Ser Lys Leu 235 Thr Val Asp Lys S ö r 240
.Arg Trp e r n •Gin Gly 24 5 Asn V U J; Phe Ser f** V- <· 250 Ser Val Met his Glu ?S5 Aia
φφ φ φφ* * *** • ώ* φ*φ
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Les Ser Leu Sei 26G 2S5
Pro Gly Lys <210» 20
<220» <400» 20
His Val Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tvr Leu Gin Gl a
1 5 10 1 ·>
Gin Alá Alá Lys Gx.cs Phe 11« Alá Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Alá.
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá
35 40 45
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Mát X ££ óör Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 •?0 75 30
val Asp Val Ser Hí ΛΪ Gin Asp Pro Gin Val Lys Phe Asn Trp Tyr Va 1.
85 80 35
Asp Gly Val Glu V ·:: í His Asn Alá Lys Thr Lys Pro Arg Gin Gin Gin
100 105 iii)
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Va1 Len His Gin
115 120 •t '> 1 <· N?
Asp Trp Len Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Alá
130 135 14G
Lsu Pro Alá Pro lle Glu Lys Thr lle Ser Lys Alá Lys Gly Gin pro
145 150 155 ISO
Arg Glu Pro G In Vá 1 Tyr Thr Len Pro Pro Ser Arg Glu Glu Mer Thr
165 170 175
Lys Asn Gin Val. Ser Len Thr Cys Len v λ r r y 3 Gly Phe Tyr Pro Ser
ISO 185 180
Asp lle Alá Val Glu Trp Glu Ser Asn <:< 1 y Cin Pro: Glu Asn Asn Tyr
¢¢9
105 200
Lys Thr Thr Pro Pro Val Len Asp
210 215
Ser Lys Leu Thr Var Asp Lys Ser
225 230
Cys γ·ϋ-1 Met 245 Hí s Giu Alá
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260
205
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Len Tyr
Arg Trp Gin Sin Gly Asn Val Phe 235 240
Lea Sis Asn his Tyr Thr Gin Lys 250 255 <210> 21 <211> 272 <212> Fehérje <220>
<223> Szintetikus konstrukció <40Ö> 21
His Val Glu Oly Thr Phe Thr Ser Asp V 3J. Ser Ser Tyr DS’ú Gl u Glu
1 5 T Π g r.
λ V J. ~·
Gin Alá Alá Lys Glu Phe ire .ála Trp Leu Val Lys Gly A.cg Gly Ser
20 30
Ser Gly Alá Pro Pro Pro Ser Alá Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Ttiív
35 40 45
H1í; Thr Cv.s Pro Pro Cys: Pro Ákd Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Asp Thr Leu Met lle Ser Arg
65 70 7 5 80
Thr Pr-o Glu V a 1 Thr Cys Val Val val Asp Var Ser His ο ί η Jv La Asp Pro
85 90 95
GlU Val Lys Phe Asn Trp X*, . V« ] Asp Gly Var \sÍU- Va 1 His Asn Alá
ICO 105 110
Lys Thr Lys Pro Arg Glu G.1 n Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val.
115 120 125
<v.£S f Vaj. Leu Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 3Ly s Giu Tyr-
130 135 14G
17£
S φ* Φ» * * φ» * Φ** »♦* { Φ ♦ , » *.« ·»♦ **»* *-ΦΦ Λ Φ ♦♦
Lys Cys 14 5 rys Val Ser Asn Lys Alá Leu Pro Alá Pro X.le Glu Lys Thr
155
160
Ile Ser Lys Alá Lys Gly Cin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu
155
Pro Pro Ser Arq Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys
180
185
ISO
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Alá Val Glu Trp Glu Ser
ISO
200
205
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
210
215
220
Ser Asp Gly Sex Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 225 230 235 240
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Sex· Cys Ser Val Met His Glu Alá
24:
250
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Len Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260
2Sí
270 <2IO> 22 <211> 272 <220>
His Gly Glu GLy Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Len Glu Glu
Gin Aie Alá Lys Glu Phe Ile Alá Trp Leu Val Lys Gly Arc; Gly Ser
Ser Gly Alá Ser Ser Gly Alá Alá Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thx
His Thr Cys Pro- Pro Cys Pro
Pr-o Gin Leu Leu Gly Gly Pro Ser 60
Val Phe Len Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Vei Ser His Glu Asp Pro ♦ *
8 5 90 95
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyt '/& Λ Asp' Giy Vei G ί Ό Val His Asn Alá
100 135 110
Lys Thr Lys Arg Glu G,i. u Gin Tyr Asn Se ?: Thr Tyr Arg Va 1 Vai
115 120 125
éx· »x Val Les T hí- Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asr- Giy Lys Giu Tyr
130 I 35 140
Lys Cys Lys va 1 Sí? r Asn Lys Zk >:i Leu Pro Ale Pro I le Gl u Lys Thr
14 5 150 155 160
Π » Ser Lys Alá Lys Giy Gin I^re Arg Giu Pro Gin Val Tyr Thr Leu
1&3 170 17 5
Pro Pro Ser Arg G 1 u Giu Met Thr Lys Asn Gin V->á i Ser Leu Thr Cys
180 185 190:
Leu χ r .·. ··: V ¢5. .1. Lys Gry Phe Tyr Pro Ser Asp lie Alá Val Giu Trp Ser
195 200 205
Asn Giy Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vei Leu Asp
210 215 220
Ser Asp Gl y Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Len Thr Val Asp Lys Ser
225 230 240
Áru Trp Gin Gin Giy Asn Val Phe S&x? Cys Ser Vei Két His Giu Ale
24 5 250 255
Leu His Asn Hís Tyr Thr Gin Ly-s Ser Leu Ser Leu Ser Pro Giy Lys
2 80 265 270
<21G> 23
Gin
Val Lys Giy Are Giy Ser 30
His Giy Giu Sly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Len Glu Glu 1 5 10 15
Alá Aie Lys Giu Phe Ue Alá Trp Lee
25 *· φ
φφφφ φφφφ φ
ΦΦΧ· φφφ'
X# φ
*** »
φφ φ
#φ *
**>
»Φ φ ♦ χ
φΧ·*Φ
Se λ' Gi y Alii 35 Pro Pro rr.ö S.i»r Gly 40 G1 y cl y Gly Ser Gly 45 Gly Oly Gly
Ser Gly 50 Gly Gly Gly Ser A-i.3 55 Glu. Pro Lys Ser Cys 60 Asp Lys Thr Kis
Thr 65 Cys Pro Pro Cys Pro 7 0 Ala Pro Glu Leu Len 7 5 Gly Gly Pro Ser Vai 80
Phe Len Phe Pro Pro se Lys Pro Lys Asp Thr OÍ) Leu Met Ile Ser Arg Th.r
Pro Glu Val Thr 100 <S 3 Cys Vai v al Vai Asp 105 eu Val Ser Kis Gl u Asp 110 «1 Pro Gin
Val Lys Phe 115 Asn Trp Tyr Val Asp 120 Gly Val Glu Vei Kis 125 Asn Ala Lys
Thr Lys 130 Pro Arg Gla Gl a Gin 135 Tyr Asn Ser Thr Tyr .14 0 Arg Va .1 Vai Ser
Val 145 Lj&U Thr Val Leu Kis 150 Gin Asp Trp Leu Asn 155 Gly Lys Glu Tvr Lys 160
Cys Lys Val Ser Asn 165 Lys Ala Len Pro Ala 170 Pro lle G.!. n Lys Thr .175 ile
Ser Lys Ala Lys ISO Gly ZV-ΐ Pro Arg 185 Pro Gin Val Tyr Thr ISO Leu Pro
Pro Arg 195 Glu Glu. Met Thr Lys 200 Asn Gin Val Ser Leu 205 Tf·. r Cvs Leu
Val Lys 210 Gly Phe Tyr Pro Ser 215 Asp lle Alá Val Glu 220 Trp G.tbí Ser Asn
Gly 225 Gin Pro Glu Asn Asn 230 Tyr Lys Thr Thr Pro 235 í? ΧΌ Vai Asp Sár 240
Asp Gly Ser Phe Phe 24 5 Leu Tyr Ser Lys Leu 250 Thr Val Asp Lys Ser 255 Arg
Trp Gin Gin Gly 260 Asn Val Phe Ser Cys 265 Ser Vai Met 8 is G1 ti 270 Ala Leu
His Asn Hi.s ·? n A. > Tyr Thr Gin Lys Ser 280 Len Ser Leu Ser Pro 285 Gly Lys
<210> 24 <21 !> 284 <220>
* * ·** » » j>** *** * * * χ ** ** **· <223> Szintetikus konstrukció
<400> 24
Kis s-' } . , Glu G’Ly Tkr Phe v Ser Asp Val Ser Ser i y 7 kíöAí Glu Glu
5. 5 i. ÍJ 13
Gin Ara Ar a 4.>YS <•*3 Ül <í Phe lle Trp Lőíi Val Lys Gly Arg Gly Ser
20 25 30
Ser Gly Alá Prsa. Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly uly
35 'X 0 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ála Glu Ser Lys Tyr GXv Pro Pro Cys Pro
50 55 60
Ser Cys Pro Alá Pro Gin Phe Leu G ..i. y Gly Pro Ser Val Pne L&u Phe
65 70 75 80
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Len i: lle Ser Arg Thx· Pro tiXki Val
§5 90 g y
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Va- Gin Phe
106 I05 IIQ
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Gin Val His Asn Alá Lys Thr Lys Pro
115 120 125
Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Vai Len Thr
130 135 140
Vai Lee Hí s Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Gin Tyr Lys Cys i-ys Val
145 150 155 160
Ser Asn Lys Gly Len Pro Ser Ser lle G1 u Lys Thr· lle Ser Lys Alá
165 170 1 7 ct
Lys Gly Gin Pro Arg Gin Pro Gin Var Tyr Thr Leu Pro Pro Sn‘c Gin
180 135 190
Glu ti±n Met Thr Lys Asn Gin Val Ser L>G'ía Thr Cys Leu Val Lys Gly
18 5 200 205
Phe Tyr Pro Ser Asp lle A.iiíí Vai Glu Trp Gm Ser Asn Gly Gin Pro
210 215 220
Gr u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser
225 230 235 240
Phe Phe Leu Tyr SfS'X' Arg Len Thr Val Asp Lys Arg Trp Gin Gin
245 250 '2 ú 9
Gly Asn Val Phe u y s Ser Val Met His Gin Alá Leu Kis Asn His
2 00 265 270
Tyr Thr Gin V - A,-. .1.» y Ser Leu Ser Leu Ser' Leu Gly Lys
275 280
Í7<
<210> 25 <211> 302 <212> Fehérje <220» <223» Szintetikus konstrukció <400» 25
His 1 Gly Glu Gly Thr Phe CT *\ v S r Asp Val 10 Sor Ser Tyr Leu Glu 15 Glu
Gin Alá Alá Lys Glu Phe He Ai e Trp Len V.íi Lys Gly Arg Glv Ser
20 25 30
S:«er Gly Alá Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Sex-
50 SS 60
Gly Liy C1 y Gly Ser Ai3 Glu Pro T , ...V Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
S5 70 7 5 80
Cys Pro Pro Cvs Pro Alá Pro Gin Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vei Phe
85 90 95
Leu Phe Pro Pro by s Pro Lys Asp Thr Leu M'et TI e Ser Arg Thr Pro
100 105 110
Glu Val Thx Cys Val Val. Val Asp Vít 1 Sor His Glu Asp Pro Glu Val
115 i 2 0 X2S
Lys Phe Asr. Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
130 135 14Ό
Lys Pro Arg Glu Glu Cin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val. Ser Val
145 150 155 160
Leu. .v<U, r Val Leu His Gin Asp Trp Len Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
165 170 175
Lys Vei i?er A.SJ3 Lys Álé Leu Pro Alá Pro He Glu Lys Thr ile Ser
180 185 190
Lys Alá Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vel iyr Thr Len Pro Pro
.1.95 200 205
Ser Arg Glu Glu Met Thr by 5 Asn Gin Vei Ser Leu Thx· Cys bee Ve i
ί
215
220
17Í **** φ* * φ «.
Φ -Λ μ φ *ΦΦ Χ«* X Φ * * * -Λ* *««Χ .· „ . Λ vc *
Lys Gly Phe Tyr Pro Sex? Asp 1.5.s Alá Val Glu Trp Gin Ser Asn. Gly
225
Gin Pro Glu .Asn
230 .•i. >5
240
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Var Len Asp Ser As
250
Gly Ser Phe Phe Len Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys; Sex· Arg Trp
260
270
Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Alá Leu His ere
280
285
Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
290
295
300 <21ö> 26
Η x s GI y G1 u Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vei Ser Ser Tyr Leu Glu Gin
1 5 10 15
Gin Alá Alá Lys Gin Phe Ile Alá Trp Len Val Lys Gly Arg Gly Gly
·> ?\ a’Í'V 25 30
Gly Gly Gly Se r Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gxy
35 40 45
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Sex· .Alá Glu Pro
50 55 60
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá Pro Glu
65 70 £-. t %. 80
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Len Phe Pro Pro Lys Pro ;.,ys Asp
§5 90 35
Thr Len tfet Ile Ser Arg Thr Pro u le Val Thr c y ó; Val Val Val Asp
100 105 110
Val Sex' His Glu Asp £·>· 0 Glu Val Lys Phe Asxj Trp Tyr Va 1 Asp Gly
115 120
Va 1 Glu 13Q Vei Hl a Asn A Lys 135 Thr Lys Pro Arg ul u 140 Glu Gin Tyr Asn
Ser Thr Tyr Arg Vai Val éj A v* Val UÖU Thr Val Leu His Gin Asp T 5^X5
145 I5C> 3 .60
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys uy s Val Ser Asn Lys Aia Leu Pro
165 ···> f\ 1 > 'J i v 6
AjLH: Pro TI a Glu Lys Thr He Ser Lys Alá Lys G1. y Gin Pro Arg G.l u
ISO 105 190
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Sex· Arg Giu Glu Mefc. Thr Lys Asn
1.95 200 203
Gin Völ Ser Leu Thr Cys Lön Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 1lö
210 215 220
Alá Val. Giu Trp Glu Sex- Asu Gly Gin Pro Giu Asn Asn Tyr Lys Thr
225 230 235 A !:40
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Len Tyr Se r Lys
24 5 250 255
Len Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys
260 205 2TÖ
Ser Val Met His Glu Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
290 <210> 27 <211> 280
<220>
400> 27 s Gly Giu Gi.y Thr Phe Thr Sex· Asp Vei Sex- Ser T'yx· Leu Glu Glu
S 10 15
Gin Alá Alá Lys Glu Phe Ile Alá Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser :0
Ser Gly Alá Pro Pro Pro Ser Ser Ser Gly Aia Pro Pro Pro Sej * *
40 45
¢3 X13' Pro 53 Lys Sér Cys Asp Lys 55 Thr Mis Thr Gys pro 6ö Pro Cys Pro Aia
Pro Giu Len Leu Giy Giy Pro Ser V 8i Phe Len Phe Pro Pro Lys Pro
65 70 75 80
Lys Asp Thr Leu Mer Ile Ser Arg Thr Pro GJ.U Val Thr Cys Val Vai
85 9Ö 95
Vai Asp Val .Ser H.i.s Giu Asp Pro 'Gm Val. Lys Phe Asn Trp Tyr Val
100 105 113
Ajsp Gly \Zs3 1 Vei His Asn A le Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gin Gin
115 120 125
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Vu Í Sor Val Leu Thr Val nőn His Gin
130 135 140
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys AÍ&
145 150 155 ·? .60
Leu Pro AJ. a. Pro Ile Glu Lys Thr lie Ser Lys Alá Lys Gly Gin Pro
165 l?0 175
Arg Giu Pro Val Tyr Thr Len Pro Pro Ser Arg G.Xu Giu Két Thr
ISO 185 190
Lys Asn Gin Vei Ser Len Thr Gys Leu. Vai Lys Giy Phe Tyr Pro Ser
195 200 205
Asp Ile Ai .& Val G-l u Trp Gin Ser Asn Gr y Gin Pro Glu Asn Asn Tyr
210 21.5 220
Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
230 0. ti r. A X> S 240
Ser Lys Leu Thr Vei Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Giy Asn Val Phe
24 5 250 255
Ser L y ő Ser Vei Met His Glu Ars iLiön Mis Asn His Tyr Th r Gin Lys
260 255 270
Ser Leu Ser Le-o Ser P ro <*Λ v - Lys
280 <210> 28 <2Ϊ1> 287 <ΖΙ.<4> rCílCrjC <213> Mesterséges Szekvencia <223> Szintetikus konstrukció
171
Φ* φ * •X φ Φ * Φ * ' *»·** φ
φ** *φ ***
Φ *
Φ»
Φ >♦ φφ Φ Φ * 4* '*£* *$'«* <400> 28
His 1 GI y Glu Ί * t y Thr 5 Phe Thr Sör Asp Val 10 Ser Sör Tyr Leu Glu Glu 16
Gin Alá Vei Lys Glu Phe lle Alá Trp Luu- lle Lys Gly Arg Gly Ser
20 z?ú 30
Ser Gly Alá Pro Pro Prn Ser Gly Gi y Gly Gly Ser Gly Gly C1 y C ΐ γ
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Álö Cj-U Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
50: 55 60
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
65 70 7 5 80
Phe Leu Phs Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lle Ser Arg Thr
85 90 95
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Sör Ri.s •Glu Ásp Prn Glu
100 105 110
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly G λ ü Val His Asn Alá Lys
115 120 125
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin i yi. Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
ISO 335 140
Val Leu Thr Val .L>ö %i His Gin Asp Trp Leu Asn. Gly Lys Glu Tyr Lys
145 150 155 160
Cys Lys Val Ser Asn lys Alá Len Pro Alá Prn lle Glu Lys Thr lle
165 170 175
Ser Lys Alá Lys íí n Gly Cin Pro Arg Glu Ϊ Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro
Pro Ser Arg Glv Glu Mer Thr Lys Asn Gin Val Sör Leu Thr Cys Leu
195 200 205
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asn lle Alá Val ί ti Trp Glu Ser Asrt
210 215 220
C.íy Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr p r o Pro Val Leu Asp Ser
225 230 ·*> 3 240
Asp Gly Ser Phe Phe L<sü Tyr Sör Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
24 ü 250 255
Trp Gin 61 n Gly Asn Val Phe Cys Ser Val Mefc His Glu Aia Leu
260 255 270
His Asn His Tyr Thr Gin Lvs Sör Leu Ser Lee Ser Prn Glv Lys
275 280 283
17$ . * $ # <210> 29 <21.1> 272
<220>
‘•00*2 <
His ϊ Gly Glu Giy Thr 5 Phe Thr· Ser Asp Leu Ser 10 nys cLn Met G .ί. u 15 Glu
ί?.ϊΛ£ Alá Val Arg Leu Phe lle Glu Trp Leu Lys Asn G.L y Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Cl y Al 3. Pro Pro Pro Ser Ara Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá Pro Glu Leu Leu Giy oly Pro Ser
50 55 60
Val Fhe Leu Phe Pro Pro Ly s Pro Lys Asp Thr Len Met lle Ser Arg
55 70 75 80
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 11 is Gin Asp Pro
05 90 95
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Aia
100 105 110
Lys Thr Lys Pro Arg GXe Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
115 120 125
Ser Val Leu Thr Val Lee His Gin Asp Trp Leu Asn Giy Lys Gin Tyr
130 135 140
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Alá L>2U Pro Alá Pro lle Glu Lys Thr
14 5 ISO 155 ISO
I le Sár Lys Alá Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr
155 170 17 5
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys
180 105 190
Len Val Lys Gl y Phe Tyr Pro Ser Asp lle Alá Val. Glu Trp Cl u Ser
135 200 205
Asn Giy Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
210 215 220
Ser Asp ί'· ! \· Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Len Thr Val Asp Lys Ser
1SC ** *
225 220 235 210
« Arg 'Ί trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gin Alá
245 250 255
Len 1 Íis Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
<210> 30 <211> 272 <212> Fehérje <213> Mesterséges Szekvencia <220>
<400> 30
His 1 Gly CaíLbi Gly Thr 5 Phe Thr Ser •Asp 10 Ser Lys Gin. Met Gin '15 Glu
Glu Alá Val Arg 2Ö Ser Phe He G ni Trp Leu Lys Asn Gly Gi y •<n Pro Ser
Ser Gly Alá Ser ul.y Alá Gin Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
Val Phe Leu Phe Pro Pro cys Pro Lys .Asp Thr Lau Met ile Sör Arg
65 70 75 80
Thr P'íto Glu Val Thr Cys Va 1 Vai Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
85 30 95
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly V s .i. GiU Vul His &s u A.1 a
300 105 110
Lys Thr Lys Pro Arg Glu L.Lu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Vsl
115 •20 1.25
Se r Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Len Asn Gly Lys Glu Tyr
130 13 5 14.0
Lys Cys Lys V 31 Ser Asn Lys Alá Leu Pro Alá Pro Ile Glu Lys Thr
5
He· Ser Lys Alá
150
Lys Gly Gin Pro Arg Glu 165 170 i 55
Pro Gin Va
Thr Le-e
75
Tvr
4..
« * «ϊ* ‘
Pro Pro Ser Arg 130 Glu Gr u Mát Thr Lysí 18 5 Asn Gin Val Ser x ex uys ISO
Leó Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lle Alá Val Glu Trp Glu Ser
195 200 205
Asn Gly Gin Pro Giu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
210 2:15 220
Ser Asp G .1 y .Ser Phe Phe Len Tyr Ser ,uy s Len Thr Val Asp Lys Ser
225 230 235 240
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser cys Ser Val Met His Glu Aia
245 250 255
.Leu His Asn Kis Tyr Thr Gin lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
264 2 65 270
<2il> 287 <212>
<213>
<400> 31
HLs Giy Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Gin
'1 lö 15
Gin Alá Val Arg Leu Phe lle Gxu Trp Len Lys Asn Giy Gry Pro Ser
20 25 30
Ser Gr y Aia P ro Pro Pro Ser Giv Gly Gly Gly Ser Gly Giy Gly Gly
35 43 45
Sex' γ ., \> . y « ... y Gly Gly Ser Alá Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr ss. a
Sö 55 60
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Al s Pro Glu Len Lea Giy Gly Pro Söx Val
65 7Ö i b 86
Phe Leu Phe Pro Pro dvs Pro uys Asp Thr Lse Met Λ .1.0 Ser Arg Thr
SS 90
Pro· Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp V a r Ser «1:5 /-> 1 <v Asp Pro Glu
100 105 110
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp G1 y Val Glu Véi .ΐ. H X 8 Asn Alá Lys
18;' »» y** .2
129
125
Thr Lys 130
Val Len 145
Cys Lys
Pro Arg Gin Sin Gin Tvr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser .40
Thr Va.l Len his Gin Asp Trp Leu Asn Giy Lys Gin Tyr Lys
155
160
Val Ser Asn Lys Alá Len Pro Aia Pro lie Glu Lys Thr lie
16;
1.75
Ser Lys Aia Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro
180 is;
190
Pro Ser Arg Gin Glu Met Thr· Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu
195
200
205
Vai Lys 210
Gly Gin 225
Giy Phe Tyr Pro Ser Asp lie Aia Vai Glu Trp Gin Ser Asn
215
220
Pro Glu As.n .Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val. Leu
230
235 ;;p Ser 240
Ser Phe Phe Leu Tvr Ser Lvs Leu Thr Val Asp Lvs Ser Ara
215
250
Trp Gin. Gin Giy Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met Sis Glu Aia Len
2SÖ
265
270
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Len Ser Pro Giy Lys
2? 5 >88
295 <210> 32 <2I1> 232 <212> Fehérje <400> 32
Aia Gin Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Prc
1;
Alá Pro Glu Lys Giy Gly Pro Ser Val. Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
Lys Asp Thr Lys Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Vai Val
Val Asp 50
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
Asp Gly Vai Gin Val. His Asn Aia Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 65 70 75 00 is;
X «
Tyr Asn Sex- Thr Tyr Arg Val 55 Val Ser Val Len Thr Val Leu His Gin
20 95
Asp Trp Leu Asn Giy Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Alá
100 105 110
Len Pro Alá Pro Ua erű Lys Thr 11« Ser Lys Alá Lys Cly Gin Pro
115 120 125
Arg Slu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Cin Cin Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly- Phe Tyr Pro Ser
145 ISO 155 160
Asp Ile Alá Val Glu Trp Glu Ser Asn Giy Cin Pro Glu Asr! Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Cly Ser Phe P'he Leu Tyr
180 185 130
Sár Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Giy Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Gin Alá Leu His Asn His Tyr- Thr Γ* } '-< 5.Í Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Giy Lys
225 230
<210> 33 <211> 703 <212> DNS <213> Hon <400> 33 gagcccaa-at cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg teaestgcgt ggtggtgg-ac gtgagccacg .aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtaeg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccsaga caaagccgcg ggaggagcag '240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgt.c ctcaecgtcc tgcaoeagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccegc 460 gacat-cgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 54 0 cccgt-gctgg actccgacgg cfcccttctfcc ctctatagca agct-cs-ccgt ggacaagagc 800
18' aggtggcago aggggaaegfc cttctcstgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaacc-ac 660 tacacgcaga agagccfcctc cctgtctccg ggtaaatgat agt 703 <2.1 !> 585 <213>
<4002* 34
Asp Alá His Lys Ser U Λ U Val Alá His
Glu Asn Phe Lys Al.a Len Val Len Ile
20 25
Gin cys Pro Phe Glu Asp Hl s Val Lys
35 40
Phe Alá Lys Thr Cys Val Al 3 Asp G.lü
30
Ser Leu His Thr Len Phe <»3 v> oly Asp Lys
65 70
Arg Glu Thr Tyr Giy Gin Mel; Alá Asp
85
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Len Gin His
100 105
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu V a 1 Asp
115 120
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Len Lys Lys
130 135
Arg His Pro Tyr Phe Tvr Al 3 Pro biU
145 1.50
Tyr Lys Λ.13 Alá Phe Thr Glu Cys Cys
165
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Gin Leu
180; IS 5
Ser A Is Lys Gin Arg Len Lys Cys A.i. e
·· ne ?fYfs
Arg Aló Phe Lys A i <3- Trp A λ 3 Val 'Λ ·«
215
His Arg Phe Lys Asp Len Gly Gla 10 15
Alá Phe· Alá Gin Tyr Leu Gin 30
Lys Les Cys TLr Val Alá Thr Len 75 30
Asp Cys Cys Alá Lys Gin G.Lu Pro ; 95
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 110
121
140
Gin Len Len Phe Phe Alá Lys; Áru i;
160
Cys Gm .Alá Ara. Asn Lys s.ia Alá
170
I 75 ·? VD
Lys Alá
Len Arg Asp Glu Giy Lys Alá Ser 190 r Len Glu Lys Phe Giy Glu 205 •g Len Ser Gin Arg Phe Pro 220
Glu Phe Alá Gin Val Ser Lys Len Val Thr Asn leu Thr Lvs
18Í «
♦*
225 230 233 240
Val B i s Thr Giu Cys cys il .1 s Gl y Asp Leu Leu /·' ‘ i·» s2 .i. U cys Alá Asp Asp
245 250 255
Arg Aia Asp Leu A a a Lys Tyr lle Cys u tu Asn Gin Asp Ser He Ser
2 GO 265 í. / V
ŐöjT Lys Le a Lys Gl a Cys Cys Giu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ue Alá Glu Val Asn Asp Giu Met Pro Alá Asp Leu Pro Ser·
290 295 300
Ara Ara Asp Phe ϊ V O .i. Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Aia
305 310 315 320
Giu Alá Lys Asp Val Phe Leu Giy Met Phe Leu Tyr Giu Tyr Alá Arg
325 330 335
Arg Hís Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Alá Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr ti.t n Lys Cys Cys Aia Aia Alá Asp Pro His Glu
355 360 36S
Cys Tyr Alá Lys Val Phe Asp G j, ii Phe Lys Pro Leu Vei Glu Giu Pro
37 Ö 375 380
Gin Asn Lea Tle Lys Gin .Asn Cys Glu Leu Phe Giu Asn Leu Gly Gin
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gin Asn Alá Leu: Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
40 5 410 415
Gin Val Ser Thr Pro Thr Le ύ Val Glu Val. Ser Arg Asn Leu Giy Lys
42.0 425 430
Val a 1 y Ser Lys Cys eys Lys Hís Pro Glu Aia Lys Arg Met Pro Cys
435 440 4 45
A.X n Glu Asp Tyr Leu Se r V a 1 Val Leu Asn Gin Leu C y a Val Leu His
450 4 5 S 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg V3,i. 2hx Lys Cys Cys Thr Giu Ser
4 65 470 475 480
Len Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Alá Leu Giu Val Asp Glu Thr
4 8 5 490 435
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ara Gl u Th r Phe Thr Phíí His Alá Asp
500 505 510
I le Cys Thr Leó Ser Glu Lys Glu. Arg Gin. lle Lys Lys Gin Thr Al«
515 520 525
Leu Val Glu Leu V & λ Lys His Lys Pro Lys Alá Thr Lys C _L u G1 ía Leu
530 535 540:
Ly s Alá Val. Met Asp Asp Phe AI a Alá Phe Vst I Glu Lys Cys Cys Lys
•J Ki -2 550 555 560
AÍ 3 Asp Asp Lys Gl a Thr Cys Phe Alá Glu Giu Giy Lys Lys Leu Val
18(
565 570
Al a Aia Ser Gin Alá Ma Leu 6.1 y Leu
580 585
575 <210> 35 <211> 1762 <212> DNS <213» Homo sapiens <400» 35 gatgcg-caca gccttggtgt aaattagtga aatfcgtgaca cgt gaa a cet tgcttettge gatgtgatgt gaaattgcca tataaagctg aagcfccgatg gccagtctcc cagagatttc gtcescacgg gccaagtata saacctctgt gaettgcct t gaggcaaagg tactetgtcg tgtgoegctg gtggasgagc tacaaattcc ccaacicttg cetgaagcaa tgtgtgttgc ttggiqaacs gagt ttsa fc g agacaaatca aasgagcaac agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagafct tgggagaaga aaatttcaaa.60 tgattgcctt tgct eagtst cttcagcagt gt.ccattt.ga agatcatgtal2'Ö atgaagtaac tgaa.t.ttgca ssaacatgtg ttgctgatga gt.cagctg.aal 80 aatcactfeca fcaccctitfcfc ggagacaaat tatgcacagt tgcaacfcctfe-240 atggtgaaat ggctgactqc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaaJGG aacacaáaga tgacaaocca aacctccccc gattggtgag acCagaggtt360 gcsctgcttt tcatgacaat gaagagacafe ttttgaaaaa atsc;:tatst4'23 gaagacatcc tfcacttttat gccccggaec tccttfctcfet fcgctaaaagg4S0 cttttacaga atgttgcoaa. gctgctgata aagetgcetg ccfegttgcca54O· aacttcggga tgaagggaag gcttegi: ctg ccaaacagag actcaagtg tóöö aaaaatttgg aga-aagagct ttcaaagcat gggcagt-agc tcgcetgagcSSO ccaaagctga gtttgcsgaa gtttccaagt feagtgacaga tcttaccaaa?'2ö a-atgctgcca tggsqatstg cttgsa tgtg clgatgscag ggcggacct L78Ö tctgtgaaaa tcaagattcg atctceagfea -aactgaagga atgctgtgas84Ö tg.gaaaáatc ccactgcatt gccgaagtgg aasatgatga gatgcctgctGÖO cattagctgc tga-ttttgtt gaaagt.aagg atgtttgcaa aaactatg-ctS-60 atgtcttcct gggcatg-ttt ttgtatgaat atgoaagaag gcatcctgatIÖ20 tgctgctgct gagacttgcc aagacatat-g aaaccactct ag-ag-aagtgclOSO cagateetca tgaafcgctat gccaaagtgt tegatgaatt taaacct-ctfell4ö ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc ttttfcgagca gcttggagagl2ÖC agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacecca agtgtc-aactl260 tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg tfcgtsa.a-catl32.0 aaagaatgcc ctgtgoagaa g-actatctat ccgtggtcct gaacca-gtta.138'0 atgagaaaac gccagtasgt gacagagtca ccasatgctg cacagaafcccl44Ö ggcgaccatg ettttcagct oiggaagtcg atgaaacata cgt'fccccaaalSOO ctgaaacatt caccttccat gca.ga tatai gcacactttc tgagaaggaglSSO agaaaca-aac tgesettgtt gagctcgtga aacacaa.gcc caaggcaaca 1828 tgáaagetgt fcatggatgat ttcgcágctt ttgtagagaa gtgctgcáégl680 is;
♦««·' gctgacgata -aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc gctgccttag gcttataatg ac aagtcaa.I.74ö
62 * φ φ φ
Φ Φ' Φ Φ Φ Φ 4 Φ Φ X * · * ♦« φ ♦ χ’ * * * * X -X φ «φφφ φ * * * *φ *ΦΦ φφ φ χ φ «

Claims (16)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1, Heterológ fúziós fehérje, ami tartalmaz egy első polipeptidet, egy N-termlnáhssal, valamint agy C-termlnálist, ami egy második polipeptidhez van fúzíonáltatva, aminek van egy N-tenninéllsa és egy C-terminállsa, és az első polipeptid egy GLP-1 vegyület, és a második polipeptidet az alábbi csoportból választhatjuk ki:
    a) humán albumin;
    b) humán albumin analógok; és
    c) a humán albumin fragmense!, és ahol az első polipeptid C-tenninállsa a második polipeptid N-termínálísához van fúzíonáltatva, és ahol a fúziós fehérje biológiailag aktív és hosszabb plazma felezési idővel rendelkezik, mint a GLP-1 vegyület önmagában,
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti heterológ fúziós fehérje, ahol az első polipeptid C-termínáíísa a második polipeptid N-terminálísához van fúzíonáltatva egy pepiid linkeren keresztül.
  3. 3, A 2, igénypont szerinti heterológ fúziós fehérje, amiben a pepiid linkért az alábbi csoportból választjuk ki:
    a) egy glicínben gazdag pepiid;
    b) egy pepiid, aminek a szekvenciája a következő: {Gly-Gly~Gly-Giy~Serjn, amiben n értéke 1, 2, 3, 4, 8 vagy 8; és
    c) egy pepiid, aminek a szekvenciája a kővetkező: IGly-Giy-Gly-Giy-Serjs·
  4. 4. Az 12, vagy 3, igénypont szerinti heterológ fúziós fehérje, amiben a GLP-1 vegyület az 1 általános képietü szekvenciát tartalmazza (2, számú szekvencia)
  5. 7 3 9 10 11 12 13 14 15 18 17
    His Xaa Xaa Giy Xaa Phe Thr Xaa Asp Xaa Xaa 18 19 20 21 22 23 24 25 28 27 28
    Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 He Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    189 «44«
    4:4 '4 4
    X X
    4.4X «4
    4 X « « 4 4
    4 XX
    Χ4 4 4 4«
    X 4 4*
    40 41 42 43 44 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa ahol az I általános képletben (2. számú szekvencia),
    Xaa jelentése a 8-as pozícióban Alá, Gly. Ser, Thr, Leu, He, Val, Glu, Asp vagy Lys;
    Xaa jelentése a 9-es pozícióban Glu, Asp vagy Lys;
    Xaa jelentése a 11-es pozícióban Thr, Alá, Gly, Ser, Lee, He, Val, Glu, Asp vagy Lys; Xaa jelentése a 14-es pozícióban Ser, Alá, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, vagy
    Lys;
    Xaa jelentése a 16-os pozícióban Vai, Alá, Gly, Ser, Thr, Leu, He, Tyr, Glu Asp, vagy Lys;
    Xaa jelentése a !?~es pozícióban Ser, Alá, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp vagy Lys;
    Xaa jelentése a 18-as pozícióban Ser, Alá, Gly, Thr, Leu, He, Val, Glu, Asp, Lys, Trp vagy Tyr;
    Xaa jelentése a 19~es pozícióban Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gin vagy Lys;
    Xaa jelentése a 20-as pozícióban Leu, Alá, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met,
    Lys, Trp vagy Tyr;
    Xaa jelentése a 21-es pozícióban Glu, Asp vagy Lys
    Xaa jelentése a 22-es pozícióban Gly, Alá, Ser, Thr, Leu, He, Val, Glu, Asp vagy Lys;
    Xaa jelentése a 23-as pozícióban Gin, Asn, Arg, Glu, Asp, vagy Lys;
    Xaa jelentése a 24-es pozícióban Alá, Gly, Ser, Thr, Leu, He, Vei, Arg, Glu, Asp vagy Lys;
    Xaa jelentése a 25-ös pozícióbari Alá, Gly, Ser, Thr, Leu, He, Vai, Glu, Asp vagy Lys;
    Xaa jelentése a 2S-cs pozícióban Lys, Arg, Gin, Glu, Asp vagy His;
    Xaa jelentése a 27-es pozícióban Leu, Glu, Asp vagy Lys;
    Xaa jelentése a 30-as pozícióban Alá, Gly, Ser, Thr, Leu, He, Val, Glu, Asp vagy Lys;
    Xaa jelentése a 31-es pozícióban Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp vagy Lys;
    190 -: —:
    * * * ♦♦♦ Μ» « β χ * * * * ♦ ♦ ♦ »#»* « **♦ 00 φφχ XX φχ Φ 0
    Xas jelentése a 32~es pozícióban tea, Gly, Alá, Ser, Thr, Hé, Val, -Glu,. Asp vagy Lys;
    Xaa jelentésé a 33-as pozícióban Val, Gly, Alá, Ser, Thr, Leu, He, Glu, Asp vagy Lys;
    Xaa Jelentése a 34-es pozícióban Asn, Lys, Arg, Glu, Asp vagy His;
    Xaa jelentése a 33-ös pozícióban Gly, Áía, Ser, Thr, Leó, He, Val, Glu, Asp vagy Lys;
    Xaa jelentése a 36-os pozícióban Gly, Arg, Lys, Glu, Asp vagy His;
    Xaa jelentése a 37-es pozícióban Pro, Gly, Alá, Ser, Thr, Leu, He, Val, Glu, Asp vagy Lys, vagy ki van vágva;
    Xaa jelentése a 38-as pozícióban Ser, Arg, Lys, Glu, Asp vagy His, vagy ki van vágva;
    Xaa jelentése a 39-es pozícióban Ser, Arg, Lys, Glu, Asp vagy His, vagy ki van vágva;
    Xaa jelentése a 40-es pozícióban Gly, Asp, Glu vagy Lys, vagy ki van vágva;
    Xaa jelentése a 41-es pozícióban Alá, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp vagy Lys, vagy ki van vágva;
    Xaa jelentése a 42-es pozícióban Ser, Pro, Lys, Glu vagy Asp, vagy ki van vágva;
    Xaa jelentése a 43-as pozícióban Ser, Pro, Glu, Asp vagy Lys, vagy ki van vágva;
    Xaa jelentése a 44-es pozícióban Gly, Pro, Glu, Asp vagy Lys, vagy ki van vágva; és
    Xaa jelentése a 43-ös pozícióban Alá, Ser, Val, Glu, Asp vagy Lys, vagy ki van vágva;
    azzal a feltételiéi, hogy ha a 37-es, 38-as, 39-es, 40-es, 41-es, 42-es, 43-as vagy 44-es pozícióban levő aminosav ki van vágva, akkor attól az aminosavtól kezdve az összes aminosav szintén ki van vágva,
    3. Az 1-4, igénypontok bámeíylke szerinti beterológ fúziós fehérje, amely ben a GLP-1 vegyület legfeljebb 8 aminosavat tartalmaz, amelyek eltérnek a GLP-1 (7 37)OH, a GLP-1 (7-38)OH vagy az Exendin-4 megfelelő aminosavaitóL
  6. 8, Az 3. igénypont szerinti heteroióg fúziós fehérje, amelyben a GLP-1 ve gyúiet legfeljebb 5 aminosavat tartalmaz, amelyek eltérnek a GLP-1 (7-37)OH, a: GLP 1(7~36)QH vagy az Exendin-4 megfelelő amincsavaítól.
    191 «ΦΦΧ ♦ ♦ * «fcfc fcfc fc 9 K * x fc ««fc« * fc X « Xfc fcfcfc fcfc ».v fc fc
    7. A 8, igénypont szedni! heterolőg fúziós fehérje, amelyben a GLP-1 vegyület legfeljebb 4 amínosavat tartalmaz, amelyek eltérnek a GLP-1 .(7-37)OH, a GLP1 (7~38)OH vagy az Exendin-4 megfelelő aminosavaltöl,
    8. Á 7. igénypont szerinti heterolőg fúziós fehérje, amelyben a GLP-1 vegyület legfeljebb 3 amínosavat tartalmaz, amelyek eltérnek a GLP-1 (7-37>GR, a GLP1(7-38)OH vagy az Exenőin-4 megfelelő aminosavaitóí.
  7. 9. A 3. igénypont szerinti heterolőg fúziós fehérje, amelyben a GLP-1 vegyület legfeljebb 2 amínosavat tartalmaz, amelyek eltérnek a GLP-1 (7~37)OH, a GLP1(7-36}OH vagy az Exendin~4 megfelelő aminosavaitól,
  8. 10. Az 1-9, Igénypontok bármelyike szerinti heterolőg fúziós fehérje, ahol a GLP-ivegyüet gllcint vagy valint tartalmaz a 8-as pozícióban.
  9. 11. Az 1-1 ö. Igénypontok bármelyike szerinti heterolőg fúziós fehérje, ahol a második polipeptid humán aibumin,
  10. 12. A 11, igénypont szerinti heterolőg fúziós fehérje, ahol a második polipeptid a 34. sz. szekvenciának megfelelő szekvenciával rendelkezik.
  11. 13. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti heterolőg fúziós fehérje, ahol a második polipeptid az aíbumin M-larminaíls fragmense.
  12. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti heterolőg fúziós fehérje gyógyszerként történő alkalmazásra.
  13. 15. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti heterolőg fúziós fehérje nem Inzulinfüggő diabetes mekitus kezelésénél történő alkalmazásra.
  14. 16. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti heterolőg fúziós fehérje elhízás kezelésénél történő alkalmazásra.
    192
  15. 17. Gyógyászati készítmény nem inzulinfüggő kábeles mellhúsban szenvedő betegek kezelésére, -amely készítmény az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti heterológ fúziós fehérjét tartalmazza,
  16. 18. Gyógyászati készítmény elhízásban szenvedő betegek kezelésére, amely készítmény az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti heterológ fúziós tehénét tartalmazza.
    meghatalmazott
    J
HU0302529A 2000-12-07 2001-11-29 Glp-1 fusion proteins HU229218B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25195400P 2000-12-07 2000-12-07
PCT/US2001/043165 WO2002046227A2 (en) 2000-12-07 2001-11-29 Glp-1 fusion proteins

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0302529A2 HUP0302529A2 (hu) 2003-10-28
HUP0302529A3 HUP0302529A3 (en) 2009-03-30
HU229218B1 true HU229218B1 (en) 2013-09-30

Family

ID=22954069

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0302529A HU229218B1 (en) 2000-12-07 2001-11-29 Glp-1 fusion proteins
HU1300326A HU230603B1 (hu) 2000-12-07 2001-11-29 GLP1 fúziós fehérjék

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1300326A HU230603B1 (hu) 2000-12-07 2001-11-29 GLP1 fúziós fehérjék

Country Status (30)

Country Link
US (1) US7271149B2 (hu)
EP (2) EP1724284B1 (hu)
JP (2) JP2004528014A (hu)
KR (2) KR20080085082A (hu)
CN (2) CN1483041A (hu)
AT (2) ATE406384T1 (hu)
AU (2) AU2002226897B2 (hu)
BR (1) BR0116024A (hu)
CA (2) CA2434237C (hu)
CY (2) CY1108485T1 (hu)
CZ (2) CZ306180B6 (hu)
DE (2) DE60135581D1 (hu)
DK (2) DK1355942T3 (hu)
EA (1) EA005584B1 (hu)
EC (1) ECSP064643A (hu)
ES (2) ES2311560T3 (hu)
HK (1) HK1061411A1 (hu)
HR (1) HRP20030455A2 (hu)
HU (2) HU229218B1 (hu)
IL (3) IL155812A0 (hu)
MX (1) MXPA03005036A (hu)
NO (3) NO331273B1 (hu)
NZ (1) NZ525577A (hu)
PL (2) PL209550B1 (hu)
PT (2) PT1355942E (hu)
SI (2) SI1724284T1 (hu)
SK (2) SK288342B6 (hu)
UA (2) UA93662C2 (hu)
WO (1) WO2002046227A2 (hu)
ZA (1) ZA200303642B (hu)

Families Citing this family (319)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6444788B1 (en) 1999-03-15 2002-09-03 Novo Nordisk A/S Ion exchange chromatography of GLP-1, analogs and derivatives thereof
US6924264B1 (en) * 1999-04-30 2005-08-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Modified exendins and exendin agonists
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2001266557A1 (en) 2000-04-12 2001-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ATE346093T1 (de) * 2000-06-16 2006-12-15 Lilly Co Eli Analoge des glucagon ähnlichen peptid-1
US20060057651A1 (en) 2000-12-08 2006-03-16 Bowdish Katherine S Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
US7408041B2 (en) 2000-12-08 2008-08-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
EP1341902A2 (en) 2000-12-08 2003-09-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Chronic lymphocytic leukemia cell line and its use for producing an antibody
AU2002228608A1 (en) * 2000-12-13 2002-06-24 Eli Lilly And Company Amidated glucagon-like peptide-1
JP2005501058A (ja) 2001-07-31 2005-01-13 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッドステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ ザ ナショナル インステ Ｇｌｐ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、そのペプチド・アナログ及びその使用
CA2458371A1 (en) * 2001-08-23 2003-03-06 Eli Lilly And Company Glucagon-like peptide-1 analogs
US7176278B2 (en) * 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
US8129504B2 (en) 2001-08-30 2012-03-06 Biorexis Technology, Inc. Oral delivery of modified transferrin fusion proteins
JP2005514337A (ja) * 2001-10-18 2005-05-19 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー ヒトグルカゴン様ペプチド−１模倣体、並びに糖尿病および関連疾患の処置におけるその使用
WO2003060071A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2003059934A2 (en) * 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20080194481A1 (en) * 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
AR038102A1 (es) * 2002-01-08 2004-12-29 Lilly Co Eli Analogos extendidos de peptido 1 de tipo glucagon
US20030191056A1 (en) * 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
ATE457355T1 (de) 2002-05-24 2010-02-15 Medtronic Inc Verfahren und dna-konstrukte zur produktion von polypeptiden mit hoher ausbeute
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
EP1545608A4 (en) * 2002-06-28 2006-09-13 Centocor Inc CH1-DELETED MAMMED MUICETIC BODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND APPLICATIONS
WO2004020454A2 (en) * 2002-08-30 2004-03-11 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin fusion proteins comprising duplicate transferrin amino or carboxy terminal domains
EP1688148A1 (en) * 2002-12-03 2006-08-09 Novo Nordisk A/S Combination treatment using exendin-4 and thiazolidinediones
WO2004050115A2 (en) * 2002-12-03 2004-06-17 Novo Nordisk A/S Combination treatment using exendin-4 and thiazolidinediones
NZ541365A (en) 2002-12-27 2009-09-25 Diobex Inc Compositions and methods for the prevention and control of insulin-induced hypoglycemia
US7655618B2 (en) 2002-12-27 2010-02-02 Diobex, Inc. Compositions and methods for the prevention and control of insulin-induced hypoglycemia
EP1582223A4 (en) * 2003-01-10 2007-01-17 Niigata Tlo Corp VECTOR FOR GENE THERAPY AND METHOD FOR THE QUANTIFICATION OF A TARGET PROTEIN IN MAMMALIAN OR CULTURAL CELLS BY APPLYING THE VECTOR FOR GENE THERAPY
KR20050111583A (ko) * 2003-02-06 2005-11-25 각고호우징 게이오기주크 펩티드 결합체
UA92451C2 (en) * 2003-03-19 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Polyethelene glycol link glp-1 compounds
BRPI0408978B8 (pt) 2003-04-08 2021-07-27 Novo Nordisk As processos para regenerar uma fase estacionária cromatográfica
WO2004089985A1 (en) * 2003-04-11 2004-10-21 Novo Nordisk A/S Stable pharmaceutical compositions
CN102174102A (zh) 2003-05-15 2011-09-07 塔夫茨大学信托人 肽和多肽药物的稳定类似物
PT1641483E (pt) * 2003-06-12 2008-04-29 Lilly Co Eli Proteínas de fusão
SI1641823T1 (sl) 2003-06-12 2011-12-30 Lilly Co Eli Fuzijski proteini analogni glp-1
TW200522976A (en) * 2003-09-19 2005-07-16 Novo Nordisk As Novel plasma protein affinity tags
KR101241862B1 (ko) * 2003-09-19 2013-03-13 노보 노르디스크 에이/에스 신규 ｇｌｐ-1 유도체
KR101135244B1 (ko) * 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
US8263084B2 (en) * 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
US20090238838A1 (en) * 2003-11-13 2009-09-24 Hanmi Pharm. Ind. Co. Ltd. Insulinotropic peptide conjugate using an immunoglobulin fc
ES2378167T3 (es) 2003-11-13 2012-04-09 Hanmi Holdings Co., Ltd Complejo de proteína que utiliza fragmento de inmunoglobulina y el método para su preparación
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
ES2727854T3 (es) 2003-11-20 2019-10-21 Novo Nordisk As Formulaciones de péptidos que contienen propilenglicol que son óptimas para la producción y para su uso en dispositivos de inyección
ATE498404T1 (de) 2003-12-09 2011-03-15 Novo Nordisk As Regulierung der nahrungspräferenz mit glp-1- agonisten
CN1893980A (zh) * 2003-12-18 2007-01-10 诺沃挪第克公司 与白蛋白样物质相连的新glp－1类似物
US20060252693A1 (en) * 2004-01-29 2006-11-09 Wolfgang Glaesner Glucagon-like peptide-1 analogs
CN1980687B (zh) * 2004-02-09 2015-05-13 人类基因科学公司 清蛋白融合蛋白
ES2567634T3 (es) * 2004-02-09 2016-04-25 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de albúmina
CN1961000B (zh) * 2004-02-11 2011-05-04 安米林药品公司 具有可选择特性的杂合多肽
JP5638177B2 (ja) 2004-02-11 2014-12-10 アミリン・ファーマシューティカルズ, リミテッド・ライアビリティ・カンパニーAmylin Pharmaceuticals, Llc 膵臓ポリペプチドファミリーモチーフおよびそのモチーフを含むポリペプチド
US8076288B2 (en) * 2004-02-11 2011-12-13 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides having glucose lowering activity
JP2008537873A (ja) * 2004-03-31 2008-10-02 セントカー・インコーポレーテツド ヒトｇｌｐ−１ミメティボディ、組成物、方法および用途
PL1759001T3 (pl) 2004-04-21 2011-09-30 Alexion Pharma Inc Koniugaty dostarczane do kości i sposób ich zastosowania do nakierowywania białek do kości
WO2005113606A2 (en) 2004-05-13 2005-12-01 Eli Lilly And Company Fgf-21 fusion proteins
JP2008501765A (ja) 2004-06-11 2008-01-24 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ Ｇｌｐ−１アゴニストを用いた薬剤誘発性肥満の中和
WO2006037810A2 (en) 2004-10-07 2006-04-13 Novo Nordisk A/S Protracted glp-1 compounds
EP1799711B1 (en) 2004-10-07 2012-06-20 Novo Nordisk A/S Protracted exendin-4 compounds
EP1841796A2 (en) 2004-12-02 2007-10-10 Domantis Limited Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and glp-1 or pyy
EP2168982A1 (en) * 2004-12-22 2010-03-31 Eli Lilly &amp; Company GLP-1 analog fusion protein formulations
AU2005337493A1 (en) * 2004-12-22 2007-04-26 Centocor, Inc. GLP-1 agonists, compositions, methods and uses
US20090016959A1 (en) * 2005-02-18 2009-01-15 Richard Beliveau Delivery of antibodies to the central nervous system
US8603972B2 (en) 2005-03-18 2013-12-10 Novo Nordisk A/S Extended GLP-1 compounds
TWI362392B (en) 2005-03-18 2012-04-21 Novo Nordisk As Acylated glp-1 compounds
BRPI0520168A2 (pt) * 2005-03-28 2009-04-22 Centocor Inc mimeticorpos de glp-1 humanos, composiÇÕes, mÉtodos e usos
CA2606809C (en) * 2005-05-06 2016-01-05 Providence Health System Trimeric ox40-immunoglobulin fusion protein and methods of use
EA012442B1 (ru) * 2005-05-13 2009-10-30 Эли Лилли Энд Компани Пегилированные соединения glp-1
CN101273134B (zh) * 2005-07-27 2012-01-04 王庆华 用于预防和治疗ⅰ型和ⅱ型糖尿病的组合物和方法
BRPI0615538A2 (pt) * 2005-07-29 2011-05-17 Amprotein Corp proteìna de fusão, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, método de produção de um polipeptìdio, composição farmacêutica, composição alimentar, método para a redução do peso corpóreo, método para o tratamento de diabetes, método para aumentar a vida média de um peptìdio ou uma proteìna terapêutica recombinante em um indivìduo, método para aumentar a eficácia de um peptìdio ou proteìna terapêutica, método para o tratamento de diabetes ou redução do peso corpóreo
CN101277722A (zh) * 2005-08-06 2008-10-01 王庆华 用于预防和治疗ⅰ型糖尿病的组合物及方法
EP1922336B1 (en) * 2005-08-11 2012-11-21 Amylin Pharmaceuticals, LLC Hybrid polypeptides with selectable properties
KR101399178B1 (ko) * 2005-08-11 2014-06-18 아스트라제네카 파마수티컬스 엘피 선별가능한 특성을 갖는 하이브리드 폴리펩티드
ES2397289T3 (es) * 2005-09-22 2013-03-06 Biocompatibles Uk Ltd. Polipéptidos de fusión de GLP-1 (péptido 1 de tipo glucagón) con resistencia a peptidasa incrementada
JPWO2007049695A1 (ja) * 2005-10-26 2009-04-30 中外製薬株式会社 凝集性ｇｌｐ−１アナログおよび徐放性医薬組成物
ES2586236T3 (es) * 2005-11-04 2016-10-13 Glaxosmithkline Llc Procedimientos para administrar agentes hipoglucémicos
US8039432B2 (en) 2005-11-09 2011-10-18 Conjuchem, Llc Method of treatment of diabetes and/or obesity with reduced nausea side effect
CN1962695B (zh) * 2005-11-09 2011-08-31 浙江德清安平生物制药有限公司 类胰高血素肽-1融合蛋白及其制备和用途
US20080280328A1 (en) * 2005-11-18 2008-11-13 Novozymes A/S Glucoamylase Variants
WO2007063907A1 (ja) * 2005-11-30 2007-06-07 Shionogi & Co., Ltd. ペプチド糖鎖付加体およびそれを有効成分とする医薬
EP2364735A3 (en) 2005-12-16 2012-04-11 Nektar Therapeutics Branched PEG conjugates of GLP-1
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
WO2007073486A2 (en) 2005-12-20 2007-06-28 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
WO2007084321A2 (en) 2006-01-12 2007-07-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to ox-2/cd200 and uses thereof
US8450269B2 (en) 2006-02-03 2013-05-28 Prolor Biotech Ltd. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
WO2007092252A2 (en) * 2006-02-03 2007-08-16 Modigene Inc Long-acting polypeptides and methods of producing same
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8759292B2 (en) 2006-02-03 2014-06-24 Prolor Biotech, Llc Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10351615B2 (en) 2006-02-03 2019-07-16 Opko Biologics Ltd. Methods of treatment with long-acting growth hormone
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9458444B2 (en) 2006-02-03 2016-10-04 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8476234B2 (en) * 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
EP1816201A1 (en) * 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
CN101003574B (zh) * 2006-02-21 2010-12-15 大连帝恩生物工程有限公司 长效降血糖肽的重组表达及其在糖尿病治疗药物中的应用
CA2800389A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Amgen Inc. Glp-1 compounds
DE602006009631D1 (de) 2006-05-10 2009-11-19 Biocompatibles Uk Ltd GLP-1 Peptide enthaltende kugelförmige Mikrokapseln, deren Produktion und deren Verwendung
CA2652907A1 (en) 2006-05-26 2007-12-06 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of diabetes
EP2474318A1 (en) 2006-06-07 2012-07-11 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2008011446A2 (en) 2006-07-18 2008-01-24 Centocor, Inc. Human glp-1 mimetibodies, compositions, methods and uses
EP2046826B1 (en) 2006-07-24 2011-09-14 Biorexis Pharmaceutical Corporation Exendin fusion proteins
CL2007002502A1 (es) 2006-08-31 2008-05-30 Hoffmann La Roche Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer.
EP2059530B1 (en) * 2006-08-31 2012-08-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Method for the production of insulin-like growth factor-i
WO2008030968A2 (en) * 2006-09-06 2008-03-13 Phase Bioscience, Inc. Fusion peptide therapeutic compositions
CL2007002634A1 (es) * 2006-09-13 2008-05-16 Smithkline Beecham Corp Uso de una composicion que comprende al menos un polipeptido que tiene actividad de peptido-1 semejante a glucagon (glp-1) como agente hipoglucemiante de larga duracion.
TWI428346B (zh) * 2006-12-13 2014-03-01 Imp Innovations Ltd 新穎化合物及其等對進食行為影響
US20090098130A1 (en) * 2007-01-05 2009-04-16 Bradshaw Curt W Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds
JP2008169195A (ja) * 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
AU2011254001B2 (en) * 2007-01-05 2012-08-02 Covx Technologies Ireland Limited Glucagon-like protein-1 receptor (GLP-1R) agonist compounds
EP1972349A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-24 Biocompatibles UK Limited GLP-1 fusion peptides conjugated to polymer(s), their production and use
EP1975176A1 (en) * 2007-03-27 2008-10-01 Biocompatibles UK Limited Novel glp-1 fusion peptides, their production and use
EP2144930A1 (en) 2007-04-18 2010-01-20 ZymoGenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
ES2402172T3 (es) 2007-04-23 2013-04-29 Intarcia Therapeutics, Inc Formulación en suspensión de péptidos insulinotrópicos y usos de los mismos
JP2009019027A (ja) * 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体
US8986684B2 (en) 2007-07-25 2015-03-24 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating autoimmune disease
JP2010535781A (ja) * 2007-08-03 2010-11-25 イーライ リリー アンド カンパニー 肥満に対する処置
ES2672770T3 (es) 2007-09-05 2018-06-18 Novo Nordisk A/S Derivados del péptido-1 similar al glucagón y su uso farmacéutico
US20100292133A1 (en) * 2007-09-05 2010-11-18 Novo Nordisk A/S Truncated glp-1 derivaties and their therapeutical use
JP5606314B2 (ja) 2007-09-05 2014-10-15 ノボ・ノルデイスク・エー／エス Ａ−ｂ−ｃ−ｄ−で誘導体化されたペプチドとその治療用途
ES2536772T3 (es) 2007-09-21 2015-05-28 The Regents Of The University Of California El interferón dirigido demuestra potentes actividades apoptóticas y antitumorales
US20090181037A1 (en) * 2007-11-02 2009-07-16 George Heavner Semi-Synthetic GLP-1 Peptide-FC Fusion Constructs, Methods and Uses
CA2718480A1 (en) * 2008-03-31 2009-10-08 Glaxo Group Limited Drug fusions and conjugates
CA2720478A1 (en) * 2008-04-03 2009-10-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Pegylated insulin-like-growth-factor assay
CN101328221B (zh) * 2008-04-14 2011-03-23 中国药科大学 一种降糖多肽融合蛋白及其衍生物的结构及用途
EP4074327A1 (en) 2008-06-27 2022-10-19 Duke University Therapeutic agents comprising elastin-like peptides
ES2523043T3 (es) 2008-07-23 2014-11-20 Hanmi Science Co., Ltd. Un complejo polipeptídico que comprende un polímero no peptidílico que tiene tres extremos funcionales
RU2526804C2 (ru) 2008-08-06 2014-08-27 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг Конъюгированные белки с пролонгированным действием in vivo
US20100075897A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Jinan University Method for sustainedly releasing bioactive peptides and application thereof
RU2011118056A (ru) 2008-10-15 2012-11-27 Ангиокем Инк. Конъюгаты агонистов glp-1 и их применение
CN102307904A (zh) 2008-12-05 2012-01-04 安吉奥开米公司 神经降压素或神经降压素类似物的缀合物及其用途
MX2011005874A (es) 2008-12-05 2011-06-27 Glaxo Group Ltd Metodos para seleccionar polipeptidos resistentes a proteasa.
JP2012511586A (ja) 2008-12-10 2012-05-24 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 医薬組成物
CN102292349B (zh) 2009-01-22 2016-04-13 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 稳定的生长激素化合物
US9493545B2 (en) 2009-02-11 2016-11-15 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates
US9238878B2 (en) 2009-02-17 2016-01-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
JP2012521971A (ja) 2009-03-27 2012-09-20 グラクソ グループ リミテッド 薬物融合体および複合体
EP2421562B1 (en) 2009-04-20 2019-03-13 Angiochem Inc. Treatment of ovarian cancer using an anticancer agent conjugated to an angiopep-2 analog
EP2448965A4 (en) 2009-07-02 2015-02-11 Angiochem Inc MULTIMEPEPTID CONJUGATES AND ITS USES
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
CN105963710A (zh) 2009-08-06 2016-09-28 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 具有延长的体内功效的生长激素
MX366935B (es) * 2009-08-14 2019-07-31 Phasebio Pharmaceuticals Inc Peptidos intestinales vasoactivos modificados.
CN101993485B (zh) * 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
CN101993496B (zh) * 2009-08-20 2013-06-05 重庆富进生物医药有限公司 双重调节血糖血脂融合蛋白及其制法和用途
SG10201406063XA (en) 2009-09-30 2014-11-27 Glaxo Group Ltd Drug fusions and conjugates with extended half life
WO2011043530A1 (ko) * 2009-10-09 2011-04-14 (주)알테오젠 Ｇｌｐ-1 유사체의 융합체, 및 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물
US8697648B2 (en) 2009-10-20 2014-04-15 Georgia State University Research Foundation, Inc. Protein agent for diabetes treatment and β cell imaging
WO2011051489A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
CN102070717B (zh) * 2009-11-19 2013-04-10 东莞太力生物工程有限公司 融合蛋白及其制备方法、编码该蛋白的dna序列、表达载体、宿主细胞、含有该蛋白的药物组合物
MX2012006462A (es) 2009-12-08 2012-10-03 Teva Pharma Fusiones de albumina bche para el tratamiento de abuso de cocaina.
TWI508737B (zh) 2010-01-22 2015-11-21 諾佛 儂迪克股份有限公司 具有延長的活體內功效的生長激素
CA2787895A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Novo Nordisk Health Care Ag Stable growth hormone compounds
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
CN102939304B (zh) 2010-04-09 2017-04-19 阿尔布麦狄克斯公司 白蛋白衍生物和变体
CN101875700B (zh) * 2010-04-09 2012-09-26 无锡和邦生物科技有限公司 一种增加促胰岛素分泌肽融合蛋白生物活性的方法
EP2555791B1 (en) 2010-04-09 2017-11-01 Sinai Health System Methods for treating disorders of the gastrointestinal tract using a glp-1 agonist
KR20130093470A (ko) 2010-04-30 2013-08-22 가부시키가이샤산와카가쿠켄큐쇼 생리활성 물질 등의 생체 내 안정성 향상을 위한 펩티드 및 생체 내 안정성이 향상된 생리활성 물질
JP2013525491A (ja) 2010-05-04 2013-06-20 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 心血管障害を治療または予防し心血管保護を提供する方法
WO2011153642A1 (en) * 2010-06-10 2011-12-15 Angiochem Inc. Leptin and leptin analog conjugates and fusion proteins and uses thereof
CN101891823B (zh) * 2010-06-11 2012-10-03 北京东方百泰生物科技有限公司 一种Exendin-4及其类似物融合蛋白
US9234023B2 (en) * 2010-06-24 2016-01-12 Biousian Biosystems, Inc. Glucagon-like peptide-1 glycopeptides
MX2013000250A (es) 2010-07-02 2013-10-28 Angiochem Inc Polipeptidos cortos y que contienen d-aminoacido para conjugados terapeuticos y usos de los mismos.
CN102311501A (zh) * 2010-07-08 2012-01-11 天津药物研究院 含有glp-1或其类似物的融合蛋白、制备方法及其应用
CN101906158B (zh) * 2010-07-14 2013-10-23 中国药科大学 一种聚乙二醇化降糖多肽及其制法和用途
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
CN102532323B (zh) * 2010-12-09 2014-07-23 天津药物研究院 一种多肽复合物、药物组合物、其制备方法和应用
KR101925620B1 (ko) 2010-12-16 2018-12-05 노보 노르디스크 에이/에스 Ｇｌｐ-1 아고니스트 및 ｎ-(8-(2-히드록시벤조일)아미노)카프릴산의 염을 포함하는 고체 조성물
CN102533655A (zh) * 2010-12-21 2012-07-04 青岛黄海制药有限责任公司 高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S细胞株及其建立方法
CA2823066A1 (en) * 2010-12-27 2012-07-05 Alexion Pharma International Sarl Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
US9540438B2 (en) 2011-01-14 2017-01-10 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged immunoglobulin polypeptides and methods of use thereof
CN103402542B (zh) 2011-02-28 2017-05-03 独立行政法人国立循环器病研究中心 恶性肿瘤转移抑制用药物
ES2676878T3 (es) 2011-03-03 2018-07-25 Zymeworks Inc. Diseño de armazón de heteromultímero multivalente y constructos
WO2012136792A2 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Cck compositions
WO2012136790A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Compositions comprising fusion proteins or conjugates with an improved half -life
US9266940B2 (en) 2011-04-12 2016-02-23 Novo Nordisk A/S Double-acylated GLP-1 derivatives
CA2873553C (en) 2011-06-06 2020-01-28 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension
UA124083C2 (uk) 2011-06-28 2021-07-21 ІНГІБРЕКС, Інк. Злитий серпіновий поліпептид і спосіб його застосування
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
RU2639526C2 (ru) * 2011-06-28 2017-12-21 ИНХИБРКС ЭлЭлСи Слитые полипептиды, содержащие домен wap, и способы их применения
KR20140054009A (ko) 2011-07-01 2014-05-08 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 릴랙신 융합 폴리펩타이드 및 그의 용도
MX2014000316A (es) 2011-07-08 2014-02-19 Bayer Ip Gmbh Proteinas de fusion liberadoras de relaxina y usos de las mismas.
US9233143B2 (en) 2011-08-19 2016-01-12 National Cerebral And Cardiovascular Center Medicinal agent for preventing exacerbation of malignant tumor, comprising combination of natriuretic peptide receptor GC-A and GC-B agonists
JP6118251B2 (ja) * 2011-08-25 2017-04-19 株式会社Ｌｓｉメディエンス グルカゴン様ペプチド−１の測定方法及びそれに使用するキット
EP2753642B8 (en) 2011-09-06 2017-12-13 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
US20140315817A1 (en) 2011-11-18 2014-10-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Variant serum albumin with improved half-life and other properties
CN104244981A (zh) 2011-12-09 2014-12-24 诺和诺德A/S Glp-1激动剂
KR101895047B1 (ko) * 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
WO2013113008A1 (en) 2012-01-26 2013-08-01 Amgen Inc. Growth differentiation factor 15 (gdf-15) polypeptides
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
KR20140136934A (ko) 2012-03-16 2014-12-01 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 알부민 변이체
EP2827885B1 (en) 2012-03-22 2018-08-15 Novo Nordisk A/S Compositions of glp-1 peptides and preparation thereof
DK2827845T3 (en) 2012-03-22 2019-04-01 Novo Nordisk As COMPOSITIONS INCLUDING A PROCEDURE AND PREPARING THEREOF
JP2015520128A (ja) 2012-04-19 2015-07-16 オプコ バイオロジクス リミテッド 長時間作用性オキシントモジュリン変異体とその作製方法
IN2014DN09297A (hu) 2012-05-16 2015-07-10 Glaxo Group Ltd
AU2013263349B2 (en) 2012-05-17 2016-09-08 Extend Biosciences, Inc Carriers for improved drug delivery
US9745359B2 (en) * 2012-05-18 2017-08-29 Adda Biotech Inc. Protein and protein conjugate for diabetes treatment, and applications thereof
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
LT3401402T (lt) * 2012-06-08 2020-12-28 Alkermes Pharma Ireland Limited Ligandai, modifikuoti cirkuliarinės permutacijos pagalba, kaip agonistai ir antagonistai
ES2871328T3 (es) 2012-06-20 2021-10-28 Novo Nordisk As Formulación de comprimido que comprende un péptido y un agente de suministro
CA2878640C (en) 2012-07-13 2023-10-24 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
AR091902A1 (es) * 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
AR092862A1 (es) * 2012-07-25 2015-05-06 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de insulina de accion prolongada y un peptido insulinotropico y metodo de preparacion
AR094821A1 (es) * 2012-07-25 2015-09-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
WO2014072481A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
BR122020018510B1 (pt) 2012-11-20 2023-03-14 Opko Biologics Ltd Método para aumentar incrementalmente o tamanho hidrodinâmico de um fator de coagulação ativado viia
WO2014089354A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 The Regents Of The University Of California Cd138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
UA116553C2 (uk) 2012-12-21 2018-04-10 Санофі Пептидна сполука - агоніст рецептора glp-1 i glp
WO2014113359A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Formulations of albu-bche, preparation and uses thereof
US9580486B2 (en) * 2013-03-14 2017-02-28 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
JP6464145B2 (ja) 2013-04-05 2019-02-06 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 成長ホルモン化合物製剤
WO2014194100A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 The Regents Of The University Of California Anti-cspg4 fusions with interferon for the treatment of malignancy
CN104277112B (zh) * 2013-07-04 2018-01-26 嘉和生物药业有限公司 长效降血糖融合蛋白
HUE050630T2 (hu) * 2013-07-31 2020-12-28 Amgen Inc Növekedési differenciációs faktor 15 (GDF15) konstrukciók
CN103408669B (zh) * 2013-08-01 2016-01-20 江苏泰康生物医药有限公司 Glp-1类似物融合蛋白，及其制备方法和用途
CN104371019B (zh) 2013-08-13 2019-09-10 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与glp-1r特异性结合的抗体及其与glp-1的融合蛋白质
WO2015022420A1 (en) * 2013-08-16 2015-02-19 Medimmune Limited Gip and glp-1 receptor dual-agonists for the treatment of diabetes
CN105934252B (zh) 2013-10-10 2020-11-10 贝思以色列女会吏医学中心公司 Tm4sf1结合蛋白及其使用方法
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
KR20160089390A (ko) * 2013-12-10 2016-07-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 다중-하부단위 구조에 대한 약학적 활성 개체의 표적화 전달을 위한 다중-하부단위 구조의 하부단위의 결합 도메인의 용도
TW201609796A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 非醯化之艾塞那肽－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）胜肽類似物
EP3080150B1 (en) 2013-12-13 2018-08-01 Sanofi Exendin-4 peptide analogues as dual glp-1/gip receptor agonists
TW201609799A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 雙重ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑
TW201609797A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
HU231358B1 (hu) * 2014-03-31 2023-03-28 Hanmi Pharm. Co., Ltd Eljárás fehérjék és peptidek oldhatóságának javítására immunoglobulin Fc fragmentum kapcsolás alkalmazása révén
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
WO2015165480A1 (en) 2014-04-30 2015-11-05 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same
NO2776305T3 (hu) 2014-04-23 2018-01-27
EP3139949B1 (en) 2014-05-08 2020-07-29 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising a vip-elp fusion protein for use in treating cystic fibrosis
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
US10822596B2 (en) 2014-07-11 2020-11-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating craniosynostosis
CN104558198A (zh) * 2014-07-25 2015-04-29 成都贝爱特生物科技有限公司 GLP-1类似物和amylin类似物的融合蛋白制备及其用途
CN104257696B (zh) * 2014-09-04 2017-08-25 西安国誉生物科技有限公司 一种降糖稳糖酵母菌粉及其制备方法和应用
EP3189072B1 (en) 2014-09-05 2018-07-18 University of Copenhagen Gip peptide analogues
CN107108713A (zh) 2014-10-10 2017-08-29 诺和诺德股份有限公司 稳定的基于glp‑1的glp‑1/胰高血糖素受体共激动剂
CN104327187B (zh) * 2014-10-11 2018-06-08 上海兴迪金生物技术有限公司 一种重组人GLP-1-Fc融合蛋白
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
CA2964463C (en) 2014-10-22 2024-02-13 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
AU2015343048A1 (en) * 2014-11-06 2017-05-18 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Immunotherapeutics for cancer and autoimmune diseases
MX2017007392A (es) 2014-12-05 2019-01-24 Alexion Pharma Inc Tratamiento de convulsiones con fosfatasa alcalina recombinante.
JP7095992B2 (ja) * 2014-12-08 2022-07-05 １グローブ バイオメディカル カンパニー， リミテッド 可溶性ユニバーサルａｄｃｃ増強合成融合遺伝子およびペプチド技術ならびにその使用
WO2016118577A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-28 Medimmune, Llc Thymosin-beta-four fusion proteins
US10603361B2 (en) 2015-01-28 2020-03-31 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
AU2016219513B2 (en) 2015-02-09 2021-09-30 Immunoforge Co., Ltd. Methods and compositions for treating muscle disease and disorders
DK3257524T3 (da) 2015-02-11 2020-11-23 Gmax Biopharm Llc Stabiliseret opløsningspræparat af farmaceutisk glp-1r-antistoffusionsprotein
CA2981517A1 (en) * 2015-04-01 2016-10-06 The Scripps Research Institute Methods and compositions related to gpcr agonist polypeptides
CR20170510A (es) 2015-04-10 2018-02-26 Amgen Inc Muteínas de interuquina 2 para la expansión de células t regulatorias
AR105616A1 (es) 2015-05-07 2017-10-25 Lilly Co Eli Proteínas de fusión
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
CN107921143B (zh) 2015-06-15 2021-11-19 安吉奥开米公司 用于治疗软脑膜癌病的方法
EP3988113A1 (en) 2015-06-19 2022-04-27 OPKO Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
AR105284A1 (es) 2015-07-10 2017-09-20 Sanofi Sa Derivados de exendina-4 como agonistas peptídicos duales específicos de los receptores de glp-1 / glucagón
CN108350440A (zh) 2015-08-17 2018-07-31 阿雷克森制药公司 碱性磷酸酯的制造
JP7007261B2 (ja) 2015-08-20 2022-01-24 アルブミディクス リミティド アルブミン変異体及びコンジュゲート
WO2017041001A2 (en) 2015-09-04 2017-03-09 The California Institute For Biomedical Research Insulin immunoglobulin fusion proteins
EP3355904A4 (en) 2015-09-28 2019-06-12 Alexion Pharmaceuticals, Inc. IDENTIFICATION OF EFFECTIVE DOSE SHEETS FOR TISSUE-SPECIFIC ALKALINE PHOSPHATASE ENZYMERSAT THERAPY OF HYPOPHOSPHATASIA
US11400140B2 (en) 2015-10-30 2022-08-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating craniosynostosis in a patient
CN105367664B (zh) * 2015-11-04 2019-09-20 成都贝爱特生物科技有限公司 激活GLP-1受体和Amylin受体双功能作用的融合蛋白制备及其用途
CN114835795A (zh) * 2015-11-16 2022-08-02 Ubi蛋白公司 用于延长蛋白质半衰期的方法
CN108473541B (zh) 2015-11-24 2023-05-12 特拉斯福特普拉斯公司 通过受体介导的化学疗法治疗癌症的肽化合物和肽缀合物
EP3426286A4 (en) 2016-03-08 2019-12-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING HYPOPHOSPHATASE IN CHILDREN
CA3019726A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating muscle weakness with alkaline phosphatases
WO2017173395A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in adolescents and adults
US11208632B2 (en) 2016-04-26 2021-12-28 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
EP3464573A4 (en) 2016-06-06 2020-02-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. IMPACT OF METAL ON THE PRODUCTION OF ALKALINE PHOSPHATASES
CN106046176B (zh) * 2016-08-16 2019-09-10 中国药科大学 一种高活性长效降糖融合蛋白及其制备方法与医药用途
US11116821B2 (en) 2016-08-18 2021-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating tracheobronchomalacia
WO2018045872A1 (zh) * 2016-09-06 2018-03-15 中国药科大学 一种多肽及其用途
CN106279400A (zh) * 2016-09-06 2017-01-04 中国药科大学 P8降糖肽的设计及其用途
CN109200273B (zh) * 2017-07-04 2021-02-19 中国药科大学 一种多肽用于制备预防或治疗脂肪肝病药物的用途
EP3554546A4 (en) * 2016-12-14 2021-04-14 Ligandal, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR ADMINISTRATION OF NUCLEIC ACID AND PROTEIN PAYLOADS
CN106519016A (zh) * 2016-12-20 2017-03-22 中国药科大学 降糖调脂肽——Progly肽的设计及其用途
CN107033234B (zh) * 2017-01-03 2018-06-26 北京凯因科技股份有限公司 酰化的glp-1衍生物
US11192931B2 (en) * 2017-01-25 2021-12-07 Medlmmune, Llc Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
KR20190129058A (ko) 2017-03-31 2019-11-19 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 성인 및 청소년에서 저포스파타제증 (hpp)을 치료하는 방법
CN108727486A (zh) * 2017-04-24 2018-11-02 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 长效神经生长因子、制备方法及其组合物
BR112019024563A2 (pt) 2017-05-24 2020-06-23 Transfert Plus S.E.C. Compostos peptídicos, compostos conjugados e usos dos mesmos para tratar doenças inflamatórias
EP4361173A2 (en) 2017-05-31 2024-05-01 University of Copenhagen Long-acting gip peptide analogues
AU2018321157B2 (en) 2017-08-24 2024-03-28 Novo Nordisk A/S GLP-1 compositions and uses thereof
WO2019067499A1 (en) 2017-09-27 2019-04-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. BIOMARKER SIGNATURE FOR PREDICTING A TUMOR RESPONSE TO ANTI-CD200 THERAPY
CA3082625A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Eli Lilly And Company Methods of using and compositions containing dulaglutide
CN115109166A (zh) * 2017-11-24 2022-09-27 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的多结构域活性蛋白
CN109836503B (zh) * 2017-11-24 2022-09-16 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的多重活性蛋白
WO2019119673A1 (zh) 2017-12-19 2019-06-27 北京吉源生物科技有限公司 一种双基因修饰的干细胞及其用途
CN113603794B (zh) * 2018-01-11 2024-01-16 安源医药科技（上海）有限公司 用于调节血糖和脂质的增效型双功能蛋白
WO2019140021A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Eli Lilly And Company Combination therapy
CN110092835A (zh) * 2018-01-30 2019-08-06 上海惠盾生物技术有限公司 一种glp-1类似物-col3a1融合蛋白
PL3746111T3 (pl) 2018-02-02 2024-01-15 Novo Nordisk A/S Stałe kompozycje zawierające agonistę glp-1 i sól kwasu n-(8-(2- hydroksybenzoilo)amino kaprylowego i substancję poślizgową
WO2019190752A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of glycoproteins
CA3095988A1 (en) 2018-04-05 2019-10-10 Sun Pharmaceutical Industries Limited Novel glp-1 analogues
KR20200140878A (ko) 2018-04-09 2020-12-16 암젠 인크 성장 분화 인자 15 융합 단백질
WO2019200594A1 (zh) 2018-04-19 2019-10-24 杭州先为达生物科技有限公司 酰化的glp-1衍生物
CN110964116A (zh) * 2018-09-26 2020-04-07 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物
MX2021004665A (es) * 2018-10-22 2021-08-24 Janssen Pharmaceutica Nv Proteinas de fusion de peptido similar al glucagon 1 (glp1)-factor de diferenciacion de crecimiento 15 (gdf15) y usos de estas.
CN113366014A (zh) 2018-12-03 2021-09-07 安泰博医药 经修饰的gip肽类似物
WO2020118843A1 (zh) * 2018-12-12 2020-06-18 四川利通科创生物医药科技有限公司 一种glp-1突变体及其制备方法和用途
US20220153853A1 (en) 2018-12-21 2022-05-19 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Bispecific protein
CA3177693A1 (en) 2019-04-05 2020-10-05 Eli Lilly And Company Therapeutic uses of dulaglutide
CN110151980B (zh) * 2019-06-30 2022-12-09 中国药科大学 Glp-1受体激动剂融合蛋白在制备预防或治疗高血脂药物中的应用
IL294520A (en) 2020-02-18 2022-09-01 Novo Nordisk As Pharmaceutical formulations
WO2021167107A1 (ja) 2020-02-22 2021-08-26 Ｊｃｒファーマ株式会社 ヒトトランスフェリンレセプター結合ペプチド
CA3193453A1 (en) 2020-09-30 2022-04-07 Beijing Ql Biopharmaceutical Co., Ltd. Polypeptide conjugates and methods of uses
BR112023019228A2 (pt) 2021-03-22 2023-11-28 Japan As Represented By The Director General Of Nat Institute Of Infectious Diseases Peptídeo e composição contendo o peptídeo
TW202305012A (zh) 2021-03-22 2023-02-01 日商肽夢想股份有限公司 c-Met 蛋白質結合肽複合物
CN113150172B (zh) * 2021-04-28 2023-09-22 中国药科大学 Glp-1r/gipr双靶点激动剂融合蛋白及其制备方法与应用
BR112023026370A2 (pt) 2021-06-18 2024-03-05 Peptidream Inc Peptídeo pendente de ligação ao ghr e composição que compreende o mesmo
AU2022329794A1 (en) 2021-08-19 2024-02-22 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Human transferrin receptor–binding peptide
WO2023026994A1 (ja) 2021-08-21 2023-03-02 武田薬品工業株式会社 ヒトトランスフェリンレセプター結合ペプチド－薬物コンジュゲート
IL311025A (en) 2021-08-24 2024-04-01 Peptidream Inc Human receptor binding antibody-peptides
CN113801853B (zh) * 2021-11-19 2022-03-15 山东兴瑞生物科技有限公司 Exendin-4融合基因修饰的MSC及其应用
EP4337244A1 (en) * 2022-03-25 2024-03-20 Beijing QL Biopharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical compositions of polypeptide conjugates and methods of uses thereof
EP4323413A1 (en) * 2022-03-30 2024-02-21 Beijing QL Biopharmaceutical Co., Ltd. Liquid pharmaceutical compositions of polypeptide conjugates and methods of uses thereof
CN114774496B (zh) * 2022-06-21 2022-10-04 北京惠之衡生物科技有限公司 一种高密度发酵制备glp-1类似物的方法

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
US5766883A (en) * 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
FR2650598B1 (fr) * 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
FR2686900B1 (fr) * 1992-01-31 1995-07-21 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1995029239A2 (en) * 1994-04-22 1995-11-02 Corixa Corporation Compounds and methods for the stimulation and enhancement of protective immune responses and il-12 production
US5990077A (en) * 1995-04-14 1999-11-23 1149336 Ontario Inc. Glucagon-like peptide-2 and its therapeutic use
US5925351A (en) * 1995-07-21 1999-07-20 Biogen, Inc. Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
PE99498A1 (es) 1996-07-26 1999-01-21 Novartis Ag Polipeptidos de fusion
ATE417622T1 (de) 1996-08-08 2009-01-15 Amylin Pharmaceuticals Inc Regulation gastrointestinaler beweglichkeit
PT944648E (pt) * 1996-08-30 2007-06-26 Novo Nordisk As Derivados do glp-1.
UA65549C2 (uk) * 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
US6190909B1 (en) * 1997-04-17 2001-02-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. TH2-specific gene
EP0887061A1 (en) * 1997-06-28 1998-12-30 The Procter & Gamble Company Faecal collector
ES2293688T5 (es) 1997-08-08 2011-05-04 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Nuevos compuestos análogos de la exendina.
ATE383867T1 (de) 1997-11-14 2008-02-15 Amylin Pharmaceuticals Inc Neuartige exendin agonisten
WO1999025727A2 (en) 1997-11-14 1999-05-27 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Novel exendin agonist compounds
WO1999040788A1 (en) 1998-02-13 1999-08-19 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Inotropic and diuretic effects of exendin and glp-1
ATE265224T1 (de) * 1998-02-27 2004-05-15 Novo Nordisk As Glp-1 derivate mit einem helix-gehalt über 25 , die partiell strukturierte mizellenartige aggregate bilden
JP2002506792A (ja) * 1998-02-27 2002-03-05 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｎ末端修飾ｇｌｐ−１誘導体
DE69942306D1 (de) 1998-02-27 2010-06-10 Novo Nordisk As Abkömmlinge von glp-1 analogen
EP1056775B1 (en) 1998-02-27 2010-04-28 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives of glp-1 and exendin with protracted profile of action
ES2273497T3 (es) * 1998-06-15 2007-05-01 Gtc Biotherapeutics, Inc. Proteina de fusion de la albumina serica humana de eritropoyetina analoga.
JP4562286B2 (ja) * 1998-12-10 2010-10-13 ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー 抗体模倣物および他の結合タンパク質のタンパク質骨格
AU754770B2 (en) * 1999-05-17 2002-11-21 Conjuchem Biotechnologies Inc. Long lasting insulinotropic peptides
US6514500B1 (en) * 1999-10-15 2003-02-04 Conjuchem, Inc. Long lasting synthetic glucagon like peptide {GLP-!}
AU2001266557A1 (en) 2000-04-12 2001-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2003060071A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2003059934A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins

Also Published As

Publication number Publication date
UA93662C2 (uk) 2011-03-10
AU2689702A (en) 2002-06-18
PL393178A1 (pl) 2011-02-14
SI1355942T1 (sl) 2009-02-28
CZ306180B6 (cs) 2016-09-14
DE60139430D1 (de) 2009-09-10
DK1724284T3 (da) 2009-11-02
ES2311560T3 (es) 2009-02-16
WO2002046227A2 (en) 2002-06-13
UA81897C2 (uk) 2008-02-25
JP2004528014A (ja) 2004-09-16
US20040053370A1 (en) 2004-03-18
SK288088B6 (sk) 2013-06-03
HUP1300326A2 (en) 2003-10-28
ZA200303642B (en) 2004-08-12
NO20032565L (no) 2003-08-01
NO20101602L (no) 2003-08-01
AU2002226897B2 (en) 2007-10-25
CA2434237C (en) 2012-05-15
MXPA03005036A (es) 2003-09-05
EP1355942B1 (en) 2008-08-27
CY1108485T1 (el) 2014-04-09
KR20080085082A (ko) 2008-09-22
PL209550B1 (pl) 2011-09-30
ATE406384T1 (de) 2008-09-15
SK288342B6 (en) 2016-03-01
HU230603B1 (hu) 2017-03-28
NO331273B1 (no) 2011-11-14
EP1724284A2 (en) 2006-11-22
CA2716959A1 (en) 2002-06-13
PT1724284E (pt) 2009-09-30
SI1724284T1 (sl) 2009-12-31
WO2002046227A3 (en) 2003-04-24
HUP0302529A2 (hu) 2003-10-28
BR0116024A (pt) 2005-12-13
EA200300644A1 (ru) 2003-12-25
CZ308214B6 (cs) 2020-03-04
ECSP064643A (es) 2009-07-25
EP1724284A3 (en) 2007-04-18
IL155812A0 (en) 2003-12-23
HRP20030455A2 (en) 2004-08-31
PT1355942E (pt) 2008-11-21
CA2434237A1 (en) 2002-06-13
ES2328510T3 (es) 2009-11-13
HK1061411A1 (en) 2004-09-17
PL366208A1 (en) 2005-01-24
KR20040038901A (ko) 2004-05-08
IL184429A (en) 2010-04-15
CN101712722A (zh) 2010-05-26
ATE437891T1 (de) 2009-08-15
EA005584B1 (ru) 2005-04-28
SK6702003A3 (en) 2004-08-03
DE60135581D1 (de) 2008-10-09
NZ525577A (en) 2005-05-27
EP1355942A2 (en) 2003-10-29
IL155812A (en) 2009-09-22
NO20032565D0 (no) 2003-06-05
DK1355942T3 (da) 2008-11-17
KR100942864B1 (ko) 2010-02-17
IL184429A0 (en) 2007-10-31
CN1483041A (zh) 2004-03-17
NO332221B1 (no) 2012-07-30
CZ20031602A3 (cs) 2006-04-12
CZ2014740A3 (hu) 2006-04-12
CY1109377T1 (el) 2014-07-02
HUP0302529A3 (en) 2009-03-30
EP1724284B1 (en) 2009-07-29
US7271149B2 (en) 2007-09-18
NO20111369L (no) 2003-08-01
JP2011006447A (ja) 2011-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU229218B1 (en) Glp-1 fusion proteins
US20070161087A1 (en) Glp-1 fusion proteins
ES2298785T3 (es) Proteinas de fusion.
JP4629047B2 (ja) Ｇｌｐ−１アナログ複合タンパク質
AU2002226897A1 (en) GLP-1 fusion proteins
AU2007231863A1 (en) GLP-1 Fusion Proteins