JP6118251B2 - グルカゴン様ペプチド−1の測定方法及びそれに使用するキット - Google Patents
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Description
DPP−IV阻害剤の作用機序とは、DPP−IV活性を阻害することにより、DPP−IVにより分解される性質を有する活性型GLP−1の濃度を上昇させ、このGLP−1によりインスリンの分泌を促進させて、糖の利用を促進するものである。従って、GLP−1の濃度を測定することによりDPP−IV阻害剤の作用効果を判定することができる。
また、酸処理は、アミノ酸配列によってはその活性を無くしてしまうなどの影響が知られており、一般的に、活性の高い(あるいは安定した)抗体の精製など、限定して使用されている。本発明における酸処理によって、GLP−1は安定であるが、非特異反応物質は変性などを受け、GLP−1濃度の測定法における非特異反応は抑制され、正確にGLP−1濃度を測定できることは、思いがけない効果であった。
(1)検体中のグルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)の存在及び/又は量を測定する方法であって、検体を予め酸性溶液にて処理する工程を含むことを特徴とするGLP−1の測定法。
(2)酸性溶液が、グリシン、塩酸、酢酸、グアニジン塩酸、硫酸、リン酸のうちの少なくとも一つを含むものである、(1)に記載の測定法。
(3)検体が血液である(1)または(2)に記載の測定法。
(4)GLP−1の測定法が、酵素免疫測定法又は競合的放射免疫測定(競合的RIA)法である、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)検体中のGLP−1の存在及び/又は量を測定するキットであって、
(a)酸性溶液、(b)GLP−1に特異的な抗体、および(c)取扱説明書を含む、該キット。
各「GLP−1」のアミノ酸配列を以下に示す。
活性型GLP−1
GLP−1(7-36) Amide:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(配列番号1)-CONH2
GLP−1(7-37):
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不活性型GLP−1
GLP−1(9-36) Amide:
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GLP−1(9-37):
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全長GLP−1
GLP−1(1-37):
HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(配列番号5)
GLP−1(1-36) Amide:
HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(配列番号6)-CONH2
上記「GLP−1」のうち、活性型GLP−1はインクレチン作用を有する。本発明は、活性型GLP−1に対して使用されることが好ましい。
本発明の酸処理に用いる酸性溶液としては、GLP−1は変性しないが、それ以外の非特異反応を起こす夾雑物は変性でき、後の測定に影響を与えないものであれば良い。そのような酸性溶液は、当業者であれば、過度な試行錯誤無く、公知の酸性溶液から選択することができる。例えば、pH4以下の酸性溶液である。より好ましくはpH2.5以下の酸性溶液である。酸性溶液のpHの下限は特に制限されないが、例えばpH1以上である。具体的には、グリシン(アミノ酢酸)、塩酸、酢酸、グアニジン塩酸、硫酸、リン酸の少なくとも1種を含む溶液が挙げられる。好適なpHは各酸によって異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。通常、pHが低い方が好ましい。また、緩衝能のある酸性溶液は、操作性のズレを補えるので好ましい。例えば、グリシン塩酸緩衝液、塩酸塩化カリウム緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液などが挙げられる。このような酸性溶液を使用することで、非特異反応物質のみを変性できるので、GLP−1のみを正確に測定することができる。また、変性した非特異反応物質が沈殿・析出しにくいため、前処理後に検体の遠心・沈殿除去作業を経ることなく、測定に供することが可能となり、操作が簡便になる。
酸性溶液は試料溶液に対し、1:9〜1:1の容量で加えることがより好ましい。
(a)酸性溶液、
(b)GLP−1に特異的な抗体、
(c)取扱説明書、を含む。
更に、前記抗体は、そのままの状態でキットに用いることもできるし、利用する免疫学的手法に基づいて、それに適した形態、例えば、ラテックス凝集免疫測定法を利用するのであれば、ラテックス担体に固定した状態で、磁性粒子などを利用した高感度測定法を利用するのであれば、磁性粒子に固定した状態で、イムノクロマトグラフ法などの基板を利用する方法であれば、基板に固定した状態で、標識物質(例えば、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性同位体、ビオチン、アビジン)による標識の必要があれば、標識化した状態で、キットに用いることもできる。
1−1:本発明の酸処理による測定法の手順
1−1−1:検体
検体は健常人を対象とし、EDTA採血管(ニプロ社製)に特開2008−104870に従ってディプロチンAを添加し、空腹時あるいは食事負荷後に採血し、以下の測定には個体別血漿を使用した。
標準物質としては、Glucagon−like Peptide 1 (Human, 7−36 Amide)(ペプチド研究所社製)を使用し、0と1〜100pmol/Lまで8段階の濃度溶液を調製し、定量に使用した。
ポリプロピレン製チューブに0.2mol/Lグリシン塩酸緩衝液(pH1.3)を150μL及び、検量線用標準試料溶液または個体別血漿150μLを添加し、混和した。37℃にて10分間インキュベートし、その後、2mol/Lトリス塩酸緩衝液(pH8.5)を30μL添加して中和し、酸処理済みサンプルとして、以下の活性型GLP−1量の測定に使用した。
活性型GLP−1濃度の測定は、抗GLP−1モノクローナル抗体によるGLUCAGON−LIKE PEPTIDE−1(ACTIVE) ELISA KIT 96Well Plate(ミリポア社製)を使用した。測定方法は、添付の説明書に従って行った。測定装置は、Veritasマイクロプレート ルミノメーター(プロメガ社製)を使用し、SoftMax Pro(モレキュラーデバイス ジャパン社製)にて解析した。
1−1−3の酸処理を以下の固相カラムに変更した以外は、1−1と同様に行った。
固相カラムとしてOasis HLB Extraction Plate(Waters社製)を使用した。使用方法は、添付の説明書に従って行った。カラムのコンディショニングを行った後、1−1−1で調製した血漿300μLをPBSで4倍希釈し1200μLに調製してウェルに添加後、遠心(10×g、3分間、室温)した。その後、10%メタノール溶液1mLを添加後、遠心(10×g、3分間、室温)を行い、ウェルを洗浄した。この操作を2回繰り返した。続いて、ディープウェルプレートをセットし、0.5%アンモニア含有75%メタノール溶液0.5mLを添加後、遠心(10×g、3分間、室温)し、溶出した。この操作を2回繰り返した後、遠心(100×g、1分間、室温)でウェルから溶出液を完全に回収した。続いて、この溶出液を窒素気流下にて乾固を行った。これにGLUCAGON−LIKE PEPTIDE−1(ACTIVE) ELISA KIT 96Well Plateキット(ミリポア社製)含有のAssay Buffer250μLを添加して、プレートシェーカーに約5分間かけて再溶解し、前処理済みサンプルとして活性型GLP−1濃度の測定に使用した。再溶解量250μLが検体量300μLより少ないため、測定値に、容量補正係数(0.83:再溶解量を検体量にて除した値)を乗じた。
また、比較として前処理を行わない場合は、1−1−1で調製した血漿をそのまま活性型GLP−1濃度の測定に使用した(容量補正も不要)。
活性型GLP−1濃度と総GLP−1濃度を同じ個体において比較した場合、前処理なし法では活性型GLP−1濃度が総GLP−1濃度を上回る個体が認められ、前処理なしでは活性型GLP−1を正確に測定できていないことが明らかであり、従来の固相カラムによる前処理の有効性が確認されている。
空腹時の健常人29例より個体別に血漿を調製し、前処理なし法、固相カラム法、酸処理法にて血漿を処理後、活性型GLP−1濃度を測定した。このうち、固相カラム法は測定値が前処理によるロスにより低めとなるため、比較上、便宜的に測定値を回収率補正(測定値/0.75)した結果を用いた。その結果、本発明の酸処理法は、固相カラム法と同等の結果が得られた。結果を図1に示す。
実施例1にしたがって、それぞれの前処理法にて食事負荷後の健常人10例の活性型GLP−1濃度を測定した。
実施例1及び下記表1にしたがって、空腹時あるいは食事負荷後の個体別血漿各2例を測定し、前処理なし法、固相カラム法及び酸処理法において、化学発光強度を比較した。固相カラム法は化学発光強度が前処理によるロスにより低めとなるため、比較上、便宜的に化学発光強度を回収率補正(化学発光強度/0.75)した結果を用いた。酸処理液は全て個体別血漿と等量(150μL)添加し、実施例1に示す酸処理条件以外の酸処理液の種類及び中和条件は表1に示す。酸処理法については、中和液添加量に対する容量補正{化学発光強度×(個体別血漿量+酸処理液量+中和液添加量)/(個体別血漿量+酸処理液量)}を行った結果を用いた。
実施例1にしたがって、それぞれの前処理法にて活性型GLP−1濃度を測定した。
空腹時の健常人50例より個体別に血漿を調製し、前処理なし法、固相カラム法、酸処理法にて血漿を処理後、活性型GLP−1濃度を測定した。このうち、固相カラム法は測定値が前処理によるロスにより低めとなるため、比較上、便宜的に測定値を回収率補正(測定値/0.75)した結果を用いた。その結果、本発明の酸処理法は、固相カラム法と同等の結果が得られた。結果を図4に示す。
実施例1にしたがって、それぞれの前処理法にて食事負荷後の健常人50例の活性型GLP−1濃度を測定した。
食事負荷後の健常人50例より個体別に血漿を調製し、固相カラム法、酸処理法にて血漿を処理後、活性型GLP−1濃度を測定した。このうち、固相カラム法は測定値が前処理によるロスにより低めとなるため、比較上、便宜的に測定値を回収率補正(測定値/0.75)した結果も用いた。その結果、本発明の酸処理法は、回収率補正した固相カラム法と同等の結果が得られ、正確に活性型GLP−1濃度を測定できることがわかった。結果を図5に示す。
実施例5及び6で得られた100例の測定値のうち、定量範囲であった97例分の測定値について、回帰分析を用いた解析を行った。
その結果、酸処理法は固相カラム法との相関が最も良好であった(r=0.921)。結果を図6に示す。
Claims (7)
- 検体中のグルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)の存在及び/又は量を測定する方法であって、検体を予め酸性溶液にて処理する工程および該酸性溶液で処理された検体を、GLP−1測定前にアルカリ溶液で中和処理する工程を含むことを特徴とするGLP−1の測定法。
- 酸性溶液が、グリシン、塩酸、酢酸、グアニジン塩酸、硫酸、リン酸のうちの少なくとも一つを含むものである、請求項1に記載の測定法。
- 前記酸性溶液はpHが2.5以下である、請求項1または2に記載の測定法。
- 検体が血液である請求項1〜3のいずれか一項に記載の測定法。
- GLP−1の測定法が、酵素免疫測定法又は競合的放射免疫測定法である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 検体中のGLP−1の存在及び/又は量を測定するキットであって、
(a)酸性溶液、
(b)GLP−1に特異的な抗体、
(c)中和のためのアルカリ溶液、および
(d)取扱説明書
を含む、該キット。 - 前記酸性溶液はpHが2.5以下である、請求項6に記載のキット。
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