CZ20031602A3 - GLP-1 fúzní proteiny - Google Patents

GLP-1 fúzní proteiny Download PDF

Info

Publication number
CZ20031602A3
CZ20031602A3 CZ20031602A CZ20031602A CZ20031602A3 CZ 20031602 A3 CZ20031602 A3 CZ 20031602A3 CZ 20031602 A CZ20031602 A CZ 20031602A CZ 20031602 A CZ20031602 A CZ 20031602A CZ 20031602 A3 CZ20031602 A3 CZ 20031602A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
xaa
glu
lys
asp
ala
Prior art date
Application number
CZ20031602A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ306180B6 (cs
Inventor
Glaesner@Wolfgang
Micanovic@Radmila
Rainbow Tschang@Sheng-Hung
Original Assignee
Eli Lilly And Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22954069&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ20031602(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Eli Lilly And Company filed Critical Eli Lilly And Company
Publication of CZ20031602A3 publication Critical patent/CZ20031602A3/cs
Publication of CZ306180B6 publication Critical patent/CZ306180B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

Resení se týká sloucenin podobných glukagonu-1 fúzovaných na proteiny, které mají úcinek prodluzující polocas zivota peptidu in vivo. Tyto fúzní proteiny mohou být pouzity pro lécení diabetes mellitus nezávislého na insulinu a rady dalsích chorob.

Description

Oblast techniky
Tento vynález se týká peptidů, podobných glukagonu, včetně analogů a jejich derivátů, fúzovaných na proteiny, které máji účinek na poločas života peptidů in vivo. Tyto fúzni proteiny se dají použit pro léčeni diabetus mellitus, který ještě není závislý na inzulínu, stejně jako jiných nemocí.
Dosavadní stav techniky
Peptid 1 podobný glukagonu (dále GLP podle anglického názvu Glucagon-Like Peptíde) (GLP-1) obsahuje 37 aminokyselin, a je vylučován L-buňkami střeva podle množství přijímané potravy. Bylo zjištěno, že stimuluje vylučování inzulínu (inzulinotropní účinky), čímž způsobuje spotřebovávání glukózy buňkami a snižuje koncentraci glukózy v krevním séru (viz, např., Mojsov, S. ,Int. J. Peptide Protein Research, 40:333-343 (1992)). Nicméně, GLP-1 je málo aktivní. Následné endogenní štěpení mezi šestým a sedmým místem má za následek účinnější biologicky aktivní GLP-1(7-37)OH peptid. Je známo velké množství typů analogů a derivátů GLP-1 a jsou zde citovány jako sloučeniny GLP-1. Mezi tyto GLP-1 analogy patří exendiny, což jsou peptidy, které se nacházejí v jedu korovce podezřelého (jedovatá ještěrka z jihozápadu USA). Exendiny mají sekvenční homologii s přírodním GPL-1 a mohou se vázat s receptorem GPL-1 iniciovat signální převáděcí kaskádu odpovědnou za řadu aktivit, které mají souvislost s GPL-1(7-37)OH.
Sloučeniny GPL-1 mají řadu fyziologicky signifikantních aktivit. Tak například se zjistilo, že GPL-1 stimuluje uvolňování inzulínu, menší vylučování glukagonu, inhibuje vyprazdňování žaludku a zvyšuje využívání glukózy (Nauck, M. A. a kol. (1993) Diabetologia 36:741-744, Gutniak, M. a kol (1992) New England J. of Med. 326:1316-1322, Nauck, M. A. a kol. (1993) J. Clin Invest. 91:301-307).
GLP-1 je nejslibnější pro léčení diabetus mellitus, který ještě není závislý na inzulinu (NIDDM). Na trhu je řada orálních léčiv pro léčení rezistence vůči inzulinu, spojené s NIDDM. Jak nemoc postupuje, musí pacient přejít na léčiva, která stimulují uvolňování inzulinu a případně i na léčení, které vyžaduje injekční podávání inzulinu. Současné účinné látky, které stimulují uvolňování inzulinu, však mohou způsobovat hypoglykémii stejně jako ji způsobuje podávání inzulinu. Účinnost GLP-1 nicméně je regulována hladinou glukózy v krvi. Když hladina klesne k určité minimální úrovni, GLP-1 není účinný. Z tohoto důvodu není žádné riziko hypoglykémie, které by vyplývalo z léčení pomocí GLP-1.
Nicméně účinnost terapie pomocí GLP-1 peptidů je omezena jejich rychlým odstraněním a krátkým poločasem rozpadu. Například GLP-1 (7-37) má poločas rozpadu séra jen 3 až 5 minut. Když je GLP-1 (7-36) amid podáván subkutánně, má dobu účinnosti kolem 50 minut. Dokonce analogy a deriváty, které jsou odolné proti endogennímu štěpení proteázou, nemají poločas rozpadu tak dlouhý, aby nebylo nutné opakovat podávání v průběhu 24 hodin. Rychlé odstranění terapeutického činidla je pro pacienta nepohodlné v případech, kdy je žádoucí • ·· ·· ·· · · · ··· · · · · · · · · • ·· ·· · ···· • · ··· · · · · ····· *·· · β « · · · ··· ·· ·· ···· ·· · udržovat v krvi vysokou hladinu účinné látky v prodlouženém časovém intervalu, dokud není podání účinné látky nutné zopakovat. Dále dlouhodobě účinná sloučenina je zejména důležitá pro diabetické pacienty, jejichž léčebný režim vyžaduje pouze podávání orálních léčiv. Tito pacienti se velmi obtížně přizpůsobují režimu, který vyž.aduje vícenásobné podávání injekcí nebo léčiv.
Tento vynález překonává problémy spojené s podáváním sloučeniny, která má krátký plazmový poločas. Sloučeniny podle vynálezu zahrnují GLP-1 sloučeniny fúzované na jiné proteiny s dlouhým poločasem oběhu, jako je Fc podíl imunoglobulinu nebo albuminu.
Obecně manipuluj e se s malými terapeutickými peptidy špatně neboť i drobné změny v jejich struktuře mohou působit na jejich stabilitu a/nebo biologickou aktivitu. To zejména platí pro GLP-1 sloučeniny, které jsou právě ve vývoji. Například GLP-1(7-37)OH má tendenci ke změně konformace z primárně alfa helixové struktury na primárně beta vrstvenou strukturu. Z této beta vrstvené formy vzniká spojený materiál, o kterém se má za to, že není aktivní. Je proto překvapující, že bylo možno vyvinout biologicky aktivní GLP-1 fúzní proteiny s prodlouženým poločasem. Bylo to zvláště neočekávané proto, že se s GLP-1(7-37)OH obtížně pracuje a v důsledku velikosti fúzované části vůči malému připojenému peptidu GLP-1.
Sloučeniny podle vynálezu patří mezi heterologní fúzní proteiny, zahrnující první polypeptid s N-zakončením a Czakončením fúzované na druhý polypeptid s N-zakončením a C·· · β · · ··« • · · · · ···· • · · · · · · · · · · · · ··· ·· ·· ···· ·· · zakončením, kde první polypeptid je GLP-1 sloučenina a druhý polypeptid je zvolen ze skupiny, do které patří
a) lidský albumin,
b) analogy lidského albuminu, a
c) fragmenty lidského albuminu, a kde C-zakončení prvního polypeptidů je fúzováno k Nzakončení druhého polypeptidů.
Sloučeniny podle vynálezu také zahrnují heterologní fúzní proteiny zahrnující první polypeptid s N-zakončením a C-zakončením fúzované na druhý polypeptid s N-zakončením a Czakončením, kde první polypeptid je GLP-1 sloučenina a druhý polypeptid je zvolen ze skupiny, do které patří
a) lidský albumin,
b) analogy lidského albuminu, a
c) fragmenty lidského albuminu, a kde C-zakončení prvního polypeptidů je fúzováno k Nzakončení druhého polypeptidů přes peptidový linker. Je výhodné, aby byl peptidový linker zvolen ze skupiny sestávající z
a) na glycin bohatého peptidu,
b) peptidu majícího sekvenci [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, kde njel, 2, 3, 4, 5 nebo 6, a
c) peptidu majícího sekvenci [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3.
Mezi další sloučeniny podle vynálezu patří heterologní fúzní proteiny, zahrnující první polypeptid s N-zakončením a C-zakončením fúzované na druhý polypeptid s N-zakončením a Czakončením, kde první polypeptid je GLP-1 sloučenina a druhý polypeptid je zvolen ze skupiny, do které patří
a) Fc podíl imunoglobulinu,
4 44 44 444
44 4 4444
444 4 444 44444
4« 44 44 4444 44 4
b) analog Fc podílu imunoglobulinu,
c) fragmenty Fc podílu imunoglobulinu, a kde C-zakončení prvního polypeptidu je fúzováno k Nzakončení druhého polypeptidu. GLP-1 sloučenina může být fúzována k druhému polypeptidu přes peptidový linker. Je výhodné, aby byl peptidový linker zvolen ze skupiny sestávající z
a) na glycin bohatého peptidů,
b) peptidů majícího sekvenci [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, kde njel, 2, 3, 4, 5 nebo 6, a
c) peptidů majícího sekvenci [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3.
Je obvykle je výhodné, aby GLP-1 sloučenina, která je částí heterologního fúzního proteinu, neměla víc než šest aminokyselin, lišících se od odpovídajících aminokyselin ve sloučeninách GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendin-4. Je dokonce ještě výhodnější, aby GLP-1 sloučenina neměla více než pět aminokyselin, lišících se od odpovídajících aminokyselin ve sloučeninách GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendin-4. Nejvýhodnější je, aby GLP-1 sloučenina neměla více než 4, 3 nebo 2 aminokyseliny, lišící se od odpovídajících aminokyselin ve sloučeninách GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendin-4. Výhodně má GLP-1 sloučenina, která je částí heterologního fúzního proteinu, glycin nebo valin v pozici 8.
Tento vynález také zahrnuje polynukleotidy kódující zde popsané heterologní fúzní peptidy, vektory zahrnující tyto polynukleotidý a hostitelské buňky transfektované nebo transformované zde popsanými vektory. Také je zahrnut proces způsob výroby heterologního fúzního proteinu, při kterém se provádějí kroky transkripce a translace zde popsaného nukleotidu za podmínek, ve kterých se heterologní fúzní protein exprimuje v detekovatelném množství.
Tento vynález také zahrnuje způsob pro normalizaci hladiny krevní glukózy u savců, kteří to potřebují, při kterém
se podává terapeuticky účinné množství zde popsaného
heterologního fúzního proteinu.
Vynález vyobrazení: je dále ilustrován s odkazem na následuj ící
Obr. 1: Sekvence aminokyseliny IgGl Fc zahrnuj ící
pantovou oblast, CH2 a CH3 domény.
Obr. 2: Sekvence aminokyseliny albuminu lidského séra
Obr. 3: A. SDS-PAGE gel a imunoblot stejného gelu, které ilustrují molekulární hmotnost fúzních proteinů IgGl-Fc a GLP1-Fc (pás 1, MW standardy, pás 2, čištěný Fc, pás 3, transfektované prostředí Mock, pás 4, Val8-GLP-1-Fc, pás 5, Exendin-4-Fc). B. SDS-PAGE gel a imunoblot stejného gelu, které ilustrují molekulární hmotnost fúzních proteinů lidského HSA a GLP-l-HSA (pás 1, MW standardy, pás 2, čištěný HSA, pás 3, transf ektované prostředí Mock, pás 4, Val8-GLP-1-HSA, pás
5, Val8-GLP-1-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser] 3-HSA) .
Obr. 4: SDS-PAGE gel čištěného Fc, albumin, a GLP-1 fúzní proteiny (Pás 1, MW standardy; Pás 2, čištěný Fc; Pás 3, Val8-GLP-1-Fc; Pás 4, Exendin-4-Fc; Pás 5, MW standard; Pás
6, Val8-GLP-1-HSA; Pás 7, Exendin-4-HSA; Pás 8, Exendin-4[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3HSA) .
·· · · · · · · · • · · · · ' · · · · ····
Obr. 5: Expresní klonující vektor obsahující Fc oblasti znázorněné na Obr. 1.
Obr. 6: Expresní klonující vektor obsahující albumin sekvenci znázorněnou na Obr. 2.
Obr. 7: Expresní klonující vektor obsahující DNA, v níž je zakódován 15 aminokyselinový linker fúzovaný v rámci a 5' albuminové sekvence znázorněné na Obr. 2.
Obr. 8: Aktivita GLP-1 fúzních proteinů na dávku in vítro.
Obr. 9: Farmakokinetika GLP-1 Fc a HSA fúzních proteinů.
Obr. 10: Glukodynamická odezva Exendin-Fc u dvou normálních hladovějících psů.
Obr. 11: Insulinotropní odezva na Exendin-Fc u dvou normálních hladových psů.
Obr. 12: DNA sekvence zahrnující lidskou IgGl Fc oblast.
Obr. 13: DNA sekvence zahrnující protein lidského albuminu.
Heterologní fúzní proteiny podle vynálezu zahrnují GLP-1 sloučeninu fúzovaný na lidský albumin, analog lidského albuminu, fragment lidského albuminu, Fc část imunoglobulinu, analog Fc části imunoglobulinu, nebo fragment Fc části imunoglobulinu. C-zakončení sloučeniny GLP-1 může být fúzován ♦· ·· ·· • · · · · · ·· · · · • · · · · · ·
přímo, nebo fúzován přes peptidový linker, N-zakončení albuminu nebo Fc protein. Tyto heterologní fúzní proteiny jsou biologicky aktivní a mají prodloužený poločas života se srovnání s nativním GLP-1.
Je výhodné, když GLP-1 sloučeniny, které tvoří část heterologního fúzního proteinu, zahrnuje polypeptidy, které mají od dvaceti pěti do asi třiceti devíti přírodně se vyskytujících nebo nepřírodně se vyskytujících aminokyselin které mají dostatečnou homologii k nativnímu GLP-1(7-37)OH, tak aby projevovaly insulinotropní aktivitu navázáním na GLP-1 receptor na β-buňkách pankreatu. GLP-1 sloučenina obvykle zahrnuje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci GLP-1(7-37)OH, analog GLP-1 (7-37)OH, fragment GLP-1(7-37)OH nebo fragment analogu GLP-1(7-37)OH. GLP-1(7-37)OH má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1:
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
His- -Ala- Glu- -Gly-Thr- Phe- -Thr- -Ser· -Asp- -Val- •Ser
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Ser- -Tyr- Leu- -Glu-Gly- Gln- -Ala- -Ala- -Lys- -Glu- -Phe-
29 30 31 32 33 34 35 36 37
Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEQ ID NO: 1)
Jak je zvykem v oboru amino zakončení GLP-1(7- 37) OH bylo označeno číslem 7 a karboxylové zakončení číslem 37. Další aminokyseliny v polypeptidů jsou číslovány postupně, jak je ukázáno v SEQ ID NO: 1. Například pozice 12 je fenylalanin a pozice 22 je glycin.
• · • ·
GLP-1 sloučeniny rovněž zahrnují GLP-1 fragmenty. Tento GLP-1 fragment je polypeptid získaný odstraněním jedné nebo více aminokyselin z N-zakončení a/nebo C- zakončení GLP-1(7-37)OH nebo jejich analogu nebo derivátu. Nomenklatura použitá pro popis GLP-1(7-37)OH je rovněž použitelná pro GLP1 fragmenty. Například GLP-1(9-36)OH označuje GLP-1 fragment získaný odstraněním dvou aminokyselin z N-zakončení a jedné aminokyseliny z C-zakončení. Aminokyseliny ve fragmentu jsou označeny stejným číslem, jako odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7- 37)OH. Například N-zakončení glutamové kyseliny kyselina v GLP1(9-36)OH je v pozici 9; pozice 12 je obsazena fenylalaninem; a pozice 22 je obsazena glycinem, jako v GLP1(7-37)OH. Pro GLP-1(7-36)OH je glycin v pozici 37 na GLP1(7-37)OH zrušen.
GLP-1 sloučeniny rovněž zahrnují polypeptidy v nichž je přidána jedna nebo více aminokyselin k N-zakončení a/nebo C-zakončení GLP-1(7-37)OH, nebo jeho fragmenty nebo analogy. Je výhodné, když GLP-1 sloučeniny tohoto typu mají více než třicet devět aminokyselin. Aminokyseliny v rozšířené GLP-1 sloučenině jsou přiřazovány ke stejným číslům, jako odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH. Například Nzakončení aminokyseliny GLP-1 sloučeniny získané přidáním dvou aminokyselin k N-zakončení GLP1(7-37)OH je v pozici 5; a Czakončení aminokyseliny GLP-1 sloučeniny získané přidáním jedné aminokyseliny k C-zakončení GLP-1(7-37)OH je v pozici 38. V obou těchto rozšířených GLP-1 sloučeninách, jako je GLP-1(7-37)OH, je tedy pozice 12 obsazena fenylalaninem a pozice 22 je obsazena glycinem. Aminokyseliny 1-6 rozšířené GLP-1 sloučeniny jsou výhodně stejné nebo dochází ke
• · ·
·· ·· • · · · · • · · · • · · · · • · · · ·· ···· konzervativní substituci aminokyseliny v odpovídající pozici GLP-1(1-37)OH. Aminokyseliny 38-45 rozšířené GLP-1 sloučeniny jsou výhodně stejné nebo dochází ke konzervativní substituci aminokyseliny v odpovídající pozici glukagonu nebo Exendinu-4.
aminokyseliny modifikovaného jeho fragmentu, tři, čtyři nebo pět
GLP-1. sloučeniny podle vynálezu zahrnují GLP-1 analogy. GLP-1 analog má dostatečnou homologii s GLP-1(737) OH nebo fragmentem GLP-1(7-37)OH, takže tento analog má insulinotropní aktivitu. Výhodně má GLP-1 analog sekvenci
GLP-1(7-37)OH nebo tak, že jedna, dvě, aminokyselin se liší od aminokyselin v odpovídající pozici GLP-1(7-37)OH nebo fragmentu GLP-1(7-37)OH. V názvosloví, které je zde použito pro označení GLP-1 sloučenin, substituující aminokyselina a její pozice je určována před hlavní strukturou. Například Glu22-GLP-1(7-37)OH označuje GLP-1 sloučeninu, v níž glycin, který se normálně nachází v pozice 22 sloučeniny GLPl(7-37)OH, byl nahrazen kyselinou glutamovou; Val8-Glu22GLP-l(7-37)OH označuje GLP-1 sloučeninu v níž byl alanin, který normálně nachází v pozici 8 a glycin, který se normálně nachází v pozice 22 na GLP-1(7-37)OH, byly zaměněny valinem a kyselinou glutamovou.
GLP-1 sloučeniny podle vynálezu rovněž zahrnují GLP-1 deriváty. GLP-1 derivát je definován jako molekula, která má sekvenci aminokyseliny GLP-1 nebo analogu GLP-1, ale navíc mají chemickou modifikaci jedné nebo více postranních skupin aminokyselin, α-uhlíkových atomů, koncové aminoskupiny nebo koncové skupiny karboxylové kyseliny. Chemická modifikace zahrnuje, ale ne výlučně, přidávání chemických skupin,
• · vytváření nových vazeb a odstraňování chemických skupin. Modifikace postranních skupin aminokyselin zahrnuje, bez omezení, acylaci ε-aminoskupin lysinu, N-alkylaci argininu, histidinu nebo lysinu, alkylaci glutamové nebo aspartové karboxylové skupiny a deamidaci glutaminu nebo asparaginu. Modifikace koncové aminoskupiny zahrnuje bez omezení desamino, N-nižší alkyl, N-di-nižší alkyl a N-acyl modifikaci. Modifikace koncové karboxylové skupiny zahrnuje bez omezení amid, nižší alkylamid, dialkylamid, a nižší alkylester modifikaci. Nižší alkyl je C1-C4 alkyl. Dále jedna nebo více postranních skupin nebo koncových skupin může být chráněna chránícími skupinami, které jsou známé odborníkům zkušeným v oboru proteinové chemie, α-uhlík aminokyseliny může být mono- nebo dimethylovaný.
Kterákoliv GLP-1 sloučenin může být částí heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu, jelikož GLP-1 sloučenina sama o sobě je schopna se navázat a indukovat vznik signálu přes GLP-1 receptor. Vazba GLP-1 receptoru a přenos signálu může být posouzen testy in vitro, které jsou popsány v patentu EP 619 322 a U.S. Patent No. 5 120 712.
Řada účinných GLP-1 fragmentů, analogů a derivátů je v oboru známa a jakýkoliv z těchto analogů a derivátů může být rovněž částí heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu. Ve vynálezu jsou poskytnuty některé příklady nových GLP-1 analogů, stejně jako GLP-1 analogů a derivátů známých v oboru.
Některé GLP-1 analogy a GLP-1 fragmenty známé v oboru zahrnují například GLP-1(7-34) a GLP-1(7-35), GLP-1(7-36),
·· ·· ► · · « ·· ·
Gln9-GLP-1(7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37
Thr16-Lys18-GLP-1 (7-37) , a Lys18-GLP-1(7-37). GLP-1 analogy jako je GLP-1(7-34) a GLP-1(735) jsou popsány v U.S. Patentu č. 5 118 666. Rovněž jsou známy biologicky zpracované formy GLP-1, které inzulinotropní vlastnosti, jako je GLP-1(7-36). Jiné biologicky účinné GLP-1 sloučeniny jsou popsány v maj i známé
U.S.
Patentu č. 5 977 071, Hoffmann, et al., U.S. Patentu č. 5 545
618, Buckley, et al., a Adelhorst, et al., J. Biol. 269:6275 (1994).
Chem.
Výhodná skupina GLP-1 analogů je sestavena z GLP-1 analogů vzorce I (SEQ ID NO: 2)
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
His-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Phe-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe
30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
41 42 43 44 45
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
Vzorec I (SEQ ID NO: 2) kde :
Xaa v pozici 8 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lle, Val, Glu, Asp, nebo Lys;
·· » « ·· *· ·· ' · · 41 ► ··· ·· · « · « • · · · • ····· • · · ·· 9
Xaa v pozici 9 je Glu, Asp, nebo Lys;
Xaa v pozici 1 1 je Thr, Ala, G1 y, Ser , Leu, Ile, Val, Glu,
Asp, nebo Lys;
Xaa v pozici 1 4 je Ser, Ala, G1 y, Thr , Leu, Ile, Val, Glu,
Asp, nebo Lys;
Xaa v pozici 16 je Val, Ala, Gly, Ser,. Thr, Leu, Ile, Tyr
Glu, Asp, Trp, nebo Lys;
Xaa v pozici 17 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu
Asp, nebo Lys;
Xaa v pozici 18 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu
Xaa
Xaa
Xaa
Xaa
Xaa
Xaa
Xaa
Xaa
Xaa
Asp, Trp, Tyr, nebo Lys;
v pozici 19 je Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gin, nebo Lys; Xaa v pozici 20 je Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr, nebo Lys;
v pozici 21 je Glu, Asp, nebo Lys;
v pozici 22 je Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, nebo Lys;
v pozici 23 je Gin, Asn, Arg, Glu, Asp, nebo Lys;
Xaa
v pozici 24 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg,
Glu, Asp, nebo Lys;
v pozici 25 je Al a, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu,
Asp, nebo Lys;
v pozici 26 je Lys, Arg, Gin, Glu, Asp, nebo His; Xaa v
pozici 27 j e Le u, Gli LI, Asp , neb< o Lys r
v pozici 30 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu,
Asp, nebo Lys;
v pozici 31 je Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp, nebo Lys; Xaa v
pozici 32 j e Le !U, G1 y, Ala, Ser , Thr , Ile , Val, Glu, Asp,
nebo Lys;
v pozici 33 je Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu,
Asp, nebo Lys;
14 • · · · · · • · · · · • · · · · · · • ·· ·····
• • · · · • · • · • •
Xaa v pozici 34 je Asn, Lys, Arg, Glu, Asp, nebo His;
Xaa v pozici 35 je Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, G lu,
Asp, nebo Lys;
Xaa v pozici 36 je Gly, Arg, Lys, Glu, Asp, nebo His;
Xaa v pozici 37 je Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val,
Glu, Asp, nebo Lys, nebo je zrušeno;
Xaa v pozici 38 je Ser, Arg, Lys , Glu, Asp, nebo His , nebo j e
zrušeno;
Xaa v pozici 39 je Ser, Arg, Lys , Glu, Asp, nebo His , nebo j e
zrušeno;
Xaa v pozici 40 je Gly, Asp, Glu, nebo Lys , nebo j e zrušeno;
Xaa v pozici 41 je Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp, uebo Lys,
nebo je zrušeno;
Xaa v pozici 42 je Ser, Pro, Lys, Glu, nebo Asp, nebo j e
zrušeno;
Xaa v pozici 43 je Ser, Pro, Glu, Asp, nebo Lys, nebo j e
zrušeno;
Xaa v pozici 44 je Gly, Pro, Glu, Asp, nebo Lys, nebo j e
zrušeno;
a Xaa v pozici 45 je Ala, Ser, Val, Glu, Asp, nebo Lys, nebo je zrušeno;
s podmínkou, že pokud je aminokyselina v pozici 37, 38,
39, 40, 41, 42, 43, nebo je 44 zrušena, potom každá další aminokyselina se rovněž ruší.
Je výhodné, aby GLP-1 sloučenina vzorce I obsahovala méně než šest aminokyselin, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH nebo Exendin-4. Je ještě výhodnější, aby se méně než pět aminokyselin lišilo od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH nebo Exendin-4. A je dokonce ještě výhodnější, aby se méně než čtyři aminokyseliny lišily od odpovídající aminokyseliny v GLP1(737)OH nebo Exendin-4.
• · · • · • · * · ·
GLP-1 sloučeniny podle vynálezu zahrnují deriváty vzorce I jako je jejich C-l-6-ester, nebo amid, nebo C-l-6alkylamid, nebo C-l-6-dialkylamid. Mezinárodní patentová publikace WO 99/43 706 popisuje deriváty GLP-1 sloučenin vzorce I a je zde zahrnuta ve své celistvosti. Sloučeniny vzorce I odvozené, jak je popsáno v mezinárodní patentové publikaci WO 99/43 706, a neodvozené jsou také zahrnuty v tomto vynálezu.
Jiná výhodná skupina GLP-1 sloučenin je tvořena GLP-1 analogy vzorce II (SEQ ID NO: 3):
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Xaa-Xaa-Leu-Glu-Gly-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37
Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-R
Vzorec II (SEQ ID NO: 3) kde:
Xaa v pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin,
2-amino-histidin, β-hydroxy-histidin, homohistidin, afluormethyl-histidin nebo a-metylhistidin;
Xaa v pozici 8 je: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, nebo Thr;
Xaa v pozici 9 je: Thr, Ser, Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Glu, nebo His;
Xaa v pozici 11 je: Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys, nebo His; Xaa v pozici 12 je: His, Trp, Phe, nebo Tyr;
Xaa v pozici 16 je: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, • · ·· · ·· · • · · · • · · · · ···« • · · · · ·· ···· ·· ·
Tyr, Glu , nebo Ala;
Xaa v pozici 18 je: His, Pro, Asp, Glu, Arg, Ser, Ala, nebo
Lys;
Xaa v pozici 19 je: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg, nebo
Cys;
Xaa v pozici 2 3 je: His, Asp, Lys, Glu, Gin, nebo Arg;
Xaa v pozici 24 je: Glu, Arg, Ala, nebo Lys;
Xaa v pozici 2 6 je: Trp, Tyr, Phe, Asp, Lys, Glu, nebo His;
Xaa v pozici 27 je: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, nebo
Lys;
Xaa v pozici 30 je: Ala, Glu, Asp, Ser, nebo His;
Xaa v pozici 31 je : Asp , Glu , Ser, Thr, Arg, Trp, nebo Lys
Xaa v pozici 33 je : Asp , Arg , Val, Lys, Ala, Gly, nebo Glu
Xaa v pozici 34 je: Glu, Lys, nebo Asp;
Xaa v pozici 35 je: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp,
Gly, Pro , His, nebo Glu;
Xaa v pozici 36 je : Thr , Ser , Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg, Glu
nebo His /
R v pozici 37 1 je: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe
His, Gly, Gly-Pro, nebo je zrušeno
Jiná výhodná skupina GLP-1 sloučenin je tvořena GLP-1 analogy vzorce III (SEQ ID NO: 4):
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Xaa-Xaa-Glu-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Phe
30 31 32 33 34 35 36 37
Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-R
Vzorec III (SEQ ID NO: 4) ·· ···· • · * · · • ···· kde :
Xaa v pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-amino-histidin, β-hydroxy-histidin, homohistidin, afluormethyl-histidin nebo oť-metylhistidin;
Xaa v pozici 8 je: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, nebo Thr;
Xaa v pozici 11 je: Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys, nebo His; Xaa v pozici 12 je: His, Trp, Phe, nebo Tyr;
Xaa v pozici 16 je: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val,
Glu, nebo Ala;
Xaa v pozici 22: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg, nebo Cys;
Xaa v pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu, nebo Gin;
Xaa v pozici 24 je: Glu, His, Ala, nebo Lys;
Xaa v pozici 25 je: Asp, Lys, Glu, nebo His;
Xaa v pozici 27 je: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, nebo
Lys;
Xaa v pozici 30 je: Ala, Glu, Asp, Ser, nebo His;
Xaa v pozici 33 je: Asp , Arg ·, Val, Lys, Ala, Gly, nebo Glu
Xaa v pozici 34 je: Glu, Lys, nebo Asp;
Xaa v pozici 35 je: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp,
Gly, Pro , His, nebo Glu;
Xaa v pozici 36 je: Arg, Glu, nebo His;
R v pozici 37 je: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe,
His, Gly, Gly-Pro, nebo je zrušeno .
Jiná výhodná skupina GLP-1 sloučenin je tvořena GLP-1 analogy vzorce IV (SEQ ID NO: 5):
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe t ·· ·· ·4 44 4 • 44 4 · ·· « · · φ • ·· ·· · 4 4 4 4 • f · · · · · · 4 · ··· • 4« ··· · « 9 • 44 ·4 44 4444 44 4
30 31 32 33 34 35 36 37
Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa-Arg-R
Vzorec IV (SEQ ID NO: 5) kde:
Xaa v pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desamino-histidin,
2-amino-histidin, oí β-hydroxy-histidin, homohistidin, afluormethyl-histidin nebo oe-metylhistidin;
Xaa v pozici 8 je: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met, nebo
Thr;
Xaa v pozici 12 je: His, Trp, Phe, nebo Tyr;
Xaa v pozici 16 je: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val,
Glu, nebo Ala;
Xaa v pozici 22 je: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg, nebo
Cys;
Xaa v pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu, nebo Gin;
Xaa v pozici 26 je: Asp, Lys, Glu, nebo Hí s;
Xaa v pozici 30 je: Al a, Glu, Asp, Ser, nebo His;
Xaa v pozici 35 je: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp,
Gly, Pro , His, nebo Glu;
R v pozici 37 je: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro, nebo je zrušeno .
Jiná výhodná skupina GLP-1 sloučenin je tvořena GLP-1 analogy vzorce V (SEQ ID NO: 6) :
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Lys-Glu-Phe
30 31 32 33 34 35 36 37 • · ř · · · · · · ·· · · · · · ·
Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R
Vzorec V (SEQ ID NO: 6) kde:
Xaa v pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desamino histidin, 2-amino-histidin, β-hydroxy-histidin, homohistidin, a-fluormethyl-histidin nebo oí-metylhistidin;
Xaa v pozici 8 je: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, nebo Thr;
Xaa v pozici Cys; 22 je : Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg, nebo
Xaa v pozici 23 je : His, Asp, Lys, Glu, nebo Gin;
Xaa v pozici Lys; 24 je : Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, nebo
Xaa v pozici 30 je : Ala, Glu, Asp, Ser, nebo His;
R v pozici 37 je: : Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe
His, Gly, Gly-Pro, nebo je zrušeno.
Mezi výhodné GLP-1 sloučeniny vzorce I, II, III, IV, a V patří GLP-1 analogy nebo fragmenty GLP-1 analogů, kde analogy nebo fragmenty obsahují jinou aminokyselinu, než alanin v pozici 8 (analogy pozice 8). Je výhodné, aby tyto analogy pozice měly jednu nebo více dalších změn v pozicích 9, 11, 12, 16, 18, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 31, 33, 34, 35, 36, a 37 ve srovnání s odpovídající aminokyselinou nativního GLP-1(737)OH. Je také výhodné, aby tyto analogy měly 6 nebo méně změn ve srovnání s odpovídající aminokyselinou nativního GLP-1(7• · ·
37) OH nebo GLP-1(7-36)OH. Ještě výhodnější analogy mají 5 nebo méně změn ve srovnání se srovnatelnými aminokyselinami v nativním GLP-1(7-37)OH nebo GLP-1(7-36)OH nebo mají 4 nebo GLP-1(7-37)OH nebo GLP-1(7-36)OH. Je dokonce ještě výhodnější, když tyto analogy mají 3 nebo méně změn ve srovnání se srovnatelnými aminokyselinami v nativním GLP-1(737)OH nebo GLP1(7-36)OH. Nejvýhodnějí mají tyto analogy 2 nebo méně změn ve srovnání se srovnatelnými aminokyselinami v nativním GLP-1(7-37)OH.
Bylo zjištěno, že sloučeniny vzorce II, III, IV, a V mají menší sklon ke shlukování a vytváření nerozpustné formy. To je také v kontextu fúzního proteinu, kde si relativně malý GLP-1 peptid si musí udržet účinnou konformaci, přestože je fúzován na mnohem větší protein. Výhodné GLP-1 sloučeniny vzorce II, III, IV, a V obsažené v fúzních proteinech podle vynálezu zahrnují GLP-1 analogy nebo fragmenty GLP-1 analogů, ve kterých glycin v pozici 22 a zejména v pozici 8 jsou nahrazeny jinou aminokyselinou.
Když je v pozici 22 aspartová kyselina, glutamová kyselina, arginin nebo lysin, v pozici 8 je výhodně glycin, valin, leucin, isoleucin, serín, threonin nebo metionin a ještě výhodněji valin nebo glycin. Když je v pozici 22 sulfonová kyselina, jako je kyselina cysteová, v pozici 8 je výhodně glycin, valin, leucin, isoleucine, serin, threonin nebo metionin a ještě výhodněji valin nebo glycin.
Jiné výhodné GLP-1 sloučeniny zahrnují GLP-1 analogy vzorce IV (SEQ ID NO:5) kde analogy mají sekvenci GLP-1(737)OH, s výjimkou toho případu, že aminokyselina v pozici 8 je výhodně glycin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin, nebo metionin a ještě výhodněji valin nebo glycin a v pozici • · i :
• φφ • · φ φ « • · · · · φ φ je kyselina glutamová, kyselina aspartová, serin, nebo histidin a ještě výhodněji kyselina glutamová.
Jiné výhodné GLP-1 sloučeniny zahrnují GLP-1 analogy vzorce IV (SEQ ID NO:5) kde analogy mají sekvenci GLP-1(737)OH s výjimkou toho případu, že aminokyselina v pozici 8 je výhodně glycin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin, nebo metionin a ještě výhodněji valin nebo glycin a v pozici 37 je histidin, lysin, arginin, threonin, serin, glutamová kyselina, aspartová kyselina, tryptofan, tyrosin, fenylalanin a ještě výhodněji histidin.
Jiné výhodné GLP-1 sloučeniny zahrnují GLP-1 analogy vzorce IV (SEQ ID NO:5) kde analogy mají sekvenci GLP-1 (737)OH s výjimkou toho případu, že aminokyselina v pozici 8 je výhodně glycin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin, nebo metionin a ještě výhodněji valin nebo glycin a v pozici 22 je glutamová kyselina, lysin, aspartová kyselina, nebo arginin a ještě výhodněji glutamová kyselina nebo lysin a v pozici 23 je lysin, arginin, glutamová kyselina, aspartová kyselina, a histidin a ještě výhodněji lysin nebo glutamová kyselina.
Jiné výhodné GLP-1 sloučeniny zahrnují GLP-1 analogy vzorce V (SEQ ID NO:6) kde analogy mají sekvenci GLP-1(7-37)OH s výjimkou toho případu, že aminokyselina v pozici 8 je výhodně glycin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin, nebo metionin a ještě výhodněji valin nebo glycin a v pozici 22 je glutamová kyselina, lysin, aspartová kyselina, nebo arginin a ještě výhodněji kyselina glutamová nebo lysin a v pozici 27 je alanin, lysin, arginin, tryptofan, tyrosin, fenylalanin, nebo histidin a ještě výhodněji alanin.
• 9 · • «I • 99 • 9 9 9 • 99 • · · • · 9 •99 9*
Jiné výhodné GLP-1 sloučeniny zahrnují GLP-1 analogy vzorce II kde analogy mají sekvenci GLP-1(7-37)OH s výjimkou toho případu, že aminokyselina v pozici 8 a jeden, dva nebo tři aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z pozice 9, pozice 11, pozice 12, pozice 16, pozice 18, pozice 22, pozice 23, pozice 24, pozice 26, pozice 27, pozice 30, pozice 31, pozice 33, pozice 34, pozice 35, pozice 36, a pozice 37, se liší od aminokyseliny na odpovídající pozici nativního GLP1(7-37)OH.
Jiné výhodné GLP-1 sloučeniny vzorce II zahrnují: Val -GLPGly8-GLP-1 (7-37) OH, Glu22-GLP-1 (7-37) OH, Asp22-GLPArg22-GLP-1 (7-37) OH, Lys22-GLP-1 (737 ) OH, Cys22-GLPVal8-Glu22-GLP-1 (7-37) OH, Val8-Asp22~GLP-l (7-37) OH,
1(7-37)OH,
1(7-37)OH,
1(7-37)OH,
Val8-Arg22-GLP-1 (7-37) OH, Val8-Lys22-GLP-1 (7-37) OH, Val8-Cys
GLP-1 (7-37) OH, Gly8-Glu22-GLP-1 (7-37 ) OH, Gly8-Asp22-GLP-1 (737) OH, Gly8-Arg22-GLP-1 (7-37) OH, Gly8-Lys22-GLP-1 (7-37) OH, Gly8Cys22-GLP-1 (7-37) OH, Glu22-GLP-1 (7-36) OH, Asp22-GLP-1 (7-36) OH,
Arg22-GLP-1 (7-36) OH, Lys22-GLP~1 (7-36) OH, Cys22-GLP-1 (7-36) OH,
Val8-Glu22-GLP1 (7-36) OH, Val8-Asp22-GLP-1 (7-36) OH, Val8-Arg22GLP-1 (7-36) OH, Val8-Lys22-GLP-1 (7-36) OH, Val8-Cys22-GLP-1 (736) OH, Gly8-Glu22-GLP-1 (7-36) OH, Gly8-Asp22-GLP-1 (7-36) OH, Gly8Arg22-GLP-1 (7-36) OH, Gly8-Lys22-GLP-1 (7-36) OH, Gly8-Cys22-GLP1(7-36) OH, Lys23-GLP-1 (7-37) OH, Val8-Lys23-GLP-1 (7-37 ) OH, Gly8Lys23-GLP-1 (7-37) OH, His24-GLP-1 (7-37) OH, Val8-His24-GLP-1 (737) OH, Gly8-His24-GLP-1 (7-37) OH, Lys24-GLP-1 (7-37) OH, Val8Lys24-GLP-1 (7-37) OH, Gly8-Lys23-GLP-1 (7-37) OH, Glu30-GLP-l (737) OH, Val8-Glu30-GLP-l (7-37) OH, Gly8-Glu30-GLP-l (7-37 ) OH, Asp30GLP-1 (7-37) OH, Val8-Asp30-GLP-l (7-37) OH, Gly8-Asp30-GLP-l (737) OH, Gln30-GLP-l (7-37) OH, Val8-Gln30-GLP-l (7-37) OH, Gly8-Gln30GLP-1 (7-37) OH, Tyr30-GLP-l (7-37 ) OH, Val8-Tyr30-GLP-l (7-37 ) OH, Gly8-Tyr30-GLP-l (737) OH, Ser30-GLP-l (7-37) OH, Val8-Ser30-GLP-l (737) OH, Gly8-Ser30-GLP-l (7-37) OH, His30-GLP-l (7-37) OH, Val8-His30GLP-1 (7-37) OH, Gly8-His30-GLP-l (7-37) OH, Glu34-GLP-1 ( 7-37) OH, • · ·· ···· (· · · • · · · i * f> ·
Val8-Glu34-GLP-1 (7-37) OH, Glya-GluJ-GLP-l (7-37) OH,
Ala34-GLP1(7-37) OH, Val8-Ala34-GLP-1 (7-37) OH, Gly8-Ala34-GLP-1 (7-37) OH,
Glyz4-GLP-1 (7-37) OH, ValB-Gly34-GLP-l (7-37 ) OH, Glya-GlyJ'-GLP35
1(7-37) OH, Ala35-GLP-1 (7-37) OH, Vale-AlaJO-GLP-l (7-37) OH, Gly°,35 ,35
Ala35-GLP-1 (7-37) OH, LysJO-GLP-l (7-37) OH, ValB-LysB0-GLP-l (737) OH, Gly8-Lys35-GLP-1 (7-37) OH, His35-GLP-1 (7-37) OH, Val8-His35GLP-1 (7-37) OH, Gly8-His35-GLP-1 (7-37) OH, Pro35-GLP-1 (7-37 ) OH, Val8-Pro35-GLP-1 (7-37) OH, Gly8-Pro35-GLP-1 (7-37 ) OH, Glu35-GLP1(7-37) OH, Val8-Glu35-GLP-1 (7-37) OH, Gly8-Glu35-GLP-1 (7-37) OH,
ValB-Ala27-GLP-l (7-37) OH, ValB-HisJ,-GLP-l (7-37) OH, ,23
Lys23-GLP-1 (7-37) OH, ValB-Gluzz-GluZJ-GLP-l (7-37) OH,
Val8-Glu22Val8-Glu22.34 ,37
Ala27-GLP-1 (7-37) OH, ValB-Gly'3'1-LysB0-GLP-l (7-37) OH, Val°-His°'22 ,27
GLP-1 (7-37) OH, GlyB-His37-GLP-l (7-37) OH, ValB-Gluzz-Alaz'-GLP ,23 (7-37) OH, Gly8-Glu22-Ala27-GLP-1 (7-37) OH, Val8-Lys22-GluZ0-GLP— 1(7-37) OH, a Gly8-Lys22-Glu23-GLP-1 (7-37) OH.
Jiná výhodná skupina GLP-1 analogů a derivátů použitelné v tomto vynálezu je tvořena molekulami vzorce VI (SEQ ID NO: 7)
Ri-X-Glu-GlylO-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-SerSer-Tyr-Leu20-Y -Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys- ZPhe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-R2
Vzorec VI (SEQ ID NO: 7) kde:
Ri je vybrán ze skupiny zahrnující L-histidin, D-histidin, desamino-histidin, 2-aminohistidin, β-hydroxy-histidin, homohistidin, alfafluormethyl-histidin, a alfamethyl-histidin;
X je vybrán ze skupiny zahrnující Ala, Gly, Val, Thr, Ile, a alfamethyl-Ala;
24 ··· ·· • · ·· . ·♦·· *«»* i
Y je vybrán ze skupiny sestávající z Glu, Gin, Ala, Thr, Ser,
a Gly r
Z je vybrán ze skupiny sestávající z Glu, Gin, Ala, Thr, Ser,
a Gly; a
R2 je Gly-OH.
Jiná výhodná skupina GLP-1 sloučenin použitelné v tomto vynálezu je popsána v WO 91/11 457, a sestává se v podstatě z GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), nebo GLP-1(7-37), nebo jejich amidových forem, a jejich farmaceuticky přijatelných solí, které mají alespoň jednu modifikaci, vybranou ze skupiny zahrnující:
(a) záměnu glycinu, šeřinu, cysteinu, threoninu, asparaginu, glutaminu, tyrosinu, alaninu, valinu, isoleucinu, leucinu, metioninu, fenylalaninu, argininu nebo D-lysinu za lysin v pozici 26 a/nebo pozici 34; nebo záměnu glycinu, šeřinu, cysteinu, threoninu, asparaginu, glutaminu, tyrosinu, alaninu, valinu, isoleucinu, leucinu, metioninu, fenylalaninu, lysinu, nebo D-argininu za arginin v pozici 36;
(b) záměnu oxidačně rezistentní aminokyseliny za tryptofan v pozici 31;
(c) záměnu aspoň jedné ze skupiny záměn: tyrosin za valin v pozici 16; lysin za serin v pozici 18; kyselina aspartová za kyselina glutamová v pozici 21; serin za glycin v pozici 22; arginin za glutamin v pozici 23; arginin za alanin v pozici 24; a glutamin za lysin v pozici 26; a (d) záměnu aspoň jedné ze skupiny záměn: glycin, serin, nebo cystein za alanin v pozici 8; kyselina aspartová, glycin, serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, metionin, nebo fenylalanin
9 •
* 9
9
9 « » · • 9
9
9999
9
9 • 9 9 9 • · · · 9 •99 99 9 za kyselinu glutamovou v pozici 9; serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, metionin, nebo fenylalanin za glycin v pozici 10; a kyselina glutamová za kyselinu aspartovou v pozici 15; a (e) záměnu glycinu, šeřinu, cysteinu, threoninu, asparaginu, glutaminu, tyrosinu, alaninu, valinu, isoleucinu, leucinu, metioninu nebo fenylalaninu, nebo D nebo Nacylované nebo alkylované formy histidinu za histidin v pozici 7; přičemž v záměnách je (a), (b), (d) a (e), substituované aminokyseliny mohou být popřípadě D-formě a aminokyseliny substituované v pozici 7 mohou popřípadě být v N-acylované nebo N-alkylované formě.
Protože enzym dipeptidyl-peptidáza IV (DPP IV) může být odpovědný za pozorovanou rychlou inaktivaci podávaného GLP1, [viz např. Mentlein, R., et al., Eur. J. Biochem., 214:829-835 (1993)], jsou v kontextu fúzních proteinů výhodné
GLP-1 analogy a deriváty, které jsou chráněny proti aktivitě DPP IV, a ještě výhodnější jsou fúzní proteiny, kde GLP-1 sloučeninou je Gly8-GLP-1(7-37)OH, Val8-GLP-1(7-37)OH, amethyl-Ala8-GLP-l (7-37) OH, nebo Gly8-Gln21-GLP-1 (7-37) OH.
Jinou výhodnou skupinou GLP-1 sloučenin použitelnou v tomto vynálezu jsou sloučeniny vzorce VII (SEQ ID NO: 8) chráněné v US patentu č. 5 512 549, které je zde výslovně uveden v odkaze.
PJ-Ala-Glu-Gly10Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala30Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-R3
R2
Vzorec VII (SEQ ID NO: 8) kde
R1 je vybrán ze skupiny sestávající z 4-imidazopropionylu, 4imidazoacetylu nebo 4-imidazo-a,a-dimethylacetylu;
R2 je vybrán ze skupiny sestávající z C6-Ci0 nerozvětveného acylu, nebo chybí;
R3 je vybrán ze skupiny sestávající z Gly-OH nebo NH2; a Xaa je Lys nebo Arg.
Ještě výhodnější sloučeniny vzorce IV, použitelné v tomto vynálezu, jsou ty, ve kterých Xaa je Arg a R2 je C6-Cio nerozvětvený acyl. Dokonce ještě výhodnější sloučeniny vzorce IV použitelné v tomto vynálezu, jsou ty, ve kterých Xaa je Arg, R2 je C6-Ci0 nerozvětvený acyl, a R3 je Gly-OH. Jiné vysoce výhodné sloučeniny vzorce IV, použitelní v tomto vynálezu, jsou ty, ve kterých Xaa je Arg, R2 je C6-Ci0 nerozvětvený acyl, R3 je Gly-OH, a R1 je 4-imidazopropionyl. A zejména výhodná sloučenina vzorce IV, použitelná v tomto vynálezu, je ta, ve které Xaa je Arg, R2 je Cg nerozvětvený acyl, R3 je Gly-OH, a R1 je 4-imidazopropionyl.
Výhodně tyto GLP-1 sloučeniny zahrnují GLP-1 analogy, kde základní řetězec těchto analogů nebo fragmentů obsahuje aminokyselinu, jinou než alanin, v pozici 8 (analogy pozice 8). Základní řetězec může rovněž zahrnovat L-histidin, Dhistidin, nebo modifikované formy histidinu, jako je desamino histidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, oífluormethylhistidin nebo α-methylhistidin v pozici 7. Je výhodné, aby tyto analogy pozice 8 obsahovaly jednu nebo více dalších změn na pozicích 12, 16, 18, 19, 20, 22, 25, 27, 30, 33 a 37 ve srovnání s odpovídající aminokyselinou nativního GLP-1(7-37)OH. Je ještě výhodnější, aby tyto analogy pozice 8 obsahovaly jednu nebo více dalších změn na pozicích 16, 18,
22, 25 a 33 ve srovnání s odpovídající aminokyselinou nativního GLP-1(7-37)OH.
9 • * · » 9
0 ♦ 000 • 0
• 0 ♦· ♦
Ve výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1(7-37)OH, kde aminokyselina v pozici 12 je vybrána ze skupiny sestávající z tryptofanu nebo tyrosinu. Je ještě výhodnější je, když kromě záměny v pozici 12, se aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem, nebo metioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je dokonce ještě výhodnější, když kromě záměny v pozicích 12 a 8, se aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou.
V jiném výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1(737)OH, kde aminokyselina v pozici 16 je vybrána ze skupiny sestávající z tryptofanu, isoleucinu, leucinu, fenylalaninu, nebo tyrosinu. Je ještě výhodnější, když kromě záměny v pozicích 16, se aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo metioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je dokonce ještě výhodnější, když kromě záměny v pozicích 16b a 8 se aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou. Je také výhodné, když kromě záměny v pozicích 16 a 8, se aminokyselina v pozici 30 nahradí kyselinou glutamovou.
Je také výhodné, když kromě záměny v pozicích 16 a 8, se aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
V jiném výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1(737)OH, kde aminokyselina v pozici 18 je vybrána ze skupiny sestávající z tryptofanu, tyrosinu, fenylalaninu, lysinu, leucinu nebo isoleucinu, výhodně tryptofanu, tyrosinu a isoleucinu. Je ještě výhodnější, když kromě záměny v pozicích 18, se aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo metioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je ·· · . * · · · • » ···»· v pozicích 16 a 8, se dokonce ještě když kromě záměny aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou.
Je dokonce ještě výhodnější, když kromě záměny v pozicích 16 a 8 se aminokyselina v pozici 30 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 16 a 8 se aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
V jiném výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1(737)OH, kde aminokyselina v pozici 19 je vybrána ze skupiny sestávající z tryptofanu nebo fenylalaninu, výhodně tryptofanu. Je výhodnější, když kromě záměny v pozicích 19 se aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo metioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je dokonce ještě výhodnější, když kromě záměny v pozicích 19 a 8 se aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 19 a se aminokyselina v pozici 30 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 19 a aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
se
V jiném výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1(737)OH, kde aminokyselina v pozici 20 je fenylalanin, tyrosin nebo tryptofan. Je výhodnější, když kromě záměny v pozici 20 se aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo metioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je dokonce ještě výhodnější, když kromě záměny v pozicích 20 a 8 se aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 20 a 8 se aminokyselina v pozici 30 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 20 a 8 se aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
GLP-1 analogem GLP-1(725 je vybrána ze skupiny >··· • · 4 * · *4444
V jiném výhodném provedení je
37)OH, kde aminokyselina v pozici sestávající z valinu, isoleucinu a leucinu, výhodně valinu. Je výhodnější, když kromě záměny v pozici 25 se aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo metioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je dokonce výhodnější, když kromě záměny v pozicích 25 a 8 se aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 25 a 8 se aminokyselina v pozici 30 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 25 a 8 se aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
V jiném výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1(737)OH, kde aminokyselina v pozici 27 je vybrána ze skupiny sestávající z isoleucinu nebo alaninu. Je výhodnější, když kromě záměny v pozici 27 se aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo metioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je dokonce ještě výhodnější, když kromě záměny v pozicích 27 a 8 se aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 27 a 8 se aminokyselina v pozici 30 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 27 a 8 se aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
V jiném výhodném provedení je GLP-1 analogem GLP-1(737)OH, kde aminokyselina v pozici 33 je isoleucin. Je výhodnější, když kromě záměny v pozici 33 se aminokyselina v pozici 8 nahradí glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem, serinem, threoninem nebo metioninem a ještě výhodněji valinem nebo glycinem. Je dokonce výhodnější, když kromě záměny v pozicích 33 a 8 se aminokyselina v pozici 22 nahradí kyselinou • · • · · • ·»·· glutamovou. Rovněž je výhodné, když kromě záměny v pozicích 33 a 8 sé aminokyselina v pozici 30 nahradí kyselinou glutamovou. Je rovněž výhodné, když kromě záměny v pozicích 33 a 8 se aminokyselina v pozici 37 nahradí histidinem.
GLP-1 sloučeniny mají modifikace na jedné nebo více následujících pozicích: 8, 12, 16, 18, 19, 20, 22, 25,
27, 30, 33 a 37. Tyto GLP-1 sloučeniny vykazují účinnost ve srovnání s GLP-1(7-37)OH a zahrnují sekvenci aminokyseliny vzorce IX (SEQ ID NO:12)
Xaa-7~Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaai2-Thr-Ser-Asp-Xaai6-SerXaai8-Xaai9-Xaa2o_Glu-Xaa22-Gln-Al a-Xaa25~Lys-Xaa27— Phe-Ile-Xaa3o-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37
Vzorec IX (SEQ ID NO: 12) kde:
Xaa7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, afluormethylhistidin nebo a-methyl-histidin;
Xaa8 je: Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr;
Xaai2 je: Phe, Trp nebo Tyr;
Xaai6 je: Val, Trp, Ile, Leu, Phe nebo Tyr;
Xaaie je: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu, Val;
Xa&i 9 je: Tyr, Trp nebo Phe;
Xaa2o je: Leu, Phe, Tyr nebo Trp;
Xaa22 je: Gly, Glu, Asp nebo Lys;
Xaa25 je: Ala, Val, Ile nebo Leu;
Xaa27 je: Glu, Ile nebo Ala;
Xaa3o je: Ala nebo Glu
X a a 3 3 je: Val, nebo Ile; a
Xaa37 je: Gly, His, NH2 nebo chybí.
♦ 4 «· ·· • · 4 ·· ·
J J * ♦ ♦ ♦ • · · · « ·· ·♦ ···.
·* 4 • · · • · · · ♦ · ··»·· • · 4 ·· t
Některé výhodné GLP-1 sloučeniny vzorce IX zahrnují GLP1(7-37)OH, GLP-1 (7-36) NH2, Gly8-GLP-1(7-37)OH, Gly8-GLP-1 (7-36)
Leu -GLP-1(7Ile8-GLP-1 (7Thr8-GLP-1 (7NH2, Vals-GLP-1 (7-37) OH, Val-GLP-l (7-36) NH2,
37) OH, Leu8-GLP-1 (7-36) NH2, Ile8-GLP-1 (7-37) OH,
36) NH2, Ser8-GLP-1 (7-37) OH, Ser8-GLP-1 (7-36) NH2,
37) OH, Thr8-GLP-1 (7-36) NH2, Val8-Tyr12-GLP-1 (7-37) OH, Val8-Tyr12GLP-1 (7-36) NH2, Val8-Tyr16-GLP-1 (7-37) OH, Val8-Tyr16-GLP-1 (736)NH2,
Val8-Glu22-GLP-1 (7-37) OH,
Val°-Glu22-GLP-1 (7-36) NH2,
GlyB-Glu22-GLP-l (7-37) OH, Gly“-Gluzz-GLP-1 (7-36) NH2, ValB-Asp .22
GLP-1 (7-37) OH, ValH-ASp22-GLP-l (7-36) NH2, GlyB-ASpzz-GLP-l (737) OH, Gly8-ASp22-GLP-l (7-36)NH2, Val8-Lys22~GLP-l (7-37) OH, ValBLys22-GLP-1 (7-36) NH2, Gly8-Lys22-GLP-1 (7-37) OH, Gly8-Lys22-GLP-1 (7-36)NH2, LeuB-Glu22-GLP-l (7-37) OH, Leua-Gluzz-GLP~1 (7-36) NH2,
Ilea-Glu22-GLP-1 (7-37) OH, IleB-Gluzz-GLP-l (7-36) NH2, LeuB-ASp
GLP-1 (7-37) OH, LeuB-Asp22-GLP-l (7-36)NH2, IleB-Aspzz-GLP-l (7-37)
OH, IleB-Asp22-GLP-l (7-36) NH2,
LeuB-Lys22-GLP-l (7-37) OH, LeuBLyszz-GLP-1 (7-36) NH2, Ile8-Lys22-GLP-1 (7-37) OH, Ile8-Lys22-GLP-1 (7-36) NH2, Ser8-Glu22-GLP-1 (7-37) OH, Ser8-Glu22-GLP-1 (7-36) NH2, Thr8-Glu22-GLP-1 (7-37) OH, Thr8-Glu22-GLP-1 (7-36) NH2, Ser8-Asp22GLP-1 (7-37) OH, Ser8-Asp22-GLP-1 (7-36)NH2, Thr8-Asp22-GLP-1 (7-37)
OH, ThrH-Asp22-GLP-l (7-36) NH2, SerB-Lyszz-GLP-l (7-37) OH, SerB,22
Lys22-GLP-1 (7-36) NH2, ThrH-Lyszz-GLP-l (7-37) OH, Thr°-Lyszz-GLP-1 (7-36) NH2, Gluzz-GLP-1 (7-37) OH, Glu22-GLP-1 (7-36) NH2, Asp22-GLP-1 i22 ,22 ,22 (7-37) OH, Aspzz-GLP-1 (7-36) NH2, Lys22-GLP-1 (7-37 ) OH, Lyszz-GLP-1 ,27 (7-36) NHZ, ValB-Ala27-GLP-l (7-37) OH, ValB-Gluzz-Alaz'-GLP-1 (737) OH, Val8-Glu30-GLP-l (7-37) OH, Val8-Glu30-GLP-l (7-36) NH2, Gly8Glu30-GLP-l (7-37) OH, Gly8-Glu30-GLP-l (7-36)NH2, Leu8-Glu30-GLP-l (7-37) OH, LeuB-Glu30-GLP-l (7-36) NH2, IleB-GluJU-GLP-l (7-37) OH,
IleB-Glu30-GLP-l (7-36)NH2, SerB-GluJU-GLP-l (7-37) OH,
Ser8-Glu3030
GLP-1 (7-36)NH2, ThrB-Glu30-GLP-l (7-37 ) OH, ThrB-GluJU-GLP-l (736)NH2,
Val8-His37-GLP-1 (7-37) OH, ValB-HisJ'-GLP-l (7-36) NH2,
Gly8-His37-GLP-1 (7-37) OH, Gly8-His37-GLP-1 (7-36)NH2, Leu8-His37GLP-1 (7-37) OH, Leu8-His37-GLP-1 (7-36)NH2, Ile8-His37-GLP-1 (7-37)
OH, Ile8-His37-GLP-1 (7-36) NH2,
SerB-His37-GLP-l (7-37) OH, SerB ·· • « • · • · · ·* ··<
*· · • · · • · · · • · · · · « ♦ · · ·♦ *
His -GLP-1(7-36)NH2, Thr -His3 -GLP-1(7-37)OH, Thr -His -GLP-1 (7-36)NH2.
Některé výhodné GLP-1 sloučeniny vzorce IX, které mají vícenásobné záměny, zahrnují GLP-1(7-37)OH, kde v pozici 8 je valin nebo glycin, v pozici 22 je kyselina glutamová, v pozici 16 je tyrosin, leucin nebo tryptofan, v pozici 18 je tyrosin, tryptofan nebo isoleucin, v pozici 25 je valin a v pozici 33 Jiné výhodné GLP-1 sloučeniny zahrnují Val8-Tyr12je isoleucin.
následující sloučeniny: Val8-Tyr12-GLP-1 (7-37) OH, .12 .16
G1u22-GLP-1 (7-37) OH, ValB-Tyrlz-Pheiy-GLP-l (7-37) OH, ValB-Tyr1BG1u22-GLP-1 (7-37) OH,
Val8-Trpls-Glu22-GLP-l (7-37) OH,
ValB-Leu1622 .16_
Glu22-GLP-1 (7-37) OH, ValB-Ile16-Gluzz-GLP-l (7-37) OH, Vala-Phelb.18 .18
Glu22-GLP-1 (7-37) OH, ValB-Trp1B-Gluzz-GLP-l (7-37) OH, ValB-Tyr1B.18
Glu22-GLP-1 (7-37) OH, ValB-Phe1B-Gluzz-GLP-l (7-37 ) OH a ValB-Ilel
Glu22-GLP-1 (7-37) OH.
GLP-1 sloučeniny podle vynálezu také zahrnují exendinové sloučenina. Exendin-3 a Exendin-4 jsou biologicky aktivní peptidy, poprvé izolované z jedu ještěrek Helodermatidae a bylo ukázáno, že vážou GLP-1 receptor a stimulují produkci H+ závislou na cAMP v parietálních buňkách savců. Exendin-3 a Exendin-4 jsou oba peptidy z 39 aminokyselin, které jsou přibližně z 53 % homologními s GLP-1. Působí jako účinný agonista s aktivitou GLP-1. Lze zaznamenat, že v N-koncové části zkrácený derivát Exendinu, známý jako Exendin(9-39 aminokyselin), je inhibitorem Exendinu-3, Exendinu-4 a GLP-1.
Exendinová sloučenina obvykle obsahuje polypeptid, který má sekvenci aminokyselin Exendinu-3, Exendinu-4 nebo jejich analogů nebo fragmentů. Exendin-3 a Exendin-4 jsou popsány US patentu č. 5 424 286.
Exendin-3 má sekvenci aminokyselin SEQ ID NO: 9:
• · • · · • ····
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
His- -Ser· -Asp-Gly-Thr- -Phe- -Thr· -Ser- -Asp- -Leu- -Ser
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Lys- -Gin· -Met-Glu-Glu- -Glu- -Ala· -Val· -Arg- Leu- -Phe
29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser
41 42 43 44 45
Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 9)
Exendin-4 má sekvenci aminokyselin SEQ ID NO: 10:
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
His· -Gly- -Glu- Gly-Thr- Phe- -Thr· -Ser- -Asp- -Leu- Ser
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Lys· -Gin- -Met- Glu-Glu- -Glu- -Ala- -Val· -Arg- -Leu- Phe
29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser
41 42 43 44 45
Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 10)
Mezi GLP-1 sloučeniny také patří fragmenty Exendinu, což jsou polypeptidy, získané po zkrácení jedné nebo více • *
• · • · · • ···· • · ·· « aminokyselin z N-zakončení a/nebo C-zakončení Exendinu nebo analogu Exendinu. Dále mezi GLP-1 sloučeniny patři Exendinové polypeptidy, ve které byla jedna nebo více aminokyselin přidána k N-zakončeni a/nebo C-zakončeni Exendinu nebo jeho fragmentů. Exendinové sloučeniny tohoto typu máji více než čtyřicet pět aminokyselin.
Mezi GLP-1 sloučeniny také patří analogy Exendinu. Analog Exendin má dostatečnou homologii s Exendinem-4, Exendinem-3 nebo jejich fragmenty, takovou, že tento analog má inzulinotropní účinnost. Účinnost Exendinových fragmentů a/nebo analogů se dá posoudit s použitím testů in vitro, jako jsou ty, které jsou popsány v EP 619 322 a US patentu č.
120 712.
Výhodně má Exendinový analog sekvenci aminokyselin Exendinu-4 nebo jeho fragmentu, modifikovanou tak, aby jedna, dvě, tři čtyři nebo pět aminokyselin lišilo od aminokyselin v odpovídající pozicí Exendinu-4 nebo fragmentu Exendinu-4. V názvosloví, které je zde použito pro označování Exendinových sloučenin, se substituující aminokyselina a její pozice je uvedena před výchozí strukturou. Například Val8-Exendin-4 znamená Exendinovou sloučeninu, v níž byl glycin, který je normálně v pozici 8 Exendinu-4, zaměněn valinem.
Jiná výhodná skupina GLP-1 sloučenin se sestává z GLP-l/Exendin-4 analogů vzorce VIII (SEQ ID NO:11).
10 11 12 13 14 15 16 17
Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Xaa-Phe • 4 · • 44· • 4 · • · 4 4 • · 4444 • · 4 •4 ·
30 31 32 33 34 35 36
Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-R
Vzorec VIII (SEQ TD NO: 11) kde:
Xaa v pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desamino-histidin, 2-amino-histidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, α-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
Xaa v pozici 8 je: Gly, Ala, nebo Val;
Xaa v pozici 16 je: Leu nebo Val;
Xaa v pozici 18 je Lys nebo Ser;
Xaa v pozici 19 je: Gin nebo Tyr;
Xaa v pozici 20 je: .Met nebo Leu;
Xaa v pozici 22 je: Glu nebo Gin;
Xaa v pozici 23 je: Glu, nebo Gin;
Xaa v pozici 25 je: Val nebo Ala;
Xaa v pozici 26 je: Arg nebo Lys;
Xaa v pozici 27 je Leu nebo Glu;
Xaa v pozici 30 je: Glu nebo Ala;
Xaa v pozici 33 je: Val nebo Lys;
Xaa v pozici 34 je: Asn nebo Lys;
Xaa v pozici 36 je: Gly nebo Arg; a
R v pozici 37 je: Gly, Pro, Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro
Ser nebo chybí.
Účinnost 18 různých druhů, které spadají do této skupiny, je uvedena v tabulce 6.
Další Exendinové analogy, které jsou použitelné pro tento vynález, jsou popsány v mezinárodní patentové publikaci PCT WO 99/25728 (Beeley et al.), WO 99/25727 Beeley et al.), WO 98/05351 (Young et al.), WO 99/40788 (Young et al.), WO 99/07404 (Beeley et al), and WO 99/43708 (Knudsen et al).
Fúzní proteiny GLP-1 podle vynálezu mohou zahrnovat glykosylovaná místa. Glykosylace je chemická modifikace, kde jsou sacharidové skupiny přidány k proteinu na určitých místech. Glykosylace proteinů hraje roli při zajištění správného náboje, ověření a stability zralého proteinu a může zaměřit protein na buněčný povrch a způsobit případnou sekreci proteinu. Nejdůležitější je, že glykosylace ovlivňuje rychlost očisty in vivo pro mnoho proteiny. Sacharidy mohou být 0vázané nebo N-vázané. Obecně 0-vázané sacharidy jsou navázány ke kyslíku hydroxylové skupiny šeřinu a threoninu, a N-vázané sacharidy jsou navázány k amidovému dusíku asparaginu. Smluvní místo pro N-glykosylaci je Asn XI X2, kde XI je jakákoliv aminokyselina s výjimkou Pro a X2 je Ser nebo Thr.
GLP-1 sloučeniny obvykle nejsou glykosylované in vivo; nicméně je zajímavé, že GLP-1 fúzní proteiny podle vynálezu, mezi které patří GLP-1. sloučenina s C prodlouženým zakončením fúzovaným na Fc sekvenci, je glykosylovaný na posledním šeřinu v C prodlouženém zakončení (SSGAPPPS*) a na threoninu v pozici 11 v N koncové oblasti Fc (AEPKSCDKTHI*CPPC . . .) .
Heterologní Fc fúzní proteiny:
Výše popsané GLP-1 sloučeniny mohou být nafúzovány přímo nebo přes peptidový linker k Fc části imunoglobulinu. Imunoglobuliny jsou molekuly obsahující polypeptidové řetězce, spojené disulfidovými vazbami, které obvykle mají dva lehké řetězce a dva těžké řetězce. V každém řetězci má jedna doména (V) variabilní sekvenci aminokyselin v závislosti na specificitě molekuly protilátky. Jiné domény (C) mají do značné míry konstantní sekvenci, která je u molekul tohoto typu běžná.
• ·· » · · ·· ··!
• ···· • ·
Jak je zde používáno, Fc část imunoglobulinu má význam, který je obecně uváděn v oblasti imunologie. Přesněji řečeno tento termín znamená fragment protilátky, která se získává odstraněním dvou regionů, které vážou antigen (Fab fragmenty), z protilátky. Jedna z cest jak odstranit Fab fragmenty je digestovat imunoglobulin papainovou proteázou. Fc část je tedy vytvořena z přibližně stejně velikých fragmentů z konstantních oblastí obou těžkých řetězců, které jsou spojeny nekovalentními interakcemi a disulfidickými vazbami. Fc část může obsahovat pantové oblasti a prodlužovat se přes CH2 a CH3 domény k C-zakončení protilátky. Příklady pantových oblastí imunoglobuliny lze nalézt v publikaci A Practical Guide, Borrebaeck, C.A.K., ed., W.H. Freeman and Co., 1992, a informace o nich jsou zde uvedeny formou odkazu. Fc část může dále obsahovat jednu nebo více glykosylačních míst. Na obrázku 1 je ukázána sekvence aminokyselin reprezentativního Fc proteinu, který obsahuje pantovou oblast, CH2 a CH3 domény a jedno N-glykosylační místo v pozici 82.
pro lidské a myší Antibody Engineering, • · ·· • 4 ♦ · ·
• · ·· ·· • · · ·· ·
Existuje pět typů lidských imunoglobulinových Fc regionů s různými účinky a farmakokinetickými vlastnostmi: IgG, IgA, IgM, IgD a IgE. IgG je nejrozšiřeněj ši imunoglobulin v séru. IgG také má ze všech imunoglobulinů v séru nejdelši poločas života (23 dni). Na rozdíl od ostatních imunoglobulinů je IgG účinně recirkulován a následně vázán na Fc receptor. Existují čtyři podtřídy IgG: Gl, G2, G3, a G4, z nichž každá má různé účinky a funkce. Gl, G2, a G3 může vázat Clq a fixovat doplněk, zatímco G4 nemůže. Přestože G3 je schopen vázat Clq účinněji než Gl, Gl je účinnější při zprostředkování doplňujícího buněčného rozkladu. G2 fixuje doplněk velmi neúčinně. Vazebné místo Clq v IgG je umístěno na oblasti karboxylového zakončení CH2 domény.
Všechny IgG podtřídy jsou schopné navazovat se na Fc receptory (CD16, CD32, CD64), přičemž s Gl a G3 jsou účinnější než G2 a G4. Vazná oblast Fc receptoru IgG je tvořena rezidui umístěnými jednak v pantové oblasti a také v oblasti karboxylového zakončení CH2 domény.
IgA může existovat v monomerní a dimerní formě, držící pohromadě J-řetězcem. IgA je druhým nejrozšířenějším Ig v séru, ale má poločas života pouze 6 dnů. IgA má tři účinky a funkce. Váže se k IgA specifickému receptoru na makrofágy a eosinofily, které rozjíždějí fagocytózu a degranulaci. IgA může také fixovat doplněk přes jinou neznámou alternativní cestu.
IgM je exprimován jako pentamer nebo hexamer, držící pohromadě J-řetězcem. IgM má poločas života 5 dnů. Váže se slabě na Clq přes vazné místo lokalizované v jeho CH3 doméně. IgD má poločas života v séru 3 dny. Je nejasné, jaké účinky a funkce náležejí tomuto Ig. IgE je monomerní Ig a má poločas • 4··· života 2,5 dne. IgE se váže na dva Fc receptory rozjíždějí degranulaci a výsledkem je uvolnění prozánětlivých účinných látek.
V závislosti na požadovaném efektu in vivo mohou heterologní fúzní proteiny podle vynálezu obsahovat jakýkoliv shora popsaný isotyp nebo mohou obsahovat změněné Fc regiony, u kterých byl změněn komplement a/nebo vazebné funkce Fc receptorů. Heterologní fúzní proteiny podle vynálezu tedy mohou obsahovat celou Fc část imunoglobulinu, fragmenty Fc části imunoglobulinu nebo jejich analogy fúzované na GLP-1 sloučeninu.
Fúzní proteiny podle vynálezu mohou sestávat z proteinů s jedním řetězcem nebo víceřetězcové polypeptidy. Dva nebo více Fc fúzní proteiny mohou být vyráběny tak, že interagují pomocí disulfidové vazby, která se přirozeně tvoří mezi Fc oblastmi. Tyto multimery mohou být homogenní s ohledem na GLP1 sloučeninu nebo mohou obsahovat jiné GLP-1 sloučeniny fúzované na N-zakončení Fc části fúzního proteinu.
Bez ohledu na finální strukturu fúzního proteinu, Fc nebo oblasti Fc podobné, musí sloužit k prodloužení poločasu života živé plasmy GLP-1 sloučeniny fúzované na N-zakončení. Dále, fúzovaná GLP-1 sloučenina musí udržovat určitou biologickou aktivitu. Zvětšení poločasu se dá dokázat použitím metody popsané v Příkladu 7, v němž se srovnává poločas života fúzního proteinu s poločasem života samotné GLP-1 sloučeniny. Biologická aktivita se dá zjistit pomocí in vitro a in vivo metod, známých v oboru. Reprezentativní biologické testy jsou popsány jako Příklady 6, 8 a 9.
Vzhledem k tomu, že Fc oblast IgG vyrobená proteolýzou má stejný poločas života in vivo jako intaktní IgG molekula a Fab ·· ·· > · · , ·» a • » a • a a a • a a aaaa • · · fragmenty rychle degradují, má se za to, že příslušná sekvence, prodlužující poločas života, sídlí v CH2 a/nebo CH3 doménách. Dále bylo ukázáno v literatuře, že rychlost katabolýzy IgG variant, které neváží s vysokou afinitou Fc receptor nebo Clq, jsou nerozeznatelné od účinnosti vyčištění hlavního divokého typu protilátky, což indikuje, že katabolické místo je odlišné od míst zahrnutých v Fc receptorů nebo Clq vazbě. [Wawrzynczak et al., (1992) Molecular
Imunology 29:221]. Studie zaměřené na rozpoznání míst při které se používá murin IgGl Fc regionu, místo IgGl Fc regionu, mutageneze, navrhly, aby rychlost katabolýzy, domény.
které kontroluje bylo umístěno na mezičlánku CH2-CH3
Na základě těchto studií, můžou být Fc regiony za účelem optimalizace poločasu života fúzovaných proteinů modifikovány na katabolickém místě. Je výhodné, aby Fc region, používaný pro heterologní fúzní proteiny podle vynálezu byl odvozen od IgGl nebo IgG4 Fc regionu. Je výhodnější, aby Fc region byl IgG4 nebo odvozen od IgG4. Je ještě výhodnější, aby IgG Fc region obsahoval CH2 i CH3 regiony i pantový region.
Heterologní fúzní proteiny s albuminem:
GLP-1 sloučeniny popsané shora mohou být fúzovány přímo nebo přes peptidový linker na albumin nebo na analog, fragment nebo jejich derivát.
Obecně, albuminové proteiny upravující část fúzovaných proteinů podle vynálezu mohou být odvozeny od albuminu klonovaného od libovolného druhu. Nicméně pro snížení nebezpečí, že se fúzovaný protein stane imunogenní u lidí, je výhodnější použít lidský albumin a fragmenty a jeho analogy. Lidský sérový albumin (HSA) sestává z jednoho ··* o
585 neglykosylovaného polypeptidového řetězce aminokyselinách se vzorcem o molekulární hmotnosti 66 500. Sekvence aminokyselin lidské HSA je znázorněna na obrázku 2. [Viz Meloun, et al. (1975) FEBS Letters 58:136; Behrens, et al. (1975) Fed. Proč. 34:591; Lawn, et al. (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114; Minghetti, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6747]. Byly popsány různé polymorfní varianty a stejně tak analogy a fragmenty albuminu. [Viz Weitkamp, et al., (1973) Ann. Hum. Genet. 37:219]. Například v EP 322 094 vynálezci objevili různé kratší formy HSA. Některé z těchto fragmentů zahrnují HSA(l-373), HSA(l-388), HSA(l-389), HSA(1369) a HSA(1-419) a fragmenty mezi 1-369 a 1-419. EP 399 666 přináší objev fragmentů albuminu, které zahrnují HSA(1-177) a HSA(l-200) a fragmenty mezi HSA(1-177) a HSA(l-200) .
Je třeba vnímat, že heterologní fúzní proteiny podle vynálezu zahrnují GLP-1 sloučeniny, které jsou s jakýmkoliv albuminovým proteinem, včetně fragmentů, analogů a derivátů, v kterých je tento fúzovaný protein biologicky aktivní a má delší plazmový poločas života, než samotná GLP-1 sloučenina. Takže není nutné, aby albuminová část fúzního proteinu měla plazmový poločas života stejný, jako nativní lidský albumin. Fragmenty, analogy a deriváty jsou známy nebo mohou být generovány, aby měly delší poločas života nebo měly délku poločasu života mezi poločasem života nativního lidského albumin a GLP-1 sloučeniny, o kterou jde.
Heterologní fúzní proteiny podle vynálezu zahrnují proteiny, které mají konzervativní aminokyselinovou substituci v GLP-2 sloučenině a/nebo Fc nebo albuminové části fúzního proteinu. Konzervativní substituce je nahrazení aminokyseliny jinou aminokyselinou, která má stejný čistý elektrický náboj a přibližně stejnou velikost a tvar. Aminokyseliny s alifatickými nebo substituovanými alifatickými aminokyselinovými postranními řetězci mají přibližně stejnou velikost, když celkový počet uhlíků heteroatomů v jejich postranním řetězci se neliší o víc než asi čtyři. Mají přibližně stejný tvar, když se počet větší jejich postranního řetězce liší o ne více než jeden. Aminokyseliny s fenylovými nebo substituovanými fenylovými skupinami se považují za přibližně stejně veliké a stejného tvaru. Kromě specificky zde vytvořených, konzervativní substituce se provádějí s přirozeně se vyskytujícími aminokyselinami.
Výraz aminokyselina, který se zde používá je míněn v vyskytuj ící vyskytující nej širším smyslu a aminokyselina, stejně aminokyseliny, včetně Posledně skupinami. definice, například přirozeně se vyskytující je norleucin, β-alanin, zahrnuje přirozeně se jako nepřirozeně se analogů a derivátů aminokyselin, uvedené zahrnují molekuly s aminokyselinovými Odborník v oboru rozpozná ve světle této nej širší že zde uvedený odkaz na aminokyselinu zahrnuje přirozeně se vyskytující proteogenní Laminokyseliny; D-aminokyseliny; chemicky modifikované aminokyseliny, jako jsou analogy a deriváty aminokyselin;
neproteogenní aminokyseliny, jako ornithin, GABA atd.; a chemicky připravené sloučeniny, které mají v oboru známé vlastnosti, které tyto aminokyseliny charakterizují. Jak je zde užíváno, výraz proteogenní znamená, že aminokyselina může být zabudována v peptidu, polypeptidu nebo proteinu v buňce metabolickou cestou.
Zabudování nepřírodních aminokyselin, včetně syntetických nenativních aminokyselin, substituovaných aminokyselin nebo jedné nebo více D-aminokyselin do heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu může být v mnoha ohledem výhodné. Peptidy obsahující D-aminokyseliny atd. vykazují zvýšenou • · · ····« stabilitu in vitro nebo in vivo ve srovnání s jejich protějšky obsahujícími L-aminokyseliny. Takže konstrukce peptidů atd. zahrnující D-aminokyseliny může být částečně užitečná, pokud se požaduje větší intracelulární stabilita. Konkrétněji, D-peptidy atd. jsou rezistentní vůči endogenním peptidázám a proteázám, čímž uskutečňují zlepšenou biologickou dostupnost molekule a prodlouženou dobu života in vivo, pokud jsou takové vlastnosti potřebné. Dále, D-peptidy, atd., nemohou být účinně zpracovány pro hlavní komplexní třídu tkáňové kompatibility II-restringové vyjádřené pro pomocné buňky T, a jsou proto schopné vyvolat humorální imunitní odezvu v celém organismu.
Kromě strukturální/funkční analýzy různých peptidů zahrnutých v tomto vynálezu, existuje řada faktorů , které mohou být uvažovány při výběru aminokyselin pro substituci. Jeden z faktorů, který může být uvažován při provádění těchto změn je hydropathický index aminokyselin. Význam hydropathického indexu aminokyselin při interaktivní biologické funkci proteinu byl diskutován v publikaci Kyte a Doolittle (1982, J. Mol. Biol., 157: 105-132). Je akceptováno, že relativní hydropathický charakter aminokyselin přispívá k sekundární struktuře výsledného proteinu. Na druhé straně to má vliv na interakci protein s molekulami, jako jsou enzymy, substráty, receptory, ligandy, DNA, protilátky, antigeny atd. Každá aminokyselina má přiřazen hydropathický index, založený na její hydrofobnosti a charakteristice nábojů: isoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenylalanin (+2,8); cystein/cystin (+2,5); methionin (+1,9); alanin (+1,8); glycin (-0,4); threonin (-0,7); serin (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrosin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2);
glutamát/glutamin/aspartát/asparagin (-3,5); lysin (-3,9) a arginin (-4,5) .
• · ····
Jak je známo z oboru, určité aminokyselin v peptidu, daj i nahradit j mými polypeptidu nebo proteinu se aminokyselinami, které mají podobný hydropathický index nebo stav a jejich efekt má za následek výsledný peptid, atd., který má podobnou nebo zlepšenou biologickou účinnost. Pro provádění těchto změn je výhodné, aby aminokyseliny, které mají hydropathické indexy v rámci hodnot ±2 jsou navzájem zaměnitelné. Výhodnější substituce jsou ty, ve kterých mají aminokyseliny hydropathické indexy v rozmezí ±1.
Nejvýhodnější substituce jsou ty, ve kterých aminokyseliny mají hydropathické indexy v rozmezí ±0,5.
Podobně mohou být aminokyseliny substituovány na zákaldě hydrofilnosti. US. patent č. 4 554 101 vysvětluje, že největší lokální průměrná hydrofilnost proteinu, jak je řízena hydrofilnosti jeho přiléhajících aminokyselin, koreluje s biologickou vlastností proteinu. Aminokyselinám jsou přiřazeny následující hodnoty hydrofilnosti: arginin/lysin ( + 3,0); aspartát/glutamát (+3,Oil); serin (+0,3); asparagin/glutamin (+0,2); glycin (0); threonin (-0,5); cystein leucin/isoleucin (-0,4) ; (-1,0) ; (-1,8) ;
prolin (-0, 5±1) ; methionin (-1,3); tyrosin (-2,3);
alanin/histidin valin (-1,5);
fenylalanin (-2,5) a tryptofan (-3,4). Jedna aminokyselina v peptidu, polypeptidu nebo protein tedy může být substituována jinou aminokyselinou, která má podobnou index hydrofilnosti a stále produkuje výsledný resultant peptid, atd., který má podobnou biologickou účinnost, t.j. stále si zachovává správnou biologickou funkci. Při provádění takových změn jsou aminokyseliny, které mají hydropathické indexy v rozmezí hodnot ±2, se mohou výhodně substituovat navzájem, výhodnější jsou ty, které mají hodnoty v rozmezí ±1, a nejvýhodnější jsou ty, které mají hodnoty v rozmezí ±0,5.
··· · · · · · · · ··«··· ·· · ····· ··· · · · · · · ··· ·· ·· ···· ·· ·
Jak bylo shora podtrženo, substituce aminokyselin v fúzovaných proteinech podle vynálezu může být založena na relativní podobnosti substituentech v postranních řetězcích aminokyselin, například jejich hydrofobicitě, hydrofilnosti, náboji, velikosti atd. Dále mohou být substituce založeny na sekundární strukturní podobnosti. Například helikální aminokyselina může být nahrazena aminokyselinou, která by zachovala helikální strukturu. Uskutečnění konzervativních změn aminokyselin pomocí substitucí, které mají mnohé z předchozích vlastností, má za následek skryté změny v peptidech, atd., a mohou být vybrány ze skupiny, do které náležejí přirozeně se vyskytující aminokyseliny.
Aminokyseliny mohou být rozděleny do následujících čtyř skupin: (1) kyselé aminokyseliny; (2) bazické aminokyseliny; (3) neutrální polární aminokyseliny a (4) neutrální nepolární aminokyseliny.
Obecné způsoby výroby heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu.
Ačkoliv heterologní fúzní proteiny podle vynálezu mohou být vyrobeny různými způsoby, výhodné jsou způsoby, které využívají rekombinačních technik. Pro účely tohoto vynálezu, jak je zde vysvětleno a chráněno, dále jsou definovány obecné termíny a zkratky pro molekulární biologii. Termíny a zkratky použité v tomto dokument mají svůj normální význam, pokud není uvedeno jinak. Například °C znamená stupně Celsia; mmolol znamená milimol nebo milimoly; mg znamená miligramy; úg znamená mikrogramy; ml znamená mililitry a μΐ znamená mikrolitry. Zkratky aminokyselin jsou uvedeny v 37 C.F.R. § 1.822 (b) (2) (1994) .
Párové báze nebo bp jak je zde používáno, znamená DNA nebo RNA. Zkratky A,C,G a T odpovídají 5'-monofosfatovým • ♦ · ·· 4 4 ··· ··· · · · · · · · · ··· · · · 4 4 4 · • 4 4 4 4 · 4 · · ·4··· • · · 4 · · · · 4 ··· · 4 ·· · 4 44 ·· · formám deoxyribonukleosidům. (deoxy)adenosinu, (deoxy)cytidinu, (deoxy)guanosinu a thymidinu, když se objeví v DNA molekulách. Zkratky U,C,G a A odpovídají 5'.monofosfátovým formám ribonukleosidů uridinu, cytidinu, guanosinu a adenosinu, když se objeví v RNA molekulách. V dvoj řetězcové DNA, jsou párové báze spojeny vždy A s T nebo C s G. V DNA/RNA, heteroduplexní párové báze může znamenat spojení A s U nebo C s G. (Viz definice komplementární, dále.)
Digesce nebo Restrikce DNA znamená katalytické rozštěpení DNA restrikčním enzymem, který působí jen v některých sekvencích DNA (sekvenčně specifické endonukleázy). Různé zde používané restrikční enzymy jsou obchodně dostupné a jejich reakční podmínky, kofaktory a jiné požadavky byly použity, jak jsou známy odborníkovi v oboru. Vhodné pufry a množství substrátu pro konkrétní restrikční enzymy jsou specifikovány výrobcem nebo se mohou snadno nalézt v literatuře.
Ligace znamená způsob výroby fosfodiesterových vazeb mezi dvěma dvouvláknovými fragmenty nukleových kyselin. Pokud není jinak ustanoveno, ligace se dá dosáhnout s použitím známý pufrů a podmínek s použitím DNA ligáz, jako je T4 DNA ligáza.
Plasmid znamená extrachromosomální (obvykle) samoreplikující se genetický prvek. Plasmidy jsou obvykle označovány malým písmenem p, následovaným písmeny a/nebo číslicemi. Zde uvedené výchozí plasmidy jsou dostupné obchodně, obecně a neomezeně dostupné nebo mohou být konstruovány z dostupných plasmidů v souladů s publikovanými postupy. Navíc ekvivaletní plasmidy , podobné těm, které jsou zde popsány, jsou známé v oboru a jsou zřejmé odborníkovi v oboru.
44 44 44 4 · 4
444 4 4 44 4 4 44
44 44 4 4444
444 4 4 44 44444
444 444 44 4
44444 444444 44 4
Klonovací vektor rekombinační DNA, jak je zde používáno, znamená jakýkoliv autonomně se replikující činidlo, které zahrnuje plasmidy a fágy, ale není na ně omezeno. Toto činidlo zahrnuje DNA molekulu, ke které může být přidáno nebo bylo přidáno jeden nebo více dalších segmentů DNA.
Expresní vektor rekombinační DNA, jak je zde používán, znamená jakýkoliv klonující vektor rekombinační DNA, ve kterém byl zabudován promotor pro řízení transkripce vložené DNA.
Transkripce znamená způsob, ve kterém se informace obsažená v nukleotidová sekvenci DNA přenáší do komplementární sekvence RNA.
Transfekce znamená vložení expresního vektoru do hostitelské buňky, kde jsou nebo nejsou, jakékoliv kódovací sekvence ve skutečnosti exprimovány. Odborníkům v oboru je známo mnoho způsobů transfekce, například společné srážení s fosforečnanem vápenatým, liposomová transfekce a elektroporéza. Úspěšná transfekce je obecně rozpoznává tehdy, když se v hostitelské buňce objeví jakákoliv indikace, že vektor se s vektorem provádí změna.
Transformace znamená zavedení DNA do organismu, tak aby DNA byla replikovatelná, buď jako extrachromosomální element nebo chromosomální integrací. Způsoby transformace bakteriálních a eukaryotických hostitelů jsou dobře známy v oboru, mnoho z těchto způsobů, jako je nástřik do jádra, splynutí protoplastů nebo působení vápníku s použití chloridu vápenatého jsou popsány v J. Sambrook, et al., Molekular Cloning: A Laboratory Manual, (1989) . Obecně se zavádí DNA • · · · 0 · · · · · · 9·· 9 · 99 99999 • 99 · · · · · 9 •90 ·· 9· ···· ·· 9 do kultivačního substrátu, termín transformace se používá jako opak k termínu transfekce.
Translace jak je zde používáno, znamená proces, při kterém se používá genetická informace messenger-RNA (mRNA), aby se upřesnila a nasměrovala syntéza řetězce polypeptidů.
odpovídající kombinovány specifické s vhodnými vlastnosti
Vektor znamená sloučeninu nukleové kyseliny, použitou pro transfekci a/nebo transformaci buněk při genové manipulaci, která nese polynukleotidové sekvence, příslušným molekulám proteinu, které jsou-li řídícími sekvencemi, propůjčují hostitelské buňce, která je transfektována a/nebo transformována. Vhodnými vektory jsou plasmidy, viry a bakteriofágy. Umělé vektory jsou konstruovány sekáním a opětným spojování DNA molekul z různých zdrojů, přičemž se používán restrikčních enzymů a ligáz. Termín vektor, jak je zde používán, zahrnuje klonující vektory rekombinační DNA a expresní vektory rekombinační DNA.
Komplementární nebo Komplementarita, jak je zde používá, znamená párové báze (puriny a pyrimídiny), které se vodíkovými vazbami do dvouřetězcové nukleové
Komplementární jsou následující párové báze: guanin spojuji kyseliny, a cytosin; adenin a tymin a adenin a uráčil.
Hybridizace, jak je zde používáno, znamená proces, při kterém se řetězec nukleové kyseliny spojuje s komplementárním řetězcem pomocí párování bází používané při hybridizaci dvou neidentických, podobných komplementárních nukleových kyselin, závislosti na stupni komplementarity těchto řetězců a jejich délce. Tyto techniky a podmínky pro jejich provádění jsou
Podmínky ale velmi se mění v dobře známé odborníkům v oboru.
Izolovaná sekvence aminokyseliny znamená jakoukoliv sekvenci aminokyseliny, konstruovanou nebo syntetizovanou, která je pozičně odlišná od přírodně se vyskytující sekvence.
Izolovaná DNA sloučenina znamená jakoukoliv sekvenci DNA, konstruovanou nebo syntetizovanou, která je pozičně odlišná od přirozené pozice v genomové DNA.
Izolovaná sloučenina nukleové kyseliny znamená jakoukoliv sekvenci RNA nebo DNA, konstruovanou nebo syntetizovanou, která je pozičně odlišná od své přirozené pozice.
Primer znamená fragment nukleové kyseliny, který funguje jako iniciační substrát pro enzymatické nebo synthetické prodlužování.
Promotor znamená sekvenci DNA, která usměrňuje transkripci z DNA na RNA.
Proba znamená sloučeninu nukleové kyseliny nebo její fragment, která se hybridizuje s jinou sloučeninou nukleové kyseliny.
Přesnost hybridizačních reakcí je snadno stanovitelná odborníkem v oboru a obecně se zjišťuje empirickým výpočtem, závislým na délce proby, teplotě promývání a koncentraci soli. Obecně, delší proby vyžadují vyšší teploty pro správnou teplotní hybridizací, a kratší proby potřebují nižší teplotu. Hybridizace obecně závisí na schopnosti denaturované DNA znovu hybridizovat, když jsou v médiu přítomny komplementární řetězce pod svou poloviční teplotou denaturace. Čím vyšší je stupeň požadované homologie mezi probou a hybridizovatelnou ·· φφ φφ ·ΦΦ· φφφ φφ φφ φ · · φ · φ φφφ φ φ · · φφφφφ φφ Φ·Φ · φ · φφ φφφφφφ ·· φ sekvencí, tím vyšší teplota se dá použít. Jako výsledek je třeba uvést, že vyšší relativní teploty mají tendenci dělat reakci přesnější, zatímco nižší teploty méně. Pro uvedení dalších podrobností a vysvětlení přesnosti hybridizace viz Ausubel et al., Current Protocols in Molekular Biology, Wiley Interscience Publishers, 1995.
Přesné podmínky nebo vyšší přesnost podmínek, jak jsou zde popsány, mohou být stanoveny tím, že (1) využívají malou iontovou sílu a vysokou teplotu pro promývání, například 15 mmol chlorid sodný/1,5 mmol citrát sodný/0,1 % dodecylsulfát sodný při 50°C; (2) využívají během hybridizace denaturační činidlo, jako je formamid, například 50 % (v/v) formamid s 0,1 % albumin hovězího séra /0,1 % fikol/0,1 % polyvinylpyrrolidon/50 mmol pufr s fosforečnanem sodným při pH 6,5 s 750 mmol chlorid sodný/75 mmol citrát sodný při 42 °C; nebo (3) využívá 50 % formamid, 5X SSC (750 mmol chlorid sodný, 75 mmol citrát sodný), 50 mmol fosforečnan sodný (pH 6,8), 0,1 % difosforečnan sodný , 5X Denhardtův roztok, DNA ze spermatu lososa upraveného ultrazvukem (50 pg/ml), 0,1 % SDS, a 10 % dextransulfát při 42 °C s promytím při 42 °C v 0,2X SSC (30 mmol sodný chlorid sodný /3 mmol citrát sodný) a 50 % formamidem při 55°C, následovaným intenzivním promytím s pomocí 0,1 X SSC obsahujícího EDTA pří 55°C.
Středně přesné podmínky jsou popsány v Sambrook et al. [Molekular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, (1989)], a zahrnují použití promývacích roztoků a hybridizačních podmínek (tj. teploty, iontové síly a % SDS) méně přísných, než bylo popsáno dříve. Příklade těchto podmínek je inkubace přes noc při 37°C v roztoku, který obsahuje: 20% formamidu, 5X SSC (750 mmol chlorid sodný, 75 mmol citrát sodný), 50 mmol fosforečnan sodný při pH 7,6, 5X Denhardtův roztok, 10 % dextransulfát a 20 mg/ml DNA lososího • ·· ·· ·· ·· · ···· · · · · · · · ··· ·· · ···· ······ · · · · ····
-- ······ · · · ··· ♦· ·· ···· ·· · spermatu, narušeného denaturací, po němž následuje promytí v IX SSC při přibližně 37-50°C. Odborník v oboru snadno rozpozná, jak nastavit teplotu, iontovou sílu atd. pokud je nutné přizpůsobit různé faktory, . jako je délka proby a podobně.
PCR znamená známou polymerační reakci řetězce, která využívá teplotně stabilní polymerázu DNA.
Vedoucí sekvence znamená sekvenci aminokyseliny, která může být enzymaticky nebo chemicky odstraněna, aby se dal vyrobit požadovaný polypeptid, o který nám jde.
Vylučovací signální sekvence znamená aminokyselinovou sekvenci , obecně přítomnou na N-koncové oblasti většího polypeptid, která funguje jako iniciátor spojení tohoto polypeptidu membránovými součástmi buňky, jako je endoplasmatické retikulum a vyloučení tohoto polypeptidu přes plazmovou membránu.
Konstrukce DNA kódující heterologní fúzní proteiny podle vynálezu:
Standardní albuminové a imolunoglobulinové proteinů lze získat z mnoha zdrojů. Například lze tyto proteiny získat z cDNA knihovny, připravené z tkání a buněk, které obsahují mRNA, o niž nám jde, v detekovatelném množství. Knihovny lze prohledávat pomocí prob, vyrobených s použitím známých DNA nebo proteinových sekvencí pro nalezení sekvence pro konkrétní protein, který nás zajímá. Například immolunoglobulin light nebo heavy chain constant regions jsou popsány v Adams, et al. (1980) Biochemistry 19:2711-2719; Goughet, et al. (1980) Biochemistry 19:2702-2710; Dolby, et al. (1980) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 6027-6031; Rice et ·· ·· « • · · · · • · · · • · · · · · ♦ · · · ·· ···· « al. (1982) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:7862-7862; Falkner, et al. (1982) Nátuře 298:286-288 a Morrison, et al. (1984)
Ann. Rev. Immolunol. 2:239-256. Nketré odkazy popisující albuminové proteiny a DNA sekvence jsou obsaženy v Meloun, et al. (1975) FEBS Letters 58:136; Behrens, et al. (1975) Fed.
Proč. 34:591; Lawn, et al. (1981) Nucleic Acides Research
9:6102-6114 a Minghetti, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6747.
Screening cDNA nebo genomové knihovny s vybranou probou může být prováděno s použitím standardních postupů, které jsou popsány v Sambrook et al., Molekular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989). Alternativním prostředkem pro izolaci genů kódujících albuminový nebo imolunoglobulinový protein, je způsob PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A , Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1995)] . PCR primery lze konstruovat na základě známých sekvencí.
Obecně, standardní sekvence s plnou délkou klonovaná z konkrétních druhů může sloužit jako matrice pro vytvoření analogů, fragmentů a derivátů, které si udržují schopnost přenášet delší poločas života na GLP-1 sloučeniny, které jsou částí fúzovaných proteinů. Je výhodné, aby Fc a albuminové části heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu byly odvozeny od nativní lidské sekvence za účelem snížit riziko potenciální imunogenicity fúzovaných proteinů u lidí.
Zejména je výhodné, aby imunoglobulinová část fúzního proteinu podle vynálezu obsahovala pouze Fc fragment imunoglobulinu. V závislosti na tom, zda je žádoucí konkrétní účinek nebo funkce a na strukturních vlastnostech fúzního proteinu, může Fc fragment obsahovat pantovou oblast spolu s • ·· ·· ·4 44 ·
4 4 · · · · · · 4
44 44 4 4444
444 4 444 4 4 4 4 4
444 444 444
444 44 44 4444 44 4
CH2 a CH3 doménami nebo některé jejich další kombinace. Tyto Fc fragmenty mohou být konstruovány s použitím PCR technik s primery určenými k hybridizaci sekvencí, odpovídajících požadovanému konci fragmentu. Pokud jsou podobně požadovány fragmenty albuminu, jsou použity PCR primery, které jsou komplementární s interními albuminovými sekvencemi. Mohou být rovněž vytvořeny PCR primery, které tvoří restrikční enzymové místo, aby se dosáhlo klonování do expresního vektoru.
DNA kódující GLP-1 sloučeniny podle vynálezu může být vyrobena mnoha různými způsoby, včetně způsobů klonování, které byly popsány shora, stejně jako chemickou syntézou DNA. Chemická syntéza může být atraktivní, aby poskytla krátkou délku kódovaného peptidu. Byla publikována aminokyselinová sekvence pro GLP-1, stejně jako sekvence preproglukagonového genu. [Lopez, et al. (1983) Proč. Nati. Acad. Sci., USA
80:5485-5489; Bell, et al. (1983) Nátuře, 302:716-718; Heinrich, G., et al. (1984) Endocrinol, 115:2176-2181; Ghiglione, M., et al. 91984) Diabetologia 27:599-600]. Primery tedy mohou být vytvořeny pro PCR nativní GLP-1 sloučeniny a jejich fragmenty.
Gen kódující fúzovaný protein může být konstruován ligaci DNA kódující GLP-1 sloučeninu s DNA kódující albumin nebo Fc protein. Gen kódující GLP-1 sloučeninu a gen kódující albumin nebo Fc protein mohou být rovněž připojeny přes DNA kódující linkerový peptid.
Funkce a stabilita heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu in vivo může být zlepšena přidáním malých peptidových linkerů pro prevenci potenciálních nežádoucích interakcí domén. Ačkoliv tyto linkery mohou mít potenciálně jakoukoliv délku a obsahovat jakoukoliv kombinaci aminokyselin, je výhodné, když jejich délka není větší, než • 99 t ♦ · ♦ · · #
4> 9 9 € 9 · «9 9 9 9 9 999 « · 9 999
999 99 99 9999 9* * jaká je nezbytná pro prevenci nežádoucích interakcí domén a/nebo optimalizaci biologické aktivity a/nebo stability. Obecně by linkery neměly obsahovat aminokyseliny s extrémně velkými postranními řetězci nebo aminokyseliny, způsobilými zavést signifikantní sekundární strukturu. Je výhodné, aby linker byl serin-glycin a měl délku kratší než 30 aminokyselin. Je výhodnější, když linker má délku kratší než 20 aminokyselin. Je dokonce ještě výhodnější, když má linker délku kratší než 15. Výhodný linker obsahuje opakování sekvence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. Je výhodné, když má mezi 2 až 6 opakování této sekvence. Je dokonce ještě výhodnější, když má mezi 3 a 4 opakováními sekvence.
DNA kódující divoký typ GLP-1, albuminu a Fc polypeptidu a jejich fragmenty, může být mutována buď před ligací nebo v kontextu cDNA, kódující celý fúzovaný protein. V oboru je známo mnoho mutagenních technik. Například, mutagenní metoda PCR využívá protažení překrývaného řetězce, aby se vytvořily specifické mutace bází za účelem změny specifických aminokyselinových sekvencí v odpovídajícím protein. Tato PCR mutagenese vyžaduje použití čtyř primerů, dvou v přední orientaci (primery A a C) a dvou v zadní orientaci (primery B a D) . Mutatovaný gen se zesiluje z vzorku divokého typu ve dvou různých krocích. První reakce zesiluje gen z poloviny tím, že se provádí reakce A a B a reakcí, která separuje C od D, kde B a C primery jsou zaměřeny na oblast genu, který má být mutován. Když se tyto primery srovnají s cílovou oblastí area, obsahují nesprávně sdružené báze, které se mají změnit. Jakmile jsou reakce A a B a C a D reakce dokončeny, jsou reakční produkty izolovány a smíchány pro použití jako vzorek pro reakci A a D. Výtěžkem této reakce je potom plně mutovaný produkt.
• 4 · • 9 • 4 4(4 4
• ·« • • 4 • 4 4
4 4 4 4 4 9 4 · 4 4
4 4 4 • • 4 4 4
444 «4 • 9 • 4 · 4 4,9
Jakmile byl vyroben gen kódující celý fúzovaný protein, může být klonován do vhodného expresního vektoru. Specifické strategie, kterou mohou být použity k vytvoření GLP-1 fúzovaných proteinů podle vynálezu jsou popsány v příkladu 1.
Obecné způsoby pro rekombinanční exprimaci fúzovaných proteinů podle vynálezu:
heterologních
Hostitelské buňky jsou transfektované nebo transformované zde popsanými expresními nebo klonujícími vektory pro výrobu heterologního fúzního proteinu a kultivovány v běžném živném roztoku upraveném pro budicí promotory, jsou známy elektroporace odborníkům
Obecné zesílení genu vybrané transformanty nebo kódujících požadované sekvence. Kultivační podmínky, jako je prostředí, teplota, pH a podobně, mohou být zvoleny odborníkem v oboru bez nadměrného počtu experimentů. Obecně lze principy, postupy a praktické techniky pro maximalizování výtěžků buněčných kultur nalézt v publikaci Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL
Press, 1991) a Sambrook, et al., supra. Způsoby transfekce v oboru, například, CaPO4 a aspekty systému transformace hostitelský buněk savců byly popsány v US Patent č. 4 399 216. Transformace do produktu je obvykle prováděna podle metody Solingen et al., J Bact. 130(2): 946-7 (1977) a Hsiao et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA ,76 (8) : 3829-33 (1979) .
Rovněž mohou být použity další způsoby pro zavádění DNA do buňky, jako je jaderná mikroinjekce, elektroporace, fúze bakteriálního protoplastů s intaktní buňkou nebo polykationty, například, polybren nebo polyomithin. Pro různé techniky transformace buněk savců viz Keown, et al.,
Methods v Enzymology 185: 527-37
Nátuře 336(6197): 348-52 (1988).
(1990) a Mansour, et al.,
• «0 0 « • 0 0 * •
0 0 0 0 0 * 0 0 0
0· ; * · 0 0 «· 0 0
• 4 1 · 0 0 0 0
0 0 0 0 0 00 000 0 0»
omezující hostitel je hostitelský
Hostitelská buňka
Vhodné hostitelské buňky pro klonování a expresi nukleových kyselin (např. DNA) ve vektorech zde zahrnují prokaryota, kvasinky nebo vyšší eukaryotické buňky. Mezi vhodná prokaryota patří (aniž by byl výčet těchto prokaryot na tyto buňky omezen) eubakterie, jako jsou Gram-negativní nebo Gram-pozitivní organismy, například, Enterobacteriacea jako je E. coli. Různé kmeny E. coli jsou běžmně dostupné, jako například E. coli K12 kmen MM294 (ATCC 3 1.446); E.
coli XI 776 (ATCC 3 1.537); E. coli kmen W3 110 (ATCC 27.325) a K5 772 (ATCC 53.635). Mezi jiné vhodné prokaryotické hostitelské buňky patří Enterobacteriaceae jako je Escherichia, např. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebisella, Próteus, Salmonella, např. Salmonella typhimurium, Serratia, např. Serratia marcescans a Shigeila, stejně jako Bacilli jako je B. subtilis a B. lichentformis (např. B. licheniformis 4 1 P popsaný v DD266,7 10, publikovaný 12.
dubna 1989), Pseudomonas jako je P. aeruginosa a Streptomyces. Tyto příklady se spíše dají považovat za ilustrativní, než za Zejména výhodný jako hostitel nebo základní W3110, protože se jedná o nejběžnější pro fermentaci produktů rekombinační DNA. s výhodou vylučuje minimální množství proteolytických enzymů. Například, proto aby se dosáhlo genetické mutace v genech kódujících proteiny, endogenní vůči hostiteli, může být modifikován kmen W3 110, přičemž příklady těchto hostitelů zahrnují E. coli W3110 kmen 1A2, který má kompletní genotyp ronA; E. coli W3 110 kmen 9E4, který má kompletní genotyp ton4 ptr3; E. coli W3110 kmen 27C7 (ATCC 55,244), který má kompletní genotyp tonA, ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT /can'; E. coli W3110 kmen 4OB4, což je kmen 37D6, který je má non-kanamycin rezistentní degP deleční mutaci; a E. coli kmen, který má mutovanou periplasmickou proteázu, popsanou v US. Patentu č. 4 946 783, vydaném 7. srpna 1990. Alternativně jsou vhodné způsoby kmen kmen
• 0 · 0 0 0« 0 0 0 ·
0 «0 0 0 0 0 0 0 0
• 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0
000 «· 00 0000 0* 0'
klonování in vivo, např. PCR nebo jiné reakce polymeráz s nukleovýni kyselinami.
Vhodnými klonujícími nebo vektory fúzovaných proteinů eukaryotické mikroby, jako jsou kvasinky. Nejběžněji používaným hostitelským mikroorganismem je expresními hostiteli pro jsou kromě prokaryot vláknité houby nebo nižším eukaryotickým
Saccharomyces cerevisiae.
Mezi jiné patří Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse, Nátuře 290: 140-3 (1981); EP 139,383 publikovaný 2. květen 1995]; Muyveromyces hosts [US Patent č. 4 943 529; Fleer, et al., Bio/Technology 9(10): 968-75 (1991)] jako je např. K lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574) [de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2): 737-42 (1983)]; K. fiagilis (ATCC 12,424),
K. bulgaricus (ATCC 16,045), K wickeramii (ATCC 24,178), K waltii (ATCC 56,500), K, drosophilarum (ATCC 36.906) [Van den Berg et al., Bio/Technology 8(2): 135-9 (1990)]; K.
thermotoierans a K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070) [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28(4): 265-78 (1988)]; Candid; Trichoderma reesia (EP
244,234); Neurospora crassa [Čase, et al., Proč. Nati. Acad Sci. USA 76(10): 5259-63 (1979)]; Schwanniomyces jako je (EP 394 538 publikováno 31. října jako jsou např. Neurospora,
Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publikováno 10. ledna 1991) a Aspergillus hostitel jako je A. nidulans [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 112(1): 284-9 (1983)]; Tilburn, et al., Gen 26(2-3): 205-21 (1983); Melton, et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81(5): 1470-4 (1984)] a A. niger [Kelly and Hyneš, EMBO J. 4(2): 475-9 (1985)]. Methylotropní kvasinky jsou zvoleny mezi druhy, mezi které patří Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis a Rhodotoruia. Seznam specifických druhů, který je příkladem
Schwanniomyces occidentulis 1990) a vláknité houby
• · · • · · · • · 9
9 * · • · « • 9 9
• · 9 * · · · 9 9 • 99·
• ·· · · • · · · « · 9 9 • 9 9
této třídy kvasinek lze nalézt Biochemistry of · Methylotrophs 269 publikaci C. Antony, The 1982).
Vhodné hostitelské buňky pro expresi fúzovaných proteinů podle vynálezu jsou odvozeny od vícebuněčných organismů. Příklady buňky bezobratlých (invertebrata) jsou buňky hmyzu, jako je Drosophila S2 a Spodoptera Sp, Spodoptera high5, stejně jako rostlinné buňky. Příklady vhodných savčích hostitelských buněčných linií jsou vaječníky čínského křečka (CHO) a COS buňky. Konkrétnějšími příklady jsou linie CV1 z opičích ledvin, transformovaná SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linie z ledvin lidských embryí [293 nebo 293 buňky subklonané pro růst suspenzní kultuře, Graham, et al., J. Gen Virol., 36(1) : 59-74 (1977)]; buňky vaječníku čínského křečka/-DHFR [CHO, Urlaub and Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77(7): 4216-20 (1980)]; buňky myší (sertoli) [TM4, Mather, Biol.
Reprod. 23(1):243-52 (1980)]; lidské plicní buňky (W138. ATCC CCL 75); lidské jaterní buňky (Hep G2, HB 8065) a tumor myší prsní žlázy (MMT 060562, ATCC CCL51). Domníváme se, že výběr vhodné hostitelské buňky je pro odborníka v oboru snadný.
Fúzovaný protein podle vynálezu může být rekombinačně vyroben přímo nebo jako protein, který má signální sekvenci nebo jiné další sekvence, které tvoří specifické štěpné místo na N-zakončení zralého fúzního proteinu. Obecně může být signální sekvence složkou vektoru nebo může být částí DNA kódující fúzovaný protein, která je zavedena do vektoru. Signální sekvence může být prokaryotickou signální sekvencí vybranou například ze skupiny, do které patří alkalická fosfatáza, penicillináza, lpp nebo tepelně stabilní enterotoxinové II zavaděče. Pro vylučování kvasinek může být signální sekvencí např. zavaděč kvasinkové invertázy, zavaděč alfa faktoru (včetně zavaděčů Saccharomyces a Kluyveromyces cc-faktoru, přičemž druhý je popsán v US Patentu č. 5 010 182) • · · · · · · ·» * • · e · · 9 9 9 9 9 9
99 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 .9 9 99 9
9 9 9 9 9 9 9 9
99 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 nebo zavaděč kyselé fosfatázy, zavaděč glukoamylázy C. albicans (EP 362,179) nebo signál, popsaný v publikaci WO 90/13 646. Při expresi savčích buněk mohou být použity pro kontrolu vylučování proteinu savčí signální sekvence, jako jsou signální sekvence z vylučovaných polypeptidů stejných nebo příbuzných druhů, stejně jako vylučovací zavaděče virů.
Expresní i klonovací vektory obsahují sekvenci nukleové kyselina, která umožňuje, aby se vektor replikoval v jedné nebo více vybraných hostitelských buňkách. Takové sekvence jsoz dobře známy pro různé bakterie, kvasinky a viry. Pro většinu Gram-negativních bakterií je vhodný původ replikace z plasmidu pBR322, původ z plasmid 2u je vhodný pro kvasinky a klonující vektory v savčích buňkách je vhodný původ z různých virů (SV40, polyoma, adenovirus, VSV nebo BPV).
Expresní a klonovací vektory obvykle obsahují selekční gen, rovněž označovaný jako volitelný markér. Obvyklé selekční geny kódují proteiny, které (a) dávají rezistenci antibiotikům nebo jiným toxinům, např. ampicilinu, neomycinu, methotrexatu nebo tetracyklinz, (b) doplňují autotrofní nedostatky nebo (c) dodávají kritické živiny, kter- nejsou dostupné v komplexním médiu např. gen kódující D-alanin racemázu pro Bacilli.
Příkladem vhodných volitelných markérů pro savčí buňky jsou ty, které jsou schopné rozpoznat buňky způsobilé převzít nukleovou kyselinu kódující fúzovaný protein, jako je as DHFR nebo thymidinkináza. Pokud je použit divoký typ DHFR, je vhodnou hostitelskou buňkou buněčná linie CHO s nedostatečnou aktivitou DHFR, vyrobená a šířená, jak je popsáno [Urlaub and Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77(7): 4216-20 (1980)]. A Vhodným selekčním genem pro použití v kvasinkách je trpí gen • · · ·· · · · · · ft» · * · · · · · · » * ·· * · ♦ ····
9 9 9 9 · < 99 9 9999
99 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 přítomný v kvasinkovém plasmidu YRp7 [Stinchcomb, et al., Nátuře 282(5734): 39-43 (1979); Kingsman, et al., Gen 7 (2) : 141-52 (1979) ; Tschumper, et al. , Gen 10 (2) : 15766 (1980)]. Tento trpí gen uskutečňuje selekční markér pro a mutovaný kmen kvasinek, u kterých chybí schopnost růstu v tryptofanu, například, ATCC No. 44076 nebo PEPCI [Jones, Gentics 85: 23-33 (1977)].
Expresní a klonující vektory obvykle obsahují promotor operabilně napojený sekvenci nukleové kyseliny kódující fúzovaný protein, aby řídila syntézu mRNA. Promotory rozpoznané řadou potenciálně hostitelských buněk jsou dobře známy. Mezi promotory vhodné pro použití s prokaryotickými hostiteli patří β-laktamáza a laktozové promotorové systémy [Chang, et al., Nátuře 275 (5681) : 617-24 (1978); Goeddel, et al. , Nátuře 281 (5732) 544-8 (1979)], alkalická fosfatáza a tryptofan (up) promotorový systém [Goeddel, Nukleic Acids Res. 8(18): 4057-74 (1980); EP 36,776 publikovaný 30. září 1981], a hybridní promotory, jako je tento promotor [deBoer, et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80 (1) : 21-5 (1983)]. Promotory pro použití v bakteriálních systémech také obsahují sekvenci Shine-Dalgarno (S. D.) operabilně navázanou na DNA kódující fúzovaný protein.
Mezi příklady vhodných promotorových sekvencí pro použití s kvasinkovými hostiteli patří 3-fosfoglycerátkináza [Hitzeman, et al, , J. Biol. Chem. 255 (24) : 12073-80 nebo jiné glykolytické enzymy [Hess et al., J. Adv.
1980)] Enzyme 49007
Reg. 7: 149 (1968) (1978)], jako fosfátdehydrogenáza, fosfofruktokináza, fosfoglycerátmutáza,
Holland, Biochemistry 17 (23): jsou enoláza, glyceraldehyde-3hexokináza, pyruvátedekarboxyláza, glukosa-6-fosfát isomeráza, 3pyruvátkináza, triosefosfátisomeráza, fosfoglukosoisomeráza a glukokináza.
• «4 4 4 4 4 4 4 4
• 4 · 4 4 4 4 4 4 4
4 4 4 • · 4 4 4 4 4 4 4 4 4
4 4 4 4 4 4 4 4 4
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Jiné kvasinkové promotory, které jsou indukujícími promotory, které mají další výhody spočívající v transkripčně řízených růstových podmínkách, jsou promotorovými regiony pro alkoholdehydrogenázu 2, isocytochrom C, kyselou fosfatázu, degradativní enzymy spojené metabolismem dusíku, metallothionein, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázou a enzymy zodpovědnými za využití maltózy a galaktózy. Vhodné vektory a promotory použitelné pro expresi kvasinek jsou dále popsány v EP 73 657. Transkripce mRNA kódující fúzovaný, protein z vektorů v savčích hostitelských buňkách může být řízena například promotory, získanými z genomů virů, jako jsou virus polyomu, fowlpox virus, adenovirus (jako je Adenovirus 2) , virus hovězího papilomu, virus ptačího sarkomu, cytomegalovirus a retrovirus, virus hepatitis-B a Virus Simian 40 (SV40), z heterologních savčích promotorů např. aktinový promotor nebo imunoglobulinový promotor a promotory vzniklé tepelným šokem, za podmínky, že takové promotory jsou kompatibilní se systémem hostitelské buňky.
Transkripce polynukleotidu, kódujícího fúzovaný protein vyššími eukaryoty, může být zvýšena vložením zesilovači sekvence do vektoru. Zesilovače jsou elementy DNA působící cis mechanismem, obvykle od 10 do 300 bp, které působí na promotor tak, že zvyšují jeho transkripci. Ze savčích genů je známo mnoho zesilovacích sekvencí (globin, elastáza, albumin, a-ketoprotein a insulin). Obvykle se v tomto případě použije zesilovač z eukaryotických buněk viru. Mezi příklady patří zesilovač SV40 na posledním replikačním místě (bp 100-270), raný promotor zesilovač cytomegaloviru, zesilovač polyomu na posledním replikačním místě a zesilovač adenoviru. Zesilovač může být zapojen vektor v pozici 5' nebo 3' kódovací sekvence fúzního proteinu, ale je výhodně umístěn na místě 5' od promotoru.
· · · · 4 4 4 4 4 • 44 4 4 4 4 4 4 4 •4 44« 4 4 44 44444 • 44 444 444 • 44 44 44 4 4 · 4 44 4
Expresní vektory používané eukaryotických hostitelských buňkách (kvasinky, houby, hmyz, rostliny, zvířata, člověk nebo buňky s jádrem z jiných mnohobuněčných organismů) také obsahují sekvence nutné pro ukončení transkripce a pro stabilizaci mRNA. Takové sekvence are jsou všeobecně dostupné z 5' a případně 3' netranslantovaných regionů eukaryot nebo DNA nebo cDNA virů. Tyto regiony obsahují nukleotidové segmenty transkribované jako polyadenylované fragmenty v netranslatovaném podílu mRNA kódující fúzovaný protein.
Různé formy fúzovaných proteinů mohou být získány z kultivačního média nebo lyzátů hostitelských buněk. Pokud josu vázány na membránu, mohou z ní být uvolněny s použitím vhodného roztoku detergentu (např. Triton-X 100) nebo enzymatickým štěpením. Buňky využívané při expresi fúzního proteinu mohou být porušeny různými fyzikálním nebo chemickými prostředky, jako je cyklus zmrazování a rozmrazování, působení ultrazvuku, mechanické rozrušení nebo činidla pro lýzi buněk.
Čištění heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu:
Jakmile jsou heterologní fúzní proteiny podle vynálezu exprimovány v odpovídající hostitelské buňce, je možné izolovat a čistit analogy. Vhodnými čistícími procedurami jsou: frakcionace na karboxymethylcelulóze; gelová filtrace, například na Sephadexu G-75; výměna na aniontové pryskyřici, například na DEAF nebo Mono-Q; kationtová výměna například na CM nebo Mono-S; protein A sefaróza pro odstranění kontaminantů, například IgG; kovové chelatační kolony, které vážou epitopem značené formy polypeptidu; HPLC s reverzní fází; chromatofokusing; silikagel; srážení etanolem a srážení síranem amonným.
• · · ·· · · «· · • · · · · · · · 9 · · • · · * · · · · · · • · · ♦ · · · · · ····» ·· · · · · · · » ··· »e ···· ·· ·
Pro čištění proteinů může být použita řada způsobů a tyto metody jsou známy v oboru a jsou popsány například v Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) a Scopes,
Protein · Purification: Principles and Practice, SpringerVerlag, NY (1982). Vybraný(é) čistící krok(y) závisí na na povaze vybraného způsobu výroby a konkrétním vyráběném fúzním proteinu. Například, fúzní proteiny obsahující Fc fragment mohou být účinně čištěny s použitím matrice afinity Protein A nebo Protein G. Pro vymytí fúzního proteinu z afinitní matrice lze použít pufry pro nízké nebo vysoké pH. Mírné eluční podmínky napomáhají předcházení nevratné denaturace fúzního proteinu. Rovněž mohou být použity pufry obsahující imidazol. Příklad 3 popisuje některé úspěšné protokoly, při kterých se čistí fúzní proteiny podle vynálezu.
Charakterizace heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu:
Pro charakterizaci fúzovaných proteinů podle vynálezu existuje řada způsobů. Mezi tyto způsoby patří: SDS-PAGE spojená s metodami barvení proteinu nebo imunobloting s použitím anti-IgG nebo anti-HSA protilátky. Jiné způsoby zahrnují matricí asistovaná laserová desorpce/ionizační hmotnostní spektrometrie (MALDI-MS), kapalinová chromatografie/hmotnostní spektrometrie, isoelektrické zesilování, analytická výměna aniontů, chromatofokusing a pokud se mají vyjmenovat alespoň způsobů. Reprezentativní množství heterologních fúzovaných proteinů bylo charakterizováno s použitím metody SDS-PAGE spojené s imunoblotingem, stejně jako hmotnostní spektrometrií (viz příklady 4 a 5 a obr. 3 a 4) .
cirkulární dichroismum, několik málo hlavních
9 9 9 9 9 9 9 9 · 9 9 9 9 9 9 9
99 9 9999
999 9 9 99 99999
999 999
999 999999 99 9
Například tab. 3 (viz příklad 5) ilustruje výpočet molekulární hmotnosti reprezentativního počtu fúzovaných proteinů a stejně tak hmotnost stanovenou hmotnostní spektrometrií. Kromě toho obr. 3 a 4 ilustrují molekulární hmotnosti reprezentativního počtu fúzovaných proteinů, jak byly stanoveny testem SDS PAGE. Všechny zkoušené heterologní fúzní proteiny byly okamžitě exprimovány a vylučovány. Aby byly získány proteiny s přesným N-zakončením, byla štěpena signální sekvence Igx
Dále tabulka 3 ilustruje, že v některých případech je hmotnost stanovená hmotnostní spektrometrií větší, než očekávaná. To je důsledkem glykosylace Fc části a prodloužení C-zakončení. Enzymatická digesce fúzovaných proteinů následovaná HPLC s reverzní fází a hmotnostní spektrometrií může identifikovat peptidové frakce, které obsahují sacharidové skupiny. Tyto frakce pak mohou být sekvencovány na N-koncové aminokyselinový, aby se identifikovalo potenciální glykosylační místo. Například, charakterizace Exendinu-4-Fc (SEQ ID NO: 29) ukazuje, že serin v pozici 39 a threonin v pozici 50 má glykosylovanou 0vazbu a asparagin v pozici 122 má glykosylovanou N-vazbu.
Reprezentativní počet GLP-1 fúzovaných proteinů byl také zkoušen an aktivitu. Pro detekci GLP-1 aktivity in vitro a in vivo existuje řada metod (viz příklady 6, 7, 8 a 9). Tabulka 4 (příklad 6) ilustruje aktivitu GLP-1 receptoru spojený s několika GLP-1 fúzemi. Čísla jsou vyjádřena relativně vůči aktivitě, spojené s Val8-GLP-1(7-37)OH. Všechny testované fúzní proteiny měly aktivitu GLP-1 receptoru. Nízká hodnota aktivity in vitro není nutně indikací pro slabý efekt in vivo. Vzhledem k výraznému zvýšení poločasu života u těchto fúzovaných proteinů, neznamená malá aktivita in vitro obecně předpověď malé účinnosti in vivo. Obrázek 7 a příklad 7 • ·· ·· ·· ·· · ·· · · · · ♦ · · · · • · · « · · · · · · • · · * · · · · · · · · · • · 9 9 9 9 9 9 9
999 99 99 9999 99 9 ilustrují prodloužený poločas života, spojený s fúzovanými proteiny podle vynálezu. Například, Val8-GLP-1-Fc má poločas života u opic přibližně 45 hodin, Val8-GLP-1-HSA má poločas života u opic přibližně 87 hodin, Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgGl má poločas života po IV podávání u psů přibližně 55 hodin a Gly8-Glu22-GLP-l-CEx~ Linker-IgGl má poločas života po SC podávání u psů přibližně 38 hodin.
Složení vynálezu:
Podstatným znakem léčivých proteinových formulací je také fyzikální stabilita. GLP-1 sloučeniny je těžké vyrobit a formulovat v důsledku strukturálních změn, které se objevují v průběhu výroby. Například některé GLP-1 sloučeniny mají obecně sklon ke shlukování. Navíc bylo ukázáno, že některé GLP-1 sloučeniny konvertují z rozpustné a účinné a-helíxové formy na nerozpustnou potenciálně neúčinnou β-vrstvovou. Fúze GLP-1 sloučenin na velké proteiny jako je Fc region IgG nebo albuminu nepřispívá jen z prodloužení poločasu života GLP-1 sloučeniny, ale také přispívá k fyzikální a konformační stabilitě GLP-1 sloučeniny. Například, Val8-GLP-1-Linker-HSA v PBS je stabilní při 37°C po dobu přibližně 30 dnů.
Heterologní fúzní proteiny podle vynálezu mohou být formulovány s jedním nebo více přísadami. Účinné fúzní proteiny podle vynálezu mohou být kombinovány s farmaceuticky přijatelným pufrem a pH upraveným na takovou hodnotu, která zajistí přijatelnou stabilitu a pH přijatelné pro podávání, jako je parenterální podávání.
Případně může být přidán jeden nebo více farmaceutickypřijatelný antimikrobiální prostředek. Výhodnými farmaceuticky-přijatelnými mikrobiálními prostředky jsou meta66 • · · · · · · • · · · · · • · · · · · • · · · ···· • · · · · ·· · · · · t · 9 kresol a fenol. Pro upravení iontové síly a tonicity může být přidána jedna nebo více farmaceuticky-přijatelných solí. Pro další úpravu isotonicity formulace může být přidána jedna nebo více přísad. Příkladem přísady, která upravuje isotonicitu je glycerin Farmaceuticky přijatelné znamená, že tento prostředek je vhodný pro podávání lidem nebo jiným živočichům a tak neobsahuje toxické prvky nebo nežádoucí kontaminanty a neruší v nich účinnost aktivních sloučenin.
V tomto vynálezu se dá použít farmaceuticky-přijatelná solná forma heterologních fúzovaných proteinů podle vynálezu. Běžně používanými kyselinami pro výrobu adičních solí s kyselinami jsou anorganické kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina jodovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná a podobně, a organické kyseliny, jako je p-toluensulfonová kyselina, methansulfonová kyselina, kyselina šťavelová, p-bromfenyl-sulfonová kyselina, kyselina uhličitá, kyselina jantarová, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina octová a podobně. Výhodné adiční soli s kyselinami jsou ty, kterou tvoří minerální kyseliny jako je kyselina chlorovodíková a bromovodíková.
Mezi adiční soli s bázemi patří ty, které jsou odvozeny od anorganických zásad, jako je hydroxidy, uhličitany, hydrogenuhličitany amonné, alkalické nebo kovů alkalických zemin a podobně. Zásady používané pro výrobu solí podle vynálezu zahrnují hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid amonný, uhličitan draselný a podobně .
Podávání kompozic:
Podávání může uskutečněno jakoukoliv cestou, o níž je lékařům známo, že je účinná. Metody podávání mohou být vnější a vnitřní. Parenterálním podáváním se obecně v lékařské • ·φ φφ φφ φφ φ ·♦ ♦ · φφφφ φφφ φ·· φφ φ φφφφ • φ φφφ φ φ φφ φφφφφ φφφ φφφ φφφ • ΦΦΦΦ φφφφφφ φφ φ literatuře rozumí injekce dávky do těla sterilní stříkačkou nebo jiným mechanickým zařízením, jako je infusní pumpa. Periferní parenterální cesty zahrnují intravenózní, intramuskulární, subkutánní a intraperitoneální cesty podávání.
Heterologní fúzní proteiny podle vynálezu mohou být rovněž podávány orálně, rektálně, nasálně, nižšími dýchacími cestami, což jsou neparenterální cesty. Mezi těmito neparenterálními cestami jsou výhodná cesta přes nižší dýchací cesty a orálně.
Fúzní proteiny podle vynálezu mohou být použity pro léčení řady nemocí a stavů. Fúzní proteiny podle vynálezu primárně projevují svůj biologický účinek působením na receptor, o kterém se zde mluví jako o GLP-1 receptorů. Subjekty s nemocemi a/nebo stavy pak odpovídají na stimulaci GLP-1 receptorů nebo na podávání GLP-1 sloučeniny příznivě a mohou tak být léčeny pomocí GLP-1 fúzovaných proteinů podle vynálezu.
těchto subjektech se hovoří jako o těch, které potřebují léčení GLP-1 sloučeninami nebo potřebují stimulaci GLP-1 receptorů. Mezi tyto subjekty patří subjekty s diabetem, který nevyžaduje léčení insulinem, diabetes, který vyžaduje léčení insulinem (viz WO 00/16797), infarkt myokardu (viz WO 98/08531), obezita (viz WO 8/19698), katabolické změny po chirurgickém zásahu (vize US. Patent č. 6 006 753), funkční dyspepsie a syndrom dráždivého tračníku (viz WO 99/64060). Mezi subjekty rovněž patří ty, které potřebují profylaktické léčení GLP-1 sloučeninami, např. subjekty, u nichž je nebezpečí, že se u nich vyvine diabetes nezávislý na insulinu (viz WO 00/07617). Mezi subjekty, u kterých je riziko rozvinutí diabetů nezávislého na insulinu patří subjekty s • · · ·· · · ··· ···· ♦ · ♦ · ··· • ·· ·· < · · · · • · · · · · 1 ·· ···· • · · · · · ··· ··· ·· ·· 1119 11 1 porušenou tolerancí glukózy nebo s poruchou subjekty, jejichž tělesná hmotnost je o přibližně normální tělesnou hmotností, odpovídající výšce glykémie, % nad a tělesné stavbě subjektu, dále subjekty částečnou pankreatektomií, subjekty, u nichž jeden nebo nezávislý na insulinu, subjekty oba rodiče měli diabetes s těhotenským diabetem a subjekty s akutní nebo chronickou pankreatitidou.
Účinné množství GLP-1 sloučeniny je množství, které má za následek požadovaný léčebný a/nebo profylaktický účinek, aniž by způsobil nežádoucí vedlejší účinky při podávání subjektu, který potřebuje stimulaci GLP-1 receptoru. Požadovaný terapeutický účinek představuje jeden nebo více následujících dějů 1) zlepšení příznaků spojených s nemocí nebo stavem, 2) odložení náběhu příznaků spojených s nemocí nebo stavem; 3) prodloužení délky života porovnaná se stavem, kdy se neléčí; a 4) vyšší kvalita života porovnaná se stavem, kdy se neléčí. Například účinné množství GLP-1 sloučeniny pro léčení diabetů je množství, které může mít za následek lepší řízení koncentrace krevní glukózy, než když se neléčí, v důsledku čehož dojde k opožděnému nástupu komplikací diabetů, jako je retinopatie, neuropatie nebo nemoci ledvin. Účinné množství GLP-1 sloučenina pro prevenci diabetů je množství, které zpomalí v porovnání se situací, kdy se neléčí, nástup vyšších hladin krevní glukózy, které vyžadují léčení pomocí anti-hypoglykemických léčiv, jako jsou sulfonylmočoviny, thíazolidindiony, insulin a/nebo bisguanidiny.
Dávka fúzního proteinu, která je dostatečná pro normalizaci hladiny glukózy, závisí na mnoha faktorech, mezi něž patří, aniž by na ně byly omezeny, pohlaví subjektu, váhu a věk, závažnost neschopnosti regulovat krevní glukózu, způsob podávání a biologická dostupnost, farmakokinetický profil fúzního proteinu, účinnost a formulace.
9 9 9 9 9 9 99 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 9 9 9 9 9 9 9
999999 9999 999
9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9
Tento vynález zahrnuje GLP-1 sloučeniny, které mají zlepšené biochemické a biofyzikální vlastnosti díky tomu, že jsou fúzovány na albuminový protein, albuminový fragment, albuminový analog, Fc protein, Fc fragment, nebo Fc analog. Tyto heterologní proteiny mohou být úspěšně exprimovány v hostitelské buňce, přičemž zachovávají signální aktivitu spojenou s aktivací GLP-1 receptoru a mají prodloužený poločas života.
Následující příklady jsou uváděny za tím účelem, aby byl popsán tento vynález. Rozsah tohoto vynálezu se neomezuje na tyto příklady. Odborník v oboru rozpoznat, že konkrétní popsané reakční činidla, zařízení a postupy jsou pouze ilustrativní a nejsou míněny tak, že by měly omezovat v nějakém směru rozsah vynálezu jakýmkoliv způsobem.
Přiklad 1: Konstrukce_DNA kódující heterologní fúzní proteiny
Příklad la Konstrukce DNA kódující Val -GLP-1(7-37)Fc:
Podíl Fc lidského IgGl byl izolován z knihovny cDNA a obsahoval plný pantový region a CH2 a CH3 domény. Fragment obsahující 696 párových bází tohoto Fc podílu lidského IgGl byl subklonován do míst Nhel a Eco47III savčího expresního vektoru pJB02, aby se vytvořil pJB02/Fc (viz Obr. 5) . DNA kódující IgK sekreční signální sekvenci fúzovanou na Val8-GLP1(7-37) byla vytvořena in vitro hybridizaci čtyř přesahujících a komplementárních oligonukleotidů:
5'-CTAGCCACCAT~GAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTT CCAGGTTCCACTGGTGACCAGTG - 3’ [SEQ ID NO:12] • ·· 99 ·· 99 9
9 9 · · · 9 9 · ··
99 9 9 9 9999
999 9 9 99 9999
999 999 999 • 99 99 99 · 9 99 99 9
5’ - GAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTGGAGGGCCAGGCCGCCAAGGA GTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGAAGAGGC - 3' [SEQ ID NO:13] ' - TGAAGGTGCCCTCCACGTGGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTA CCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCATGGTGG - 3’ [SEQ ID NO:14]
5'- GCCTCTTCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAACTCCTTGGCGGCCTGGCCCTCCAGA TAGGAGGACACGTCGGAGG - 3' [SEQ ID NO:15]
Hybridizačni reakce byla ekvivalentních množství každého konečné koncentrace každého oligonukleotidů byla prováděna s použitím oligonukleotidu (1 pm/μΐ oligonukleotidu). Směs 5 min při 100°C v zahřívána prodlužovacím pufru (50 mmolol Tris-HCl, pH 7,5, 10 mmol MgCl2 10 mmol DTT, 1 mmol ATP, 25 pg/ml albumin hovězího séra) a potom chlazen po dobu nejméně 2 hodin na 30 °C.
Výsledný hybridizační produkt byl ligován po dobu 2 hodin při pokojové teplotě nebo přes noc při 16°C to the pJB02/Fc hlavní řetězec vektoru, který byl digestován pomocí Nhel a Eco47III. Produkty ligace byly pak použity, aby se transformovaly příslušné XL-1 modré buňky (Stratagen). U rekombinantních plasmidů byl digestováním klonů pomocí Ncol (kódující sekvence Kozák a první Met signálního peptidu) a sekvencováním prováděn screening na přítomnost peptidu kódujícího inserty. Výsledný expresní plasmid, použitý pro transfekční testy byl označen pJB02-V8-GLP-l-Fc (Obr. 5).
Příklad lb Konstrukce
DNA kódující Val8-GLP-1 (7-37 ) HSA:
Plasmid HSA/pcDNA3.1GS byl získán od Invítrogen (Catalog # H-M12523M-pcDNA3.1/GS) a použit jako šablona pro izolaci cDNA kódující albumin lidského séra (HSA). HSA cDNA byl připraven s použitím PCR, kde byly z konce 5'odstraněny DNA ·· · · kódující hlavní sekvenci, stejně jako pro-peptid se šesti aminokyselinami. Navíc byly přidány stop kodony přímo na konec 3' HSA kódovací sekvence. Nakonec byla na koncích 5' a 3' vytvořena místa restrikčních enzymů, aby se docílilo klonování. DNA sekvence HSA přítomná v původním vektor, získaném od firmy Invitrogen, obsahovala samostatnou bázi změněnou v regionu 3’ genu (pozice 667), ve srovnání s nativní lidskou sekvencí. Tato změna má za následek vznik kodonu pro Asn namísto Asp. Tedy, použitím kmene přesahujícího PCR shora diskutované mutagenní metody, kodon byl zaměněn tak, aby kódoval Asp na této pozici. Výsledný HSA kódující DNA byl klonován na Nhel a HindlII místa pJB02, aby vznikl pJB02-HSA (Obr. 6).
Hlavní sekvence Igx fúzovaná na Val8-GLP-1(7-37) sekvenci byla vytvořena jak bylo uvedeno v Příkladu la. Tato DNA byla ligována na Nhel a Fspl místa pJB02-HSA, aby vznikl pJB02Val8-GLP-1-HSA.
Příklad lc Konstrukce DNA kódující Val8-GLP-1(7-37) linker-HSA:
Vektor pJB02-HSA byl připraven jak bylo uvedeno v Příkladu lb. DNA kódující linkerovou sekvenci [GGGGS]3 byla ligována v rámci na 5' konec HSA kódující DNA, aby vznikl pJB02-linker-HSA (Obr. 7). DNA kódující hlavní sekvenci Ig>c a fúzovaná na sekvenci Val8-GLP-1 (7-37) a 5' část linkerové sekvence byla vytvořena, jak bylo uvedeno v Příkladu la. Tato DNA byla ligována na Nhel a BspEI místa pJB02, aby vznikl pJB02- Val8-GLP-l-linker-HSA.
Příklad ld Konstrukce DNA kódující Exendin-4-Fc:
Plasmid pJB02/Fc byl připraven, jak je popsáno v ··
I • ·
99 99 9
9 9 9 9 9 • · · · · · • · ·· 99999
9 9 9 9
9999 99 9
Příkladu la. DNA kódující Igx signální sekvenci, fúzovanou na Exending-4, byla vytvořena in vitro hybridizaci následujících přesahujících a komplementárních oligonukleotidů:
5' - CTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTG GGTTCCAGGTTCCACCGGTCAC - 3' [SEQ ID NO:16]
5' - GGAGAGGGAACCTTCACCAGCGACCTGAGCAAGCAGATGGAGGAGGAGGCCGT GAGACTG - 3’ [SEQ ID NO:17]
5’ - TTCATCGAGTGGCTGAAGAACGGAGGACCAAGCAGCGGAGCCCCTCCTCCT AGC - 3' [SEQ ID NO:18]
5' - GAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCA TGGTGG - 3' [SEQ ID NO:19]
5' - CTCCTCCTCCATCTGCTTGCTCAGGTCGCTGGTGAAGGTTCCCTCTCCGTGA
CCGGTG - 3' [SEQ ID NO:20]
5' - GCTAGGAGGAGGGGCTCCGCTGCTTGGTCCTCCGTTCTTCAGCCACTCGAT
GAACAGTCTCACGGC - 3' [SEQ ID NO:21]
Hybridizační reakce byla prováděna, jak je popsáno v Příkladu la. Hybridizovaný produkt byl ligován na pJB02 vektor, který byl digestován pomocí Nhel a Eco47lII, jak je popsáno v Příkladu la, aby vznikl pJB02-Exendin-4-Fc.
Příklad le Konstrukce DNA kódující Exendin-4-HSA:
Plasmid pJB02-HSA byl připraven, jak je popsáno v Příkladu lb. DNA kódující Igx signální sekvenci, fúzovanou na Exending-4, byla vytvořena in vitro hybridizaci stejných přesahujících a komplementárních oligonukleotidů,jako jsou popsány v Příkladu ld. Hybridizační reakce byly rovněž ··
0 0 0 0 0
0· · «
0 0 0
0 0 0 9 • 0 00000
0 0 0 00 0
0 «0 0900 prováděny, jak je popsáno shora. DNA byla klonována na unikátní Nhel a Fspl místa v pJB02-HSA, aby vznikl pJB02Exendin-4HSA.
Příklad lf Konstrukce DNA kódující Exendin-4-linker-HSA:
Plasmid pJB02-linker-HSA byl konstruován, jak je popsáno v Příkladu lc. DNA kódující Igx signální sekvenci, fúzovanou na Exendin-4 a 5’ část linkerové sekvence, byla vytvořena jako v Příkladu ld. Tato DNA byla klonována na unikátní Nhel a BspĚI místa v pJB02-linker-HSA, aby vznikl pJB02-Exendin-4linker-HSA.
Příklad lg Konstrukce DNA kódující ValB-GLP-l/C-Ex-Fc:
Plasmid pJB02-Exendin-4-Fc byl připraven, jak je popsáno v Příkladu ld. Exendin-4 kódující DNA byl odstraněn z vektoru pomocí Agel a Eco471II. Val8-GLP-1/C-Ex kódující DNA byla vytvořena in vitro hybridizaci následujících přesahujících a komplementárních oligonukleotidů:
5' -CCGGTCACGTGGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTGGA
GGGCCAGGCCGCCA - 3' [SEQ TD NO:22]
5' - AGGAATTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGCAGCAGCGG
AGCCCCTCCTCCTAGC - 3’ [SEQ ID NO:23]
5' - CTCCAGATAGGAGGACACGTCGGAGGTGAAGGTGCCCTCCAC
GTGA - 3’ [SEQ ID NO:24]
5' - GCTAGGAGGAGGGGCTCCGCTGCTGCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGA
TGAATTCCTTGGCGGCCTGGCC - 3’ [SEQ ID NO:25] • · ·· ♦ · · · · • · · · · ·
Hybridizační reakce byla prováděna, jak je popsáno v Příkladu la. Hybridizovaný produkt byl ligován na místě Exendinu-4 v pJB02-Exendin-4-Fc expresním vektoru, aby vznikl pJB02-Val8-GLP-l/C~Ex-Fc.
Příklad lh Konstrukce DNA kódující Val8-Glu22-GLP-1-Fc:
Plasmid pJB02-Exendin-4-Fc byl připraven, jak je popsáno v Příkladu ld. Exendin-4 kódující DNA byla odstraněna z vektoru pomocí Agel a Eco47III. Val8-Glu22-GLP-1 kódující DNA byla vytvořena in vitro hybridizaci následujících přesahujících a komplementárních oligonukleotidů:
5' -CCGGTCACGTGGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTCGA
GGAGCAGGCCGCCA - 3' [SEQ ID NO:26]
5' - AGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGC - 3' [SEQ ID NO:27]
5' - GCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAACTCCTTGGCGGCC
TGCTC - 3' [SEQ ID NO:28]
5' - CTCGAGATAGGAGGACACGTCGGAGGTGAAGGTGCCCT
CCACGTGA - 3' [SEQ ID NO:29]
Hybridizační reakce byla prováděna, jak je popsáno v Příkladu la. Hybridizovaný produkt byl ligován v místě Exendin-4 v pJB02-Exendin-4-Fc expresního vektoru, aby vznikl p JB02-Val8-Glu22-GLP-l-Fc.
Příklad li Konstrukce DNA kódující Val8-Glu22-GLP-l/CEx-Fc:
Plasmid pJB02-Exendin-4-Fc byl připraven, jak je popsáno v Příkladu ld. Exendin-4 kódující DNA byla • 4 • 4 · · * · · · • 44 · · · ·«···· · •· 4444 vyseknuta z vektor pomocí Agel a Eco47lII Ex kódující DNA byla vytvořena in následujících přesahujících a oligonukleotidů:
Val8-Glu22-GLP-1/Cvitro hybridizaci komplementárních
5' - CCGGTCACGTGGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTCGA GGAGCAGGCCGCCA - 3’ [SEQ ID NO:30]
5' - AGGAATTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGCAGCAGCGGA GCCCCTCCTCCTAGC - 3’ [SEQ ID NO:31]
5' - CTCGAGATAGGAGGACACGTCGGAGGTGAAGGTGCCC TCCACGTGA - 3' [SEQ ID NO:32]
5' - GCTAGGAGGAGGGGCTCCGCTGCTGCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGA
TGAATTCCTTGGCGGCCTGCTC - 3’ [SEQ ID NO:33]
Hybridizační reakce byla prováděna, jak je popsáno v Příkladu la. Hybridizovaný produkt byl ligován v místě Exendinu-4 v pJB02-Exendin-4-Fc expresním vektoru, aby vznikl pJB02-Val8-Glu22-GLP-l/C-Ex-Fc.
Příklad lj: Konstrukce DNA kódující Gly8-GAP-1-Fc:
Plasmid pJB02-Exendin-4-Fc byl připraven, jak je popsáno v Příkladu ld. Exendin-4 kódující DNA byla odstraněna z vektoru pomocí Agel a Eco47III. Gly8-GLP-1 kódující DNA byla vytvořena in vitro hybridizaci následujících a přesahujících a komplementárních oligonukleotidů:
5’ - CCGGTCACGGCGAGGGCACCTTCACTAGTGACGTGTCCTCCTATCTGGA GGGCCAGGCCGCCA - 3' [SEQ ID NO:34]
5’ - AGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGC - 3' [SEQ ID NO:35] • β • · · « · · · • · · · « • · · · ····
5' - CTCCAGATAGGAGGACACGTCACTAGTGAAGGTGCCCTC
GCCGTGA - 3' [SEQ ID NO:36]
5' - GCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAACTCCTTGGCGGC
CTGGCC - 3' [SEQ ID NO:37]
Hybridizačni reakce byla prováděna, jak bylo popsáno v Příkladu la. Hybridizovaný produkt byl ligován v místě Exendinu-4 v pJB02-Exendin-4-Fc expresním vektoru, aby vznikl pJB02-Gly8-GLP-l-Fc.
Příklad 2: Exprimace heterologních fúzovaných proteinů
Exprimace fúzovaných proteinů kódovaných DNA, konstruovanými v Příkladu 1, byla provedena přechodnými transfektními buňkami HEK 293EBNA (jak přisedlé, tak v suspenzi). Buňky byly počítány a očkovány 24 hodiny před transfekcí. Transfekční koktejl byl přípraven mícháním transfekčního činidla FuGeneTM6 (Roche Molecular
Biochemicals, katalog # 1814443) s OptiMEM (Gibco/BRL) a inkubován při pokojové teplotě 5 min, což je teplota, při které byla přidána DNA a koktejl byl inkubován dalších 15 min. Bezprostředně před transfekcí bylo na desku naneseno čerstvé kultivační médium. Další detaily transfekce jsou uvedeny v tabulce 1 a 2.
• 0
Tabulka 1: Činidla použitá při transientni transfekci buněk 293EBNA
Tkáňová Počet DNA FuGene OptiMEM Obj em
kultivační očkovaných (yg) (pl) media kult.
nádoba buněk (ml) media
(ml)
35 mm 5 X 105 1,5 9 0,102 2
100 mm 2 X 106 12 73 0, 820 10
700 cm2 2 X 107 65 400 4,0 100
(RB)
Tabulka 2: Složeni media Růstové a transfekční medium
DMEM F12 3:1 % FBS mmol HEPES mmol L-glutamin 50 pg/ml genetícin (G418 NEO ) pg/ml tobromycin
Kultivační medium
Hybritech báze mmol Ca2+ mmol HEPES pg/ml Nuselin (lidský insulin) lpg/ml lidský transferrin pg/ml tobromycin
Pro transfekce malého rozsahu (35 mm-10 mm nádoby), byly buňky propláchnuty PBS a převedeny do kultivačního média 24 hodiny po transfekci a medium bylo shromážděno a vyměňováno za čerstvé každých 24 hodiny po několik dnů. V případě transfekci velkého rozsahu (700 cm2 válcová baňka), byly válcové baňky vypláchnuty PBS 48 hodiny po transfekci a buňky byly převedeny do kultivačního media. Medium bylo shromažďováno a vyměňováno za čerstvé každých 24 hodin po nejméně 10 po sobě následujících dnů. Obvykle bylo pro následné čištění proteinu použito 10 sklizní.
·# · »· ····
Příklad 3: Čištění heterologních fúzovaných proteinů
Příklad 3a Čištění Val-GLP-l-Fc
Přibližně 4,5 litrů kondiciovaného media (hladina exprese fúzovaných proteinů přibližně 20 pg/ml) z transfekce velkého rozsahu bylo filtrováno s použitím filtračního systému CUNO a koncentrováno na 250 ml s použitím filtračního systému ProFlux s tangenciálním tokem s 10 K filtrační membránou. Val8-GLP-1-Fc byly zachyceny na koloně 5 ml HiTrap protein A v lx PBS, pH 7,4 při průtoku 2 ml/min a eluovány 50 mmol kyseliny citrónové pH 3,3. Frakce (1 ml) byly shromážděny ve zkumavkách obsahujících 4 ml lx PBS a 100 μΐ 1 M Tris pH 8.
Frakce obsahující fúzovaný protein, jak byl stanoven pomocí SDS-PAGE a HPLC s reverzní fází na Zorbax C8, byly dány dohromady a naneseny na kolonu Superdex 75 60/60 v lx PBS pH 7,4 s průtokem 10 ml/min. Pozitivní frakce (20 ml/zkumavku) byly shromážděny. Spojené frakce byly potom podrobeny chromatografií s C4 reverzní fází v 0,1 % TFA ve vodě při průtoku 3 ml/min. Val8-GLP-1-Fc byl eluován s gradientem od 5 % B (0,1 % TFA v acetonitrilu) do 100 % B v průběhu 70 min. Eluované frakce (3 ml/zkumavka) byly shromážděny. Acetonitril byl odstraněn vakuovým sušením a byl přidán 1 mi H2O. Vyčištěný vzorek (přibližně 32 ml) byl dvakrát dialyzován se 4 litry lx PBS pH 7,4.
Dialyzovaný vzorek byl potom filtrován s použitím filtrační jednotky MILLEX-GV 0,22 pm a koncentrace byla stanovena s použitím absorpce při 280 nm.
Příklad 3b Čištění Val8-GLP-1-HSA nebo Val8-GLP-1-Linker-HSA
· • · ·
Přibližně 6,5 litrů kondiciovaného media (hladina exprese fúzovaných proteinů přibližně 10 pg/ml) bylo filtrováno s použitím filtračního systému CUNO a koncentrováno na 380 ml s použitím filtračního systému ProFlux s tangenciálním tokem s 10 K filtrační membránou.
Fúzní proteiny byly zachyceny s použitím 50 ml Q kolony s rychlým tokem (Pharmacia) v 20 mmol Tris pH 7,4 při průtoku 5ml/min. Protein byl eluován s použitím gradientu: od 0 % do 50 % 20 mmol Tris pH 7,4, 1M NaCl v 10 CV, potom na 100 % B v 2 CV.
Frakce obsahující fúzní protein byly spojeny a podrobeny C4 chromatografií s reverzní fází v 0,1 % TFA ve vodě při průtoku 5 ml/min. Fúzní protein byl eluován s použitím gradientu od 20 % B (0,1 % TFA v acetonitrilu) do 90 % B v průběhu 120 min. Frakce (3,5 ml/zkumavka) byly shromážděny. Acetonitril byl odstraněn vakuovým sušením.
Přibližně 9 ml shromážděného vzorku bylo zředěno lx PBS pH 7,4 na 40 ml a dialyzováno s 4 litry lx PBS pH 7,4 přes noc. Vzorek byl filtrován a koncentrace byla stanovena absorpcí při 280 nm.
Příklad 3c Čištění Exendinu-4-Fc:
Přibližně 4 litry kondiciovaného media Přibližně 6,5 litrů kondiciovaného media (hladina exprese fúzních proteinů přibližně 8 pg/ml) bylo filtrováno s použitím filtračního systému CUNO a koncentrováno na 250 ml s použitím filtračního systému ProFlux s tangenciálním tokem s 30 K filtrační membránou.
• ·
Exendin-4-Fc byl zachycen 5 ml HiTrap protein A kolonou v lx PBS, pH 7,4 při průtoku 2 ml/min a eluován 50 mmol kyseliny citrónové pH 3,3. Frakce obsahující fúzní protein byly shromážděny, filtrovány a dialyzovány s 4 litry 1 x PBS přes noc. Dialyzovaný vzorek byl potom nanesen na kolonu Superdex 75 60/60 v lx PBS pH 7,4, 0,5M NaCl při průtoku 10 ml/min. Frakce (20 ml/zkumavka) obsahující fúzní protein byly shromážděny koncentrovány na přibližně 1 mg/ml. Koncentrované vzorky byly potom filtrován s použitím filtrační jednotky MILLEX-GV 0.22 um.
·· ·
Příklad 3d Čištění Exendin-4-HSA a Exendin-41inker-HSA:
Přibližně 1,1 litru kondiciovaného media (hladina exprese fúzních proteinů přibližně 6 pg/ml) byl filtrován s použitím CUNO filtračního systému a koncentrováno na 175 ml s použitím filtračního systému ProFlux s tangenciálním tokem s 30 K filtrační membránou.
Fúzní protein byl zachycen s použitím 5 ml kolony HiTrap Q sepharose (Pharmacia) v 20 mmol Tris pH 7,4 při průtoku 2 ml/min. Protein byl eluován s použitím gradientu od 0 % do 50 % 20 mmol Tris pH 7,4, 1M NaCl v 12 CV a potom na 100 % B v 4 CV.
Frakce obsahující fúzní protein byly shromážděny a podrobeny C4 chromatografií s reverzní fází v 0,1 % TFA ve vodě při průtoku 5 ml/min. Fúzní protein byl eluován s použitím gradientu od 10 % B (0,1% TFA v acetonitrilu) do 100 % B v průběhu 70 min. Frakce (10 ml/zkumavka) obsahující fúzní protein byly shromážděny. Acetonitril byl odstraněn s použitím vakuové sušičky.
Přibližně 8 ml shromážděných vzorků bylo dialyzováno s 4 litrů lx PBS pH 7,4 přes noc. Vzorek byl filtrován a koncentrace byla stanovena absorpcí při 280nm. Dialyzovaný vzorek byl potom nanesen na kolonu Superdex 200 26/60 v lx PBS pH 7,4, 0,5 M NaCl při průtoku 2 ml/min. Frakce (3 ml/zkumavka) obsahující fúzní protein byly shromážděny, koncentrovány a filtrovány.
Příklad 4: Charakterizace fúzních proteinů pomocí SDS PAGE:
Pro analýzu čištěného fúzního proteinu a kondiciovaného media z buněk transfektovaných různými • ·
·· ·· • · · • · · · • · · · · · · ·· · expresními vektory fúzních proteinů byly použity SDS-PAGE, následovaný imunoblotingem. SDS-PAGE byl proveden v systému Novex Powerease 500 s použitím Novex 16% Tris-glycinových předem vyrobených gelů (EC6498), provozního pufru (10 x, LC2675) a vzorkového pufru (L 2676) . Vzorky byly redukovány s 50 mmol DTT a zahřívány 3-5 min při 95°C před naplněním.
Po použití SDS-PAGE gelu, byla použita voda a transferový pufr (IX Tris-Glycin Seprabuff (Owl Scientific Cat. No. ER26-S) s 20 % methanolem) pro vymytí SDS z gelů. Byl použit transferové zařízení Novex s PVDF (BioRad, Cat. No. 162-0174) a nitrocelulózové membrány (BioRad, Cat. No. 1703965 nebo 1703932). Transfer byl proveden při pokojové teplotě po dobu 90 min při 30-35 V. Membrány byly uzavřeny v IX PBS s 0,1 % Tween-20 (Sigma, Cat. No. P7949) a 5 % mléce (BioRad, Cat. No. 170-6404) po dobu 1-12 hodiny při 4°C. Protilátky byly zředěn v IX PBS +5 % mléka a bloty byly inkubovány v těchto roztocích po dobu 1-2 h při 4°C. Mezi inkubacemi byly bloty promyty čtyřikrát po dobu 5 min, pokaždé s IX PBS a 0,2 % Tween-20 při pokojové teplotě. PBS byl vyroben z buď z GIBCO 10X PBS (Cat No. 70011), aby vznikla konečná kompozice 1 mmol jednosytného fosforečnanu draselného, 3 mmol monohydrogenfosforečnanu sodného, 153 mmol chloridu sodného, pH 7,4 nebo byl PBS získán od Sigma (Cat. No. 10003), což poskytlo 120 mmol NaCl, 2,7 mmol KC1 a 10 mmol fosforečnanu, pH 7,4 při 25°C.
Primární protilátky byly buď polyklonální kozí anti-IgGl nebo králičí anti-HSA. Sekundární protilátky byly buď anti-kozí IgG HRP nebo anti-králičí TgG HRP. Sekundární protilátka byla zředěna 1:5000. Pro vyvíjení blotů by použit ECL systém (Amersham Pharmacia Biotech, Cat. No. RN2108 a Cat. No. RPN1674H).
·· · • · · · W» • · · · · · ··· ·· ·· · · · · · ····· · · · · ···· ····· · · · • ·· ·· ···· ·· *
Fc protein s kondiciovaným a oJB02-Exendin-4-Fc
Obr. 3A porovnává čištěný mediem z pJB02-Val8-GLP-l-Fc transfektovaných buněk. Zvýšení mobility je konzistentní se zvyšující se velkostí v důsledku GLP-1 části fúzního proteinu. Obr. 3B podobně porovnává čištěný HSA s kondiciovaným mediem z buněk transfektovaných pJB02-Val8-GLP-2-HSA, pJB02-Val8-GLP1-Linker-HSA, pJB02-Exendin-4-HSA, nebo pJB02-Exendin-4Linker-HSA. Obr. 4 ukazuje čištěné fúzní proteinové přípravky.
Příklad 5: Charakterizace fúzních proteinů s použitím hmotnostní spektrometrie:
Všechny experimenty byly prováděny na Micromass TofSpec2E hmotnostním spektrometru, vybaveném elektronikou pro úpravou· časové prodlevy, Reflectronu (použitém při analýze 0-8000 Da peptidového rozpětí), lineárním detektoru (použitém během vysokohmotnostní a dobrý signál poskytující analýze) a Post Acceleration Detector (nebo P.A.D., použitý při vysokohmotnostní a mimořádně slabý signál poskytující ananlýze). Délka účinné cesty zařízení v lineárním modu je 1,2 metru, v modu Reflectron je 2,3 metru. Pro detekci lineárním a reflectronovém modu byly použity dva duální mikrokanálové deskové detektory. Byl použit dusíkový laser firmy Laser Science lne. VSL-3371 pracující 337 nm při 5 laserových záblescích za sekundu. Všechny data byla získána s použitím 2 GHz, 8 bit interního digitalizačního zařízení a více než 50 laserový záblesků bylo použito jako průměr na spektrum.
Zařízení pracovalo v lineárním modu pro analýzu GLP1 fúzních proteinů, o které se jedná. Lineární detektor je zařízení, které detekuje ionty, které cestují dolů s světelnou trubicí zařízení MALDI-ToF-MS. To měří četnost iontů v čase a posílá signál do zařízení pro převádění na číselné hodnoty.
·· ···· • · » c ·· t· · • « · • « · · • · ···· • · · ·· ·
Tento digitalizér konvertuje analogový signál na digitální, což umožňuje, aby byl signál z hmotnostního spektrometru převeden do počítače, kde je převeden do použitelného m/z spektra.
Jako ionizační matrice byl použit rekrystalizovaný nasycený roztok kyselina sinapové (zředěné v 50/50 Acn / H2O a 0,1 % TFA). Kyselina sinapová je vhodnou matrici pro proteiny větší než 10 kDa. Pro vnější a vnitřní kalibrační soubory, která mají sloužit pro přesná měření hmotnosti analyzovaných vzorků, byly použity referenční proteiny s vhodnou hmotností. Vzorky byly všechny analyzovány s použitím vzorku o zředění 1:2 vůči matrici. Zařízení bylo nejprve nastaveno na následující lineární detekční podmínky.
Zdroj napětí: 20,0 keV Vytažené napětí: 20,0 keV Zasílení napětí: 16,0 keV Lineární detektor: 3,7 keV P.A.D.: (off line)
Napěťové pulzy: 3,0 keV Laserová četnost: 50 Laserová jemnost: 50
Tato nastavení byla upravována (pokud to bylo nutné) tak, aby bylo dosaženo nej lepšího poměru signál/šum nej vyššího rozlišení. Tabulka 3 poskytuje vlastnosti odlišných GLP-1 fúzních proteinů.
Tabulka 3 Fúzní protein
Val8-GLP-l-IgGl
Val8-Glu22-GLP-l-IgGl
Gly8-GLP-l-IgGl
Očekávaná Hmotnost stanovená
hmotnost hmotnostní
spektrometrií
(kDa) (kDa)
59, 08 61,94
59, 23 63, 61
59, 00 62, 93
« · · • · •
• · · • • 9 ♦ • » ·
• · • · © · • • · · ·
• · · • • · • • •
• ·· · · • · • · · · • · •
Val8-GLP-l-CEx-IgGl
Val8-Glu22-GLP-l-CEx-IgGl
Exendin-4-IgGl Val8-GLP-1-Linker-HSA
Exendin-4-HSA
Exendin-4-Linker-HSA
60, 45 65,1-65,6
60,69 65, 86
60, 69 65, 86
70, 70 69, 89, 70,Ί
70, 56 70, 62
71, 56 71, 62
CEx znamená C-koncové prodloužení a představuje sekvenci Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser.
Linkerem je Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly— Gly-Gly-Ser.
Příklad 6: Aktivita heterologních fúzních proteinů:
Schopnost fúzních proteinů podle vynálezu aktivovat GLP-1 receptor byla posouzena s použitím in vitro testů, které jsou jako takové popsány v EP 619 322 Gelfand, et al. a v US patentu č. 5 120 712. Aktivita těchto sloučenin vůči aktivitě Val8-GLP-1(7-37)OH je uvedena v Tabulce 4. Obr. 8 představuje křivku odezvy na dávky in vitro na Val8-GLP-1 a Exendin-4 fúzni proteiny. Dále tabulka 5a a 5b ukazuje in vitro aktivitu velké skupiny GLP-1 analogů, které mohou být fúzovány na Fc nebo albuminový protein s cílem vyrobit biologicky aktivní fúzni proteiny. Tyto aktivity jsou porovnány s GLP-1(7-37)OH.
Tabulka 4: In vitro aktivita GLP-1 Fúzni protein
Val8-GLP-l-IgGl
Exendin-4-IgGl
Val8-GLP-1-Linker-HSA
Exendin-4-HSA
Exendin-4-Linker-HSA
Exendin-4 fúzních proteinů
In Vitro Aktivita (% Val8-GLP-1)
240
0,2
500 • ·· ·· · · · * · • · e · 1 · * ·· ···♦· • · · 0·· ·· · ····· ······ ·· β
Val8-Glu22-GLP-l-IgGl 3,7
Gly -GLP-1-IgGl 3,3
Val8-GLP-l-CEx-IgGl 3, 3
Val8-Glu22-GLP-l-CEx-IgGl 29
Gly8- Glu22-GLP-l-C2-IgGl 75
Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgGl 150
Exendin-4-C2-IgGl 250
Exendin-4-Linker-IgGl 330
Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-HSA 4
Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgG4 80
CEx znamená C-koncové prodloužení a představuje sekvenci Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser.
Linkerem je Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-GlyGlyGly-Gly-Ser.
C2 je Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-Ser-Gly-Ala.
Aminokyselinové sekvence fúzních proteinů, které jsou popsány v tabulkách 3 a 4 jsou uvedeny od SED ID NO: 13 po SEQ ID NO: 31.
Aminokyselinová sekvence Val8-GLP-l-lidského sérového albuminu je uvedena pod SEQ ID NO: 13.
1 HVEGTFTSDV KALVLIAFAQ SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GDAHKSEVAH RFKDLGEENF
61 YLQQCPFEDH LRETYGEMAD VKLVNEVTEF AKTCVADESA ENCDKSLHTL FGDKLCTVAT
121 CCAKQEPERN YEIARRHPYF ECFLQHKDDN PNLPRLVRPE VDVMCTAFHD NEETFLKKYL
181 YAPELLFFAK RYKAAFTECC QAADKAACLL PKLDELRDEG RASSAKQRLK
CASLQKFGER • ·· ♦· ·· ·· · • 4 4 9 4 4 9 9 4 4 9 * ·· · · · 4-444
4 9 · 4 4 4 <· 4 4 444 4
9 4 4 4 4 9 9 4
449 44 44 4444 44 4
241 AFKAWAVARL LAKYICENQD SQRFPKAEFA EVSKLVTDLT KVHTECCHGD LLECADDRAD
301 SISSKLKECC AEAKDVFLGM EKPLLEKSHC IAEVENDEMP ADLPSLAADF VESKDVCKNY
361 FLYEYARRHP LVEEPQNLIK DYSWLLLRL AKTYETTLEK CCAAADPHEC YAKVFDEFKP
421 QNCELFEQLG HPEAKRMPCA EYKFQNALLV RYTKKVPQVS TPTLVEVSRN LGKVGSKCCK
481 EDYLSWLNQ KEFNAETFTF LCVLHEKTPV SDRVTKCCTE SLVNRRPCFS ALEVDETYVP
541 HADICTLSEK ERQIKKQTAL VELVKHKPKA TKEQLKAVMD DFAAFVEKCC
KADDKETCFA
601 EEGKKLVAAS QAALGL [SEQ ID NO: 13]
Aminokyselinová sekvence Val8-GLP-l-Linker-lidského sérového
albuminu je uvedena pod SEQ ID NO: 14.
1 HVEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GGGGGSGGGG SGGGGSDAHK
SEVAHRFKDL 61 GEENFKALVL IAFAQYLQQC PFEDHVKLVN EVTEFAKTCV ADESAENCDK
SLHTLFGDKL 121 CTVATLRETY GEMADCCAKQ EPERNECFLQ HKDDNPNLPR LVRPEVDVMC
TAFHDNEETF 181 LKKYLYEIAR RHPYFYAPEL LFFAKRYKAA FTECCQAADK AACLLPKLDE
LRDEGKASSA 241 KQRLKCASLQ KFGERAFKAW AVARLSQRFP KAEFAEVSKL VTDLTKVHTE
CCHGDLLECA 301 DDRADLAKYI CENQDSISSK LKECCEKPLL EKSHCIAEVE NDEMPADLPS
LAADFVESKD 361 VCKNYAEAKD VFLGMFLYEY ARRHPDYSW LLLRLAKTYE TTLEKCCAAA
DPHECYAKVF 421 DEFKPLVEEP QNLIKQNCEL FEQLGEYKFQ NALLVRYTKK VPQVSTPTLV
EVSRNLGKVG • 4 4 4 4 44 ·· ·
4 4 4 · 44 9 · «4
44 44 4 4 4 4 4
4 444 4 4 4 · 4 4444
OO 444444 444 θθ 494 44 44 4444 44 ·
481 SKCCKHPEAK RMPCAEDYLS WLNQLCVLH EKTPVSDRVT KCCTESLVNR
RPCFSALEVD
541 ETYVPKEFNA ETFTFHADIC TLSEKERQIK KQTALVELVK HKPKATKEQL
KAVMDDFAAF
601 VEKCCKADDK ETCFAEEGKK LVAASQAALG L [SEQ ID NO: 14]
Aminokyselinová sekvence Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-lidskéhQ sérového albuminu je uvedena pod SEQ ID NO: 15.
HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGGSGGGGS GGGGSDAHKS
EVAHRFKDLG EENFKALVLI AFAQYLQQCP FEDHVKLVNE VTEFAKTCVA
DESAENCDKS
121 LHTLFGDKLC TVATLRETYG EMADCCAKQE PERNECFLQH KDDNPNLPRL
VRPEVDVMCT
181 AFHDNEETFL KKYLYEIARR HPYFYAPELL FFAKRYKAAF TECCQAADKA
ACLLPKLDEL
241 RDEGKASSAK QRLKCASLQK FGERAFKAWA VARLSQRFPK AEFAEVSKLV TDLTKVHTEC
301 CHGDLLECAD DRADLAKYIC ENQDSISSKL KECCEKPLLE KSHCIAEVEN DEMPADLPSL
361 AADFVESKDV CKNYAEAKDV FLGMFLYEYA RRHPDYSWL LLRLAKTYET
TLEKCCAAAD
421 PHECYAKVFD EFKPLVEEPQ NLIKQNCELF EQLGEYKFQN ALLVRYTKKV PQVSTPTLVE
481 VSRNLGKVGS KCCKHPEAKR MPCAEDYLSV VLNQLCVLHE KTPVSDRVTK CCTESLVNRR
541 PCFSALEVDE TYVPKEFNAE TFTFHADICT LSEKERQIKK QTALVELVKH KPKATKEQLK
601 AVMDDFAAFV EKCCKADDKE TCFAEEGKKL VAASQAALGL [SEQ ID NO 15]:
Aminokyselinová sekvence Exendin-4-lidského sérového albuminu je uvedena pod SEQ ID NO: 16.
« ·
89 • «· · · • · · 1 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 99 99 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 99999 • · · 9 9 9 99 «9 9
1 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSD AHKSEVAHRF
KDLGEENFKA 61 LVLIAFAQYL QQCPFEDHVK LVNEVTEFAK TCVADESAEN CDKSLHTLFG
DKLCTVATLR 121 ETYGEMADCC AKQEPERNEC FLQHKDDNPN LPRLVRPEVD VMCTAFHDNE
ETFLKKYLYE 181 IARRHPYFYA PELLFFAKRY KAAFTECCQA ADKAACLLPK LDELRDEGKA
SSAKQRLKCA 241 SLQKFGERAF KAWAVARLSQ RFPKAEFAEV SKLVTDLTKV HTECCHGDLL
ECADDRADLA 301 KYICENQDSI SSKLKECCEK PLLEKSHCIA EVENDEMPAD LPSLAADFVE
SKDVCKNYAE 361 AKDVFLGMFL YEYARRHPDY SWLLLRLAK TYETTLEKCC AAADPHECYA
KVFDEFKPLV 421 EEPQNLIKQN CELFEQLGEY KFQNALLVRY TKKVPQVSTP TLVEVSRNLG
KVGSKCCKHP 481 EAKRMPCAED YLSWLNQLC VLHEKTPVSD RVTKCCTESL VNRRPCFSAL
EVDETWPKE 541 FNAETFTFHA DICTLSEKER QIKKQTALVE LVKHKPKATK EQLKAVMDDF
AAFVEKCCKA
601 DDKETCFAEE GKKLVAASQA ALGL [SEQ ID NO: 16]
Aminokyselinová sekvence Exendin-4-Linker-lidského sérového albuminu je uvedena pod SEQ ID NO: 17.
1 HGEGTFTSDL GGGGSDAHKS SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSG GGGGSGGGGS
61 EVAHRFKDLG DESAENCDKS EENFKALVLI AFAQYLQQCP FEDHVKLVNE VTEFAKTCVA
121 LHTLFGDKLC VRPEVDVMCT TVATLRETYG EMADCCAKQE PERNECFLQH KDDNPNLPRL
181 AFHDNEETFL KKYLYEIARR HPYFYAPELL FFAKRYKAAF TECCQAADKA
ACLLPKLDEL « 0 * 00
241 RDEGKASSAK QRLKCASLQK FGERAFKAWA VARLSQRFPK AEFAEVSKLV
TDLTKVHTEC 301 CHGDLLECAD DRADLAKYIC ENQDSISSKL KECCEKPLLE KSHCIAEVEN
DEMPADLPSL 361 AADFVESKDV CKNYAEAKDV FLGMFLYEYA RRHPDYSWL LLRLAKTYET
TLEKCCAAAD 421 PHECYAKVFD EFKPLVEEPQ NLIKQNCELF EQLGEYKFQN ALLVRYTKKV
PQVSTPTLVE 481 VSRNLGKVGS KCCKHPEAKR MPCAEDYLSV VLNQLCVLHE KTPVSDRVTK
CCTESLVNRR 541 PCFSALEVDE TYVPKEFNAE TFTFHADICT LSEKERQIKK QTALVELVKH
KPKATKEQLK
601 AVMDDFAAFV EKCCKADDKE TCFAEEGKKL VAASQAALGL [SEQ ID NO: 17]
Aminokyselinová sekvence Val8-GLP-l-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 18.
1 HVEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GAEPKSCDKT HTCPPCPAPE
LLGGPSVFLF 61 PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRW 121 SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
SREEMTKNQV 181 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
KSRWQQGNVF
241 SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK [SEQ ID NO: 18]
Aminokyselinová sekvence Val8-GLP-l-Cex-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 19.
HVEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSA EPKSCDKTHT
CPPCPAPELL
GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
• 99 • · 9 9 • 9 «
* 99 • • 9 9 9 9 9
«1 .9 9 • · 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 · · • 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 · 9999 9 9 9
121 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQWTLPPSR
181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO: 19]
Aminokyselinová sekvence Val8-Glu22-GLP-l-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO:20.
1 HVEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GAEPKSCDKT HTCPPCPAPE
LLGGPSVFLF 61 PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRW 121 SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQWTLPP
SREEMTKNQV 181 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
KSRWQQGNVF
241 SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK [SEQ ID NO: 20]
Aminokyselinová sekvence Val8-Glu22-GLP-l-CEx-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 21.
HVEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR CPPCPAPELL
GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD NAKTKPREEQ
121 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN PQWTLPPSR
181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG LYSKLTVDKS
241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
GSSGAPPPSA
VSHEDPEVKF
KALPAPIEKT
QPENNYKTTP [SEQ ID NO:
EPKSCDKTHT
NWYVDGVEVH
ISKAKGQPRE
PVLDSDGSFF
21] ,
Aminokyselinová sekvence Gly8-Glu22-GLP-l-C2-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 22.
• ·· 0 » 9 909«
909 « 9 00 00009
999 099 990
000 99 90 0900 00 «
HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGASSGAA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL
GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
121 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQWTLPPSR
181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF
LYSKLTVDKS
241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO: 22]
Aminokyselinová uvedena pod SEQ sekvence ID NO: 23. Gly8-Glu22-GLP ’-1-CEx-Linker-IgGl je
1 HGEGTFTSDV GGGSAEPKSC SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG
61 DKTHTCPPCP PEVKFNWYVD APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED
121 GVEVHNAKTK PIEKTISKAK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
181 GQPREPQWT YKTTPPVLDS LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN
241 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO: 23]
Aminokyselinová sekvence Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgG4 je uvedena pod SEQ ID NO: 24.
HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG
GGGSAESKYG
PPCPSCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE
121 VHNAKTKPRE EQFNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP
181 REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS
241 FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK [SEQ ID NO: 24]
Aminokyselinová sekvence Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-2Linker-IgGl je
uvedena pod SEQ ID NO: 25.
1 HGEGTFTSDV GGGSGGGGSG SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG
61 GGGSGGGGSA TPEVTCWVD EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR
121 VSHEDPEVKF GKEYKCKVSN NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN
181 KALPAPIEKT DIAVEWESNG ISKAKGQPRE PQWTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS
241 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH
YTQKSLSLSP 301 GK [SEQ ID NO: 25]
Aminokyselinová uvedena pod SEQ sekvence ID NO: 26. Gly8-Glu22-GLP-l-2Linker-IgGl je
1 HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GGGGGSGGGG SGGGGSGGGG
SGGGGSGGGG
61 SAEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW
VDVSHEDPEV
121 KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV
SNKALPAPIE
181 KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES
NGQPENNYKT • · ·· ····
241 TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPGK [SEQ ID NO: 26]
Aminokyselinová sekvence Gly8-Glu22-GLP-l-2CEx-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 27.
1 HGEGTFTSDV KSCDKTHTCP SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSS SGAPPPSAEP
61 PCPAPELLGG YVDGVEVHNA PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW
121 KTKPREEQYN KAKGQPREPQ STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS
181 WTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
LDSDGSFFLY
241 SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 27]
Aminokyselinová Gly8-Glu22-Val25-Ile33-GLP-l-CEx-Linker-IgGl sekvence je uvedena pod SEQ ID NO: 28.
1 HGEGTFTSDV GGGSAEPKSC SSYLEEQAVK EFIAWLIKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG
61 DKTHTCPPCP PEVKFNWYVD APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED
121 GVEVHNAKTK PIEKTISKAK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
181 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN
YKTTPPVLDS
241 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO: 28]
Aminokyselinová sekvence Exendin-4-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 29.
« • · · ·· ♦ · · • ·· · • · · · · • φ · · • · · · · ·· ·· · • · 9 · • · · · · • 9 9 99·99
9 9 9
9999 99 9
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG CPPCPAPELL
GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD
NAKTKPREEQ
121 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN PQWTLPPSR
181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG LYSKLTVDKS
241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
PSSGAPPPSA
VSHEDPEVKF
KALPAPIEKT
QPENNYKTTP [SEQ ID NO:
EPKSCDKTHT
NWYVDGVEVH
ISKAKGQPRE
PVLDSDGSFF
29]
Aminokyselinová sekvence Exendin-4-C2-IgGl je uvedena pod SEQ ID NO: 30.
1 HGEGTFTSDL CPPCPAPELL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGASSGAA EPKSCDKTHT
61 GGPSVFLFPP NAKTKPREEQ KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH
121 YNSTYRWSV PQVYTLPPSR LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
181 EEMTKNQVSL LYSKLTVDKS TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF
241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO: 30]
Aminokyselinová SEQ ID NO: 31. sekvence Exendin-4-Linker-IgGl je uvedena pod
1 HGEGTFTSDL GGGSAEPKSC SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSG GGGSGGGGSG
61 DKTHTCPPCP PEVKFNWYVD APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED
121 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK • · · · · · · 99 9 9 9 9 9 9
99 99 9
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9
999 99 99 9999
181 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN
YKTTPPVLDS
241 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO: 31]
Tabulka 5a: Aktivita GLP-1 analogu in vitro
Aktivace GLP-1 receptoru
GLP-1 sloučenina
GLP-1(7-37)OH 1,0
Val8-GLP-1(7-37)OH 0, 47 (n =
Gly8-Hisn-GLP-1 (7-37) OH 0,282
Val8-Ala11-GLP-1 (7-37) OH 0, 021
Val8-Lysn-GLP-1 (7-37) OH 0, 001
Val8-Tyr12-GLP-1 (7-37) OH 0, 81
Val8-Glu16-GLP-1 (7-37) OH 0, 047
Val8-Ala16-GLP-1 (7-37) OH 0, 112
Val8 -Tyrl6-GLP-1(7-37)OH 1,175
Vals-Lys20-GLP-l (7-37) OH 0,33
Gln22-GLP-1 (7-37) OH 0, 42
Val8-Ala22-GLP-1 (7-37) OH 0,56
Val8-Ser22-GLP-1 (7-37) OH 0, 50
Val8-Asp22-GLP-1 (7-37) OH 0,40
Val8-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 1,29
Val8-Lys22-GLP-1 (7-37) OH 0,58
Val8-Pro22-GLP-1 (7-37) OH 0, 01
Vals-His22 -GLP-1(7-37)OH 0,14
Val8-Lys22-GLP-1 (7-36) NH2 0, 53
Val8-Glu22-GLP-1 (7-36)NH2 1,0
Gly8-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 1,07
Val8-Lys23-GLP-1 (7-37) OH 0, 18
Val8-His24-GLP-1 (7-37) OH 0, 007
Val8-Lys24-GLP-1 (7-37) OH 0, 02
Val8-HiS26-GLP-l (7-37) OH 1,6
Val8-Glu26-GLP-1 (7-37) OH 1,5
Val8-His27-GLP-1 (7-37) OH 0,37
• 9
Val8-Ala27-GLP-1 (7-37) OH 0,47
Gly8-Glu30-GLP-l (7-37) OH 0, 29
Val8-Glu30-GLP-l (7-37) OH 0,29
Val8 -Asp30-GLP-l (7-37) OH 0, 15
Val8-Ser30-GLP-l (7-37) OH 0, 19
Val8-His30 -GLP-1 (7-37) OH 0,19
Val8-Glu33 -GLP-1 (7-37) OH 0, 039
Val8-Ala33-GLP-1 (7-37) OH 0,1
Val8-Gly33-GLP-1 (7-37) OH 0, 01
Val8-Glu34-GLP-1 (7-37) OH 0,17
Val8-Pro35-GLP-1 (7-37) OH 0, 094
Val8 -HiS35-GLP-l (7-37) OH 0,41
Val8-Glu35-GLP-1 (7-37) OH 0,15
Val8-Glu36-GLP-1 (7-37) OH 0, 11
Val8-HÍS36-GLP-l (7-37) OH 0, 22
Val8-His37-GLP-1 (7-37) OH 0, 33
Val8-Leul6-Glu26-GLP-1(7-37)OH 0, 23
Val8-Lys22-Glu30-GLP-l (7-37) OH 0,37
Val8-Lys22-Glu23-GLP-1 (7-37) OH 0, 35
Val8-Glu22-Ala27-GLP-1 (7-37) OH 1,02
Val8-Glu22-Lys23-GLP-1 (7-37) OH 1,43
Val8-Lys33-Val34-GLP-1 (7-37) OH 0, 08
Val8-Lys33-Asn34-GLP-1 (7-37) OH 0, 09
Val8-Gly34-Lys35-GLP-1 (7-37) OH 0, 34
Val8-Gly36-Pro37-GLP-1 (7-37)NH2 0,53
• · · ·· ···· ····
Tabulka 5b. Aktivita GLP-1 analogu in vitro
GLP-1 sloučenina Aktivace GLP-1 receptorů
GLP-1(7-37)OH lr0
Vala-GLP-1(7-37)OH 0,47
Glya-GLP-1(7-37)OH 0,80
Val8-Tyr12-GLP-1 (7-37) OH 0,80
Val H-Tyru-GLP-1 (7-36)NH2 0 , 52
Val“-Trp1^-GLP-1 (7-37) OH 0,52
Val “-Leu16-GLP-1 (7-37) OH 0,52
Vala-Vallb-GLP-1 (7-37) OH 0,52
Vala-Tyrib-GLP-1 (7-37) OH 1,18
Glya-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 1,03
Vala-Leu26-GLP-1 (7-37) OH 0,24
Val a-Tyr12-Tyr16-GLP-1 (7-37) OH 0,70
Vala-Trp12-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 0,80
Vala-Tyr12-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 1,27
Vala-Tyrlb-Pheiy-GLP-1 (7-37) OH 1,32
Vala-Tyrlb-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 1,69, 1,79
Vala-Trplb-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 2,30, 2,16
Vala-Leulb-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 2,02
'Vala-Uelb-Glu22-GLP-1 (7-37)OH ' 1,55
Vala-Phelb-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 1,08
Vala-Trp1B-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 1,50, 3,10
Vala-Tyria-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 2,40, 2,77
Vala-Pheia-Glu22-GLP-1 (7-37)OH 0,94
Vala-Ileia-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 1,88
Vala-Lysltí-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 1,18
Vala-Trpiy-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 1,50
Vala-Pheiy-Glu22-GLP-1 (7-37) OH 0,70
Vala-Phe2U-Glu22-GLP-l (7-37) OH . 1,-,27
• · • · · ·· ··
Vala-Glu22-Leu25-GLP-1 (7-3 7) OH 1,32
Vala-Glu22-Ile2b-GLP-1 (7-37) OH 1,46
Val8-Glu22-Val2b-GLP-l (7-37) OH 2,21, 1,36
Vala-Glu22-Ile2'-GLP-1 (7-37) OH 0,94
Vala-Glu22-Ala27-GLP-1 (7-37) OH 1,03
Valtí-Glu22-Ile2J-GLP-l (7-37) OH 2,21, 1,79, 1,60
Vala-Aspy-IleXi-Tyrib-Glu22- GLP-1(7-37)OH 2,02
ValB-TyrIÉ,-Trpiy-Glu22-GLP-l (7- 37)OH 1,64
Valtí-Trp±6-Glu22-Val2b-Ile2J- GLP-1(7-37)OH 2,35
Valtí-Trp16-Glu22-Ile32-GLP-1 (7- 37)OH 1,93
.Val8-Glu22-Val25-Ile·3·3-GLP-1 (7- 3 7) OH 2,30, 2,73, 3,15
Vala-Trpib-Glu22-Val2b-GLP-1 (7- 37) OH 2,07
Val8-Cyslfe-Lys26-GLP-1 (7-3 7) OH 1,97
Vala-Cyslb-Lys2b-Arg34-GLP-1 (7- ” 37)OH 2,4,1,9
Tabulka 6: Aktivita GLP/Exendin analogů in vitro
Sekvence peptidu Aktivita in vitro (% Val8-GLP- 1(7-37)OH)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGP-NH2 6,21
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPP PS-NH2 6,75,3,25
HVEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIAWLVKGRG 2,86
HVEGTFTSDVSSYLEEEAVRLFIAWLVKGRG 1,47
HVEGTFTSDLSKQMEGQAAKEFIAWLVKGRG 0,11
4
100
4« 4 444
HVEGTFTSDVSKQMEGQAAKEFIAWLVKGRG 0,04
HGEGTFTSDLSKQMEGQAAKEFIEWLKNGGP-NH2 1,44
HGEGTFTSDLS KQMEEEAAKEFIEWLKNGGP- NH2 2,80
HGEGTFTSDVS SYLEEEAVRLFIEWLKNGGP- NH2 5,40
HGEGTFTSDLSSYLEEEAVRLFIEWLKNGGP-NH2 5,07
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS -NH2 3,30
HAEGTFTSDVSKQLEEEAAKEFIAWLVKGRG 2,15
HVEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIEWLKNGGP- NH2 2,36
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIAWLVKGRG 3,25
HVEGTFTSDVSSYLEEEAAKEFIAWLVKGRG 1,00
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLKNGRG 0,20
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 1,00
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 2^12
Příklad 7: Farmakokinetika Val8-GLP-l-IgGl a
Val8-GLP-1-HSA in vivo:
Farmakokinetická studie Val8-GLP-l-IgGl a Val8 GLP-l-HSA byla provedena u opic druhu .cynomologus. Opicím bylo dávkováno 5, 6 nmolů/kg buď čištěného Val -GLP-1-IgGl/nebo Val8-GLP-1-HSA. Sloučeniny byly podávány jako intravenózními pilulkami. Byla shromažďována krev před dávkováním a v čase 0, 083, 0, 25, 0, 5, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, a 216 hodin po dávkování do trubiček obsahujících EDTA. Koncentrace imunoreaktivního Val8-GLP-1 v plazmě byla stanovena s použitím radioimunologických testů, které využívají polyklonální antisérum, .které má primární specifitu pro region N-zakončení (7-16) Val8-GLP-1(7-37).
101 • ·· ·· ·· ·· · · · · · · • ·· · · · ······ · • · · · · · ··· ·· ·· ···· • · ·· · ·
Obr. 9 zobrazuje koncentraci Val8-GLP-1-Fc a Val8-GLP-1Linker-HSA v plazmě po podání jednotlivé intravenózní dávky dvěma opicích druhu cynomologus. Fc fúzní proteiny mají poločas života přibližně 45 hodin a albuminový fúzní protein má poločas života přibližně 87 hodin.
Příklad 8: Farmakodynamika Exendinu-4-IgGl in vivo:
Byli studováni dva normální samci psů beagle s trvale zavedenou kanylou, poté co přes noc hladověli. Byly otevřeny arteriální a venózní vaskulární přístupové cesty a byl zaveden katétr perkutánně do hlavové žíly a stabilizován. Zvířata byla umístěna v klecích a jejich katétr byl napojen na otočný upevňovací systém. Roztok obsahující fúzní protein Exendin-4IgGl (11.8 μΜ) byl vstříknut injekčně intravenózně (1,0 nmol/kg) katétrem hlavové žíly. Katétr byl pak vyčištěn 10 ml slaného roztoku. Po dvou hodinách byla aktivována hyperglykemická svorka (150 mg/dl) a pokračovalo se tři hodiny. Během této pětihodinové periody byly odebírány vzorky arteriální krve stanovení koncentrace fúzního proteinu, glukózy a insulinu v plazmě.
Výsledky této studie byly porovnány s výsledky podobné dříve provedené studie, ve které zvířata obdržela dávku slaného roztoku a o tři hodiny později byla zvířata testována s použitím tříhodinové hyperglykemické svorky (150 mg/dl).
V obou uvedených studiích byla koncentrace glukózy v plazmě stanovena Beckman glukózovým ananlyzátorem. Koncentrace insulinu v plazmě byly stanoveny v Lineo Research, lne. s použitím soupravy RIA, vyvinutých v jejich laboratořích. Výsledky jsou znázorněny na obrázcích 10 a 11.
Příklad 9: Farmakokinetika Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgGl
102 • ·· ·· ·· ·· · ·· · · · · · · · · · • ·· · · · ···· • · · · · · · · · ····· • · · · · · ··· ··· ·· ·· ···· ·· ·
Dvě skupiny tří normálních psích samců beagle byla podána subkutánně (SC) nebo intravenózně (IV) dávka 0, 1 mg/kg Gly8-Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgGl. Koncentrace Gly8-Glu22-GLP-1CEx-Linker-IgGl v plazmě a imunoreaktivita byly stanoveny radioimunoologickým testem ve vzorcích shromažďovaných 30 minut před dávkováním a 216 hodin po dávkování ve skupinách IV a SC. Tyto koncentrace byly poté použity pro stanovení zde uváděných farmakokinetických parameterů. Střední doba odstranění poloviny dávky při intravenózním podávání Gly8Glu22-GLP-l-CEx-Linker-IgGl byla přibližně 55 hodin a celková doba odstranění z těla bylo 1,5 ml/h/kg. Střední doba odstranění poloviny dávky při subkutánním podávání Gly8-Glu22GLP-l-CEx-Linker-IgGl byla přibližně 38 hodin.

Claims (2)

  1. 000 00 00 0000 00 0
    gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct 59 ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660 cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720 gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780 gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa. 840 aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900 gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960 gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020 tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080 tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140 gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc .tttttgagca gcttggagag 1200 tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260 ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320 cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380 tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440 ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500 gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560 agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620 aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680 gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740 gctgccttag gcttataatg ac 1762
    Patentové nároky
    1. Heterologní fúzní protein, zahrnující první polypeptid s N-zakončením a C-zakončením fúzovaný na druhý polypeptid s N-zakončením a C-zakončením, kde první polypeptid je GLP-1 sloučenina a druhý polypeptid je vybraný ze skupiny, do které patří
    a) lidský albumin;
    b) analogy lidského albuminu; a
    c) fragmenty lidského albuminu, a kde C-zakončení prvního polypeptidů je fúzováno na Nzakončení druhého polypeptidů.
    2. Heterologní fúzní protein, zahrnující první polypeptid s N-zakončením a C-zakončením, fúzovaný na druhý polypeptid s N-zakončením a C-zakončením, kde první polypeptid je GLP-1 sloučenina a druhý polypeptid je vybraný ze skupiny, do které patří
    a) lidský albumin;
    b) analogy lidského albuminu; a
    c) fragmenty lidského albuminu, a kde C-zakončení prvního polypeptidů je fúzováno na Nzakončení druhého polypeptidů přes peptidový linker.
    3. Heterologní fúzní protein podle nároku 2, kde peptidový linker je vybrán ze skupiny, do které patří:
    a) glycinem bohatý peptid;
    b) peptid, který má sekvenci [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser] n, kde njel, 2, 3, 4, 5 nebo 6; a
    c) peptid, který má sekvenci [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3.
    104
    4. Heterologní fúzní protein podle nároků 1, 2 nebo 3, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci vzorce 1 [SEQ ID NO: 2]
    7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 His- -Xaa- -Xaa-Gly-Xaa-Phe- -Thr- -Xaa· -Asp- -Xaa- -Xaa 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Xaa- -Xaa- -Xaa-Xaa-Xaa-Xaa- -Xaa- -Xaa- -Xaa- -Xaa- -Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
    Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
    40 41 42 43 44 45
    Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
    Vzorec I (SEQ ID NO: 2) kde:
    Xaa na pozici 8 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys; Xaa na pozici 9 je Glu, Asp n .ebo L iys; Xaa na pozici 11 je Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys; Xaa na pozici 14 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys ; Xaa na pozicí 16 je Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp nebo Lys; Xaa na pozici 17 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu,
    ·· ·· ·« • · · · · ·· · · ····-· « • · · · ·
    105
    Asp nebo Lys;
    Xaa na pozici 18 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu Asp, Trp, - Ty rr nebo Lys; Xaa na pozici 19 je Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gin nebo Lys; Xaa na pozici 20 je Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu Asp, Met, , Tr Pz Tyr nebo Lys; Xaa na pozici 21 je Glu, Asp nebo Lys; Xaa na pozici 22 je Gly, Ala, Ser, Thr,~Leu, Ile, Val, Glu Asp nebo Lys f Xaa na pozici 23 je Gin, Asn, Arg, Glu, Asp nebo Lys; Xaa na pozici 24 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg Glu, Asp neb o Lys; Xaa na pozici 25 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys f Xaa na pozici 26 je Lys, Arg, Gin, Glu, Asp nebo His; Xaa na pozici 27 je Leu, Glu, Asp nebo Lys; Xaa na pozici 30 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys f Xaa na pozici 31 je Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp nebo Lys; Xaa na pozici 32 je Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys f Xaa na pozici 33 je Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp nebo Lys Z Xaa na pozici 34 je Asn, Lys, Arg, Glu, Asp nebo His; Xaa na pozici 35 je Gly, Ala, Ser., Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys Z Xaa na pozici 36 je Gly, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His; Xaa na pozici 37 je Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val,
    Glu, Asp nebo Lys nebo chybí;
    • · · · • · ··· • · · * · ·
    106
    Xaa na pozici 38 nebo chybí; je Ser, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His, Xaa na pozici 39 je Ser, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His, nebo chybí; Xaa na pozici 40 je Gly, Asp, Glu nebo Lys nebo chybí; Xaa na pozici 41 je Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp nebo Lys,
    nebo chybí;
    Xaa na pozici 42 je Ser, Pro, Lys, Glu nebo Asp nebo chybí; Xaa na pozici 43 je Ser, Pro, Glu, Asp nebo Lys nebo chybí; Xaa •Z) na pozici 44 je Gly, Pro, Glu, Asp nebo Lys nebo chybí; cl Xaa na pozici 45 je Ala, Ser, Val, Glu, Asp nebe > Lys,
    nebo chybí s podmínkou, že když aminokyselina na pozici 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 nebo 44 chybí, potom každá aminokyselina za touto aminokyselinou rovněž chybí.
    5. Heterologní fúzní protein podle nároků 1, 2 nebo 3, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci vzorce II (SEQ ID NO: 3)
    7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Xaa- •Xaa- -Xaa- Gly-Xaa- -Xaa- -Thr· -Ser- -Asp-Xaa-Ser 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Xaa- •Tyr- -Leu- •Glu-Xaa- -Xaa- -Xaa- -Ala- -Xaa-Xaa-Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37
    Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
    Vzorec II (SEQ ID NO: 3) • ·
    107 kde:
    Xaa na pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, α-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
    Xaa na pozici 8 je: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr; Xaa na pozici 9 je: nebo His; Thr, Ser, Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Glu Xaa na pozici 11 je: Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys nebo His; Xaa na pozici 12 je: His, Trp, Phe nebo Tyr; Xaa na pozici 16 je: Leu, Ser, Thr, Trp, Tyr, Glu nebo Ala; His, Phe, Asp, Val Xaa na pozici 18 je: Lys; His, Pro, Asp, Glu, Arg, Ser, Ala nebo Xaa na pozici 22 je: Cys; Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Xaa na pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu, Gin nebo Arg; Xaa na pozici 24 je: Glu, Arg, Ala nebo Lys; Xaa na pozici 26 je: Trp, Tyr, Phe, Asp, Lys, Glu nebo His; Xaa na pozici 27 je: Lys; Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg nebo Xaa na pozici 30 je: Ala, Glu, Asp, Ser nebo His; Xaa na pozici 31 je: Asp, Glu, Ser, Thr, Arg, Trp nebo Lys; Xaa na pozici 33 je: Xaa na pozici 34 je: Asp, Arg, Val, Lys, Glu, Lys nebo Asp; Ala, Gly nebo Glu; Xaa na pozici 35 je: Thr, Ser, Lys, Arg, Gly, Pro, His nebo Glu; Trp, Tyr, Phe, Asp Xaa na pozici 36 je: nebo His; Thr, Ser, Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg, Glu Xaa na pozici 37 je: Phe, His, Gly, Lys, Arg, Thr, Ser, Gly-Pro nebo chybí. Glu, Asp, Trp, Tyr
    6. Heterologní fúzní protein podle nároků 1, 2 nebo 3, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci • · • ·
    108 vzorce III (SEQ ID NO: 4)
    7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Xaa- -Xaa· -Glu-Gly-Xaa- -Xaa- -Thr- -Ser- -Asp-Xaa- -Ser 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Ser- -Tyr- -Leu-Glu-Xaa- -Xaa- -Xaa- -Xaa· -Lys-Xaa- •Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37
    Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
    Vzorec III (SEQ ID NO: 4) kde:
    Xaa na pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, a-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
    Xaa na pozici θ je: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr; Xaa na pozici 11 je: Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys nebo His; Xaa na pozici 12 je: His, Trp, Phe nebo Tyr; Xaa na pozici 16 je: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu nebo Ala; Xaa na pozici 22 : Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Cys Xaa na pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu nebo Gin; Xaa na pozici 24 je: Glu, His, Ala nebo Lys; Xaa na pozici 25 je: Asp, Lys, Glu nebo His; Xaa na pozici 27 je: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg nebo Lys; Xaa na pozici 30 je: Ala, Glu, Asp, Ser nebo His; Xaa na pozici 33 je: Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly nebo Glu; Xaa na pozici 34 je: Glu, Lys nebo Asp; Xaa na pozici 35 je: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp,
    Gly, Pro, His nebo Glu;
    Xaa na pozici 36 je: Arg, Glu nebo His;
    • ·
    109
    Xaa na pozici 37 je: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro nebo chybí.
    7. Heterologní fúzní protein podle nároku 1, 2 nebo 3, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci vzorce IV (SEQ ID NO: 5)
    7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Xaa- -Xaa- -Glu-Gly-Thr- -Xaa- -Thr· -Ser- -Asp- -Xaa-Ser 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Ser- -Tyr· -Leu-Glu-Xaa- -Xaa· -Ala- -Ala- -Xaa- -Glu-Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37
    Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa-Arg-Xaa
    Vzorec IV (SEQ ID NO: 5) kde:
    Xaa na pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, α-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
    Xaa na pozici 8 je: Gly, Al a, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr; Xaa na pozici 12 je: His, Trp, Phe nebo Tyr; Xaa na pozici 16 je: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe , Asp, Val Glu nebo Ala; Xaa na pozici 22 je: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys , Arg
    nebo Cys;
    Xaa na pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu nebo Gin; Xaa na pozici 26 je: Asp, Lys, Glu nebo His; Xaa na pozici 30 je: Ala, Glu, Asp, Ser nebo His; Xaa na pozici 35 je: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp Gly, Pro, His n< ebo G( Lu; Xaa na pozici 37 je: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr
    • ·
    110
    Phe, His, -NH2, Gly, Gly-Pro nebo Gly-Pro-NH2 nebo chybí.
    8. Heterologní fúzní protein podle nároků 1, 2 nebo 3, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci vzorce V (SEQ ID NO: 6)
    7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Xaa· -Xaa- -Glu-Gly-Thr- -Phe' -Thr- -Ser· -Asp-Val- -Ser 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Ser- -Tyr- -Leu-Glu-Xaa- -Xaa- -Ala· -Ala- -Lys-Xaa- Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37
    Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa
    Vzorec V (SEQ ID NO: 6) kde:
    Xaa na pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, oí-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
    Xaa na pozici 8 je: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr; Xaa na pozici 22 je: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Cys; Xaa na pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu nebo Gin; Xaa na pozici 24 je: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg
    nebo Lys
    Xaa na pozici 30 je: Ala, Glu, Asp, Ser nebo His ; Xaa na pozici 37 je: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp
    Phe, His, Gly, Gly-Pro nebo chybí.
    9. Heterologní fúzní protein podle nároků 1, 2 nebo 3, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci vzorce VIII (SEQ ID NO: 11) .
    ·· ·
    111
    7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Xaa· -Xaa· -Glu- -Gly-Thr- -Phe· -Thr- -Ser-Asp-Xaa- •Ser 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Xaa- -Xaa· -Xaa- -Glu-Xaa- -Xaa· -Ala- -Xaa-Xaa-Xaa- Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37
    Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa
    Vzorec VIII (SEQ ID NO: 11) kde:
    Xaa na pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, α-fluormethylhistidin nebo oí-methylhistidin;
    Xaa na pozici 8 je: Gly, Ala nebo Val; Xaa na pozici 16 je: Leu nebo Val; Xaa na pozici 18 je Lys nebo Ser; Xaa na pozici 19 je: Gin nebo Tyr; Xaa na pozici 20 je: Met nebo Leu; Xaa na pozici 22 je: Glu nebo Gin; Xaa na pozici 23 je: Glu nebo Gin; Xaa na pozici 25 je: Val nebo Ala; Xaa na pozici 26 je: Arg nebo Lys; Xaa na pozici 27 je Leu nebo Glu; Xaa na pozici 30 je: Glu nebo Ala; Xaa na pozici 33 je: Val nebo Lys; Xaa na pozici 34 je: Asn nebo Lys; Xaa na pozici 36 je: Gly nebo Arg; a Xaa na pozici 37 je: Gly, Pro , Pro -Ser-Ser-Gly-Ala-Pro
    Pro-Ser nebo chybí.
    • ·
    112
    10. Heterologní fúzní protein podle nároků 1 až 9, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 6 aminokyselin, které jsou odlišné od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH,
    GLP-1 (7-36)OH nebo Exendinu-4.
    11. Heterologní fúzní protein podle nároku 10, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 5 aminokyselin, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendinu-4.
    12. Heterologní fúzní protein podle nároku 11, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 4 aminokyselin, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendinu-4.
    13. Heterologní fúzní protein podle nároku 12, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 3 aminokyseliny, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendinu-4.
    14. Heterologní fúzní protein podle nároku 13, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 2 aminokyseliny, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendinu-4.
    15. Heterologní fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, kde Xaa na pozici 8 je glycin nebo valin.
    16. Heterologní fúzní protein podle nároku 8, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 2 aminokyseliny, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH nebo GLP-1(7-36)OH a Xaa na pozici 8 je glycin nebo valin a Xaa na pozici 30 je alanin, kyselina glutamová, kyselina aspartová, serin nebo histidin.
    99 9 w: ’ ’ · · · 9 9 9 · • ·9 99 9 9999 ί!!·** ·9»9 9999 *·· 999 999
    999 ·9 99 9999 ¢9 9
    113
    17. Heterologní fúzní protein podle nároku 16, kde Xaa na pozici 30 je kyselina glutamová.
    18. Heterologní fúzní protein podle nároku 8, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 2 aminokyseliny, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH nebo GLP-1(7-36)OH a Xaa na pozici 8 je glycin nebo valin a Xaa na pozici 37 je histidin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, kyselina aspartová, kyselina glutamová, serin, threonin, arginin nebo lysin.
    19. Heterologní fúzní protein podle nároku 18, kde Xaa na pozici 37 je histidin.
    20. Heterologní fúzní protein podle nároku 8, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 2 aminokyseliny, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH nebo GLP1(7-36)OH a Xaa na pozici 8 je glycin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin nebo metionin a Xaa na pozici 22 je kyselina aspartová, kyselina glutamová, lysin, arginin, asparagin, glutamin nebo histidin.
    21. Heterologní fúzní protein podle nároku 20, kde Xaa na pozici 22 je lysin nebo kyselina glutamová.
    22. Heterologní fúzní protein podle nároku 8, kde GLP-1 sloučeninou je Val8-GLP-1(7-37).
    23. Heterologní fúzní protein podle nároku 8, kde GLP-1 sloučeninou je Gly8-GLP-1(7-37).
    24. Heterologní fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 23, kde druhým polypeptidem je lidský albumin.
    • · ·· ···· • · · • ···· • · ·· ·
    114
    25. Heterologní fúzní protein podle nároku 24, kde druhý polypeptid má sekvenci SEQ ID NO: 34.
    26. Heterologní fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 23, kde druhý polypeptid je fragment albuminu s N-zakončením.
    27. Heterologní fúzní protein zahrnující první polypeptid s N-zakončením a C-zakončením fúzovaný na druhý polypeptid s N-zakončením a C-zakončením, kde první polypeptid je GLP-1 sloučenina a druhý polypeptid je vybrán ze skupiny, do které patří
    a) Fc část imunoglobulinu;
    b) analog Fc části imunoglobulinu; a
    c) fragmenty Fc části imunoglobulinu, a kde C-zakončení prvního polypeptidů je fúzováno na Nzakončení druhého polypeptidů.
    28. Heterologní fúzní protein zahrnující první polypeptid s N-zakončením a C-zakončením fúzovaný na druhý polypeptid s N-zakončením a C-zakončením, kde první polypeptid je GLP-1 sloučenina a druhý polypeptid je vybrán ze skupiny, do které patří
    a) Fc část imunoglobulinu;
    b) analog Fc části imunoglobulinu; a
    c) fragmenty Fc části imunoglobulinu, a kde C-zakončení prvního polypeptidů je fúzováno na Nzakončení druhého polypeptid přes peptidový linker.
    29. Heterologní fúzní protein podle nároku 28, kde peptidový linker je vybrán ze skupiny, do které patří:
    a) glycinem bohatý peptid;
    b) peptid, který má sekvenci [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n , kde njel, 2, 3, 4, 5 nebo 6; a
    115
    c) peptid, který má sekvenci [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3.
    30. Heterologní fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 27, 28 nebo 29, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci vzorce 1 [SEQ ID NO: 2].
    7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 His- -Xaa- -Xaa· -Gly-Xaa· -Phe· -Thr- -Xaa- -Asp- -Xaa· -Xaa 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Xaa· -Xaa- -Xaa· -Xaa-Xaa· -Xaa- -Xaa- -Xaa- -Xaa- -Xaa· -Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
    Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
    40 41 42 43 44 45
    Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
    Vzorec I (SEQ ID NO: 2) kde:
    Xaa na pozici 8 j e . Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, nebo Lys; Xaa na pozici 9 j e Glu, Asp n .ebo Lys; Xaa na pozici 11 je Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys; Xaa na pozici 14 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys; Xaa na pozici 16 je Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp ] nebo Lys; Xaa na pozici 17 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys; Xaa na pozici 18 je Ser, Al a, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu,
    Asp, Trp, Tyr nebo Lys;
    • 9 • · 9
    99 9999
    99 « • · 9 • 9 9 9 • · 9999 •99
    99 9
    116
    Xaa na pozici 19 je Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gin nebo Lys; Xaa na pozici 20 je Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, - Tr Pz Tyr nebo Lys; Xaa na pozici 21 je Glu, Asp nebo Lys; Xaa na pozici 22 je Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys r Xaa na pozici 23 je Gin, Asn, Arg, Glu, Asp nebo Lys; Xaa na pozici 24 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp neb o Lys; Xaa na pozici 25 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys r Xaa na pozici 26 je Lys, Arg, Gin, Glu, Asp nebo His; Xaa na pozici 27 je Leu, Glu, Asp nebo : Lys; Xaa na pozici 30 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, , Glu Asp nebo Lys r Xaa na pozici 31 je Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp nebo Lys; Xaa na pozici 32 je Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys Z Xaa na pozici 33 je Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp nebo Lys Z Xaa na pozici 34 je Asn, Lys, Arg, Glu, Asp nebo His; Xaa na pozici 35 je Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys Z Xaa na pozici 36 je Gly, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His; Xaa na pozici 37 je Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp neb o Lys nebo chybí; Xaa na pozici 38 je Ser, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His
    nebo chybí;
    Xaa na pozici chybí; 39 je Ser, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His nebo Xaa na pozici 40 je Gly, Asp, Glu nebo Lys : nebo chybí; Xaa na pozici 41 nebo chybí; je Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu z Asp nebo Lys Xaa na pozici 42 je Ser, Pro, Lys, Glu nebo Asp nebo chyb
    • ·· ·· · 4 4 4 4 ·· 444 4 4 44 4444
    444 »4 4 44 4
    444 44 44 4444 44 4
    117
    Xaa na pozici 43 je Ser, Pro, Glu, Asp nebo Lys nebo chybí; Xaa na pozici 44 je Gly, Pro, Glu, Asp nebo Lys nebo chybí; Xaa na pozici 45 je Ala, Ser, Val, Glu, Asp nebo Lys nebo
    chybí;
    s podmínkou, že pokud aminokyselina na pozici 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 nebo 44 chybí, potom každá aminokyselina za touto aminokyselinou rovněž chybí.
    31. Heterologní fúzní protein podle nároků 27, 28 nebo 29, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci vzorce II (SEQ ID NO: 3)
    7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Xaa· -Xaa- -Xaa- Gly-Xaa- -Xaa· -Thr· -Ser- -Asp- -Xaa- Ser 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Xaa· -Tyr- -Leu- Glu-Xaa- -Xaa· -Xaa· -Ala- -Xaa- -Xaa- Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37
    Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
    Vzorec II (SEQ ID NO: 3) kde:
    Xaa na pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, α-fluormethylhistidin nebo cc-methylhistidin;
    Xaa na pozici 8 je: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr; Xaa na pozici 9 je: Thr, Ser, Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Glu nebo His; Xaa na pozici 11 je: : Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys nebo His; Xaa na pozici 12 je: : His, Trp, Phe nebo Tyr; Xaa na pozici 16 je: : Leu, Ser, Thr, Trp, His, - Phe , Asp , Val,
    • ·· · · · ···· • · ··· · · ·· ···· • · · ··· · · · ····· ······ · · ·
    Tyr, Glu nebo Ala;
    118
    Xaa na pozici 18 je: His, Pro, Asp, Glu, Arg, Ser, Ala nebo Lys; Xaa na pozici 22 je: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Cys; Xaa na pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu, Gin nebo Arg; Xaa na pozici 24 je: Glu, Arg, Ala nebo Lys; Xaa na pozici 26 je: Trp, Tyr, Phe, Asp, Lys, Glu nebo His; Xaa na pozici 27 je: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg nebo Lys; Xaa na pozici 30 je: Ala, Glu, Asp, Ser nebo His; Xaa na pozici 31 je: Asp, Glu, Ser, Thr, Arg, Trp nebo Lys; Xaa na pozici 33 je: Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly nebo Glu; Xaa na pozici 34 je: Glu, Lys nebo Asp; Xaa na pozici 35 je: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, ,Asp, Gly, Pro, His n .ebo G( Lu; Xaa na pozici 36 je: Thr, Ser, Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg, Glu nebo His; Xaa na pozici 37 je: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro ne bo chybí.
    32. Heterologní fúzní protein podle nároků 27, 28 nebo 29, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci vzorce III (SEQ ID NO: 4)
    7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Xaa· -Xaa· -Glu- Gly- -Xaa- -Xaa· -Thr- -Ser· -Asp· -Xaa-Ser 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Ser· -Tyr- -Leu- Glu- -Xaa- -Xaa· -Xaa- -Xaa- -Lys· -Xaa-Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37
    Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-R
    119 vzorec III (SEQ ID NO: 4) kde:
    Xaa na pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, α-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
    Xaa na pozici 8 je: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr; Xaa na pozici 11 je: ; Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys nebo His; Xaa na pozici 12 je: His, Trp, Phe nebo Tyr; Xaa na pozici 16 je: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu nebo Ala; Xaa na pozici 22: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Cys; Xaa na pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu nebo Gin; Xaa na pozici 24 je: Glu, His, Ala nebo Lys; Xaa na pozici 25 je: Asp, Lys, Glu nebo His; Xaa na pozici 27 je: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg
    nebo Lys;
    Xaa na pozici 30 je : Ala, Glu, Asp, Ser nebo His; Xaa na pozici 33 je : Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly nebo Glu; Xaa na pozici 34 je : Glu, Lys nebo Asp; Xaa na pozici 35 je : Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp Gly, Pro, His nebo Glu; Xaa na pozici 36 je : Arg, Glu nebo His; Xaa na pozici 37 je : Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr Phe, His, Gly, Gly-Pro nebo chybí.
    33. Heterologní fúzní protein podle nároku 27, 28 nebo 29, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci vzorce IV (SEQ ID NO: 5):
    7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
    Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser
    18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 ···· • · · · • · · · · • · · • · ·
    120
    Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe
    29 30 31 32 33 34 35 36 37
    Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa-Arg-Xaa
    Vzorec IV (SEQ ID NO: 5) kde:
    Xaa na pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, oi-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
    Xaa na pozici 8 j e: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr; Xaa na pozici 12 je: His, Trp, Phe nebo Tyr; Xaa na pozici 16 je: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val Glu nebo Ala Z Xaa na pozici 22 je: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Cys; Xaa na pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu nebo Gin; Xaa na pozici 26 je: Asp, Lys, Glu nebo His; Xaa na pozici 30 je: Ala, Glu, Asp, Ser nebo His; Xaa na pozici 35 je: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp Gly, Pro, Hi s n ebo G lu; Xaa na pozici 37 je: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr Phe, His, Gl y, Gly-P ro nebo ch ,ybí.
    34. Heterologní fúzní protein podle nároků 27, 28 nebo 29, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci vzorce V (SEQ ID NO: 6)
    7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
    Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser
    18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
    Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Lys-Xaa-Phe • · · «· · 4··· • · ··· · · Λ · ···· ··· · · · · · · ····· ······ · · ·
    121
    29 30 31 32 33 34 35 36 37
    Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa
    Vzorec V (SEQ ID NO: 6) kde:
    Xaa na pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, oí-fluormethylhistidin nebo oí-methylhistidin;
    Xaa na pozici 8 je: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr Xaa na pozici 22 je: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Cys; Xaa na pozici 23 je: His, Asp, Lys, Glu nebo Gin; Xaa na pozici 24 je: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg
    nebo Lys
    Xaa na pozici 30 je: Ala, Glu, Asp, Ser nebo His; Xaa na pozici 37 je: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp
    Phe, His, Gly, Gly-Pro nebo chybí.
    35. Heterologní fúzní protein podle nároků 27, 28 nebo 29, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci vzorce VIII (SEQ ID NO: 11).
    7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Xaa· -Xaa· -Glu-Gly-Thr- -Phe· -Thr- -Ser- -Asp-Xaa-Ser 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Xaa· -Xaa· -Xaa-Glu-Xaa- -Xaa- -Ala- -Xaa- -Xaa-Xaa-Phe 29 30 31 32 33 34 35 36 37
    Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-R
    Vzorec VIII (SEQ ID NO: 11) • · · · · · · • · · · · ·· · · · · · • · · · 9 · ·
    122 kde:
    Xaa na pozici 7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin,
    2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, α-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
    Xaa na pozici θ je: Gly, Ala nebo Val; Xaa na pozici 16 je: Leu nebo Val; Xaa na pozici 18 je Lys nebo Ser; Xaa na pozici 19 je: Gin nebo Tyr; Xaa na pozici 20 je: Met nebo Leu; Xaa na pozici 22 je: Glu nebo Gin; Xaa na pozici 23 je: Glu nebo Gin; Xaa na pozici 25 je: Val nebo Ala; Xaa na pozici 26 je: Arg nebo Lys; Xaa na pozici 27 je Leu nebo ' Glu; Xaa na pozici 30 je: Glu nebo Ala; Xaa na pozici 33 je: Val nebo Lys; Xaa na pozici 34 je: Asn nebo Lys; Xaa na pozici 36 je: Gly nebo Arg; a Xaa na pozici 37 je: Gly, Pro , Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro
    Pro-Ser nebo chybí.
    36. Heterologní fúzní protein podle nároků 27 až 35, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 6 aminokyselin, které jsou odlišné od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH,
    GLP-1(7-3 6)OH nebo Exendinu-4.
    37. Heterologní fúzní protein podle nároku 36, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 5 aminokyselin, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendinu-4.
    38. Heterologní fúzní protein podle nároku 37, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 4 aminokyseliny, které se liší od • ·· · · · · · · · • · ··· · · · · · ···· • · · ··· ··· ····· ······ ·· ·
    123 odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendinu-4.
    39. Heterologní fúzní protein podle nároku 38, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 3 aminokyselin, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendinu-4.
    40. Heterologní fúzní protein podle nároku 39, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 2 aminokyseliny, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH nebo Exendinu-4.
    41. Heterologní fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 27 až 40, kde Xaa na pozici 8 je glycin nebo valin.
    42. Heterologní fúzní protein podle nároku 34, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 2 aminokyselin, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH nebo GLP1(7-36)OH a Xaa na pozici 8 je glycin nebo valin a Xaa na pozici 30 je alanin, kyselina glutamová, kyselina aspartová, serin nebo histidin.
    43. Heterologní fúzní protein podle nároku 42, kde Xaa na pozici 30 je kyselina glutamová.
    44. Heterologní fúzní protein podle nároku 34, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 2 aminokyseliny, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH nebo GLP-1(7-36)OH a Xaa na pozici 8 je glycin nebo valin a Xaa na pozici 37 je histidin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, kyselina aspartová, kyselina glutamová, serin, threonin, arginin nebo lysin.
    124
    45. Heterologní fúzní protein podle nároku 44, kde Xaa na pozici 37 je histidin.
    46. Heterologní fúzní protein podle nároku 34, kde GLP-1 sloučenina nemá více než 2 aminokyselin, které se liší od odpovídající aminokyseliny v GLP-1(7-37)OH nebo GLP-1(7-36)OH a Xaa na pozici 8 je glycin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin nebo methionin a Xaa na pozici 22 je kyselina aspartová, kyselina glutamová, lysin, arginin, asparagin, glutamin nebo histidin.
    47. Heterologní fúzní protein podle nároku 46, pozici 22 je lysin nebo kyselina glutamová.
    kde Xaa na
    48. Heterologní fúzní protein podle nároku 34, kde sloučenina je Val8-GLP-1(7-37).
    49. Heterologní fúzní protein podle nároku 34, kde sloučenina je Gly8-GLP-1(7-37).
    GLP-1
    GLP-1
    50. Heterologní fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 27 až 49, kde druhý polypeptid je Fc část Ig vybraného ze skupiny, do které patří: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD nebo IgM.
    51. Heterologní fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 27 až 50, kde druhý polypeptid je Fc část Ig vybraného ze skupiny, do které patří: IgGl, IgG2, IgG3, and IgG4.
    52. Heterologní fúzní protein podle nároku 51, kde druhý polypeptid je část IgGl imunoglobulinu.
    53. Heterologní fúzní protein podle nároku 51, kde druhý polypeptid je Fc část IgG4 imunoglobulinu.
    125
    54. Heterologní fúzní protein podle nároků 50 až 53, kde IgG je lidský.
    55. Heterologní fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 27 až 54, kde Fc část zahrnuje pantovou oblast, CH2, CH3 domény.
    56. Heterologní fúzní protein podle nároku 52, kde druhý polypeptid má sekvenci SEQ ID NO: 32.
    57. Polynukleotid kódující heterologní fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 56.
    58. Vektor zahrnující polynukleotid podle nároku 57.
    59. Hostitelská buňka zahrnující vektor podle nároku 58.
    60. Hostitelská buňka, exprimující alespoň jeden heterologní fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 56.
    61. Hostitelská buňka podle nároku 60, kde uvedená hostitelská buňka je buňka CHO.
    62. Způsob výroby heterologního fúzního proteinu zahrnující kroky transkripce a translace polynukleotidu podle nároku 57 za podmínek, při kterých heterologní fúzní protein je exprimován v detekovatelném množství.
    63. Způsob normalizace hladiny krevní glukózy u savců, kteří to potřebují, zahrnující podávání terapeuticky účinného množství heterologního fúzního proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 56.
    * ·· φφ φφ φφφ ···· φφφφ φφφ ··· ·· φφφφφ ·· φφφ · φ φφ φφφφφ ··· φφφ φφφ • ΦΦ φφ φφ φφφφ φφ φ
    126
    64. Způsob léčení pacienta, který má diabetes mellitus nezávislý na inzulínu, zahrnující podávání terapeuticky účinného heterologního fúzního proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 56.
    65. Způsob léčení obesity zahrnující podávání terapeuticky účinného množství heterologního fúzního proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 56.
    66. Použití heterologního fúzního proteinu podle z kteréhokoliv z nároků 1 až 56 pro výrobu prostředku k léčení pacientů, kteří mají diabetes mellitus nezávislý na isulinu.
    67. Použití heterologního fúzního proteinu podle z kteréhokoliv z nároků 1 až 56 pro výrobu prostředku k léčení pacientů, kteří jsou obézní.
    68. Farmaceutická formulace přizpůspbená pro léčení pacientů, kteří mají diabetes mellitus nezávislý na isulinu, zahrnující heterologní fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 56.
    69. Heterologní fúzní protein podle nároků 1, 2 nebo 3, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci vzorce I [SEQ.ID NO: 12]
    Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaai2-Thr-Ser-Asp-Xaai6-Ser
    Xaal8-Xaai9-Xaa2o_Glu-Xaa22~Gln-Ala-Xaa25-Lys-Xaa2-7Phe-Ile-Xaa3o-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37
    Vzorec IX (SEQ ID NO: 12) kde:
    Xaa-? je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, • 0 · · « • · · « • · · 90
    0 9 9 9 9
    0 00 9
    127
    2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, α-fluormethylhistidin nebo a-methylhistidin;
    Xaa8 je: Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Xaai2 je : Phe , Trp nebe > Tyr; Xaai6 je: Val, Trp, Ile, Leu, Phe Xaai8 je: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Xaai9 je : Tyr , Trp nebe i Phe ; Xaa2o je: Leu, Phe, Tyr nebo Trp; Xaa22 je: Gly, Glu, Asp nebo Lys; Xaa25 je: Ala, Val, Ile nebo Leu; Xaa27 je: Glu, Ile nebo Ala; Xaa3o je: Ala nebo Glu Xaa33 je: Val nebo Ile; a Xaa37 je: Gly, His, nh2 nebo chybí 70. Heterologní fúzní protei:
    polypeptidem je lidský albumin.
    71. Heterologní fúzní protein podle nároku 70, kde druhý polypeptid má sekvenci SEQ ID NO: 34.
    72. Heterologní fúzní protein podle nároku 69, kde druhý polypeptid je fragment albuminu s N-zakončením.
    73. Heterologní fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 27, 28 nebo 29, kde GLP-1 sloučenina zahrnuje sekvenci vzorce IX [SEQ ID NO: 12]
    Xaa-7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaai2-Thr-Ser-Asp-Xaai6-SerXaaig-Xaai 9-Xaa2o-Glu-Xaa22 - G ln-Al a-Xaa25-Ly s—Xaa27 — Phe-Ile-Xaa3o-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37
    Vzorec IX (SEQ ID NO: 12)
    128 ·· ·· ·· • · ♦ · ·
    99 9 9 9
    9 9 9 9 9 • 9 9 9 •9 9 9 99 9 9 • · ·
    9 9 9 9
    9 9 999
    9 9 9 ·· · kde:
    Xaa7 je: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin,
    2-aminohistidin, β-hydroxyhistidin, homohistidin, a-fluormethylhistidin nebo oí-methylhistidin ;
    Xaag je: Ala, Gly, Val , Leu, , Ile, Ser nebo Xaai2 je: Phe, Trp nebo Tyr; Xaai6 je: Val, Trp, Ile, Leu, Phe nebo Tyr; Xaai8 j e : Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu, Xaaigje: Tyr, Trp nebo Phe; Xaa2o j e : Leu, Phe, Tyr nebo Trp; Xaa22 je: Gly, Glu, Asp nebo Lys; Xaa25 je: Ala, Val, Ile nebo Leu; Xaa27 je: Glu, Ile nebo Ala; Xaa30 je: Ala nebo Glu Xaa33 j e: Val nebo Ile; a Xaa37 je: Gly, His, NH2 nebo chybí.
    74. Heterologní fúzní protein podle nároku 73, kde druhým polypeptidem je Fc část Ig vybraného ze skupiny, do které patří: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD nebo IgM.
    75. Heterologní fúzní protein podle nároku 73 nebo 74, kde druhým polypeptidem je Fc část Ig vybraného ze skupiny, do které patří: IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4.
    76. Heterologní fúzní protein podle nároku 75, kde druhým polypeptidem je Fc část IgGl imunoglobulinu.
    77. Heterologní fúzní protein podle nároku 75, kde druhým polypeptidem je Fc část IgG4 imunoglobulinu.
    78. Heterologní fúzní protein podle nároků 73 až 78, kde IgG je lidský.
    • · · i *··· • ·
    129
    79. Heterologní fúzní protein podle nároku 75, kde druhý polypeptid má sekvenci SEQ ID NO: 32.
    80. Heterologní fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 69 až 79, kde GLP-1 sloučenina je vybrána ze skupiny, do které patří Gly8-GLP-1 (7-37) , Val8-Tyr12-GLP-1 (7-37) , Val8Tyr12-GLP-1 (7-36) , Val8-Trp12-1 (7-37) , Val8-Leu16-GLP-1 (7-37 ) , Val8-Val16-GLP-1 (7-37) , Val8-Tyr16-GLP-1 (7-37) , Gly8-Glu22-GLP-1 (7-37), Val8-Glu22-GLP-1 (7-37) , Val8-Leu25-GLP-1 (7-37) , Val8Tyr12-Tyr16-GLP-1 (7-37) , Val8-Trp12-Glu22-GLP-1 (7-37) , Val8-Tyr12G1u22-GLP-1 (7-37) , Val8-Tyr16-Phe19-GLP-1 (7-37) , Val8-Tyr16-Glu22GLP-1 (7-37) , Val8-Trp16-Glu22-GLP-1 (7-37) , Val8-Leu16-Glu22-GLP-1 (7-37), Val8-Ile16-Glu22-GLP-1 (7-37) , Val8-Phe16-Glu22-GLP-1 (737) , Val8-Trp18-Glu22-GLP-1 (7-37) , Val8-Tyr18-Glu22-GLP-1 (7-37) , Val8-Phe18-Glu22-GLP-1 (7-37) , Val8-Ile18-Glu22-GLP-1 (7-37) , Val8Lys18-Glu22-GLP-1 (7-37) , Val8-Trp19-Glu22-GLP-1 (7-37) , Val8-Phe19G1u22-GLP-1 (7-37) , Val8-Phe20-Glu22-GLP-l (7-37) , Val8-Glu22-Leu25GLP-1 (7-37) , Val9-Glu22-Ile25-GLP-1 (7-37) , Val8-Glu22-Val25~GLP-1 (7-37), Val8-Glu22-Ile27-GLP-1 (7-37) , Val8-Glu22-Ala27-GLP-1 (737), Val8-Glu22-Ile33-GLP-1 (7-37) , Val8-Asp9-Ilei;i-Tyr16-Glu22GLP-1 (7-37) , Val8-Tyr16-Trp19-Glu22-GLP-1 (7-37) , Val8-Trp16-Glu22Val25-Ile33-GLP-1 (7-37) , Val8-Trp16~Glu22-Ile33-GLP-l (7-37) , Val8Glu22-Val25-Ile33-GLP-1 (7-37) , Val8-Trp16-Glu22-Val25-GLP-1 (7-37) a Val8-Cysls-Lys26-GLP-l (7-37) .
    1/17
    Obr. 1
    Ala Glu Pro Lys 5 Ser 20 Cys Asp Lys Thr 10 His Thr 25 Cys Pro Pro 15 Cys 30 Pro Ala Pro Glu Lys Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 35 40 45 Lys Pro Lys Asp Thr Lys Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 50 55 60 Cys Val Val Val Asp Val' Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 65 70 75 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 80 85 90 Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 95 100 105 Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 110 115 120 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 125 130 135 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 140 145 150 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 155 160 165 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 170 175 180 Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 185 190 195 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 200 205 210 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 215 220 225 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser
    230
    Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys [SEQ ID NO: 32]
    2/17
    Obr. 2
    Asp Ala His Lys 5 Ser Glu Val Ala His 10 Arg Phe Lys Asp Leu 15 Gly Glu Glu Asn Phe 20 Lys Ala Leu Val Leu 25 Ile Ala Phe Ala Gin 30 Tyr Leu Gin Gin Cys 35 Pro Phe Glu Asp His 40 Val Lys Leu Val Asn 45 Glu Val Thr Glu Phe 50 Ala Lys Thr Cys Val 55 Ala Asp Glu Ser Ala 60 Glu Asn Cys Asp Lys 65 Ser Leu His Thr Leu 70 Phe Gly Asp Lys Leu 75 Cys. Thr Val Ala Thr 80 Leu Arg Glu Thr Tyr 85 Gly Glu Met Ala Asp 90 Cys Cys Ala Lys Gin 95 Glu Pro Glu Arg Asn 100 Glu Cys Phe Leu Gin 105 His Lys Asp Asp Asn 110 Pro Asn Leu Pro Arg 115 Leu Val Arg Pro Glu 120 Val Asp val Met Cys 125 Thr Ala Phe His Asp 130 Asn Glu Glu Thr Phe 135 Leu Lys Lys Tyr Leu 140 Tyr Glu Ile Ala Arg 145 Arg His Pro Tyr Phe 150 Tyr Ala Pro Glu Leu 155 Leu Phe Phe Ala Lys 160 Arg Tyr Lys Ala Ala 165 Phe Thr Glu Cys Cys 170 Gin Ala Ala Asp Lys 175 Ala Ala Cys Leu Leu 180 Pro Lys Leu Asp Glu 185 Leu Arg Asp Glu Gly 190 Lys Ala Ser Ser Ala 195 Lys Gin Arg Leu Lys 200 Cys Ala Ser Leu Gin 205 Lys Phe Gly Glu Arg 210 Ala Phe Lys Ala Trp 215 Ala Val Ala Arg Leu 220 Ser Gin Arg Phe Pro 225 Lys Ala Glu Phe Ala 230 Glu Val Ser Lys Leu 235 Val Thr Asp Leu Thr 240 Lys Val His Thr Glu 245 Cys Cys His Gly Asp 250 Leu Leu Glu Cys Ala 255 Asp Asp Arg Ala Asp 260 Leu Ala Lys Tyr Ile 265 Cys Glu Asn Gin Asp 270 Ser Ile Ser Ser Lys 275 Leu Lys Glu Cys Cys 280 Glu Lys Pro Leu Leu 285 Glu Lys Ser His Cys 290 Ile Ala Glu Val Glu 295 Asn Asp Glu Met Pro 300 Ala Asp Leu Pro Ser 305 Leu Ala Ala Asp Phe 310 Val Glu Ser Lys Asp 315 Val Cys Lys Asn Tyr 320 Ala Glu Ala Lys Asp 325 Val Phe Leu Gly Met 330 Phe Leu Tyr Glu Tyr 335 Ala Arg Arg His Pro 340 Asp Tyr Ser Val Val 345 Leu Leu Leu Arg Leu 350 Ala Lys Thr Tyr Glu 355 Thr Thr Leu Glu Lys 360 Cys Cys Ala Ala Ala 365 Asp Pro His Glu Cys 370 Tyr Ala Lys Val 375 Phe Asp Glu Phe Lys Pro 380 Leu Val Glu Glu Pro 385 Gin Asn Leu Ile Lys 390 Gin Asn Cys Glu Leu 395 Phe Glu Asn Leu Gly 400 Glu Tyr Lys Phe Gin 405 Asn Ala Leu Leu Val 410 Arg Tyr Thr Lys Lys 415 Val Pro Gin Val Ser 420 Thr Pro Thr Leu Val 425 Glu Val Ser Arg Asn 430 Leu Gly Lys Val Gly 435 Ser Lys Cys Cys Lys 440 His Pro Glu Ala Lys 445 Arg Met Pro Cys Ala 450 Glu Asp Tyr Leu Ser 455 Val Val Leu Asn Gin 460 Leu Cys Val Leu His 465 Glu Lys Thr Pro Val 470 Ser Asp Arg Val Thr 475 Lys Cys Cys Thr Glu 480 Ser Leu Val Asn Arg 485 Arg Pro
    ·**· .♦* «· <: : · : :
    3/17
    Obr.
  2. 2 pokračování
    490 495 500 Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 505 510 515 520 Glu Thr Phe Thr Phé His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin 525 530 535 540 Ile Lys Lys Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lýs Ala Thr 545 550 555 l>ys Glu Gin Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys 560 565 570 575 Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 580 585 Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu
    [SEQ ID NO: 34] ♦ 4· ····· • ·· » · «4 · - · · * ·· «4 .· · · · · ·
    Obr. 3
    A.
    Β.
    t
    ·· · ·
    5/17
    Obr. 4
    6/17
    Obr. 5 * * · ♦ · · · •π Nhet
    CMV promotér £co47lll
    Fc full hinge Xbá BGHpA pMB1 ori
    SV40 Ori y Ori ?
    SNA
    Ί/Ί.Ί
    Obr. 6
    Tfi Ί ί/ΓΆ —Α (η CPt
    8/17
    Obr. 7 i
    ·· · • · · ·· ·
    9/17
    Obr. 8 • · 4 • · 1 ► ·· · · • * • · · • ····
    X
    A
    -P
    O ΰ
    Ό
    CD
    Sf-( a > Ή -J-) fO Γ—í CD ft —ZÉ Exendin-4 Exendin-4 :··>-~ί V8GLP-1 '/r—ři, Exendin-4-L-HSA 'b Exendin-4-HSA V8GLP-FC ' Y ‘i·;., V8GLP-L-HSA
    Peptid [mmol] i“ —I
    100 • · ·
    10/17
    Obr. 9
    • · ♦ * · • · · · ·
    Koncentrace [mmol] ·· ·* ·· · • · · « · · • · · · · · * · * · «»··· • · 9 9 9
    99 9999 99 9
    99 9
    11/17
    Obr. 10
    A.
    proteinů 2 hodiny před nastavením svorky o
    Glukóza v plazmě (mg/dl) ·· · · ·· ·· —* ·· · • · · • · · · • · · · · ·
    12/17
    Obr. 10
    B.
    Rychlost infuze glukózy (mg/kg/min) proteinů 2 hodiny před nastavením svorky
    Glukóza v plazmě (mg/dl)
    13/17
    Ύϋ'ί/’νΊ-/!
    .··. .··..··. .··.;
    • ·· ··
    ·..· · · · . · · ·
    Obr. 11
    A.
    Čas od počátku nastavení svorky (min), injekce fúzních proteinů 2 hodiny před nastavením svorky
    14/17 . .. ΛνιοίΓΝ'Ιόθν · · ··.··· ·· · • Z r · ? ···
    Obr. 11
    Β.
    Cas od počátku nastavení svorky (min), injekce fúzních proteinů 2 hodiny před nastavením svorky ί\6σν ·· ·· ·· · jí·· « ..
    jí · · · · · í í « · · ···· • · · · · · ·· ···· ·· t
    15/17
    Obr. 12
    GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACC
    TGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCČCCCAAAACCCAAGG
    100
    ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGAC
    150
    GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT
    200
    GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA
    250
    CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAT
    300
    GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT
    350
    CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT
    400
    ACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG
    450
    ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGA
    500
    GAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
    550
    ACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC
    600
    AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT
    650
    GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAT
    700
    AGT [SEQ ID NO: 33]
    16/17
    Obr. I-3
    GATGCGCACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGA 50
    AAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGT
    100
    GTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCA 150 '
    AAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCA
    200
    TACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCT
    250
    ATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAA
    300
    TGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAG
    350
    ACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACAT
    400
    TTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTAT
    450
    GCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGA
    500
    ATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATG
    550
    AACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGT
    600
    GCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGC
    650
    TCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGT
    700
    TAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTG
    750
    CTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAA
    800
    TCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGT
    850
    TGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCT
    900
    GACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAA
    950
    AAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAAT
    1000
    ATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCC
    17/17 ?d ·· ' ·· • · ·· *··· • · • · · • ···« • ·
    Obr. 13 pokračování
    1050
    AAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCA
    1100
    TGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGC
    1150
    CTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAG
    1200
    TACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCA
    1250
    AGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGG
    1300
    GCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAA
    1350
    GACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAAC
    1400
    GCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACA
    1450
    GGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAA
    1500
    GAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTC
    1550
    TGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGA
    1600
    AACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGAT
    1650
    TTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTG
    1700
    CTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAG
    1750
    GCTTATAATGAC [SEQ XD NO: 35] « .··. ·♦ ·*^ WH • ·· ! ;* ; ··· ·· ··· · . .· ··· ··· ·*.······
    ........... ·..· .·
    Přehled sekvenci <110> Eli Lilly and Company <120> GLP-1 FÚZNÍ PROTEINY <130> X-13991 <150> US 60/251,954 <151> 2000-06-12 <160> 35 <170> Verze patentu 3.1 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
    His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gin Ala. Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30
    <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> syntetický konstrukt <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (2) . . (2) <223> Xaa na pozici 2 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, val, • ·« 4 «
    • ·· ·
    0 0 · · 0 • · 0 0
    Glu, Asp nebo Lys;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY
    <222> <223> (3) . . (3) Xaa na pozici 3 je Glu, Asp nebo Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (5) . . (5) <223> Xaa na pozici 5 je Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, val, Glu, Asp nebo Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (8) . . (8) <223> Xaa na pozici 8 je Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, vat, Glu, Asp nebo Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (10)..(10) <223> Xaa na pozici 10 je val , Ala, Gly, ser, Thr, Leu , Ile, Tyr, Glu, Asp nebo Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (11)..(11) <223> Xaa na pozici 11 je Ser , Ala, Gly, Thr, Leu, Ile , val, Glu f Asp nebo Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (12) . . (12) <223> Xaa na pozici 12 j e Ser , Ala, Gly, Thr, Leu, Ile , val, Glu, Asp, : Lys, Trp nebo Tyr Z
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (13)..(13) • 4
    Phe, Trp, G7u, Asp, Gin nebo Lys;
    4 4
    4 4 ··· 44
    4 4 4 ·· 4444
    <223> Xaa na pozici 13 je Tyr, <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (14) . . (14) <223> Xaa na pozici 14 je Leu, Asp, Met, Lys, Trp i nebo • Tyr; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (15) . . (15) <223> Xaa na pozici 15 je Glu, <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (16) . . (16) <223> Xaa na pozici 16 je Gly,
    Asp, Trp nebo Lys;
    Asp nebo Lys;
    Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, val, Glu,
    Ala, ser, Thr, Leu, Ile, val, Glu,
    <220> ZNAKY (17) je Gin f <221> <222> <223> RŮZNÉ (17) . . Xaa na pozici 17 <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (18) . . (18) <223> Xaa na pozici 18 je Ala,
    Glu, Asp nebo Lys;
    Asn, Arg, Glu, Asp nebo Lys;
    Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, val, Arg,
    <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (19) . . (19) <223> Xaa na pozici 19 je Ala,
    Asp nebo Lys;
    Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (20)..(20)
    • 9 • • · 9 9 9 • · • · ♦ · • · · » · · · • · · • · · · · · • · * · • · · • · « · 9 • · • · · · • • 4 <223> Xaa na pozici 20 je Lys, Arg, Gin f Gin, Asp nebo His; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (21) . . (21) <223> Xaa na pozici 21 je Leu, Glu, Asp nebo Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (24) . . (24) <223> Xaa na pozici 24 je Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (25) . . (25) <223> Xaa na pozici 25 je Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp nebo Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (26) . . (26) <223> Xaa na pozici 26 je Leu, Gly, Ala, ser, Thr, Ile, val, Glu, Asp nebo Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (27) . . (27) <223> Xaa na pozici 27 je Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp nebo Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (28) . . (28) <223> Xaa na pozici 28 je Asn, Lys, Arg, Glu, Asp nebo His; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (29) . . (29) <223> Xaa na pozici 29 je Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp nebo Lys;
    • · · · • · • · · · • · • ·· ♦ · · • · · • · · · ·
    <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (30) . . (30) <223> Xaa na pozici 30 je Gly, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (31) . . (31) <223> Xaa na pozici 31 je Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile,
    Glu,
    Asp nebo Lys nebo chybí;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222>
    <223> chybí; Xaa na pozici 32 je Ser, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His nebo <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (33) . . (33) <223> Xaa na pozici 33 je Ser, Arg, Lys, Glu, Asp nebo His nebo chybí; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (34) . . (34) <223> Xaa na pozici 34 je Gly, Asp, Glu nebo Lys nebo chybí; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (35) . . (35) <223> Xaa na pozici 35 je Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, , Asp nebo Lys
    nebo chybí;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (36)..(36) <223> Xaa na pozici 36 je Ser, Pro, Lys, Glu nebo Asp nebo chybí;
    • 4 • ·· <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (37)..(37) <223> Xaa na pozici 37 je Ser, Pro, Glu, Asp nebo Lys nebo chybí;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (38) . . (38) <223> Xaa na pozici 38 je Gly, Pro, Glu, Asp nebo Lys nebo chybí;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (39)..(39) <223> Xaa na pozici 39 je Ala, Ser, val, Glu, Asp nebo Lys nebo chybí ;
    <400> 2
    His Xaa Xaa Gly Xaa Phe Thr Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15
    Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    20 25 30
    Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> syntetický konstrukt <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (1)..(1) <223> Xaa na pozici 1 je L-histidin, D-histidin nebo chybí.
    • · • ·· · · · «
    ........• · · · · »·· ·« ·· <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (2) . . (2) <223> Xaa na pozici 2 <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (3) . . ( 3) <223> Xaa na pozici 3 nebo His ; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (5)..( 5) <223> Xaa na pozici 5 <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (6) · · (6) <223> Xaa na pozicí 6 <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (10) . . (10) <223> Xaa na pozici 10 Tyr, Glu nebo Ala; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (12) . . (12) <223> Xaa na pozici 12 Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (13) . . (13) <223> Xaa na pozici 13 Arg nebo Cys;
    <220>
    • · · · <221>
    <222>
    <223>
    <220>
    <221>
    <222>
    <223>
    <220>
    <221>
    <222>
    <223>
    <220>
    <221>
    <222>
    <223>
    <220>
    <221>
    <222>
    <223>
    <220>
    <221>
    <222>
    <223>
    <220>
    <221>
    <222>
    <223>
    <220>
    <221>
    <222>
    <223>
    RŮZNÉ ZNAKY (17)..(17)
    Xaa na pozici 17 je His, Asp, Lys, Glu, Gin nebo Arg;
    RŮZNÉ ZNAKY (18)..(18)
    Xaa na pozici 18 je Glu, Arg, Ala nebo Lys;
    RŮZNÉ ZNAKY (20) . . (20)
    Xaa na pozici 20 je Trp, Tyr, Phe, Asp, Lys, Glu nebo His
    RŮZNÉ ZNAKY (21)..(21)
    Xaa na pozici 21 je Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg nebo Lys;
    RŮZNÉ ZNAKY (24) . . (24)
    Xaa na pozici 24 je Ala, Glu, Asp, Ser nebo His;
    RŮZNÉ ZNAKY (25) .. (25)
    Xaa na pozici 25 je Asp, Glu, Ser, Thr, Arg, Trp nebo Lys
    RŮZNÉ ZNAKY (27) . . (27)
    Xaa na pozici 27 je Asp, Arg, val, Lys, Ala, Gly nebo Glu
    RŮZNÉ ZNAKY (28) . . (28)
    Xaa na pozici 28 je Glu, Lys nebo Asp;
    <220>
    • · • · » « ► « • · • · • · 4 • ··<
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (29)..(29) <223> Xaa na pozici 29 je Thr, ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His nebo Glu;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (30)..(30) <223> Xaa na pozici 30 je Thr, Ser, Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg, Glu nebo His;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (31)..(31) <223> Xaa na pozici 31 je Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His,Gly nebo chybí.
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (32) . . (32) <223> Xaa na pozici 31 je Pro nebo chybí.
    <400> 3
    Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Leu Glu Gly 15 10 15
    Xaa Xaa Ala
    Xaa Xaa
    Phe Ile Xaa Xaa
    Leu Xaa Xaa
    Xaa Xaa Xaa Xaa <210> 4 <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> syntetický konstrukt <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (1) .. (1) <223> Xaa na pozici 1 je L-histidin, D-histidin nebo chybí.
    • · • · <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (2) . . (2) <223> Xaa na pozici 2 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr;
    <220>
    <222> RŮZNÉ ZNAKY <222> (5)...(5) <223> Xaa na pozici 5 je Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys nebo His;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (6)..(6) <223> Xaa na pozici 6 je His, Trp, Phe nebo Tyr;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (10) . . (10)
    <223> Xaa na pozici 10 je Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu nebo Ala; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (16) . . (16) <223> Xaa na pozici 16 je Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Cys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (17) . . (17) <223> Xaa na pozici 17 je His, Asp, Lys, Glu nebo Gin; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (18) . . (18) <223> Xaa na pozici 18 je GTu, His, Ala nebo Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (19) · · (19) <223> Xaa na pozici 19 je Asp, Lys, Glu nebo His;
    • · · · <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (21) . . (21) <223> Xaa na pozici
    Lys ;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (24)..(24) <223> Xaa na pozici <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (27) .. (27) <223> Xaa na pozici <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (28)..(28) <223> Xaa na pozici <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (29)..(29) <223> Xaa na pozici Gly, Pro, His nebo <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (30)..(30) <223> Xaa na pozici <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (31)..(31) <223> Xaa na pozici Phe, His, Gly nebo
    21 je Ala, Glu, His,
    24 je Ala, Glu, Asp,
    27 je Asp, Arg, Val,
    28 je Glu, Lys nebo
    29 je Thr, Ser, Lys, Glu;
    30 je Arg, Glu nebo
    31 je Lys, Arg, Thr, chybí.
    Phe, Tyr, Trp, Arg nebo
    Ser nebo His;
    Lys, Ala, Gly nebo Glu
    Asp;
    Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp
    His;
    Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY • · · ·· ··· * w · • · · · • · · · · · • · · ·· · <222> (32)..(32) <223> Xaa na pozici 32 je Pro nebo chybí.
    <400> 4
    Xaa Xaa Glu Gly Xaa Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa 1 5 10 15
    Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30
    <210> 5 <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence
    <220>
    <223> syntetický konstrukt <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (1)..(1) <223> Xaa na pozici 1 je L-histidin, D-histidin nebo chybí.
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (2) . . (2) <223> Xaa na pozici 2 je Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met nebo Thr;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (6)..(6) <223> Xaa na pozici 6 je His, Trp, Phe nebo Tyr;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (10) . . (10) <223> Xaa na pozici 10 je Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu nebo Ala;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY • · · · • ·· <222> (16)..(16) <223> Xaa na pozici 16 je Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Cys ;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (17)..(17) <223> Xaa na pozici 17 je His, Asp, Lys, Glu nebo Gin;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (20)..(20) <223> Xaa na pozici 20 je Asp, Lys, Glu nebo His;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (24) . . (24) <223> Xaa na pozici 24 je Ala, Glu, Asp, Ser nebo His;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (29)..(29) <223> Xaa na pozici 29 je Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His nebo Glu;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (31)..(31) <223> Xaa na pozici 31 je Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly nebo chybí.
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (32)..(32) <223> Xaa na pozici 32 je Pro nebo chybí.
    <400> 5
    Xaa Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa 15 10 15 • · ·
    Xaa Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Xaa Trp Leu val Lys Xaa Arg Xaa Xaa 20 25 30 <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> syntetický konstrukt <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (1)..(1) <223> Xaa na pozici 1 je L-histidin, D-histidin nebo chybí.
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (2)..(2)
    <223> Xaa na pozici 2 je ' Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (16) . . (16) <223> Xaa na pozici 16 je Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg nebo Cys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (17) · · (17) <223> Xaa na pozici 17 je His, Asp, Lys, Glu nebo Gin; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (18) . . (18) <223> Xaa na pozici 18 je Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg nebo Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (24) . . (24) <223> Xaa na pozici 24 je Al a, Glu, Asp, Ser nebo His;
    * • ·· <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (31)..(31) <223> Xaa na pozici 31 je Lys, Arg , Thr, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro nebo <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (32) .. (32) <223> Xaa na pozici 32 je Pro nebo chybí.
    <400> 6
    Ser, Glu, Asp, Trp, chybí.
    Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr ser Asp Val 10 Ser Ser Tyr Leu Glu 15 Xaa 1 5 Xaa Xaa Ala Lys Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa Xaa 20 25 30 <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> syntetický konstrukt
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (1) .. (1) <223> Xaa na pozici 1 je L-histidin, D-histidin nebo chybí.
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (2)..(2) <223> Xaa na pozici 2 je Ala, Gly, Val, Thr, Ile, a alfa-methyl-Ala;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (15) . . (15) • 0· 0 • 0 0 0 0 >00 0 000 00
    0000
    0 0 0 0 0000 0 0
    <22 3> Xaa na pozici 15 je Glu, Gin, Ala, Thr, Ser a Gly; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (21) . . (21) <223> Xaa na pozici 21 je Glu, Gin, Ala, Thr, Ser a Gly; <400> 7 Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Xaa 1 5 10 15 Gin Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Ala Trp Leu val Lys Gly Arg Gly 20 25 30
    <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> syntetický konstrukt <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (19) . . (19) <223> Xaa na pozici 19 je Lys nebo Arg;
    <220>
    <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> ACETYLACE <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (30) . . (30) <223> Xaa na pozici 30 je Gly;
    <220>
    <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDACE <400> 8
    Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Seř Ser Tyr Leu Glu Gly Gin 1 5 10 15
    Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa 20 25 30 <210> 9 <211> 39 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> syntetický konstrukt <400> 9
    His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu 15 10 15
    Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30
    Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 10 <211> 39 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> syntetický konstrukt <400> 10
    His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu 15 10 15
    Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 • ·
    Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 11 <211> 39 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> syntetický konstrukt <224>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (1) . . (1) <223> Xaa na pozici 1 je L-histidin, D-histidin nebo chybí.
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (2) .. (2) <223> Xaa na pozici 2 je Gly, Ala nebo Val;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (10)..(10)
    <223> Xaa na pozici 10 je Leu nebo Val; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (12) . • (12) <223> Xaa na pozici 12 je Lys nebo Ser; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (13) . . (13) <223> Xaa na pozici 13 je Gin nebo Tyr; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (14) . . (14) <223> Xaa na pozici 14 je Met nebo Leu;
    <220>
    • · ·
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (16) . . (16) <223> Xaa na pozici 16 je Glu nebo Gin; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (17) . . (17) <223> Xaa na pozici 17 je Glu nebo Gin; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (19) . . (19) <223> Xaa na pozici 19 je Val nebo Ala; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (20) . . (20) <223> Xaa na pozici 20 je Arg nebo Lys ; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (21) . . (21) <223> Xaa na pozici 21 je Leu nebo Glu; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (24) . . (24) <223> Xaa na pozici 24 je Glu nebo Ala; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (27) . • (27) <223> Xaa na pozici 27 je Val nebo Lys; <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (28) . . (28) <223> Xaa na pozici 28 je Asn nebo Lys;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (30)..(30) <223> Xaa na pozici 30 je Gly nebo Arg; a • 4 44 • · · ·
    44 · ·
    4 4 4 4 4 ♦
    4 4 4 4 4 • 44 44 ♦··· <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (31)..(31) <Z23> Xaa na pozici 31 je Gly nebo Pro;
    <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (32) . . (32) <223> Xaa na pozici 32 je Ser nebo chybí <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (33) . . (33) <223> Xaa na pozici 33 je Ser nebo chybí <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <2Z2> (34) . . (34) <223> Xaa na pozici 34 je Gly nebo chybí <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (35) . . (35) <223> Xaa na pozici 35 je Ala nebo chybí <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (36).. (36) <223> Xaa na pozici 36 je Pro nebo chybí <220> <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (37) . . (37) <223> Xaa na pozici 37 je Pro nebo chybí
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (38) .. (38) • · β · ·· · • · · ·· · • · · · • · · • ·♦ 1 • * · · · • ·····« • · · · » ··· · 9· <223> Xaa na pozici 38 je Pro nebo chybí.
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (39)..(39) <223> Xaa na pozici 39 je Pro nebo chybí.
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (39)..(39) <223> Xaa na pozici 39 je Ser nebo chybí.
    <400> 11
    Xaa Xaa Glu Glu Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 15 10 15
    Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa 20 25 30
    Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> syntetický konstrukt <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (1)..(1) <223> Xaa na pozici 1 je L-histidin, D-histidin nebo chybí.
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (2)..(2) <223> Xaa na pozici 2 je Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser nebo Thr;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY ···· <222> (6)..(6) <223> Xaa na pozici 6 je
    Phe, Trp nebo Tyr;
    ·-» <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (10)..(10) <223> Xaa na pozici 10 je Val, Trp, Tle, Leu, Phe nebo Tyr;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (12) . . (12) <223> Xaa na pozici 12 je Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu, Val;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (13) . . (13) <223> Xaa na pozici 13 je Tyr, Trp nebo Phe;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (14)..(14) <223> Xaa na pozici 14 je Leu, Phe, Tyr nebo Trp;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (16)..(16) <223> Xaa na pozici 16 je Gly, Glu, Asp nebo Lys;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (19)..(19) <223> Xaa na pozici 19 je Ala, Val, Ile nebo Leu;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (21)..(21) <223> Xaa na pozici 21 je Glu, Ile nebo Ala;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (24) .. (24) • · · • · · <223> Xaa na pozici 24 je Ala nebo Glu;
    <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (27) . . (27) <223> Xaa na pozici 27 je Val nebo Ile; a <220>
    <221> MOD_RES <222> (30.. (30) <223> AMIDACE <220>
    <221> RŮZNÉ ZNAKY <222> (31) . . (31) <223> Xaa na pozici 31 je Gly, His nebo chybí.
    <400> 12
    Xaa Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 1 5 10 15
    Gin Ala Xaa Lys
    Xaa Phe Ile Xaa Trp
    Leu Xaa Lys
    Gly Arg Xaa <210> 13 • · · • · · · • · • · <211> 616 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> Syntetický konstrukt <400> 13
    His 1 Val Glu Gly Thr Phe Thr ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 15 Gly 5 10 Gin Ala Ala Lys 20 Glu Phe ile Ala Trp 25 Leu Val Lys Gly Arg 30 Gly Asp Ala His Lys Ser Glu val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu. Glu 35 40 45 Asn Phe Lys Ala Leu val Leu Ile Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin 50 55 60 cys pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu val Thr Glu Phe 65 70 75 80 Ala Lys Thr cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn cys Asp Lys Ser 85 90 95 Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu cys Thr val Ala Thr Leu Arg 100 105 110 Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala ASp Cys Cys Ala Lys Gin Glu Pro Glu 115 120 125 Arg Asn Glu cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro 130 135 140 Arg Leu Val Arg Pro Glu val Asp val Met Cys Thr Ala Phe His Asp 145 150 155 160 Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu ile Ala Arg Arg 165 170 175 Hi S Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr 180 185 190 Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys cys Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala cys 195 200 205 Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser 210 215 220
    ·* ·
    25 Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg 225 230 235 240 Ala phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys 245 250 255 Ala Glu Phe Ala Glu val Ser Lys Leu val Thr Asp Leu Thr Lys val 260 265 270 His Thr Glu Cys cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg 275 280 285 Ala ASp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gin Asp Ser Ile Ser Ser 290 295 300 Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His cys 305 310 315 320 Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu pro Ser Leu 325 330 335 Ala Ala Asp Phe val Glu Ser Lys Asp val cys Lys Asn Tyr Ala Glu 340 345 350 Ala Lys ASp val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg 355 360 365 Hi s pro ASp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr 370 375 380 Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala ASP Pro His Glu Cys 385 390 395 400 Tyr Ala Lys val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gin 405 410 415 Asn Leu ile Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr 420 425 430 Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gin 435 440 445 val ser Thr Pro Thr Leu val Glu Val ser Arg Asn Leu Gly Lys val 450 455 460 Gly Ser Lys cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala 465 470 475 480 Glu Asp Tyr Leu Ser val Val Leu Asn Gin Leu cys Val Leu His Glu 485 490 495
    • * • · * • ···
    Lys Thr Pro val 500 Ser Asp Arg val Thr 505 Lys cys Cys Thr Glu 510 ser Leu val Asn Arg Arg Pro cys Phe ser Ala Leu Glu val Asp Glu Thr Tyr 515 520 525 val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile 530 535 540 cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin Ile Lys Lys Gin Thr Ala Leu 545 550 555 560 Val Glu Leu Val Lys HIS Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gin Leu Lys 565 570 575 Ala val Met ASp Asp Phe Ala Ala Phe val Glu Lys Cys cys Lys Ala 580 585 590 Asp Asp Lys Glu Thr cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu val Ala 595 600 605 Ala ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu
    610 615 <210> 14
    <211> ' 631 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> <223> Syntetický konstrukt <400> 14 His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp val Ser ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Asp Ala 35 40 45 His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn 50 55 60 Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin cys 65 70 75 80
    η • 4
    Pro Phe Glu ASp His 85 Val Lys Leu val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala 90 95 Lys Thr cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lýs ser Leu 100 105 110 His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr val Ala Thr Leu Arg Glu 115 120 125 Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gin Glu pro Glu Arg 130 135 140 Asn Glu Cys Phe Leu Gin HÍS Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg 145 150 155 160 Leu Val Arg Pro Glu val ASp val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn 165 170 175 Glu Glu Thr phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu ile Ala Arg Arg His 180 185 190 Pro Tyr Phe 195 Tyr Ala Pro Glu Leu 200 Leu Phe Phe Ala Lys 205 Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys cys Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala cys Leu 210 215 220 Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala ser Ser Ala 225 230 235 240 Lys Gin Arg Leu Lys cys Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala 245 250 255 Phe Lys Ala Trp Ala val Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala 260 265 270 Glu Phe Ala Glu val ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His 275 280 285 Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp ASP Arg Ala 290 295 300 Asp Leu Ala Lys Tyr Ile cys Glu Asn Gin Asp ser Ile ser Ser Lys 305 310 315 320 Leu Lys Glu cys cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His cys Ile 325 330 335 Ala Glu val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu pro ser Leu Ala 340 345 350
    • * o
    Ala asd phe val Glu Ser Lys Asp val 360 Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala 365 355 Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His 370 375 380 Pro ASp Tyr Ser Val val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu 385 390 395 400 Thr Thr Leu Glu Lys cys Cys Ala Ala Ala Asp pro His Glu cys Tyr 405 410 415 Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gin Asn 420 425 430 Leu Ile Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys 435 440 445 Phe Gin Asn Ala Leu Leu val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gin val 450 455 460 ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys val Gly 465 470 475 480 ser Lys cys cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro cys Ala Glu 485 490 495 Asp Tyr Leu Ser val Val Leu Asn Gin Leu cys Val Leu HÍS Glu Lys 500 505 510 Thr Pro Val Ser Asp Arg val Thr Lys Cys cys Thr Glu Ser Leu val 515 520 525 Asn Arg Arg Pro cys Phe ser Ala Leu Glu val Asp Glu Thr Tyr val 530 535 540 pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile cys 545 550 555 560 Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin Ile Lys Lys Gin Thr Ala Leu val 565 570 575 Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gin Leu Lys Ala 580 585 590 Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe val Glu Lys cys Cys Lys Ala Asp 595 600 605
    Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu val Ala Ala 610 615 620 • ·
    Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 625 630 <210> 15 <211> 640 <212> PRT <213> Uměl á sekvence <220> <223> Syntetický konstrukt <400> 15 His 1 Gly Glu Gly Thr 5 Phe Thr Ser Asp Val 10 Ser Ser Tyr Leu Glu 15 Glu Gin Ala Ala Lys Glu Phe ile Ala Trp Leu val Lys Gly Arg Gly ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro pro Ser Gly. Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu val Ala His 50 55 60 Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu val Leu Ile 65 70 75 80 Al a Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin cys Pro Phe Glu Asp His val Lys 85 90 95 Leu Val Asn Glu val Thr Glu Phe Ala Lys Thr cys Val Ala Asp Glu 100 105 110 Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly ASp Lys 115 120 125 Leu Cys Thr 130 Val Ala Thr Leu 135 Arg Glu Thr Tyr Gly 140 Glu Met Ala 1 Asp Cys Cys Ala Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin HIS 145 150 155 160 Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu val Arg Pro Glu Val Asp 165 170 175 val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys 180 185 190
    Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu 195 200 205 Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu cys Cys 210 215 220 Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu 225 230 235 240 Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys cys Ala 245 250 255 ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala val Ala 260 265 270 Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu val Ser Lys 275 280 285 Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys cys His Gly ASp 290 295 300 Leu Leu Glu cys Ala Asp ASp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr ile cys 305 310 315 320 Glu Asn Gin Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu cys cys Glu Lys 325 330 335 pro Leu Leu Glu Lys Ser His cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp GlU 340 345 350 Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe val Glu Ser Lys 355 360 365 Asp Val cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp val Phe Leu Gly Met 370 375 380 phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser val Val Leu 385 390 395 400 Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys 405 410 415 Ala Ala Ala ASp Pro His Glu cys Tyr Ala Lys val Phe Asp Glu Phe 420 425 430 Lys pro Leu Val Glu Glu Pro Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn cys Glu 435 440 445 Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu val 450 455 460
    0 *
    Arg Tyr Thr Lys Lys val Pro Gin val Ser Thr Pro Thr Leu val Glu 465 470 475 480 Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys cys Lys His Pro 485 490 495 Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu ser Val Val Leu 500 505 510 Asn Gin Leu cys val Leu His Glu Lys Thr Pro val Ser Asp Arg Val 515 520 525 Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu va.l Asn Arg Arg Pro cys Phe Ser 530 535 540 Ala Leu Glu val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu phe Asn Ala Glu 545 550 555 560 Thr Phe Thr Phe His Ala ASP Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg 565 570 575 Gin Ile Lys Lys Gin Thr Ala Leu val Glu Leu Val Lys His Lys Pro 580 585 590 Lys Ala Thr Lys Glu Gin Leu Lys Ala Val Met Asp ASp Phe Ala Ala 595 600 605 Phe val Glu Lys cys cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr cys Phe Ala 610 615 620 Glu Glu Gly Lys Lys Leu val Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 625 630 635 640
    <210> 16 <211> 624 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> Syntetický konstrukt <400> 16
    His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu ser uys Gin Met Glu Glu 15 10 15
    Glu Ala val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 i
    Ser Gly Ala Pro 35 Pro Pro Ser Asp Ala 40 His Lys Ser Glu 45 val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu ile 50 55 60 Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin cys Pro Phe Glu Asp His val Lys 65 70 75 80 Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr cys val Ala ASp Glu 85 90 95 Ser Ala Glu Asn cys Asp Lys Ser Leu HiS Thr Leu Phe Gly Asp Lys 100 105 110 Leu cys Thr val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala ASp 115 120 125 Cys cys Ala Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu cys Phe Leu Gin HÍS 130 135 140 Lys ASp Asp Asn pro Asn Leu Pro Arg Leu val Arg pro Glu val ASP 145 150 155 160 Val Met cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys 165 170 175 Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg Hi s Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu 180 185 190 Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu cys Cys 195 200 205 Gin Ala 210 Ala Asp Lys Ala Ala 215 cys Leu Leu Pro Lys 220 Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys cys Ala 225 230 235 240 Ser Leu Gin Lys phe Gly GlU Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala val Ala 245 250 255 Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu val Ser Lys 260 265 270 Leu val Thr ASp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys Hi s Gly Asp 275 280 285
    Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile cys 290 295 300 ·«
    Glu Asn Gin Asp ser ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys 315 cys Glu Lys 320 305 310 Pro Leu Leu Glu Lys Ser Hi s Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu 325 330 335 Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe val Glu Ser Lys 340 345 350 Asp val cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp val Phe Leu Gly Met 355 360 365 Phe Leu Tyr GlU Tyr Ala Arg Arg HÍS Pro Asp Tyr Ser Val val Leu 370 375 380 Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys cys cys 385 390 395 400 Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe 405 410 415 Lys pro Leu val Glu Glu Pro Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn cys Glu 420 425 430 Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu val 435 440 445 Arg Tyr Thr Lys Lys val Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu val Glu 450 455 460 val Ser Arg Asn Leu Gly Lys val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro 465 470 475 480 Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val val Leu 485 490 495 Asn Gin Leu cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val 500 505 510 Thr Lys Cys Cys Thr Glu ser Leu val Asn Arg Arg Pro cys Phe Ser 515 520 525 Ala Leu Glu val Asp Glu Thr Tyr val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu 530 535 540 Thr Phe Thr phe His Ala Asp Ile cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg 545 550 555 560 Gin Ile Lys Lys Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro
    565 570 575
    610
    34 >1 • Thr Lys Glu Gin Leu Lys Ala Val Met Asp ASp phe Ala Ala 580 585 590 Glu Lys cys Cys Lys Ala ASP Asp Lys Glu Thr cys Phe Ala 595 600 605 Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu
    615
    620 • ··· • · <210> 17 <211> 640 <212> PRT <213> Umělá sekvence <22O>
    <223>
    Syntetický konstrukt <400> 17
    His 1 Gly Glu Gly Thr 5 Phe Thr ser Asp Leu Ser Lys Gin 10 Met Glu 15 Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala 35 Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly 40 Ser 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser ASp Ala His Lys Ser Glu val Ala His 50 55 60 Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu val Leu Ile 65 70 75 80 Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin cys Pro Phe Glu ASp His Val Lys 85 90 95 Leu val Asn Glu val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu 100 105 110 ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys 115 120 125 Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp 130 135 140 cys Cys Ala tys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu cys Phe Leu Gin HÍS 145 150 155 160
    • 0 0
    Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu val Arg Pro 170 Glu val 175 Asp 165 val Met cys Thr Ala Phe HÍS •Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys 180 185 190 Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala ΡΓΟ Glu 195 200 205 Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu cys cys 210 215 220 Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu 225 230 235 240 Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys cys Ala 245 250 255 Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala 260 265 270 Arg Leu ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu val Ser Lys 275 280 285 Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu cys Cys His Gly ASp 290 295 300 Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile cys 305 310 315 320 Glu Asn Gin Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu cys cys Glu Lys 325 330 335 Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu val Glu Α5Π Asp Glu 340 345 350 Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val GlU Ser Lys 355 360 365 Asp val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp val Phe Leu Gly Met 370 375 380 Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg Hi s •Pro Asp Tyr Ser val val Leu 385 390 395 400 Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys cys cys 405 410 415 Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe ASp Glu Phe 420 425 430
    Lys Pro Leu val GlU Glu Pro Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn Cys Glu 435 440 445 Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu val 450 455 460 Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu val Glu 465 470 475 480 Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys val Gly ser Lys cys cys Lys His Pro 485 490 495 Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser val val Leu 500 505 510 Asn Gin Leu cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro val Ser ASp Arg Val 515 520 525 Thr Lys cys cys Thr Glu ser Leu Val Asn Arg Arg Pro cys Phe Ser 530 535 540 Ala Leu Glu val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu 545 550 555 560 Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg 565 570 575 Gin Ile Lys Lys Gin Thr Ala Leu val Glu Leu val Lys His Lys Pro 580 585 590 Lys Ala Thr Lys Glu Gin Leu Lys Ala val Met Asp Asp Phe Ala Ala 595 600 605 Phe Val Glu Lys cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr cys Phe Ala 610 615 620 Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu
    625 630 635 640 <210> 18 <211> 264 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> Syntetický konstrukt • · • · <400> 18
    HIS 1 Val Glu Gly Thr 5 Phe Thr Ser Asp val ser ser 10 Tyr Leu Glu 15 Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe ile Ala Trp Leu val Lys Gly Arg Gly Ala 20 25 30 Glu Pro Lys ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro cys Pro Ala 35 40 45 Pro Glu Leu Leu Gly Gly pro ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 50 55 60 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys val val 65 70 75 80 Val Asp val ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr val 85 90 95 Asp Gly Val Glu Val Hi S Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 100 105 110 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 115 120 125 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys val Ser Asn Lys Ala 130 135 140 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr ile ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 145 150 155 160 Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 165 170 175 Lys Asn Gin val Ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 180 185 190 Asp Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 195 200 205 Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr 210 215 220
    Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe 225 230 235 240 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 245 250 255 Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys 260
    <210> 19 <211> 272 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> Syntetický konstrukt <400> 19
    His 1 val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 15 Gly 5 • 10 Gin Ala Ala Lys Glu Phe lle Ala Trp Leu val Lys Gly Arg Gly Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro ser Ala Glu Pro Lys ser Cys Asp Lys Thr 35 40 45 His Thr Cys Pro Pro cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 50 55 60 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys pro Lys Asp Thr Leu Met lle Ser Arg 65 70 75 80 Thr Pro Glu val Thr cys val val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 85 90 95 Gl u val Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly val Glu val Hi s Asn Ala 100 105 110 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 6ln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val Val 115 120 125 Ser val Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 130 135 140 Lys cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lle Glu Lys Thr 145 150 155 160 lle ser Lys Ala Lys Gly Gin pro Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu 165 170 175 Pro Pro ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr cys 180 185 190 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lle Ala val Glu Trp Glu Ser 195 200 205
    «· ·· ·· • · · · · • · · · w · · · · • · · · *· ···· *'*
    39 Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 210 215 220 ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 225 230 235 240 Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 245 250 255 Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser pro Gly Lys 260 265 270
    <210> 20 <211> 264 <212> PRT <213> Umělá sekvence
    <220>
    <223> syntetický konstrukt <400> 20
    Hi s 1 Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp val ser Ser Tyr Leu Glu 15 Glu 5 10 Gin Ala Ala Lys Glu Phe ile Ala Trp Leu val Lys Gly Arg Gly Ala 20 25 30 Glu Pro Lys Ser cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro cys Pro Ala 35 40 45 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser val Phe Leu Phe Pro pro Lys Pro 50 55 60 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys val Val 65 70 75 80 Val Asp Val Ser Hi S Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 85 90 95 Asp Gly Val Glu Val HÍS Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 100 105 110 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 115 120 125 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
    130 135 140
    Leu Pro Ala Pro ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 160 145 150 155 Arg Glu Pro Gin Val Tyr .Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 165 170 175 Lys Asn Gin Val ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro ser 180 185 190 Asp ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 195 200 205 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe phe Leu Tyr 210 215 220 Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 225 230 235 240 Ser Cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys
    245 250 255 ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys 260 <210> 21 <211> 272 <212> PRT <213> Umělá sekvence .
    <220>
    <223> syntetický konstrukt <400> 21
    HÍS val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp val Ser ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gin Ala Ala Lys 20 Gl u Phe Ile Ala Trp 25 Leu Val Lys Gly Arg 30 Gly Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys ASP Lys Thr 35 40 45 Hi s Thr Cys Pro pro cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
    50 55 60
    Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg 65 70 75 80
    Thr Pro Glu Val Thr 85 cys val val Val Asp 90 Val Ser His Glu Asp 95 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly val Glu val His Asn Ala 100 105 110 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn ser Thr Tyr Arg val val 115 120 125 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 130 135 140 Lys cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 145 150 155 160 Ile ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu 165 170 175 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr Cys 180 185 190 Leu val Lys Gly phe Tyr Pro ser ASp Ile Ala val Glu Trp Glu ser 195 200 205 Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 210 215 220 ser ASp Gly ser phe phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser 225 230 235 240 Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe ser cys Ser val Met His Glu Ala 245 250 255 Leu Hi S Asn Hi s Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser pro Gly Lys
    260 265 270 <210> 22 <211> 272 <212> PRT <213> Umělá sekvence <22O>
    <223> Syntetický konstrukt <400> 22 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr ser Asp Val ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15
    • · · 99 9 9 ·· 9 • ·· • 9 · 9 9 9 • ·· 99 9 Í> « • 9 · · 9 9 9 99 ·*·· • 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9999 9 9
    >!
    Gin Ala Ala Lys 20 Glu Phe Ile Ala Trp Leu val 25 Lys Gly Arg 30 Gly Ser Ser Gly 'Ala Ser ser Gly Ala Ala Glu pro Lys Ser Cys ASp Lys Thr 35 40 45 Hi S Thr Cys Pro Pro Cys pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser •50 55 60 val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg 65 70 75 80 Thr Pro Glu Val Thr Cys val Val val ASP Val Ser HÍS Glu Asp Pro 85 90 95 Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu val His Asn Ala 100 105 110 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val val 115 120 125 Ser val Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 130 135 140 Lys cys Lys val ser Asn Lys Ala Leu pro Ala Pro ile Glu Lys Thr 145 150 155 160 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu pro Gin val Tyr Thr Leu 165 170 175 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 180 185 190 Leu Val Lys Gly Phe Tyr pro Ser Asp Ile Ala val Glu Trp Glu ser 195 200 205 Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu 'ASp 210 215 220 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser 225 230 235 240 Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe ser cys Ser val Met His Glu Ala 245 250 255 Leu Hi S Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu ser Leu Ser pro Gly Lys 260 265 270
    <210> 23 <211> 287 <212> PRT <213> Umělá sekvence <22O>
    Syntetický konstrukt <400> 23
    Hi S 1 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 15 Glu 5 10 Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser 20 25 30 ser Gly Ala Pro pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 50 55 60 Thr cys pro Pro cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val 65 70 75 80 Phe Leu Phe Pro pro Lys pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 85 90 95 Pro Glu val Thr cys val val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 100 105 110 val Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 115 120 125 Thr Lys 130 Pro Arg Glu Glu Gin 135 Tyr Asn Ser Thr Tyr 140 Arg Val Val Ser val Leu Thr Val Leu His Gin ASp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 145 150 155 160 cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 165 170 175 ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 180 185 190 pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr Cys Leu 195 200 205 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 210 215 220
    ·..♦ : : ·.....
    ::-: : ·* ·· 99 9999 99
    Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr pro Pro Val Leu Asp Ser 225 230 235 240 ASp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 245 250 255 Trp Gin Gin Gly Asn val Phe Ser cys Ser val Met His Glu Ala Leu 260 265 270 His Asn His Tyr Thr Gin Lys ser Leu Ser Leu Ser pro Gly Lys 275 280 285
    <21Ο> 24 <211> 284 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> Syntetický konstrukt <400> 24
    His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly cly Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro cys Pro 50 55 60 ser cys pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly pro Ser val Phe Leu Phe 65 70 75 80 Pro pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr Pro Glu Val 85 90 95 Thr cys Val val Val ASp val Ser Gin Glu Asp Pro Glu val Gin phe 100 105 110 Asn Trp Tyr val Asp Gly val Glu val Hi S Asn Ala Lys Thr Lys Pro 115 120 125 Arg Glu Glu Gin Phe Asn ser Thr Tyr Arg val val Ser Val Leu Thr 130 135 140
    val 145 Leu His Gin Asp Trp Leu 150 Asn Gly Lys Glu 155 Tyr Lys Cys Lys val 160 ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 165 170 175 Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro ser Gin 180 185 190 Glu Glu Met 195 Thr Lys Asn Gin Val 200 Ser Leu Thr Cys Leu 205 val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp ile Ala val Glu Trp Glu ser Asn Gly Gin pro 210 215 220 Glu 225 Asn Asn Tyr Lys Thr 230 Thr Pro Pro val Leu 235 Asp ser Asp Gly ser 240 Phe Phe Leu Tyr ser Arg Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu 245 250 255 Gly Asn val Phe ser cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 260 265 270 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 275 280
    <210> 25 <211> 302 <212> PRT <213> Umělá sekvence
    <220>
    <223> Synt eti' cký kon strukt <400> 25 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu val Lys Gly Arg Gly Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 35 40 45
    Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 50 55 60 ·· · ··· ·» ····· • * « · · * ♦ · * · ···· ·«· · · · · * * «·» ·· ·♦ ···· *· *
    Gly Gly 65 Gly Gly ser Ala 70 Glu Pro. Lys Ser cys 75 Asp Lys Thr His Thr 80 cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val phe 85 90 95 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr pro 100 105 110 Glu Val Thr Cys Val Val val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu val 115 120 125 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 130 135 140 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn ser Thr Tyr Arg Val Val Ser val 145 150 155 160 Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys 165 170 175 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro ile Glu Lys Thr Ile ser 180 185 190 Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro pro 195 200 205 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr cys Leu val 210 215 220 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser ASP Ile Ala Val Glu Trp Glu ser Asn Gly 225 230 235 240 Gin Pro Glu Asn Asn 245 Tyr Lys Thr Thr Pro 250 Pro Val Leu Asp Ser 255 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp 260 265 270 Gin Gin Gly Asn val Phe Ser Cys ser Val Met His Glu Ala Leu His 275 280 285 Asn His Tyr Thr Gin Lys ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 290 295 300
    <210> 26 <211> 294 <212> PRT
    9 99 99 9 9 9 9 9 •9 9 9* · ♦ · * 99999 • 99 999 99 9 • 99 ·9 ·· «♦·· ·· * <213> Umělá sekvence ' <220>
    <223> Syntetický konstrukt <400> 26
    His Gly Glu Gly Thr Phe Thr ser Ásp Val 10 Ser Ser Tyr Leu Glu 15 Glu 1 5 Gin Ala Ala Lys Glu Phe ile Ala Trp Leu val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly 35 Ser Gly Gly Gly Gly 40 ser Gly Gly Gly Gly 45 ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu pro 50 55 60 Lys ser cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro cys Pro Ala Pro Glu 65 70 75 80 Leu Leu Gly Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 85 90 95 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys val val val ASP 100 105 110 val Ser HÍS Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly 115 120 125 val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 130 135 140 Ser Thr Tyr Arg Val val Ser val Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp 145 150 155 160 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu pro 165 170 175 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 180 185 190 Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 195 200 205 Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 210 215 220 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 225 230 235 240
    ·· ·· · «··♦ • * « » » · ·» ·♦·· • · ··· · · · ·· ·· «·*· »· ·
    Thr Pro Pro val Leu ASp ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 245 250 255 Leu Thr Val A5p Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe Ser cys 260 265 r 270 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 275 280 285 ser Leu Ser Pro Gly Lys
    290 <210> 27 <211> 280 <212> PRT <213> Umělá sekvence
    <220> <22Ξ !> Synt etický kon strukt <400> 27 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu val Lys Gly Arg Gly Ser 20 25 30 ser Gly Ala Pro Pro Pro ser Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Ala 35 40 45 Glu Pro Lys Ser cys Asp Lys Thr His Thr cys Pro Pro Cys Pro Ala 50 55 60 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys pro 65 70 75 80 Lys ASp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr Pro Glu Val Thr cys val Val .85 90 95 val Asp val ser His Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 100 105 110 Asp Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 115 120 125 Tyr Asn sér Thr Tyr Arg Val val Ser Val Leu Thr val Leu His Gin 130 135 140
    ·# » 4 » « • 9
    9 9 9 9 9
    9 99 9 9
    ASp 145 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 150 Lys Cys Lys 155 val Ser Asn Lys Ala 160 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr i-le Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 165 170 175 Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Glu Glu Met Thr 180 185 190 Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 195 200 205 Asp Ile 210 Ala Val Glu Trp Glu 215 Ser Asn Gly Gin Pro 220 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro pro Val Leu Asp Ser ASp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 225 230 235 240 Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 245 250 255 Ser cys ser val Met His Glu Ala Leu Hi S Asn His Tyr Thr Gin Lys
    260 265 270
    Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys 275' 280 <210> 28 <211> 287 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> Syntetický konstrukt <400> 28
    His Gly Glu Gly Thr Phe Thr ser Asp val ser 1 5 10
    Gin Ala val Lys Glu Phe ile Ala Trp Leu ile 20 25
    Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly 35 40
    Ser Tyr Leu Glu Glu 15
    Lys Gly Arg Gly Ser 30
    Ser Gly Gly Gly Gly 45
    Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Pro Lys ser cys Asp Lys Thr His 50 55 60 • 9 · · ► · * 9 9 ► β · · « ·· ···· ··
    50 i
    Thr cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro GlU Leu Leu Gly Gly Pro Ser val 65 70 75 80 phe Leu Phe Pro Pro Lys pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 85 90 95 pro Glu Val Thr Cys Val val val ASP Val Ser His Glu Asp Pro Glu 100 105 110 Val Lys Phe 115 Asn Trp Tyr val Asp 120 Gly Val Glu val HÍS 125 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val val ser 130 135 140 val Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 145 150 155 160 cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 165 170 175 ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 180 185 190 pro Ser Arg Glu Glu Met Thr LyŠAsn Gin val Ser Leu Thr Cys Leu 195 200 205 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn 210 215 220 Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp Ser 225 230 235 240 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg 245 250 255 Trp Gin Gin Gly Asn val Phe Ser cys Ser val Met His Glu Ala Leu 260 265 270 His Asn Hi S Tyr Thr Gin Lys Ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 280 285
    <210> 29 <211> 272 <212> PRT <213> Umělá sekvence
    • ·· ·· · ♦ • 11 • · · • ·· · ·
    11 1
    1 9
    <22Ο> <223> ; Syntetický konstrukt <400> 29 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro ser Ala Glu Pro Lys ser Cys Asp Lys Thr 35 40 45 His Thr cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 50 55 60 Val Phe Leu. Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg 65 70 75 80 Thr Pro Glu val Thr cys val Val val Asp val Ser His Glu Asp Pro 85 90 95 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu val His Asn Ala 100 105 110 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val val 115 120 125 Ser Val Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 130 135 140 Lys cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro ile Glu Lys Thr 145 150 155 160 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 165 170 175 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr Cys 180 185 190 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala val Glu Trp Glu Ser 195 200 205 Asn Gly Gin Pro Glu Α5Π Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 210 215 220 Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser 225 230 235 240 Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe Ser cys Ser Val Met His Glu Ala 245 250 255
    Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 260 265 270 <210> 30 <211> 272 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
    <223> Syntetický konstrukt <400> 30
    His 1 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu 15 Glu 5 10 Glu Ala val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Ser Ser Gly Ala Ala Glu Pro Lys Ser cys ASp Lys Thr 35 40 45 His Thr cys Pro Pro cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 50 55 60 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys ASp Thr Leu Met Ile Ser Arg 65 70 75 80 Thr Pro Glu val Thr Cys Val val Val ASp Val Ser His Glu Asp Pro 85 90 95 Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly Val Glu val His Asn Ala 100 105 110 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val val 115 120 125 Ser val Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 130 135 140 Lys cys tys val Ser Asn Lys Ala Leu pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 145 150 155 160 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 165 170 175
    Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 180 185 190
    4 44 44 44 44 4
    44 44 4444 444
    4 44 44 4 4 4 4 4
    444444 4444 4444
    444 444 444
    444 44 44 4444 44 ·
    Leu val Lys 195 Gly Phe Tyr pro Ser Asp Ile Ala val Glu Trp Glu ser 200 205 Asn Gly Gin pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu ASp 210 215 220 Ser ASp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser 225 230 235 240 Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe ser cys Ser val Met His GlU Ala 245 250 255 Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys 260 265 270
    <210> 31 <211> 287 <212> PRT <213> Umělá sekvence
    <220>
    <223> syntetický konstrukt <400> 31
    Hi S 1 Gly Glu Gly Thr Phe Thr 5 Ser Asp Leu Ser Lys 10 Gin Met Glu 15 Glu Glu Ala val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro pro Ser Gly Glv Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys ASp Lys Thr His 50 55 60 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val 65 70 75 80 Phe Leu Phe Pro Pro Lys pro Lys Asp Thr Leu Met ile ser Arg Thr 85 90 95 Pro Glu val Thr cys val val Val Asp val Ser HÍ 5 Glu Asp Pro Glu 100 105 110 Val Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly Val Glu val His Asn Ala Lys • 115 120 125
    ·· *· · · • · · • · · • · · ··· ·· • · ····
    Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 135 Tyr Asn Ser Thr Tyr 140 Arg Val val Ser 130 Val Leu Thr val Leu HiS Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 145 150 155 160 cys Lys Val ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala pro lle GlU Lys Thr lle 165 170 175 Ser Lys Ala Lys Gly Gin pro Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro 180 185 190 Pro ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr cys Leu 195 200 205 val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser ASp lle Ala val Glu Trp Glu ser Asn 210 215 220 Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu ASp Ser 225 230 235 240 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg 245 250 255 Trp Gin Gin Gly Asn val phe Ser cys Ser val Met Hi s Glu Ala Leu 260 265 270 Hi s Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 280 285 <210> 32 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 . Ala Glu Pro Lys Ser cys Asp Lys Thr Hi s Thr cys Pro Pro cys Pro 1 5 10 15 Ala Pro Glu Lys Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Lys Met lle Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys val Val 35 40 45 Val Asp Val ser His Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60
    ·· «4 444«
    ASp 65 Gly val Glu val His 70 Asn Ala Lys Thr Lys 75 Pro Arg Glu Glu Gin 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val ser. val Leu Thr val Leu His Gin 85 90 95 Asp Trp Leu Asn 100 Gly Lys Glu Tyr Lys 105 cys Lys Val Ser Asn 110 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro pro ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gin val ser Leu Thr cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 5er Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp Ser ASp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asň Val Phe 195 200 205 Ser cys Ser val Met HÍS Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 210 215 220
    Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 33 <211> 703 <212> DNA <213> Homo sapiens
    <400> 33 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360 ··· · · · · · · · ······ · · · · ···· • · · ··· ··· ··· ·· ·· *··· ·· · atctccaaag ccaaagggca gccccgagiaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaacťacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc . 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgat agt 703 <210> 34 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34
    Asp 1 Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu 10 Gly 15 Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin 20 25 30 Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala 50 Lys Thr cys Val Ala 55 ASp Glu ser Ala Glu 60 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu cys Thr val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp cys cys Ala Lys Gin Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu cys Phe Leu Gl n His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu val Arg Pro Glu val Asp val Met cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160
    Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu cys Cys Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 • 99 99 99 • « 99 9999 999
    9 9« 99 9 9999
    9 9 9 · 9 9 9 9 · 9 9 9 · 9
    999 999 99 ·
    999 99 99 9999 99 ·
    9β 9
    cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys cys Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala 210 Phe Lys Ala Trp Ala 215 val Ala Arg Leu Ser 220 Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 val His Thr Glu Cys cys His Gly Asp Leu Leu Glu cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile cys Glu Asn Gin ASp ser ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met pro Ala Asp Leu Pro ser 290 295 300 Leu Ala Ala ASP Phe val Glu ser Lys Asp Val cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp 340 Tyr Ser val Val Leu 345 Leu Leu Arg Leu Ala 350 Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn cys Glu Leu Phe Glu Asn Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu val Arg Tyr Thr Lys Lys val Pro 405 410 415 Gin val Ser Thr Pro Thr Leu val Glu val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430
    val Gly Ser Lys Cys cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro cys 435 440 4.45 • 9 • · ···
    Ala Glu 450 Asp Tyr Leu ser val 455 Val Leu Asn Gin Leu 460 cys val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg val Thr Lys cys cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 ile cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gin Ile Lys Lys Gin Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gin Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe val Glu Lys cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu val 565 570 575 Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu 580 585
    <210> 35 <211> 1762 <212> DNA <213> Homo <400> 35
    gatgcgcaca agagtgaggt tgctcatcgg gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aattgtgaca aatcacttca tacccttttt cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat tataaagctg cttttacaga atgttgccaa aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60 cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120 aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180 ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240 tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300 aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360 gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420 gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480 gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540 gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600 • · 0···
    0 «0 00 00 00 00 00 0000 00
    0 00 0 0 0 0 0 000000 0000 • 00 * · 0 00 0
CZ2003-1602A 2000-12-07 2001-11-29 GLP-1 fúzní proteiny CZ306180B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25195400P 2000-12-07 2000-12-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20031602A3 true CZ20031602A3 (cs) 2006-04-12
CZ306180B6 CZ306180B6 (cs) 2016-09-14

Family

ID=22954069

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2003-1602A CZ306180B6 (cs) 2000-12-07 2001-11-29 GLP-1 fúzní proteiny
CZ2014-740A CZ308214B6 (cs) 2000-12-07 2001-11-29 GLP-1 fúzní proteiny

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2014-740A CZ308214B6 (cs) 2000-12-07 2001-11-29 GLP-1 fúzní proteiny

Country Status (29)

Country Link
US (1) US7271149B2 (cs)
EP (2) EP1355942B1 (cs)
JP (2) JP2004528014A (cs)
KR (2) KR20080085082A (cs)
CN (2) CN101712722A (cs)
AT (2) ATE437891T1 (cs)
AU (2) AU2002226897B2 (cs)
BR (1) BR0116024A (cs)
CA (2) CA2716959A1 (cs)
CY (2) CY1108485T1 (cs)
CZ (2) CZ306180B6 (cs)
DE (2) DE60135581D1 (cs)
DK (2) DK1355942T3 (cs)
EA (1) EA005584B1 (cs)
EC (1) ECSP064643A (cs)
ES (2) ES2328510T3 (cs)
HR (1) HRP20030455A2 (cs)
HU (2) HU229218B1 (cs)
IL (3) IL155812A0 (cs)
MX (1) MXPA03005036A (cs)
NO (3) NO331273B1 (cs)
NZ (1) NZ525577A (cs)
PL (2) PL209550B1 (cs)
PT (2) PT1355942E (cs)
SI (2) SI1355942T1 (cs)
SK (2) SK288088B6 (cs)
UA (2) UA93662C2 (cs)
WO (1) WO2002046227A2 (cs)
ZA (1) ZA200303642B (cs)

Families Citing this family (343)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US6444788B1 (en) 1999-03-15 2002-09-03 Novo Nordisk A/S Ion exchange chromatography of GLP-1, analogs and derivatives thereof
US6924264B1 (en) 1999-04-30 2005-08-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Modified exendins and exendin agonists
EP1276849A4 (en) 2000-04-12 2004-06-09 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
US6946134B1 (en) 2000-04-12 2005-09-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7084243B2 (en) * 2000-06-16 2006-08-01 Eli Lilly And Company Glucagon-like peptide-1 analogs
US7408041B2 (en) 2000-12-08 2008-08-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
US20060057651A1 (en) 2000-12-08 2006-03-16 Bowdish Katherine S Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
EP1341902A2 (en) 2000-12-08 2003-09-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Chronic lymphocytic leukemia cell line and its use for producing an antibody
AU2002228608A1 (en) * 2000-12-13 2002-06-24 Eli Lilly And Company Amidated glucagon-like peptide-1
US7507413B2 (en) 2001-04-12 2009-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2455963C (en) * 2001-07-31 2017-07-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Glp-1, exendin-4, peptide analogs and uses thereof
HUP0501192A3 (en) * 2001-08-23 2006-06-28 Lilly Co Eli Glucagon-like peptide-1 analogs
US8129504B2 (en) 2001-08-30 2012-03-06 Biorexis Technology, Inc. Oral delivery of modified transferrin fusion proteins
US7176278B2 (en) 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
WO2003033671A2 (en) * 2001-10-18 2003-04-24 Bristol-Myers Squibb Company Human glucagon-like-peptide-1 mimics and their use in the treatment of diabetes and related conditions
EP2990417A1 (en) 2001-12-21 2016-03-02 Human Genome Sciences, Inc. Albumin insulin fusion protein
WO2003059934A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20080194481A1 (en) * 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
US7482321B2 (en) * 2002-01-08 2009-01-27 Eli Lilly And Company Extended glucagon-like peptide-1 analogs
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
DE60331226D1 (de) 2002-05-24 2010-03-25 Medtronic Inc Verfahren und dna-konstrukte zur produktion von polypeptiden mit hoher ausbeute
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
AU2003280130B2 (en) * 2002-06-28 2009-06-11 Centocor, Inc. Mammalian CH1 deleted mimetibodies, compositions, methods and uses
US20060130158A1 (en) * 2002-08-30 2006-06-15 Turner Andrew J Modified transferrin fusion proteins comprising duplicate transferrin amino or carboxy terminal domains
EP1688148A1 (en) * 2002-12-03 2006-08-09 Novo Nordisk A/S Combination treatment using exendin-4 and thiazolidinediones
EP1569682A2 (en) * 2002-12-03 2005-09-07 Novo Nordisk A/S Combination treatment using exendin-4 and thiazolidinediones
EP1578437A4 (en) 2002-12-27 2006-08-09 Diobex Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR PREVENTING AND REDUCING INSULIN-INDUCED HYPOGLYCEMIA
US7655618B2 (en) 2002-12-27 2010-02-02 Diobex, Inc. Compositions and methods for the prevention and control of insulin-induced hypoglycemia
CA2512676A1 (en) * 2003-01-10 2004-07-29 Niigata Tlo Corporation Vector for gene therapy and method of quantifying target protein in mammal or cultured cells with the administration of the vector for gene theraphy
CA2513213C (en) 2003-01-22 2013-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
KR20050111583A (ko) * 2003-02-06 2005-11-25 각고호우징 게이오기주크 펩티드 결합체
AU2004231461B2 (en) * 2003-03-19 2009-11-12 Eli Lilly And Company Polyethelene glycol linked GLP-1 compounds
BRPI0408978B8 (pt) 2003-04-08 2021-07-27 Novo Nordisk As processos para regenerar uma fase estacionária cromatográfica
WO2004089985A1 (en) * 2003-04-11 2004-10-21 Novo Nordisk A/S Stable pharmaceutical compositions
CN102174102A (zh) 2003-05-15 2011-09-07 塔夫茨大学信托人 肽和多肽药物的稳定类似物
SI1641823T1 (sl) 2003-06-12 2011-12-30 Lilly Co Eli Fuzijski proteini analogni glp-1
CN1802167A (zh) * 2003-06-12 2006-07-12 伊莱利利公司 融合蛋白质
JP2007537981A (ja) * 2003-09-19 2007-12-27 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ 新規の血漿タンパク質親和性タグ
AU2004273573B2 (en) * 2003-09-19 2010-04-22 Novo Nordisk A/S Albumin-binding derivatives of therapeutic peptides
KR101135244B1 (ko) * 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
US20090238838A1 (en) * 2003-11-13 2009-09-24 Hanmi Pharm. Ind. Co. Ltd. Insulinotropic peptide conjugate using an immunoglobulin fc
US8263084B2 (en) * 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
EP1682583B1 (en) 2003-11-13 2012-01-11 Hanmi Holdings Co., Ltd Protein complex using immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
CN113304250A (zh) 2003-11-20 2021-08-27 诺和诺德股份有限公司 对于生产和用于注射装置中是最佳的含有丙二醇的肽制剂
WO2005056036A2 (en) 2003-12-09 2005-06-23 Novo Nordisk A/S Regulation of food preference using glp-1 agonists
RU2006120077A (ru) * 2003-12-18 2008-01-27 Ново Нордиск А/С (DK) Аналоги глюкагоноподобного пептида-1 (glp-1), связанные с альбуминоподобными агентами
US20060252693A1 (en) * 2004-01-29 2006-11-09 Wolfgang Glaesner Glucagon-like peptide-1 analogs
CN1980687B (zh) * 2004-02-09 2015-05-13 人类基因科学公司 清蛋白融合蛋白
CN102816241B (zh) * 2004-02-09 2015-07-22 人类基因科学公司 清蛋白融合蛋白
US8076288B2 (en) * 2004-02-11 2011-12-13 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides having glucose lowering activity
AU2005211776B2 (en) 2004-02-11 2012-02-02 Amylin Pharmaceuticals, Llc Pancreatic polypeptide family motifs and polypeptides comprising the same
EP1718665B1 (en) * 2004-02-11 2013-04-10 Amylin Pharmaceuticals, LLC Hybrid polypeptides with selectable properties
AU2005231359A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-20 Centocor, Inc. Human GLP-1 mimetibodies, compositions, methods and uses
HUE055861T2 (hu) 2004-04-21 2021-12-28 Alexion Pharma Inc Csontbejuttató konjugátumok és azok alkalmazási módszere fehérjék csonthoz kötéséhez
CA2565300A1 (en) 2004-05-13 2005-12-01 Eli Lilly And Company Fgf-21 fusion proteins
EP2316446A1 (en) 2004-06-11 2011-05-04 Novo Nordisk A/S Counteracting drug-induced obesity using GLP-1 agonists
US7893017B2 (en) 2004-10-07 2011-02-22 Novo Nordisk A/S Protracted GLP-1 compounds
WO2006037811A2 (en) 2004-10-07 2006-04-13 Novo Nordisk A/S Protracted exendin-4 compounds
CA2589800A1 (en) 2004-12-02 2006-06-08 Domantis Limited Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and glp-1 or pyy
CA2592065A1 (en) * 2004-12-22 2007-04-26 Centocor, Inc. Glp-1 agonists, compositions, methods and uses
KR100879662B1 (ko) * 2004-12-22 2009-01-20 일라이 릴리 앤드 캄파니 Ｇｌｐ-1 유사체 융합 단백질 제제
US20090286723A1 (en) * 2005-02-11 2009-11-19 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid Polypeptides with Selectable Properties
US20090016959A1 (en) * 2005-02-18 2009-01-15 Richard Beliveau Delivery of antibodies to the central nervous system
EP1863521B1 (en) * 2005-03-18 2014-05-07 Novo Nordisk A/S Extended glp-1 compounds
TWI362392B (en) 2005-03-18 2012-04-21 Novo Nordisk As Acylated glp-1 compounds
KR20080005378A (ko) * 2005-03-28 2008-01-11 센토코 인코포레이티드 인간 ｇｌｐ-1 모방체, 조성물, 방법 및 용도
AU2006244497B2 (en) * 2005-05-06 2011-09-22 Providence Health & Services - Oregon Trimeric OX40L-immunoglobulin fusion protein and methods of use
BRPI0609676A2 (pt) * 2005-05-13 2011-10-18 Lilly Co Eli composto de glp-1 peguilado,e, uso do mesmo
CN101273134B (zh) * 2005-07-27 2012-01-04 王庆华 用于预防和治疗ⅰ型和ⅱ型糖尿病的组合物和方法
CA2616551A1 (en) * 2005-07-29 2007-02-15 Amprotein Corporation Chimeric therapeutic agents
CA2658678A1 (en) * 2005-08-06 2007-02-15 Gerald J. Prud'homme Composition and method for prevention and treatment of type i diabetes
KR101399178B1 (ko) * 2005-08-11 2014-06-18 아스트라제네카 파마수티컬스 엘피 선별가능한 특성을 갖는 하이브리드 폴리펩티드
ATE448247T1 (de) 2005-09-22 2009-11-15 Biocompatibles Uk Ltd Fusionspolypeptide vom glp-1 (glucagon-like peptide-1) mit erhöhten peptidaseresistenz
WO2007049695A1 (ja) * 2005-10-26 2007-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 凝集性ｇｌｐ－１アナログおよび徐放性医薬組成物
DK1965823T3 (en) * 2005-11-04 2016-08-22 Glaxosmithkline Llc Corp Service Company Methods of administering hypoglycemics
CN1962695B (zh) * 2005-11-09 2011-08-31 浙江德清安平生物制药有限公司 类胰高血素肽-1融合蛋白及其制备和用途
US8039432B2 (en) 2005-11-09 2011-10-18 Conjuchem, Llc Method of treatment of diabetes and/or obesity with reduced nausea side effect
US20080280328A1 (en) * 2005-11-18 2008-11-13 Novozymes A/S Glucoamylase Variants
EP1961764B1 (en) * 2005-11-30 2011-05-11 Shionogi Co., Ltd. Sugar chain adduct of peptide and pharmaceutical comprising the same as active ingredient
WO2007075534A2 (en) 2005-12-16 2007-07-05 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer conjugates of glp-1
EP1971355B1 (en) 2005-12-20 2020-03-11 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
ES2586825T3 (es) 2006-01-12 2016-10-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos para OX-2/CD200 y usos de los mismos
US10351615B2 (en) 2006-02-03 2019-07-16 Opko Biologics Ltd. Methods of treatment with long-acting growth hormone
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8450269B2 (en) 2006-02-03 2013-05-28 Prolor Biotech Ltd. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US7553941B2 (en) 2006-02-03 2009-06-30 Modigene Inc Long-acting polypeptides and methods of producing same
US8476234B2 (en) * 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US9458444B2 (en) 2006-02-03 2016-10-04 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8759292B2 (en) 2006-02-03 2014-06-24 Prolor Biotech, Llc Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
EP1816201A1 (en) * 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
CN101003574B (zh) * 2006-02-21 2010-12-15 大连帝恩生物工程有限公司 长效降血糖肽的重组表达及其在糖尿病治疗药物中的应用
JP2009534423A (ja) 2006-04-20 2009-09-24 アムジェン インコーポレイテッド Ｇｌｐ−１化合物
EP1854455B1 (en) 2006-05-10 2009-10-07 Biocompatibles UK Limited Spherical microcapsules comprising GLP-1 peptides, their production and use
US20100029554A1 (en) 2006-05-26 2010-02-04 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Composition and Methods for Treatment of Congestive Heart Failure
CA2654055A1 (en) 2006-06-07 2007-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
KR20090039787A (ko) * 2006-07-18 2009-04-22 센토코 인코포레이티드 인간 ｇｌｐ-1 모방체, 조성물, 방법 및 용도
KR101193722B1 (ko) 2006-07-24 2013-01-11 바이오렉시스 파마슈티칼 코포레이션 엑센딘 융합 단백질
CL2007002502A1 (es) 2006-08-31 2008-05-30 Hoffmann La Roche Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer.
ES2393373T3 (es) * 2006-08-31 2012-12-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Método para la producción de factor-I de crecimiento similar a la insulina
MX2009002547A (es) * 2006-09-06 2009-06-19 Phasebio Pharmaceuticals Inc Composiciones terapeuticas de peptido de fusion.
PE20121528A1 (es) * 2006-09-13 2012-12-12 Smithkline Beecham Corp Metodos para administrar agentes hipoglucemiantes de larga duracion
TWI428346B (zh) * 2006-12-13 2014-03-01 Imp Innovations Ltd 新穎化合物及其等對進食行為影響
US20090098130A1 (en) * 2007-01-05 2009-04-16 Bradshaw Curt W Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds
RU2432361C2 (ru) * 2007-01-05 2011-10-27 КовЭкс Текнолоджиз Айэлэнд Лимитед Соединения агонисты рецептора глюкагоноподобного белка-1 (glp-1r)
AU2011254001B2 (en) * 2007-01-05 2012-08-02 Covx Technologies Ireland Limited Glucagon-like protein-1 receptor (GLP-1R) agonist compounds
JP2008169195A (ja) * 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
EP1972349A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-24 Biocompatibles UK Limited GLP-1 fusion peptides conjugated to polymer(s), their production and use
EP1975176A1 (en) * 2007-03-27 2008-10-01 Biocompatibles UK Limited Novel glp-1 fusion peptides, their production and use
US20080260738A1 (en) 2007-04-18 2008-10-23 Moore Margaret D Single chain fc, methods of making and methods of treatment
JP5351884B2 (ja) 2007-04-23 2013-11-27 インターシア セラピューティクス，インコーポレイティド インスリン分泌促進性ペプチドの懸濁製剤及び使用
JP2009019027A (ja) 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体
JP2010534242A (ja) 2007-07-25 2010-11-04 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 自己免疫疾患を治療するための方法および組成物
WO2009020802A2 (en) * 2007-08-03 2009-02-12 Eli Lilly And Company Treatment for obesity
US20100261637A1 (en) 2007-09-05 2010-10-14 Novo Nordisk A/S Peptides derivatized with a-b-c-d- and their therapeutical use
JP2010538049A (ja) 2007-09-05 2010-12-09 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 切断型ｇｌｐ−１誘導体及びその治療的使用
US8895694B2 (en) 2007-09-05 2014-11-25 Novo Nordisk A/S Glucagon-Like Peptide-1 derivatives and their pharmaceutical use
ES2536772T3 (es) 2007-09-21 2015-05-28 The Regents Of The University Of California El interferón dirigido demuestra potentes actividades apoptóticas y antitumorales
US20090181037A1 (en) * 2007-11-02 2009-07-16 George Heavner Semi-Synthetic GLP-1 Peptide-FC Fusion Constructs, Methods and Uses
CN102046207B (zh) * 2008-03-31 2013-08-28 葛兰素集团有限公司 药物融合物和缀合物
EP2274624B1 (en) * 2008-04-03 2011-11-09 F. Hoffmann-La Roche AG Pegylated insulin-like-growth-factor assay
CN101328221B (zh) * 2008-04-14 2011-03-23 中国药科大学 一种降糖多肽融合蛋白及其衍生物的结构及用途
EP4074327A1 (en) * 2008-06-27 2022-10-19 Duke University Therapeutic agents comprising elastin-like peptides
AU2009274738B2 (en) 2008-07-23 2012-12-13 Hanmi Science Co., Ltd. A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
BRPI0917000A2 (pt) 2008-08-06 2016-02-16 Novo Nordisk Healthcare Ag proteínas conjugadas com eficácia in vivo prolongada
US20100075897A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Jinan University Method for sustainedly releasing bioactive peptides and application thereof
WO2010043047A1 (en) 2008-10-15 2010-04-22 Angiochem Inc. Conjugates of glp-1 agonists and uses thereof
MX2011005963A (es) 2008-12-05 2011-09-01 Angiochem Inc Conjugados de neurotensina o analogos de neurotensina y sus usos.
KR101740066B1 (ko) 2008-12-05 2017-05-25 글락소 그룹 리미티드 프로테아제 저항성 폴리펩티드를 선택하는 방법
LT2373681T (lt) 2008-12-10 2017-04-10 Glaxosmithkline Llc Albiglutido farmacinės kompozicijos
CA2747825A1 (en) 2009-01-22 2010-07-29 Novo Nordisk Health Care Ag Stable growth hormone compounds
US9493545B2 (en) 2009-02-11 2016-11-15 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
CA2756853A1 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Christopher Herring Drug fusions and conjugates
EP2421562B1 (en) 2009-04-20 2019-03-13 Angiochem Inc. Treatment of ovarian cancer using an anticancer agent conjugated to an angiopep-2 analog
JP5932642B2 (ja) 2009-07-02 2016-06-08 アンジオケム インコーポレーテッド 多量体ペプチドコンジュゲートおよびその使用
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US12203113B2 (en) 2009-07-09 2025-01-21 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
CN105963710A (zh) 2009-08-06 2016-09-28 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 具有延长的体内功效的生长激素
US9029505B2 (en) * 2009-08-14 2015-05-12 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Modified vasoactive intestinal peptides
CN101993485B (zh) 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
CN101993496B (zh) * 2009-08-20 2013-06-05 重庆富进生物医药有限公司 双重调节血糖血脂融合蛋白及其制法和用途
EA201290123A1 (ru) 2009-09-30 2012-10-30 Глаксо Груп Лимитед Продукты слияния и конъюгаты лекарственных средств с увеличенным периодом полувыведения
WO2011043530A1 (ko) * 2009-10-09 2011-04-14 (주)알테오젠 Ｇｌｐ-1 유사체의 융합체, 및 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물
WO2011050052A2 (en) 2009-10-20 2011-04-28 Georgia State University Research Foundation, Inc. Protein agent for diabetes treatment and beta cell imaging
WO2011051489A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
CN102070717B (zh) * 2009-11-19 2013-04-10 东莞太力生物工程有限公司 融合蛋白及其制备方法、编码该蛋白的dna序列、表达载体、宿主细胞、含有该蛋白的药物组合物
NZ601034A (en) 2009-12-08 2013-07-26 Teva Pharma Bche albumin fusions for the treatment of cocaine abuse
EP2525833A2 (en) 2010-01-22 2012-11-28 Novo Nordisk Health Care AG Stable growth hormone compounds
MX380749B (es) 2010-01-22 2025-03-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Hormonas de crecimiento con eficacia in vivo prolongada.
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
CN101875700B (zh) * 2010-04-09 2012-09-26 无锡和邦生物科技有限公司 一种增加促胰岛素分泌肽融合蛋白生物活性的方法
CN106977608A (zh) 2010-04-09 2017-07-25 阿尔布麦狄克斯公司 白蛋白衍生物和变体
WO2011123943A1 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Mount Sinai Hospital Methods for treating disorders of the gastrointestinal tract using a glp-1 agonist
EP2565202A4 (en) 2010-04-30 2013-10-30 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co PEPTIDE FOR IMPROVING THE IN VIVO STABILITY OF A PHYSIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE OR ANALOGUES AND PHYSIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE AND ANALOGUES HAVING IN VIVO STABILITY IMPROVEMENT
WO2011140176A1 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Glaxosmithkline Llc Methods for treating or preventing cardiovascular disorders and providing cardiovascular protection
WO2011153642A1 (en) * 2010-06-10 2011-12-15 Angiochem Inc. Leptin and leptin analog conjugates and fusion proteins and uses thereof
CN101891823B (zh) 2010-06-11 2012-10-03 北京东方百泰生物科技有限公司 一种Exendin-4及其类似物融合蛋白
US9234023B2 (en) * 2010-06-24 2016-01-12 Biousian Biosystems, Inc. Glucagon-like peptide-1 glycopeptides
JP2013530993A (ja) 2010-07-02 2013-08-01 アンジオケム インコーポレーテッド 治療用コンジュゲートのための短く且つｄ−アミノ酸を含有するポリペプチドおよびその使用
CN102311501A (zh) * 2010-07-08 2012-01-11 天津药物研究院 含有glp-1或其类似物的融合蛋白、制备方法及其应用
CN101906158B (zh) * 2010-07-14 2013-10-23 中国药科大学 一种聚乙二醇化降糖多肽及其制法和用途
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
CN102532323B (zh) * 2010-12-09 2014-07-23 天津药物研究院 一种多肽复合物、药物组合物、其制备方法和应用
LT2651398T (lt) 2010-12-16 2018-03-26 Novo Nordisk A/S Kietos kompozicijos, apimančios glp-1 agonistą ir n-(8-(2-hidroksibenzoil)amino)oktano rūgšties druską
CN102533655A (zh) * 2010-12-21 2012-07-04 青岛黄海制药有限责任公司 高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S细胞株及其建立方法
CA2823066A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Alexion Pharma International Sarl Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
US9540438B2 (en) 2011-01-14 2017-01-10 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged immunoglobulin polypeptides and methods of use thereof
WO2012118042A1 (ja) 2011-02-28 2012-09-07 独立行政法人国立循環器病研究センター 悪性腫瘍転移抑制用医薬
CA2828811C (en) 2011-03-03 2021-09-21 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
WO2012136790A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Compositions comprising fusion proteins or conjugates with an improved half -life
WO2012136792A2 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Cck compositions
AU2012241894B2 (en) 2011-04-12 2015-12-03 Novo Nordisk A/S Double-acylated GLP-1 derivatives
WO2012170524A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
AU2012275287B2 (en) 2011-06-28 2017-10-05 Sanofi Aatd Inc. Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
IN2013MN02442A (cs) * 2011-06-28 2015-06-12 Inhibrx Llc
CA2840552A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
US20140148390A1 (en) 2011-07-08 2014-05-29 Bayer Intellectual Property Gmbh Fusion proteins releasing relaxin and uses thereof
WO2013027680A1 (ja) 2011-08-19 2013-02-28 独立行政法人国立循環器病研究センター ナトリウム利尿ペプチド受容体gc-aアゴニスト及びgc-bアゴニストを組み合わせてなる悪性腫瘍の増悪防止用医薬
SG2014012546A (en) * 2011-08-25 2014-08-28 Mitsubishi Chem Medience Corp Method for determining glucagon-like peptide-1, and kit for use in said method
CN104039822A (zh) 2011-09-06 2014-09-10 诺沃—诺迪斯克有限公司 Glp-1衍生物
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
WO2013075066A2 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Proteins with improved half-life and other properties
JP2015500823A (ja) 2011-12-09 2015-01-08 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｇｌｐ−１アゴニスト
KR101895047B1 (ko) * 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
EP2807266B1 (en) 2012-01-26 2020-01-15 Amgen Inc. Growth differentiation factor 15 (gdf-15) polypeptides
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
US9944691B2 (en) 2012-03-16 2018-04-17 Albumedix A/S Albumin variants
DK2827845T3 (en) 2012-03-22 2019-04-01 Novo Nordisk As COMPOSITIONS INCLUDING A PROCEDURE AND PREPARING THEREOF
EP2827885B1 (en) 2012-03-22 2018-08-15 Novo Nordisk A/S Compositions of glp-1 peptides and preparation thereof
MY167814A (en) 2012-04-19 2018-09-26 Opko Biologics Ltd Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same
AU2013261214A1 (en) 2012-05-16 2014-11-20 Glaxo Group Limited Polypeptide loaded POCA nanoparticles for oral administration
JP6195911B2 (ja) 2012-05-17 2017-09-13 エクステンド バイオサイエンシズ インコーポレーテッドＥｘｔｅｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ 向上した薬物送達のための担体
WO2013170636A1 (zh) * 2012-05-18 2013-11-21 爱德迪安（北京）生物技术有限公司 用于糖尿病治疗的蛋白、蛋白缀合物及其应用
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
WO2013184938A2 (en) * 2012-06-08 2013-12-12 Alkermes. Inc. Fusion polypeptides comprising mucin-domain polypeptide linkers
EP2863895B1 (en) 2012-06-20 2021-04-14 Novo Nordisk A/S Tablet formulation comprising a peptide and a delivery agent
CN104768571B (zh) 2012-07-13 2018-11-09 酵活有限公司 多价异多聚体支架设计和构建体
AR092862A1 (es) * 2012-07-25 2015-05-06 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de insulina de accion prolongada y un peptido insulinotropico y metodo de preparacion
AR091902A1 (es) 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
AR094821A1 (es) * 2012-07-25 2015-09-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
CA2890766A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
KR102341581B1 (ko) 2012-11-20 2021-12-21 옵코 바이오로직스 리미티드 생식샘자극 호르몬 카복시 말단 펩타이드들과 부착하여 폴리펩타이드들의 유체역학적 부피를 증가시키는 방법
US9803021B2 (en) 2012-12-07 2017-10-31 The Regents Of The University Of California CD138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
HK1211232A1 (en) 2012-12-21 2016-05-20 Sanofi Exendin-4 derivatives as dual glp1/gip or trigonal glp1/gip/glucagon agonists
HK1217670A1 (zh) 2013-01-15 2017-01-20 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Albu-bche调配物、其制造方法和用途
US9580486B2 (en) * 2013-03-14 2017-02-28 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
EP2981282B1 (en) 2013-04-05 2020-11-04 Novo Nordisk Health Care AG Growth hormone compound formulation
US20160067184A1 (en) 2013-05-02 2016-03-10 Novo Nordisk A/S Oral Dosing of GLP-1 Compounds
WO2014194100A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 The Regents Of The University Of California Anti-cspg4 fusions with interferon for the treatment of malignancy
CN104277112B (zh) * 2013-07-04 2018-01-26 嘉和生物药业有限公司 长效降血糖融合蛋白
EP3763734A1 (en) 2013-07-31 2021-01-13 Amgen Inc. Growth differentiation factor 15 (gdf-15) constructs
CN103408669B (zh) * 2013-08-01 2016-01-20 江苏泰康生物医药有限公司 Glp-1类似物融合蛋白，及其制备方法和用途
CN104371019B (zh) 2013-08-13 2019-09-10 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与glp-1r特异性结合的抗体及其与glp-1的融合蛋白质
HK1226084A1 (zh) * 2013-08-16 2017-09-22 Medimmune Limited 用於治疗糖尿病的gip和glp-1受体双重激动剂
JP6534654B2 (ja) 2013-10-10 2019-06-26 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター インコーポレイティッド Ｔｍ４ｓｆ１結合性タンパク質およびそれを使用する方法
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
CA2941958A1 (en) * 2013-12-10 2015-06-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of the binding domain of a subunit of a multi-subunit structure for targeted delivery of pharmaceutically active entities to the multi-subunit structure
WO2015086730A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
WO2015086733A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
EP3080154B1 (en) 2013-12-13 2018-02-07 Sanofi Dual glp-1/gip receptor agonists
WO2015086728A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Exendin-4 peptide analogues as dual glp-1/gip receptor agonists
EP3889185A3 (en) * 2014-03-31 2022-01-26 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Composition for improving the solubility of a protein or peptide by using immunoglobulin fc fragment linkage
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
WO2015165480A1 (en) 2014-04-30 2015-11-05 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same
NO2776305T3 (cs) 2014-04-23 2018-01-27
WO2015172046A1 (en) 2014-05-08 2015-11-12 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating cystic fibrosis
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
US10822596B2 (en) 2014-07-11 2020-11-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating craniosynostosis
CN104558198A (zh) * 2014-07-25 2015-04-29 成都贝爱特生物科技有限公司 GLP-1类似物和amylin类似物的融合蛋白制备及其用途
CN104257696B (zh) * 2014-09-04 2017-08-25 西安国誉生物科技有限公司 一种降糖稳糖酵母菌粉及其制备方法和应用
ES2685987T3 (es) 2014-09-05 2018-10-15 University Of Copenhagen Análogos de péptidos gip
EP3204408B1 (en) 2014-10-10 2020-05-06 Novo Nordisk A/S Stable glp-1 based glp-1/glucagon receptor co-agonists
CN104327187B (zh) * 2014-10-11 2018-06-08 上海兴迪金生物技术有限公司 一种重组人GLP-1-Fc融合蛋白
US9585934B2 (en) 2014-10-22 2017-03-07 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin D conjugates
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
CA2966988A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Immunotherapeutics for cancer and autoimmune diseases
KR20170095278A (ko) 2014-12-05 2017-08-22 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 재조합 알칼리성 포스파타제를 이용한 발작 치료
SG11201704124YA (en) * 2014-12-08 2017-06-29 1Globe Biomedical Co Ltd Soluble universal adcc-enhancing synthetic fusion gene and peptide technology and its use thereof
WO2016118577A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-28 Medimmune, Llc Thymosin-beta-four fusion proteins
AU2016211447B2 (en) 2015-01-28 2021-09-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
CN107427556B (zh) 2015-02-09 2022-02-25 费斯生物制药公司 用于治疗肌肉疾病和病症的方法和组合物
WO2016127887A1 (zh) 2015-02-11 2016-08-18 杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司 一种药用glp-1r抗体融合蛋白的稳定溶液制剂
EA201792084A8 (ru) * 2015-04-01 2019-06-28 Зе Скриппс Рисёрч Инститьют Способы и композиции, связанные с полипептидами - агонистами gpcr
US10851144B2 (en) 2015-04-10 2020-12-01 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
AR105616A1 (es) 2015-05-07 2017-10-25 Lilly Co Eli Proteínas de fusión
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
CN107921143B (zh) 2015-06-15 2021-11-19 安吉奥开米公司 用于治疗软脑膜癌病的方法
PL3310347T3 (pl) 2015-06-19 2021-12-27 Opko Biologics Ltd. Długo działające czynniki krzepnięcia i sposoby wytwarzania
AR105284A1 (es) 2015-07-10 2017-09-20 Sanofi Sa Derivados de exendina-4 como agonistas peptídicos duales específicos de los receptores de glp-1 / glucagón
EP3337894A1 (en) 2015-08-17 2018-06-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of alkaline phosphatases
AU2016308504A1 (en) 2015-08-20 2018-01-18 Albumedix Ltd. Albumin variants and conjugates
WO2017041001A2 (en) 2015-09-04 2017-03-09 The California Institute For Biomedical Research Insulin immunoglobulin fusion proteins
WO2017058822A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Identifying effective dosage regimens for tissue non-specific alkaline phosphatase (tnsalp)-enzyme replacement therapy of hypophosphatasia
JP2018533571A (ja) 2015-10-30 2018-11-15 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 患者の頭蓋縫合早期癒合症を治療するための方法
CN105367664B (zh) * 2015-11-04 2019-09-20 成都贝爱特生物科技有限公司 激活GLP-1受体和Amylin受体双功能作用的融合蛋白制备及其用途
CN114874312B (zh) * 2015-11-16 2024-11-12 Ubi蛋白公司 用于延长蛋白质半衰期的方法
WO2017088058A1 (en) 2015-11-24 2017-06-01 Transfert Plus, S.E.C. Peptide compounds and peptide conjugates for the treatment of cancer through receptor-mediated chemotherapy
WO2017155569A1 (en) 2016-03-08 2017-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in children
WO2017173395A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in adolescents and adults
AU2017240238B2 (en) 2016-04-01 2024-06-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating muscle weakness with alkaline phosphatases
CN109071634A (zh) 2016-04-26 2018-12-21 R.P.谢勒技术有限责任公司 抗体偶联物及其制备和使用方法
US10988744B2 (en) 2016-06-06 2021-04-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of producing alkaline phosphatase
IL264208B2 (en) 2016-07-11 2025-02-01 Opko Biologics Ltd Long-acting clotting factors and methods for their preparation
CN106046176B (zh) 2016-08-16 2019-09-10 中国药科大学 一种高活性长效降糖融合蛋白及其制备方法与医药用途
US11116821B2 (en) 2016-08-18 2021-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating tracheobronchomalacia
WO2018045872A1 (zh) * 2016-09-06 2018-03-15 中国药科大学 一种多肽及其用途
CN109200273B (zh) * 2017-07-04 2021-02-19 中国药科大学 一种多肽用于制备预防或治疗脂肪肝病药物的用途
CN106279400A (zh) * 2016-09-06 2017-01-04 中国药科大学 P8降糖肽的设计及其用途
KR20210035022A (ko) 2016-12-14 2021-03-31 리간달 인코포레이티드 핵산 및/또는 단백질 적재물 전달을 위한 조성물 및 방법
CN106519016A (zh) * 2016-12-20 2017-03-22 中国药科大学 降糖调脂肽——Progly肽的设计及其用途
CN107033234B (zh) * 2017-01-03 2018-06-26 北京凯因科技股份有限公司 酰化的glp-1衍生物
JP2020505029A (ja) * 2017-01-25 2020-02-20 メディミューン，エルエルシー リラキシン融合ポリペプチドおよびその使用
CA3057502A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia (hpp) in adults and adolescents
CN108727486A (zh) * 2017-04-24 2018-11-02 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 长效神经生长因子、制备方法及其组合物
US20200157151A1 (en) 2017-05-24 2020-05-21 Transfert Plus, S.E.C. Peptide compounds, conjugate compounds and uses thereof for treating inflammatory diseases
BR112019025195A8 (pt) 2017-05-31 2020-07-07 Univ Copenhagen análogos do peptídeo gip de ação prolongada
MY198425A (en) 2017-08-24 2023-08-29 Novo Nordisk As Glp-1 Compositions and uses Thereof
US11761963B2 (en) 2017-09-27 2023-09-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Biomarker signature for predicting tumor response to anti-CD200 therapy
BR112020007817A2 (pt) 2017-11-21 2020-10-06 Eli Lilly And Company método de uso e composições contendo dulaglutido
CN109836504B (zh) * 2017-11-24 2022-08-02 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的多结构域活性蛋白
CN109836503B (zh) * 2017-11-24 2022-09-16 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的多重活性蛋白
WO2019119673A1 (zh) 2017-12-19 2019-06-27 北京吉源生物科技有限公司 一种双基因修饰的干细胞及其用途
CN113603794B (zh) * 2018-01-11 2024-01-16 安源医药科技（上海）有限公司 用于调节血糖和脂质的增效型双功能蛋白
WO2019140021A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Eli Lilly And Company Combination therapy
CN110092835A (zh) * 2018-01-30 2019-08-06 上海惠盾生物技术有限公司 一种glp-1类似物-col3a1融合蛋白
CN111683676B (zh) 2018-02-02 2024-06-18 诺和诺德股份有限公司 包含glp-1激动剂、n-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐和润滑剂的固体组合物
JP2021519590A (ja) 2018-03-30 2021-08-12 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 糖タンパク質の製造
EP4122954B1 (en) 2018-04-05 2024-04-03 Sun Pharmaceutical Industries Limited Novel glp-1 analogues
SG11202009884YA (en) 2018-04-09 2020-11-27 Amgen Inc Growth differentiation factor 15 fusion proteins
WO2019200594A1 (zh) 2018-04-19 2019-10-24 杭州先为达生物科技有限公司 酰化的glp-1衍生物
US12268733B2 (en) 2018-08-10 2025-04-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neurofibromatosis type 1 and related conditions with alkaline phosphatase
CN110964116A (zh) * 2018-09-26 2020-04-07 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物
CN113226351B (zh) 2018-10-22 2025-01-14 詹森药业有限公司 胰高血糖素样肽1(glp1)-生长分化因子15(gdf15)融合蛋白及其用途
AU2019365212A1 (en) * 2018-10-24 2021-04-29 Shire-Nps Pharmaceuticals, Inc. GLP-2 fusion polypeptides and uses for treating and preventing gastrointestinal conditions
EP3891174A1 (en) 2018-12-03 2021-10-13 Antag Therapeutics ApS Modified gip peptide analogues
WO2020118843A1 (zh) * 2018-12-12 2020-06-18 四川利通科创生物医药科技有限公司 一种glp-1突变体及其制备方法和用途
JP2022516439A (ja) 2018-12-21 2022-02-28 ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド 二特異性タンパク質
CA3056663C (en) 2019-04-05 2022-10-18 Jeffrey S. RIESMEYER Use of dulaglutide in reducing risk of cardiovascular events in patients with type 2 diabetes mellitus
CN110151980B (zh) * 2019-06-30 2022-12-09 中国药科大学 Glp-1受体激动剂融合蛋白在制备预防或治疗高血脂药物中的应用
EP4065585B1 (en) 2019-11-25 2025-08-20 Alkermes, Inc. Substituted macrocyclic compounds and related methods of treatment
MX2022009844A (es) 2020-02-18 2022-09-05 Novo Nordisk As Composiciones y usos del peptido similar al glucagon-1 (glp-1).
CA3171988A1 (en) 2020-02-22 2021-08-26 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Human transferrin receptor binding peptide
CN116390745A (zh) * 2020-08-24 2023-07-04 宾夕法尼亚州大学信托人 编码glp-1受体激动剂融合体的病毒载体及其在治疗猫科动物代谢疾病中的用途
US12122817B2 (en) * 2020-09-22 2024-10-22 Serpentide Inc. Long-lasting GLP1 analogue drug for type-2 diabetes
CN115925994B (zh) * 2020-09-30 2023-09-22 北京质肽生物医药科技有限公司 多肽缀合物和使用方法
CN114685644A (zh) * 2020-12-29 2022-07-01 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 一种人glp-1多肽变体及其应用
WO2022173987A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Alkaline phosphatase polypeptides and methods of use thereof
TW202509086A (zh) 2021-03-22 2025-03-01 日商肽夢想股份有限公司 c－Met蛋白質結合肽複合物
BR112023019228A2 (pt) 2021-03-22 2023-11-28 Japan As Represented By The Director General Of Nat Institute Of Infectious Diseases Peptídeo e composição contendo o peptídeo
CN117440972A (zh) 2021-03-24 2024-01-23 奥克梅斯公司 Upar抗体和具有所述抗体的融合蛋白
CN113150172B (zh) * 2021-04-28 2023-09-22 中国药科大学 Glp-1r/gipr双靶点激动剂融合蛋白及其制备方法与应用
BR112023026370A2 (pt) 2021-06-18 2024-03-05 Peptidream Inc Peptídeo pendente de ligação ao ghr e composição que compreende o mesmo
EP4389758A4 (en) 2021-08-19 2025-08-20 Peptidream Inc HUMAN TRANSFERRIN RECEPTOR BINDING PEPTIDE
WO2023026994A1 (ja) 2021-08-21 2023-03-02 武田薬品工業株式会社 ヒトトランスフェリンレセプター結合ペプチド－薬物コンジュゲート
US20240366775A1 (en) 2021-08-24 2024-11-07 Peptidream Inc. Human transferrin receptor binding antibody-peptide conjugate
KR20240082377A (ko) 2021-09-30 2024-06-10 페프티드림 아이엔씨. 펩티드
CN113801853B (zh) * 2021-11-19 2022-03-15 山东兴瑞生物科技有限公司 Exendin-4融合基因修饰的MSC及其应用
CN117241821B (zh) * 2022-03-25 2024-04-09 北京质肽生物医药科技有限公司 多肽缀合物的药物组合物及其使用方法
EP4501941A1 (en) 2022-03-30 2025-02-05 PeptiDream Inc. Peptide complex having trkb binding activity
EP4323413A1 (en) * 2022-03-30 2024-02-21 Beijing QL Biopharmaceutical Co., Ltd. Liquid pharmaceutical compositions of polypeptide conjugates and methods of uses thereof
EP4541805A1 (en) 2022-06-15 2025-04-23 PeptiDream Inc. Peptide and peptide-containing agent
CN114774496B (zh) * 2022-06-21 2022-10-04 北京惠之衡生物科技有限公司 一种高密度发酵制备glp-1类似物的方法
AU2023287079A1 (en) 2022-06-23 2025-01-30 Guangzhou Innogen Pharmaceutical Group Co., Ltd. Fusion protein containing improved glp-1 receptor agonist and uses
IL319526A (en) 2022-09-30 2025-05-01 Extend Biosciences Inc Long-acting parathyroid hormone
WO2024123812A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Shattuck Labs, Inc. Fusion proteins for the treatment of cardiometabolic diseases
TW202504632A (zh) 2023-06-07 2025-02-01 日商肽夢想股份有限公司 靶向磷脂醯肌醇蛋白聚糖－３之肽組成物及其用途

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
US5766883A (en) * 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
FR2650598B1 (fr) * 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686900B1 (fr) * 1992-01-31 1995-07-21 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1995029239A2 (en) * 1994-04-22 1995-11-02 Corixa Corporation Compounds and methods for the stimulation and enhancement of protective immune responses and il-12 production
US5990077A (en) * 1995-04-14 1999-11-23 1149336 Ontario Inc. Glucagon-like peptide-2 and its therapeutic use
US5925351A (en) * 1995-07-21 1999-07-20 Biogen, Inc. Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
AR008077A1 (es) * 1996-07-26 1999-12-09 Talarico Salinas Laura Beatriz Un polipeptido de fusion o una sal del mismo, su uso, un proceso para prepararlos, una composicion farmaceutica que los comprende, y un vector.
CA2262647C (en) 1996-08-08 2007-12-04 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Methods for regulating gastrointestinal motility
JP3149958B2 (ja) * 1996-08-30 2001-03-26 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｇｌｐ―１誘導体
UA65549C2 (uk) * 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
US6190909B1 (en) * 1997-04-17 2001-02-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. TH2-specific gene
EP0887061A1 (en) * 1997-06-28 1998-12-30 The Procter & Gamble Company Faecal collector
WO1999007404A1 (en) 1997-08-08 1999-02-18 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Novel exendin agonist compounds
AU757748B2 (en) 1997-11-14 2003-03-06 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Novel exendin agonist compounds
ATE383867T1 (de) 1997-11-14 2008-02-15 Amylin Pharmaceuticals Inc Neuartige exendin agonisten
ES2291017T3 (es) 1998-02-13 2008-02-16 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Efectos inotropicos y diureticos de la exendina y glp-1.
DE69942307D1 (de) * 1998-02-27 2010-06-10 Novo Nordisk As N-terminal veränderte glp-1 abkömmlinge
WO1999043341A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives with helix-content exceeding 25 %, forming partially structured micellar-like aggregates
JP2003522099A (ja) 1998-02-27 2003-07-22 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 遅延作用プロファイルを有するｇｌｐ−１のｇｌｐ−１誘導体及びエキセンジン
EP1060191B1 (en) * 1998-02-27 2010-04-28 Novo Nordisk A/S Derivatives of glp-1 analogs
DK1088084T3 (da) * 1998-06-15 2007-01-29 Gtc Biotherapeutics Inc Erythropoietin analog-humant serumalbumin fusionsprotein
DE69941267D1 (de) * 1998-12-10 2009-09-24 Bristol Myers Squibb Co Proteingerüste für antikörper-nachahmer und andere bindende proteine
US6514500B1 (en) * 1999-10-15 2003-02-04 Conjuchem, Inc. Long lasting synthetic glucagon like peptide {GLP-!}
PT1180121E (pt) * 1999-05-17 2004-03-31 Conjuchem Inc Peptidos insulinotropicos de longa duracao
EP1276849A4 (en) 2000-04-12 2004-06-09 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
EP2990417A1 (en) * 2001-12-21 2016-03-02 Human Genome Sciences, Inc. Albumin insulin fusion protein
WO2003059934A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins

Also Published As

Publication number Publication date
US7271149B2 (en) 2007-09-18
KR100942864B1 (ko) 2010-02-17
CZ2014740A3 (cs) 2006-04-12
CA2434237A1 (en) 2002-06-13
UA81897C2 (uk) 2008-02-25
NO20032565D0 (no) 2003-06-05
HUP0302529A2 (hu) 2003-10-28
NO20111369L (no) 2003-08-01
EP1355942B1 (en) 2008-08-27
CY1109377T1 (el) 2014-07-02
AU2002226897B2 (en) 2007-10-25
DK1355942T3 (da) 2008-11-17
PL209550B1 (pl) 2011-09-30
SK288088B6 (sk) 2013-06-03
MXPA03005036A (es) 2003-09-05
NO332221B1 (no) 2012-07-30
CA2716959A1 (en) 2002-06-13
WO2002046227A2 (en) 2002-06-13
PT1355942E (pt) 2008-11-21
BR0116024A (pt) 2005-12-13
CZ308214B6 (cs) 2020-03-04
UA93662C2 (uk) 2011-03-10
WO2002046227A3 (en) 2003-04-24
HRP20030455A2 (en) 2004-08-31
EP1724284A2 (en) 2006-11-22
EP1724284A3 (en) 2007-04-18
NO20032565L (no) 2003-08-01
PL366208A1 (en) 2005-01-24
SI1724284T1 (sl) 2009-12-31
KR20040038901A (ko) 2004-05-08
DE60135581D1 (de) 2008-10-09
CY1108485T1 (el) 2014-04-09
IL155812A0 (en) 2003-12-23
EA200300644A1 (ru) 2003-12-25
ES2311560T3 (es) 2009-02-16
CA2434237C (en) 2012-05-15
ATE437891T1 (de) 2009-08-15
IL184429A0 (en) 2007-10-31
US20040053370A1 (en) 2004-03-18
CN101712722A (zh) 2010-05-26
PL393178A1 (pl) 2011-02-14
SI1355942T1 (sl) 2009-02-28
IL184429A (en) 2010-04-15
HU229218B1 (en) 2013-09-30
ZA200303642B (en) 2004-08-12
HUP0302529A3 (en) 2009-03-30
CN1483041A (zh) 2004-03-17
IL155812A (en) 2009-09-22
ES2328510T3 (es) 2009-11-13
EP1355942A2 (en) 2003-10-29
DK1724284T3 (da) 2009-11-02
SK6702003A3 (en) 2004-08-03
EA005584B1 (ru) 2005-04-28
DE60139430D1 (de) 2009-09-10
ATE406384T1 (de) 2008-09-15
NZ525577A (en) 2005-05-27
HU230603B1 (hu) 2017-03-28
SK288342B6 (en) 2016-03-01
KR20080085082A (ko) 2008-09-22
JP2004528014A (ja) 2004-09-16
NO331273B1 (no) 2011-11-14
JP2011006447A (ja) 2011-01-13
HUP1300326A2 (en) 2003-10-28
ECSP064643A (es) 2009-07-25
NO20101602L (no) 2003-08-01
EP1724284B1 (en) 2009-07-29
HK1061411A1 (en) 2004-09-17
PT1724284E (pt) 2009-09-30
AU2689702A (en) 2002-06-18
CZ306180B6 (cs) 2016-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20031602A3 (cs) GLP-1 fúzní proteiny
US20070161087A1 (en) Glp-1 fusion proteins
AU2002226897A1 (en) GLP-1 fusion proteins
ES2298785T3 (es) Proteinas de fusion.
KR100758755B1 (ko) Ｇｌｐ-1 유사체 융합 단백질
AU2007231863A1 (en) GLP-1 Fusion Proteins
HK1061411B (en) Glp-1 fusion proteins

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20211129