MX2012006462A - Fusiones de albumina bche para el tratamiento de abuso de cocaina. - Google Patents
Fusiones de albumina bche para el tratamiento de abuso de cocaina.Info
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Abstract
Se describe un método para atenuar un efecto biológico de exposición a cocaína en un primate. Tal método incluye administrar al primate una cantidad de una proteína de fusión BChE-albúmina que comprende las sustituciones de aminoácido A227S, S315G, A356W, y Y360G, en donde la cantidad de la proteína de fusión es efectiva para provocar la atenuación del efecto biológico de la exposición a cocaína en el primate.
Description
FUSIONES DE ALBÚMINA BCHE PARA EL TRATAMIENTO DE ABUSO DE
COCAÍNA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a un método para atenuar un efecto biológico de exposición a cocaína en un primate.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El abuso y dependencia de cocaína tiene consecuencias médicas y sociales desastrosas que han hecho el desarrollo de un tratamiento efectivo una alta prioridad (Pan, Y., Gao, D., Yang, W., Cho, H., Yahg, . G . , Tai, H., Zhan, C, "Gompütational redesign of human butyrylcholinesterase for anticocaine medication", · PNAS, 102 (46) : 16656-61, 2005) . Sin embargo, como se establece por Briinijoin y colaboradores .: "there is no reliable means to treat cocaine overdose or reduce -the likelihood of relapse in users who have achieved abstinence Human plasma butyrylcholinesterase (BChE) contributes to normal cocaine metabolism and has been considered for use in. treating cocaine toxicity" (Brimijoin, S., Gao, Y., Anker, J., Gliddon, L., LaFleur, D., Shah, R., Zhao, Q. , Singh, M., Carroll, M., "A Cocaine Hydrolase Engineered from Human Butyrylcholinesterase Selectively Blocks Cocaine Toxicity and Reinstatement of Drug Seeking in Rats",
Neuropsychopharmacology, 33:2715-25, 2008).
La BChE de tipo natural, aunque es importante para el metabolismo de la cocaína en el cuerpo, tiene baja eficiencia catalítica con la cocaína. La baja actividad de la cocaína hidrolasa de la BChE de tipo natural requeriría el uso de cantidades prohibitivamente grandes de enzima purificada para el tratamiento · de abuso o sobredosis de cocaína. La mutagénesis realizada en la BChE humana con la meta de aumentar la actividad de la cocaína hidrolasa dio por resultado el desarrollo del mutante doble A328W/Y332A (residuos 356 y 360 relativos a la BChE de longitud' completa) que tiene una Kca . que es 40 veces mayor que la BChE de tipo natural, con solo una KM ligeramente incrementada (Sun H., Shen M., Pang Y., Lockridge O., Brimijoin S., "Cocaine Metabolism Accelerated by a Re-Engineered Human Butyrylcholinesterase" Journal of Pharmacology ' and Experimental Therapeutics, 302 (2) :. 710-716, 2002).
La experimentación adicional que utiliza la dinámica molecular para simular el estado de transición para la primera etapa de reacción química de la hidrólisis de la cocaína catalizada con BChE dio por resultado el mutante de BChE A227S/S315G/A356W/Y360G que tiene una eficiencia catalítica que es 500 veces mayor que la BChE de tipo natural y es mayor que los otros imitantes de BChE previamente diseñados (Pan, Y., Gao, D., Yang, W., Cho, H., Yang, G. , Tai, H., Zhan, C, "Computational redesign of human butyrylcholinesterase for anticocaine medication", PNAS, 102 (461:16656-61, 2005) .
Para obtener una forma del mutante de BChE A227S/S315G/A356 /Y360G que puede ser adecuado para uso terapéutico, el mutante de BChE diseñado por Pan y colaboradores . se fusionó en su C-terminal a la albúmina de suero humano (HSA) debido a que se ha observado que fusiones similares muestran propiedades farmacocinéticas favorables con alta estabilidad y vidas medias en plasma prolongadas. Se observó que la fusión de BChE-albúmina que comprende las mutaciones anteriores retiene alta eficiencia catalítica con la cocaína y muestra .una vida media en plasma de 8 horas después de la inyección i.v. a ratas. (Brimijoin S.., Gao, Y., Anker J., Gliddon L., LaFleur D., Shah R., Zhao, Q. , "A Cocaine Hydrolase Engineered from Human Butyrylcholinesterase Selectively Blocks Cocaine Toxicity and Reinstatement of Drug Seeking in Rats" Neuropsycopharmacology, 33:2715-25, 2008).
Hasta la fecha, no ha habido un método efectivo para tratar el abuso o sobredosis de cocaína en primates desarrollados que utilice una fusión de BChE-albúmina que comprende las mutaciones A227S, S315G, A356W, e Y360G.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La Invención' objeto proporciona un. método.' para atenuar un efecto biológico de una exposición a cocaína en un primate que comprende administrar al primate una cantidad de una proteína de fusión que comprende
(a) un polipéptido de butirilcolinesterasa (BChE) mutante que comprende la secuencia
EDDIIIATK GKVRGM LTVFGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNA TKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPOTDLSEDCLYL VWIPAP PK ATVLI IYGG GFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSM YRVGALGFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLA LQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLLSPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWA VTSLYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNKDPQEILLNEAFWPYGTPLGV F
GPTVDGDFLTDMPDILLELGQFK TQILVGV KDEGTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRK EFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTD VDDQRPENYREALGDWGDYNFICPALEFT KKFSE GN AFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYEIEFVFGLPLERRDNYTKAEEILS RSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPWKSTEQKYLTL TESTRIMTKLRAQQCRF TSFFPKV ( SEQ ID NO : 1) ,
(b) un polipéptido de albúmina de suero humano (HSA) que comprende la secuencia,
DAHKSEVAHRFKDLGEENF ALVLIAFAQYLQQCPFEDHV LVNEV EFAKTCVADES AE CDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNP LPRLV RPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADK AACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVS KLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICE QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCI AEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKOTAEAKDWLGMFLYEYARRHPDYSWLLLR LAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNA LLVRYTK VPQVSTPTLVEVSR LGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVtJSIQLCVLH
E TPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF AETFTFHADICTLSEKERQ I KQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVE CCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGL (SEQ ID NO: 2), y
(c) un péptido señal que comprende la secuencia MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG (SEQ ID NO: 3),
en donde la cantidad de ' la proteína de fusión es efectiva para provocar la atenuación del efecto biológico de la exposición a cocaína en el primate.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 (SEQ ID NO: 4) muestra la secuencia de aminoácidos de AlbuBChE, una proteína de fusión de BChE-albúmina que comprende las mutaciones A227S, S315G, A356 , e Y360G.
La Figura 2 muestra el perfil de concentración en suero de AlbuBChE-tiempo en monos cynomolgus individuales después de una sola administración IM de una dosis de 0.2, 1 o 5 mg/kg de AlbuBChE (escala lineal panel superior-, escala semi-logarítmica panel inferior) .
La Figura 3' muestra el perfil de concentración media en suero de AlbuBChE-tiempo en monos cynomolgus después de una sola administración IM de una dosis de 0.2, 1 o 5 mg/kg de AlbuBChE (escala lineal, panel superior, escala semi-logarítmica panel .inferior) .
La Figura 4A-4B muestra la concentración media de cocaína versus tiempo en animales de control (n=2) y como una función de tiempo después de la dosis AlbuBChE (n=3) .
La Figura 5A-5B muestra la concentración media de benzoilecgonina versus. tiempo en animales de control (n=2) y como una función de tiempo la después de la dosis de AlbuBChE La Figura 6A-6B muestra la concentración media de éster metílico de ecgonina versus tiempo en animales de control (n=2) y como una función de tiempo la después de la dosis de AlbuBChE (n=3) .
La Figura 7 muestra una comparación del perfil de concentración media de cocaína-tiempo para el grupo de control de cocaína del Día 1 con la después de la administración de AlbuBChE del Día 11 (240 horas) a 0.2, l o 5 mg/kg.
La Figura 8 muestra el análisis de ' PK/PD de
AlbuBChE en monos cynomolgus después de una sola administración IM de una dosis de 0.2, 1 o 5 mg/kg de AlbuBChE. La cocaína se administró IV en una dosis de 1 mg/kg en animales de control o a 2, 48, 96, 120 y 240 horas después de la dosis de AlbuBChE.
La Figura . 9 muestra procesos metabólicos de la cocaína .
La Figura 10 muestra la AUC(o-ti después de una dosis IV de 1 mg/kg de cocaína en animales de control (?=2)· y como una función de tiempo la después de la dosis de AlbuBChE n=3) .
La Figura 11 muestra .la AUC(0-t) de la benzoilecgonina después de una dosis IV de 1 mg/kg de cocaína en animales de control (n=2) y como una función de tiempo la después de la dosis de AlbuBChE <n=3) .
La Figura 12 muestra el perfil de concentración en suero de AlbuBChE-tiempo en monos ardilla individuales después de una sola administración IM de una dosis de 5 mg/kg de AlbuBChE (escala logarítmica) .
La Figura 13 muestra la concentración media de cocaína versus tiempo en animales de control (n=2) y como una función de tiempo la después de la dosis de AlbuBChE (n=3) .
La Figura 14 muestra la concentración media de éster metílico de ecgonina a 5 minutos después de una dosis IV de 1 mg/kg de cocaína en animales de control (n=2) y como una función de tiempo la después de la dosis dé AlbuBChE (n=3) . .
La Figura 15 muestra la concentración media de benzoilecgonina a 5 minutos después de una dosis IV de 1 mg/kg de cocaína en animales de control (n=2) y como una función de tiempo la después de la dosis de AlbuBChE (n=3) .
La Figura 16 muestra un .sumario de los niveles de cocaína . en la sangre de mono ardilla y los metabolitos de la cocaína éster metílico de ecgonina (EME) y benzoilecgonina (BZ) en 5 minutos (panel superior) y 30 minutos (panel inferior) después de la inyección de cocaína.
La Figúra 17. muestra el análisis PK/PD de AlbuBChE en monos Ardilla después de una sola administración IM de una dosis de 5 mg/kg de AlbuBChE. La cocaína se administró IV en una dosis de 1 mg/kg en animales de control (n=2) o a 2, 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE (n=3) .
La Figura 18 muestra la frecuencia cardíaca media versus tiempo en monos cynomolgus antes y después de una sola administración IM de una solución amortiguadora de formulación o dosis de 15 mg/kg de AlbuBChE.
La Figura 19 muestra el producto de presión de frecuencia cardiaca media versus. tiempo en monos cynomolgus antes y después de una sola administración IM de una solución amortiguadora de formulación o dosis de 15 mg/kg de AlbuBChE.
La Figura 20 muestra la presión arterial media versus tiempo en monos cynomolgus antes y después de una sola administración . I de una solución amortiguadora de formulación o dosis 15 mg/kg de AlbuBChE.
La Figura 21 muestra la presión diastólica media versus tiempo en monos cynomolgus antes y después de una sola administración IM de una solución amortiguadora de formulación o dosis de 15 mg/kg de AlbuBChE.
La Figura 22 muestra la presión sistólica media versus tiempo en monos' cynomolgus antes y después de una ola administración IM de una solución amortiguadora de formulación o dosis de 15 mg/kg de AlbuBChE.
La Figura 23 muestra la temperatura corporal media versus tiempo en monos . cynomolgus antes y después . de una sola administración IM de una solución amortiguadora de formulación o dosis de 15 mg/kg de AlbuBChE.
La Figura 24A muestra el ritmo respiratorio medio versus tiempo en monos cynomolgus antes y después de una sola administración IM de una solución amortiguadora de formulación o dosis de 15 mg/kg de AlbuBChE. Los datos para monos cynomolgus machos se muestran en la Figura 24B, panel superior, y los datos para monos cynomolgus hembras se muestran en la Figura 24B, panel inferior.
La Figura 25A muestra los niveles SP02 medios versus tiempo en monos cynomolgus antes y después de una sola administración IM de una solución amortiguadora de formulación o dosis de 15 mg/kg AlbuBChE. Los datos para monos cynomolgus machos se muestran en la Figura 25B, panel superior, y los ¦ datos para monos cynomolgus hembras se muestran en la Figura 25B, panel inferior.
La Figura 26A muestra los niveles de ETC02 medios versus tiempo en monos cynomolgus antes y después de una sola administración IM de una solución amortiguadora de formulación o dosis de 15 mg/kg de AlbuBChE. Los datos para monos cynomolgus machos se muestran en la Figura' 26B, panel superior, y los datos para monos cynomolgus hembras se muestran en la Figura 26B, panel inferior.
La Figura 27 muestra la presión arterial media versus tiempo en monos cynomolgus después de una dosis de cocaína de 1 mg/kg administrada IV tres horas después de una dosis de 15 mg/kg de AlbuBChE. La dosis de cocaína se administró a t=0.
La Figura 28 muestra la presión diastólica media versus tiempo en monos cynomolgus después de una dosis de cocaína de 1 mg/kg administrada IV tres horas después de una dosis de 15 mg/kg de AlbuBChE. La dosis de cocaína se administró a t=0.
La Figura 29 muestra la presión sistólic.a media versus tiempo en monos cynomolgus después de una dosis de cocaína de 1 mg/kg administrada IV tres horas después de una dosis de 15 mg/kg de AlbuBChE. La dosis de cocaína se administró a t=0.
La Figura 30 muestra la frecuencia cardíaca media versus tiempo en monos cynomolgus después de una dosis de cocaína de 1 mg/kg administrada IV tres horas después de una dosis de 15 mg/kg de AlbuBChE. La dosis de cocaína se administró a t=0.
La Figura 31 muestra el producto presión de frecuencia media versus tiempo en monos cynomolgus después de una dosis de cocaína de 1 mg/kg administrada IV tres horas después de una dosis 'de 15 mg/kg de AlbuBChE. La dosis de cocaína se administró a t=0.
La Figura 32 muestra la temperatura corporal media versus tiempo en monos cynomolguS' después de una dosis de cocaína de 1 mg/kg administrada IV tres horas después de una dosis de 15 mg/kg de AlbuBChE. La dosis de cocaína se administró a t=0.
La Figura 33 muestra la tasa de repuesta del mono ardilla (paneles superiores) y número de inyecciones (paneles inferiores) durante sesiones de auto-administración en días consecutivos donde ya sea la cocaína o solución salina fueron disponible para la- auto-administración. La respuesta fue seguida durante 5 días después de la administración del vehículo o AlbuBChE (5 mg/kg).
La Figura 34 muestra niveles de restablecimiento de la auto-administración de cocaína después de la administración de AlbuBChE o vehículo de AlbuBChE. La AlbuBChE o vehículo sé administró i.m. dos, 48 y 96 horas después una dosis de 0.3 mg/kg de cocaína (paneles izquierdos) o una dosis i.v. de 0.1 mg/kg de cocaína (paneles derechos) 5 minutos antes de una sesión de sustitución con solución salina.
La Figura 35 muestra la modulación de los efectos discriminatorios-estímulo de la cocaína en sujetos entrenados con metanfetamina por la AlbuBChE.
La Figura 36 muestra los efectos discriminatorios-estimulo de la metanfetamina en sujetos entrenados con metanfetamina después de la administración de AlbuBChE.
La Figura 37 muestra ¦ la concentración ¦ en suero relativa de una fusión de. albúmina comparada con un péptido no de fusión donde la fusión de albúmina se dosifica una vez a la semana y el péptido no de fusión se dosifica diario.
La Figura 38 muestra una SDS-PAGE de la AlbuBChE purificada de células CHO. La linea 1 es un marcador de peso molecular, y las lineas 2 y 4 muestran la AlbuBChE purificada bajo condiciones de reducción y no de reducción, respectivamente .
La Figura 39 muestra el número de cruces de haces versus tempo en ratas tratadas con BChE de tipo natural o Albu-CocH antes de una dosis de cocaína, ratas que recibieron una sola dosis de cocaína, y ratas que no recibieron cocaína y BChE. La actividad locomotora se evaluó al detectar los rompimientos de haces infrarrojos como se describe por Brimijoin y colaboradores.
La Figura 40 muestra la concentración de AlbuBChE versus tiempo en ratones después de una dosis de AlbuBChE y también muestra la hidrólisis de la cocaína (representada como el porcentaje de cocaína convertida a ácido benzoico (%BA) dentro de 60 minutos de la administración de cocaína) versus tiempo después de la dosis de AlbuBChE.
La Figura 41 muestra el contenido de cocaína de un cerebro y corazón recolectado de ratas (n=6) que recibieron una dosis de AlbuBChE (3 mg/kg) o solución salina, a través de la vena de la cola, seguido diez minutos después por 30 pCi de 3H-cocaina (3.5 mg/kg), también a través de la vena de la cola. Los cerebros y corazones se recolectaron 10 minutos después de la dosis de 3H-cocaína. De izquierda a derecha, los datos de control son las barras 1 y 3 mientras que los datos de AlbuBChE son las barras 2 y 4.
La Figura 42 muestra los niveles de cocaína (gráfica izquierda) y benzoato (gráfica derecha) en el cerebro, corazón y plasma recolectados de ratas que recibieron una dosis de 3 mg/kg de AlbuBChE o solución salina 10 minutos antes de una dosis de 30 pCi de 3H-cocaína (3.5 mg/kg) . El cerebro, corazón y plasma se recolectaron 10 minutos después de la dosis de cocaína.
La Figura 43 muestra el diseño experimental de un estudio que examina la capacidad de la AlbuBChE de protegerse de sobredosis letal.
La Figura 44 muestra el porcentaje de ratas que muestran hiperactividad, ataques, y muerte en respuesta a una dosis de 100 mg/kg de cocaína administrada diez minutos después de una dosis de 0, 1,' 3, o 10 mg/kg de AlbuBChE.
La Figura 45 muestra la concentración de cocaína versus tiempo en- ratas Sprague Dawley que recibieron una dosis IV de una dosis de 0, 2, y 10 mg/kg de AlbuBChE seguido cinco minutos después por una dosis IP de cocaína a 60 o 100 mg/kg.
La Figura 46 muestra un modelo de comportamiento de adicción y recaída. "S" y "D" representan solución salina y la droga cocaína, respectivamente. Los animales se entrenaron para emitir un accionamiento de palanca para una infusión de cocaína. Después de la estabilización (mantenimiento), la solución salina se sustituye por cocaína y el comportamiento se deja extinguir. . En la fase de restablecimiento subsecuente, se administran inyecciones de cebado de cocaína, alternándose con solución salina.
La Figura 47 muestra el blogueo selectivo' de restablecimiento cebado con cocaína del comportamiento de búsqueda de droga que. resulta del tratamiento de AlbuBChE. Las ratas que se habían auto-administrado previamente cocaína y se extinguió cuando se reemplazó la cocaína con solución salina se cebaron con una inyección IV de solución salina (S) , cocaína (C, 10 mg/kg) , o anfetamina (A, 2 mg/kg) . La AlbuBChE se administró, IV (E, 2 mg/kg) dos horas antes de la sesión de comportamiento.
La Figura 48 muestra el número de accionamientos de la palanca por sesión en ratas después de la inyección de solución salina, inyección de cocaína (10 mg/kg, IV), o AlbuBChE (2 mg/kg, IV) seguido por cocaína (10 mg/kg, IV) después de una fase de adicción y abstinencia forzadas.
La Figura 49 muestra la biodisponibilidad de
AlbuBChE, vida media, y tiempo para concentración máxima Tmax, en monos cynomolgus después de una sola inyección intravenosa (IV), subcutánea (SO), o intramuscular. (IM). Se calculó la disponibilidad absoluta . de AlbuBChE para vías de administración IM y SC relativo con la IV en el nivel de dosis de 3 mg/kg.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención objeto proporciona un método para atenuar un efecto biológico de una exposición a cocaína en un primate que comprende administrar al primate una cantidad de una proteína de fusión que comprende
(a) un polipéptido de butirilcolinesterasa (BChE) mutante que comprende la secuencia
EDDIIIATKNG VRGM LTVFGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNA
TK^A SCCQNIDQSFPGFHGSFJWmPOTDLSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVLI IYGG GFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIWSMNYRVGALGFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLA LQWVQK IAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLLSPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWA VTSLYEARNRTLNLA LTGGSRENETEII CLR KDPQEILL EAFWPYGTPLGVNF GPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDEGT FLVGGAPGFSKD NSIITRK EFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPE YREALGDWGDYNFICPALEFT
^ KKFSEWGN AFFYYFEHRSSKLPWPEW GVMHGYEIEFVFGLPLERRDNYTKAEEILS
RSIVKRWANFAKYGNPNETQ NSTSWPVFKSTEQKYLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFW TSFFPKV (SEQ ID N0:1),
(b) un polipéptido. de albúmina de suero humano (HSA) que comprende la secuencia
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEV EFAKTCVADES AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQH DDNP LPRLV
^ RPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADK
AACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVS KLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICE QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCI AEVENOEMPADLPSI-AADFVESKDVCl^AEAKDWLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLR LAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNA LLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSR LG VGSKCC HPEAKP.MPCAEDYLSVVL QLCVLH EKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ IKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGL (SEQ ID NO : 2 ) , y
15
(c) un péptido de señal que comprende la secuencia
MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG (SEQ ID NO: 3),
en donde la cantidad¦ de la proteina de fusión' es efectiva para provocar la atenuación del efecto biológico de la 20 exposición a cocaína en el' primate.
En una modalidad del método, la proteína de fusión comprende la secuencia
MRPTWA WLFLVLLLALWAPARGEDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQ
PPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNATKYANSCCQ IDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCL YUWiIPAPKPKNATVLIWIYGGGFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVS>INYRVGAL
GFLALPGNPEAPG MGLFDQQLALQWVQK IAAFGGNPKSV LFGESSGAASVSLHLL SPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWAVTSLYEARNRTLNIAKLTGCSRE ETEIIKCLRNK DPQEILI- EAFVVPYGTPLGVNFGPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVN DE
GTWFLVGGAPGFSKDN SIITRKEFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPE NYREALGDWGDY FICPALEFTKKFSE GNNAFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYE IEFVFGLPLERRDNYTKAEEILSRSIVXRWANFAKYGNPNETQITOSTSWPWKSTEQK YLTL TESTRIM KLRAQQCRFWTSFFPKVDAHKSEVAHRFKDLGEE FKALVLIAFA QYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGE MADCCAKQEPER ECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIAR RHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADL AKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFDYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLiEKCCAAADPHECYAKVFDE
FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSR LG VG SKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLV RRPCFSALE VDETYVPKEF AETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDD FAAFVEKCCKADD ETCFAEEGKKLVAASQAALGL ( SEQ ID NO : 4 ) .
En otra modalidad del método, la proteína de fusión se administra antes de la exposición a cocaína.
En otra modalidad, la proteína de fusión se administra hasta un día antes de la exposición a cocaína.
En otra modalidad, la proteína de fusión se administrada hasta 216 horas antes de la exposición a cocaína. La proteína de fusión se puede administrar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 días antes de .la exposición a cocaína.
En todavía otra modalidad del método, la proteína de fusión se administra después de la exposición a cocaína. En una modalidad adicional, la proteína de fusión se administra hasta seis horas después de la exposición a
cocaína. En otra modalidad, la proteina de fusión se administra hasta una hora después de la exposición cocaína.
En todavía modalidad del método, la . exposición a cocaína es una sola exposición a cocaína.
En todavía otra' modalidad del método, la exposición a cocaína es una exposición a cocaína recurrente. En una modalidad adicional del método, la exposición a cocaína recurrente es abuso de cocaína o dependencia de cocaína.
En todavía otra modalidad del método, la exposición a cocaína recurrente comprende por lo menos seis exposiciones a cocaína individuales en un período de doce meses.
En todavía otra modalidad del método, la exposición a cocaína recurrente comprende por lo menos veinte exposiciones a cocaína individuales durante el tiempo de vida del primate.
En todavía otra modalidad del método, el efecto biológico es provocado por sobredosis de cocaína en el primate y la atenuación es tratar o prevenir el efecto biológico.
En todavía otra modalidad del método, el efecto biológico es un incremente en la presión sanguínea.
En una modalidad adicional del método, la duración del incremento en la presión sanguínea se reduce en un 60-90%.
En una modalidad adicional del método, la duración del incremento en la presión sanguínea se reduce aproximadamente en un 78%.
En todavía otra modalidad del método, el efecto biológico es un incremento en la frecuencia cardíaca o temperatura corporal. En una modalidad adicional del método, el grado de atenuación es de 45%-70%. En una modalidad adicional del método, el grado de atenuación es de 57%.
En todavía otra modalidad del método, el efecto biológico es comportamiento de búsqueda de cocaína en el primate .
En todavía otra modalidad del método, el comportamiento de búsqueda de cocaína se presenta n período de abstinencia de cocaína después de la exposición a cocaína.
En todavía otra modalidad del método, el comportamiento de búsqueda de cocaína sigue una recaída.
En todavía otra modalidad del método, la administración de la proteína de fusión dos horas antes de la recaída atenúa el comportamiento de búsqueda de cocaína por el primate inmediatamente después de la recaída. ·
En todavía otra modalidad del método, la administración de la proteína de fusión dos horas antes .de la exposición a cocaína da por resultado una reducción de ' 50% a 100% en el comportamiento de búsqueda de cocaína por el primate.
En todavía otra modalidad del método, la atenuación del comportamiento de búsqueda de cocaína se observa hasta cuatro días después de la administración de la- proteína de fusión.
En todavía otra modalidad del método, la administración de la proteína de fusión da por resultado una disminución de la exposición a cocaína total en el primate que sin la administración.
En todavía otra modalidad del método, la atenuación de comportamiento de búsqueda de cocaína da por resultado un período de abstinencia de cocaína en el primate. En una modalidad adicional del método, el período de abstinencia es de 2 semanas a 3 semanas.
En todavía otra modalidad del método, la atenuación de comportamiento de búsqueda de cocaína da por resultado una proporción más grande de días en que el primate no se expone a cocaína que sin la administración.
En todavía otra modalidad del método, la atenuación de comportamiento de búsqueda de cocaína da por resultado un gran número de días consecutivos en los cuales el primate no se expone a la cocaína que sin la administración.
En todavía, otra modalidad del método, la atenuación de comportamiento de búsqueda de cocaína da por resultado una disminución de gravedad de dependencia o abuso dé cocaína como se evalúa por la evaluación de gravedad selectiva de cocaína (CSSA) o Manual de Diagnóstico y Estadístico de Trastornos Mentales IV (DSM-IV) .
En todavía otra modalidad del método, la cantidad efectiva de la proteína de fusión es una cantidad que reduce el nivel de cocaína en suero del primate de aproximadamente 0 ng/ml dentro de aproximadamente 30 minutos de una dosis de 1 mg/kg de cocaína intravenosa.
En todavía otra modalidad del método, la administración de la proteína de fusión reduce el nivel de cocaína en suero del primate a menor que 12% del nivel de cocaína en sueros sin la administración dentro de aproximadamente 5 minutos de una dosis de 1 mg/kg de cocaína intravenosa.
En todavía otra modalidad del método, la administración de la proteína de fusión reduce el nivel de cocaína en suero del primate a 7% del nivel de cocaína en suero sin la administración dentro de aproximadamente 5 minutos de una dosis de 1 mg/kg de cocaína intravenosa.
En todavía otra modalidad del método, la proteína de fusión administrada solo una vez, diaria, dos veces por semana, a la semana, cada dos semanas o al mes.
En otra modalidad, la proteína de fusión se administra a la semana o dos veces a la semana.
En otra modalidad, la proteina de fusión se administra como una sola dosis después de la exposición a cocaína.
En otra modalidad, la proteína de fusión se administra como una sola dosis después de una sobre dosis de cocaína.
En, todavía otra modalidad del método, lá proteína de fusión se administra mediante inyección intramuscular o inyección subcutánea.
En todavía otra modalidad del método, lá pr'oteína de fusión en una solución amortiguadora de formulación que comprende lOmM de -fosfato de sodio, 200mM de manitol, 60mM de trehalosa, y 0.01% (p/.v) de polisorbato 80, pH 7.2.
En todavía otra modalidad del método, la proteína de fusión la proteína de fusión está presente en la formulación en la concentración de por lo menos 30 mg/ml.
En todavía otra modalidad del método, la atenuación del efecto biológico se observa hasta 72 horas después de la administración de la proteína de fusión.
En todavía otra' modalidad del método, el primate es un humano.
En una modalidad adicional del método, la exposición a cocaína es una sola exposición a cocaína, de 10 mg a 60 mg o una exposición a cocaína recurrente en donde cada exposición a cocaína de la exposición a cocaína recurrente es de 10 mg a 60 mg.
En todavía otra modalidad del método, la cantidad efectiva de la proteína de fusión es una cantidad que reduce el nivel de cocaína en suero del humano a aproximadamente 0 ng/ml dentro de aproximadamente 30 minutos de una dosis de 40 mg de cocaína intravenosa.
En todavía otra modalidad del método, la cantidad efectiva de la proteína de fusión es de 0.06 mg/kg a 5 mg/kg. En otra modalidad del método, la cantidad efectiva de la proteína de fusión es de 0.06 mg/kg, 0.3 mg/kg,. 1.6 mg/kg, o 4.8 mg/kg.
En todavía ¦ otra modalidad del método, la cantidad efectiva de la proteína de fusión es d 50' mg a 300 mg . En otra modalidad del método, la cantidad efectiva de la proteína de fusión es de 50 mg, 100 mg, 150 mg, o 300 mg.
Una modalidad de la proteína de fusión, de BChE-albúmina que comprende las sustituciones de aminoácidos A227S, S315G, A356W, e Y360G se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 4) . La secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 comprende un péptido señal heterólogo, mostrado por subrayado, un dominio BChE que comprende aminoácidos E29 a V529 de la. BChE humana, y albúmina de. suero humano (HSA) , mostrados en cursiva. Las sustituciones de aminoácidos A227S, S315G, A356 , e Y360G se muestran en negritas y se subrayan en la Figura 1. La numeración de las sustituciones es relativa a aquella de la BChE de longitud completa. La proteina codificada por la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 es referida como "AlbuBChE" por toda esta solicitud.
Se entiende que todas las combinaciones de las modalidades descritas en lo anterior de la invención están dentro del alcance de la invención.
Como se utiliza en este documento, "primate" se refiere a cualquiera de un orden de mamíferos que se caracteriza especialmente por desarrollo avanzado de visión binocular, especialización de los apéndices para tomar o agarrar, y agrandamiento de los hemisferios cerebrales y que incluyen humanos, simios, monos y formas relacionadas .
Como se utiliza en este documento, "grado de atenuación" se refiere a la disminución en el efecto biológico de la exposición a cocaína que se observa después de la administración de una proteína de fusión BChE-albúmina como es comparado con el efecto biológico a la exposición a cocaína observada en ausencia de la proteína de fusión' BChE-albúmina. El grado, de atenuación se calcula por la siguiente fórmula :
' ? BChE-albúmina ausente - ? BChE-albúmina presente grado de atenuación =
? BChE-albúmina ausente
Por ejemplo, si la exposición a cocaína eleva una temperatura de valor de referencia de 38°C a 38.7°C en ausencia de una proteína de fusión BChE-albúmina, y la exposición a cocaína eleva una temperatura de valor de referencia de 38 °C a 38.3°C en presencia de una proteína de fusión BChE, el grado de atenuación es de 57.1% ((0.7°C -0.3°C) /0.7°C) .
Como se utiliza en este documento, .' "una. sola exposición a cocaína" se refiere a una exposición de cocaína aislada de cualquier otra exposición de cocaína. "Una exposición a cocaína recurrente" se refiere a más de una sola exposición a cocaína. La exposición a cocaína recurrente puede ser un patrón regular o irregular de exposiciones a cocaína individuales que comienzan con la segunda exposición a cocaína individual o subsecuente en el sujeto. Un individuo que experimenta exposición a cocaína recurrente puede cumplir los criterios para dependencia de cocaína o abuso de cocaína de Manual de Diagnóstico y Estadístico de Trastornos Mentales IV (DSM-IV) .
Como se utiliza en este documento, el término "exposición a cocaína total" se refiere a una exposición a
cocaína agregada durante un intervalo de tiempo dado. La exposición a cocaína total se puede medir durante o después de un período de un tratamiento diseñado para atenuar el comportamiento de búsqueda de cocaína u otro efecto biológico de exposición a cocaína.
Como se utiliza en este documento, el término "un período de abstinencia de cocaína" se refiere a un período de tiempo después de la exposición a cocaína donde el primate no experimenta una nueva exposición a cocaína.
Como se . utiliza en este documento, el término
"recaída" se refiere a una exposición a. cocaína después de un período de abstinencia de cocaína.
Se entiende que donde es proporciona un intervalo de parámetro, todas las decenas de números enteros dentro de ese intervalo se proporcionan por la invención. Por ejemplo, "0.2 mg/kg a 15 mg/kg* incluye 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg etcétera, hasta incluyendo 15.0 mg/kg.
Una dosis animal se puede convertir a una dosis equivalente humana (HED) al utilizar la tabla de conversión encontrada en la publicación "Guidance for Industry: Estimating the Máximum, Safe Starting Dose in Initial Clinical Triáis for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers", U.S. Department of Health and Human Services, Food and' Drug Administration Center for ¦ Drug Evaluation and Research (CDER) , Julio de 2005. La dosis para monos cynomolgus en mg/kg se puede convertir a una HED en mg/kg al dividir la dosis de monos cynomolgus por 3.1. La dosis para monos ardilla en mg/kg sé puede convertir a una HED en mg/kg al dividir la dosis de mono árdilla por 5.3.
Lista de Abreviaturas
AUC(o-7) Área bajo la curva de concentración en plasma- tiempo del tiempo cero hasta el tiempo de última concentración' detectable (tz)
AUC(o-8) Área bajo la curva de concentración en plasma- tiempo de tiempo cero al infinito
%AUCex porcentaje de AUC que es debido a la extrapolación de tz al infinito
EChE butirilcolinesterasa
BQL abajo del limite de cuantificación
CL eliminación
Cmax concentración máxima
CocH cocaína hidrolasa
ELISA ensayo inmunoabsórbente enlazado a enzimas
GFR velocidad de filtración glomerular
Hr hora(s)
HRP peroxidasa de rábano picante
IM intramuscular
IV intravenosa
LLOQ límite inferior de cuantificación
Min minuto (s)
NCA análisis sin compartimiento
NIDA Instituto Nacional en Abuso de Drogas
PBS solución salina amortiguada con fosfato
PD farmacodinámica
PK farmacocinética
RT Temperatura ambiente
Rsq coeficiente de determinación'
%RSD Porcentaje de Desviación Estándar Relativa
SD Desviación Estándar
Se subcutánea
SOP protocolo de operación estándar
?? 2 vida media de la fase terminal
Tmax tiempo de concentración máxima
Vx volumen de distribución de la fase terminal.
La proteína de fusión BChE-albúmina mostrada en la
Figura 1 (AlbuBChE) se aplicó a ensayos como se describe en los ejemplos a continuación.
Ejemplo 1 - Estudio Farmacocinético y Farmacodinámico Después de una Sola Administración Intramuscular de AlbuBChE y
Múltiples Dosis Intravenosas de Cocaína a Monos Cynomolgus
Objetivos
El objetivo de este ensayo fue determinar el perfil farmacocinético (PK) de AlbuBChE' en monos cynomolgus machos después de una sola administración intramuscular en niveles de dosis de 0.2, 1 o 5 mg/kg de AlbuBChE y para determinar la actividad de AlbuBChE como una función de tiempo mediante administración intravenosa de una dosis de 1 mg/kg de cocaína a 2,· 48, 96, 120, y 240 horas después de la administración de la dosis de AlbuBChE,
Justificación
La AlbuBChE es una proteína de fusión de albúmina de suero humano (HSA) y una forma genéticamente modificada de butirilcolinesterasa humana (BChE) que muestra alta eficiencia catalítica para la hidrólisis de cocaína a ácido benzoico. La AlbuBChE está bajo desarrollo como una intervención potencial en la prevención de recaída al comportamiento de búsqueda de drogas. La fusión de una proteína a albúmina se -ha mostrado que mejora las propiedades farmacocinéticas de la proteína al reducir la eliminación y al prolongar la vida media. Una vida media más prolongada se espera que se traduzca en un intervalo de dosificación más prolongado y mejor cumplimiento con un régimen de fármacos. Justificación para la Selección de Especies
Se seleccionaro monos cynomolgus (macaca múlatta) para este estudio con base en las similitudes anatómicas, fisiológicas, y bioquímicas a humanos, que pueden facilitar la extrapolación de propiedades . farmacocinéticas y farmacodinámicas observadas a humanos. Los monos se sabe que expresan butirilcoline.sterasa, que es un componente de esta droga. Los monos también son fisiológicamente sensibles a la cocaína.
Justificación para el Nivel de Dosis y Via
En un estudio previo, se evaluó el perfil farmacocinético de la AlbuBChE en monos cynomolgus. En ese estudio, se administró el artículo de prueba SC (7.8, 2.4 y 0.78 mg/kg), IM (2.4 mg/kg) e IV (2.4 mg/kg) . Las propiedades farmacocinéticas de la AlbuBChE fueron lineales por todas las dosis SC medidas. La selección de IM para este estudio se basó en la mayor disponibilidad en IM como es comparada con SC (79% y 35-39% respectivamente) observada en el estudio previo. Además, los niveles de dosis IM de AlbuBChE de 0.2, 1 y 5 mg/kg se seleccionaron para definir el intervalo farmacodinámico de AlbuBChE en monos cynomolgus..
La dosis de cocaína a 1 mg/kg IV se seleccionó como una dosis suficientemente alta para producir una respuesta fisiológicamente relevante y lograr una concentración medible de cocaína en sangre, mientras no estimulando excesivamente los animales.
El número de animales en cada grupo es el húmero mínimo de animales por grupo necesarios para evaluación de la variabilidad inter-animal . Ya que esto es un estudio piloto, solamente se evaluó un sexo (machos) .
Soluciones de Prueba
El artículo de prueba, AlbuBChE, se almacenó en una solución madre como una formulación líquida congelada que contiene 29.9 mg/mL a -70 ± 15BC. Antes de la dosificación, la formulación del artículo de prueba se descongeló ' a temperatura ambiente. Cuando la formulación del artículo de prueba se descongeló completamente, el recipiente se mezcló mediante inversión suave y se diluyó con el volumen apropiado del diluyente de artículo de prueba para- lograr una concentración de 20 mg/mL. Esta' formulación se diluyó en serie con el diluyente de artículo de prueba para lograr concentraciones de 4 y 0.8 mg/mL.
Clorhidrato de cocaína, el artículo de prueba farmacodinámico, se adquirió de Sigma. Los niveles de . dosis se expresaron como la sal de clorhidrato.
Diseño Experimental
El estudio incluyó un total de monos cynomolgus machos adultos, sin tratamiento divididos en cuatro grupos de dosis :
un grupo de control de dos monos cynomolgus que recibieron solamente una sola dosis IV de cocaína;
tres grupos de dosis que se trataron con una sola dosis IM de AlbuBChE a 0.2, 1 o 5 mg/kg. Tres monos cynomolgus machos adultos sin tratamiento se utilizaron en cada grupo de dosis. Después del tratamiento con AlbuBChE, una dosis de IV de 1 mg/kg de cocaína se administró a 2, 48, 96, 120, y 240 horas después de la administración de la dosis de AlbuBChE.
Un sumario de la designación de dosis y los niveles de dosis se puede encontrar en . la Tabla 1. Las dosis individuales se calcularon con base en los pesos corporales registrados en el día de. la administración de . la dosis. Los animales no ayunaron antes de la administración de la' dosis.
Tabla 1 : Designaciones de Grupo y Niveles de Dosis
Todos los tiempos serán dentro de ± 5 minutos de los tiempos listados
Recolección de muestras para AlbuBChE
Una sola administración intramuscular (IM) de AlbuBChE se administró ' en el dia 1 de estudio y la sangre se recolectó en los puntos de tiempo indicados en la Tabla 2.
Aproximadamente 0.5 mL de sangre entera se recolectaron de la vena femoral en tubos separados de suero (SST) .
Tabla 2 : Farmacocihética para AlbuBChE
Recolección de Muestras para Cocaína
Aproximadamente 0.5 mL de sangre entera se recolectaron de la vena femoral a 5, 10, 15, 20, 30, 40 y 60 minutos después de cada .dosis de cocaína (Día 1 de Estudio del Grupo de control y Día 1 de estudio (2 hr) , 3 (48 hr) , 5 (96 hr), 6 (120 hr) , y 11 (240 hr) después de la administración de la dosis de AlbuBChE) . La sangre se colocó en tubos de recolección de sangre K2EDTA con inhibidor de estearasa diisopropilfluorofosfato (DFP). Los tubos se invirtieron varias veces y se colocaron en hielo húmedo en la recolección. Las muestras se centrifugaron a 2-8°C dentro de 45 minutos de la recolección. Se recuperó el plasma resultante y una sola alícuota de 200 L de plasma se colocó en tubos de polipropileno. Las muestras de plasma se congelaron sobre hielo seco y se almacenaron a -75 ± 15SC. Métodos de Ensayo
El siguiente esquema describe el ensayo basado en ELISA empleado en la medición de las concentraciones de AlbuBChE en muestras de suero, de mono obtenidas pre-administración y en diferentes tiempos después de la administración.
Se recubrieron placas Immulon 4 HBX con 100 L de mAb anti-BChE 002-01 (Abeam abl7246) a 1 ug/mL en PBS, durante toda la noche ' a 4 C°. El bloqueo se hizo con 2% de Caseína en PBS lx, 200 pL/pocillo, 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado, 100 µL de muestras de suero diluido se adicionaron a las placas, junto con estándares. Los estándares se generaron a- través de 3.64 veces, dilución en serie de AlbuBChE de 2Ó00 a 3.1 ng/mL. Las muestras de suero y los estándares se mantuvieron a 10% de suero en dilución con solución amortiguadora que contiene suero de . mono cynomolgus combinado. Una etapa de lavado precede la detección con 100 pL de mAb-6502-HRP anti-HSA a 0.04 pg/mL durante 1 hora. Los pocilios se lavaron nuevamente,' antes del desarrollo con 100 pL de substrato de T B. Después de 15 minutos, la reacción se determinó con 100 pL/pocillo de H2S04 1N y se leyó en el lector de placas SpectraMax t 450/570 nm. Los valores para las muestras de suero desconocidas se calcularon mediante interpolación de la curva estándar generada por el ajuste de 4 parámetros de los estándares de AlbuBChE. El limite de cuantificación en suero de monos cynomolgus fue de 21.1 ng/mL.
Cuantificación de LC-MS de cocaína en Suero
El siguiente esquema describe el ensayo basado en LC-MS empleado para la medición de cocaína en muestras de plasma. Antes del análisis MS, las muestras de plasma, estándares y controles de calibración se extrajeron utilizando la extracción, de liquido soportado (SLE-ISOLUTE, Biotage) , veinticinco microlitros de muestras (25 pL) recibieron 150 µ? de hidróxido de amonio al y .25 µ? de solución estándar interna (Cocaina-d3) . Después del mezclado y transferencia a la placa de SLE, las muestras se eluyeron con cloruro de metileno y se evaporaron a sequedad. Después de la re-suspensión en 50 µ? de solución de reconstitución -5% de ACN en acetato de amonio 10 mM en agua, se inyectaron 10 µ? en la columna Thermo Hypercarb a 0.5 ml/min. La fase móvil fue bifásica. Se llevó a cabo la : detección espectrofotométrica de masas utilizando la interfaz positiva Api APCI 4000 y la supervisión múltiple (MRM) . Las concentraciones en plasma de la. cocaína, benzoilecgonina y éster metílico ecgonina se determinaron utilizando' este ensayo.
Análisis PK de AlbuBChB
Se determinaron los valores de los parámetros farmacocinéticos de AlbuBChE utilizando perfiles de concentración en suero-tiempo para animales individuales. Se utilizó el software de computadora inNonlin Professional (Versión 4.0.1 Pharsight Corporation, EUA) . Específicamente, es aplicó el modelo para el análisis sin compartimiento con entrada vascular. Si hubo poco más de 3 puntos de datos en la fase terminal de la curva de concentración de suero, una vida media de fase terminal y parámetros PK derivadas de la vida media no se calcularon para ese perfil. Se calcularon los parámetros analizados incluyendo tmax, Cmax, ti2, AUC(o-t) y AUC (o-8) ·
Análisis PK de Cocaína
Cuando se permitieron los datos, los valores del parámetro farmacocinético para la cocaína y sus metabolitos se determinaron utilizando los perfiles de concentración de plasma-tiempo para animales individuales en todos los días de estudio de la administración de cocaína. Se utilizó el software de computadora WinNonlin Professional (Versión 4.0.1 Pharsight Corporation, EUA) . Específicamente, se aplicó el modelo para análisis sin compartimiento con entrada de bolo IV para cocaína y entrada extravascular para los metabolitos. Si hubo poco más de 3 puntos de datos de la fase terminal de la curva de concentración de plasma, una vida media de fase terminal y parámetros PK derivados de la vida media ' no se calcularon para ese perfil.
Análisis PK/PD
La relación de PK/PD de AlbuBChE se definió utilizando el software. de computadora WinNonlin Professional (Versión 4.0.1 Pharsight Corporation, EUA). Específicamente, se utilizó el modelo Emax de efecto inhibidor sigmoideo directo en el cual el efecto máximo (Emax) como es medido por la AUC de cocaína se asumió en la concentración de AlbuBChE de cero. La ecuación del modelo, se puede describir como sigue:
Emax sigmoideo del efecto inhibidor, C = =a Eraax , C = infinito a E0
E=Emax- (Emax-EO) * (C**Gamma/ (C**Gamma+EC50**Gamma) )
Se seleccionó el modelo sigmoideo debido a la mayor actividad observada en el punto de tiempo de 48 horas comparado con el punto de tiempo de 2 horas.
El parámetro PD utilizado en el análisis fue AUC de cocaína. Los parámetros PK utilizados en el modelo fueron concentraciones en plasma de AlbuBChE 2, 48, 96,' 120, 240 horas después de la dosis de AlbuBChE. Debido al hecho de que la concentración de AlbuBChE no se midió a 2 horas después de la dosis de AlbuBChE, la concentración a 3 horas después de la dosis se utilizó en el análisis con las suposiciones de que la concentración de AlbuBChE a 3 horas después de la dosis de AlbuBChE puede reflejar la concentración de AlbuBChE a 2 horas después de la dosis de AlbuBChE.
Métodos Estadísticos
Se calcularon las estadísticas de resumen de los perfiles de concentración y los valores de parámetros de PK por el grupo experimental utilizando la función de estadísticas descriptivas en WinNonlin. Los parámetros estadísticos reportados son N, medio, SD y porcentaje de coeficiente de variación (%CV) .
Resultados
Perfil de concentración de AlbuBChE
Los datos de concentración de AlbuBChE-tiempo ' y las estadísticas de resumen se listan en las Tablas 3 y 4. Los perfiles de concentración en suero de AlbuBChE de animal individual-tiempo después de una sola inyección M de AlbuBChE de 0.2, 1 o 5 mg/kg se muestran en la Figura 2. Los perfiles de concentración en suero medio-tiempo para los tres grupos de dosis de AlbuBChE. se muestran en la Figura 3.
Después de la inyección IM, todos los animales tuvieron concentraciones de AlbuBChE medibles. La variabilidad inter-animales por grupo de dosificación parece que es razonable como se indica por el % CV que varió de 8.2 a 78.4 para todos los puntos .de tiempo. La concentración en suero de AlbuBChE se incrementó con la dosis de incremento.
Tabla 3 : Perfil de Concentración Individual y Media en Suero de AlbuBChE (ng/mL) versus tiempo (hr) en Monos Cynomolgus después de una sola administración IM de una dosis de 0.2, 1 o 5 mg/kg/animal de AlbuBChE .
-- No aplicable
LLOQ 27.2 ng/ml Tabla 4 : Resumen de la Concentración Media en Suero de AlbuBChE (ng/ml) versus tiempo (hr) en Monos Cynomolgus después de una sola Administración IM de una dosis de 0.2, 1 , o 5 mg/kg/animal de AlbuBChE.
-- No aplicable
LLOQ 27.2 ng/ml
Perfil de concentración de cocaína, benzoilecgonina y éster metílico de ecgonina
Se llevó a cabo el análisis LC/MS sobre ' todas las muestras para analizar los niveles de cocaína, benzoilecgonina y éter metílico de ecgonina en plasma de mono. Los perfiles de concentración en plasma media-tiempo en los animales de control y después de 0.2, 1, o 5 mg/kg se pueden encontrar en las Tablas 5, 6, y 7 y las Figuras 4, 5 y 6 para cocaína, benzoilecgonina y éster metílico de ecgonina, respectivamente.
En general, las concentraciones en plasma de cocaína parece que disminuyen como una función de la dosis de AlbuBChE y el incremento como una . función de tiempo después de la administración de · AlbuBChE. Las concentraciones de cocaína a 240 horas después de la administración de AlbuBChE parece que están en el mismo intervalo como el grupo d control de cocaína del Día 1 (Figura 7). Esto sugiere que la AlbuBChE no fue activa a 240 horas después de la administración de AlbuBChE de 0.2, 1 o 5 mg/kg. Esto también indica que la cinética de la cocaína no muestra cinética dependiente de tiempo en monos cynomolgus haciendo factible la comparación del control de cocaína de una sola dosis IV de Día 1 al perfil de cocaína de múltiples dosis después de la administración de AlbuBChE'.
Como se podría esperar con base en la ruta metabólica de la cocaína (Figura 9) , las concentraciones en plasmas de benzoilecgonina parece que disminuyen como una función de la dosis de AlbuBChE y se incrementan como una función de tiempo después de la administración AlbuBChE. '
Teóricamente, la concentración en plasma de éster metílico de ecgonina debe incrementar la siguiente administración de AlbuBChE (Figura 9) . Este incremento solo fue evidente en la dosis de cocaína administrada a 2.horas después de la administración de AlbuBChE para todos los tres niveles de dosis de AlbuBChE.. La concentración en plasma de éster metílico de ecgonina no se podría distinguir fácilmente del control después de la administración de cocaína 48, 96, 120 o 240 horas después de la administración de AlbuBChE.
Tabla 5 : Concentración Media en Plasma de Cocaína (ng/mL) versus tiempo (min) en monos Cynomolgus después de la dosis IV de cocaína de 1 mg/kg en animales de control <n-2) o a 2, 48, 72, 96, 120 y 240 horas después de la dosis IM de AlbuBChE de 0.2, 1, o 5 mg/kg (n=3 por grupo de dosis) .
Control y dosis de 0.2 mg/kg de AlbuBChE
Control y dosis de 1 mg/kg de AlbuBChE
Control y dosis de 5 mg/kg de AlbuBChE
Tabla 6: Concentración Media en Plasma de Benzoilecgonina
(ng/mL) versus tiempo (min) en Monos Cynomolgus después de 1 dosis IV de cocaína de 1 mg/kg en animales de control <n-2) a 2, 48, 72, 96, 120 y 240 horas después de la dosis IM d AlbuBChE de 0.2, 1, o 5 mg/kg (n=3 por grupo de dosis) .
Control y dosis de 0.2 mg/kg de AlbuBChE
Control y dosis de 1 mg/kg de AlbuBChE
Control y dosis de 5 mg/kg de AlbuBChE
Tabla 7 : Concentración en Plasma de Ester Metílico de Ecgonina (ng/mL) versus tiempo (min) en Monos Cynomolgus después de la dosis IV de cocaína de 1 mg/kg en animales de control (n=2) o a 2, 48, 72, 96, 120 y 240 horas después de la dosis IM de AlbuBChE de 0.2, 1 , o 5 mg/kg (n=3 por grupo de dosis) .
Control y dosis de 0.2 mg/kg de AlbuBChE
Control y dosis de 1 mg/kg de AlbuBChE
Control y dosis de 5 mg/kg de AlbuBChE
Análisis Faxmacocinético de la AlbuBChE
Los valores de parámetros farmacocinéticos de la AlbuBChE después de una sola dosis IM de una dosis de 0.2, 1 o 5 mg/kg de AlbuBChE en animales individuales y estadística descriptiva por grupo se pueden encontrar en la Tabla 8. Los valores de parámetro PK medios para AlbuBChE después de la dosificación IM en 0.2, 1 o 5 mg/kg se resumen en la Tabla 9.
La absorción en general del sitio IM de administración fue rápida con concentraciones: medibles observadas en la primera muestra recolectada (1 hora después de la dosis) . Se observó una concentración máxima a 3 horas para el nivel de dosis de 0.2 y 1 mg/kg. Los valores Tn,ax fueron ligeramente más prolongados (6 horas) para la dosis de 5 mg/kg.
La exposición de AlbuBChE se incrementó con la dosis de incremento. Los valores Cmax y AUC normalizados con dosis parece que sé incrementan como una función de dosis sugiriendo un incremento más que proporcional . en la exposición como una función de dosis. Esto también se acompañó con un incremento en la eliminación terminal tv, como una función de dosis ¦ particularmente entre los niveles de dosis de 1 y 5 mg/kg donde el valor t¼ casi se duplicó.
Tabla 8 : Valores Individuales y Medios del Parámetro Farmacocinético de AlbuBChE en Monos Cynomolgus después de una sola administración IM de dosis de 0.2, 1 o 5 mg/k/animal de AlbuBChE.
Dosis de 0.2 mg/kg de AlbuBChE
Animal # R T1/2 (hr) AUC(0.,) ' AUCM AUC %
(ng/mL) (ng/mL) (hr*ng/mL) (hr*ng/mL)
17691 1.00 3 15.3 3 176 2746 3404 19.3
17692 1.00 3 42.1 3 279 7878 9704 . .18.8
17693 0.980 7 24.4 3 281 8479 9867 14.1
Medio 27.2 245 6368 7658 17.4
SD 13.6 59.8 3151 3686 2.90
% de CV 50.0 24.4 49.5 48.1 16.7
Dosis de 1 mg/kg de AlbuBChE
Animal # R T1/2 (hr) Tmax AUC((M) AUC^, AUC %
(ng/mL) (ng/mL) (hrVig/mL) (hr*ng/mL)
17694 0.990 6 28.4 3 1666 43128 44251 2.54
17695 0.992 8 34.3 3 1374 51298 53255 2.67
17696 0.992 6 30.3 3 1956 46185 47564 2.90
Medio 31.0 1665 46871 48357 3.04
SD 3.03 291 4128 4554 0.581
% de CV 9.76 17.5 8.81 9.42 ' 19.1
Dosis de 5 mg/kg de AlbuBChE
Animal # R T1/2 (hr) Tmm AUC(o-,) AUC(o^) AUC %
(ng/mL) (ng/mL) (hr*ng/mL) (hr*ng/mL)
17697 0.999 4 63.4 6 6016 201754 205584 1.86
17698 1.00 3 56.4 6 17687 437848 441992 0.938
17699 1.00 3 65.5 6 6530 235983 240442 1.85
Medio 61.8 10078 291862 296006 1.55
SD 4.73 6595 127581 127623 0.532
% de CV 7.66 65.4 43.7 43.1 34.3
Tabla 9 : Valores Medios del Parámetro Farmacocinético para
AlbuBChE después de una sola inyección IM en monos cynomolgus a 0.2 , 1 o 5 mg/kg .
Análisis Fazmacocinético de Cocaína y Métabolitos
La tabla de resumen de los valores farmacocinéticos de la cocaína por grupo de dosis se presentan en la Tabla 10.
El perfil farmacocinético de la cocaína se caracterizó bien para todos los grupos de dosis y los puntos de tiempo con una excepción: el perfil de concentración en plasma-tiempo para la dosis de cocaína administrada' en 2 horas después de la dosis de AlbuBChE fue variable para todos los grupos de dosis. Como tal, la eliminación terminal t¾ no se podría caracterizar con precisión en la mayoría de los animales en esta ocasión de dosificación de cocaína.
La AUCjo-t) de cocaína parece que disminuye como una función de la dosis de AlbuBChE y se incrementa como una función de tiempo después de la administración de' AlbuBChE. Similarmente, la eliminación plasmática sistémica de cocaína parece que se incrementa como una función de . dosis de AlbuBChE y regresa a los valores de control como una función de tiempo la después de. la dosis de AlbuBChE. A 240 horas después de la administración de AlbuBChE la AUC y eliminación de cocaína parece que está en el mismo intervalo como en el grupo de control de cocaína del Día 1.
Para todos los tres niveles de dosis de AlbuBChE, el efecto de AlbuBChE máximo en la eliminación AUC de cocaína se observó a 48 horas después de la dosis. La duración del efecto se relacionó con los niveles de dosis de AlbuBChE . Después de la dosis de 5 mg/kg, el efecto de AlbuBChE en la AUC y eliminación de cocaína fue evidente hasta 120 horas después de la dosis. En la dosis de 1 mg/kg, el ' efecto de AlbuBChE en la AUC o eliminación de cocaína aún fue evidente de 96 a 120 horas después de la dosis de post-AlbuBChE relativa con el control o los valore de 240 horas. Como la dosis de AlbuBChE disminuyó a 0.2 mg/kg, lo hizo de esta manera la duración del efecto con .48 horas que comienza en el último punto de tiempo con eliminación elevada de cocaína. Con base en estos datos, es más probable un régimen de dosificación de una vez o dos veces a la semana de AlbuBChE.
Como se puede observar en la Figura 5, el perfil de concentración-tiempo de la benzoilecgonina no incluyó una fase de eliminación terminal. Como tal, la caracterización farmacocinética de la benzoilecgonina se limitó a la caracterización de AUC(0-t) - La tabla de resumen de los valores AUC medios como una función de la dosis de AlbuBChE y el tiempo después de la dosis de AlbuBChE en comparación con el grupo de control de cocaína se puede encontrar en la Tabla 11. Consistente co la ruta metabólica de cocaína (Figura 9), la AUC de la benzoilecgonina disminuyó como una función de la dosis de AlbuBChE y se incrementa como una función de tiempo después de la administración de AlbuBChE como se muestra en la Figura 11.
Como se puede observar en la Figura 6, el perfil de concentración-tiempo de éster metílico de ecgonina fue único y no incluyó una fase de' eliminación terminal. Como tal, no se condujo caracterización farmacocinética del éster metílico de ecgonina. Teóricamente, la AUC del éster metílico de ecgonina debe incrementarse después de la administración de AlbuBChE (Figura 9) . Este incremento solo fue evidente en la dosis de cocaína administrada a 2 horas después de la administración- de AlbuBChE para todos los tres niveles de dosis de AlbuBChE. El efecto de AlbuBChE en el éter metílico de ecgonina no se podría distinguir fácilmente del control después de la concentración de cocaína a 48, 96, 120 o 240 horas después de la administración de AlbuBChE.
Tabla 10: Valores medios del parámetro farmacocinético de la cocaína en monos Cynomolgus después de una dosis IV de 1 mg/kg de cocaína en animales de control (n-2) o a 2, 48, 72, 96, 120 y 240 horas después de la dosis IM de AlbuBChE de 0.2, 1, o S mg/kg (n=3 por grupo de dosis) .
NA no aplicable o no determinado debido a que no permitieron datos.
Tabla 11: Tabla de Resumen de la AUC(o-t) Media Benzoxlecgonxna (min* ng/mL) en animales de control y una función de tiempo la después de la dosis de AlbuBChE.
Análisis PK/PD
Con base en el mecanismo de acción de AlbuBChE se anticipó que un modelo Emax inhibidor de efecto directo seria capaz de caracterizar la relación de PK/PD de la AlbuBChE y cocaína.
Los datos de PK y PD utilizados en los análisis se muestran en la Tabla 12. El ajuste que resulta del modelo Emax de efecto inhibidor Sigmoideo directo se muestra en la Figura
Los datos muestran claramente que la relación inversa entre la concentración en suero de AlbuBChE y la exposición a cocaína. La concentración en suero de AlbuBChE que puede dar por resultado 50% de disminución en la concentración de cocaína (EC50) se estimó por el modelo que es - 600 ng/mL. Emax, E0, y los valores Gamma fueron 12909 (min*ng/mL) , 1096 (min*ng/mL) , y 0.708, respectivamente.
Tabla 12 : Análisis P /PD de AlbuBChE de Monos Cynomolgus después de una sola administración IM de una dosis de 0.2, 1 o 5 mg/kg de AlbuBChE . La cocaína se administró IV en una dosis de 1 mg/kg en an males de control o a 2, 48, 96, 120 y 240 horas después de la dosis de AlbuBChE.
Parámetros PK: concentraciones plasmáticas de AlbuBChE por animales a 3#, 48, 96, 120 y 240 horas después de la dosis de AlbuBChE
Parámetro PD: AUC(o-4> de cocaína por animal a 2, 48, 9.6, 120 y 240 horas después de la dosis de AlbuBChE.
10 # la concentración de AlbuBChE no se midió a 2 horas después de la dosis de AlbuBChE, .las tres horas después de la dosis de AlbuBChE se utilizó en el análisis.
Observaciones de los Animales
Los animales se observaron por todo el estudio. No hubo muertes durante el estudio, y no hubo observaciones clínicas o de. jaula asociadas con la administración de AlbuBChE en cualesquier dosis. La administración de cocaína en una dosis de 1 mg/kg sin pre-tratamiento con el artículo de prueba dio por resultado hiperactividad y ritmo respiratorio incrementado con respiración abdominal. No se observaron observaciones relacionadas con la cocaína durante cinco días después del pre-tratamiento con el artículo de prueba en dosis de AlbuBChE que varían de 0.2 a 5 mg/kg pero regresaron en los días 6 y 11 de estudio.
Conclusiones
La AlbuBChE se toleró bien en monos Cynomolgus después de una sola dosis IM de 0.2, 1 o 5 mg/kg..
La absorción de AlbuBChE del sitio IM . de administración fue rápida. La Tmax se observó a 3 horas para la dosis de 0.2 y 1 mg/kg y 6 horas para la dosis de 5 mg/kg. La exposición de AlbuBChE parece que se. incrementa en una manera más que proporcionar como una función de dosis. La eliminación terminal t¾ se incremento de 31 a 62 horas- entre niveles de dosis de 1 y 5 mg/kg.
La cocaína sé administró a animales de control en el Día 1 y en a 2 , 48, 96, 120 y 240 horas después de la dosis de AlbuBChE. Después de cada administración de cocaína, se extrajeron múltiples muestras con el objetivo de determinar el perfil farmacocinético en respuesta, a la disminución de niveles de suero de AlbuBChE. La AUC(o-t) de cocaína disminuyó como una función de dosis de AlbuBChE y se incrementa como una función de tiempo después de la administración de AlbuBChE.
La duración del efecto se relacionó con los niveles de dosis de AlbuBChE.' El efecto de AlbuBChE en la AUC y eliminación de cocaína fue evidente hasta 120 horas para dosis de 5 mg/kg, 96-120 horas para dosis de 1 mg/kg y 48 horas para la dosis de 0.2 mg/kg. Con base en estos datos, es más probable un régimen de dosificación de una vez o dos veces a la semana de AlbuBChE.
La relación de PK/PD en monos Cynomolgus parece que indica una relación inversa entre la concentración en suero de AlbuBChE y la exposición a cocaína. La concentración en suero de AlbuBChE que puede dar por resultado 50% de disminución en la concentración de cocaína (EC50) se estimó por el modelo Emax de Efecto ' inhibidor Sigmoideo directo que es -600 ng/mL.
Ejemplo 2 - Estudio farmacocinético-farmacodinámico (PK/PD) de AlbuBChE en Monos Ardilla
Objetivo
Para ¦ evaluar la farmacocinética y la farmacodinámica de la AlbuBChE después de una sola inyección intramuscular de 5 mg/kg de AlbuBChE a monos Ardilla, el efecto farmacodinámico de AlbuBChE se midió después de la administración IV de cocaína en una dosis de 1 mg/kg en animales de control o a 2, 72 y 96. horas después de la dosis de AlbuBChE.
Diseño del Estudio
Nivel de Dosis: el nivel de dosis de AlbuBChE de 5 mg/kg se seleccionó con base en estudios anteriores en monos Cynomolgus en los cuales está este nivel de dosis en control que es efectiva en disminuir la exposición a cocaína. La dosis IV de cocaína de 1 mg/kg se basó en los reportes de literatura que tal dosis es suficiente para provocar un efecto en monos sin provocar hiperactividad excesiva. Se seleccionó la vía de administración IM para la dosificación de AlbuBChE debido a que esta es una vía de administración propuesta para humanos.
Tabla 13 : Sistema de Prueba y Materiales Limpios
Tabla 14; Designación de Grupos y Niveles de Dosificación
Muestras Farmacocxne'ticas de AlbuBChE
Se recolectaron muestras de sangre (0.4 mL) de la vena femoral y se colocaron en tubos separadores de suero (SST) en pre-dosis, 24, 12, 96 y 336 horas después .de la dosis (las muestras recolectadas a 336 horas' (14 días) después de la dosis se propusieron para evaluar la inmunogenicidad . Las muestras también se analizaron para concentración de AlbuBChE) . Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante por lo menos 1 hora, pero no a 4 horas de exceso antes de la centrifugación. Las muestras se centrifugaron y por lo menos 200 pL de suero se recolectó y se mantuvo en hielo seco antes del almacenamiento a aproximadamente -70°C.
Muestras Farmacocinóticas de Cocaína
Aproximadamente- 0.4 mL de sangre entera se recolectó de la vena femoral después de cada dosis de cocaína a 5 y 30 minutos después de la dosis. La muestra se colocó en tubos de recolección de sangre K2EDTA con inhibidor de esterasa (diisopropilfluorofosfato (DFP). Los tubos se invirtieron varias veces y se colocaron en hielo húmedo en la recolección. Las muestras se centrifugaron a 2-8°C dentro de 45 minutos de recolección. Se recuperó el plasma resultante y una sola alícuota de 200 de plasma se colocó en tubos de polipropileno. Las muestras de plasma se congelaron sobre hielo seco y se almacenaron a aproximadamente -70°C.
Análisis de la Muestra de AlbuBChE
El siguiente párrafo describe brevemente el ensayo basado en ELISA empleado en la medición de concentraciones de AlbuBChE en muestras de suero.
Placas Immulon 4 HBX se recubrieron con lOOul de BChE mAb 002-01 anti-humano (Abeam abl7246) a 1 g/mL en PBS, durante toda la noche a 4C. El bloqueo se hizo con caseína al 2% en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) , 200 L/pocillo, 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado, 100 ]i de muestras de suero diluidos se agregaron a las placas junto con los estándares. Los estándares se generaron a través de una dilución en serie, de 2.6 veces, de AlbuBChE de 420 a 5.2 ng/mL. Las muestras de suero y estándares se mantuvieron en .suero al 10% mediante la dilución con solución amortiguadora que contiene suero de monos cynomolgus combinado. Una etapa de lavado precede la detección con 100 µ? de mAb-6502-HRP anti-HSA a 0.04 µg/mL durante 1 hora. Los pocilios se lavaron nuevamente, antes de desarrollarse con 100 L de substrato de tetrametilbenzidina . Después de 15 minutos la reacción se terminó con 100 µ?/??????? de H2S04 1N y se leyó en un lector- de placa SpectraMax a 450/570 nm. Los valores para las muestras de suero desconocidas se calcularon mediante la interpolación de la curva estándar generada por el ajuste de 5 parámetros de estándares de AlbuBChE. Las muestras de suero recolectadas en pre-dosis y en el Dia 14 después de la dosis también se analizaron para inmunogenicidad.
Farmacocinética de la AlbuBChE y Análisis PK/PD
Se determinaron los valores del parámetro farmacocinético de AlbuBChE utilizando perfiles de concentración en suero-tiempo para animales individuales. Se utilizó el software de computadora WinNonlin Professional (Versión 4.0.1 Pharsight Corporation, EUA) . Específicamente se aplicó el modelo para el análisis sin compartimiento con la entrada extravascular . .
A pesar de la cantidad de datos limitados, se hizo un intento para caracterizar la relación de PK/PD. Se utilizó el software WinNonlin Professional (Versión 4.0.1 Pharsight Corporation, EUA) . Específicamente se utilizó el modelo Emax de Efecto Inhibidor directo en el cual el Emax se asumió en la concentración de AlbuBChE de cero. La ecuación modelo se puede describir como sigue:
E=Eraax* (1-(C/(C+EC50) ) )
El parámetro' PD utilizado en el análisis .fue la concentración en plasma de cocaína a 5 minutos después · de la dosis de cocaína. Los parámetros PK utilizados en el modelo fueron concentraciones plasmáticas de AlbuBChE a 2, 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE. Debido al hecho de que la concentración de AlbuBChE no se midió a 2 horas después de la dosis de AlbuBChE, se utilizó la primera muestra de tiempo recolectada en el análisis (24 horas después de la dosis de AlbuBChE) con las suposiciones de que la concentración de AlbuBChE a 24 horas después de la dosis de AlbuBChE puede reflejar la concentración de AlbuBChE a 2 horas después de la dosis de AlbuBChE. Debido a los datos limitados y las suposiciones utilizadas en el análisis, los valores de los parámetros de ese análisis PK/PD necesitan ser observados como estimaciones aproximadas.
Resultados
AlbuBChE
La Tabla 15 y la Figura 12 proporcionan el perfil de concentración en suero de AlbuBChE-tiempo en tres monos ardilla después de una sola administración intramuscular de una dosis de 5 m.g/kg de AlbuBChE. La Tabla 16 resume los valores de los parámetros farmacocinéticos de monos- Ardilla de AlbuBChE.
La inclinación de eliminación terminal de AlbuBChE se caracterizó bien como se indica por los valores Rsq que son mayores que 0.9. El área ¦ bajo la curva también se caracterizó bien como se indica por el % de AUC extrapolado que es menor que.20%. La fase de absorción inicial del perfil de concentración de AlbuBChE-tiempo no se caracterizó puesto que la primera muestra se recolectó a 24 horas después de la dosis. Como tal, el Tmax y Cmax reportados son evidentes puesto que el Traax actual se puede esperar que se presente entre 3 y 6 horas. La exposición de AlbuBChE fue consistente para los tres animales, con diferencias en los niveles solo evidentes claramente después de 2 semanas. Por ejemplo, los valores AUC para los tres animales estuvieron, en un intervalo estrecho con. % de CV de -7%. La ti 2 de eliminación terminal de AlbuBChE se estimó para variar de 45.5 a 65.5 horas (vida media promedio de 56.6 horas).
Tabla 15: Perfil de Concentración en suero de AlbuBChE (ng/mL) versus tiempo (hr) en Monos Ardilla Individuales después de una sola administración IM de una dosis de 5 mg/kg/animal de AlbuBChE.
Tabla 16: Valores de los Parámetros Farmacocinóticos de AlbuBChE en Monos Ardilla individuales después de una sola administración IM de una dosis de 5 mg/kg/animal de AlbuBChE.
Cocaína y metabolitos
La cocaína se administró IV en una dosis de 1 mg/kg en animales de control (n=2) o a 2, 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE (n=3). El método bioanalítico midió la concentración en plasma de cocaína y dos de sus metabolitos: éter metílico de ecgonina y ¦ benzoilecgonina . La ruta metabólica de la cocaína se muestra en la Figura 9, el metabolito de éter metílico de ecgonina se forma directamente de la cocaína a través de la enzima butirilcolinesterasa . Como tal, este metabolito se puede predecir que se incrementa después de la administración de AlbuBChE.
Los datos de la concentración individual y media en plasma de cocaína (ng/mL) versus tiempo (hr) en el control- y monos Ardilla tratados con AlbuBChE se' muestran en la Tabla 17. Un resumen de las concentraciones medias de cocaína versus tiempo se muestran en la Figura 13. Las concentraciones más altas de cocaína se observaron en un los animales de control. Los niveles más bajos de cocaína se observaron a 2 horas después de la administración de AlbuBChE que alcanzan valores que son de aproximadamente 7% de control. Las concentraciones de cocaína se incrementaron como una función de tiempo después de la administración de AlbuBChE todavía aún a 96 horas después de la administración de AlbuBChE, la concentración de cocaína aún fue del 60% de los animales de control.
Los datos de la concentración individual y media en plasma de éster metílico de ecgonina (ng/mL) versus tiempo (hr) en el control y monos Ardilla tratados con AlbuBChE se muestran en la Tabla 18. Un resumen de las concentraciones medias de éster metílico de ecgonina se muestra en la Figura 14. Como se espera, la concentración de éster metílico de ecgonina a 5 minutos después de la administración de cocaína fue baja en los animales, de control. Los valores fueron -40 veces mayores en los animales tratados con AlbuBChE con las concentraciones más altas observadas a 2 horas después de la dosis de AlbuBChE. Las concentraciones de éster metílico de ecgonina disminuyeron como una función de tiempo después de la administración dé AlbuBChE todavía aún a 96 horas después de la administración de AlbuBChE, la concentración de éster metílico de ecgonina aún fue mayor que en los animales de control.
Los datos de concentración en · plasma de benzoilecgonina individual y media (ng/mL) versus tiempo (hr) en el control y monos Ardilla tratados con AlbuBChE se muestran en la Tabla 19. Un resumen de las concentraciones medias de benzoilecgonina se muestra en la Figura 15. Como se ilustra, el efecto de AlbuBChE en el metabolito de cocaína benzoilecgonina fue menos pronunciado.
La Figura 16 muestra un resumen de los niveles en sangre de cocaína y los metabolitos de cocaína éster metílico de ecgonina (EME) y benzoilecgonina (BZ) a 5 y 30 minutos después de la inyección de cocaína. Comparada con una inyección de cocaína de control después de la administración del vehículo, dos horas después de la administración de AlbuBChE los niveles en sangré de cocaína se , redujeron significativamente en ambos puntos de tiempo de 5 y 30 minutos (F3,7 = 7.34, p < 0.05 y F3 = 14.4, p < 0.005 respectivamente) . Setenta y dos horas después de la AlbuBChE los niveles de cocaína estuvieron aún significativamente abajo de los niveles -de control 30 minutos después de la administración de cocaína. Los efectos de la AlbuBChE no fueron significativos en el punto de tiempo de ya sea 5 o 30 minutos 96 horas después de la administración. Los efectos de AlbuBChE en los niveles EME fueron similares, ' pero en la dirección opuesta a aquellos de la cocaína. Los en. sangre de EME se elevaron al punto de tiempo de tanto 5 como 30 minutos 2 horas después de la administración de AlbuBChE <F = 5.6, p < 0.05 y F3,7 = 33.3, p < 0.001). Los niveles, en ' sangre de EME siguieron siendo significativamente elevados a 72 horas después de la administración de AlbuBChE para el punto de tiempo de 30 minutos. Mientras que los niveles en sangre de BZ parecieron que se redujeron ligeramente 2 horas después de la administración de AlbuBChE, estos efectos no fueron significativos.
Tabla 17 : Concentración en Plasma de Cocaína (ng/mL) versus tiempo (hr) en Monos Ardilla Individuales después de una sola administración IM de una dosis de 5 mg/kg de AlbuBChE. La cocaína se administró IV en una dosis de 1 mg/kg en animales de control (n=2) o a 2 , 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE (n=3) .
Concentración de cocaína a 5 minutos después de la dosis de cocaína a 2 , 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE
Concentración de cocaína a 30 minutos después de la dosis de cocaína a 2 , 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE
Concentración de cocaína a 5 y 30 minutos después de la dosis de cocaína en animales de control
Tabla de Resumen de la Concentración Media de Cocaína versus Tiempo en animales de control y como una función de tiempo después de la dosis de AlbuBChE
Tabla 18: Concentración en Plasma de Ester metílico de Ecgonina (ng/mL) versus tiempo (hr) en Monos Ardilla Individuales después de una sola administración IM de una dosis de 5 mg/kg de AlbuBChE. La cocaína se administró IV en una dosis de 1 mg/kg en animales de control (n=2) o a 2, 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE (n=3) .
Concentración de Ester Metílico de Ecgonina a 5 minutos después de la dosis de Cocaína a 2 , 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE
Concentración de Ester Metílico de Ecgonina a 30 minutos después de la dosis de Cocaína a 2 , 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE
Concentración de Ester Metílico de Ecgonina a 5 y 30 minutos después de la dosis de cocaína en an ales de control
<LLOQ (1 ng/mL)
Tabla de Resumen de la Concentración Media de Ester Metílico de Ecgonina versus Tiempo en an males de control y como una función de tiempo después de la dosis de AlbuBChE
Tabla 19: Concentración en Plasma de Benzoilecgonina (ng/mL) versus tiempo (hr) en Monos Ardilla Individuales después de una sola administración IM de una dosis de 5 mg/kg de AlbuBChE . La cocaína se administró IV en una dosis de 1 mg/kg en an males de control (n=2 ) o a 2 , 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE (n=3) .
Concentración de Benzoilecgonina a 5 minutos después de la dosis de Cocaína a 2 , 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE
Concentración de Benzoilecgonina a 30 minutos después de la dosis de Cocaína a 2 , 72 y 96 horas después de la dosis de
Concentración de Benzoilecgonina a 5 y 30 minutos después la dosis de cocaxna en animales de control
<LLOQ (1 ng/mL)
Tabla de Resumen de la Concentración Media de Benzoilecgonina versus Tiempo en animales de control y como una función de tiempo después de la dosis de AlbuBChE
Relación de PK/PD de AlbuBChE
A pesar del número limitado de . untos de tiempo y animales, se hizo un intento para caracterizar la relación de PK/PD de AlbuBChE en monos Ardilla machos. Los datos de PK y PD utilizados en el análisis se muestran en la Tabla 20. Los datos individuales y el ajuste que. resulta del modelo Emax de efecto inhibidor directo · se muestra en la Figura 17. Los datos muestran claramente la relación inversa entre la concentración en suero de AlbuBChE y los niveles de cocaína. La concentración en suero de AlbuBChE que puede dar por resultado 50% de disminución en la concentración de cocaína (EC50) se estimó por el modelo que es -400 ng/mL. La Emax fue 213 ng/mL. Debido a los datos limitados y las suposiciones utilizadas en los análisis, los valores de los parámetros de este análisis PK/PD- no necesitan ser observados como estimaciones aproximadas.
Tabla 20; Análisis de PK/PD de AlbuBChE de Monos Ardilla Después de una sola administración IM de una dosis de 5 mg/kg de AlbuBChE. La cocaína se administró IV en una dosis de 1 mg/kg en animales de control (n=2) o a 2, 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE (n=3) .
Parámetros PK: concentración en plasma de AlbuBChE a 24*' 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE
Parámetro PD: concentración en plasma de cocaína a 5 minutos después de la dosis de cocaína
# Debido al hecho de que la concentración de AlbuBChE no se midió a 2 horas después de la dosis de AlbuBChE, la primera muestra de tiempo recolectada se utilizó en el análisis . (24 horas después de la dosis de AlbuBChE) con las suposiciones de que la concentración de AlbuBChE a 24 horas después de la dosis de AlbuBChE puede reflejar la. concentración de AlbuBChE a 2 horas después de la dosis de AlbuBChE.
Conclusiones
El perfil farmacocinético de AlbuBChE se caracterizó en tres monos ardilla machos después de una sola dosis 5 de mg/kg de AlbuBChE. El grado de variabilidad de exposición fue mínimo (~7%). Se estimó la ti2 de eliminación terminal AlbuBChE para variar de 4.5.5 a 65.5 horas.
Se administró cocaína IV en una dosis de 1 mg/kg en animales de control (n=2) o a 2, 72 y 96 horas después de la dosis de AlbuBChE (n=3) . El AlbuBChE provocó una disminución en la exposición a cocaína. El efecto no fue más pronunciado a 2 horas después de la dosis de AlbuBChE (<7% de control) . La exposición a cocaína fue -60% de control a 9.6 horas después de la dosis de AlbuBChE.
Consistente con el mecanismo de acción de la AlbuBChE, la exposición al metabolito de cocaína éster metílico de ecgonina se' incrementó -40 veces á 2 . horas después de la administración de AlbuBChE y disminuyó como una función de tiempo la después de la dosis de AlbuBChE.
El efecto de la AlbuBChE fue menos pronunciado en el metabolito de cocaína, benzoilecgonina .
La relación de PK/PD en Monos Ardilla parece que indica una relación inversa entre los niveles de concentración en suero de AlbuBChE y cocaína'. La concentración en suero de AlbuBChE que puede dar por resultados 50% de disminución en la concentración de cocaína (EC50) se estimó por el modelo Emax de efecto inhibidor directo que es ~400 ng/mL. Debido a los datos limitados y las suposiciones utilizadas en el análisis, los valores de los parámetros de este análisis de PK/PD necesitan ser observados como estimaciones apropiadas.
Ejemplo 3 - AlbuBChE: Un Estudio de Farmacología de Seguridad Cardiovascular en Monos Cynomolgus con o sin Administración de Cocaína
Objetivo
Para evaluar la seguridad cardiovascular y respiratoria de la AlbuBChE administrada por. la vía intramuscular (IM) en 3' monos cynomolgus machos y tres hembras. Además, el efecto de la cocaína (administrada por la vía intravenosa (IV)), la AlbuBChE y su combinación en la seguridad cardiovascular se evaluó en otro grupo de 3 monos cynomolgus y 3 hembras.-Diseño del Estudio
Antes de comenzar el estudio, a los monos se les colocaron quirúrgicamente transmisores de telemetría y puertos de acceso vascular. Se supervisaron los siguientes parámetros CV: presión sistólica, presión diastólica, presión sanguínea arterial media, frecuencia cardíaca media y producto de frecuencia - presión media. También se supervisaron los cambios de temperaturas corporales.
El grupo de estudio 1 (3 machos y 3 hembras) sirvieron como un grupo de control para someter a prueba el efecto de la AlbuBChE sola comparada con su vehículo. Los monos se administraron (IM) con solución amortiguadora 'de formulación de AlbuBChE de artículo de control en los Días de Estudio (SDs) 1 y 4. Tres horas después de la administración del solución amortiguadora de "formulación se registraron los parámetros respiratorios y cardiovasculares (CV) , respectivamente.
Una sola dosis IM del articulo de prueba (AlbuBChE a 15mg/kg) se administró en SD 8 y 11. Tres horas después de la dosificación de' AlbuBChE (.que corresponde a Tmax de AlbuBChE) se supervisaron los parámetros CV y respiratorios, respectivamente.
El efecto del pre-tratamiento con AlbuBChE antes de la dosis de cocaína en los parámetros de CV se sometió a prueba en el segundo grupo (Grupo 2) de los animales (3 machos y 3 hembras) . Primero se registraron los parámetros de CV de valor de referencia de SD 15 después de una administración IM de solución amortiguadora de formulación de AlbuBChE seguido por una sola administración IV de solución salina (vehículo de ' cocaína) , 3 .horas después. El efecto de la cocaína en los parámetros de CV se midió en SD 18, en el cual los animales recibieron una sola inyección IM de solución amortiguadora de formulación de AlbuBChE seguido por una sola dosis IV de cocaína (lmg/kg, IV), 3 horas después.
El efecto del pre-tratamiento con AlbuBChE en cambios inducidos por ' la cocaína en los parámetros de CV se supervisó en SD 22. Los parámetros CV se registraron subsecuentemente a una sola dosis IM de AlbuBChE (15mg/kg) seguido por una sola dosis IV de cocaína (lmg/kg) , 3 horas después (véase la Tabla 21) .
Todos los animales se observaron por lo menos dos veces al día para morbilidad, mortalidad, lesión, y disponibilidad de alimento y agua. Se supervisaron las respuestas fisiológicas a la administración del artículo de prueba, incluyendo presión sanguínea, frecuencia cardíaca, temperatura corporal y electrocardiograma (ECG) .
Tabla 21: Designación del Grupo y Niveles de Dosificación
Resultados
Todos los animales sobrevivieron a la terminación del estudio.
Grupo de Estudio 1
La AlbuBChE a 15mg/kg (IM) ) no produjo ningún cambio significativo en los parámetros CV registrados, tampoco en la temperatura corporal comparada con los valores de valor de referencia determinados con el solución amortiguadora de formulación de AlbuBChE, como se muestra en las Figuras 18-26.
Grupo de Estudio 2
Centro de dos minutos después de la administración de cocaína (1.0 mg/kg, IV) se incremento la presión arterial media (MAP) por aproximadamente 35 mmHg arriba del valor de valor de referencia de 105 mmHg. El pre-tratamiento con 15mg/kg antes de la. dosis de cocaína mostró que no solo fue la presión sanguínea máxima que se incrementó por la AlbuBChE sino el tiempo para revertir el efecto también se trunco por 4.5 veces (17 minutos en el pre-tratamiento con- AlbuBChE antes de la dosis de cocaína comparado con 77 minutos cuando la cocaína se administró sola)., como, se muestra en la Figura 27.
La administración de cocaína (1.0 mg/kg, IV) indujo un rápido incremento en la frecuencia cardíaca dé un valor de valor de referencia de 140. latidos/minutos que alcanza un valor pico de 240 latidos/minutos (70% de incremento) dentro de aproximadamente 3 minutos. Esta elevación inducida por cocaína en la frecuencia cardíaca se sostuvo durante aproximadamente 15 minutos disipándose gradualmente regresando al valor de valor de referencia 2 horas después de la administración de la cocaína. El pre-tratamiento con cocaína alterada con .AlbuBChE - indujo la elevación en la frecuencia cardíaca que muestra un incremento rápido pero moderado de 30% a un valor pico de 182 latidos/minuto dentro de aproximadamente 3 minutos . Este incremento leve en la frecuencia cardíaca se revirtió completamente regresando al valor de valor de referencia 30 minutos ya después de la dosis de cocaína, como se muestra en la Figura 30.
La administración de cocaína (1.0 mg/kg, IV) dio por resultado un ' incremento leve y en etapas en la temperatura corporal con un valor pico de 38.7°C a 45 minutos después de la dosis comparada con la temperatura de valor de referencia de 38 °C. El pre-tratamiento. con AlbuBChE (15 mg/kg, IM) antes de la dosis de cocaína provocó solamente un incremento sutil en la temperatura corporal a un valor de 38.3°C, como se muestra en la Figura 32.
Ejemplo 4 - AlbuBChE: Una Auto-Administración de Cocaina y Restablecimiento del Estudio de Auto-Administración de Cocaina en Monos Ardilla
Métodos
Sujetos
Monos Ardilla machos adultos (Saimirí ' sciureus) pesando 0.8 a 1.2 kg se utilizaron como sujetos. Todos los monos se alojaron individualmente en una habitación con humedad y temperatura controladas y tuvieron libre acceso a agua. Los monos se alimentaron después de cualesquiera procedimientos experimentales con una cantidad de alimento (Lab Diet 5045, ??G Nutrition International, Richmond, IN; Banana Softies, Bio-Serv, Frenchtown, NJ) determinada para mantener un peso estable. Fruta fresca, vegetales y enriquecimiento ambiental también se les proporcionó diariamente. Las instalaciones para el cuidado de los animales se acreditó completamente por la AAALAC y todos los experimentos se aprobaron por el NIDA Intramural Research Program Animal Care and Use Committee.
Auto-Administración- de Cocaína
Tres monos se entrenaron para auto-administrarse 30 pg/kg/inyección de cocaína i.v. Los detalles del procedimiento de entrenamiento de auto-administración se puede encontrar en cualquier lugar (Justinova y colaboradores., 2003). En resumen, los monos se colocaron en una posición centrada en una silla de restricción de Plexiglás. La silla se encerró en una cámara acústica más grande. En la pared frontal de la silla de restricción hubo una palanca de respuesta y luces de estímulo. Una luz verde señaló el inicio de la sesión. Los monos se entrenaron para hacer 10 respuestas (relación fija FR, 10) para récibir una inyección i.v. de cocaína. La inyección de cocaína se acompañó por la luz verde apagándose y una luz de estímulo amarilla que se presenta por 2 segundos. Después de cada inyección de cocaína también hubo un tiempo de espera de 60 segundos. Al final del tiempo de espera, la luz verde se encendió. Las sesiones duraron 1 hora. Ocasionalmente, la solución salina se sustituyó por cocaína. Después del establecimiento de la auto-administración de cocaína estable y la extinción confiable de respuesta después de la sustitución con solución salina, ' la AlbuBChE (5 mg/kg, i.m.) o su vehículo (i.m.) se administraron 2 horas antes de una sesión de auto-administración. La respuesta de autoadministración entonces se midió durante 5 días consecutivos. Después de cada sustitución .de prueba de fármaco o solución salina, la respuesta para 30 ug/kg/inyección de cocaína se restableció durante por lo menos 5 días. Después de la prueba de restablecimiento (véase a continuación) , la dosis de cocaína disponible para la auto-administración se disminuyó a 10 g/kg/inyección y el efecto de la AlbuBChE (5 mg/kg, i.m.) se determinó nuevamente- Restablecímiento de la Auto-administración de Cocaína
La solución' salina se sustituyó por cocaína en monos que se auto-administraron confiable 30 pg/kg/inyección de cocaína i.v. La respuesta disminuyó rápidamente y se mantuvo en ese nivel bajo por un número de días. El vehículo de AlbuBChE luego se administró 2 horas antes de la cocaína (0.3 mg/kg, i.v.), que se administró 5 minutos antes de una sesión donde la solución salina fue disponible para la autoadministración para determinar si la cocaína restablecería la respuesta de auto-administración. La misma dosis de cocaína también se administró antes de las sesiones de autoadministración de solución salina 48 y 96 horas después. Subsecuentemente, la AlbuBChE (5 mg/kg, i.m.) se administró 2 horas antes a una segunda secuencia de 3 pruebas de restablecimiento con 0.3 mg/kg de cocaína i.v. Después de estas pruebas, los monos se regresaron a la línea base donde 30 ug/kg/inyección de cocaína fue disponible para la autoadministración. Subsecuentemente, la solución salina se sustituyó nuevamente por cocaína y una segunda serie de pruebas de restablecimiento se condujeron en una manera similar excepto que 0.1 mg/kg de cocaína i.v, se administró antes de las sesiones de restablecimiento.
Fármacos
La AlbuBChE se administró por TEVA Pharmaceutical
(Netanya, Israel) en una solución congelada a una concentración de 30 mg/ml. Una vez descongelada la solución se diluyó a 15 mg/ml con vehículo y luego se administró a los monos en un volumen de 0.33 ml/kg. La cocaína (NIDA, Baltimore, MD) se preparó en solución salina estéril y se administró en un volumen de 0.2 mi para auto-administración. Cuando se administró como un pre-tratamiento para los estudios de restablecimiento, la cocaína se administró en un volumen de 0.3 ml/kg.
Análisis de los Datos
Los datos de nivel en sangre se analizaron separadamente para cada metabolito y punto de tiempo (5 o 30 min) . Un análisis de la varianza de una vía (ANOVA) se llevó a cabo con pruebas Dunnett de seguimiento utilizando los resultados de monos tratados con vehículo como el control . Los datos de la auto-administración se . analizaron separadamente para tasa de respuesta o inyecciones después de su tratamiento con vehículo o tratamiento con AlbuBChE. Los datos de control se incluyeron en el análisis al tomar el promedio de por lo menos 3 días para la condición de valor de referencia inmediatamente anterior. Después se realizó un ANOVA dentro de sujetos con pruebas de seguimiento que contrastan los días después del vehículo o AlbuBChE con el control. Para las pruebas de restablecimiento, se llevó a cabo un ANOVA de dos vías p AlbuBChE como el factor dentro de sujetos y el pre-tratamiento (vehículo o AlbuBChE) como el factor entre sujetos. El contraste de seguimiento se comparó con el vehículo y la AlbuBChE en cada punto de tiempo.
Resultados
En monos a los que se auto-administran 30 ug/kg/inyección de co'caína, la AlbuBChE redujo la autoadministración. Los paneles de la Figura 33 muestran la tasa de respuesta (panel superior) y las inyecciones (panel inferior) en días consecutivos. Los primeros cinco días muestran la respuesta de valor de referencia. La solución salina luego se sustituyó por cocaína y tanto la tasa (Fs,io = 37.0, p < 0.001) como las inyecciones (F5,io = 188.7, p < 0.001) se redujeron significativamente durante los 5 días de sustitución cuando se compararon con el promedio de los últimos 3 días del periodo de valor de referencia anterior. Después de un retorno de 5 días á la linea base, los monos se trataron con vehículo y se les dio 5 días de entrenamiento de auto-administración. Cuando se compara con el promedio de los últimos 3 días del período de valor de referencia anterior, el tratamiento con vehículo no tuvo efecto en las inyecciones (F5,io = 2.6, p = 0.10).. Un efecto total de días se observó para tasa de respuesta (F5(10 = 4.6, p < 0.05), sin embargo los contrastes de seguimiento no lograron revelar ningún cambio significativo en la respuesta del control o en cualquiera de los 5 días después del tratamiento con vehículo. Después del tratamiento con vehículo, los monos se les administró 5 mg/kg de AlbuBChE y la auto-administración de cocaína se siguió durante 5 días. Los cambios significativos del promedio de los últimos 3 días del valor de referencia previo se observaron para tanto la tasa de respuesta (F5 i0 = 4.6, .p < 0.05) como las inyecciones (F5(i0 = 14.1, p < 0.001). El contraste de seguimiento reveló que la tasa de respuesta fue diferente del control en los días 1-4 después del tratamiento y las inyecciones fueron significativamente diferentes del control en los días 1 y 4 después del tratamiento.
Después de la prueba de restablecimiento (véase a continuación) , los monos se regresaron a la autoadministración en una dosis de cocaína inferior (10 pg/kg/inyección) . La disminución de la dosis de mantenimiento disminuyó la tasa de respuesta y el número de inyecciones (Figura 33 paneles derechos). Después de la estabilidad del valor de referencia, .a los monos se les administra una inyección de vehículo y la auto-administración continuó durante 5 días.
No cambiaron significativamente la tasa de respuesta ni las inyecciones después de la inyección con vehículo comparada con el promedio de los últimos 3 días en la línea base. Luego se administró la AlbuBChE (5 mg/kg) y la auto-administración de cocaína continuó durante 5 días adicionales. Tanto la tasa de respuesta como las inyecciones disminuyeron 2 horas después de la inyección con AlbuBChE, pero estos efectos no lograron alcanzar una importancia.
En los monos que estuvieron respondiendo para 30 pg/kg/inyección de cocaína, la sustitución de solución salina para cocaína . condujo a una rápida disminución en la respuesta. El vehículo de AlbuBChE entonces se administró i.m. Dos, 48 y 96 horas después se administraron 0.3 mg/kg de cocaína i.v. 5 minutos antes de una sesión de sustitución de solución salina. La administración de cocaína condujo a un restablecimiento de respuesta . de auto-administración de cocaína como se muestra en las barras negras en los paneles izquierdos de la Figura 34. Cuando se administró i.m. 5 mg/kg de AlbuBChE, y 2 horas, 48 horas y 96 horas después se administraron 0.3 mg/kg de cocaína i.v. inmediatamente antes de una sesión de. sustitución de solución salina, el restablecimiento de la respuesta se. bloqueó significativamente en el punto de' tiempo de 2 horas para tanto la tasa de respuesta (Fi,4 = 16.9, p < 0.05)' como las inyecciones (Fi(4 = 34.9, p < 0.001). Los monos se sometieron a prueba subsecuentemente en. una manera idéntica con 0.1 mg/kg de cocaína como. la dosis de restablecimiento. Mientras que el restablecimiento a la dosis de cocaína inferior fue más variable, se o.bservó un patrón similar de resultados con el efecto de 5 mg/kg de AlbuBChE nuevamente significativo a 2 horas para tanto las respuestas (Fl,4 = 15.2, p < 0.05) como las inyecciones (Fi,4 = 129.7, p < 0.001).
En 4 monos que se entrenaron para discriminar 0.6 mg/kg de metanfetamina de solución salina, la cocaína se sustituyó completamente para metanfetamina en una dosis de 0.3 mg/kg (Figura 35, panel superior). Cuando se administraron 5 mg/kg de AlbuBChE 2 horas antes de la determinación de la función de dosis-efecto de cocaína, 0.3 mg/kg de cocaína no logró generalizar el impulso, a la metanfetamina .
Se observó una sustitución parcial (aproximadamente 70%) en una dosis 'de cocaína más alta (1.0 mg/kg) . Veinticuatro horas después de la AlbuBChE, la dosis de 0.3 mg/kg de cocaína aún no logró generalizar completamente el impulso a la metanfetamina (aproximadamente 70%), pero 1.0 mg/kg se generalizó ahora completamente a la metanfetamina . Por 48 horas después de la AlbuBChE, la dosis de 0..3 mg/kg se generalizó completamente al impulso.de metanfetamina . El pre-tratamiento con AlbuBChE 2 horas antes de la determinación de la función de dosis-efecto de la metanfetamina no afectó la generalización de la metanfetamina al impulso de metanfetamina (Figura 36, panel superior). El pre-tratamiento con AlbuBChE no afectó la tasa de respuesta bajo cualquiera condición de tratamiento (Figuras 35 y 36, paneles inferiores) .
Los monos entrenados para administrarse cocaína y también se sometieron aprueba en el procedimiento de restablecimiento recibieron un total de 4 inyecciones de AlbuBChE. Se tomó sangre para la determinación de los anticuerpos de AlbuBChE después de la primera, segunda y cuarta inyección de AlbuBChE. Después de las primeras 2 inyecciones, los niveles de anticuerpos estuvieron abajo del nivel de detección (nivel de titulo de 20) . Después de la cuarta inyección, sin embargo, los niveles de anticuerpos se presentaron elevados. En 2 monos el titulo de anticuerpo se elevó ligeramente sobre el limite de detección (21 y 43) . Para el tercer mono, los niveles de anticuerpos se elevaron claramente (643). La concentración de AlbuBChE en la sangre para este mono una semana después de la inyección de AlbuBChE también se redujo reduce (27 ng/ml versus 55 y 53 ng/ml para los otros 2 monos) .
Planteamiento
Los resultados. de estos estudios muestran claramente que el pre-tratamiento . con una forma modificada de BChE es efectivo en antagonizar los efectos de comportamiento de la cocaína en un primate no humano. Este trabajo se extiende al trabajo previo con este compuesto en roedores, donde se mostró que la AlbuBChE podría antagonizar los efectos tóxicos en la cocaína en ratas y también bloquear el restablecimiento inducido por cocaína de la ' autoadministración de cocaína (Brimijoin y colaboradores., 2008). En este punto, el pre-tratamiento con 5 mg/kg de AlbuBChE redujo tanto la tasa de respuesta como inyecciones en monos que se auto-administran en 30 ug/kg/inyección de cocaína. En estos mismos monos sometidos a prueba para el restablecimiento de la auto-administración de cocaína después de la extinción . de .la auto-administración, 5 mg/kg de AlbuBChE fueron capaces de bloquear el restablecimiento de la respuesta por ya sea 0.3 mg/kg o 0.1 mg/kg de cocaína. Cuando la dosis disponible para la auto-administración se redujo a 10 pg/kg/inyección, la AlbuBChE pareció nuevamente que reduce la tasa de respuesta y el número de inyecciones recibidas, aunque estos efectos con 10 pg/kg/inyección de cocaína fueron más variables y no lograron alcanzar importancia. Finalmente, la dosis de 5 mg/kg de AlbuBChE también fue capaz de antagonizar la generalización de cocaína a un estímulo discriminativo de metanfetamina, pero este efecto fue específico a la cocaína ya que la AlbuBChE no fue capaz de antagonizar los efectos de estímulo discriminativos de la metanfetamina .
Cuando se sometieron a prueba nuevamente 30 pg/kg/inyección de auto-administración de cocaína, los efectos del AlbuBChE aún fueron evidentes 3 días después, aunque en una efectividad reducida. En el restablecimiento y discriminación, sin embargo, los efectos del AlbuBChE no fueron evidentes 48 horas después, del tratamiento. La vida media del AlbuBChE se mostró que es de aproximadamente 56 horas y los efectos en el metabolismo de la cocaína aún fueron evidentes 72 horas después de la administración del AlbuBChE, de modo que podría haber sido esperado que algún efecto en estos procedimientos habría sido evidente a 72 horas. Una variedad de factores podrían contribuir a esta falla para ver una reducción en el restablecimiento o generalizació de la cocaína a 72 horas. Durante la autoadministración dosis más pequeñas de cocaína se administraron durante un período de · tiempo prolongado. En los otros procedimientos una dosis relativamente más grande de cocaína se administró como una inyección en bolo. Puede ser más fácil para el AlbuBChE metabolizar la cocaína antes de que alcance el cerebro bajo las condiciones de auto-administración que bajo las otras condiciones. Cuando la AlbuBChE metaboliza la cocaína bajo la auto-administración, su afecto es instituir las condiciones de extinción. La recuperación de comportamiento de la extinción también puede prolongar los efectos del tratamiento con AlbuBChE en la autoadministración. En el · estudio de restablecimiento, la solución salina produjo la respuesta y el estímulo previo asociado con el refuerzo. Cuando los monos se restablecieron a la respuesta después de una inyección de cocaína, los monos aún recibieron solución salina para la respuesta,¦ pero también recibieron el estímulo asociado previamente con la cocaína. La presentación de este estímulo también pudo haber facilitado la respuesta continuada bajo las condiciones de restablecimiento (Spealman y colaboradores., 1999), cubriendo algunos de los efectos del AlbuBChE.
Los efectos del AlbuBChE casi se relaciónarón con certeza con sus efectos en el metabolismo de la cocaína. La administración del AlbuBChE disminuyó la cantidad de cocaína en la sangre durante por lo menos 72 horas. El hecho de que los niveles EME también se incrementaron para por lo menos 72 horas después de la AlbuBChE sugiere que la AlbuBChE estuvo metabolizando la cocaína similarmente a la BChE nativa (Jones, 1984). Este curso de tiempo para el metabolismo de la cocaína es similar a aquel observado para el experimento de auto-administración donde los monos se reforzaron con 30 µg/k:g/inyección de . cocaína. Además, la AlbuBChE no tuvo efecto en la tasa de respuesta en el estudio de discriminación, se sugirió que' no produjo un efecto no específico en la respuesta operante independiente de la presencia de cocaína en la sangre.
La observación de niveles relativamente ' altos de anticuerpos de AlbuBChE en un mono después de su cuarta inyección indica que la AlbuBChE podría perder algo de su efectividad en múltiples inyecciones. Mientras que ¦· los resultados para ese mono particular no pareció que sea diferente de los otros 2 monos sometidos a prueba, la observación de los anticuerpos sugiere que algo de la AlbuBChE se podría enlazar por. anticuerpos que podrían disminuir su capacidad a metabolizar la cocaína. Será necesario trabajo adicional para determinar que tan común es la producción de anticuerpos en primates y si los niveles de anticuerpos observados son · suficientes para disminuir la efectividad de la AlbuBChE en la metabolización ' de la cocaína .
La cocaína continúa mostrándose en ambas menciones de sala de emergencia y reportes de examinadores de médicos en las encuestas DAWN. Como tal, un fármaco que podría contrarrestar los efectos tóxicos de la cocaína puede ser un adjunto útil para tratamiento de salas de emergencia para pacientes que abusan de la cocaína.' Una ventaja de utilizar un fármaco que metaboliza la cocaína es que será específico para cocaína y debe tener efectos secundarios mínimos. Sin embargo, sería necesario confirmar que un paciente está utilizando cocaína ya que la AlbuBChE no podría ser efectiva contra la toxicidad producida por otros fármacos de abuso, tales como anfetaminas, que podrían producir un espectro similar de efectos tóxicos.
Además de tratar los' efectos tóxicos de la cocaína, la AlbuBChE podría también ser útil como un adjunto para otros tratamientos para el abuso de- cocaína. Una persona con un nivel en sangre suficiente de AlbuBChE ' quien toma cocaína sería esperado que experimente un . efecto subjetivo reducido de cocaína. En el contexto del estudio actual, esto se traduce a menos auto administración de cocaína, restablecimiento reducido de la auto-administración de cocaína y la falla de cocaína a generalizarse a los estímulos discriminativos de la metanfetamina . Como recaía al abuso de cocaína sigue siendo un problema en el tratamiento, los efectos subjetivos reducidos de la cocaína se podrían esperar para reducir la recaída. Para alguien que se somete a tratamiento que recae al uso, la presencia de AlbuBChE en la sangre metabolizaría mucha de la cocaína y ' reduciría potencialmente la probabilidad del uso continuado de cocaína. Esto requeriría que un individuo continúe tomando la AlbuBChE por todo el período de tiempo en que se esperaría la recaída. Por lo tanto, será crítico determinar que tan común es el desarrollo de anticuerpos a la AlbuBChE y como podría afectar su capacidad a metabolizar la cocaína.
En conclusión, el pre-tratamiento de monos Ardilla con AlbuBChE fue capaz de reducir la cantidad de cocaína en la sangre después de un tratamiento de bolo de cocaína. El pre-tratamiento con AlbuBChE también fue capaz de reducir la auto-administración de cocaína en monos que habían sido entrenados para auto-administrarse 10 y 30 µg/kg/inyección de cocaína. La AlbuBChE fue capaz de bloquear el restablecimiento inducido por cocaína de la ' autoadministración de cocaína por 2 dosis diferentes de cocaína. Finalmente, la AlbuBChE también fue capaz de antagonizar los efectos discriminativos de la cocaína en monos Ardilla. El descubrimiento de que. la AlbuBChE fue capaz dé antagonizar los efectos de comportamiento de la cocaína en 3 diferentes modelos de efectos de comportamiento de la cocaína sugiere que sería efectivo como un tratamiento potencial del abuso de cocaína.
Ejemplo 5 - Una sola dosis ascendente, controlada de placebo, doble ciego de AlbuBChE seguida por múltiples dosis de cocaína para evaluar los parámetros farmacocinóticos y farmacodinámicos de la coca na después de la administración de AlbuBChE en voluntarios recreativos de cocaxna
Objetivo
Para determinar los niveles en sangre de cocaína después de múltiples dosis subsecuentes a la administración de AlbuBChE, y para determinar los efectos de comportamiento, psicológicos y de seguridad de la cocaína después de dosis múltiples subsecuentes a la administración de AlbuBChE. Apra evaluar la farmácocinética, seguridad y tolerabilidad de la AlbuBChE.
Diseño de Estudio
Este es un estudio aleatorizado, de doble ciego, activo y controlado con placebo, de grupo paralelo de 5 brazos, para controlar el tratamiento con AlbuBChE con placebo como un control negativo.
Cuarenta (40) adultos sanos que no buscan tratamiento quienes han utilizado cocaína se asignaron aleatoriamente a cinco (5) grupos de tratamiento. Cada grupo contendrá ocho sujetos.
Grupo A (dosis baja): Los sujetos reciben una sola inyección intramuscular de 50 mg de AlbuBChE.
Grupo B (dosis intermedia) : Los sujetos reciben una sola inyección intramuscular de 100 mg de AlbuBChE.
Grupo C (dosis alta-intermedia) : Los sujetos reciben una sola inyección intramuscular de 150 mg de AlbuBChE.
Grupo D (dosis alta): Los sujetos reciben una sola inyección intramuscular de 300 mg de AlbuBChE.
Grupo E (control negativo) : Los sujetos reciben una sola inyección intramuscular de placebo.
El estudio se divide en 5 cohortes de 8 sujetos por cohorte con 2 a 3 días separados.
Fase de Hospitalización
Los sujetos permanecieron en la clínica desde la tarde antes del Día 1 (registro; Día 1) hasta la mañana del Día 11. Los sujetos regresaron a la clínica para visita de seguimiento en el Día 18±2.
Día -1: En la mañana del día -1, se administra una dosis intravenosa de 40 mg de cocaína.
Día 1: Se administra una sola dosis de AlbuBChE o placebo.
Día 1, 4, 8 y 10: En el Día 1, en Cmax de AlbuBChE (3 horas después de la dosis) y en la mañana de los días 4 (72 horas), 8 (168 horas) y 10 (216 horas) en el tiempo correspondiente de la administración de AlbuBChE/placebo, se administra una dosis de estimulación intravenosa de 40 mg de cocaína.
Se incluyen infusiones salinas (aleatorizadas con infusiones de cocaína,' administradas 2 horas de diferencia) en cada día de la administración de cocaína, y tienen el tipo de infusión de orden de simple ciego.
Administración del Fármaco de Estudio
Las dosis de AlbuBChE planeadas son como se describe en lo anterior para los grupos A-E. Cada sujeto recibe una sola dosis de AlbuBChE o placebo mediante inyección intramuscular (IM) . 40 mg de clorhidrato de cocaína, preparada como una solución salina de .1 mg/ml se inyecta en la vena del · antebrazo en la velocidad de 1 mg/segundo utilizando ' una bomba de infusión de velocidad constante.
Duración del Estudio
La duración .del estudio (desde la clasificación hasta el final de la visita de estudio (EOS) ) para .cada sujeto es de aproximadamente 11 a 12 semanas.
Población del Estudio
Un total de cuarenta (40) sujetos hombres de 18-55 años de edad quienes son usuarios de cocaína recreativos. Los sujetos quienes descontinúan el estudio por cualquier razón después de la dosificación no se reemplazan.
Criterios de Inclusión/Exclusión Principales
Criterios de Inclusión
1. Voluntarios hombres de 18-55 años de edad, inclusive;
2. índice de masa corporal (BMI) 18-33 kg/m2 y peso de por lo menos 50 kg;
3. Sanos, como se determina por, sin historial médico clínicamente significativo, examinación física, electrocardiograma . (ECG) , signos vitales y resultados de laboratorio en la clasificación;
4. Usar actualmente cocaína fumada, intranasal o vía i.v.; definida como por lo menos una vez al mes antes de la clasificación, 6 veces en el último año y 20 veces durante el tiempo de vida. El uso actual se confirma a través de una Prueba de Drogas por Orina positiva (UDS) antes del período de internación del paciente (es decir en la clasificación o entre la clasificación y el Día -1) ;
5. Capaz de' entender la naturaleza del ensayo y cualquier peligro de participar en él.
6. Capaz de comunicarse satisfactoriamente con el investigador y de participar, y cumplir con los requisitos del ensayo completo; y
7. Disponibilidad para dar el consentimiento escrito para participar, después leer la forma de información y consentimiento y después tener la oportunidad de plantear el ensayo con el investigador o su delegado y firmar el Consentimiento Informado.
Criterios de Exclusión
1. Historial actual de dependencia de alcohol o drogas de acuerdo con criterios DSM-IV-TR (Manual de Diagnósticas de Trastornos Mentales -última versión) (excluir nicotina y cafeína) , .o participación en programa de rehabilitación (excepto para dejar de fumar) ;
2. Historial ' de reacciones alérgicas anafilácticas graves;
3. Alergia o hipersensibilidad conocida a butirilcolinesterasa natural o recombinante (BChE) , albúmina de suero humano (HSA) o cualquier otro componente de la formulación;
4. Historial de cualquier enfermedad cardíaca, endocrina, hematológica, hepática, inmunológica, metabólica, urológica, pulmonar, . neurológica, dermatológica, psiquiátrica, renal u, otra mayor clínicamente significativa (como se determina por el investigador principal);
5. Historial de cualquier enfermedad maligna;
6. Trauma o cirugía mayor en los 2 meses antes de la clasificación o en cualquier momento entre la clasificación y el registro;
7. Infección .aguda dentro de 2 semanas antes de la clasificación o en cualquier momento entre la clasificación y el registro;
8. Descubrimientos de ECG anormal clínicamente significativos en la clasificación en las visitas de clasificación o registro, como . es determinado por el Investigador Principal;
9. Presión sanguínea fuera de los intervalos 90-140 mmHg sistólica o 45-90 mmHg diastólica (medida después de un descanso de por lo menos 5 minutos) en clasificación o registro. La presión .sanguínea se puede reajustar en la posición supina en intervalos de 5-10 minutos. La elevación de presión se considera sostenida si cualquier presión sistólica o diastólica excede los límites establecidos después de tres evaluaciones, y de esta manera el sujeto no se puede aleatorizar;
10. Frecuencia cardíaca <40 latidos/minuto (medida después de un descanso de por menos 5 minutos) en la clasificación o registro;
11. Historial conocido de o un resultado de prueba positiva para virus de inmunodeficiencia humana (HIV) tipos 1 o 2 en la clasificación; Historial conocido de, . o un resultado de prueba positiva para antigenos superficial de hepatitis B (HBsAg) o virus de hepatitis C (HCV) en la clasificación ;"
Uso de medicamentos con receta o de venta libre (GTC) (diferente a paracetamol (acetaminofen) , =2g/día o ibuprofen, =650 mg/dia) , fármacos de investigación, vitaminas, o hierbas medicinales, dentro de 2 semanas antes de la dosificación o dentro 5 vidas medias antes de la dosificación, lo que' sea más prolongado;
14. Participación en otro ensayo clínico de una nueva entidad química o una medicina de receta dentro de los tres meses antes de la dosificación o dentro de 5 vidas medias antes de la dosificación, lo que sea más prolongado;
15. Pérdida de >400 mL de sangre (por ejemplo, como un donador de sangre) dentro de meses antes de la dosificación, o haber recibido cualquier transfusión .de sangre, plasma o plaquetas dentro de 3 meses antes del registro, o quienes hayan planeado donaciones durante el estudio o dentro de 3 meses después del estudio;
16. El sujeto consume mayor que 20 cigarros al día en promedio, en el mes antes de la clasificación, o sea incapaz de abstenerse de fumar (o el uso de cualquier sustancia que contenga nicotina) durante por lo menos 6 horas (de modo que todas las evaluaciones relacionadas con antes de la dosis y después de, la dosis/infusión se pueden completar ininterrumpidamente) ;
17. UDS Positivo para anfetamina, cocaína (solamente en el Día -1), opioides, canabinoides , y benzodiazepinas . El resultado positivo para benzodiazepinas y canabinoides aceptables siempre y cuando sea estable o disminuya debido a vidas medias prolongadas. UDS positivo para otros fármacos dará por resultado la reprogramación en la discreción del investigador/designado; Prueba de aliento alcohólico positiva también dará por resultado la reprogramación en la discreción del investigador designado;
18. Exposición a pesticidas o cualquier otro organofosfato (por ejemplo trabajadores agrícolas) ;
19. Incapacidad de participar o completar exitosamente el estudio, en la opinión de su practicante general o el investigador, debido a que el voluntario es:
a. mental o legalmente incapacitado, o incapaz de dar su consentimiento por cualquier razón;
b. en custodia debido a una decisión administrativa o legal o bajo libertad condicional supervisada, o que sea admitido a un sanatorio o institución social;
c. incapaz de ser contactado en caso de emergencia; o
d. sin deseos a cooperar o cumplir con el protocolo de estudio clínico o sea inadecuado por cualquier otra razón.
Seguridad, tolerabilidad y Análisis de Inmunogenicidad
Seguridad
Se supervisan los signos vitales, incluyendo presión sanguínea, frecuencia cardíaca (parte de los parámetros PD) y temperatura corporal. Se realizan exámenes físicos, pruebas de 'laboratorio clínico, y ECGs de 12 derivaciones, con ECGs de 12 derivaciones después de cada infusión de cocaína, en la pre-infusión, 30 minutos y 2 horas después de la infusión, y 8 horas después de la primera infusión. Se realiza la telemetría durante 4 horas inmediatamente después de cada inyección de cocaína.
Las muestras para la . actividad de BChE y acetilcolinesterasa (AChE) se recolectan pero no. todas se someten a ensayo necesariamente. La actividad de la BChE. y AChE se determinó utilizando un método colorimétrico basado en el ensayo Ellman, que sirve como un ensayo de neutralización para las enzimas endógenas. Los puntos de tiempo de muestreo son en la clasificación, pre-dosis y después de la dosis 168 horas (Día 8), 240 horas (Día 11) y seguimiento (Día 18±2). Las pruebas de sangre para el ensayo Ellman se llevan a cabo antes de la administración de cocaína (donde sea relevante) .
Las infusiones intravenosas de cocaína se determinan inmediatamente antes y cualquiera de lo siguiente se presenta:
1. BP sistólica de 180 mm Hg o mayor;
2. BP diastolica de 100 mm Hg o mayor;
3. HR de 130 bpm o mayor; o
4. manifestaciones de comportamiento de .toxicidad psicoestimulante (agitación, psicosis, o incapacidad de cooperar con los procedimientos del estudio) .
Los sujetos se consideran que no han tolerado las infusiones libre de cocaína y cualquiera de lo siguiente se presenta:
1. Dolor agudo de pecho o falta de aliento;
2. BP sistólica de 180 mm Hg o mayor;
3. BP diastolica de 120 mm Hg o mayor;
4. HR de [220 - edad X 0.85] bpm o mayor (es decir, > que 170 bpm para un sujeto de 2.0 años de edad);
5. Eventos ¦ neurológicos o psiquiátricos. (por ejemplo, pánico o psicosis);
6. Anormalidades ECG clínicamente significativas (incluyendo bloqueo cardíaco, tres o más. latidos ventriculares ectópicos sostenidos, o taquiarritmias ) ;
7. Criterio de detención para la infusión de cocaína adicional de no regresar a los límites aceptables dentro de los marcos de tiempo apropiados (por ejemplo, 30 minutos) ; ¦
8. Criterios de detención para la infusión de cocaína adicional se cumplen para un segundo tiempo dentro del protocolo; o
9. Cualquier condición que en la evaluación clínica del PI que es de magnitud suficiente para presentar un peligro al sujeto.
Tolerabilidad de la Inyección IM de AlbuBCE
La tolerabilidad y dolor local (evaluados por la escala análoga visual (VAS) ) en el sitio de la inyección se evalúan durante las primeras 24 horas después de la dosificación. Los puntos de tiempo son: 20 min, 1, 2, 4, 8 y 24 horas después de la dosis de AlbuBChE.
Eventos adversos (AEs) se supervisan por todo el estudio.
Inmunogenicidad y (IG)
Las muestras para los niveles inmunogénicos se recolectan pero no todos se someten necesariamente a ensayo. Los títulos para anticuerpos contra HSA, butirilcolinesterasa (hBChE) humana y AlbuBChE se evalúan. Los puntos de tiempo de muestreo son; antes de la dosis y después de la dosis 168 horas (Día 8), 240 horas (Día 11) y seguimiento (Día 18±2). La pruebas de sangre para los ensayos IG se llevan a cabo antes de la administración de la cocaína (done sea relevante) .
Variables Farmacocinóticas y Muestreo
Para determinar la concentración en . suero de AlbuBChE, las muestras- de sangre se recolectan antes de la dosificación y en varios puntos de tiempo después dé la dosificación. Donde los datos lo. permitan, se calculan los siguientes parámetros farmacocinéticos (PK) :
Cmax concentración en- suero observada máxima
tmax tiempo para lograr Cmax
AUC(o-t) área bajo la curva concentración-tiempo en suero de 0 h al tiempo de la última concentración cuantificable
AUC(o—> área bajo la curva de concentración-tiempo en suero extrapolada a infinito
AUCext porcentaje de AUC(o-~> debido a la extrapolación de tías _ si infinito .
Vd/f volumen evidente de distribución durante la fase terminal
CL/f eliminación corporal total evidente
?? constante de velocidad de eliminación terminal, estimada por regresión lineal en la fase terminal de la concentración semi-logarítmica versus curva de tiempo
ti 2 vida media de eliminación terminal evidente
RT tiempo de residencia medio
Se pueden calcular los parámetros adicionales si se considera necesario. Los puntos de tiempo del muestreo para PK de AlbuBChE en suero son como , sigue: antes de la dosis y 20, 40 min, 1 hora, 1.5 horas, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas (Dia 2), 36 horas (Dia 2), 48. horas (Dia 3), 72 horas (Dia 4), 96 horas (Dia 5), 120 horas (Dia 6), 144 horas (Dia 7), 168 horas (Día 8), 192 horas (Dia 9)·, y 216 horas (Dia 10) después de la dosis. Cuando sea aplicable, los puntos de tiempo de muestreo para PK de AlbuBChE se toman justo antes de la infusión de cocaína.
Variables Farmacodinámicas y Muestreo
Se recolectan muestras de sangre antes de la dosificación y en varios puntos de tiempo después de cada dosificación de cocaína. Los niveles de cocaína in vivo (y sus metabolitos benzoilecgonina y éster metílico de ecgonina) se determinan por el método LC/MS-MS validado y se correlacionan con los niveles en sangre de AlbuBChE. Se determina la exposición a cocaína (Cmax, tmax, AUC(0-t), AUC(o-~> y Vd) y la eliminación (CL, ??, ti/2) . Los puntos de tiempo de muestreo PD de los niveles de cocaína en suero, después de cada dosis de cocaína son como sigue: antes de la dosis, 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, y 120 minutos después de . la dosis.
La presión sanguínea y la frecuencia cardíaca se miden antes de la infusión y 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, y 300. minutos después de la infusión.
Comportamiento y efectos psicológicos (Efectos subjetivos) los efectos subjetivos se miden utilizando una escala análoga visual (VAS) computarizada (21 CFR 11 validadas) . Los puntos de tiempo para la recolección de efectos subjetivos se igualan con aquellos para las muestras sanguíneas de cocaína. El siguiente conjunto de VAS son: Justo por las Drogas, Toma de Drogas Otra vez, Gusto por Drogas Total, Altos Efectos Buenos, Efectos Malos, Sensación de Apuro, Deseo por Cocaína, Sensación de Ansiedad, Sobre-estimulado y Cualquier Efecto de Drogas.
Los puntos de tiempo del muestreo . PD de los parámetros VAS después de cada dosis de cocaína son como sigue: antes de la dosis, 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, y 120 minutos después de la dosis.
Recolección de Orina
La orina se recolecta para investigaciones metabólicas en un intervalo de 52 horas después de la administración de cocaína en el Día -1, Día 4 y Día .8. Los intervalos de recolección son: (i) inmediatamente después de la dosis .de cocaína, seguido por intervalos de recolección de
(ii) dos intervalos de' tres horas, y (iii) nueve intervalos de seis horas.
Análisis Estadísticos
Farmacocinética
Los parámetros PK se derivan de concentraciones en suero para cada nivel de dosis (número de sujetos, medio, SD, medio geométrico (para AUC y Cmax) , coeficiente de variación, mínimo, medio y máximo) . Proporcionalidad de dosis (para solamente AlbuBChE) la utilización del modelo de potencia se evalúa para Cmax, AUCo-t y AUC(o-~) .
Far acodinámica
Se determina el curso de tiempo de los efectos PD
(subjetivo y objetivo) . Los parámetros PD incluyen: Emax (efecto máximo) , TEmax (tiempo a Emax) , área promedio de tiempo bajo la curva de efecto (TA_AUE) , AUE parcial para puntos de tiempo tempranos y AUE acumulativa.
Seguridad
Los datos de seguridad se determinan utilizando estadísticas descriptivas, y cambios del valor de referencia, donde sea apropiado, para cada grupo de tratamiento. Los AEs se codifican utilizando la última versión del Diccionario Médico para Actividades Reguladoras (MedDRA) y se resume por la clase de órganos de sistema y término preferido.
Bioanalitico
Las muestras de suero congeladas para determinar las concentraciones de AlbuBChE y anticuerpos se envían en hielo seco para análisis. Los análisis de niveles de cocaína y metabolito se realizan utilizando métodos validados.
Resultados
Seguridad, Tolerabilidad e Inmunogenicidad
La AlbuBChE es segura de . administrar a humanos. NO se observan problemas de- seguridad significativos con las dosis de AlbuBChE intramusculares. (IM) de 50 mg a 300 mg, la AlbuBChE se tolera bien, sin efectos secundarios inaceptables. La tolerabilidad local y el dolor en el sitio de la inyección IM son aceptables, sin eventos adversos significativos. La administración de 50 mg a 300 mg de AlbuBChE como una sola dosis no provoca una respuesta inmune significativa. Los títulos para los anticuerpos contra HSA, butirilcolinesterasa (hBChE) humana y AlbuBChE todos, están dentro de los límites aceptables.'
Variables Farmacocinéticas- La concentración en suero observada máxima de
AlbuBChE, Craax, se incrementa con la dosis de incremento de AlbuBChE. La absorción de AlbuBChE del sito IM de administración es rápida, con un tiempo corto para lograr maxf AUC(o-t) y AUC(o—.) que indican que los niveles de AlbuBChE persisten durante una- cantidad de tiempo significativa y clínicamente útil. Los valores Vd/f indican que la mayoría de AlbuBChE está presente en la circulación durante la fase terminal. Los valores CL/f indican que el AlbuBChE se elimina del cuerpo en una velocidad aceptable. Los valores, de vida media de eliminación terminal evidentes indican dosificación a la semana o dos veces a la semana de AlbuBChE para mantener los niveles terapéuticos. El tiempo, de residencia medio de la AlbuBChE está dentro de los límites clínicamente aceptables. Variables Farmacodínámicas
La concentración en suero observada máxima de cocaína, Cmax, disminuye con la dosis de incremento de AlbuBChE. Los niveles de Cmax se logran muy rápidamente después de una dosis intravenosa de 40 mg de cocaína, con tmax, AUC(o-t) y AUC(o-8) cortas de cocaína y sus metabolitos benzoilecgonina y éster metílico de ecgonina indican que la cocaína se metaboliza más rápidamente en sujetos que reciben una dosis de AlbuBChE antes de la exposición a. cocaína que los sujetos que reciben placebo-. La AUC(o-t) de la cocaína, disminuye como una función de la dosis de AlbuBChE y se incrementa como una ' función de tiempo después de la administración de AlbuBChE. Los valores Vd indican que la mayoría de la cocaína estás presente en la circulación durante la fase terminal. Los valores CL indican eliminación de cocaína más rápida después de la administración de AlbuBChE comparadas con el placebo, con velocidad de eliminación que disminuye conforme se incrementa el tiempo después de la · administración de AlbuBChE. Similarmente , los valores de vida media de eliminación terminal evidentes indican eliminación de cocaína más rápida después de la administración de AlbuBChE comparada con el placebo, con velocidad de eliminación que disminuye conforme se incrementa el tiempo después de la administración de AlbuBChE.
Efectos de comportamiento y psicológicos
Los sujetos administrados con AlbuBChE reportan significativamente resultados diferentes en la escala análoga visual (VAS) comparados con sujetos administrados con placebo. La administración de AlbuBChE disminuye el gusto por la cocaína. La administración de AlbuBChE disminuye el deseo de tomar cocaína nuevamente. La administración de AlbuBChE disminuye el gusto por drogas total. La administración de AlbuBChE disminuye el "bajo el efecto de la droga" asociado con la exposición a cocaína- La administración de AlbuBChE disminuye la sensación subjetiva de "buenos efectos" después de la exposición a cocaína. La administración de AlbuBChE disminuye la sensación subjetiva de "apuro" asociada con la exposición a cocaína. La administración de AlbuBChE disminuye el deseo por cocaína. La administración de AlbuBChE reduce las sensaciones de ansiedad después de la exposición a cocaína. La administración de AlbuBChE reduce las . sensaciones de ser estimulado después de la exposición a cocaína. La administración de AlbuBChE reduce el reporte de "cualquier efecto de droga".
Los sujetos administrados con AlbuBChE antes de la exposición a cocaína no reportan "malos efectos" significativamente diferentes después de la administración de AlbuBChE comparados con sujetos administrados con placebo.
La AlbuBChE reduce la sensación de "malos efectos" después de la exposición a cocaína.
Planteamiento
El presente ejemplo determina los niveles en sangre de cocaína después de múltiples dosis de cocaína subsecuentes a la administración de AlbuBChE, y determina dos efectos de comportamiento, psicológicos y de seguridad de la cocaína después de múltiples dosis subsecuentes de la administración de AlbuBChE en un entorno hospitalario.
La medida primaria de un segundo tratamiento exitoso de abuso y dependencia de cocaína en un entorno ambulatorio es un período de abstinencia durante y después del tratamiento. La facilitación de un período de abstinencia, tal como un período de dos. o tres semanas de abstinencia, indica un tratamiento exitoso. Las mediciones del resultado secundario incluyen reducción en los niveles de cocaína o cantidad de ingesta de cocaína, proporción total de días sin uso de cocaína, proporción de sujetos exitosos, el número más grande de días- sin uso de cocaína consecutivos y gravedad de dependencia de cocaína como es evaluado, por ejemplo, por la evaluación de gravedad selectiva de cocaína (CCSA) .
Los estudios previos han descubierto que la AlbuBChE tiene una vida media de aproximadamente 8 horas en ratas y se ha especulado que la vida media potencial de la AlbuBChE variaría de 1 a varios días en humanos. (Brimijoin y colaboradores., 2008;· Gao y colaboradores. 2009). Gao y colaboradores notaron que la vida media observada de la AlbuBChE monomérica en ratas es más corta que aquella de la BChE tetramérica nativa, y especularon que la vida media de la AlbuBChE se podría incrementar por modificaciones pos-traduccionales tales como glicosilación de polietileno.
El presente Ejemplo determina que la vida media de la AlbuBChE cuando se administra por inyección intramuscular es dependiente de dosis, con valores de vida media que se incrementan con la dosis de incremento. Los valores de vida media en las dosificaciones especificadas permiten un programa de dosificación semanal o dos veces a la- semana sin la necesidad de modificaciones pos-traduccionales tal como glicosilación de polietileno.
Estudios previos también han reportado que la administración intravenosa de AlbuBChE a ratas puede provocar un incremento modesto en la presión sanguínea y letargo leve, (Brimijoin y colaboradores, 2008). En contraste, no se observa un incremento significativo en la presión sanguínea cuando la AlbuBChE se administra a humanos mediante inyección intramuscular, tampoco se reporta letargo en un número significativo de sujetos.
Los sujetos humanos administrados con AlbuBChE no reportan un incremento significativo en deseos de cocaína. En contraste, el deseo de usar cocaína se disminuye significativamente después de la dosificación de AlbuBChE y permanece significativamente reducido por hasta .una semana después de una sola administración de AlbuBChE.
Los descubrimientos del presente ejemplo indican que la administración intramuscular de AlbuBChE a humanos en las dosificaciones especificadas no da por resultado ningún efecto secundario inaceptable y que la dosificación especificada permitirá el tratamiento exitoso de efectos biológicos de la exposición a cocaína.
Referencias
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Publicación de Solicitud de Patente de JE.U.A. No. 2008/0194481, publicada el 14 de Agosto de 2008 (U.S. Serial No. 11/932,823, presentada el 31 de Octubre 31, 2007).
Gao, y colaborador-es (2009) "An . Albúmina-Bytyrylcolinesterase for- Cocaine Toxicity and Addiction: Catalytic and Pharmacokinetic Properties", N1H Public Access Author anuscript, published in final edited form as Chem. Biol. Interact. 25 de Septiembre de 2008; 175 (1-3): 83-87.
Claims (45)
1. Un método para atenuar un efecto biológico de una exposición a cocaína en un primate, que . comprende administrar al primate una cantidad de una proteína de fusión, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido de butirilcolinesterasa (BChE) mutante que comprende la secuencia EDDI11ATK GKVRGM LTVF.GGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIW A TKYA SCCQNIDQSFPGFHGSEMVWPOTDLSEDCLYLNWIPAPKPKNATVl.IWIYGG GFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIWSMNYRVGALGFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLA LQWVQKNIAAFGGNP SV LFGESSGAASVSLHLLSPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWA VTSLYEAR RTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLR KDPQEILLNEAFWPYGTPLGVNF GPTVDGDFLTDMPDILLELGQF TQILVGVNKDEG FLVGGAPGFSKD SIITRK EFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPENYREALGDWGDYNFICPALEFT KKFSEWGI AFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMICYE RSIVKR ANFAKYGNPNETQN STS PVFKSTEQKYLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFW TSFFP V (SEQ ID N0:1), (b) un polipéptido de albúmina de suero humano. (HSA) que comprende la secuencia, DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES AE CDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLV RPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADK AACLLP LDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVS KLVTDLTKVHTECCHGDLLEC DDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCI AEVENDEMPADLPSLAADFVÉSKDVCK YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLR LAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEY FQNA LLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLISIQLCVLH EKTPVSDRVTKCCTESLV RRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ IKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGL (SEQ ID NO : 2 ) , y (c) un péptido ¦ señal que comprende la secuencia MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG (SEQ ID NO: 3), en donde la cantidad de la proteina de fusión es efectiva para provocar la atenuación del efecto biológico de la exposición a cocaína en el primate.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de fusión comprende la secuencia MRP AW LFLVLLLALWAPARGEDDIIIA KNGK RGMNL VFGGTV AFLGIPYAQ PPLGRLRFKKPQSLTK SDIWNAT YA SCCQNIDQSFPGFHGSEMW PNTDLSEDCL YLNVWIPAPKPK ATVLIWIYGGGFQTGTSSLHVYDG FLARVERVIWSM YRVGAL GFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLALQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLL SPGSHSLFTRAILQSGSFNAP AVTSLYEAR RTLNLAKLTGCSRE ETEII CLRNK DPQBILIiNEAFVVPYGTPLGVNFGPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGYNKDE GT FLVGGAPGFSKD NSIITRKEFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPE NYREALGDVVGDYNFICPALEFTKKFSEWG NAFFYYFEHRSSKLPWPE MGVMHGYE IEFVFGLPLERRD YTKAEEILSRSIVKR ANFA YGNPNETQNNSTS PVFKSTEQK YLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFWTSFFPKVDAHKSEVAHRFKDLGEE FKALVLIAFA QYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGE MADCCAKQEPER ECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIAR RHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS LQKFGERAFKAWAVARLSQRFP AEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADL AKYICENQDSISSKL ECCEKPLLEKSHCIAEVENÜEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEA DVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDE FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSR LGKVG SKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALE VDE YVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDD FAAFVEKCCKADDKETCFAEEGK LVAASQAALGL (SEQ ID NO : 4 ) .
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque la proteina de fusión se administra antes de la exposición a cocaína..
. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la proteína de fusión se administra hasta un día antes de la exposición a cocaína.
5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la proteína de fusión se administra hasta 216 horas antes de la exposición a cocaína.
6 El método de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque la proteína de fusión se administra después de la exposición a cocaína.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la proteína de fusión se administra hasta una hora después de la exposición a cocaína.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, .caracterizado porque la exposición a cocaína es una sola exposición a cocaína.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la exposición a cocaína es una exposición a cocaína recurrente.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la exposición a cocaína recurrente es abuso de cocaína o dependencia de cocaína.
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-10, caracterizado porque la exposición a cocaína recurrente comprende por lo menos seis exposiciones a cocaína individuales en un período de doce meses.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-10, caracterizado porque la exposición a cocaína recurrente comprende por lo menos veinte exposiciones a cocaína individuales durante el tiempo de vida del primate.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque el efecto biológico es provocado por la sobredosis de cocaína en el primate y la atenuación es tratar o prevenir el efecto biológico .
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque el efecto biológico es un incremento en la presión sanguínea.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la duración del incremento en la presión sanguínea se reduce en un 60-90%.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la duración del incremento en la presión sanguínea se reduce en un aproximadamente 78%.
17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque el efecto biológico es un incremento en la frecuencia cardíaca o temperatura corporal.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el grado de atenuación es de 45%- 70%.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el grado de atenuación es de 57%.
20. El método de conformidad . con cualquiera, de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque el efecto ' biológico es comportamiento de búsqueda de cocaína en el primate .
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el comportamiento de búsqueda de cocaína se presenta durante un' período de abstinencia de cocaína después de la exposición a cocaína.
22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el comportamiento de búsqueda de cocaína sigue una recaída.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la administración de la pro'teína de fusión dos horas antes de la recaída atenúa el comportamiento de búsqueda de cocaína por el primate inmediatamente después de la recaída.
24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-23, caracterizado porque la administración de la proteína de fusión dos horas antes de la exposición a cocaína da por resultado una reducción de 50% a 100% en el comportamiento de búsqueda de cocaína- por el primate. ·
25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-24, caracterizado porque la atenuación del comportamiento de búsqueda de cocaína se observa hasta cuatro días después de la administración de la proteína de fusión.
26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-25, caracterizado porque la administración de la proteína de fusión da por resultado una disminución de la exposición a cocaína total en el primate que sin la administración.
27. El método de conformidad con cualquiera · de las reivindicaciones 20-26, caracterizado porque la atenuación de comportamiento de búsqueda de cocaína da por resultado un período de abstinencia de cocaína de 2 semanas a 3 semanas.
28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-27, caracterizado porque la atenuación de comportamiento de búsqueda de cocaína da por ' resultado una mayor proporción de días en los cuales el primate no se expone a cocaína que sin la administración.
29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-28, caracterizado porque la atenuación de comportamiento de búsqueda de cocaína da por resultado un mayor número de días consecutivos en los cuales el primate no se expone a cocaína que sin la administración.
30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-29, caracterizado porque la atenuación de comportamiento de búsqueda de cocaína da por resultado una disminución de gravedad de dependencia o abuso de cocaína como es evaluado por la evaluación de gravedad selectiva de cocaína (CSSA) o Manual de Diagnóstico, y Estadística de Trastornos Mentales IV. (DSM-IV) .
31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-30, caracterizado porque la cantidad efectiva de la proteíná de fusión es una cantidad que reduce el nivel de cocaína en suero del primate aproximadamente 0 ng/ml dentro de aproximadamente 30 minutos de una dosis intravenosa de 1 mg/kg de cocaína.
32. El método de conformidad con cualquiera, de las reivindicaciones 1-31, caracterizado porque la administración de la proteína de fusión reduce el nivel de cocaína en suero del primate a menor que 12% del nivel de cocaína en suero sin la administración dentro de aproximadamente 5 minutos de una dosis intravenosa de 1 mg/kg de cocaína.
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la administración de la proteína de fusión reduce el nivel de cocaína en suero del primate a 7% del nivel de cocaína en suero sin la administración dentro de aproximadamente 5 minutos de una dosis intravenosa de 1. mg/kg de cocaína.
34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-33, caracterizado porque la proteíná de fusión se administra semanalmente o dos veces a la semana.
35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-34, caracterizado porque la proteína de fusión se administra mediante inyección intramuscular o inyección subcutánea.
36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-35, caracterizado porque la proteina de fusión está en una solución amortiguadora de formulación que comprende lOmM de fosfato de sodio, 200mM de manitol, 60mM de trehalosa, y 0.01% (p/v) de polisorbato 80, pH 7.2.
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la proteina de fusión está presente en la formulación de una concentración de por lo menos 30 mg/ml.
38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-37, caracterizado porque la atenuación del efecto biológico se observa hasta 72 horas después de la administración de la proteina de fusión.
39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-38, caracterizado porque el primate es un humano.
40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la exposición a cocaína es una sola exposición a cocaína de 10 mg a 60 mg o una exposición a cocaína recurrente en donde cada exposición a cocaína individual de la exposición a cocaína recurrente es de 10 mg a 60 mg.
41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la cantidad efectiva de la proteína de fusión es una cantidad que reduce el nivel de cocaína en el suero del humano a aproximadamente 0 ng/ml dentro de aproximadamente 30 minutos de una dosis intravenosa de 40 mg de cocaína.
42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-41, caracterizado porque la cantidad efectiva de la proteína de fusión es de 0.06 mg/kg a 5 mg/kg.
43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la cantidad efectiva de la proteína de fusión es de 0.06 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1.6 mg/kg, o 4.8 mg/kg.
44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-41, caracterizado porque la cantidad efectiva de la proteína de fusión es de 50 mg a 300 mg.
45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la cantidad efectiva de la proteína de fusión es de 50 mg, 100 mg, 150 mg, o 300 mg.
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