MX2011005874A - Metodos para seleccionar polipeptidos resistentes a proteasa. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método para seleccionar, aislar y/o recuperar un péptido o polipéptido de una genoteca o un repertorio de péptidos y polipéptidos (v.gr., un sistema de despliegue) que es resistente a degradación por una proteasa tal como una proteasa encontrada en el suero; generalmente, el método comprende proveer una genoteca o repertorio de péptidos o polipéptidos, incubar la genoteca o repertorio con una proteasa bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa, y seleccionar, aislar y/o recuperar un péptido o polipéptido que es resistente a degradación por la proteasa y tiene una actividad biológica deseada; los péptidos y polipéptidos seleccionados tienen utilidad como terapéuticos, v.gr., para tratar enfermedad en humanos.

Description

MÉTODOS PARA SELECCIONAR POLIPÉPTIPOS RESISTENTES A PROTEASA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los polipéptidos y péptidos se han convertido en agentes cada vez más importantes en una variedad de aplicaciones, incluyendo aplicaciones industriales y uso como agentes medicinales, terapéuticos y de diagnóstico. Sin embargo, muchos péptidos, polipéptidos y proteínas terapéuticos son particularmente susceptibles a degradación in vivo por proteasas que ocurren naturalmente. Más aún, en ciertos estados fisiológicos, tales como estados inflamatorios (v.gr., EPOC) y cáncer, la cantidad de proteasas presentes en un tejido, órgano o animal (v.gr., en el pulmón, en o adyacente a un tumor) puede incrementar. Este incremento en proteasas puede dar por resultado degradación acelerada e inactivación de proteínas endógenas y de péptidos, polipéptidos y proteínas terapéuticos que se administran para tratar enfermedad. Por consiguiente, algunos agentes que tienen potencial para uso in vivo (v.gr., uso en el tratamiento, diagnóstico o prevención de enfermedad en mamíferos tales como humanos) sólo tienen eficacia limitada debido a que son rápidamente degradados e inactivados por proteasas.

Los polipéptidos resistentes a proteasa proveen varias ventajas. Por ejemplo, los polipéptidos resistentes a proteasa permanecen activos in vivo más tiempo que los agentes sensibles a proteasa y, por consiguiente, permanecen funcionales durante un periodo que es suficiente para producir efectos biológicos. Existe la necesidad de métodos mejorados para seleccionar polipéptidos que sean resistentes a degradación por proteasa y que también tengan actividad biológica deseable.

El péptido similar a glucagón (GLP)-1 es una hormona incretina con acciones insulinotrópica y glucagonostática dependientes de glucosa potentes, efectos tróficos sobre las células ß pancreáticas, y efectos inhibidores sobre secreción y motilidad gastrointestinal, que se combinan con glucosa en el plasma más baja y reducen excursiones glicémicas. GLP-1 es un agonista del receptor de GLP-1. Además, mediante su capacidad para incrementar saciedad, GLP-1 reduce la ingesta de alimentos, limitando asi la ganancia en peso, e incluso puede causar pérdida de peso. Tomadas juntas, estas acciones dan a GLP-1 un perfil único, considerado altamente deseable para un agente antidiabético, particularmente debido que la dependencia de la glucosa de sus efectos antihiperglicémicos debe reducir al mínimo cualquier riesgo de hipoglicemia severa. Sin embargo, su perfil farmacocinético/ farmacodinámico es tal que GLP-1 nativo no es terapéuticamente útil. Por lo tanto, aunque GLP-1 es más efectivo cuando se administra continuamente, inyecciones subcutáneas individuales tienen efectos de corta duración. GLP-1 es altamente susceptible a degradación enzimática in vivo, y la digestión por dipeptidilo peptidasa IV (DPP-IV) es probablemente la más relevante, ya que esto ocurre rápidamente y genera un metabolito no insulinotrópico. Las estrategias para aprovechar el potencial terapéutico de GLP-1 , con base en un entendimiento de factores que influyen en su estabilidad metabólica y perfil farmacocinético/farmacodinámico, por lo tanto ha sido el foco de investigación intensa.

Se ha hecho trabajo extensivo para intentar inhibir la peptidasa o para modificar GLP-1 de tal manera que su degradación se desacelere mientras aún mantenga la actividad biológica. El documento WO05/027978 (US2007203058) describe derivados de GLP-1 que tienen un perfil de acción protractado (e incorporados aquí por referencia como ejemplos de derivados y análogos de GLP-1 que se pueden usar en la presente invención). El documento WO 02/46227 (US2004053370) describe proteínas de fusión heterólogas que comprenden un polipéptido (por ejemplo, albúmina) fusionado a GLP-1 o análogos (la descripción de estos análogos se incorpora aquí por referencia como ejemplos de análogos de GLP-1 que se pueden usar en la presente invención). Los documentos WO05/003296, WO03/060071 , WO03/059934 describen amino proteína de fusión en donde GLP-1 ha sido fusionado con albúmina para intentar incrementar la vida media de la hormona.

Sin embargo, a pesar de estos esfuerzos, no se ha producido un GLP-1 activo de larga duración.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a métodos para seleccionar péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa y métodos para seleccionar péptidos o polipéptidos que se unen a un ligando objetivo con alta afinidad. La invención además se refiere a un método de producción de un repertorio de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa.

En un aspecto, la invención es un método para seleccionar un péptido o polipéptido resistente a proteasa. El método comprende proveer un repertorio de péptidos o polipéptidos, incubar el repertorio y una proteasa bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa, y recuperar un péptido o polipéptido que tiene una actividad biológica deseada, por lo que se selecciona un péptido o polipéptido resistente a proteasa.

En una modalidad, el repertorio de péptidos o polipéptidos es expresado en un sistema de despliegue y la proteasa es una proteasa que es expresada en el sistema de despliegue u hospedero de expresión. Por ejemplo, en una modalidad, el repertorio de péptidos o polipéptidos es expresado en células bacterianas y la proteasa es una proteasa endógena a una bacteria. Adecuadamente, las condiciones para expresión de repertorio aumentan al máximo la expresión y actividad de la proteasa endógena, tal como proteasa bacteriana. La expresión y actividad de proteasa es aumentada al máximo, por ejemplo, al incrementar el tiempo y/o temperatura para expresión de proteína del repertorio en bacterias. Por ejemplo, el tiempo de incubación puede ser de 1 hora a durante la noche (v.gr., de 12 hasta 24 horas) o más (v.gr., de 24 hasta 48 horas, o más). En una modalidad, la temperatura puede ser de 30 a 37 grados C o más. Además, la expresión de proteasa puede ser incrementada usando diferentes cepas bacterianas y/o modificación de ingredientes del medio. La densidad del cultivo de bacterias también se puede variar. En otra modalidad, el sistema de despliegue puede ser modificado v.gr., por modificación genética para incrementar la expresión de proteasa.

En una modalidad, el repertorio se provee como un sistema de despliegue de bacteriófagos en donde el repertorio de bacteriófago es expresado y/o amplificado en células bacterianas de E. Coli, tal como células TBI de E. Coli, células TCI o células de la cepa HB2151 de E. Coli. Por consiguiente, en esta modalidad, la proteasa bacteriana es una proteasa expresada endógenamente en células de E. coli. En una modalidad, la proteasa bacteriana puede ser una proteasa que es expresada en el periplasma bacteriano. En una modalidad, la expresión de proteasa puede ser durante producción de fagos, secreción o en el sobrenadante bacteriano.

Por lo tanto, en una modalidad de la invención, se provee un método que comprende los pasos de tomar una genoteca de bacteriófago; expresar dicha genoteca en bacterias bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa bacteriana; incubar dicha genoteca expresada con un ligando objetivo por lo que se selecciona un péptido de unión a objetivo resistente a proteasa. Opcionalmente, dicha incubación con un ligando objetivo incluye la presencia de una proteasa adicional.

En otra modalidad, el sistema de despliegue es un sistema de despliegue de levadura tal como Pichia y la proteasa es una proteasa endógena que es expresada en células de levadura.

En una modalidad, el método de conformidad con la invención además comprende combinar el repertorio y una proteasa adicional bajo condiciones adecuadas para dicha actividad de proteasa adicional, y recuperar un péptido o polipéptido que tiene una actividad biológica deseada, por lo que se selecciona un péptido o polipéptido resistente a proteasa. En una modalidad, la proteasa se combina con el repertorio en solución (es decir, la proteasa no es inmovilizada sobre un soporte). Adecuadamente la proteasa adicional se encuentra en uno o más de suero, esputo, moco (v.gr., moco gástrico, moco nasal, moco bronquial), lavado broncoalveolar, homogenado de pulmón, extracto de pulmón, extracto pancreático, fluido gástrico, saliva o lágrimas.

En otro aspecto, se provee un método para seleccionar un péptido o polipéptido resistente a proteasa. El método comprende proveer un repertorio de péptidos o polipéptidos, incubar el repertorio y una primera proteasa bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa y que comprende además combinar el repertorio con una segunda proteasa bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa y recuperar un péptido o polipéptido que tiene una actividad biológica deseada, por lo que se selecciona un péptido o polipéptido resistente a proteasa. En una modalidad de este aspecto, la primera proteasa es una proteasa endógena al sistema de despliegue del repertorio y la segunda proteasa se selecciona de una proteasa encontrada en suero, esputo, moco (v.gr., moco gástrico, moco nasal, moco bronquial), lavado broncoalveolar, homogenado de pulmón, extracto de pulmón, extracto pancreático, fluido gástrico, saliva o lágrimas. Se apreciará, sin embargo, que el "primer" y "segundo" pasos de proteasa se pueden llevar a cabo en cualquier orden. Además, se apreciará que múltiples repeticiones de cualesquiera de esos pasos pueden ser abarcadas dentro del método de la invención.

En una modalidad de cualquier aspecto de la invención, dichas condiciones para la adicional o segunda actividad de proteasa son (i) aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 3 mg/ml de proteasa, (ii) aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C y (iii) por lo menos durante aproximadamente 30 minutos. En una modalidad, estas condiciones astringentes permiten la selección de péptidos o polipéptidos con alta afinidad y/o Tm mejorada. En tal caso, los péptidos y polipéptidos pueden desplegar alta afinidad en forma monomérica.

En una modalidad, en los métodos de la invención de conformidad con cualquier aspecto, para dichas condiciones adecuadas para actividad de proteasa se usa de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 pg/ml proteasa. Para dichas condiciones adecuadas para actividad de proteasa a temperatura de aproximadamente 30 a aproximadamente 37°C (v.gr., a aproximadamente 37°C o aproximadamente temperatura ambiente) se puede usar. En una modalidad, el repertorio y proteasa se pueden combinar por lo menos durante aproximadamente una hora (v.gr., aproximadamente 1 hora, aproximadamente dos horas, durante la noche v.gr. 18 a 24 horas). En los métodos de la invención, el repertorio y la proteasa están en una modalidad incubada durante un período de por lo menos aproximadamente 30 minutos. En una modalidad, la proteasa se usa a aproximadamente 100 pg/ml, y el repertorio y proteasa combinados se incuban a aproximadamente 37°C por lo menos durante aproximadamente hora.

En una modalidad de cualquier aspecto de la invención, la relación (sobre una base de mol/mol) de proteasa, v.gr., tripsina, un polipéptido o dominio variable es 8,000 a 80,000 proteasa:dominio variable. En una modalidad, la relación (sobre una base de peso/peso, v.gr. microgramo/microgramo) de proteasa (v.gr., tripsina) a polipéptido o dominio variable es 16,000 a 160,000 proteasa:dominio variable. En una modalidad, la proteasa se usa a una concentración de por lo menos 100 ó 1000 microgramos/ml de proteasa.

Cualquier proteasa deseada se puede usar en un método de conformidad con cualquier aspecto de la invención, tal como uno o más de los siguientes, serina proteasa, cisteína proteasa, aspartato proteasas, tiol proteasas, metaloproteasa de matriz, carboxipeptidasa (v.gr., carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa B), tripsina, quimiotripsina, pepsina, papaína, elastasa, leucozima, pancreatina, trombina, plasmina, catepsinas (v.gr., catepsina G), proteinasa (v.gr., proteinasa 1 , proteinasa 2, proteinasa 3), termolisina, quimiosina, enteropeptidasa, caspasa (v.gr., caspasa 1 , caspasa 2, caspasa 4, caspasa 5, caspasa 9, caspasa 12, caspasa 13), calpaína, ficaína, clostripaína, actinidaína, bromelina, separasa y dipeptidilo peptidasa IV (DPP-IV). En modalidades particulares, la proteasa es tripsina, elastasa o leucozima. La proteasa también puede ser provista por un extracto biológico, homogenado biológico o preparación biológica, v.gr., células enteras in vitro. Si se desea, el método además comprende añadir un inhibidor de proteasa a la combinación del repertorio y la proteasa después de que se complete la incubación.

En una modalidad de cualquiera de los métodos de la invención, la proteasa(s) está en solución cuando se combina con el repertorio.

En una modalidad de cualquier aspecto de la invención, la actividad biológica deseada es actividad de unión, v.gr., a un ligando, v.gr., un ligando objetivo o un ligando genérico. En algunas modalidades, un péptido o polipéptido que tiene una actividad biológica deseada es recuperado con base en una actividad de unión. Por ejemplo, el péptido o polipéptido puede ser recuperado con base en unión a ligando genérico, tal como proteína A, proteína G o proteína L La actividad de unión también puede ser unión específica a un ligando objetivo. Ligandos objetivos ilustrativos incluyen ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1 , CEA, CD40, CD40 Ligando, CD56, CD38, CD138, EGF, receptor de EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FAPa, FGF-ácido, FGF-básico, factor de crecimiento de fibroblastos-10, ligando de FLT3, Fractalkine (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-ß? , albúmina de suero humana, insulina, IFN-?, IGF-I, IGF-II, IL- la, IL-1 ß, receptor de IL-1 , receptor de IL-1 tipo 1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL- 0, IL-1 I, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibina a, Inhibina ß, IP-10, factor de crecimiento de queratinocitos-2 (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, sustancia inhibidora Mulleriana, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteina atrayente de monocitos, M-CSF, DC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a ), MIG, ???-1 a, ???-1 ß, ???-3a, ???-3ß, MIP-4, factor inhibidor de progenitor mieloide-1 (MPIF- ), NAP-2, Neurturin, factor de crecimiento de nervio, ß-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatin M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1 a, SDF1 ß, SCF, SCGF, factor de células madre (SCF), TARC, TGF-ct, TGF-ß, TGF-&2, TGF^3, factor de necrosis tumoral (FNT), FNT-a, FNT-ß, receptor de FNT I, receptor de FNT II, TNIL-1 , TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, receptor de VEGF 1 , receptor de VEGF 2, receptor de VEGF 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-ß, GRO-Y, HCCI, 1-309, HER 1 , HER 2, HER 3, HER 4, albúmina de suero, vWF, proteínas amiloides (v.gr., amiloide alfa), MMP12, PDK1 , IgE, IL-13Ra1 , IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD1 1 a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1 , TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1 ), quimasa, FGF, Furin, Endotelina-1 , Eotaxinas (v.gr., Eotaxina, Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1 , ICOS, IgE, IFNa, 1 -309, integrinas, L-selectina, MIF, MIP4, MDC, MCP-1 , MPs, elastasa de neutrofilos, osteopontin, OX-40, PARC, PD-1 , RANTES, SCF, SDF-1 , siglec8, TARC, TGFb, Trombinl , Tim-1 , FNT, TRANCE, Triptasa, VEGF, VLA-4, VCAM, a4ß7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfabeta6, alfabeta8, cMET, CD8, vWF, proteínas amiloides (v.gr., amiloide alfa), MMP12, PDK1 , y IgE. En otra modalidad, el ligando objetivo es receptor de GLP-1 , o porciones del mismo. Por ejemplo, en el método de conformidad con cualquier aspecto de la invención, el ligando puede ser dominio extracelular de receptor de GLP-1.

En modalidades particulares de cualquier aspecto de la invención, el péptido o polipéptido es recuperado por reconocimiento y selección.

En una modalidad de cualquiera de los métodos de la invención, el repertorio es expuesto a un ligando (ligando objetivo; ligando genérico) cuando está en presencia de la proteasa y uno o más miembros del repertorio se seleccionan con base en la unión al ligando.

En algunas modalidades de cualesquiera métodos de la invención, el repertorio comprende un sistema de despliegue. Por ejemplo, el sistema de despliegue puede ser despliegue de bacteriófagos, despliegue de ribosoma, compartimentalización y despliegue de emulsión, despliegue de levadura, despliegue de puromicina, despliegue de bacterias, despliegue sobre plásmido, o despliegue covalente. Los sistemas de despliegue preferidos enlazan la función codificante de un ácido nucleico y características funcionales del péptido o polipéptido codificado por el ácido nucleico. En modalidades particulares, el sistema de despliegue comprende paquetes genéticos replicables.

En algunas modalidades de cualesquiera métodos de la invención, el sistema de despliegue comprende despliegue de bacteriófagos. Por ejemplo, el bacteriófago puede ser fd, M13, lambda, MS2 o T7. En modalidades particulares, el sistema de despliegue de bacteriófagos es multivalente. En algunas modalidades, el péptido o polipéptido es desplegado como una proteina de fusión de plll.

En una modalidad de cualesquiera métodos de la invención, el repertorio de péptidos o polipéptidos (v.gr., dominio variables) es desplegado sobre bacteriófago, por ejemplo a un tamaño de genoteca de fago de 106 a 1013, v.gr., 108 a 1012 unidades replicativas (viriones infectivos). En una modalidad, el repertorio es desplegado sobre bacteriófagos cuando se incuba con la segunda o adicional proteasa.

En otras modalidades de cualquier aspecto de la invención, el método además comprende amplificar el ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido que tiene una actividad biológica deseada. En modalidades particulares, el ácido nucleico es amplificado por amplificación de fagos, crecimiento celular o reacción en cadena de polimerasa.

En una modalidad de cualquier aspecto de la invención, el repertorio de péptidos o polipéptidos es desplegado sobre bacteriófagos que son amplificados y expresados en células bacterianas tales como E. Coli. En esta modalidad, el repertorio de péptidos o polipéptidos son expuestos a proteasa bacteriana cuando son expresados en células bacterianas.

En algunas modalidades, el repertorio es un repertorio de dominio variable sencillo de inmunoglobulinas. En modalidades particulares, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un dominio variable de cadena pesada. En modalidades muy particulares, el dominio variable de cadena pesada es un dominio variable de cadena pesada humana. En otras modalidades, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un dominio variable de cadena ligera. En modalidades particulares, el dominio variable de cadena ligera es un dominio variable de cadena ligera humano.

En otro aspecto, la invención es un método para seleccionar un péptido o polipéptido que se une a un ligando objetivo con alta afinidad desde un repertorio de péptidos o polipéptidos. El método comprende proveer un repertorio de péptidos o polipéptidos, combinar el repertorio y una proteasa bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa, y recuperar un péptido o polipéptido que se une al ligando objetivo.

En cuanto a los métodos anteriores de la invención, en donde la actividad biológica deseada es actividad de unión, el ligando que se une (ligando objetivo; ligando genérico) no es el mismo que la proteasa(s).

En otro aspecto, la invención es un método de producción de un repertorio de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa. El método comprende proveer un repertorio de péptidos o polipéptidos, combinar el repertorio de péptidos o polipéptidos y una proteasa bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa, y recuperar una pluralidad de péptidos o polipéptidos que tienen una actividad biológica deseada, por lo que se produce un repertorio de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa.

En algunas modalidades, una pluralidad de péptidos o polipéptidos que tienen una actividad biológica deseada es recuperada con base en una actividad de unión. Por ejemplo, una pluralidad de péptidos o polipéptidos puede ser recuperada con base en unión a ligando genérico, tal como proteina A, proteína G o proteína L.

En otro aspecto, la invención es un método para seleccionar un polipéptido resistente a proteasa que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina (dAb) que se une a un ligando objetivo desde un repertono. En una modalidad, el método comprende proveer un sistema de despliegue de fagos que comprende un repertorio de polipéptidos que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, que combina el sistema de despliegue de fagos y una proteasa seleccionados del grupo que consiste de elastasa, leucozima y tripsina, bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa, y recuperar un fago que despliega un polipéptido que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une al ligando objetivo. Adecuadamente, en una modalidad de este aspecto, el método además comprende incubación bajo condiciones para expresión de una proteasa endógena. Por ejemplo, una proteasa endógena es una proteasa que es expresada por el sistema de despliegue.

En algunas modalidades, la proteasa se usa a 100 pg/ml, y el sistema de despliegue de fagos y proteasa combinado es incubado a aproximadamente 37°C durante la noche.

En algunas modalidades, el fago que despliega un polipéptido que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une al ligando objetivo es recuperado al unirse a dicho objetivo. En otras modalidades, el fago que despliega un polipéptido que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une al ligando objetivo es recuperado por reconocimiento y selección.

La invención también se refiere un péptido o polipéptido resistente a proteasa aislado seleccionare o seleccionado por los métodos descritos aquí. En una modalidad particular, la invención se refiere a agonistas de receptor de GLP-1 tales como péptidos de GLP-1 como se describe aquí. Los péptidos de GLP-1 y derivados de péptidos de GLP-1 adecuados se exponen en los ejemplos y en la figura 1. Otros péptidos adecuados incluyen homólogos o derivados de GLP-1 tales como exendina y sus homólogos y derivados. Derivados adecuados adicionales incluyen derivados de GLP-1 resistentes a dipeptidilo peptidasa IV. Un péptido preferido es identificado por secuencia de aminoácidos DMS7148 (secuencia 6 en la figura 1). Otro péptido preferido es identificado por la secuencia de aminoácidos DMS7161 (secuencia 11 en la figura 1). Adecuadamente, estos péptidos de GLP-1 son fusionados a una secuencia de AlbudAb™. En otra modalidad, la invención se refiere a una proteasa aislada (v.gr., tripsina, elastasa, leucozima) dominio variable sencillo de inmunoglobulina resistente (v.gr., dominio variable de cadena pesada de anticuerpo humano, dominio variable de cadena ligera de anticuerpo humano) seleccionable o seleccionado por los métodos descritos aquí.

Ventajosamente, péptidos o polipéptidos de conformidad con la invención pueden desplegar propiedades mejoradas en términos de expresión en hospederos a bajo costo sin proteólisis durante la expresión, haciéndolos así más adecuados para producción a escala industrial.

La invención también se refiere a un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un péptido o polipéptido resistente a proteasa (v.gr., dominio variable sencillo de inmunoglobulina resistente a tripsina, elastasa o leucozima) seleccionable o seleccionado por los métodos descritos aquí, y a vectores (v.gr., vectores de expresión) y células hospederas que comprenden los ácido nucleicos.

La invención también se refiere a un método para hacer un péptido o polipéptido resistente a proteasa (v.gr., dominio variable sencillo de inmunoglobulina resistente a tripsina, elastasa o leucozima) seleccionable o seleccionado por los métodos descritos aquí, que comprende mantener una célula hospedera que contiene un ácido nucleico recombinante que codifica el péptido o polipéptido resistente a proteasa bajo condiciones adecuadas para expresión, por lo que se produce un péptido o polipéptido resistente a proteasa.

Por lo tanto, en el contexto de cualquier aspecto de la presente invención, la proteasa puede ser una proteasa endógena a un sistema de despliegue tal como una proteasa bacteriana o se encuentra en uno o más de suero, esputo, moco (v.gr., moco gástrico, moco nasal, moco bronquial), lavado broncoalveolar, homogenado de pulmón, extracto de pulmón, extracto pancreático, fluido gástrico, saliva o lágrimas. En una modalidad, la proteasa es una encontrada en los ojos y/o lágrimas. Como se describe aquí, los péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa seleccionados tienen utilidad en terapia, profilaxis y diagnóstico de enfermedad o condiciones en mamíferos, v.gr., humanos. En particular, los péptidos y polipéptidos tienen utilidad como la base de fármacos que probablemente encuentren proteasas cuando se administren a un paciente, tal como un humano.

Por ejemplo, cuando se administra al tracto Gl (v.gr., administrado por vía oral, sublingual, rectal), en cuyo caso el péptido o polipéptido puede ser sometido a proteasa en uno o más del tracto Gl superior, tracto Gl inferior, boca, estómago, intestino delgado e intestino grueso. Una modalidad, por lo tanto, provee un péptido o polipéptido resistente a proteasa que ha de ser administrado por vía oral, sublingual, rectal al tracto Gl de un paciente para tratar y/o prevenir una enfermedad o condición en el paciente.

Por ejemplo, en una modalidad la invención se refiere a administración oral de un péptido o polipéptido antagonista de FNT alfa seleccionado o seleccionable por el método de la invención, para el tratamiento y/o prevención de una condición o enfermedad mediada por FNT alfa tal como artritis (v.gr., artritis reumatoide), IBD, psoriasis o enfermedad de Cro n. En esta modalidad, el antagonista puede ser un dominio variable sencillo de inmunoglobulina (dAb) anti-TNFR1. En otro ejemplo, el péptido o polipéptido es probable que encuentre proteasa cuando se administre (v.gr., por inhalación o por vía intranasal) a tejido pulmonar (v.gr., el pulmón o vías aéreas). Una modalidad, por lo tanto, provee que un péptido o polipéptido resistente a proteasa sea administrado por inhalación o por vía intranasal a tejido pulmonar de un paciente para tratar y/o prevenir una enfermedad o condición en el paciente. Dicha condición puede ser asma (v.gr., asma alérgica), EPOC, influenza o cualquier otra enfermedad o condición pulmonar descrita en el documento WO2006038027 (US2006002935), incorporado aquí por referencia.

En otro ejemplo, el péptido o polipéptido es probable que encuentre proteasas en el suero cuando se administre por vía parenteral, por ejemplo a través de inyección, v.gr., por vía subcutánea. Una modalidad, por lo tanto, provee que un péptido o polipéptido resistente a proteasa sea administrado por inyección y trate y/o prevenga una enfermedad o condición en el paciente. Dicha condición puede ser diabetes. En una modalidad, la invención provee la administración parenteral de un agonista de receptor de péptido similar a glucagón 1 tal como GLP- o sus homólogos y derivados, tal como exendina o derivados de la misma, seleccionados o seleccionables por el método de la invención para el tratamiento y/o prevención de diabetes o trastornos relacionados con diabetes.

Los péptídos y polipéptidos de conformidad con la invención puede desplegar temperaturas de fusión (Tf) mejoradas o relativamente altas, que proveen estabilidad incrementada. La unión objetivo de alta afinidad también puede ser una característica de los péptidos y polipéptidos. Estas características, combinadas con resistencia a la proteasa, hacen a los péptidos y polipéptidos sujetos a usarse como fármacos en mamíferos, tales como humanos, en donde es probable que las proteasas se encuentren, v.gr., para el tracto Gl, tejido pulmonar o administración parenteral.

En otro ejemplo, es probable que el péptido o polipéptido (v.gr., dominio variable o antagonista) encuentre proteasa cuando se administre (v.gr., por inyección intraocular o como gotas para los ojos) a un ojo de un paciente. Una modalidad, por lo tanto, provee la administración ocular del péptido, polipéptido, dominio variable sencillo de inmunoglobulina, agonista o antagonista resistente a proteasa a un paciente (v.gr., a un humano) para tratar y/o prevenir una enfermedad o condición (v.gr., una enfermedad o condición de los ojos) en el paciente. La administración podría ser administración tópica a los ojos, en forma de gotas para los ojos o por inyección en los ojos, v.gr., en el humor vitreo.

En una modalidad, la invención provee una formulación pulmonar para suministrarse a los pulmones, en donde la formulación comprende un agonista, antagonista, péptido, polipéptido o dominio variable de la invención con un intervalo de tamaño de partícula de menos de 5 mieras, por ejemplo menos de 4.5, 4, 3.5 ó 3 mieras (v.gr., cuando está en regulador de pH Britton-Robinson, v.gr., a un pH de 6.5 a 8.0, v.gr., a un pH de 7 a 7.5, v.gr., a un pH de 7 o a un pH de 7.5).

En una modalidad, las formulaciones y composiciones de la invención se proveen a un pH de 6.5 a 8.0, por ejemplo 7 a 7.5, por ejemplo 7, por ejemplo 7.5.

Los péptidos o polipéptidos (v.gr., dominios variables) de conformidad con cualquier aspecto de la invención pueden tener una Tf de por lo menos 50°C, o por lo menos 55°C, o por lo menos 60°C, o por lo menos 65°C, o por lo menos 70°C. Un agonista, antagonista, uso, método, composición, dispositivo o formulación de la invención puede comprender dicho péptido o polipéptido. En un aspecto de la invención, los péptidos, polipéptidos, dominios variables, agonistas, antagonistas, composiciones o formulaciones de la invención son sustancialmente estables después de la incubación (a una concentración de polipéptido o dominio variable de 1 mg/ml) a 37 a 50°C durante 14 días en regulador de pH Britton-Robinson. En una modalidad, por lo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% del péptido, polipéptido, agonista, antagonista o dominio variable permanece en forma no agregada después de dicha incubación a 37 grados C. En una modalidad, por lo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% del péptido, polipéptido o dominio variable sigue siendo monomérico después de dicha incubación a 37 grados C. En una modalidad, por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% del péptido, polipéptido, agonista, antagonista o dominio variable permanece en forma no agregada después de dicha incubación a 50 grados C. En una modalidad, por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% del péptido, polipéptido o dominio variable sigue siendo monomérico después de dicha incubación a 50 grados C. En una modalidad, la no agregación del péptido, polipéptidos, dominios variables, agonistas, antagonistas se ve después de cualquiera de dichas incubaciones. En una modalidad, el pH del péptido, polipéptido o dominio variable permanece invariable o sustancialmente invariable después de incubación a 37 grados C a una concentración de polipéptido o dominio variable de 1 mg/ml en regulador de pH Britton-Robinson.

En un aspecto de la invención, el péptido, polipéptidos, dominio variables, agonistas, antagonistas, composiciones o formulaciones de la invención son sustancialmente estables después de la incubación (a una concentración de polipéptido o dominio variable de 100 mg/ml) a 4°C durante 7 días en regulador de pH Britton-Robinson a un pH de 7 a 7.5 (v.gr., un pH de 7 o pH de 7.5). En una modalidad, por lo menos 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 ó 99.5% del péptido, polipéptido, agonista, antagonista o dominio variable permanece en forma no agregada después de dicha incubación. En una modalidad, por lo menos 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 ó 99.5% del péptido, polipéptido o dominio variable sigue siendo monomérico después de dicha incubación. En una modalidad, la no agregación del péptido, polipéptidos, dominio variables, agonistas, antagonistas se ve después de cualquiera de dichas incubaciones. En un aspecto de la invención, el péptido, polipéptidos, dominio variables, agonistas, antagonistas, composiciones o formulaciones de la invención son sustancialmente estables después de nebulización (a una concentración de polipéptido o dominio variable de 40 mg/ml) v.gr., a temperatura ambiente, 20 grados C o 37°C, durante 1 hora, v.gr., en un nebulizador de chorro, v.gr., una copa de Pari LC+. En una modalidad, por lo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 ó 99.5% del péptido, polipéptido, agonista, antagonista o dominio variable permanece en forma no agregada después de dicha nebulización. En una modalidad, por lo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 ó 99.5% del péptido, polipéptido o dominio variable sigue siendo monomérico después de dicha nebulización. En una modalidad, no agregación del péptido, polipéptidos, dominio variables, agonistas, antagonistas se ve después de cualquiera de dicha nebulización.

El péptido o polipéptido puede ser aislado y/o recombinante.

Adecuadamente en una modalidad de cualquier aspecto de la invención, el péptido o polipéptido resistente a proteasa se selecciona de un repertorio de péptidos o polipéptidos.

La invención también se refiere a un péptido o polipéptido resistente a proteasa (v.gr., dominio variable sencillo de inmunoglobulina resistente a tripsina, elastasa o leucozima) seleccionable o seleccionado por los métodos descritos aquí para usarse en medicina (v.gr., para terapia o diagnóstico). La invención también se refiere al uso de un péptido o polipéptido resistente a proteasa (v.gr., dominio variable sencillo de inmunoglobulina resistente a tripsina, elastasa o leucozima) seleccionable o seleccionado por los métodos descritos aquí para la fabricación de un medicamento para tratar enfermedad. La invención también se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad, que comprende administrar a un sujeto que necesita el mismo, una cantidad efectiva de un péptido o polipéptido resistente a proteasa (v.gr., dominio variable sencillo de inmunoglobulina resistente a tripsina, elastasa o leucozima) seleccionable o seleccionado por los métodos descritos aquí. En una modalidad de cualquier aspecto de la invención, el método además comprende combinar una segunda proteasa son el repertorio de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa bajo condiciones adecuadas para actividad de la segunda proteasa; y recuperar por lo menos un péptido o polipéptido que tiene una actividad biológica deseada, por lo que se selecciona por lo menos un péptido o polipéptido que es resistente a la segunda proteasa. La primera y segunda proteasas son diferentes. La segunda proteasa puede ser como se definió antes. En una modalidad, la primera o segunda proteasa es endógena al repertorio sistema de despliegue.

La invención además provee un agonista de receptor de GLP-1 aislado que comprende un péptido o polipéptido, que es resistente a una o más proteasa mencionada antes, cuando se incuba con la proteasa bajo las condiciones adecuadas para un método de la invención, v.gr., una condición de (i) aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 3 mg/ml proteasa, (ii) aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C y (iii) por lo menos aproximadamente durante 30 minutos (v.gr., bajo la condición de 100 pg/ml o proteasa a 37°C por lo menos durante una hora), para administrarse a un paciente para tratar y/o prevenir diabetes. El agonista puede ser usado para administrarse por inyección.

En una modalidad de los métodos de la invención, el péptido o polipéptido seleccionado es además evaluado para resistencia a una segunda proteasa o a la primera proteasa pero bajo un conjunto de condiciones que difieren de aquellas usadas en el método de selección. La segunda proteasa es diferente de la primera proteasa, pero de otra manera puede ser cualquier proteasa descrita anteriormente. En una modalidad, más de un péptido o polipéptido resistente a proteasa es seleccionado en los métodos de la invención, seguido por un paso adicional de determinar cuál de estos péptido(s) o polipéptido(s) muestra resistencia a una segunda proteasa o a la primera proteasa pero bajo un conjunto de condiciones que difieren de aquellos usados en el método de selección. La segunda proteasa es diferente de la primera proteasa, pero de otra manera puede ser cualquier proteasa descrita anteriormente. De esta forma, se obtiene uno o más péptidos o polipéptidos que son resistentes a más de una proteasa. En una modalidad, la primera o segunda proteasa es una proteasa que es endógenamente expresada en el repertorio sistema de despliegue.

En una modalidad de los métodos de la invención, se selecciona un péptido o polipéptido monomérico resistente a proteasa (v.gr., un monómero de dominio variable sencillo de inmunoglobulina).

Los medicamentos, agonistas y antagonistas de la invención pueden comprender una región constante de anticuerpo (v.gr., un Fe) fusionada al péptido o polipéptido.

En una modalidad, la invención provee el uso de péptido o polipéptido resistente a proteasa en la fabricación de un medicamento para administrarse a un mamífero para proveer un medicamento con una PK mejorada. La PK mejorada puede ser una AUC (área bajo la curva) mejorada y/o una vida media mejorada. En una modalidad, el péptido o polipéptido resistente a proteasa es seleccionado o seleccionable por un método de la invención. En una modalidad, el péptido o polipéptido es un dominio variable sencillo de inmunoglobulina. El medicamento puede comprender una región constante de anticuerpo fusionada al péptido o polipéptido, v.gr., un Fe de anticuerpo.

La invención provee un medicamento que comprende un péptido o polipéptido resistente a proteasa para administrarse a un mamífero (v.gr., un humano) para proveer un medicamento con una PK mejorada en el mamífero. En una modalidad, el péptido o polipéptido resistente a proteasa es seleccionado o seleccionable por un método de la presente invención. En una modalidad, el péptido o polipéptido es un dominio variable sencillo de inmunoglobulina. El medicamento puede comprender una región constante de anticuerpo (v.gr., una Fe) fusionada al péptido o polipéptido.

BREVE DESCRIPCIÓN PE LAS FIGURAS La figura 1 muestra secuencias de variantes de fusión 1 -10 de GLP-1-AlbudAb.

La figura 2 muestra un gel de variantes de fusión 6-10 de GLP-1- AlbudAb.

La figura 3 muestra un gel de variantes de fusión 6-10 de GLP-1-AlbudAb (concentradas).

La figura 4 muestra un gel de variantes de fusión 11 de GLP-1-AlbudAb.

Las figuras 5A-5F muestran resultados de EM de variantes de fusión 6-1 1 de GLP-1-AlbudAb.

La figura 5A muestra DMS7148 (Variante 6); (Notas del análisis: La masa medida concuerda con la masa esperada con un disulfuro sencillo (15245.88)); la figura 5B muestra DMS7149 (Variante 7) (Notas del análisis: La masa medida concuerda con los residuos 24-142 (12860.56), 26-142 (12603.26) y 28-142 (12390.97), todos con disulfuros sencillos. Cada pico tiene un pico asociado que es +42 Da - muy probablemente acetilado); la figura 5C muestra DMS7150 (Variante 8) (Notas del análisis: La masa medida concuerda con los residuos 26-142 con un disulfuro sencillo (12603.26)); la figura 5D muestra DMS7151 (Variante 9) (Notas del análisis: Incapaz de explicar 12960. 12890.5, 12603 y 12391.50 son concordancias cercanas a los residuos 24-142, 26-142 y 28-142 respectivamente, cada uno con un disulfuro sencillo (12862.53, 12605.24 y 12392.94). Sin embargo, el valor es una discrepancia de masa de 2 Da entre las masas medida y calculada; la figura 5E muestra DMS7152 (Variante 10) (Notas del análisis: 12790.5 y 12320.5 concuerdan con los residuos 24-142 y 28-142 respectivamente con disulfuros sencillos (12790.42 y 12320.84)); la figura 5F muestra DMS7161 (Variante 1 1 ).

La figura 6 muestra los resultados de una prueba de variante de fusión 6 de GLP-1-AlbudAb.

La figura 7 muestra los resultados de una prueba de variante de fusión 1 de GLP-1 -AlbudAb.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Dentro de esta especificación, la invención se ha descrito, con referencia a modalidades, de una manera que permite que se escriba una especificación clara y concisa. Se pretende y se debe apreciar que las modalidades pueden ser variadamente combinadas o separadas sin partir de la invención.

Como se usa aquí, "péptido" se refiere a aproximadamente dos a aproximadamente 50 aminoácidos que se unen entre sí mediante enlaces peptídicos.

Como se usa aquí, "polipéptido" se refiere a por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos que se unen entre sí medíante enlaces peptídicos. Los polipéptidos generalmente comprende estructura terciaria y se doblan en dominios funcionales.

Como se usa aquí, un péptido o polipéptido (v.gr., un anticuerpo de dominio (dAb)) que es "resistente a degradación por proteasa" no es sustancialmente degradado por una proteasa cuando se incuba con la proteasa bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa. Un polipéptido (v.gr., un dAb) no es sustancialmente degradado cuando no más de aproximadamente 25%, no más de aproximadamente 20%, no más de aproximadamente 15%, no más de aproximadamente 14%, no más de aproximadamente 13%, no más de aproximadamente 12%, no más de aproximadamente 1 1 %, no más de aproximadamente 10%, no más de aproximadamente 9%, no más de aproximadamente 8%, no más de aproximadamente 7%, no más de aproximadamente 6%, no más de aproximadamente 5%, no más de aproximadamente 4%, no más de aproximadamente 3%, no más de aproximadamente 2%, no más de aproximadamente 1%, o sustancialmente ninguna de la proteína es degradada por proteasa al incubarse con la proteasa durante aproximadamente una hora a una temperatura adecuada para actividad de proteasa. Por ejemplo a 37 ó 50 grados C. La degradación de proteína puede ser evaluada usando cualquier método adecuado, por ejemplo, por SDS-PAGE o por prueba funcional (v.gr., unión a ligando) como se describe aquí.

Como se usa aquí, "sistema de despliegue" se refiere a un sistema en el cual una colección de polipéptidos o péptidos son accesibles para selección basada en una característica deseada, tal como una característica física, química o funcional. El sistema de despliegue puede ser un repertorio de polipéptidos o péptidos adecuados (v.gr., en una solución, inmovilizada en un soporte adecuado). El sistema de despliegue también puede ser un sistema bioquímico que utiliza un sistema de expresión celular (v.gr., expresión de una genoteca de ácidos nucleicos en, v.gr., células transformadas, infectadas, transfectadas o transducidas y despliegue de los polipéptidos codificados sobre la superficie de las células) o un sistema de expresión acelular (v.gr., compartimentalización y despliegue de emulsión). Los sistemas de despliegue preferidos enlazan la función codificante de un ácido nucleico y características físicas, químicas y/o funcionales de un polipéptido o péptido codificado por el ácido nucleico. Cuando se utiliza dicho sistema de despliegue, los polipéptidos o péptidos que tienen una característica física, química y/o funcional deseada se pueden seleccionar y un ácido nucleico que codifica el polipéptido o péptido seleccionado puede ser fácilmente aislado o recuperado. Un número de sistemas de despliegue que enlazan la función codificante de un ácido nucleico y características físicas, químicas y/o funcionales de un polipéptido o péptido son conocidos en la técnica, por ejemplo, despliegue de bacteriófagos (despliegue de fagos), despliegue de ribosomas, compartimentalización y despliegue de emulsión, despliegue de levaduras, despliegue de puromicina, despliegue de bacterias, despliegue sobre plásmido, despliegue covalente y similares (véase, v.gr., EP 0436597 (Dyax), patente de E.U.A. No. 6,172, 197 (McCafferty et al), patente de E.U.A. No. 6,489,103 (Griffiths et al)).

Como se usa aquí, "repertorio" se refiere a una colección de polipéptidos o péptidos que son caracterizados por una diversidad de secuencia de aminoácidos. Los miembros individuales de un repertorio pueden tener características comunes, tales como características estructurales comunes (v.gr., una estructura de núcleo común) y/o características funcionales comunes (v.gr., capacidad para unirse a un ligando común (v.gr., un ligando genérico o un ligando objetivo)).

Como se usa aquí, "funcional" describe un polipéptido o péptido que tiene actividad biológica, tal como actividad de unión específica. Por ejemplo, el término "polipéptido funcional" incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un antígeno objetivo a través de su sitio de unión a antígeno, y una enzima que se une a su sustrato(s).

Como se usa aquí, "ligando genérico" se refiere a un ligando que se une a una porción sustancial (v.gr., sustancialmente todos) de los miembros funcionales de un repertorio dado. Un ligando genérico (v.gr., un ligando genérico común) puede unirse a muchos miembros de un repertorio dado aun cuando los miembros pueden no tener especificidad de unión para un ligando objetivo común. En general, la presencia de un sitio de unión a ligando genérico funcional en un polipéptido (como se indica por la capacidad para unirse a un ligando genérico) indica que el polipéptido es correctamente doblado y funcional. Ejemplos adecuados de ligandos genéricos incluyen superantígenos, anticuerpos que se unen a un epítope expresado en una porción sustancial de miembros funcionales de un repertorio, y similares.

"Superantígeno" es un término de la técnica que se refiere a ligandos genéricos que interactúan con miembros de la superfamilia de inmunoglobulina a un sitio que es distinto de los sitios de unión a ligando objetivo de estas proteínas. Las enterotoxinas estafilocócicas son ejemplos de superantígenos que interactúan con receptores de células T. Los superantígenos que se unen a anticuerpos incluyen Proteína G, que se une a la región constante de IgG (Bjorck y Kronvall, J. Immunol, 133:969 (1984)); Proteína A que se une a la región constante de IgG y dominios VH (Forsgren y Sjoquist, J. Immunol., 97:822 (1966)); y Proteína L que se une a dominios VL (Bjorck, J. Immunol, 140: 1194 (1988)).

Como se usa aquí, "ligando objetivo" se refiere a un ligando que es específicamente o selectivamente unido por un polipéptido o péptido. Por ejemplo, cuando un polipéptido es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, el ligando objetivo puede ser cualquier antígeno o epítope deseado, y cuando un polipéptido es una enzima, el ligando objetivo puede ser cualquier sustrato deseado. La unión al antígeno objetivo es dependiente del polipéptido o péptido que es funcional.

Como se usa aquí, "formato de anticuerpo" se refiere a cualquier estructura de polipéptido adecuada en la cual un anticuerpo dominio variable puede ser incorporado para conferir especificidad de unión para antígeno sobre la estructura. Una variedad de formatos de anticuerpo deseados son conocidos en la técnica, tales como, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpo, cadenas ligeras de, anticuerpo, homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas y/o cadenas ligeras de anticuerpo, fragmentos de unión a antigeno de cualquiera de los anteriores (v.gr., un fragmento Fv (v.gr., Fv de cadena sencilla (scFv), un Fv unido a disulfuro), un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2), un dominio variable de anticuerpo sencillo (v.gr., a dAb, VH, VHH, VL), y versiones modificadas de cualquiera de los anteriores (v.gr., modificado por la unión covalente de polietilenglicol u otro polímero adecuado).

La frase "dominio variable sencillo de inmunoglobulina" se refiere a un dominio variable de anticuerpo (VH, VHH, Vl) que se une específicamente a un antígeno o epítope independientemente de otras regiones V o dominios. Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina puede estar presente en un formato (v.gr., homo- o hetero-multímero) con otras regiones variables o dominios variables en donde las otras regiones o dominios no son requeridos para unión a antígeno por el dominio variable sencillo de inmunoglobulina (es decir, en donde el dominio variable sencillo de inmunoglobulina se une a antígeno independientemente de los dominios variables adicionales). Un "anticuerpo de dominio" o "dAb" es el mismo que un "dominio variable sencillo de inmunoglobulina" como se usa el término aquí. Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina es preferiblemente un dominio variable de anticuerpo humano, pero también incluye dominios variables sencillos de anticuerpo de otras especies tales como roedores (por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/29004 (US2002012909), cuyo contenido se incorpora aquí por referencia), VHH dAbs de tiburón nodriza y camélidos. Los VHH de camélidos son polipéptidos de dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se derivan de especies que incluyen camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, que producen anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadenas ligeras.

Un "dominio" es una estructura de proteína doblada que tiene estructura terciaria independiente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de propiedades funcionales discretas de proteínas, y en muchos casos pueden ser añadidos, removidos o transferidos a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio. Un "dominio variable sencillo de anticuerpo" es un dominio de polipéptido doblado que comprende secuencias características de dominios variables de anticuerpo. Por lo tanto, incluye dominios variables de anticuerpo completos y dominios variables modificados, por ejemplo, en los cuales uno o más bucles han sido reemplazados por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpo, o dominios variables de anticuerpo que han sido truncados o comprenden extensiones N- o C-terminal, así como fragmentos doblados de dominios variables que retienen por lo menos la actividad y especificidad de unión del dominio de longitud completa.

El término "genoteca" se refiere a una mezcla de polipéptidos o ácidos nucleicos heterogéneos. La genoteca está compuesta de miembros, cada uno de los cuales tiene una secuencia sencilla de polipéptido o ácido nucleico. A esta extensión, "genoteca" es sinónimo de "repertorio." Las diferencias de secuencia entre los miembros de la genoteca son responsables de la diversidad presente en la genoteca. La genoteca puede adoptar la forma de una mezcla simple de polipéptidos o ácido nucleicos, o puede estar en forma de organismos o células, por ejemplo, bacterias, virus, células animales o vegetales y similares, transformadas con una genoteca de ácido nucleicos. Preferiblemente, cada organismo o célula individual contiene sólo uno o un número limitado de miembros de genoteca. Ventajosamente, los ácidos nucleicos son incorporados en vectores de expresión, a fin de permitir la expresión de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. En un aspecto preferido, por lo tanto, una genoteca puede adoptar la forma de una población de organismos hospederos, cada organismo conteniendo una o más copias de un vector de expresión que contiene un solo miembro de la genoteca en forma de ácido nucleico que puede ser expresado para producir su miembro de polipéptido correspondiente. Por lo tanto, la población de organismos hospederos tiene el potencial para codificar un gran repertorio de diversos polipéptidos. Un "marco de trabajo universal" es una secuencia de marco de trabajo sencillo de anticuerpo correspondiente a las regiones de un anticuerpo conservado en secuencia como se define por Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, 1991) o correspondiente al repertorio o estructura de inmunoglobulina de línea germinal humana como lo definen Chothia y Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917. La invención provee el uso de un de trabajo sencillo, o un conjunto de esos marcos de trabajo, que se ha encontrado que permiten la derivación de virtualmente cualquier especificidad de unión a través de variación en las regiones hipervariables solas.

Las alineaciones de secuencias de aminoácidos y nucleótidos y homología, similitud o identidad, como se define aquí se preparan y se determinan preferiblemente usando el algoritmo BLAST 2 Sequences, usando parámetros por omisión (Tatusova, T. A. et al, FEMS Microbiol Lett, 774: 187-188 (1999)).

La invención se refiere a un método de selección de péptidos y polipéptidos resistentes a proteasa que tienen una actividad biológica deseada. Por lo menos dos presiones selectivas se usan en el método para producir un proceso eficiente para seleccionar polipéptidos que son altamente estables y resistentes a degradación por proteasa, y que tienen actividad biológica deseada. Como se describe aquí, péptidos y polipéptidos resistentes a proteasa generalmente retienen actividad biológica. Por el contrario, los péptidos y polipéptidos sensibles a proteasa son cortados o digeridos por proteasa en los métodos descritos aquí, y por lo tanto, pierden su actividad biológica. Por consiguiente, los péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa son generalmente seleccionados con base en su actividad biológica, tal como actividad de unión.

Los métodos descritos aquí proveen varias ventajas. Por ejemplo, como se describe y ejemplifica aquí, los péptidos o polipéptidos que se seleccionan para resistencia a degradación proteolitica por una proteasa (v.gr., tripsina), también son resistentes a degradación por otras proteasas (v.gr., elastasa, leucozima). Además, la resistencia a proteasa se correlaciona con una temperatura de fusión más alta (Tf) del péptido o polipéptido. Las temperaturas de fusión más altas son indicativas de péptidos y polipéptidos más estables. La resistencia a la degradación por proteasa también se correlaciona con unión de alta afinidad a ligandos objetivos. Por lo tanto, los métodos descritos aquí proveen una forma eficiente de seleccionar, aislar y/o recuperar polipéptidos que tienen una actividad biológica deseada y que están bien adaptados para uso terapéutico y/o de diagnóstico in vivo porque son resistentes y estables a proteasa.

Métodos de selección En un aspecto, la invención es un método para seleccionar, aislar y/o recuperar un péptido o polipéptido de una genoteca o un repertorio de péptidos y polipéptidos (v.gr., un sistema de despliegue) que es resistente a degradación por una proteasa (v.gr., uno o más proteasas). Preferiblemente, el método es un método para seleccionar, aislar y/o recuperar un polipéptido de una genoteca o un repertorio de péptidos y polipéptidos (v.gr., un sistema de despliegue) que es resistente a degradación por una proteasa (v.gr., uno o más proteasas). Generalmente, el método comprende proveer una genoteca o repertorio de péptidos o polipéptidos, incubar la genoteca o repertorio en presencia de una proteasa (v.gr. a proteasa bacteriana o una proteasa exógenamente añadida tal como tripsina, elastasa, leucozima, pancreatina, esputo) bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa, y seleccionar, aislar y/o recuperar un péptido o polipéptido que es resistente a degradación por la proteasa y tiene una actividad biológica deseada. Los péptidos o polipéptidos que son degradados por una proteasa generalmente tienen actividad biológica reducida o pierden su actividad biológica debido a la actividad de proteasa. Por consiguiente, los péptidos o polipéptidos que son resistentes a degradación por proteasa pueden ser seleccionados, aislados y/o recuperados usando el método con base en su actividad biológica, tal como actividad de unión (v.gr., unión a un ligando general, unión a un ligando específico, unión a un sustrato), actividad catalítica u otra actividad biológica.

Como se describe y se ejemplifica aquí, dAbs resistente a proteasa generalmente se une a su ligando objetivo con alta afinidad. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención es un método para seleccionar, aislar y/o recuperar un péptido o polipéptido que se une a un ligando, preferiblemente un ligando objetivo, con alta afinidad. Preferiblemente, el método es un método para seleccionar, aislar y/o recuperar un polipéptido que se une a un ligando, preferiblemente un ligando objetivo, con alta afinidad. Generalmente, el método comprende proveer una genoteca o repertorio de péptidos o polipéptidos, combinar la genoteca o repertorio con una proteasa (v.gr., tripsina, elastasa, leucozima, pancreatina, esputo) bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa, y seleccionar, aislar y/o recuperar un péptido o polipéptido que se une a un ligando (v.gr., ligando objetivo). Como se describe aquí, el método también puede comprender incubar la genoteca o repertorio de péptidos o polipéptidos bajo condiciones adecuadas para actividad de una proteasa que es endógena al sistema de despliegue tal como una proteasa bacteriana (en donde el sistema de despliegue incluye expresión en bacterias). Debido a que la genoteca o repertorio ha sido expuesto a proteasa bajo condiciones en donde los péptidos o polipéptidos sensibles a proteasa serán digeridos, la actividad de proteasa puede eliminar los polipéptidos menos estables que tienen afinidad de unión baja, y por lo tanto producen una colección de péptidos o polipéptidos de unión de alta afinidad. Por ejemplo, el péptido o polipéptido seleccionado se puede unir a su ligando objetivo con una afinidad (KD; KD = KaSoc¡ac¡ón(kd)/Kd¡soc¡ac¡ón(ka) como se determina por resonancia de plasmón de superficie) de 1 µ? o más fuerte, preferiblemente de aproximadamente 500 nM a aproximadamente 0.5 pM. Por ejemplo, el péptido o polipéptido de alta afinidad se puede unir a ligando objetivo con una afinidad de aproximadamente 500 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 1 pM o aproximadamente 0.5 pM. Se cree que los péptidos y polipéptidos que son resistentes a proteasas tienen una entropía más baja y/o a energía de estabilización más alta. Por lo tanto, la correlación entre resistencia a proteasa y unión de alta afinidad puede estar relacionada con el grado de compactación y estabilidad de las superficies de los péptidos y polipéptidos seleccionados por el método de la invención.

La genoteca o repertorio de péptidos o polipéptidos se combina con una proteasa (v.gr., uno o más proteasas) bajo condiciones adecuadas para actividad proteolítica de la proteasa. Las condiciones que son adecuadas para actividad proteolítica de proteasa, y preparaciones biológicas o mezclas que contienen actividad proteolítica, son bien conocidas en la técnica o pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica. Si se desea, las condiciones adecuadas pueden ser identificadas u optimizadas, por ejemplo, evaluando la actividad de proteasa bajo una gama de condiciones de pH, concentraciones de proteasa, temperaturas y/o variando la cantidad de tiempo que la genoteca o repertorio y la proteasa se dejan reaccionar. Por ejemplo, en algunas modalidades, la relación (sobre una base de mol/mol) de proteasa, v.gr., tripsina, a péptido o polipéptido (v.gr., dominio variable) es 800 a 80,000 (v.gr., 8,000 a 80,000) proteasa:péptido o polipéptido, v.gr., cuando se usa 10 microgramos/ml de proteasa, la relación es 800 a 80,000 proteasa:péptido o polipéptido; o cuando se usa 100 microgramos/ml de proteasa, la relación es 8,000 a 80,000 proteasa:péptido o polipéptido. En una modalidad, la relación (sobre una relación peso/peso, v.gr., microgramo/microgramo) de proteasa (v.gr., tripsina) a péptido o polipéptido (v.gr., dominio variable) es 1 ,600 a 160,000 (v.gr., 16,000 a 160,000) proteasa:péptido o polipéptido v.gr., cuando se usa 10 microgramos/ml de proteasa, la relación es 1 ,600 a 160,000 proteasa:péptido o polipéptido; o cuando se usa 100 microgramos/ml de proteasa, la relación es 16,000 a 160,000 proteasa: péptido o polipéptido. En una modalidad, la proteasa se usa a una concentración de por lo menos 00 ó 1000 microgramos/ml y la relación proteasa:péptido (sobre una base de mol/mol) de proteasa, v.gr., tripsina, a péptido o polipéptido (v.gr., dominio variable) es 8,000 a 80,000 proteasa: péptido o polipéptido. En una modalidad, la proteasa se usa a una concentración de por lo menos 10 microgramos/ml y la relación proteasa:péptido (sobre una base de mol/mol) de proteasa, v.gr. tripsina, a péptido o polipéptido (v.gr., dominio variable) es 800 a 80,000 proteasa: péptido o polipéptido. En una modalidad la relación (sobre una relación peso/peso, v.gr., microgramo/microgramo) de proteasa (v.gr., tripsina) a péptido o polipéptido (v.gr., dominio variable) es 1600 a 160,000 proteasa:péptido o polipéptido v.gr., cuando C es 10 microgramos/ml; o cuando C o C es 100 microgramos/ml, la relación es 16,000 a 160,000 proteasa: péptido o polipéptido. En una modalidad, la concentración (c o c') es por lo menos 100 o 1000 microgramos/ml de proteasa. Para probar un péptido o polipéptido individual o aislado (v.gr., un dominio variable de inmunoglobulina), v.gr., uno que ya ha sido aislado desde un repertorio o genoteca, una proteasa puede ser añadida a una solución de péptido o polipéptido en un regulador de pH adecuado (v.gr., PBS) para producir una solución de péptido o polipéptido/proteasa, tal como una solución de por lo menos aproximadamente 0.01 % (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 5% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, aproximadamente 0.05% a aproximadamente 5% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 5% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, aproximadamente 0.5% a aproximadamente 5% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, aproximadamente 1 % a aproximadamente 5% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.01 % (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.02% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.03% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.04% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.05% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.06% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.07% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.08% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.09% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.1 % (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.2% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.3% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.4% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.5% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.6% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.7% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.8% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 0.9% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 1 % (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 2% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 3% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, por lo menos aproximadamente 4% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido, o aproximadamente 5% (p/p) proteasa/péptido o polipéptido. La mezcla puede ser incubada a una temperatura adecuada para actividad de proteasa (v.gr., temperatura ambiente, aproximadamente 37°C) y las muestras pueden tomarse a intervalos de tiempo (v.gr., a 1 hora, 2 horas, 3 horas, etc.). Las muestras pueden ser analizadas para degradación de proteína usando cualquier método adecuado, tal como análisis de SDS-PAGE o unión a ligando, y los resultados pueden ser usados para establecer un curso de tiempo de degradación. Cualquier proteasa o proteasas deseadas se pueden usar en los métodos descritos aquí.

Por ejemplo, una proteasa sola, se puede usar cualquier combinación deseada de diferentes proteasas, o cualquier preparación biológica, extracto biológico, u homogenado biológico que contiene actividad proteolítica. No es necesario que se conozca la identidad de la proteasa o proteasas que se usan. Ejemplos adecuados de proteasas que se pueden usar solas o en cualquier combinación deseada incluyen serina proteasa, cisteína proteasa, aspartato proteasas, tiol proteasas, metaloproteasa de matriz, carboxipeptidasa (v.gr., carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa B), tripsina, quimiotripsina, pepsina, papaína, elastasa, leucozima, pancreatina, trombina, plasmina, catepsinas (v.gr., catepsina G), proteinasa (v.gr., proteinasa 1 , proteinasa 2, proteinasa 3), termolisina, quimiosina, enteropeptidasa, caspasa (v.gr., caspasa 1 , caspasa 2, caspasa 4, caspasa 5, caspasa 9, caspasa 12, caspasa 13), calpaína, ficaína, clostripaína, actinidaina, bromelina, separasa, dipeptidilo aminopeptidasa IV y similares. Extractos biológicos, homogenados y preparaciones adecuadas que contienen actividad proteolitica incluyen suero, esputo, moco (v.gr., moco gástrico, moco nasal, moco bronquial), lavado broncoalveolar, homogenado de pulmón, extracto de pulmón, extracto pancreático, fluido gástrico, saliva, lágrimas y similares. En una modalidad, la proteasa es una encontrada en los ojos y/o lágrimas. La proteasa se usa en una cantidad adecuada para que ocurra degradación proteolitica. Por ejemplo, como se describe aquí, la proteasa se puede usar a aproximadamente 0.01% a aproximadamente 5% (p/p, proteasa/péptido o polipéptido). Cuando la proteasa se combina con un sistema de despliegue que comprende el repertorio de péptidos o polipéptidos (v.gr., un sistema de despliegue de fagos), por ejemplo, la proteasa puede ser usada a una concentración de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 20 pg/ml, aproximadamente 30 pg/ml, aproximadamente 40 pg/ml, aproximadamente 50 Mg/ml, aproximadamente 60 Mg/ml, aproximadamente 70 pg/ml, aproximadamente 80 Mg/ml, aproximadamente 90 pg/ml, aproximadamente 100 pg/ml, aproximadamente 200 pg/ml, aproximadamente 300 pg/ml, aproximadamente 400 pg/ml, aproximadamente 500 Mg/ml, aproximadamente 600 MQ/ml, aproximadamente 700 pg/ml, aproximadamente 800 M9/ml> aproximadamente 900 g/ml, aproximadamente 1000 pg/ml, aproximadamente 1.5 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 2.5 mg/ml o aproximadamente 3 mg/ml. Las concentraciones adecuadas son aproximadamente 10 pg/ml a 1 mg/ml, 10 pg/ml a 100, 90, 80, 70, 60, 50 ó 40 pg/ml, o 10, 20, 30, 40 ó 50 pg/ml a 100, 90, 80, 70, 60 pg/ml.

La proteasa se incuba con la colección de péptidos o polipéptidos (genoteca o repertorio) a una temperatura que es adecuada para actividad de la proteasa. Por ejemplo, la proteasa y colección de péptidos o polipéptidos se pueden incubar a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C (v.gr., a temperatura ambiente, aproximadamente 20°C, aproximadamente 21 °C, aproximadamente 22°C, aproximadamente 23°C, aproximadamente 24°C, aproximadamente 25°C, aproximadamente 26°C, aproximadamente 27°C, aproximadamente 28°C, aproximadamente 29°C, aproximadamente 30°C, aproximadamente 31°C, aproximadamente 32°C, aproximadamente 33°C, aproximadamente 34°C, aproximadamente 35°C, aproximadamente 36°C, aproximadamente 37°C, aproximadamente 38°C, aproximadamente 39°C, aproximadamente 40°C). La proteasa y la colección de péptidos o polipéptidos se incuban juntas durante un período suficiente para que ocurra degradación proteolítica. Por ejemplo, la colección de péptidos o polipéptidos puede ser incubada junto con proteasa durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 o aproximadamente 48 horas. En algunos ejemplos, la colección de péptidos o polipéptidos se incuba junto con proteasa durante la noche, o por lo menos durante aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 1.5 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, o más.

Es generalmente deseable, por lo menos en las primeras rondas de selección (v.gr., cuando se usa un sistema de despliegue), que la proteasa resulte en una reducción en el número de clones que tienen la actividad biológica deseada que es seleccionada por lo menos por un orden de magnitud, en comparación con selecciones que no incluyen incubación con proteasa. En ejemplos particulares, la cantidad de proteasa y condiciones usadas en los métodos son suficientes para reducir el número de clones recuperados por lo menos por aproximadamente un log (un factor de 10), por lo menos aproximadamente 2 logs (un factor de 100), por lo menos aproximadamente 3 logs (un factor de 1000) o por lo menos aproximadamente 4 logs (un factor de 10,000). Las cantidades adecuadas de proteasa y condiciones de incubación que resultarán en la reducción deseada en clones recuperados se pueden determinar fácilmente usando métodos convencionales y/o la guía provista aquí.

La proteasa y colección de péptidos o polipéptidos se pueden combinar e incubar usando cualquier método adecuado (v.gr., in vitro, in vivo o ex vivo). Por ejemplo, la proteasa y colección de péptidos o polipéptidos se puede combinar en un contenedor adecuado y mantener estacionario, oscilado, agitado, sometido a acción de remolino o similar, a una temperatura adecuada para actividad de proteasa. Si se desea, la proteasa y colección de péptidos o polipéptidos se pueden combinar en un sistema in vivo o ex vivo, tal como introduciendo la colección de polipéptidos (v.gr., una genoteca o repertorio de despliegue de fagos) en un animal adecuado (v.gr., un ratón), y después de que ha transcurrido un tiempo suficiente para actividad de proteasa, recuperar la colección de péptidos o polipéptidos. En otro ejemplo, un órgano o tejido es perfundido con la colección de polipéptidos (v.gr., una genoteca o repertorio de despliegue de fagos), y después de que ha transcurrido un tiempo suficiente para actividad de proteasa, la colección de polipéptidos es recuperada.

Después de la incubación, un péptido o polipéptido resistente a proteasa puede ser seleccionado con base en una actividad biológica deseada, tal como una actividad de unión. Si se desea, un inhibidor de proteasa puede ser añadido antes de la selección. Se puede usar cualquier inhibidor de proteasa adecuado (o combinación de dos o más inhibidores de proteasa) que no interfiera sustancialmente con el método de selección. Ejemplos de inhibidores de proteasa adecuados incluyen, a1-anti-tripsina, a2-macroglobulina, amastatina, antipaína, antitrombina III, aprotinina, clorhidroato de fluoruro de 4-(2-Aminoetil)bencensulfonilo (AEBSF), fluoruro de (4- Amidino-fen¡l)-metan-sulfon¡lo (APMSF), bestatina, benzamidina, quimiostatina, 3,4-Dicloroisocoumarina, fluorofosfato de diisoproplo (DIFP), E-64, ácido etilenediaminotetraacético (EDTA), elastatinal, leupeptina, N-Etilmaleimida, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), pepstatina, 1 ,10-fenantrolina, fosforamidona, inhibidores de serina proteasa, N-tosil-L-lisina-clorometil cetona (TLCK), Na-Tosil-Phe-clorometilcetona (TPCK) y similares. Además, muchas preparaciones que contienen inhibidores de varias clases de proteasas están comercialmente disponibles (v.gr., Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets™ (Roche Diagnostics Corporation; Indianapolis, IN, E.U.A.), que inhibe la quimiotripsina, termolisina, papaína, pronasa, extracto pancreático y tripsina).

Un péptido o polipéptido resistente a proteasa se puede seleccionar usando un método de selección de actividad biológica deseada, que permite a los péptidos y polipéptidos que tiene la actividad biológica deseada distinguir de y seleccionados sobre péptidos y polipéptidos que no tienen la actividad biológica deseada. Generalmente, los péptidos o polipéptidos que han sido digeridos o cortados por proteasa pierden su actividad biológica, mientras que los péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa permanecen funcionales. Por lo tanto, las pruebas adecuadas para actividad biológica se pueden usar para seleccionar péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa. Por ejemplo, una función de unión común (v.gr., unión de un ligando general, unión de un ligando específico, o unión de un sustrato) puede ser evaluada usando una prueba de unión adecuada (v.gr., ELISA, reconocimiento y selección). Por ejemplo, los polipéptidos que se unen a un ligando objetivo o a un ligando genérico, tal como proteína A, proteína L o un anticuerpo, se pueden seleccionar, aislar, y/o recuperar por reconocimiento y selección o usando una matriz de afinidad adecuada. El reconocimiento y selección se pueden lograr añadiendo una solución de ligando (v.gr., ligando genérico, ligando objetivo) a un recipiente adecuado (v.gr., tubo, caja de petri) y dejando que el ligando se deposite o sea revestido sobre las paredes del recipiente. El exceso de ligando se puede lavar y los polipéptidos (v.gr., una genoteca de despliegue de fagos) se puede añadir al recipiente y el recipiente se puede mantener bajo condiciones adecuadas para que los polipéptidos se unan al ligando inmovilizado. El polipéptido no unido puede ser lavado y los polipéptidos unidos pueden ser recuperados usando cualquier método adecuado, tal como, por ejemplo, raspando o bajando el pH.

Cuando se usa un sistema de despliegue de fagos, la unión puede ser probada en una prueba de ELISA de fagos. La prueba de ELISA de fagos se puede realizar de conformidad con cualquier procedimiento adecuado. En un ejemplo, poblaciones de fagos producidas en cada ronda de selección se pueden determinar selectivamente para unión por ELISA al ligando objetivo o ligando genérico seleccionado, para identificar fagos que despliegan péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa. Si se desea, los péptidos y polipéptidos solubles se puede probar para unión a ligando objetivo o ligando genérico, por ejemplo por prueba de ELISA usando reactivos, por ejemplo, contra una etiqueta C- o N-terminal (véase, por ejemplo, Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 y referencias citadas en el mismo). La diversidad de los fagos seleccionados también se puede evaluar por electroforesis en gel de productos de PCR (Marks et al. 1991 , supra; Nissim et al. 1994 supra), sondeo (Tomlinson et al, 1992) J. Mol. Biol. 227, 1 16) o por secuenciación del ADN del vector.

Los péptidos y polipéptidos resistentes a proteasa también se pueden seleccionar, por ejemplo, con base en actividad catalítica, que se puede medir usando una prueba de actividad catalítica (v.gr., prueba de actividad proteolítica, prueba de fosfotransferasa, prueba de fosfohidrolasa, prueba de actividad de polimerasa).

El péptido o polipéptido resistente a proteasa (v.gr., dominio variable de anticuerpo sencillo) puede tener especificidad de unión para un ligando genérico o cualquier ligando objetivo deseado, tal como proteínas humanas o animales, incluyendo citocinas, factores de crecimiento, receptores de citocina, receptores de factor de crecimiento, enzimas (v.gr., proteasas), co-factores para enzimas, proteínas de unión a ADN, lípidos y carbohidratos. Antígenos objetivos adecuados, incluyendo citocinas, factores de crecimiento, receptores de citocina, receptores de factor de crecimiento y otras proteínas como se describe aquí. Se apreciará que esta lista de ninguna manera es exhaustiva.

En algunas modalidades, el péptido o polipéptido resistente a proteasa se une a un objetivo en tejido pulmonar, tal como un objetivo seleccionado del grupo que consiste de TNFR1 , IL-1 , IL-1 R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12 IL-12R, IL-13, IL-13Ra1 , IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1 , TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), quimasa, FGF, Furina, Endotelina-1 , Eotaxinas (v gr., Eotaxina, Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1 , ICOS, IgE, IFNa, 1-309, integrinas, L-selectina, MIF, MIP4, MDC, MCP-1 , MMPs, elastasa de neutrófilos, osteopontina, OX-40, PARC, PD-1 , RANTES, SCF, SDF-1 , s¡glec8, TARC, TGFb, Trombina, Tim-1 , FNT, TRANCE, Triptasa, VEGF, VLA-4, VCAM, a4ß7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfabeta6, alfabeta8, cMET, CD8, vWF, proteínas amiloides (v.gr., amiloide alfa), MMP12, PDK1 , e IgE.

Cuando un sistema de despliegue (v.gr., un sistema de despliegue que enlaza la función codificante de un ácido nucleico y características funcionales del péptido o polipéptido codificado por el ácido nucleico) se usa en los métodos descritos aquí, frecuentemente es ventajoso amplificar o incrementar el número de copias de los ácidos nucleicos que codifican los péptidos o polipéptidos seleccionados. Esto provee una forma eficiente de obtener cantidades suficientes de ácido nucleicos y/o péptidos o polipéptidos para rondas selección adicionales, usando los métodos descritos aquí u otros métodos adecuados, o para preparar repertorios adicionales (v.gr., repertorios de maduración de afinidad). Por lo tanto, en algunas modalidades, los métodos de la invención comprenden usar un sistema de despliegue (v.gr., que enlaza la función codificante de un ácido nucleico y características funcionales del péptido o polipéptido codificado por el ácido nucleico, tal como despliegue de fagos) y además comprende amplificar o incrementar el número de copias de un ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido seleccionado. Los ácidos nucleicos puede ser amplificados usando cualesquiera métodos adecuados, tales como por amplificación de fagos, crecimiento celular o reacción en cadena de polimerasa.

Los métodos descritos aquí se pueden usar como parte de un programa para aislar péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa que pueden comprender, si se desea, otros métodos de selección adecuados. En estas situaciones, los métodos descritos aquí se pueden utilizar en cualquier punto deseado en el programa, tal como antes o después de que se usan otros métodos de selección. Los métodos descritos aquí también se pueden usar para proveer dos o más rondas de selección, como se describen y ejemplifican aquí.

En otro aspecto, la invención es un método de producción de un repertorio de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa. El método comprende proveer un repertorio de péptidos o polipéptidos; combinar el repertorio de péptidos o polipéptidos y una proteasa bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa; y recuperar una pluralidad de péptidos o polipéptidos que tienen una actividad biológica deseada, por lo que un repertorio de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa es producida. Preferiblemente, la pluralidad de péptidos o polipéptidos que tienen una actividad biológica deseada son recuperados con base en una actividad de unión, tal como unión a un ligando genérico o un ligando objetivo. Las proteasas, sistemas de despliegue, condiciones para actividad de proteasa, y métodos para seleccionar péptidos o polipéptidos que son adecuados para usarse en el método se describen aquí con respecto a los otros métodos de la invención.

En algunas modalidades, un sistema de despliegue (v.gr., un sistema de despliegue que enlaza la función codificante de un ácido nucleico y características funcionales del péptido o polipéptido codificado por el ácido nucleico) que comprende un repertorio de péptidos o polipéptidos se usa, y el método además comprende amplificar o incrementar el número de copias de los ácidos nucleicos que codifican la pluralidad de péptidos o polipéptidos seleccionados. Los ácidos nucleicos pueden ser amplificados usando cualquier método adecuado, tal como mediante amplificación de fagos, crecimiento celular o reacción en cadena de polimerasa. En una modalidad, el sistema de despliegue es despliegue de bacteriófagos y la amplificación es a través de expresión en E. Coli. En esta modalidad, las expresión de proteasa en E. Coli puede proveer la proteasa para selección de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa.

En una modalidad particular, la invención es un método de producción de un repertorio de polipéptidos resistentes a proteasa que comprenden dAbs. El método comprende proveer un repertorio de polipéptidos que comprenden dAbs; combinar el repertorio de péptidos o polipéptidos y una proteasa (v.gr., tripsina, elastasa, leucozima) bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa; y recuperar una pluralidad de polipéptidos que comprenden dAbs que tienen especificidad de unión para un ligando genérico (v.gr., proteína A, proteína G, proteína L) o un ligando objetivo. El método se puede usar para producir un repertorio intacto, o un repertorio que es desviado hacia una especificidad de unión deseada, tal como un repertorio de maduración de afinidad con base en un dAb progenitor que tiene especificidad de unión para un ligando objetivo deseado.

Sistemas de despliegue de polipéptido Preferiblemente, el repertorio o genoteca de péptidos o polipéptidos provistos para usarse en los métodos de la invención comprenden un sistema de despliegue adecuado. El sistema de despliegue preferiblemente resiste degradación por proteasa (v.gr., una sola proteasa o una combinación de proteasas, y cualquier extracto biológico, homogenado o preparación que contenga actividad proteolítica (v.gr., suero, esputo, moco (v.gr., moco gástrico, moco nasal, moco bronquial), lavado broncoalveolar, homogenado de pulmón, extracto de pulmón, extracto pancreático, fluido gástrico, saliva, lágrimas y similares). El sistema de despliegue y el enlace entre el sistema de despliegue y el polipéptido desplegado es preferiblemente por lo menos tan resistente a la proteasa como los péptidos o polipéptidos más estables del repertorio. Esto permite que un ácido nucleico que codifica un polipéptido desplegado seleccionado sea fácilmente aislado y/o amplificado.

En un ejemplo, un péptido o polipéptido resistente a proteasa puede ser seleccionado, aislado y/o recuperado de un repertorio de péptidos o polipéptidos que está en solución, o es covalentemente o no covalentemente unido a una superficie adecuada, tal como plástico o vidrio (v.gr., placa de microtitulación, alineación de polipéptidos tal como una microalineación). Por ejemplo, se puede usar una alineación de péptidos sobre una superficie de una manera que coloque cada miembro de la genoteca distinto (v.gr., secuencia de péptido única) a un lugar discreto, predefinido en la alineación. La identidad de cada miembro de la genoteca en dicha alineación puede ser determinada por su localización espacial en la alineación. Las localizaciones en la alineación en donde ocurren interacciones de unión entre a ligando objetivo, por ejemplo, y miembros de la genoteca reactivos se pueden determinar, identificando así las secuencias de los miembros reactivos sobre la base de localización espacial (véase, v.gr., patente de E.U.A. No. 5,143,854, WO 90/15070 y WO 92/10092.) Preferiblemente, los métodos utilizan un sistema de despliegue que enlaza la función codificante de un ácido nucleico y características físicas, químicas y/o funcionales del polipéptido codificado por el ácido nucleico. Dicho sistema de despliegue puede comprender una pluralidad de paquetes genéticos replicables, tales como bacteriófagos o células (bacterias). Preferiblemente, el sistema de despliegue comprende una genoteca, tal como una genoteca de despliegue de bacteriófagos. El despliegue de bacteriófagos es un sistema de despliegue particularmente preferido.

Se ha descrito un número de sistemas de despliegue de bacteriófagos adecuado (v.gr., sistemas de despliegue monovalente y despliegue multivalente) (Véase, v.gr., Griffiths et al., patente de E.U.A. No. 6,555,313 B1 (incorporado aquí por referencia); Johnson et al., patente de E.U.A. No. 5,733,743 (incorporada aquí por referencia); McCafferty et al, patente de E.U.A. No. 5,969,108 (incorporada aquí por referencia); Mulligan-Kehoe, patente de E.U.A. No. 5,702,892 (incorporada aquí por referencia); Winter, G. et al, Annu. Rev. Immunol. 72:433-455 (1994); Soumillion, P. et al, Appl Biochem. Biotechnol 47(2-3): 175-189 (1994); Castagnoli, L. et al, Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2): 121-133 (2001)). Los péptidos o polipéptidos desplegados en un sistema de despliegue de bacteriófagos pueden ser desplegados en cualquier bacteriófago adecuado, tales como, por ejemplo, un fago filamentoso (v.gr., fd, M13, F1 ), un fago lítico (v.gr., T4, T7, lambda), o un fago de ARN (v.gr., MS2).

Generalmente, una genoteca de fago que despliega un repertorio de péptidos o polipéptidos de fago, como proteínas de fusión con una proteína de revestimiento de fago adecuada (v.gr., proteína fd plll), es producida o provista. La proteína de fusión puede desplegar los péptidos o polipéptidos en la punta de la proteína de revestimiento de fago, o si se desea en una posición interna. Por ejemplo, el péptído o polipéptido desplegado puede estar presente en una posición que es amino-terminal al dominio 1 de plll (el dominio 1 de plll también se refiere como N1). El polipéptido desplegado puede ser directamente fusionado a plll (v.gr., el N-terminal del dominio 1 de plll) o fusionado a plll usando un enlazador. Si se desea, la fusión además puede comprender una etiqueta (v.gr., epítope myc, etiqueta His). Las genotecas que comprenden un repertorio de péptidos o polipéptidos que son desplegados como proteínas de fusión con una proteína de revestimiento de fago puede ser producida usando cualesquiera métodos adecuados, tales como introduciendo una genoteca de vectores de fago o vectores de fagémido que codifican los péptidos o polipéptidos desplegados en bacterias hospederas adecuadas, y cultivando las bacterias resultantes para producir fagos (v.gr., usando un fago auxiliar adecuado o complementando el plásmido si se desea). Adecuadamente, en una modalidad de la invención, las condiciones adecuadas para expresión de proteasa en las bacterias se seleccionan. La genoteca de fago puede ser recuperada del cultivo usando cualquier método adecuado, tal como precipitación y centrifugación.

El sistema de despliegue puede comprender un repertorio de péptidos o polipéptidos que contienen cualquier cantidad deseada de diversidad. Por ejemplo, el repertorio puede contener péptidos o polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que corresponden a polipéptidos que ocurren naturalmente expresados por un organismo, grupo de organismos, tejido deseado o tipo de célula deseado, o puede contener péptidos o polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos aleatorias o aleatorizadas. Si se desea, los polipéptidos pueden compartir un núcleo o armazón proteínico común. Por ejemplo, todos los polipéptidos en el repertorio o genoteca pueden ser con base en un armazón proteínico seleccionado de proteína A, proteína L, proteína G, un dominio de fibronectina, una anticalina, CTLA4, una enzima deseada (v.gr., una polimerasa, una celulasa), o un polipéptido de la superfamilia de inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (v.gr., un dominio variable de anticuerpo). Los polipéptidos en dicho repertorio o genoteca pueden comprender regiones definidas de secuencia de aminoácidos aleatoria o aleatorizadas y regiones de secuencia de aminoácidos común. En ciertas modalidades, todos o sustancialmente todos los polipéptidos en un repertorio son de un tipo deseado, tal como una enzima deseada (v.gr., una polimerasa) o un fragmento de unión a antígeno deseado de un anticuerpo (v.gr., VH humano o VL humano). En modalidades preferidas, el sistema de despliegue de polipéptido comprende un repertorio de polipéptidos en donde cada polipéptido comprende un dominio variable de anticuerpo. Por ejemplo, cada polipéptido en el repertorio puede contener un VH, un VL o un Fv (v.gr., un Fv de cadena sencilla). Como se describe aquí, el repertorio puede ser una genoteca de polipéptidos con base en moléculas progenitoras tales como GLP-1 o sus derivados tales como un derivado resistente a dipeptidilo peptidasa IV.

La diversidad de secuencia de aminoácidos puede ser introducida en cualquier región deseada de un péptido o polipéptido o armazón proteínico usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, la diversidad de secuencia de aminoácidos puede ser introducida en una región objetiva, tal como una región determinante de complementariedad de un dominio variable de anticuerpo o un dominio hidrofóbico, al preparar una genoteca de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos diversificados usando cualesquiera métodos de mutagénesis adecuados (v.gr., PCR de baja fidelidad, mutagénesis mediada por oligonucleótidos o dirigida al sitio, diversificación usando codones de NNK) o cualquier otro método adecuado. Si se desea, una región de un polipéptido que ha de ser diversificado puede ser aleatorizado.

El tamaño de los polipéptidos que constituyen el repertorio es en gran medida un asunto de elección y el tamaño de polipéptido uniforme no es requerido. Preferiblemente, los polipéptidos en el repertorio tienen por lo menos estructura terciaria (forman por lo menos un dominio).

Selección/aislamiento/recuperación Un péptido o polipéptido resistente a proteasa (v.gr., una población de polipéptidos resistentes a proteasa) puede ser seleccionado, aislado y/o recuperado de un repertorio o genoteca (v.gr., en un sistema de despliegue) usando cualquier método adecuado. Preferiblemente, un polipéptido resistente a proteasa es seleccionado o aislado con base en una característica seleccionable (v.gr., característica física, característica química, característica funcional). Las características funcionales seleccionares adecuadas incluyen actividades biológicas de péptidos o polipéptidos en el repertorio, por ejemplo, unión a un ligando genérico (v.gr., un superantígeno), unión a un ligando objetivo (v.gr., un antígeno, un epitope, un sustrato), unión a un anticuerpo (v.gr., a través de un epitope expresado en un péptido o polipéptido), y actividad catalítica (Véase, v.gr., Tomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655.) En algunas modalidades, el péptido o polipéptido resistente a proteasa es seleccionado y/o aislado de una genoteca o repertorio de péptidos o polipéptidos en los cuales sustancialmente todos los péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa comparten una característica seleccionarle común. Por ejemplo, el péptido o polipéptido resistente a proteasa puede ser seleccionado de una genoteca o repertorio en la cual sustancialmente todos los péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa se unen a un ligando genérico común, se unen a un ligando objetivo común, se unen (o son unidos por) un anticuerpo común, o poseen una actividad catalítica común. Este tipo de selección es particularmente útil para preparar un repertorio de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa que son con base en un péptido o polipéptido progenitor que tiene una actividad biológica deseada, por ejemplo, cuando realiza maduración de afinidad de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina.

Selección con base en unión a un ligando genérico común puede producir una colección o población de péptidos o polipéptidos que contienen todos o sustancialmente todos los péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa que eran componentes de la genoteca o repertorio original. Por ejemplo, péptidos o polipéptidos que se unen a un ligando objetivo o un ligando genérico, tal corno proteína A, proteína L o un anticuerpo, pueden ser seleccionados, aislados y/o recuperados por reconocimiento y selección o usando una matriz de afinidad adecuada. El reconocimiento y selección se pueden lograr añadiendo una solución de ligando (v.gr., ligando genérico, ligando objetivo) a un recipiente adecuado (v.gr., tubo, caja de petri) y dejando que el ligando se deposite o sea revestido sobre las paredes del recipiente. El exceso de ligando se puede lavar y los péptidos o polipéptidos (v.gr., un repertorio que ha sido incubado con proteasa) se puede añadir al recipiente y el recipiente se puede mantener bajo condiciones adecuadas para que los péptidos o polipéptidos se unan al ligando inmovilizado. Los péptidos o polipéptidos no unidos pueden ser lavados y los péptidos o polipéptidos unidos pueden ser recuperados usando cualquier método adecuado, tal como, por ejemplo, raspando o bajando el pH.

Las matrices de afinidad de ligando adecuadas generalmente contienen un soporte sólido o esfera (v.gr., agarosa) a la cual un ligando es covalentemente o no covalentemente unido. La matriz de afinidad puede ser combinada con péptidos o polipéptidos (v.gr., un repertorio que ha sido incubado con proteasa) usando un proceso por lotes, un proceso de columna o cualquier otro proceso adecuado bajo condiciones adecuadas para la unión de péptidos o polipéptidos al ligando sobre la matriz. Los péptidos o polipéptidos que no se unen a la matriz de afinidad pueden ser lavados y los péptidos o polipéptidos unidos pueden ser eluidos y recuperados usando cualquier método adecuado, tal como elución con un regulador de pH de pH más bajo, con un agente desnaturalizador ligero (v.gr., urea), o con un péptido que compite para unirse al ligando. En un ejemplo, un ligando objetivo biotinilado se combina con un repertorio bajo condiciones adecuadas a péptidos o polipéptidos en el repertorio para unirse al ligando objetivo. Los péptidos o polipéptidos unidos son recuperados usando avidina o estreptavidina inmovilizada (v.gr., en una esfera).

En algunas modalidades, el ligando genérico u objetivo es un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen a características estructurales de los péptidos o polipéptidos que son sustancialmente conservadas en los péptidos o polipéptidos de una genoteca o repertorio son particularmente útiles como ligandos genéricos. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno adecuados para usarse como ligandos para aislar, seleccionar y/o recuperar péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa pueden ser monoclonales o policlonales y pueden ser preparados usando cualquier método adecuado.

Genotecas/repertorios En otros aspectos, la invención se refiere a repertorios de péptidos y polipéptidos resistentes a proteasa, a genotecas que codifican péptidos y polipéptidos resistentes a proteasa, y a métodos para producir dichas genotecas y repertorios.

Las genotecas que codifican y/o contienen péptidos y polipéptidos resistentes a proteasa pueden ser preparadas u obtenidas usando cualquier método adecuado. La genoteca de la invención puede ser diseñada para codificar péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa con base en un péptido o polipéptido de interés (v.gr., un péptido o polipéptido seleccionado de una genoteca) o pueden ser seleccionados de otra genoteca usando los métodos descritos aquí. Por ejemplo, una genoteca enriquecida en polipéptidos resistentes a proteasa se puede preparar usando un sistema de despliegue de polipéptido adecuado.

En un ejemplo, una genoteca de despliegue de fagos que comprende un repertorio de polipéptidos desplegados que comprenden dominios variables sencillos de inmunoglobulina (v.gr., VH, VK, ??) se combina con una proteasa bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa, como se describe aquí. Los polipéptidos resistentes a proteasa son recuperados con base en una actividad biológica deseada, tal como una actividad de unión (v.gr., ligando genérico de unión, ligando objetivo de unión) produciendo así una genoteca de despliegue de fagos enriquecida en polipéptidos resistentes a proteasa.

En otro ejemplo, una genoteca de despliegue de fagos que comprende un repertorio de polipéptidos desplegados que comprenden dominios variables sencillos de inmunoglobulina (v.gr., VH, VK, \/?) es primero determinado selectivamente para identificar miembros del repertorio que tienen especificidad de unión para un antígeno objetivo deseado. Una colección de polipéptidos que tiene la especificidad de unión deseada son recuperados y la colección es combinada con proteasa bajo condiciones adecuadas para actividad proteolítica, como se describe aquí. Una colección de polipéptidos resistentes a proteasa que tienen la especificidad de unión objetivo deseada es recuperada, produciendo una genoteca enriquecida en polipéptidos resistentes a proteasa y de alta afinidad. Como se describe aquí, la resistencia a la proteasa en este método de selección se correlaciona con unión de alta afinidad.

Las genotecas que codifican un repertorio de un tipo deseado de polipéptidos pueden ser fácilmente producidas usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un tipo deseado de polipéptido (v.gr., una polimerasa, un dominio variable de inmunoglobulina), se puede obtener y una colección de ácidos nucleicos que contienen cada uno una o más mutaciones se puede preparar, por ejemplo, mediante amplificación del ácido nucleicos usando un sistema de reacción en cadena de polimerasa (PCR) sujeto a error, por mutagénesis química (Deng et al, J. Biol. Chem., 269:9533 (1994)) o usando cepas mutantes bacterianas (Low er a/, J. Mol. Biol., 260:359 (1996)).

En otras modalidades, regiones particulares del ácido nucleico pueden ser dirigidas para diversificación. Los métodos para mutación de posiciones seleccionadas también son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el uso de oligonucleótidos no pareados u oligonucleótidos degenerados, con o sin el uso de PCR. Por ejemplo, genotecas de anticuerpo sintéticas se han creado al dirigir mutaciones a los bucles de unión de antígeno. Regiones de anticuerpo H3 y L3 aleatorias o semialeatorias han sido anexadas a segmentos de gen de inmunoglobulina V de linea germinal para producir genotecas grandes con regiones de marco de trabajo no mutadas (Hoogenboom y Winter (1992), supra; Nissim et al (1994), supra; Griffiths et al. (1994) supra; DeKruif et al (1995), supra). Dicha diversificación se ha extendido para incluir algunos o todos los otros bucles de unión (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio Technology, 13:475; Morphosys, WO 97/08320, supra). En otras modalidades, regiones particulares del ácido nucleico pueden ser dirigidas para diversificación, por ejemplo, por una estrategia de PCR de dos pasos que utiliza el producto de la primera PCR como "mega-iniciador". (Véase, v.gr., Landt, O. et al., Gene 96:125-128 (1990)). La diversificación dirigida también se puede lograr, por ejemplo, por SOE PCR. (Véase, v.gr., Horton, RM et al., Gene 77:61-68 (1989)).

La diversidad de secuencia en posiciones seleccionadas se puede lograr alterando la secuencia codificante que especifica la secuencia del polipéptido de tal manera que el número de aminoácidos posibles (v.gr., todos los 20 o un subconjunto de los mismos) se pueda incorporar en esa posición. Usando la nomenclatura de IUPAC, el codón más versátil es NNK, que codifica todos los aminoácidos así como el codón de detención TAG. El codón NNK preferiblemente se usa para introducir la diversidad requerida. Se usan otros codones que logran los mismos fines también, incluyendo el codón NNN, que conduce a la producción de los codones de detención TGA y TAA.

Dicho enfoque dirigido también permite que el espacio de secuencia completo en un área objetivo sea explorado.

Las genotecas preferidas comprenden polipéptidos resistentes a proteasa que son miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas (v.gr., anticuerpos o porciones lo los mismos). Por ejemplo, las genotecas pueden comprender polipéptidos de anticuerpo resistentes a proteasa que tengan una conformación de cadena principal conocida. (Véase, v.gr., Tomlinson et al.., WO 99/20749). Las genotecas se pueden preparar en un plásmido o vector adecuado. Como se usa aquí, vector se refiere a un elemento discreto que es usado para introducir ADN heterólogo en células para la expresión y/o replicación de las mismas. Cualquier vector adecuado se puede usar, incluyendo plásmidos (v.gr., plásmidos bacterianos), vectores virales o bacteriófagos, cromosomas artificiales y vectores episomales. Dichos vectores se pueden usar para clonación y mutagénesis simple, o un vector de expresión se puede usar para expresión de la genoteca. Vectores y plásmidos usualmente contienen uno o más sitios de clonación (v.gr., un polienlazador), un origen de replicación y por lo menos un gen marcador seleccionable. Los vectores de expresión además puede contener elementos para impulsar la transcripción y traducción de un polipéptido, tales como un elemento incrementador, promotor, señal de terminación de transcripción, secuencias de señales y similares. Estos elementos pueden estar dispuestos de una manera tal que sean operablemente enlazados a un inserto clonado que codifica un polipéptido, de tal manera que el polipéptido sea expresado y producido cuando dicho vector de expresión se mantenga bajo condiciones adecuadas para expresión (v.gr., en una célula hospedera adecuada).

Los vectores de clonación y expresión generalmente contienen secuencias de ácido nucleico que permiten que el vector se replique en una o más células hospederas. Típicamente en vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independiente del ADN cromosómico del hospedero e incluye orígenes de replicacion o secuencias autónomamente replicantes. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicacion del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido de 2 mieras es adecuado para levadura y varios orígenes virales (v.gr., SV40, adenovirus) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen de replicacion no es necesario para vectores de expresión en mamíferos, a menos que estos se usen en células de mamíferos capaces replicar altos niveles de ADN, tales como células COS.

Los vectores de clonación o expresión pueden contener un gen de selección también referido como marcador seleccionable. Dichos genes marcadores codifican una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células hospederas transformadas que crecen en un medio de cultivo selectivo. Las células hospederas no transformadas con el vector que contiene el gen de selección por lo tanto no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, v.gr. , ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, deficiencias auxotróficas de complemento, o nutrientes críticos de suministro no disponibles en el medio de crecimiento.

Los vectores de expresión adecuados pueden contener un número de componentes, por ejemplo, un origen de replicación, un gen marcador seleccionable, uno o más elementos de control de expresión, tales como un elemento de control de transcripción (v.gr., promotor, incrementador, terminador) y/o una o más señales de traducción, una secuencia de señal o secuencia líder, y similares. Los elementos de control de expresión y una secuencia de señal o líder, si está presente, pueden ser provistos por el vector u otra fuente. Por ejemplo, las secuencias de control transcripcionlaes y/o traduccionables de un ácido nucleico clonado que codifica una cadena de anticuerpo se pueden usar para dirigir la expresión.

Se puede proveer un promotor para expresión en una célula hospedera deseada. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, un promotor puede ser operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, cadena de anticuerpo o porción de la misma, de tal manera que dirige la transcripción del ácido nucleico. Una variedad de promotores adecuados para hospederos procarióticos (v.gr., los sistemas de promotor de ß-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema de promotor de triptófano (trp), promotores lac, tac, T3, T7 para E. cofí) y eucarióticos (v.gr., promotor temprano o tardío de virus simiano 40, promotor de repetición de terminal largo de virus del sarcoma de Rous, promotor de citomegalovirus, promotor tardío de adenovirus, promotor de EG-1 a) están disponibles.

Además, los vectores de expresión típicamente comprenden un marcador seleccionable para selección de células hospederas que portan el vector, y en el caso de un vector de expresión replicable, un origen de replicación. Los genes que codifican productos que confieren resistencia a antibióticos o fármacos son marcadores seleccionares comunes y se pueden usar en células procarióticas (v.gr., gen de ß-lactamasa (resistencia a ampicilina), gen Tet para resistencia a tetraciclina) y células eucarióticas (v.gr., genes de resistencia a neomicina (G418 o geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina, o higromicina). Los genes marcadores de dihidrofolato reductasa permiten la selección con metotrexato en una variedad de hospederos. Los genes que codifican el producto de gen de marcadores auxotróficos del hospedero (v.gr., LEU2, URA3, HIS3) a menudo se usan como marcadores seleccionares en levaduras. El uso de vectores virales (v.gr., baculovirus) o fagos, y vectores que son capaces de integrarse en el genoma de la célula hospedera, tales como vectores retrovirales, también son contemplados.

Los vectores de expresión adecuados para la expresión en células procarióticas (v.gr., células bacterianas tales como E. coli) o células de mamífero incluyen, por ejemplo un vector pET (v.gr., pET-12a, pET-36, pET-37, pET-39, pET-40, Novagen y otros), un vector de fago (v.gr., pCANTAB 5 E, Pharmacia), pRIT2T (vector de fusión de proteína A, Pharmacia), pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1 , pRc/RSV, pEF-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5, pXT1 (Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3 (Goldman, L.A., et al, Biotechniques, 27:1013-1015 (1996)), pSVSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD), pEF-Bos (Mizushima, S., et al, Nucleic Acids Res., 78:5322 (1990)) y similares. Los vectores de expresión que son adecuados para usarse en varios hospederos de expresión, tales como células procarióticas (E. coli), células de insecto (células S2 Schneider de Drosophila, Sf9), levaduras (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) y células de mamífero (v.gr., células COS) están disponibles.

Los vectores preferidos son vectores de expresión que permiten la expresión de una secuencia de nucleótidos correspondiente a un miembro de genoteca de polipéptido. Por lo tanto, la selección con ligandos genéricos y/u objetivos se pueden realizar mediante propagación o expresión separada de un solo clon que expresa un miembro de genoteca de polipéptido. Como se describió antes, el sistema de despliegue de selección preferido es despliegue de bacteriófagos. Por lo tanto, vectores de fago o fagémico se pueden usar. Los vectores preferidos son vectores de fagémido que tienen un origen de replicación de E. coli (para replicación de doble cadena), y también un origen de replicación de fago (para producción de ADN de una sola cadena). La manipulación y expresión de dichos vectores es bien conocida en el técnica (Hoogenboom y Winter (1992), supra;. Nissim et al. (1994), supra). En resumen, el vector puede contener un gen de ß-lactamasa para conferir selectividad al fagémido y un promotor lac hacia el extremo 5' de un cásete de expresión que puede contener una secuencia líder adecuada, un sitio de clonación múltiple, una o más etiquetas de péptido, uno o más codones de detención TAG y la proteina de fago plll. Por lo tanto, el uso de varias cepas supresoras y no supresoras de E. coli y con la adición de glucosa, iso-propil tio- -D-galactósido (IPTG) o un fago auxiliar, tal como VCS M13, el vector es capaz de replicarse como un plásmido sin expresión, producir grandes cantidades del miembro de genoteca de polipéptido únicamente o fago de producto, algunos de los cuales contienen por lo menos una copia de la fusión de polipéptido-p 111 sobre su superficie.

Las genotecas y repertorios de la invención pueden contener formatos de anticuerpo. Por ejemplo, el polipéptido contenido dentro de las genotecas y repertorios pueden ser anticuerpos enteros o fragmentos de los mismos, tales como fragmentos Fab, F(ab')2, Fv o scFv, dominios de VH o VL separados, cualquiera de las cuales son ya sea modificadas o no modificados. Los fragmentos scFv, así como otros polipéptidos de anticuerpo, pueden ser producidos fácilmente usando cualquier método adecuado. Un número de métodos de ingeniería genética para anticuerpos adecuados son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un scFv se puede formar enlazando ácidos nucleicos que codifican dos dominios variables con un oligonucleótido adecuado que codifica un péptido enlazador apropiado, tal como (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 u otros péptidos enlazadores adecuados. El enlazador forma puente entre el extremo C-terminal de la primera región V y el extremo N-terminal de la segunda región V. Se pueden usar técnicas similares para la construcción de otros formatos de anticuerpo, tales como fragmentos Fv, Fab y F(ab')2. Para fragmentos de formato Fab y F(ab')2, los polipéptidos VH y VL se pueden combinar con segmentos de región constante que se pueden aislar de genes reordenados, genes C de línea germinal o sintetizados a partir de datos de secuencia de anticuerpos. Una genoteca o repertorio de conformidad con la invención puede ser una genoteca o repertorio de VH o VL.

Los polipéptidos que comprenden un dominio variable resistente a proteasa preferiblemente comprenden un sitio de unión a ligando objetivo y/o un sitio de unión a ligando genérico. En ciertas modalidades, el sitio de unión a ligando genérico es un sitio de unión para un superantígeno, tal como proteína A, proteína L o proteína G. La dominios variables se puede basar en cualquier dominio variable deseado, por ejemplo, un VH humano (v.gr., VH 1a, VH1 b, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6), un ?? humano (v.gr., V l, V II, V III, V IV, V V, ???? o VK1 ) o un VK humano (v.gr., VK2, VK3, VK4, VK5, VH6, VK7, VK8, Ácidos nucleicos, células hospederas y métodos para producir polipéptidos resistentes a proteasa La invención también se refiere a ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican péptido o polipéptido resistente a proteasa, v.gr., que son seleccionares o seleccionados por los métodos descritos en la presente.

Los ácidos nucleicos referidos aquí como "aislados" son ácidos nucleicos que han sido separados de otro material (v.gr., otros ácidos nucleicos tales como ADN genómico, ADNc y/o ARN) en su ambiente original (v.gr., en células o en una mezcla de ácidos nucleicos tales como una genoteca). Un ácido nucleico aislado puede ser aislado como parte de un vector (v.gr., un plásmido).

Los ácidos nucleicos referidos aquí como "recombinantes" son ácidos nucleicos que han sido producidos por metodología de ADN recombinante, incluyendo métodos que se basan en recombinación artificial, tal como clonación en un vector o cromosoma usando, por ejemplo, enzimas de restricción, recombinación homologa, virus y similares, y ácidos nucleicos preparados usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR).

La presente invención también se refiere a una célula hospedera recombinante que comprende un ácido nucleico recombinante (uno o más) o constructo de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido resistente a proteasa, v.gr., un péptido o polipéptido seleccionable o seleccionado por los métodos descritos en la presente. La invención también incluye un método para preparar un péptido o polipéptido resistente a proteasa, que comprende mantener una célula hospedera recombinante de la invención bajo condiciones apropiadas para la expresión de un péptido o polipéptido resistente a proteasa. El método puede comprender además el paso de aislar o recuperar el péptido o polipéptido resistente a proteasa, si se desea.

Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico (es decir, una o más moléculas de ácido nucleico) que codifican un péptido o polipéptido resistente a proteasa, o un constructo de expresión (es decir, uno o más constructos) que comprende molécula(s) de ácido nucleico, puede ser introducido en una célula hospedera adecuada para crear una célula hospedera recombinante usando cualquier método apropiado para la célula hospedera seleccionada (v.gr., transformación, transfección, electroporación, infección), por lo que la molécula(s) de ácido nucleico son operablemente enlazadas a uno o más elementos de control de expresión (v.gr., en un vector, en un constructo creado por procedimientos en la célula, integrados al genoma de la célula hospedera). La célula hospedera recombinante resultante se puede mantener bajo condiciones adecuadas para expresión (v.gr., en presencia de un inductor, en un animal adecuado, en un medio de cultivo adecuado complementado con sales, factores de crecimiento, antibióticos, complementos nutricionales apropiados, etc.), por lo que el péptido o polipéptido es producido. Si se desea, el péptido o polipéptido codificado puede ser aislado o recuperado (v.gr., de animal, la célula hospedera, medio, leche). Este procedimiento abarca expresión en una célula hospedera de un animal transgénico (véase, v.gr., WO 92/03918, GenPharm International).

El péptido o polipéptido resistente a proteasa seleccionado por el método descrito en la presente también se puede producir en un sistema de expresión ¡n vitro adecuado, por síntesis química o por cualquier otro método adecuado.

Polipéptidos, dAbs, agonistas y antagonistas Como se describe y se ejemplifica en la presente, los péptidos, polipéptido o dAbs resistentes a proteasa de la invención generalmente se unen a su ligando objetivo con alta afinidad. Por lo tanto, en otro aspecto, se provee un método para seleccionar, aislar, y/o recuperar un polipéptido o dAb de la invención que se una a antígeno objetivo con alta afinidad. Generalmente, el método comprende proveer una genoteca o repertorio de péptidos o polipéptidos (v.gr., dAbs), combinar la genoteca o repertorio con una proteasa (v.gr., tripsina, elastasa, leucozima, pancreatina, esputo) bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa, y seleccionar, aislar o recuperar un péptido o polipéptido que se une a un ligando (v.gr., ligando objetivo). Debido a que la genoteca o repertorio ha sido expuesta a proteasa bajo condiciones en donde los péptido o polipéptido sensibles a proteasa serán digeridos, la actividad de la proteasa puede eliminar los polipéptidos menos estables que tienen baja afinidad de unión, y por lo tanto producir una colección de péptidos o polipéptidos de unión de alta afinidad. Por ejemplo, el polipéptido o dAb de la invención se puede unir a antígeno objetivo con una afinidad (KD; KD = Kd¡SOc¡ac¡ón(kd)/Kasoc¡ación(ka) como se determina mediante resonancia de plasmón de superficie) de 1 µ? o más fuerte, o aproximadamente 500 nM a aproximadamente 0.5 pM. Por ejemplo, el polipéptido de dAb de la invención puede unir antígeno objetivo (v.gr., TNFR1) con una afinidad de aproximadamente 500 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 1 pM o aproximadamente 0.5 pM. Aunque no nos limitamos a ninguna teoría en particular, los péptidos y polipéptidos que son resistentes a proteasas se cree que tienen una entropía más baja y/o energía de estabilización más alta. Por lo tanto, la correlación entre la resistencia a la proteasa y unión de alta afinidad se pueden relacionar con el grado de compactacion y estabilidad de las superficies de los péptidos y polipéptidos y dAbs seleccionados por los métodos descritos en la presente.

El polipéptido, dAb, agonista o antagonista puede ser expresado en E. coli o en especies de Pichia (v.gr., P. pastoris). En una modalidad, el ligando o monómero de dAb es secretado en una cantidad de por lo menos aproximadamente 0.5 mg/L cuando se expresa en E. coli o en especies de Pichia (v.gr., P. pastoris). Aunque los ligandos y monómeros de dAb descritos aquí pueden ser secretados cuando se expresan en E. coli o en especies de Pichia (v.gr., P. pastoris). Pueden ser producidos usando cualquier método adecuado, tal como, métodos de química sintética o métodos de producción biológica que no utilizan E. coli o en especies de Pichia.

En algunas modalidades, el polipéptido, dAb, agonista o antagonista no comprende un dominio variable de inmunoglobulina de Camelid, o uno o más aminoácidos de marco de trabajo que son únicos para dominios variables de inmunoglobulina codificados por segmentos de gen de anticuerpo de linea germinal de Camelid, v.gr., en la posición 108, 37, 44, 45 y/o 47.

Agonistas o antagonistas de conformidad con la invención pueden ser monovalentes o multivalentes. En algunas modalidades, el agonista o antagonista es monovalente y contiene un sitio de unión que interactúa con antigeno objetivo, el sitio de unión provisto por un polipéptido o dAb de la invención. Los agonistas o antagonistas monovalentes se unen a un antígeno objetivo y pueden no inducir entrelazamiento o agregación de antígeno objetivo (v.gr., antígenos de receptor) sobre la superficie de células que pueden conducir a la activación del receptor y transducción de señal.

En otras modalidades, el agonista o antagonista de la invención es multivalente. Los agonistas o antagonistas multivalentes pueden contener dos o más copias de un sitio de unión particular para antígeno objetivo o contener dos o más sitios de unión diferentes que se unen a antígeno objetivo, por lo menos uno de los sitios de unión siendo provistos por un polipéptido o dAb de la invención. Por ejemplo, como se describe aquí, el agonista o antagonista puede ser un dímero, trímero o multímero que comprende dos o más copias de un polipéptido o dAb particular de la invención que se une a antígeno objetivo, o dos o más polipéptidos o dAbs diferentes de la invención que se unen a antígeno objetivo. En una modalidad, un antagonista multivalente se une a un antígeno de receptor de superficie celular y no es agonista sustancial del antígeno (actúa como un agonista del antígeno) en una prueba de células estándar.

En ciertas modalidades, el agonista o antagonista multivalente contiene dos o más sitios de unión para un epítope o dominio deseado de antígeno objetivo.

En otras modalidades, el polipéptido puede ser un agente insulinotrópico tal como un péptido derivado de GLP-1. Los métodos adecuados para determinar la potencia de un agente insulinotrópico, resistencia a proteasas tales como DPP-IV, vida media después de administración y efectos in vivo se describen, por ejemplo, en el documento WO 2006/059106.

En otras modalidades, el agonista o antagonista multivalente contiene dos o más sitios de unión provistos por polipéptidos o dAbs de la invención que se unen a epítopes o dominios diferentes de antígeno objetivo.

En ciertas modalidades, el polipéptido, dAb, agonista o antagonista de la invención son eficaces en modelos de enfermedades inflamatorias crónicas cuando una cantidad efectiva es administrada. Generalmente, una cantidad efectiva es aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg (v.gr., aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, o aproximadamente 10 mg/kg). Los modelos de enfermedad inflamatoria (véase aquellos descritos en WO2006038027) son reconocidos por los expertos en la técnica como siendo predictivos en eficacia terapéutica en humanos.

Generalmente, los presentes ligandos (v.gr., agonistas, antagonistas) serán utilizados en forma purificada junto con vehículos farmacológicamente apropiados. Típicamente, estos vehículos incluyen soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, cualquiera incluyendo solución salina y/o medio regulado en su pH. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio y solución de Ringer lactada. Los adyuvantes fisiológicamente aceptables adecuados, si es necesario para mantener un complejo de polipéptido en suspensión, se pueden escoger de espesantes tales como carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos.

Los vehículos intravenosos incluyen rellenadores fluidos y de nutrientes y rellenadores de electrolitos, tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer. Los conservadores y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelatadores y gases inertes, también pueden estar presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Edición). Una variedad de formulaciones adecuadas se pueden usar, incluyendo formulaciones de liberación prolongada.

Los ligandos (v.gr., antagonistas) de la presente invención se pueden usar como composiciones administradas por separado o junto con otros agentes. Estos pueden incluir varios fármacos inmunoterapéuticos tales como ciclosporina, metotraxato, adriamicína o cisplatino, e inmunotoxinas. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir "cócteles" de varios citotóxicos u otros agentes junto con los ligandos de la presente invención, o incluso combinaciones de ligandos de conformidad con la presente invención que tienen especificidades diferentes, tales como ligandos seleccionados usando diferentes antígenos o epítopes objetivos, ya sea que estén o no en acervo antes de la administración.

La vía de administración de composiciones farmacéuticas de conformidad con la invención puede ser cualquiera de aquellas comúnmente conocidas por los expertos en la técnica. Para terapia, incluyendo sin limitación inmunoterapia, los ligandos seleccionados de los mismos de la invención se pueden administrar a cualquier paciente de conformidad con técnicas estándares.

La administración puede ser cualquier modo apropiado, incluyendo vía parenteral intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, pulmonar, o también, de manera apropiada, por infusión directa con un catéter. La dosis y frecuencia de administración dependerán de la edad, sexo y condición del paciente, administración concurrente de otros fármacos, contraindicaciones y otros parámetros que han de ser tomados en cuenta por el médico. La administración puede ser local (v.gr., suministro local al pulmón por administración pulmonar, v.gr., administración intranasal) o sistémica como se indica.

Los ligandos de esta invención pueden ser liofilizados por almacenamiento y reconstituidos en un vehículo adecuado antes de usarse. Esta técnica se ha mostrado que es efectiva con inmunoglobulinas convencionales y se pueden utilizar técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica. Los expertos en la técnica apreciarán que la liofilización y reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad de anticuerpos (v.gr., con inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a tener mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG) y que los niveles de uso pueden tener que ser ajustados ascendentemente para compensación.

Las composiciones que contienen los presentes ligandos (v.gr., agonistas, antagonistas) o un cóctel de los mismos de pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En ciertas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para lograr por lo menos inhibición parcial, supresión, modulación, muerte o algunos otros parámetros medibles, de la población de células seleccionadas se define como "dosis terapéuticamente efectiva", las cantidades necesarias para lograr esta dosis dependerán de la severidad de la enfermedad y el estado general del sistema inmunológico propio del paciente, pero generalmente varían de 0.005 a 5.0 mg del ligando, v.gr., dAb, agonista o antagonista por kilogramo de peso corporal, con dosis de 0.05 a 2.0 mg/kg/dosis siendo más comúnmente usadas. Para aplicaciones profilácticas, composiciones que contienen los presentes ligandos o cócteles de los mismos pueden ser administrados también en dosis similares o ligeramente más bajas, para prevenir, inhibir o retardar el inicio de la enfermedad (v.gr., para sostener remisión o quiescencia, o para prevenir fase aguda). El médico clínico podrá determinar el intervalo de dosis apropiado para tratar, suprimir o prevenir enfermedad. El tratamiento o terapia puede ser utilizado usando las composiciones descritas en la presente se considera "efectivo" si uno o más síntomas son reducidos (v.gr., por lo menos por 10% o por lo menos un punto en una escala de evaluación clínica), en relación con dichos síntomas presentes antes del tratamiento, o en relación con dichos síntomas en un individuo (humano o modelo animal) no tratado con dicha composición u otro control adecuado. Los síntomas obviamente variaran dependiendo de la enfermedad o trastorno objetivo, pero lo puede medir un clínico o técnico experto en la técnica. Esos síntomas se pueden medir, por ejemplo, monitoreando el nivel de uno o más indicadores bioquímicos de la enfermedad o trastorno (v.gr., niveles de una enzima o metabolito correlacionado con la enfermedad, números de células afectadas, etc.), al monitorear manifestaciones físicas (v.gr., inflamación, tamaño de tumor, etc.), o por una escala de evaluación clínica aceptada, por ejemplo, la escala de estado de incapacidad expandida (para esclerosis múltiple), el cuestionario de enfermedad intestinal inflamatoria de Irvine (evaluación de 32 puntos que evalúan la calidad de vida con respecto a función intestinal, síntomas sistémicos, función social y estado emocional-las puntuaciones varían de 32 a 224, en donde las puntuaciones más altas indican una mejor calidad de vida), la escala de calidad de vida en artritis reumatoide, u otra escala de evaluación clínica aceptada son conocidas en el campo. Una reducción sostenida (v.gr., un día o más largo) en síntomas de enfermedad o trastorno por lo menos por 10% o por uno o más puntos en una escala clínica dada es indicativo de tratamiento "efectivo". De manera similar, la profilaxis realizada usando una composición como se describe en la presente es "efectiva" si el inicio o severidad de uno o más síntomas es retardado, reducido o anulado en relación con los síntomas en un individuo similar (humano o modelo animal) no tratado con la composición.

Una composición que contiene un ligando (v.gr., agonista, antagonista) o cóctel del mismo de conformidad con la presente invención se puede utilizar en situaciones profiláctica y terapéutica para ayudar a la alteración, inactivación, muerte o remoción de una población de células objetivo seleccionadas en un mamífero. Además, los repertorios seleccionados de polipéptidos descritos en la presente se pueden usar extracorporalmente o in vitro selectivamente para matar, agotar o de otra manera remover de manera efectiva una población de células objetivo de una colección heterogénea de células. Sangre de un mamífero se puede combinar extracorporalmente con los ligandos, por lo que las células no deseadas son muertas o removidas de otra manera de la sangre para ser regresadas al mamífero de conformidad con técnicas estándares.

Una composición que contiene un ligando (v.gr., agonistas o antagonista) de conformidad con la presente invención se puede utilizar en situaciones profiláctica y terapéutica para ayudar en alteración, inactivación, muerte o remoción de una población de células objetivo seleccionadas en un mamífero.

Los ligandos (v.gr., antagonistas anti-antígeno objetivo, agonistas, monómeros de dAb) se pueden administrar y/o formular junto con uno o más agentes terapéuticos o activos adicionales. Cuando un ligando (v.gr., un dAb) se administra con un agente terapéutico adicional, el ligando se puede administrar antes, simultáneamente con o después de la administración del agente adicional. Generalmente, el ligando y agente adicional se administran de una manera que provea una traslape de efecto terapéutico.

En una modalidad preferida de la invención, las composiciones farmacéuticas que contienen un fármaco GLP-1 o un análogo o derivado de GLP-1 de conformidad con el presente invención se pueden administrar parenteralmente a pacientes que necesitan dicho tratamiento. La administración parenteral se puede realizar por inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa en forma de pluma. Alternativamente, la administración parenteral se puede realizar por medio de una bomba de infusión. Una opción adicional es una composición que puede ser potenciada o un líquido para la administración del fármaco GLP-1 o análogo o derivado de GLP-1 en forma de una aspersión nasal o pulmonar. Como una opción adicional, el fármaco GLP-1 o análogo o derivado de GLP-1 de la invención también se puede administrar por vía transdérmica, v.gr., desde un parche, opcionalmente un parche iontoforético o por vía transmucosa, v.gr., vía bucal. En otras modalidades, las composiciones se administras por vía oral, v.gr., una pildora, cápsula, bebida (v.gr., comercializada como una bebida de pérdida de peso para tratamiento de obesidad).

Una composición para administración parenteral de compuestos de GLP-1 , por ejemplo, se puede preparar como se descnbe en el documento WO 03/002136 (US2003119734) (incorporado aquí por referencia).

En otra modalidad, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de conformidad con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hiperglicemia, diabetes de tipo 1 , diabetes de tipo 2 o deficiencia de células ß. En modalidades específicas para estas indicaciones, el fármacos se selecciona de un agente insulinotrópico, e incretina, un péptido similar a glucagón 1 , un péptido GLP-1 , un análogo de GLP-1 , un derivado de GLP-1 , PYY, un péptido de PYY, un análogo de PYY, un derivado de PYY, Exendina-3, un péptido de Exendina-3, un análogo de Exendina-3, un derivado de Exendina-3, Exendina-4, un péptido de Exendina-4, un análogo de Exendina-4, un derivado de Exendina-4 o una combinación de dos o más de estos (v:gr., péptido de GLP-1 y un péptido de PYY).

El tratamiento con un compuesto de conformidad con la presente invención también se puede combinar con una segunda o más sustancias farmacológicamente activas, que pueden o no ser parte del conjugado de fármaco o fusión. Por ejemplo, un activo seleccionado de agentes antidiabéticos, agentes antiobesidad, agentes reguladores del apetito, agentes antihipertensivos, agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones que resultan de o asociadas con diabetes y agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos que resultan de o asociados con obesidad. En el presente contexto, la expresión "agente antidiabético" incluye compuestos para el tratamiento y/o profilaxis de resistencia a la insulina y enfermedades en donde la resistencia a la insulina es un mecanismo patofisiológico.

Formatos La vida media incrementada es útil en aplicaciones in vivo de inmunoglobulinas, especialmente anticuerpos y muy especialmente fragmentos de anticuerpo de tamaño pequeño. Dichos fragmentos (Fvs, Fvs, Fabs, scFvs, dAbs unidos a disulfuro) padecen de aclaramiento rápido del cuerpo; por lo tanto, mientras que son capaces de alcanzar la mayor parte del cuerpo rápidamente, son rápidos de producir y fáciles de manejar, sus aplicaciones in vivo han sido limitadas sólo por su persistencia breve in vivo. Una modalidad de la invención resuelve este problema al proveer vida media 4 incrementada de los ligandos in vivo y consecuentemente tiempos de persistencia más largos en el cuerpo de la actividad funcional del ligando.

Los métodos para análisis farmacocinético y determinación de la vida media del ligando serán familiares para los expertos en la técnica. Se pueden encontrar detalles en Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, publicada por Marcel Dekker, 2a. Rev. ex edición (1982), que describe parámetros farmacocinéticos tales como vidas media de alfa t y beta t y están bajo la curva (AUC).

Las vidas medias (t½ alfa y VA beta) y AUC se puede determinar a partir de una curva de concentración de ligando en el suero contra el tiempo. El paquete de análisis WinNonlin (disponible de Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, E.U.A.) se puede usar, por ejemplo, para modelar la curva. En una primera fase (la fase alfa) el ligando está principalmente bajo distribución en el paciente con alguna eliminación. Una segunda fase (fase beta) es la fase terminal cuando el ligando ha sido distribuido y la concentración en el suero está disminuyendo a medida que el ligando es aclarado del paciente. La vida media alfa t es la vida media de la primera fase y la vida media beta t es la vida media de la segunda fase. Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención provee un ligando o una composición que comprende un ligando de conformidad con la invención que tiene una vida media de ta en el intervalo de 15 minutos o más. En una modalidad, el extremo inferior del intervalo es 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 1 1 horas o 12 horas. Además, o alternativamente, un ligando o composición de conformidad con la invención tendrá una vida media ta en el intervalo de hasta y que incluye 12 horas. En una modalidad, el extremo superior del intervalo es 1 1 , 10, 9, 8, 7, 6 ó 5 horas. Un ejemplo de un intervalo adecuado es 1 a 6 horas, 2 a 5 horas o 3 a 4 horas.

En una modalidad, la presente invención provee un ligando (polipéptido, dAb, agonista o antagonista) o una composición que comprende un ligando de conformidad con la invención que tiene una vida media tp en el intervalo de 2.5 horas o más. En una modalidad, el extremo inferior del intervalo es 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Además, o alternativamente, un ligando o composición de conformidad con la invención tiene una vida media en el intervalo de hasta y que incluye 21 días. En una modalidad, el extremo superior del intervalo es 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días o 20 días. En una modalidad, un ligando o composición de conformidad con la invención tendrá una vida media ?ß en el intervalo de 12 a 60 horas. En una modalidad adicional, estará en el intervalo de 12 a 48 horas. En una modalidad adicional más, estará en el intervalo 12 a 26 horas.

Además, o alternativamente a los criterios anteriores, la presente invención provee un ligando o una composición que comprende un ligando de conformidad con la invención que tiene un valor de AUC (área bajo la curva) en el intervalo de 1 mg.min/ml o más. En una modalidad, el extremo inferior del intervalo es 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 ó 300 mg.min/ml. Además, o alternativamente, un ligando o composición de conformidad con la invención tiene una AUC en el intervalo de hasta 600 mg.min/ml. En una modalidad, el extremo superior del intervalo es 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ó 50 mg.min/ml. En una modalidad, un ligando de conformidad con la invención tendrá una AUC en el intervalo seleccionado del grupo que consiste de los siguientes: 15 a 150 mg.min/ml, 15 a 100 mg.min/ml, 15 a 75 mg.min/ml y 15 a 50 mg.min/ml.

Polipéptidos y dAbs de la invención y agonistas o antagonistas que comprenden estos se pueden formular para tener un tamaño hidrodinámico más grande, por ejemplo, al unir un grupo PEG, albúmina de suero, transferrina, receptor de transferrina o por lo menos una porción de unión a transferrina del mismo, una región Fe de anticuerpo, o mediante conjugación a un dominio de anticuerpo. Por ejemplo, polipéptidos dAbs, agonistas y antagonistas formateados como un fragmento de unión a antígeno más grande de un anticuerpo o como un anticuerpo (v.gr., formateados como Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv).

El tamaño hidrodinámico de los ligandos (v.gr., monómeros y multímeros de dAb) de la invención se puede determinar usando métodos que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, cromatografía de filtración en gel se puede usar para determinar el tamaño hidrodinámico de un ligando. Matrices de filtración en gel adecuadas para determinar los tamaños hidrodinámicos de ligandos, tales como matrices de agarosa entrelazadas, son bien conocidas y están fácilmente disponibles.

El tamaño de un formato de ligando (v.gr., el tamaño de una porción de PEG unida a un monómero de dAb), se puede variar dependiendo de la aplicación deseada. Por ejemplo, en donde el ligando está diseñado para dejar la circulación y entrar al tejido periférico, es deseable mantener el tamaño hidrodinámico de un ligando bajo para facilitar la extravazación desde el torrente sanguíneo. Alternativamente, en donde se desea tener el ligando permaneciendo en la circulación sistémica durante un periodo más largo de tiempo, el tamaño de ligando se puede incrementar, por ejemplo formateando como una proteína similar a Ig.

Extensión de la vida media al dirigir un antígeno o epítope que incrementa la vida media in vivo El tamaño hidrodinámico de un ligando y su vida media en el suero también se puede incrementar conjugando o asociando un polipéptido de unión a antigeno objetivo, dAb, agonista o antagonista de la invención a un dominio de unión (v.gr., anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une a un antígeno o epítope que incrementa la vida media in vivo, como se describe aquí. Por ejemplo, el agente de unión a antígeno objetivo (v.gr., polipéptidos) se puede conjugar a o enlazar a una albúmina de antisuero o anticuerpo de receptor Fe anti-neonatal o fragmento de anticuerpo, v.gr., un receptor Fe anti-SA o anti-neonatal dAb, Fab, Fab' o scFv, o a un anticuerpo anti-SA o anticuerpo de receptor Fe anti-neonatal o un anticuerpo avímero anti-SA, o un dominio de unión anti-SA que comprende un armazón proteínico seleccionado de, pero preferiblemente no limitado al grupo que consiste de CTLA-4, lipocalina, SpA, un aficuerpo, un avímero, GroEl y fíbronectina (véase documento PCT/GB2008/000453 presentado el 8 de febrero de 2008 (WO2008096158; US2009259026) para descripción de este dominio de unión, dichos dominios y sus secuencias se incorporan aquí por referencia y forman parte de la descripción del presente texto). Conjugación se refiere a una composición que comprende polipéptido, dAb, agonista o antagonista de la invención que se une (covalente o no covalentemente) a un dominio de unión que se une a albúmina de suero.

Los polipéptidos adecuados que incrementan la vida media en el suero in vivo incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión de agente neurofarmacéutico de ligando específico de receptor de transferrina (véase patente de E.U.A. No 5,977,307, cuyas enseñanzas se incorporan aquí por referencia), receptor de células endoteliales capilares de cerebro, transferrina, receptor de transferrina (v.gr., receptor de transferrina soluble), insulina, receptor de factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1), receptor de factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF-2), receptor de insulina, factor de coagulación de la sangre X, D1 -antitripsina y HNF 1 a. Los polipéptidos adecuados que incrementan la vida media en el suero también incluyen alfa-1 glicoproteína (orosomucoide; AAG), alfa-1 antiquimiotripsina (ACT), alfa-1 microglobulina (proteína HC; AIM), antitrombina III (AT III), apolipoproteínas A-1 (Apo A-1), apolipoproteína B (Apo B), ceruloplasmina (Cp), componente de complemento C3 (C3), componente de complemento C4 (C4), inhibidor de esterasa de C1 (C1 INH), proteína de C-reactivo (CRP), ferritina (FER), hemopexina (HPX), lipoproteína(a) (Lp(a)), proteína de unión a mañosa (MBP), mioglobina (Myo), prealbúmina (transtiretina; PAL), proteína de unión a retinol (RBP), y factor reumatoide (RF).

Proteínas adecuadas de matriz extracelular incluyen, por ejemplo, colágenos, laminínas, integrinas y fibronectina. Los colágenos son las principales proteínas de la matriz extracelular. Aproximadamente 15 tipos de moléculas de colágeno son actualmente conocidas, encontradas en diferentes partes del cuerpo, v.gr., colágeno tipo I (que representa el 90% del colágeno del cuerpo) encontrado en hueso, piel, tendón, ligamentos, córnea, órganos internos o colágeno de tipo II encontrado en cartílago, disco vertebral, notocorda y humor vitreo del ojo.

Las proteínas adecuadas de la sangre incluyen, por ejemplo, proteínas del plasma (v.gr., fibrina, a-2 macroglobulina, albúmina de suero, fibrinógeno (v.gr., fibrinógeno A, fibrinógeno B), proteína amiloide A del suero, haptoglobina, profilina, ubiquitina, uteroglobulina y ß-2-microglobulina), enzimas e inhibidores de enzima (v.gr., plasminógeno, lisozima, cistatina C, alfa- -antitripsina e inhibidor de tripsina pancreática), proteínas del sistema inmunológico, tales como proteínas de inmunoglobulina (v.gr., IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, cadenas ligeras de inmunoglobulina (kappa/lambda)), proteínas transportadoras (v.gr., proteína de unión a retinol, a-1 microglobulina), defensinas (v.gr., beta-defensína 1 , defensina 1 de neutrófilo, defensina 2 de neutrófilo y defensina 3 de neutrófilo) y similares.

Las proteínas adecuadas encontradas en la barrera hemato-cerebral o en un tejido neural incluyen, por ejemplo, receptor de melanocortina, mielina, transportador de ascorbato y similares.

Los polipéptidos adecuados que incrementan la vida media en el suero ¡n vivo también incluyen proteínas localizadas en el riñon (v.gr., policistina, colágeno de tipo IV, transportador de anión orgánico K1 , antígeno de Heymann), proteínas localizadas en el hígado (v.gr., alcohol deshidrogenasa, G250), proteínas localizadas en el pulmón (v.gr., componente secretor, que se une a IgA), proteínas localizadas en el corazón (v.gr., HSP 27, que está asociado con cardiomiopatía dilatada), proteínas localizadas en la piel (v.gr., queratina), proteina específicas de hueso tales como proteínas morfogénicas (BMPs), que son un subconjunto de la superfamilia de proteínas de factor de crecimiento transformante ß que demuestran actividad osteogénica (v.gr., BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8), proteínas específicas del tumor (v.gr., antígeno de trofoblasto, receptor de herceptina, receptor de estrógeno, catepsinas (v.gr., catepsina B, que se puede encontrar en el hígado y el bazo)).

Las proteínas específicas de enfermedad adecuadas incluyen, por ejemplo, antígenos expresados sólo sobres células T activadas, incluyendo LAG-3 (gen de activación de linfocitos), ligando de osteoprotegerina (OPGL; véase Nature 402, 304-309 (1999)), OX40 (un miembro de la familia del receptor de FNT, expresado sobre células T activadas y específicamente no regulado en células productoras de virus de leucemia de células T humanas de tipo I (HTLV-I); véase Immunol. 165 (1):263-70 (2000)). Las proteínas específicas de enfermedad adecuadas también incluyen, por ejemplo, metaloproteasas (asociadas con artritis/cánceres) incluyendo Drosophila CG6512, paraplegina humana, FtsH humana, AFG3L2 humana, ftsH de murino; y factores de crecimiento angiogénicos, incluyendo factor de crecimiento de fibroblastos ácido (FGF-1 ), factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF-2), factor de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF), factor de crecimiento transformante a (TGF a), factor de necrosis tumoral alfa (FNT-ot), angiogenina, interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento placentario (P1 GF), factor de crecimiento derivado de plaquetas de midkine-BB (PDGF) y fractalkine.

Los polipéptidos adecuados que incrementan la vida media en el suero in vivo también incluyen proteínas de estrés tales como proteínas de choque térmico (HSPs). Las HSPs normalmente se encuentran intracelularmente. Cuando se encuentran extracelularmente, es un indicador de que una célula ha muerto y derramado su contenido. Esta muerte celular no programada (necrosis) ocurre cuando, como resultado de trauma, enfermedad o lesión, las HSPs extracelulares desencadenan una respuesta del sistema inmunológico. La unión a HSP extracelular puede ocasionar la localización de las composiciones de la invención a un sitio de enfermedad.

Las proteínas adecuadas implicadas en transporte de Fe incluyen, por ejemplo, receptor de Brambell (también conocido como FcRB). Este receptor de Fe tiene dos funciones, ambas de las cuales son potencialmente útiles para suministro. Las funciones son (1 ) transporte de IgG de madre a hijo a través de la placenta, (2) protección de IgG contra degradación prolongando así su vida media en el suero. Se piensa que el receptor recicla IgG de endosomas. (Véase, Holliger et al, Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997).) dAbs que se une a albúmina de suero (AlbudAbs™) La invención en una modalidad provee un polipéptido, agonista o antagonista (v.gr., ligando específico doble que comprende un dAb anti-antígeno objetivo (un primer dAb)) que se une a un antígeno objetivo y un segundo dAb que se une a albúmina de suero (SA), el segundo dAb que se une a SA con una KD como se determina por resonancia de plasmón de superficie de 1 nM a 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 ó 500 µ M (es decir, x 10"9 a 5 x 10"4), o 100 nM a 10 µ?, o 1 a 5 µ? o 3 a 70 nM o 10 nM a 1 , 2, 3, 4 ó 5 µ?. Por ejemplo 30 a 70 nM como se determina por resonancia de plasmón de superficie. En una modalidad, el primer dAb (o un monómero de dAb) se une a SA (v.gr., HSA) con un KD como se determina por resonancia de plasmón de superficie de aproximadamente 1 , 50, 70, 100, 150, 200, 300 nM o 1 , 2 ó 3 µ?. En una modalidad, para un ligando específico doble que comprende un primer dAb anti-SA y un segundo dAb a antígeno objetivo, la afinidad (v.gr., KD y/o Kd¡sociaci6n como se mide por resonancia de plasmón de superficie, v.gr., usando BiaCore) del segundo dAb para su objetivo es de 1 a 100000 veces (v.gr., 100 a 100000, o 1000 a 100000, o 10000 a 100000 veces) la afinidad del primer dAb para SA. En una modalidad, la albúmina en el suero es albúmina de suero humana (HSA). Por ejemplo, el primer dAb se une a SA con una afinidad de aproximadamente 10 µ?, mientras el segundo dAb se une a su objetivo con una afinidad de 100 pM. En una modalidad, la albúmina en el suero es albúmina de suero humana (HSA). En una modalidad, el primer dAb se une a SA (v.gr., HSA) con una KD de aproximadamente 50, por ejemplo 70, 100, 150 ó 200 nM. Detalles de ligando específico dobles se encuentran en los documentos WO03002609, Los ligandos de la invención en una modalidad pueden comprender un dAb que se une a albúmina en el suero (SA) con una KD como se determina por resonancia de plasmón de superficie de 1 nM a 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 ó 500 µ M (es decir, x 10"9 a 5 x 10" ), o 100 nM a 10 µ?, o 1 a 5 µ? o 3 a 70 nM o 10 nM a 1 , 2, 3, 4 ó 5 µ?. Por ejemplo 30 a 70 nM como se determina por resonancia de plasmón de superficie. En una modalidad, el primer dAb (o un monómero de dAb) se une a SA (v.gr., HSA) con una KD como se determina por resonancia de plasmón de superficie de aproximadamente 1 , 50, 70, 100, 150, 200, 300 nM o 1 , 2 ó 3 µ M. En una modalidad, el primer y segundo dAbs son enlazados por un enlazador, por ejemplo un enlazador de 1 a 4 aminoácidos o de 1 a 3 aminoácidos, o más de 3 aminoácidos o más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ó 20 aminoácidos. En una modalidad, un enlazador más largo (más de 3 aminoácidos) se usa para incrementar potencia (KD de uno o ambos dAbs en el agonista o antagonista). En una modalidad, el enlazador es un enlazador helicoidal.

En modalidades particulares de los ligandos, agonistas y antagonistas, el dAb se une a albúmina de suero humana y compite para unirse a albúmina con un dAb seleccionado del grupo que consiste de MSA-16, MSA-26 (Véase el documento WO04003019 (US2006106203) para descripción de estas secuencias, dichas secuencias y su contraparte de ácido nucleico son incorporadas aquí por referencia y forman parte de la descripción del presente texto), DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473), DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7 (SEQ ID NO: 476), DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7r-4 (SEQ ID NO: 478), DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479), DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481), DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491 ), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7 4 (SEQ ID NO: 498), DOM7M 5 (SEQ ID NO: 499), DOM7 6 (SEQ ID NO: 500), DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501), DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502), DOM7 9 (SEQ ID NO: 503), DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504), DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505), DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506), DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508), DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509), DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510), DOM7r-27 (SEQ ID NO: 51 1), DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512), DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513), DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514), DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515), DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516), DOM7r-33 (SEQ ID NO: 517) (Véase el documento WO2007080392 (US20070003549) para descripción de estas secuencias, dichas secuencias y su contraparte de ácido nucleico son incorporadas aquí por referencia y forman parte de la descripción del presente texto; las SEQ ID No's en este párrafo son aquellas que aparecen en el documento dAb8 (dAbl O), dAb 10, dAb36, dAb7r20 (DOM7r20), dAb7r21 (DOM7r21 ), dAb7r22 (DOM7r22), dAb7r23 (DOM7r23), dAb7r24 (DOM7r24), dAb7r25 (DOM7r25), dAb7r26 (DOM7r26), dAb7r27 (DOM7r27), dAb7r28 (DOM7r28), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r31 (DOM7r31 ), dAb7r32 (DOM7r32), dAb7r33 (DOM7r33), dAb7r33 (DOM7r33), dAb7h22 (DOM7h22), dAb7h23 (DOM7h23), dAb7h24 (DOM7h24), dAb7h25 (DOM7h25), dAb7h26 (DOM7h26), dAb7h27 (DOM7h27), dAb7h30 (DOM7h30), dAb7h31 (DOM7h31), dAb2 (dAbs 4,7,41), dAb4, dAb7, dAb1 1 , dAb12 (dAb7m12), dAb13 (dAb 15), dAb15, dAb 16 (dAb21 , dAb7m16) , dAb 17, dAb 18, dAb 19, dAb21 , dAb22, dAb23, dAb24, dAb25 ( dAb26, dAb7m26), dAb27, dAb30 (dAb35), dAb31 , dAb33, dAb34, dAb35, dAb38 (dAb54), dAb41 , dAb46 (dAbs 47, 52 y 56), dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m 2, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1 (DOM7r1), dAb7r3 (DOM7r3), dAb7r4 (DOM7r4), dAb7r5 (DOM7r5), dAb7r7 (DOM7r7), dAb7r8 (DOM7r8), dAb7r13 (DOM7r13), dAb7r14 (DOM7r14), dAb7r15 (DOM7r15), dAb7r16 (DOM7M6), dAb7r17 (DOM7M 7), dAb7r18 (DOM7 8), dAb7r19 (DOM7r19), dAb7h1 (DOM7hl), dAb7h2 (DOM7h2), dAb7h6 (DOM7h6), dAb7h7 (DO 7h7), dAb7h8 (DOM7h8), dAb7h9 (DO 7h9), dAb7h10 (DOM7M0), dAb7h1 1 (DOM7hl I), dAb7h12 (DOM7M2), dAb7h13 (DOM7hl3), dAb7h14 (DOM7hl4), dAb7p1 (DOM7p1), y dAb7p2 (DOM7p2) (véase el documento WO2008096158 (US2009259026) para descripción de estas secuencias, dichas secuencias y su contraparte de ácido nucleico son incorporadas aquí por referencia y forman parte de la descripción del presente texto). Nombres alternativos se muestran entre corchetes después de que el dAb, v.gr., dAb8 tiene un nombre alternativo que es dAb10 es decir dAb8 (dAb10).

En ciertas modalidades, el dAb se une a albúmina de suero humana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 80%, ó por lo menos aproximadamente 85%, o por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 95%, o por lo menos aproximadamente 96%, o por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 98%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionado del grupo que consiste de MSA-16, MSA-26, DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473), DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7r-1 (SEQ ID NO: 476), DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7r-4 (SEQ ID NO: 478), DOM7r-5 (SEQ ID NO. 479), DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481 ), DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7 3 (SEQ ID NO: 497), DOM7 4 (SEQ ID NO: 498), DOM7 5 (SEQ ID NO: 499), DOM7 6 (SEQ ID NO: 500), DOM7r-17 (SEQ ID NO. 501 ), DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502), DOM7 9 (SEQ ID NO: 503), DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504), DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505), DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506), DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508), DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509), DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510), DOM7r-27 (SEQ ID NO: 5 1), DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512), DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513), DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514), DO 7r-31 (SEQ ID NO: 515), DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516), DOM7r-33 (SEQ ID NO: 517) (las SEQ ID No's en este párrafo son aquellas que aparecen en el documento WO2007080392 ((US20070003549)), dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21 , dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31 , dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21 , dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31 , dAb2, dAb4, dAb7, dAb1 1 , dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21 , dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31 , dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41 , dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1 , dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1 , dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h1 1 , dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1 , y dAb7p2.

Por ejemplo, el dAb que se une a albúmina de suero humana puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 95%, o por lo menos aproximadamente 96%, o por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 98%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con DOM7h-2 (SEQ ID NO:482), DOM7h-3 (SEQ ID NO:483), DOM7h-4 (SEQ ID NO:484), DOM7h-6 (SEQ ID NO:485), DOM7h-1 (SEQ ID NO:486), DOM7h-7 (SEQ ID NO:487), DOM7h-8 (SEQ ID NO:496), DOM7 3 (SEQ ID NO.497), DOM7r-14 (SEQ ID N0.498), DOM7h-22 (SEQ ID NO:489), DOM7h-23 (SEQ ID NO:490), DOM7h-24 (SEQ ID NO:491), DOM7h-25 (SEQ ID NO:492), DOM7h-26 (SEQ ID NO:493), DOM7h-21 (SEQ ID NO:494), DOM7h-27 (SEQ ID NO:495) (las SEQ ID No's en este párrafo son aquellas que aparecen en el documento WO2007080392 (US20070003549)), dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7h21 , dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31 , dAb2, dAb4, dAb7, dAb1 1 , dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21 , dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31 , dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41 , dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7h1 , dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11 , dAb7h12, dAb7h13 y dAb7h14.

En ciertas modalidades, el dAb se une a albúmina de suero humana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 80%, o por lo menos aproximadamente 85%, o por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 95%, o por lo menos aproximadamente 96%, o por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 98%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionado del grupo que consiste de DOM7h-2 (SEQ ID NO:482), DOM7h-6 (SEQ ID NO:485), DOM7h-1 (SEQ ID NO:486), DOM7h-7 (SEQ ID NO:487), DOM7h-8 (SEQ ID NO:496), DOM7h-22 (SEQ ID NO:489), DOM7h-23 (SEQ ID NO:490), DOM7h-24 (SEQ ID NO:491), DOM7h-25 (SEQ ID NO:492), DOM7h-26 (SEQ ID NO:493), DOM7h-21 (SEQ ID NO:494), DOM7h-27 (SEQ ID NO:495) (las SEQ ID No's en este párrafo son aquellas que aparecen en el documento WO2007080392 (US20070003549)), dAb7h21 , dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31 , dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAMI, dAb7h1 , dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h1 1 , dAb7h12, dAb7h13 y dAb7h14.

En modalidades muy particulares, el dAb es un VK dAb que se une a albúmina de suero humana y tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de DOM7h-2 (SEQ ID NO:482), DOM7h-6 (SEQ ID NO:485), DOM7h-1 (SEQ ID NO:486), DOM7h-7 (SEQ ID NO:487), DOM7h-8 (SEQ ID NO:496) (la SEQ ID No's en este párrafo son aquellas que aparecen en el documento WO2007080392 (US20070003549)), dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAMI, dAb54, dAb7h1 , dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11 , dAb7h12, dAb7h13 y dAb7h14.

En modalidades muy particulares, el dAb es un Vg dAb que se une a albúmina de suero humana y tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de dAb7h30 y dAb7h31.

En modalidades muy particulares, el dAb es dAb7h1 1 o dAb7h14. En otras modalidades, el dAb, ligando, agonista o antagonista se une a albúmina de suero humana y comprende una, dos o tres de las CDRs de cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores, v.gr., una, dos o tres de las CDRs de dAb7h1 1 o dAb7h14.

VHH de camélido adecuado que se une a albúmina en el suero incluye aquellos descritos en el documento WO 2004/041862 (Ablynx N.V.) (US2009238829) y en el documento WO2007080392 ((US20070003549) (cuyas secuencias de VHH y su contraparte de ácido nucleico son incorporadas aquí por referencia y forman parte de la descripción del presente texto), tal como Secuencia A (SEQ ID NO:5 8), Secuencia B (SEQ ID NO:519), Secuencia C (SEQ ID NO:520), Secuencia D (SEQ ID NO:521 ), Secuencia E (SEQ ID NO:522), Secuencia F (SEQ ID NO:523), Secuencia G (SEQ ID NO:524), Secuencia H (SEQ ID NO:525), Secuencia I (SEQ ID NO:526), Secuencia J (SEQ ID NO:527), Secuencia K (SEQ ID NO:528), Secuencia L (SEQ ID NO:529), Secuencia M (SEQ ID NO:530), Secuencia N (SEQ ID NO:531), Secuencia O (SEQ ID NO:532), Secuencia P (SEQ ID NO:533), Secuencia Q (SEQ ID NO:534), estos números de secuencia correspondientes a aquellos citados en el documento WO2007080392 o WO 2004/041862 (Ablynx N.V.). En ciertas modalidades, el VHH de camélido se une a albúmina de suero humana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 80%, o por lo menos aproximadamente 85%, o por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 95%, o por lo menos aproximadamente 96%, o por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 98%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con ALB1 descrita en el documento WO2007080392 o cualquiera de SEQ ID NOS:518-534, estos números de secuencia correspondientes a aquellos citados en el documento WO2007080392 o WO 2004/041862.

En algunas modalidades, el ligando, agonista o antagonista comprende una anti-albúmina en el suero dAb que compite con cualquier anti-albúmina en el suero dAb descrita en la presente para unirse a albúmina en el suero (v.gr., albúmina de suero humana).

En una modalidad alternativa, el agonista, antagonista o ligando comprende una porción de unión específica para antígeno objetivo (v.gr., TNFR1 humano), en donde la porción comprende secuencias que no son inmunoglobulina como describe en la solicitud co-pendiente PCT/GB2008/000453 presentada el 8 de febrero de 2008, la descripción de estas porciones de unión, sus métodos de producción y selección (v.gr., de diversas genotecas) y sus secuencias son incorporadas aquí por referencia como parte de la descripción del presente texto).

Conjugación a una porción de extensión de vida media (v.gr., albúmina) En una modalidad, una (una o más) porción de extensión de vida media (v.gr., albúmina, transferrina y fragmentos y análogos de los mismos) es conjugada o asociada con el polipéptido de unión a antígeno objetivo, dAb, agonista o antagonista de la invención. Ejemplos de albúmina, fragmentos de albúmina o variantes de albúmina adecuados para usarse en un formato de unión a antígeno objetivo se describen en el documento WO 2005077042 (US2005186664), cuya descripción se incorpora aquí por referencia y forma parte de la descripción del presente texto. En particular, la siguiente albúmina, fragmentos de albúmina o variantes de albúmina se pueden usar en la presente invención: · SEQ ID NO: 1 (como se describe en el documento WO 2005077042, esta secuencia siendo explícitamente incorporada en la presente descripción por referencia); • Fragmento o variante de albúmina que comprende o que consiste de aminoácidos 1-387 de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; • Albúmina, o fragmento o variante de la misma, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: (a) aminoácidos 54 a 61 de SEQ ID NO:1 en el documento WO 2005077042; (b) aminoácidos 76 a 89 de SEQ ID NO:1 en el documento WO 2005077042; (c) aminoácidos 92 a 100 de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; (d) aminoácidos 170 a 176 de SEQ ID NO:1 en el documento WO 2005077042; (e) aminoácidos 247 a 252 de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; (f) aminoácidos 266 a 277 de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; (g) aminoácidos 280 a 288 de SEQ ID NO.1 en el documento WO 2005077042; (h) aminoácidos 362 a 368 de SEQ ID NO:1 en el documento WO 2005077042; (i) aminoácidos 439 a 447 de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042 (j) aminoácidos 462 a 475 de SEQ ID NO:1 en el documento WO 2005077042; (k) aminoácidos 478 a 486 de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; y (1) aminoácidos 560 a 566 de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042.

Ejemplos adicionales de albúmina, fragmentos y análogos adecuados para usarse en un formato de unión a antigeno objetivo se describen en el documento WO 03076567 (US2008108560), cuya descripción se incorpora aquí por referencia y que forma parte de la descripción del presente texto. En particular, la siguiente albúmina, fragmentos o variantes se pueden usar en la presente invención: • Albúmina humana en el suero como se describe en el documento WO 03076567, v.gr., en la figura 3 (esta información de secuencia siendo explícitamente incorporada en la presente descripción por referencia); • Albúmina humana en el suero (HA) que consiste de una cadena sencilla de polipéptido no glicosilado de 585 aminoácidos con una fórmula molecular peso de 66,500 (Véase, Meloun, et al, FEBS Letters 55: 136 (1975); Behrens, et al, Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, et al, Nucleic Acids Research 9:6102-61 14 (1981); Minghetti, et al., J. Biol. Chem. 261 :6747 (1986)); • Una vanante polimórfica o análogo o fragmento de albúmina como se describe en Weitkamp, et al, Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973); • Un fragmento o variante de albúmina como se describe en EP 322094, v.gr., HA(1-373), HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369), y HA(1-419) y fragmentos entre 1- 369 y 1-419; • Un fragmento o variante de albúmina como se describe en EP 399666, v.gr., HA(1-177) y HA(1-200) y fragmentos entre HA(1-X), en donde X es cualquier número de 178 a 199.

En donde una porción que extiende la vida media (una o más) (v.gr., albúmina, transferrina y fragmentos de análogos de las mismas) se usa para dar formato a los polipéptidos de unión de antígeno objetivos, dAbs, agonistas y antagonistas de la invención, se puede conjugar usando cualquier método adecuado, tal como por infusión directa a una porción de unión a antígeno objetivo (v.gr., anti-TNFR1 dAb), por ejemplo usando un solo constructo de nucleótido que codifica una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión es codificada como una cadena de polipéptidos sencilla con la porción de extensión de vida media localizada N- o C-terminal a la porción de unión a antígeno objetivo. Alternativamente, la conjugación se puede lograr usando un enlazador de péptido entre las porciones, v.gr., un enlazador de péptido como se describe en el documento WO 03076567 (US2008108560) o WO 2004003019 (estas descripciones de enlazador son incorporadas por referencia en la presente descripción para proveer ejemplos para usarse en la presente invención). En una modalidad, la conjugación puede ser a través de un enlazador helicoidal tal como el enlazador helicoidal como se describe aquí. También se debe apreciar que otros enlazadores que pueden ser útiles para este propósito incluyen aquellos tales como enlazadores ricos en glicina-serina. En una modalidad, el enlazador puede ser un enlazador resistente a proteasa. Típicamente, un polipéptido que codifica vida media en el suero in vivo es un polipéptido que ocurre naturalmente in vivo y que resiste la degradación o remoción por mecanismos endógenos que remueven material no deseado del organismo (v.gr., humano). Por ejemplo, un polipéptido que incrementa la vida media del suero in vivo se puede seleccionar de proteínas de la matriz extracelular, proteínas encontradas en la sangre, proteínas encontradas en la barrera hemato-cerebral o en tejido neural, proteínas localizadas en el riñon, hígado, pulmón, corazón, piel o hueso, proteínas de estrés, proteínas especificas de enfermedad, o proteínas implicadas en transporte de Fe.

En modalidades de la invención descritas a lo largo de esta descripción, en lugar del uso de un antígeno anti-objetivo "dAb" en un agonista, antagonista o ligando de la invención, se contempla que el experto en la técnica puede usar un polipéptido o dominio que comprenda una o más de todas las tres CDRs de un dAb de la invención que se une a antígeno objetivo (v.gr., CDRs injertada sobre un armazón proteínico de proteína adecuado o esqueleto, v.gr., un aficuerpo, un armazón proteínico de SpA, un dominio de clase A de receptor de LDL o un dominio de EGF). La descripción como un todo debe considerarse de para proveer una descripción de agonistas o antagonistas usando dichos dominios en lugar de dAb. A este respecto, véase el documento WO2008096158 (US2009259026), cuya descripción se incorpora por referencia.

En una modalidad, por lo tanto, un agonista o antagonista de la invención comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina o un anticuerpo de dominio (dAb) que tiene especificidad de unión para antígeno objetivo o las regiones determinantes de complementariedad de dicho dAb en un formato adecuado. El agonista o antagonista puede ser un polipéptido que consista de dicho dAb, o que consista esencialmente de dicho dAb. El agonista o antagonista puede ser un polipéptido que comprenda un dAb (o las CDRs de un dAb) en un formato adecuado, tal como un formato de anticuerpo (v.gr., formato similar a IgG, scFv, Fab, Fab', F(ab')2), o un ligando especifico doble que comprenda un dAb que se una a antígeno objetivo y un segundo dAb que se una a otra proteína objetivo, antígeno o epítope (v.gr., albúmina de suero).

Polipéptidos, dAds, agonistas y antagonistas de conformidad con la invención pueden ser formateados como una variedad de formatos de anticuerpo adecuados que son conocidos en la técnica, tales como formatos similares a IgG, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpo, cadenas ligeras de anticuerpos, homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas y/o cadenas ligeras de anticuerpo, fragmentos de unión a antígeno de cualquiera de los anteriores (v.gr., un fragmento Fv (v.gr., Fv de cadena sencilla (scFv), un Fv unido a disulfuro), un fragmento de Fab, un fragmento de Fab', un fragmento de F(ab')2), un dominio variable sencillo (v.gr., VH, VL), un dAb, y versiones modificadas de cualquiera de los anteriores (v.gr., modificado por la unión covalente de polialquiíenglicol (v.gr., polietilenglicol, polipropilenglicol, polibutilenglicol) u otro polímero adecuado).

En algunas modalidades, la invención provee un ligando (un antagonista anti-TNFR1) que se un formato similar a IgG. Dichos formatos tienen la estructura de cuatro cadenas convencional de una molécula de IgG (dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras) en la cual una o más de las regiones variables (VH y/o VL) ha sido remplazado por un dAb de la invención. En una modalidad, cada una de las regiones variables (regiones 2 VH y regiones 2 VL) es remplazada por un dAb o un dominio variable sencillo. Por lo menos uno de los cuales es un dAb de antígeno anti-objetivo de conformidad con la invención. Los dAbs o dominios de variable sencillos que son incluidos en el formato similar a IgG pueden tener la misma especificidad o diferentes especificidades. En algunas modalidades, el formato similar a IgG es tetravalente y puede tener uno (antígeno anti-objetivo únicamente) dos (v.gr., antígeno anti-objetivo y anti-SA), tres o cuatro especificidades. Por ejemplo, el formato similar a IgG puede ser mono específico y comprende 4 dAbs que tienen la misma especificidad; biespecífico y comprende 3 dAbs que tienen la misma especificidad y otro dAb que tiene una especificidad diferente; biespecífico y comprenden dos dAbs que comprenden especificidad y dos dAbs que tienen una especificidad común pero diferente; triespecifico y comprende primer y segundo dAbs que tienen la misma especificidad, un tercer dAb con una especificidad diferente y un cuarto dAb con una especificidad diferente del primer, segundo y tercer dAbs; o tetraespecífico y comprende cuatro dAbs que tienen cada uno una especificidad diferente. Fragmentos de unión a antígeno de formatos similares a IgG (v.gr., Fab, F(ab')2, Fab', Fv, scFv) pueden ser preparados. En una modalidad, los formatos similares a IgG o fragmentos de unión a antígeno de los mismos no entrelazan antígeno objetivo, por ejemplo, el formato puede ser monovalente para antígeno objetivo. Si la activación de complemento y/o función de citotoxicidad de unión dependiente de anticuerpo (ADCC) se desea, el ligando puede ser un formato similar a lgG1. Si se desea, el formato similar a IgG puede comprender una región constante mutada (región constante de cadena pesada de IgG variante) para reducir al mínimo la unión para receptores a Fe y/o capacidad para fijar complemento (véase, v.gr., Winter et al., GB 2,209,757 B; Morrison er al, WO 89/07142; Morgan et al, WO 94/29351 , 22 de Diciembre de 1994).

Los ligandos de la invención (polipéptidos, dAbs, agonistas y antagonistas) pueden ser formateados como una proteína de fusión que contiene un primer dominio variable sencillo de inmunoglobulina que es fusionado directamente a un segundo dominio variable sencillo de inmunoglobulina. Si se desea dicho formato, además puede comprender una porción de extensión de vida media. Por ejemplo, el ligando puede comprender un primer dominio variable sencillo de inmunoglobulina que es fusionado directamente a un segundo dominio variable sencillo de inmunoglobulina que es fusionado directamente a un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une a albúmina de suero.

Generalmente, la orientación del los dominios de polipéptido que tienen un sitio de unión con especificidades de unión para un objetivo, y si el ligando comprende un enlazador, es asunto de elección de diseño. Sin embargo, algunas orientaciones, con o sin enlazadores, pueden proveer mejores características de unión que otras orientaciones. Todas las orientaciones (v.gr., dAb1-enlazador-dAb2; dAb2-enlazador-dAb1 ) son abarcadas por la invención son ligandos que contienen una orientación que proveen características de unión deseadas pueden ser fácilmente identificadas por determinación selectiva.

Polipéptidos y dAbs de conformidad con la invención, incluyendo monómeros dímeros y trímeros de dAb, pueden ser enlazados a región de Fe de anticuerpo, que comprenden uno o ambos de los dominios de CH2 y CH3 y opcionalmente una región de gozne. Por ejemplo, vectores que codifican ligandos enlazados como una secuencia de nucleótidos sencilla a una región de Fe se pueden usar para preparar dichos polipéptidos. La invención además provee dímeros, trímeros y polímeros de los monómeros de dAb antes mencionados.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 Propósito del estudio El propósito del estudio fue obtener variantes resistentes a proteasa de fusiones de GLP-1 AlbudAb™ al realizar selección de fagos en una genoteca derivada de variante de GLP-1 que comprende GLP-1 resistente a DPP IV (referido aquí como *GLP-1) en combinación con tratamiento de fago con varias proteasas (incluyendo aquellas que ocurren naturalmente en el hospedero de expresión). Como se describe aquí, un AlbudAb™ es un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une específicamente a albúmina de suero.

Receptor de GLP-1 El receptor de péptido-1 similar a glucagón (GLP-1 R) pertenece a la familia B1 de siete receptores acoplados a proteína G de transmembrana. Las interacciones de unión entre el receptor y su ligando agonista natural GLP-1 es iniciado por unión del ligando a dominio N-terminal extracelular del receptor (ECD GLP-1 R) y seguido por interacción con el núcleo de la porción de transmembrana (Al-Sabah et al, 2003; FEBS Lett; 553(3): 342-6). Se ha mostrado que la unión de GLP-1 al dominio N-terminal aislado es retenida si el núcleo de transmembrana es removido, aunque la afinidad es reducida (López de Maturana et al, 2003; J. Biol. Chem; 278(12): 10195-200). Puesto que el uso del receptor entero no es deseable para selección de fagos en solución, debido a la solubilidad de solución deficiente de receptores con dominio de transmembrana en solución acuosa sin detergentes solubilizantes, el dominio extracelular aislado se usó para captura de fagos para simplificar el experimento y enriquecer moléculas de despliegue de fagos con afinidad a ECD GLP-1 R.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para el monómero Fe con etiqueta His de ECD GLP-1 R son como sigue: Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:1): ATGGCCGGCG CCCCCGGCCC GCTGCGCCTT GCGCTGCTGC TGCTCGGGAT GGTGGGCAGG GCCGGCCCCC GCCCCCAGGG TGCCACTGTG TCCCTCTGGG AGACGGTGCA GAAATGGCGA GAATACCGAC GCCAGTGCCA GCGCTCCCTG ACTGAGGATC CACCTCCTGC CACAGACTTG TTCTGCAACC GGACCTTCGA TGAATACGCC TGCTGGCCAG ATGGGGAGCC AGGCTCGTTC GTGAATGTCA GCTGCCCCTG GTACCTGCCC TGGGCCAGCA GTGTGCCGCA GGGCCACGTG TACCGGTTCT GCACAGCTGA AGGCCTCTGG CTGCAGAAGG ACAACTCCAG CCTGCCCTGG AGGGACTTGT CGGAGTGCGA GGAGTCCAAG CGAGGGGAGA GAAGCTCCCC GGAGGAGCAG CTCCTGTTCC TCAAGCTTGA GCCCAAATCG GCCGACAAAA CTCACACATC ACCACCGTCA CCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA CAACAGCACG TACCGGGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA TGAGCTGACC AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA CATCGCCGTG GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC CGTGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG TAAACATCAC CATCATCATC ACTGA Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:2): MAGAPGPLRL ALLLLGMVGR AGPRPQGATV SLWETVQKWR EYRRQCQRSL TEDPPPATDL FCNRTFDEYA CWPDGEPGSF VNVSCPWYLP WASSVPQGHV YRFCTAEGLW LQ DNSSLPW RDLSECEES RGERSSPEEQ LLFL LEPKS ADK.THTSPPS PAPELLGGPS VFLFPP D TL ISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKF WYV DGVEVHNAKT KPREEQY ST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTTSKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYS LTVDK.SRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG HH HHHH El GLP-1 R ECD también se expresó con una etiqueta IgG Fe, que permitió la purificación inicial de la proteína agarosa de proteína A. durante selecciones de fago, el receptor soluble entonces puede ser capturado usando esferas revestidas con proteína A.

Selecciones de fago de prueba Se realizaron pruebas para verificar que el dominio extracelular de receptor de GLP-1 se puede usar para selecciones de genoteca de despliegue de fagos.

Vector de fago Un vector de despliegue de fago filamentoso (fd), pDOM34 (que es un derivado de pDOM34) se usa, el cual se basa en vector fd con una myc tag y en donde una secuencia de proteína puede ser clonada entre sitios de restricción para proveer una fusión de proteína-gen III (pDOM3, como se describe en el documento WO 2007/085815, es un derivado del vector de fago Fd en el cual la secuencia de péptido de señal del gen III es remplazada por el péptido de señal de proteína de superficie anclada a glicolípido de levadura (GAS) (WO 2005/093074). También contiene una etiqueta c-myc entre la secuencia líder y el gen III, que pone al gen III de regreso en el marco).

Modificaciones de pDOM4 que conducen a pDOM34 incluyen: 1) desactivación del sitio Ncol en la posición 7476nt de pDOM4 2) Deleción de la etiqueta Myc fusionada al N-terminal de cplll 3) Introducción de sitio de restricción Ncol para facilitar la clonación directa después del péptido de señal.

Los genes que codifican repertorios de genoteca se clonaron como fragmentos de Ncol/Notl.

El vector se propagó en células E. coli Machi, aisladas con uso del kit Plasmid Mega Prep (Qiagen) y la fracción superenrollada fue aislada mediante centrifugación de gradiente de cloruro de cesio usando técnicas estándares (Sambrook y Maniatis 1989). El vector fue cortado con enzimas Ncol y Notl seguido por Pstl para reducir la tasa de autoligación. Después se realizó extracción con fenol/cloroformo, el ADN se precipitó con etanol y se purificó a partir del fragmento de ADN de "relleno" requerido entre los sitios Ncol y Notl sobre columnas Chromaspin TE-1000 (Clontech). Después de la purificación se usó ADN del vector para probar ligaciones con fragmentos de ADN de DAT-X diversificados.

Construcción de qenotecas de DAT-X Dieciocho repertorios se construyeron con base en la molécula progenitora de DAT-X que comprendía GLP-1 resistente a DPP IV, que posteriormente se denominó *GLP-1.

*GLP-1 (7-37): Secuencia de aminoácidos HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEF1AWLVKGRG (SEQ ID MO:3) Secuencia de nucleótidos: CATGGTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAA GCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGGCCGAGGA (SEQ ID NO:4) Las moléculas progenitoras de DAT-X además comprenden una fusión con DOM7h-14 (un anticuerpo de dominio (dAb) que se une a albúmina de suero (albudab; AlbudAb™)).

DOM7h-14: Secuencia de aminoácidos DIQMTQSPSSLSASVGDRWITCPvASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLUMWRSSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR (SEQ JD NO:5) Secuencia de nucleótidos: ÜACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACC GTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTG GTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTC CTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGAC AGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTAC TACTGTGCTCAGGGTGCGGCGTTGCCTAGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAG GTGGAAATCAAACGG (SEQ ID NO: 6) *GLP-1 y DOM7h-14 en molécula progenitora de DAT-X son conectados por enlazador helicoidal: Enlazador helicoidal: Secuencia de aminoácidos KEAAAKEAAAKEAAAKELAAKEAAAKEAAAKEAAAKELAA (SEQ ID NO: 7) Secuencia de nucleótidos: AAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCGGCGGCGAAAG AATTGGCCGCAAAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCG GCGGCGAAAGAATTGGCCGCA (SEQ ID NO: 8) Para cubrir la secuencia entera del *GLP-1 (excluyendo sitios que se sabe que son importantes para unión a receptor (como se describe, por ejemplo, en Sarrauste de Menthiere et al. Eur J Med Chem. 2004 Jun;39(6):473-80; Neidigh et al. Biochemistry. 2001 Nov 6;40(44): 13188-200; Hjorth et al. J Biol Chem. 1994 Dec 2;269(48):30121-4 y Gallwitz et al. Regul Pept. 7 de mayo de 1996; 63(l): 17-22)), se construyeron 17 repertorios usando un protocolo de PCR de ensamble mediante el uso de polimerasa de alta fidelidad Phusion (NEB) en un volumen de reacción de 50 microlitros. Cuatro nucleótidos distribuidos aleatoriamente por genoteca fueron introducidos por iniciadores en PCRs primarios y después el ensamble se realizó con iniciadores biotinilados. PCR sujeto a error usando Kit Mutazyme II kit (Stratagene), iniciadores biotinilados y 5-50 pg de plantilla para una reacción de 50 µ? introdujo mutaciones aleatorias dentro de *GLP-1. Debido a la longitud corta de la secuencia de nucleótido de *GLP-1 , la PCR sujeta a error se revisó dos veces, para incrementar la tasa de mutación.

Después de la digestión con Ncol y Notl, los insertos fueron purificados a partir de productos no digeridos con esferas revestidas con estreptavidina. La ligación de prueba se realizó en donde productos digeridos fueron ligados en pDOM34 en los sitios correspondientes.

La secuenciación de los clones de ligación de prueba confirmó la diversificación esperada en todas las genotecas después de lo cual siguió la ligación a escala completa y transformación de las genotecas. La ligación se realizó en un volumen total de 500 microlitros, con 1 microgramo del vector digerido e inserto en la relación 1 :2 con ADN ligasa de T4 (NEB). Cada genoteca fue transformada en dos pasos, 10 microlitros por 100 microlitros de células TB1 de E. co// electrocompetentes y después de la recuperación, 100 mi de medio durante 1 hr a 37°C con agitación, las genotecas se colocaron en placas cuadradas grandes (22 cm) que contenían agar 2XTY Tet. Las placas se hicieron crecer durante la noche y después se rasparon en 5 mi de 2xTY con 15% de glicerol para preparación de abastecimiento. Los tamaños de genoteca estaban en el intervalo de 107-108 transformantes.

Para preparación de genoteca de fagos, un cultivo de genoteca se inició mediante la inoculación de 100 microlitros de abastecimiento de glicerol en 200 mililitros de medio 2xTY que contenía antibiótico de tal manera que la densidad final del cultivo inmediatamente después de la inoculación no excedió ??ß?? = 0.1. Las genotecas se cultivaron durante la noche a aproximadamente 18 horas a 37°C con agitación. Se formaron pastillas con el cultivo por centrifugación y se prepararon genotecas de fagos por precipitación doble con PEG y se resuspendieron en PBS.

Varios clones de genotecas no seleccionadas se escogieron aleatoriamente para secuenciación, para confirmar la construcción de genotecas exitosa y la primera ronda de reconocimiento y selección seguida después de la preparación de la genoteca de fagos.

Los métodos de reconocimiento y selección, preparación de abastecimiento de glicerol y amplificación de fagos son como se describe más adelante a menos que se indique otra cosa.

El dominio extracelular del receptor de GLP-1 se usó para reconocimiento y selección. 100 microlitros de las genotecas de fagos se incubaron con 2% de Marvell PBS que contenía 100nM GLP-1 R. La incubación se llevó a cabo durante 1 hr a temperatura ambiente y después los fagos se combinaron con dinaesferas de proteína A pre-bloqueadas (2% Marvell PBS, 1 hr, T.A.) (Dynal). Después de una hora de incubación sobre una rueda giratoria a T.A. las esferas se lavaron en el sistema de purificación KingFisher (Thermo Electron Corporation) ocho veces con 0.1 % de Tween PBS (el robot KingFisher automatiza el proceso de lavado usando una sonda magnética para transferir las esferas de solución de lavado a solución de lavado) y fagos específicos fueron recuperados por elución en 500 microlitros de glicina 0.1 M pH 2.0. Después de la neutralización con 100 microlitros de Tris-CI 1 M, pH 8.0 se usaron fagos para infección de las células TG1 de E. coli en fase log durante 45 minutos a 37°C. Las células infectadas se colocaron sobre placas de agar Tet que se hicieron crecer durante la noche a 37°C. Los títulos de genotecas, entrada, salida y tamaño de genotecas se presentan en el siguiente cuadro.

Genoteca Tamaño de 1a selección; fago f/ml genoteca Entrada Salida 1 2.8 x 10" 3.9 x 101U 3.2 x 10' 2 1.2 x 10a 1.0 X 1011 1.0 x 10° 3 2.4 x 10' 4.6 x 101U 7.0 x 103 4 8.0 x 10' 1.0 x 1011 8.0 x 10b 5 4.0 x 10' 2.6 x 10a 1.0 X 10' 6 8.0 x 10' 7.3 x 10lü 6.0 x 10° 7 4.0 x 10' 8.0 x 10a 6.0 X 10" 8 2.8 x 10' 5.4 x 10a 1.0 x 10' 9 6.8 x 10' 9.4 x 10s 5.0 x 10° 10 2.0 x 10B 5.7 x 10a 1.5 x 10 1 1 8.8 x 10B 4.5 x 10a 2.0 x 10° 12 6.6 x 10H 4.0 x 10a 1.6 x 10° 13 1.8 x 10B 6.7 x 101U 2.0 x 105 14 4.8 x 10' 6.0 x 10a 3.0 x 10a 15 6.0 x 10' 4.2 x 101U 1.0 x 10" 16 2.4 x 10a 1 6 x 101U 4.8 x 10a 17 4.2 x 10B 1.3 x 10lu 1.4 x 10B 18 sujeto a error 1.5 x 10B 2.5 x 10a 6.0 x 105 Auto-ligación 4.0 x 10s DAT-X control - 4 0 x 10a 1.8 x 10' La primera ronda de selección produjo una salida razonable para todas las genotecas.

Los abastecimientos de glicerol se prepararon raspando las colonias de placa de agar con 2 mi de medio 2XTY que contenía 15% de glicerol y se puso en alicuotados en tubos criogénicos.

Las siguientes selecciones se realizaron en el fago en acervo. El fago amplificado se obtuvo combinando el cultivo de los gliceroles de E. coli que contenían salidas de la primera selección de todas las 18 genotecas. El cultivo se inició mediante la inoculación de 50 microlitros de cada abastecimiento de glicerol de genoteca reconocida y seleccionada en 1 litro de medio 2xTY con antibiótico. El cultivo se dividió en 21 matraces con agitador, medio litro en cada uno y cultivados durante la noche a 37°C con agitación, 250 rpm. El fago se preparó después del 18-20 hr del cultivo mediante precipitación individual con PEG y resuspensión en PBS.

Selección de genotecas de despliegue de fagos DAT-X con proteasa El fago amplificado de la salida de la 1a. selección se usó para las selecciones posteriores con concentración constante de GLP-1 R, 100 nM. Además, antes de la selección con tripsina, un lote de fago de la salida de la primera selección se subclonó con la mutación R108W en la secuencia AlbudAb. Esta mutación hace al clon Vkappa AlbudAb más resistente para tratamiento con tripsina cuando se despliega en fagos. Esto es debido a que el residuo de arginina en el carboxi terminal del dAb que enlaza el anticuerpo de dominio a la proteína plll es sensible a la tripsina. La mutación en este sitio remueve el sitio de digestión de tripsina, y mejora la dirección de selecciones de proteasa a la región deseada del péptido objetivo. Por lo tanto, dos lotes de fago, con o sin la mutación R108W en AlbudAb, se usaron fácilmente en la segunda ronda de selección.

El fago se trató con las proteasas tripsina o quimiotripsina a diferentes concentraciones o se dejó sin tratar antes de la incubación con receptor de 1 hr a temperatura ambiente. Los títulos de la 2a. selección (f/ml) se presentan en el siguiente cuadro.

Las salidas de fago de cada selección (0 µg/ml-10 µg/ml) fueron amplificadas por inoculación de 50 microlitros de abastecimiento de glicerol en 50 mililitros de 2xTY con Tet y cultivo durante la noche, 20 hr a 37°C con agitación. El fago purificado se usó para la tercera ronda de selección, con las mismas condiciones de incubación.

Los títulos de la 3a. selección (f/ml) se presentan en los siguientes cuadros.

Debido a que la diversidad de clones ya ha disminuido después de la 3a ronda, como se verificó por secuenciación de colonia de un conjunto de clones representativos, unos cuantos clones de salidas de selección se expresaron como proteínas solubles como se detalla más adelante.

Salidas de selección de qenotecas de despliegue de fagos DAT- X Varias variantes de *GLP-1 se escogieron para ser clonadas como una fusión con AlbudAb pero con enlazadores alternativos como se describe más adelante, expresados, purificados y probados en la prueba de receptor de GLP-1 . Sus secuencias de aminoácidos se exponen como secuencias de 1 -10 (véase figura 1). Una vanante de secuencia de *GLP-1 (secuencia 7) estuvo presente abundantemente en salidas de selecciones con tratamiento tanto de quimotripsina como de tripsina y como una fusión es denominada DMS7149, dos estaban presentes en salidas cuando la quimotripsina se usó (DMS7150 (secuencia 8) y 51 (secuencia 9)), una se observó en las salidas en donde sólo proteasas naturales actuaron en las células durante la expresión y secreción de fagos y no se usó pre-tratamiento con tripsina o quimotripsina (DMS7148 (secuencia 6)) y una se clonó para crear una desactivación de sitios de digestión de tripsina (DMS7152 (secuencia 10)).

Las proteínas con las secuencias de aminoácidos 1-4 (véase figura 1 ) se probaron y mostraron baja potencia en relación con GLP-1 y variante DAT-X de control. La secuenciación de Edman sugirió que las proteínas fueron erróneamente procesadas.

La clonación se realizó al introducir mutaciones en el clon DAT-Y que comprendía *GLP-1 enlazado a DOM7h-14 por un enlazador alternativo que tenía la secuencia de aminoácidos: PSS (SEQ ID NO: 9) y secuencia de nucleótidos: CCAAGCTCG (SEQ ID NO: 10).

Se introdujeron mutaciones escogidas a la secuencia de *GLP-1 por iniciadores en PCR primaria y en la PCR de ensamble los sitios de digestión Ncol y BamHI se introdujeron en los extremos 5' y 3' respectivamente de la secuencia de fusión.

La PCR de ensamble fue digerida con endonucleasas de restricción en Ncol y BamHI.

El vector de expresión pDOM35 se preparó para clonación.

El vector pDOM35 es un derivado de pET12a con modificaciones: • Los últimos tres residuos de péptido de señal OmpT se cambiaron de SFA a AWA, que mejora el procesamiento en el sitio correcto por la peptidasa de señal de E. coli.

· El sitio Ncol fue introducido para facilitar la clonación directa después del péptido de señal.

• Una "secuencia de relleno" está presente entre el sitio Ncol y BamHI. pDOM35 fue digerido con Ncol y BamHI y las PCRs de ensamble de corte fueron ligadas en el vector con el uso del kit Quick Ligation Kit (NEB). 2 microlitros de ligación se usaron para transformación de células Machi y después de la recuperación de células se colocaron sobre placas de agar que contenían carbenicilina y se hicieron crecer durante la noche. Las colonias fueron secuenciadas y las que contenían secuencias correctas se usaron para propagación de plásmido y su aislamiento (Plasmid Mini Prep kit, Qiagen). Células BL21 (DE3) fueron transformadas con ADN de plásmido y las colonias resultantes se usaron para inoculación de cultivo de expresión.

La expresión se realizó por inoculación de un cultivo de 50 mililitros de medio 2xTY complementado con soluciones de autoinducción Overnight Express™ (1 mililitro de solución 1 (Cat. No. 71298), 2.5 mililitros de solución 2 (Cat. No. 71299), 50 microlitros de solución 3 (Cat.No 71304), Novagen) y 100 microgramos por mililitro de carbenicilina. El cultivo se llevó a cabo durante la noche a 37°C, y después el sobrenadante de cultivo se aclaró por centrifugación a 3700xg durante 45 minutos. La proteína expresada fue después purificada del sobrenadante aclarado usando línea de flujo de proteína L (GE Healthcare, Cat.No. 28-4058-03, proteína L acoplada), y se eluyó a partir de la proteína L usando glicina 0.1 M, pH 2.0, después se neutralizó usando 0.2 volúmenes de Tris 1 M pH 8.0.

La porción de variante *GLP-1 de DMS7148 se clonó después como DMS7161 de fusión (secuencia 1 1) con albudab de afinidad más alta, DOM7h-1 -10, y se conectó por el enlazador de PSS alternativo, en el pDOM35 como se describió anteriormente.

DOM7h-14-10 Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22): DIQMTQSPSSLSASVGDRVT1TCRASQW1GSQLSWY0QKPGKAPI LL1MWRSSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGT VEIKR Secuencia de nucleótidos (SEQ. ID NO:23): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACC GTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTG GTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTC CTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGAC AGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTAC TACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAG GTGGAAATCAAACGG Después de que el ADN del plásmido pDO 35 que comprende la secuencia de DMS7161 fue transformado en BL21 (DE3), el abastecimiento de glicerol se preparó a partir de colonias de crecimiento, raspando colonias en un medio mínimo con glucosa y mediante la adición de glicerol, concentración final de aproximadamente 15%. La expresión de DMS7161 se inicio por inoculación del glicerol de medio mínimo (DMS7161 A) complementado en extracto de levadura para concentración final de 10 g/litro (DMS7161 B) para obtener la densidad de cultivo inicial de DO600=0.024. El cultivo se hizo crecer a DO600 de aproximadamente 1.4 a 30°C, después fue inducido por la adición de 0.1 mM isopropil-beta-d-tiogalactósido. El cultivo se continuó durante 24 horas adicionales a 23°C y después el sobrenadante de cultivo fue aclarado por centrifugación a 3700xg por 45 minutos. La proteína expresada fue purificada después a partir del sobrenadante aclarado usando proteína L, y se eluyó de la proteína L (GE Healthcare, Cat.No. 28-4058-03, acoplada a la proteína L) usando 0.1 M de glicina pH 2.0, después neutralizado usando 2.0 volúmenes de Tris 1 M, pH 8.0.

Control de calidad de DMS7148-52 Las proteínas DMS7148-52 fueron expresadas y visualizadas sobre SDS-PAGE no reductor, los clones DMS7148 y DMS7161 fueron expresados en E. coli con la mayor parte del material migrando al tamaño esperado (figuras 2, 3 y 4). La espectroscopia de masa (figuras 5A-5F) y análisis de secuenciación de Edman confirmaron la integridad de la secuencia. Todas las otras proteínas fueron degradadas en el sitio de amino y carboxilo de 25-triptofano (productos 24-142 y 26-142, respectivamente) en donde DMS7148 contenía mutación de W25-D y el ácido aspártico no creo un sitio de digestión para la proteasa natural que actúa en células de E. coli (figuras 5A a 5F). El producto de degradación 28-142 también se observó en los clones restantes.

La proteína DMS7148 se probó en actividad por una prueba de unión a receptor de GLP-1 de conformidad con el siguiente protocolo: Antecedentes: GLP-1 R es un receptor acoplado a proteína G de 7TM que se expresa en células CHO. La activación del receptor por GLP-1 o dichos análogos, conduce a la conversión de ATP a AMPc por adenilato ciclasa que es acoplada al receptor. Células CHO son establemente transfectadas con gen reportero de 6CRE/luc. Durante la producción de AMPc después de activación de GLP-1 del receptor, el gen promotor (que contenía seis copias del elemento de respuesta a AMPc -6CRE) impulsa la expresión del gen reportero de luciferasa. Este después cataliza una reacción con luciferina para producir luz que se puede medir en un luminómetro.

Protocolo: células CHO 6CRE GLP-1 R (células CHO Kl establemente transfectadas con seis elementos de respuesta a AMPc que impulsa un gen reportero de luciferasa y también con receptor de GLP-1 humano) se sembraron a 2 x 105 células/ml en medio de suspensión. El cultivo de suspensión se mantuvo durante 48 horas. Las células después se diluyeron en 15mM de HEPES, 2 mM de L glutamina (2.5 x 105 células/ml) y se suministraron a placas de 384 pozos que contenían 10 ul/pozo del compuesto para ser analizados. Después de la adición de controles de prueba, las placas regresaron a la incubadora durante 3 horas a 37°C y 5% de C02. Después de la incubación, el sustrato de luciferasa constante (Promega) se añadió a los pozos como se describe en el Kit y las placas se sellaron con sellos de placa autoadhesivos (Weber Marking Systems Inc. Cat. No. 607780).

Las placas se colocaron en el lector (Packard TopCount) y se pre-incubaron durante 5 minutos antes de leer la fluorescencia y graficar los resultados. El compuesto se probó a un intervalo de curva de concentraciones-respuesta para ser ajustada a partir de la cual se calcularon pC50s.

Se encontró que la proteína DMS7148 era activa, sin embargo menos activa que el péptido GLP-1 (figura 6 y resumido a continuación): Molécula pEC50 % de respuesta máxima DMS 7148 9.45 107 GLP 7-36 1 1.92 97 DMS7 61 se probó para actividad en una prueba de GLP-1 de conformidad con el siguiente protocolo: Método Células CHO 6CRE GLP-1 R fueron descongeladas rápidamente por inmersión a la mitad de los frascos en un baño de agua a 37°C, y los contenidos de los frascos fueron transferidos a un tubo falcon de 50 mi y 10 mi de medio de prueba RPMI (libre de rojo de fenol) (Sigma, cat# Rl 509) + 2mM L-glutamina (Gibco, cat # 25030) + 15 mM de HEPES (Sigma, cat # H0887) añadido por frasco. Después de contar y centrifugar a 1200 rpm por 5 minutos las células se resuspendieron en un volumen apropiado de medio de prueba RPMI para dar 1x106 células por mi y 50 µ? suministradas en cada pozo de una placa de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pozos (placa de cultivo de tejido de 96 pozos Costar, estéril blanca, cat # 3917J.I_as células se incubaron durante la noche a 37C/5%C02. El día siguiente las células fueron removidas de la incubadora y 50 µ? de control/muestra previamente preparados se añadió a los pozos y la placa se regresó a la incubadora durante 3 horas a 37°C y 5% C02.

Preparación de control de GLP-1 (7-36) (Siqma, cat # G8 4) En una placa de 96 pozos con fondo en V y 2 µ? de 1 mg/ml GLP-1 (7-36) a 18 µ? de medio de prueba RPMI para dar una solución 30 µ?. Se añadieron 2 µ? de la solución 30 µ? a 298 µ? de medio de prueba RPMI para dar una solución 200 nM (para una concentración final en la prueba de 100 nM). Se diluyó en serie el control 1 :10 a la placa (15 µ? de control + 135 µ? de medio de prueba RPMI) para generar curva de 8 puntos.

Preparación de control de Exendina-4 (Siqma, cat #E7144) En una placa de 96 pozos con fondo en V se añaden 2 µ? de 1 mg/ml Exedina-4 a 188 µ? a medio de prueba RPMI para dar una solución 2.39 µ?. Se añadieron 2 µ? de la solución 2.39 µ? a 237 µ? de medio de prueba RPMI para dar una solución 20 nM (para una concentración final en la prueba de 10 nM). Se diluye en serie el control 1 :10 a la placa (15 µ? de control + 135 µ? de medio de prueba RPMI) para generar curva de 8 puntos.

Preparación de muestras desconocidas Se usan los mismos lineamientos para la preparación de los controles para la preparación de las muestras desconocidas. Se hacen concentraciones superiores a dos veces la concentración de prueba final requerida y se diluyen 1 :10 en la placa.

Preparación de luciferasa (Promeqa, cat # E2620) Se remueve el número requerido de alícuotas de luciferasa Bright-Glo del congelador y se dejan descongelar hasta temperatura ambiente en la oscuridad. Un frasco de 5 mi es suficiente para una placa de prueba.

Después del tiempo de incubación, 50 µ? de reactivo de luciferasa Bright-Glo se añadió a los pozos y la placa se incubó a temperatura ambiente durante tres minutos para permitir que ocurriera la lisis de células. La luminiscencia (conteos por segundo) se leyó usando el lector de microplaca M5e registrando cada pozo durante 0.1 segundos. CPS de los pozos de fondo que contenían células únicamente, se sustrajo de los otros pozos. Los pozos de control (GLP- 1 (7-36) o Exendina-4) deben presentar estimulación máxima a las concentraciones más altas. Las curvas de efecto de concentración de la muestra desconocida se ajustan a partir de las cuales EC50 se calcula con el uso de software GraphPad Prism o ExcelFit.

DMS7161 es potente con EC50 entre 1.6 y 3.4 nM como se muestra en la figura 7 y como se resume a continuación.

EC50 (M) pEC50 3.6E-09 8.45 3.4E-09 8.47 1.6E-09 8.79 Se encontró que DMS7161 es tan activo como DMS7148.

Sumario La selección de fagos de fusión de péptidos diversificadas que fue naturalmente muy sensible a proteasas y se degrada durante la expresión en E. coli les permitió a los inventores de la presente identificar la fusión de variante de *GLP-1 que es resistente a proteasas bacterianas naturales y lo mismo es expresable en E. coli. Los sitios de proteasa que fueron privados en este clon son similares a estos reconocidos por tripsina y quimiotripsina, sin embargo esta secuencia no estuvo presente en las salidas de las selecciones con tratamiento con tripsina y quimiotripsina adicional.

CUADRO DE SECUENCIAS Secuencia SEQ. ID NO: Secuencia de nucleótidos de monómero de Fe 1 etiquetado con His de ECD GLP-1 R Secuencia de aminoácido de monómero de Fe 2 etiquetado con His de ECD GLP-1 R Secuencia de aminoácidos de *GLP-1 (7-37) 3 Secuencia de nucleótido de *GLP-1 (7-37) 4 Secuencia de aminoácidos de DOM7h- 4: 5 Secuencia de nucleótido de DOM7h-14: 6 Secuencia de aminoácidos de enlazador helicoidal: 7 Secuencia de nucleótidos de enlazador helicoidal: 8 PSS 9 Secuencia de nucleótidos de PSS: 10 DMS7190 11 DMS7191 12 DMS7192 13 DMS7193 14 DMS7194 15 DMS7148 16 DMS7 49 17 DMS7150 18 DMS7151 19 DMS7152 20 DMS7161 21 Secuencia de aminoácidos de DOM7h-14-10 22 Secuencia de nucleótidos de DOM7h-14-10 23

Claims (55)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un método para seleccionar un péptido o polipéptido resistente a proteasa a partir de un repertorio de péptidos o polipéptidos, que comprende proveer un repertorio de péptidos o polipéptidos; incubar el repertorio y una proteasa bajo condiciones adecuadas para actividad de proteasa; y recuperar un péptido o polipéptido que tiene una actividad biológica deseada, por lo que un péptido o polipéptido resistente a proteasa es seleccionado. 2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el repertorio es expresado en un sistema de despliegue y la proteasa es endógena al sistema de despliegue. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el sistema de despliegue es bacterias y la proteasa es una proteasa expresada en bacterias. 4. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque comprende adicionalmente combinar el repertorio y una proteasa adicional bajo condiciones adecuadas para dicha actividad de proteasa adicional. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dichas condiciones son (i) aproximadamente 10 µ?/?t?? a aproximadamente 3 mg/ml de la proteasa adicional, (ii) aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C y (iii) por lo menos durante aproximadamente 30 minutos. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque para dichas condiciones (i) es aproximadamente 10 a aproximadamente 100 pg/ml la proteasa adicional. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizado además porque para dichas condiciones (ii) es aproximadamente 30 a aproximadamente 37°C. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado además porque para dichas condiciones (iii) es por lo menos aproximadamente una hora. 9. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado además porque dicha proteasa adicional se selecciona de una proteasa encontrada en suero, esputo, moco (v.gr., moco gástrico, moco nasal, moco bronquial), lavado broncoalveolar, homogenado de pulmón, extracto de pulmón, extracto pancreático, fluido gástrico, saliva o lágrimas. 10. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque dicha proteasa o proteasa adicional comprende uno o más de los siguientes, serina proteasa, cisteína proteasa, aspartato proteasas, tiol proteasas, metaloproteasa de matriz, carboxipeptidasa (v.gr., carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa B), tripsina, quimiotripsina, pepsina, papaína, elastasa, leucozima, pancreatina, trombina, plasmina, catepsinas (v.gr., catepsina G), proteinasa (v.gr., proteinasa 1 , proteinasa 2, proteinasa 3), termolisina, quimiosina, enteropeptidasa, caspasa (v.gr., caspasa 1 , caspasa 2, caspasa 4, caspasa 5, caspasa 9, caspasa 12, caspasa 13), calpaína, ficaína, clostripaína, actinidaína, bromelina, separasa y dipeptidilo peptidasa IV (DPP-IV). 1 1.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha proteasa o proteasa adicional es tripsina o quimiotripsina. 12.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una proteasa es provista por un extracto biológico, homogenado biológico o preparación biológica. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho extracto biológico, homogenado biológico o preparación biológica se selecciona del grupo que consiste de suero, esputo, moco (v.gr., moco gástrico, moco nasal, moco bronquial), lavado broncoalveolar, homogenado de pulmón, extracto de pulmón, extracto pancreático, fluido gástrico, saliva o lágrimas. 14. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque dicha actividad biológica deseada es actividad de unión. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicha actividad de unión es unión a ligando genérico. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho ligando genérico es proteína A, proteína G o proteína L. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicha actividad de unión es unión específica a un ligando objetivo. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho ligando objetivo es receptor de GLP-1. 19.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el péptido o polipéptido que tiene una actividad biológica deseada es recuperado por reconocimiento y selección. 20. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque dicho repertorio comprende un sistema de despliegue. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicho sistema de despliegue se selecciona del grupo que consiste de despliegue de bacteriófagos, despliegue de ribosoma, compartimentalización y despliegue de emulsión, despliegue de levadura, despliegue de puromicina, despliegue de bacterias, despliegue sobre plásmido, o despliegue covalente. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 20 ó 21 , caracterizado además porque dicho sistema de despliegue enlaza la función codificante de un ácido nucleico y características funcionales del péptido o polipéptido codificadas por el ácido nucleico. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 20, 21 ó 22, caracterizado además porque dicho sistema de despliegue comprende paquetes genéticos replicables. 24. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado además porque dicho sistema de despliegue comprende despliegue de bacteriófagos. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el sistema de despliegue de bacteriófagos es multivalente. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicho bacteriófago se selecciona del grupo que consiste de fd, M13, lambda, MS2 y 17. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el péptido o polipéptido es desplegado como una proteína de fusión de plll. 28. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el péptido o polipéptido es amino-terminal a dominio 1 de plll. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque comprende adicionalmente amplificar el ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido que tiene una actividad biológica deseada. 30. - El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicho ácido nucleico es amplificado por amplificación de fagos, crecimiento celular o reacción en cadena de polimerasa. 31. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque dicho repertorio es un repertorio de dominio variable sencillo de inmunoglobulinas. 32.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un dominio variable de cadena pesada. 33. - El método de conformidad con la reivindicación 32, caractenzado además porque dicho dominio variable de cadena pesada es un dominio variable de cadena pesada humano o humanizado. 34. - El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un dominio variable de cadena ligera. 35. - El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho dominio variable de cadena ligera es un dominio variable de cadena ligera humano o humanizado. 36. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para seleccionar un péptido o polipéptido que se une a un ligando objetivo con alta afinidad a partir de dicho repertorio de péptidos o polipéptidos. 37. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la proteasa se usa a aproximadamente 100 pg/ml, y el repertorio y proteasa combinados son incubados a aproximadamente 37°C por lo menos durante aproximadamente hora. 38. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque cada uno de dicho polipéptido es un péptido que se une a un objetivo; el repertorio es provisto por un sistema de despliegue de fagos que despliega un repertorio de péptidos; en el paso de incubación, los fagos son expresados en bacterias bajo condiciones adecuadas para expresión de proteasa bacteriana (la primera proteasa); y en el paso de combinación, el sistema de despliegue de fagos se combina con una segunda proteasa seleccionada de tripsina y quimiotripsina bajo condiciones adecuadas para segunda actividad de proteasa; y en el paso de recuperación un fago que despliega un polipéptido que comprende un péptido que se une a dicho ligando objetivo es recuperado. 39. - Un método de producción de un repertorio de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa, que comprende llevar a cabo el método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde en dicho paso de recuperación una pluralidad de péptidos o polipéptidos que tienen una actividad biológica deseada son recuperados, por lo que se produce un repertorio de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa. 40 - El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque el repertorio de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa es un repertorio intacto. 41.- El método de conformidad con la reivindicación 39 ó 40, caracterizado además porque comprende adicionalmente combinar una tercera proteasa con el repertorio de péptidos o polipéptidos resistentes a proteasa bajo condiciones adecuadas para actividad de la tercera proteasa; y recuperar por lo menos un péptido o polipéptido que tiene una actividad biológica deseada, por lo que por lo menos un péptido o polipéptido que es resistente a la tercera proteasa es seleccionado. 42.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque la tercera proteasa es como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 43.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la relación (sobre una base de mol/mol) de proteasa a péptido o polipéptido en dicho repertorio es 8,000 a 80,000 proteasa:péptido o polipéptido. 44. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la relación (sobre una base de peso/peso) de proteasa a péptido o polipéptido en dicho repertorio es 1 ,600 a 160,000 proteasa: péptido o polipéptido. 45. - Un péptido o polipéptido aislado resistente a proteasa selecciónatele o seleccionado por el método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 46. - Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina aislado resistente a proteasa seleccionable o seleccionado por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 44. 47. - El uso de un agonista de receptor de GLP-1 aislado que es resistente a uno o más proteasa seleccionada de tripsina y quimiotripsina cuando se incuba con la proteasa bajo las condiciones de (i) aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 3 mg/ml proteasa, (ii) aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C y (iii) por lo menos durante aproximadamente 30 minutos (v.gr., bajo la condición de 100 pg/ml o proteasa a 37°C por lo menos durante una hora), para la elaboración de un medicamento para tratar y/o prevenir diabetes en un paciente. 48. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 47, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por inyección al paciente. 49. - Un ácido nucleico aislado que codifica un péptido, polipéptido o dominio variable resistente a proteasa de la reivindicación 45 ó 46 o un agonista como se define en cualquiera de las reivindicaciones 47 ó 48. 50. - Un ácido nucleico recombinante que codifica un péptido, polipéptido o dominio variable resistente a proteasa de la reivindicación 45 ó 46 o un agonista como se define en cualquiera de las reivindicaciones 47 ó 48. 51. - Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 49 ó 50. 52. - Una célula hospedera que comprende el vector de la reivindicación 51. 53. - Un método para hacer un péptido o polipéptido resistente a proteasa seleccionable o seleccionado por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 44 o un agonista como se define en cualquiera de las reivindicaciones 47 a 48, que comprende mantener una célula hospedera que contiene un ácido nucleico recombinante que codifica el péptido o polipéptido resistente a proteasa, agonista o antagonista bajo condiciones adecuadas para expresión, por lo que un péptido o polipéptido resistente a proteasa, agonista o antagonista es producido. 54 - Un péptido o polipéptido resistente a proteasa seleccionable o seleccionado por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 44 para usarse en medicina. 55.- El uso de un péptido o polipéptido resistente a proteasa o dominio variable seleccionable o seleccionado por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 44, para la elaboración de un medicamento para tratar y/o prevenir una enfermedad.