CN117241821B - 多肽缀合物的药物组合物及其使用方法 - Google Patents

多肽缀合物的药物组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了包含GLP‑1受体激动剂和肽接头的多肽缀合物，以及包含其的药物组合物。还提供了使用此类物质治疗疾病的方法。

Description

多肽缀合物的药物组合物及其使用方法
发明领域
本申请大体上涉及治疗性肽的领域，并且更具体地说，涉及多肽缀合物，即胰高血糖素样肽1(GLP-1)化合物、其药物组合物和使用此类物质预防和/或治疗代谢病症(如糖尿病)的方法。
背景技术
代谢病症或代谢疾病是一组特征在于身体不能适当地将食物转换成能量以及利用和/或储存能量的病况，其中最突出的代谢病症为糖尿病。代谢病症通常与胰岛素抵抗、内脏肥胖、致动脉粥样硬化血脂异常等相关，其在世界范围内构成重大且不断升级的公共卫生和临床挑战。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是响应于营养摄入由肠道L细胞分泌的胰高血糖素原衍生肽。GLP-1主要充当肠促胰岛素，即内分泌激素，以在口服摄入食物之后增加胰岛素反应，通过一般调节胰高血糖素的浓度、减缓胃排空、刺激(促)胰岛素的生物合成、增加对胰岛素的敏感性以及刺激糖原的非胰岛素依赖性生物合成等。因为GLP-1可在正常和糖尿病受试者两者中快速降低血糖水平，所以对于开发用于预防和/或治疗2型糖尿病的基于GLP-1的药剂(即下文中称为GLP-1化合物)已有相当大的关注。
目前，已知呈天然形式的人GLP-1(具有37个氨基酸残基)活性不良，并且天然GLP-1的两种主要天然存在且生物活性截短形式包括30和31个氨基酸的肽片段，即GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)，其衍生自胰高血糖素原肽的翻译后加工，具有极短体内半衰期，这主要是由于二肽基肽酶DPP-IV引起的N端裂解和失活。尽管已付出极大努力开发更新且更好的GLP-1化合物以及更有利的施用方案，但现有GLP-1化合物及其药物组合物的半衰期、功效和/或给药频率仍远不理想。
因此，需要GLP-1化合物的改进的设计及其改进的药物组合物。
发明内容
本文提供包括药物组合物及其用于治疗/预防代谢病症的使用方法。
在第一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含多肽缀合物和吸收增强赋形剂。
多肽缀合物基本上包含多肽部分和缀合物部分。多肽部分包含单个生物活性肽和肽接头。生物活性肽连接到肽接头的N端并且包含GLP-1受体激动剂。缀合物部分包含第一清除率降低部分(CRM)，其与肽接头中的第一CRM残基缀合。
在一些实施方式中，第一CRM残基与生物活性肽(例如GLP-1受体激动剂)的C端氨基酸残基相距至少5个氨基酸残基(不包括CRM残基)，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、33、35、38、40、43、45、48、50、53、55、58、60、63、65、68、70、73、75或78个氨基酸残基。
在一些实施方式中，GLP-1受体激动剂包含GLP-1。如本文所用，术语“GLP-1”是指具有以下特征的分子：所述分子基本上具有野生型人GLP-1(SEQ ID NO:1)的生物活性，并且所述分子包含与野生型人GLP-1具有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽片段。
在一些实施方式中，GLP-1包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，同时保留SEQ ID NO:1的基本生物活性。
在一些实施方式中，GLP-1包含氨基酸序列X7X8EGTFTSDVSSYLEX22X23AAX26X27FIX30WLVX34GX36G(SEQ ID NO:2)，其中X7为H、咪唑-4-乙酸(IA)或咪唑丙酸(IPA)；X8为A、G、S、V、Aib、T、I或L；X22为G或E；X23为Q、C或K；X26为K、R或C；X27为E、K或C；X30为A、C或K；X34为R、K或C；并且X36为R或G。
在GLP-1的一些实施方式中，X7为H；并且X8为G或Aib。
在一些实施方式中，GLP-1相对于SEQ ID NO:1包含选自下组的位置处的一个或多个突变或由其组成：A8、G22、K26、K34和R36或其任何组合。
在一些实施方式中，GLP-1包含选自下组的一个或多个取代或由其组成：A8Aib、G22E、K26R、K34R和R36G或其任何组合。
在一些实施方式中，GLP-1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3-9。
在如上文所提及的多肽缀合物的任何实施方式中，肽接头的长度可以是至少10个氨基酸残基，至少12、24、32、40、48、50、60、70或80个氨基酸残基。
在一些实施方式中，除第一CRM残基以外，肽接头由选自下组的氨基酸残基组成：G、Q、A、E、P、S和T。
在一些实施方式中，肽接头包含第一序列和第二序列。第一序列由重复序列的一个或多个重复组成，并且连接到第二序列的N端。第一CRM残基在第二序列中，并且是赖氨酸残基或半胱氨酸残基。
在一些实施方式中，肽接头的第一序列中的重复序列具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10(GQEPGAQP)、SEQ ID NO:11(GAQPGAQP)、SEQ ID NO:12(GQEP)、SEQ IDNO:13(GAQP)、SEQ ID NO:14(GAQPGQEPGAQP)、SEQ ID NO:15(GAQPGQEP)、SEQ ID NO:16(GEQP)、SEQ ID NO:17(GPQE)、SEQ ID NO:18(GPEQ)、SEQ ID NO:19(GSEP)、SEQ ID NO:20(GESP)、SEQ ID NO:21(GPSE)、SEQ ID NO:22(GPES)、SEQ ID NO:23(GQAP)、SEQ ID NO:24(GPAQ)、SEQ ID NO:25(GPQA)、SEQ ID NO:26(GSQP)、SEQ ID NO:27(GASP)、SEQ ID NO:28(GPAS)、SEQ ID NO:29(GPSA)、SEQ ID NO:30(GGGS)、SEQ ID NO:31(GSGS)、SEQ ID NO:32(GGGGS)、SEQ ID NO:33(GQEPGQAP)、SEQ ID NO:34(GQAPGQEP)、SEQ ID NO:35(SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG)、SEQ ID NO:36(SEPATS)、SEQ ID NO:37(GSETPG)、SEQ ID NO:38(TSESAT)、SEQ ID NO:39(PESGPG)、SEQ ID NO:40(TSTEPS)和GS。
在一些实施方式中，肽接头的第一序列中的重复序列具有SEQ ID NO:13(GAQP)的序列。在本文中任选地，重复序列的一个或多个重复的数目为1与30之间的整数。在某些实施方式中，重复序列的一个或多个重复的数目选自下组：5、7、9和11。
在某些实施方式中，肽接头的第二序列具有SEQ ID NO:41(GQKP)或SEQ ID NO:42(GQCP)的序列。
在某些实施方式中，多肽接头包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:43-50和82-84。
在如上文所提及的多肽缀合物的任何实施方式中，第一CRM包含血浆蛋白结合部分、聚合物、Fc、HSA(白蛋白)、Xten序列或PAS序列。
在一些实施方式中，第一CRM包含白蛋白结合部分。
在一些实施方式中，白蛋白结合部分包含以下结构：*-A-B-C-D-E，其中A、B、C、D和E通过酰胺键互连，并且A的*端连接到多肽复合物上可缀合残基的反应性基团。
此处，A选自键、其中a、b、c和d独立地为0到4的整数，R1为氢或-COOH。
此处，B选自键、其中e为1到4的整数，其中位置α连接位置α'。
此处，C为键或其中R2为-CH2SO3H或-COOH，f为1到4的整数，n为1到25的整数，其中当B不为键时，则位置β'连接位置β，或者当B为键时，则位置β'连接位置α'。
此处，D选自键、其中g和h独立地为0或1，并且R3为H或-CH2COOH。此处，当B不为键且C为键时，则位置γ'连接位置β；当C不为键时，则位置γ'连接位置γ；并且当B为键且C为键时，则位置γ'连接位置α'。
此处，E为具有下式的酸性基团：其中W表示-(CR4R5)l-，其中R4和R5独立地选自下组：氢、卤素、氰基、羟基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟烷基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基和羧酰胺，R6选自羟基或NR7R8，其中R7和R8独立地选自下组：氢、烷基、羟基和/>并且l为10到20的整数。此处，当D不为键时，则位置δ连接位置δ'，当C不为键且D为键时，则位置δ连接位置γ，当B不为键、C为键且D为键时，则位置δ连接位置β，当A不为键且B、C和D都为键时，则位置δ连接位置α'。
在第一CRM的一些实施方式中，A为键或其中d为1到4的整数，R1为氢；B为键或/>其中e为1到4的整数，其中位置α连接位置α'；C为/>其中R2为-COOH，f为1到4的整数，n为1到25的整数，并且当B不为键时，则位置β'连接位置β，或者当B为键时，则位置β'连接位置α'；D为键；关于E，R4和R5中的每一者为氢，R6为羟基，l为10到20的整数，并且位置δ连接位置γ。
在第一CRM的一些实施方式中，d为1，e为2，f为1，n为1，并且l为14到20的整数。
在第一CRM的一些实施方式中，l为16。
在多肽缀合物的一些实施方式中，第一CRM残基为赖氨酸残基，其中：A为键并且B为
在一些实施方式中，第一CRM包含A基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO)，所述A基团具有下式结构：
在多肽缀合物的一些实施方式中，第一CRM残基为半胱氨酸残基，其中A为并且B为/>
在一些实施方式中，第一CRM包含B基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2)，所述B基团具有下式结构：
在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物是单缀合的，并且具有与肽接头缀合而非与生物活性肽(例如GLP-1)缀合的CRM。
在单缀合的多肽缀合物的一些实施方式中，第一CRM残基为赖氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含一个赖氨酸残基。
在单缀合的多肽缀合物的一些实施方式中，第一CRM残基为半胱氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含一个半胱氨酸残基。
在一些实施方式中，GLP-1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、5、6、8和9。
在本文中，在一些实施方式中，多肽部分包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:52、55、56、60-62、66-71和75-80；并且第一CRM残基为选自下组的位置处的赖氨酸残基或半胱氨酸残基：60、68和76。
以下列出本文所公开的单缀合的多肽缀合物的某些实施方式：
多肽部分包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，并且在76K处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，并且在68K处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，并且在60K处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，并且在76K处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，并且在68K处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，并且在60K处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，并且在76C处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，并且在68C处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，并且在60C处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，并且在76C处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，并且在68C处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，并且第一CRM在60C处与多肽部分缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列，并且在76C处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，并且在68C处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，并且在60C处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，并且在76C处与第一CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列，并且在68C处与第一CRM缀合；或
多肽部分包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，并且在60C处与第一CRM缀合。
在多肽缀合物的某一实施方式中，多肽部分包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，并且第一CRM残基为76K。更具体地说，多肽缀合物的某一实施方式具有以下所示的结构：
在多肽缀合物的某一实施方式中，多肽部分包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，并且第一CRM残基为76K。更具体地说，多肽缀合物的某一实施方式具有以下所示的结构：
在一些实施方式中，多肽缀合物是双缀合的多肽缀合物并且进一步包含与第二CRM残基缀合的第二CRM。
在双缀合的多肽缀合物的一些实施方式中，第一CRM残基和第二CRM残基均为赖氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含两个赖氨酸残基。
在本文中任选地，第二CRM残基在GLP-1中，并且任选地选自下组：K23、K26、K27、K30和K34。
在一些实施方式中，第二CRM残基为K26。
在双缀合的多肽缀合物的一些实施方式中，第一CRM残基和第二CRM残基均为半胱氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含两个半胱氨酸残基。
在本文中任选地，第二CRM残基在GLP-1中，并且任选地选自下组：C23、C26、C27、C30和C34。
在一些实施方式中，第二CRM残基为C26。
在本文中，如上文所描述的位置(即23、26、27、30和34，作为K或C)相对于野生型人GLP-1(SEQ ID NO:1)提及并且从其N端开始。
在本文中，根据一些实施方式，第二CRM与第一CRM相同。在一些实施方式中，第二CRM残基和第一CRM残基均为赖氨酸残基或均为半胱氨酸残基。
在双缀合的多肽缀合物的一些实施方式中，GLP-1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、4、6和7。
在一些实施方式中，多肽部分包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:51、53、54、57-59、63-65和72-74、85和86；第一CRM残基为选自下组的位置处的赖氨酸残基或半胱氨酸残基：68、76和84；并且第二CRM残基为位置26处的赖氨酸残基或半胱氨酸残基。
以下列出如本文所公开的双缀合的多肽缀合物的某些实施方式：
多肽部分包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，并且分别在26K和76K处与第一CRM和第二CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且分别在26K和84K处与第一CRM和第二CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，并且分别在26K和68K处与第一CRM和第二CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，并且分别在26K和76K处与第一CRM和第二CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，并且分别在26K和84K处与第一CRM和第二CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，并且分别在26K和68K处与第一CRM和第二CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，并且分别在26K和96K处与第一CRM和第二CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列，并且分别在26K和60K处与第一CRM和第二CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，并且分别在26C和84C处与第一CRM和第二CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，并且分别在26C和76C处与第一CRM和第二CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且分别在26C和68C处与第一CRM和第二CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，并且分别在26C和84C处与第一CRM和第二CRM缀合；
多肽部分包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，并且分别在26C和76C处与第一CRM和第二CRM缀合；或
多肽部分包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，并且分别在26C和68C处与第一CRM和第二CRM缀合。
在某些实施方式中，多肽部分包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，并且分别在26K和76K处与第一CRM和第二CRM缀合。更具体地说，多肽缀合物的某一实施方式具有以下所示的结构：
在本文中，为了获得第一方面中提供的药物组合物中的多肽缀合物，可以设计编码多肽缀合物的多肽部分(或其片段)的多核苷酸，其可以可操作地布置于载体中。载体可以转移到宿主细胞(如原核细胞或真核细胞)中，并且宿主细胞可以在允许多核苷酸表达的条件下培养，从而获得多肽缀合物的多肽部分。
在本文中任选地，多肽部分表达为可溶性蛋白质。在获得多肽部分之后，CRM可进一步与多肽部分缀合，从而获得单缀合或双缀合的多肽缀合物。
在本文所提供的药物组合物的某些实施方式中，吸收增强赋形剂包含N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐。
在本文中，所述盐可选自下组：钠盐、钾盐和铵盐。
在某些实施方式中，所述盐为钠盐，即药物组合物基本上包含N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸钠(SNAC)作为吸收增强赋形剂。
任选地，药物组合物进一步包括其它药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方式中，药物组合物进一步包含至少一种润滑剂，所述润滑剂各自选自下组：硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、胶态二氧化硅、二十二酸甘油酯、聚氧化乙烯聚合物、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁、油酸钠、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸、氢化植物油、轻质矿物油、二氧化硅、烷基硫酸盐、苯甲酸钠、聚乙二醇、滑石、蜡和甘油酯。
在某些实施方式中，至少一种润滑剂包含硬脂酸镁或由硬脂酸镁组成。
在某些实施方式中，药物组合物进一步包含至少一种填充剂，所述填充剂各自选自下组：微晶纤维素(MCC)、纤维素粉末、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、磷酸氢钙、玉米淀粉和预胶化淀粉。
任选地，药物组合物可进一步包含至少一种粘合剂，所述粘合剂各自选自下组：聚维酮、乳糖、羟丙基纤维素、L-羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素(HPMC)、甲基纤维素聚合物、羟乙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、其它纤维素衍生物、蔗糖、糊精、麦芽糊精、淀粉、乳酸钙、碳酸钙、阿拉伯胶、海藻酸钠、琼脂、角叉菜胶、明胶、瓜尔豆胶、果胶、PEG。
在某些实施方式中，药物组合物不包含填充剂或粘合剂。
在某些实施方式中，药物组合物由多肽缀合物、N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸钠(SNAC)和硬脂酸镁组成。
在某些实施方式中，多肽缀合物是单缀合的，并且第一CRM为多肽缀合物的缀合物部分中的唯一一个CRM。任选地，第一CRM残基为赖氨酸残基，并且进一步任选地，并且第一CRM包含A基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO)，所述A基团具有下式结构：
其中剂型包含：大致0.5-50mg(0.5-50mg(例如0.5-10mg、0.5-2.5mg、2.5-5mg、5-10mg、10-20mg或20-50mg)的多肽缀合物；以及大致50-300mg(例如100-300mg)的SNAC。
在某些实施方式中，药物组合物进一步包含1-10mg润滑剂。
在药物组合物的某些实施方式中，多肽缀合物的多肽部分包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，并且在76K处与第一CRM缀合。
在药物组合物的某些实施方式中，多肽缀合物的多肽部分包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，并且在76K处与第一CRM缀合。
在某些实施方式中，SNAC占单位剂型的约80％到约98％、约81％到约98％、约82％到约98％、约83％到约98％、约84％到约98％、约85％到约98％、约86％到约98％、约87％到约98％、约88％到约98％、约89％到约98％、约90％到约98％w/w。
在某些实施方式中，其单位剂型包含至多300mg、至多250mg、至多200mg、至多150mg、至多100mg或至多50mg SNAC。
在某些实施方式中，其单位剂型包含约50mg到约300mg、约75mg到约300mg、约100mg到约300mg、约100mg到500mg、约150mg到约300mg、约200mg到约300mg SNAC。
在某些实施方式中，SNAC占单位剂型中的赋形剂的约91％到约98％w/w。
在某些实施方式中，多肽缀合物占单位剂型的约0.1％w/w到约20％w/w。
在某些实施方式中，其单位剂型包含至多50mg、至多40mg、至多30mg、至多20mg或至多10mg的多肽缀合物。
在某些实施方式中，其单位剂型包含0.5-50mg、0.5-40mg、0.5-30mg、0.5-20mg、0.5-10mg、0.5-5mg、0.5-2.5mg、2.5-5mg、2.5-10mg、2.5-15mg、2.5-20mg、5-10mg、10-20mg、10-30mg或20-50mg的多肽缀合物。
在某些实施方式中，单位剂型包含1-10mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含大致0.5-50mg的多肽缀合物、大致50-300mg的SNAC和大致1-10mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含：大致0.5-10mg的多肽缀合物、大致50-300mg的SNAC和大致1-10mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含：大致10-20mg的多肽缀合物、大致100-300mg的SNAC和大致1-10mg硬脂酸镁；或
在某些实施方式中，单位剂型包含：大致20-50mg的多肽缀合物、大致200-300mg的SNAC和大致1-10mg硬脂酸镁。
在药物组合物的某些实施方式中，多肽缀合物是双缀合的，并且多肽缀合物的缀合物部分进一步包含与多肽部分中的第二CRM残基缀合的第二CRM。任选地，第二CRM残基为赖氨酸残基，并且进一步任选地，第一CRM和第二CRM中的每一者包含A基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO)，所述A基团具有下式结构：
其中药物组合物的剂型包含：大致10-100mg(例如10-20mg、10-50mg、20-30mg、20-40mg、20-50mg、40-50mg、50-70mg或80-100mg等)的多肽缀合物；以及大致50-500mg(例如50-100mg、100-200mg、250-500mg等)的SNAC。在一些实施方式中，药物组合物进一步包含1-20mg润滑剂。
在药物组合物的一些实施方式中，多肽缀合物的多肽部分包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，并且分别在26K和76K处与第一CRM和第二CRM缀合。
在某些实施方式中，SNAC占单位剂型的约60％到约96％、约62％到约96％、约65％到约96％、约66％到约96％、约67％到约96％、约68％到约96％、约70％到约96％、约72％到约96％、约75％到约96％、约78％到约96％、约80％到约96％、约86％到约96％、约87％到约96％w/w。
在某些实施方式中，其单位剂型包含至多500mg、至多450mg、至多400mg、至多350mg、至多300mg、至多250mg、至多200mg、至多150mg、至多100mg SNAC。
在某些实施方式中，其单位剂型包含约100mg到约500mg、约100mg到约450mg、约100mg到约400mg、约100mg到约350mg、约100mg到约300mg SNAC。
在某些实施方式中，SNAC占单位剂型中的赋形剂的约91％到约98％w/w。
在某些实施方式中，多肽缀合物占单位剂型的至少1％w/w且至多32％w/w。
在某些实施方式中，其单位剂型包含至多100mg、至多90mg、至多80mg、至多70mg、至多60mg、至多50mg、至多40mg、至多30mg、至多20mg、至多10mg的多肽缀合物。
在某些实施方式中，其单位剂型包含10-100mg、10-90mg、10-80mg、10-70mg、10-60mg、10-50mg、10-40mg、20-100mg、20-90mg、20-80mg、20-70mg、20-60mg、20-50mg、20-40mg的多肽缀合物。
在某些实施方式中，单位剂型包含1-20mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，其单位剂型包含：大致10-100mg的多肽缀合物；大致100-500mg的SNAC，和大致1-20mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含：大致10-20mg的多肽缀合物、大致100-300mg的SNAC和大致1-20mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含：大致20-40mg的多肽缀合物、大致200-300mg的SNAC和大致1-20mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含：大致20-50mg的多肽缀合物、大致200-300mg的SNAC和大致1-20mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含：大致40-50mg的多肽缀合物、大致200-300mg的SNAC和大致1-20mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含：大致50-100mg的多肽缀合物、大致300-500mg的SNAC和大致1-20mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含大致0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg或100mg的多肽缀合物。
在如上文所提及的药物组合物的任何实施方式中，其剂型可呈选自下组的形式：片剂、胶囊、药囊、口香糖和散剂。
在某些实施方式中，药物组合物的剂量呈片剂形式。
在第二方面，本申请提供一种预防或治疗有需要的受试者的代谢病症的方法，其包括施用治疗有效量的第一方面的多肽缀合物。
在某些实施方式中，代谢病症为糖尿病、肥胖症、超重、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、心血管如血脂异常、动脉粥样硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、糖尿病肾病、妊娠期糖尿病、代谢综合征如代谢综合征X、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、终末期肝病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝硬化或原发性胆汁性肝硬化(PBC)或阿尔茨海默病。
在某些实施方式中，糖尿病可以是任何形式的糖尿病，包括但不限于高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低、1型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、青年的成年发病型糖尿病(MODY)、妊娠期糖尿病和HbA1C水平升高。
在某些实施方式中，代谢病症为阿尔茨海默病。在某些实施方式中，本申请提供一种预防或治疗有需要的受试者的阿尔茨海默病的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物或药物组合物。
在第三方面，本申请提供一种管理有需要的受试者的体重的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物，从而管理受试者的体重。
在第四方面，本申请提供一种减少有需要的受试者的食物摄入量的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物，从而减少受试者的食物摄入量。
在第五方面，本申请提供一种减轻有需要的受试者的体重的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物，从而减轻受试者的体重。
在如上文所提及的第二到第五方面中的任一方法中，受试者可以是人。
在某些实施方式中，受试者的空腹血糖水平为125mg/dL或更高。
在某些实施方式中，受试者的身体质量指数(BMI)为至少或高于25。
在某些实施方式中，药物组合物按以下或不超过以下的给药方案施用：每天两次、每天一次、每2天一次、每3天一次或每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次。
在某些实施方式中，药物组合物每天两次、每天一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两月一次施用。
在某些实施方式中，给药方案的给药间隔在约每3天一次到约每月一次，或约每周一次到约每月一次的范围内。
在某些实施方式中，药物组合物口服施用。
在整个本申请中，冠词“一(a/an)”和“所述”在本文中用于指所述冠词的一个(种)或超过一个(种)(即，至少一个(种))语法对象。举例来说，“融合多肽”意指一个融合多肽或多于一个融合多肽。
在本申请中出现一系列叙述的数值的所有情况下，应理解，任何叙述的数值可以是数值范围的上限或下限。应进一步理解，本发明涵盖所有此类数值范围，即，具有数值上限和数值下限的组合的范围，其中上限和下限中的每一者的数值可以是本文中叙述的任何数值。本文所提供的范围理解为包括范围内的所有值。举例来说，1-10理解为包括所有值1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，以及适当时分数值。类似地，由“至少”限定的范围理解为包括提供的下限值和所有更高的数字。
如本文所用，“约”或“大致”理解为包括在平均值的三个标准差内或在特定技术中的标准公差范围内。在某些实施方式中，约理解为不超过0.5的变化。
冠词“一”在本文中用于指所述冠词的一个或多于一个(即，指至少一个)语法对象。举例来说，“一元件”意指一个元件或多于一个元件。
术语“包括”在本文中用以意指短语“包括但不限于”且可与所述短语互换使用。类似地，“如”在本文中用以意指短语“如但不限于”且可与所述短语互换使用。
除非上下文另外明确指示，否则术语“或”在本文中包含地使用以意指术语“和/或”且可与所述术语互换使用。
附图说明
图1A到1B显示测试分子在C57BL/6小鼠中的体内活性。为了评估体重变化，对10周龄雄性C57BL/6小鼠用待测药物进行皮下注射给药一次。图1A显示分子012或分子001给药后第1天到第8天的体重减轻。图1B显示分子007、008、012和016给药后第1天到第8天的体重减轻。数据指示为平均值和标准误差(SEM)。索玛鲁肽作为比较对照平行测试。
图2A、2B、2C、2D和2E显示分子001、002、012和019在db/db小鼠中的体内活性。图2A显示分子001单次剂量给药后的空腹血糖。图2B显示分子002单次剂量给药后的空腹血糖。数据指示为平均值和标准误差(SEM)。图2C显示分子012单次剂量给药后的非空腹血糖。图2D显示分子019单次剂量给药后的非空腹血糖，并且图2E显示分子019单次剂量给药后的非空腹血糖的0-48小时曲线下面积。为了评估血糖，10周龄雄性db/db小鼠用所示GLP-1多肽缀合物以所示剂量皮下施用。在不同时间测量空腹血糖(图2A和2B)或非空腹血糖(图2C和2D)，并且每个组使用五只动物。Δ血糖是血糖减去基线水平。数据指示为平均值和标准误差(SEM)。
图3A和3B显示在饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中的体内功效。为了评估各个GLP-1多肽缀合物对体重、食物摄入量和血糖水平的影响，22周龄DIO小鼠(摄入高脂肪饮食13周的C57BL/6小鼠)每隔一天用不同浓度的所示GLP-1多肽缀合物皮下施用，持续25天。图3A显示在10、30和100nmol/kg的分子012的剂量滴定的情况下的体重变化。图3B显示给药后的空腹血糖变化。数据表示为平均值和标准误差(SEM)。
图4A-4D分别是分子012不同药物组合物的GLP-1(图4A)和SNAC(图4B)的溶出曲线。图4C和4D分别是分子012不同药物组合物的GLP-1(图4C)和SNAC(图4D)的溶出曲线。
图5A-5E显示在阿尔茨海默病(APP/PS1，APPswe/PSEN1dE9)小鼠中的体内功效。为了评估各个GLP-1多肽缀合物对认知功能(莫里斯(Morris)水迷宫和Y迷宫)、脑Aβ斑块沉积和海马锥体神经元数目的影响，6月龄APP/PS1雄性小鼠每天一次(QD)或每隔一天(Q2D)用不同浓度的所示GLP-1多肽缀合物(分子012)皮下施用，持续10周。图5A分别显示分子012在30和100nmol/kg下的象限占有率变化。图5B分别显示分子012在30和100nmol/kg下的交替百分比变化。图5C分别显示分子012在30和100nmol/kg下的皮质中Aβ斑块沉积变化。图5D分别显示分子012在30和100nmol/kg下的海马中的Aβ斑块沉积变化。图5E分别显示分子012在30和100nmol/kg下的海马中的神经元数目变化。数据表示为平均值和标准误差(SEM)。用媒剂给药的野生型小鼠用作对照。用媒剂给药的阿尔茨海默病(APP/PS1)小鼠也用作对照。用索玛鲁肽给药的阿尔茨海默病(APP/PS1)小鼠也用作对照。
图6A-6E显示本申请中所公开的所有序列(除SEQ ID NO:81以外)。
具体实施方式
以下对本发明的描述仅旨在说明本发明的各种实施方式。如此，所讨论的具体修改不应被解释为对本发明范围的限制。对本领域的技术人员将显而易见的是，可以在不脱离本发明的范围的情况下作出各种等效物、变化和修改，并且应理解，此类等效实施方式将包括在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本文中。
定义
如本文所用，术语“氨基酸”是指含有胺(-NH2)和羧基(-COOH)官能团以及每种氨基酸特有的侧链的有机化合物。
如本文所用，术语“天然存在的”氨基酸残基是指在天然蛋白质或肽中发现的氨基酸残基，如果其结构允许D和L立体异构体形式，则均呈此类立体异构形式。天然存在的氨基酸残基的实施例包括但不限于20种标准氨基酸，包括甘氨酸(Gly或G)、丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、丝氨酸(Ser或S)、半胱氨酸(Cys或C)、苏氨酸(Thr或T)、蛋氨酸(Met或M)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)、酪氨酸(Tyr或Y)、色氨酸(Trp或W)、组氨酸(His或H)、赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、天冬酰胺(Asn或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)，以及其天然类似物，如刀豆氨酸、吡咯赖氨酸(PYL)、硒代半胱氨酸、吡咯啉-羧基-赖氨酸(PCL)、肌氨酸、β-丙氨酸、磷酸丝氨酸、γ-羧基谷氨酸和鸟氨酸。呈D立体异构体的天然存在的氨基酸残基的实施例包括例如D-天冬氨酸、D-丝氨酸、D-半胱氨酸、D-丙氨酸、D-谷氨酸等。
“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基以及R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但将保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
如本文所用，“非天然”氨基酸残基是指未在自然界中发现的任何氨基酸残基，包括但不限于修饰的氨基酸残基和/或氨基酸模拟物，氨基酸模拟物不是已知天然存在的氨基酸中的一者，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。修饰的氨基酸残基或模拟物可通过添加化学实体(如碳水化合物基团、磷酸基、法呢基、异法呢基、脂肪酸基和用于缀合的接头)、官能化或其它修饰等来产生。非天然氨基酸还可指通过化学合成制造的氨基酸。示范性非天然氨基酸包括但不限于2-氨基异丁酸(Aib)、咪唑-4-乙酸(IA)、咪唑丙酸(IPA)、α-氨基丁酸(Abu)、叔丁基甘氨酸(Tle)、β-丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、去氨基组氨酸(缩写为DesaminoHis，别名咪唑丙酸，缩写为lmpr)、如β-丙氨酸的氨基酸β类似物、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰-组氨酸、α-氟-甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、α,α-二甲基-谷氨酸、间CF3-苯丙氨酸、α,β-二氨基丙酸(缩写为Dap)、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)-羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸以及(1-氨基环辛基)羧酸。
将非天然氨基酸引入到多肽中可通过以下中所描述的技术实现：Wang等人,《科学(Science)》292:498-500,2001；Deiters等人,《美国化学会志(J Am Chem Soc)》125:11782-1 1783,2003；Wang和Schultz,《科学》301:964-967,2003；Zhang等人,《科学》303:371-373,2004或美国专利第7,083,970号。简单来说，这些表达系统中的一些涉及定点诱变以将终止密码子(如琥珀(UAG)、赭石(UAA)和蛋白石(UGA)密码子)引入到编码本申请的融合多肽的开放阅读框中。也可将其它密码子，如四碱基密码子(例如AGGA、AGGU、CGGU、CGCU、CGAU、CCCU、CUCU、CUAU和GGGU)、五碱基密码子、六碱基密码子等引入到非天然氨基酸的表达系统中。然后将此类表达载体引入到可利用对引入的终止密码子或其它密码子具特异性且携带所选非天然氨基酸的tRNA的宿主中。再例如，非天然氨基酸可化学合成并且通过如酰化的化学反应插入到多肽中或连接到多肽。
“序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大数目的相同氨基酸(或核酸)之后，候选序列中的氨基酸(或核酸)残基与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的百分比。换句话说，氨基酸序列(或核酸序列)的序列同一性百分比(％)可以通过将相对于其比较的参考序列相同的氨基酸残基(或碱基)的数目除以候选序列或参考序列中氨基酸残基(或碱基)的总数(以较短者为准)来计算。氨基酸残基的保守取代不视为相同残基。出于确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的目的进行的比对可例如使用可公开获得的工具，如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(U.S.National Center for Biotechnology Information，NCBI)的网站上获得，另参见Altschul S.F.等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,215:403-410(1990)；Stephen F.等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,25:3389-3402(1997))、ClustalW2(可在欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)网站上获得，另参见Higgins D.G.等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》,266:383-402(1996)；Larkin M.A.等人,《生物信息学(Bioinformatics)》(英格兰牛津(Oxford,England)),23(21):2947-8(2007)))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现。本领域的技术人员可使用所述工具提供的默认参数，或可自定义适于比对的参数，例如通过选择合适算法进行。
关于氨基酸序列的“保守取代”是指用具有相似生理化学特性的侧链的不同氨基酸残基置换氨基酸残基。举例来说，可在具有疏水性侧链的氨基酸残基(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)间、具有中性亲水性侧链的残基(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)间、具有酸性侧链的残基(例如Asp、Glu)间、具有碱性侧链的氨基酸(例如His、Lys和Arg)间或具有芳香族侧链的残基(例如Trp、Tyr和Phe)间进行保守取代。如本领域中已知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，并且因此可保留蛋白质的生物活性。
如本文所用，术语“功能形式”是指亲本分子的不同形式(如变体、片段、融合体、衍生物和模拟物)，其尽管在氨基酸序列或化学结构中具有差异，但仍保留亲本分子的基本生物活性。如本文所用，表述“保留基本生物活性”意指展现亲本分子的生物活性的至少一部分(例如不小于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或全部。亲本多肽的功能形式可包括天然存在的变体形式和非天然存在的形式，如通过重组方法或化学合成获得的那些。功能形式可含有非天然氨基酸残基。
如本文所用，术语“变体”是指与亲本多肽具有至少70％序列同一性的多肽。变体与亲本肽的不同之处可在于一个或多个氨基酸残基。举例来说，变体可具有亲本多肽的一个更多氨基酸残基的取代、添加、缺失、插入或截短。
如本文所用，术语“片段”是指任何长度的亲本多肽的部分序列。片段仍可保留亲本多肽的至少部分功能。
如本文所用，术语“衍生物”是指化学修饰的多肽或融合多肽，其中一个或多个明确限定数目的取代基已共价连接到多肽或融合多肽的一个或多个特定氨基酸残基。示范性化学修饰可以是例如一个或多个氨基酸的烷基化、酰化、酯化、酰胺化、磷酸化、糖基化、标记、甲基化或与一个或多个部分缀合。
如本文所用，术语“模拟物”是指充当氨基酸、肽、多肽或融合多肽的替代物的分子结构。举例来说，如本文所用，氨基酸模拟物可以是合成结构(已知或未知)，其可为或可不为氨基酸，但保留亲本氨基酸的功能特征，同时氨基酸模拟物的结构不同于亲本氨基酸的结构。实施例包括酰胺的甲基丙烯酰基或丙烯酰基衍生物、β-、γ-、δ-亚氨基酸(如哌啶-4-甲酸)等。
如本文所用，病况的“治疗(treating/treatment)”包括预防或减轻病况，减缓病况的发作或发展速率，降低罹患病况的风险，预防或延迟与病况相关的症状的发展，减少或结束与病况相关的症状，产生病况的完全或部分消退，治愈病况或其某一组合。
如本文所用，术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以引起所述蛋白质表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其携带的基因元件在宿主细胞内表达。载体的实施例包括质粒；噬菌粒；粘粒；人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)；噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体；和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如SV40)。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选元件和报告基因。另外，载体可以含有复制起点。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。载体可以是表达载体或克隆载体。本申请提供载体(例如表达载体)，其含有本文所提供的编码融合多肽的核酸序列、可操作地连接到所述核酸序列的至少一个启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)和至少一个选择标记。载体的实施例包含但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
如本文所用，短语“宿主细胞”是指已将外源多核苷酸和/或载体引入其中的细胞。
术语“药学上可接受的”指示，指定载剂、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐一般在化学上和/或物理上与构成配制物的其它成分相容，并且在生理上与其接受者相容。
如本文所用，术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”是指需要诊断、预后、改善、预防和/或治疗疾病或病症的人或非人动物，包括哺乳动物或灵长类动物。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜，以及动物园、体育或玩赏动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等。
多肽缀合物
在一个方面，本申请提供一种多肽缀合物，其包含多肽部分和缀合物部分。多肽部分包含单个生物活性肽和肽接头。生物活性肽连接到肽接头的N端并且包含GLP-1受体激动剂。缀合物部分包含第一清除率降低部分(CRM)，其与肽接头中的第一CRM残基缀合。在本文中，第一CRM残基与生物活性肽(例如GLP-1受体激动剂)的C端氨基酸残基相距至少5个氨基酸残基(不包括CRM残基)。
术语“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指通过如肽键的共价键连接的氨基酸残基的聚合物。如本文所提供的肽或多肽可包含天然存在的氨基酸残基或非天然氨基酸残基，或两者。本文所提供的多肽和肽可包含任何合适长度的氨基酸残基，例如长度为至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸残基。
多肽缀合物包含单个，即仅一个生物活性肽。关于生物活性肽的“单个”意指多肽缀合物不含分别连接到肽接头的两个或更多个不同的生物活性肽。然而，单个生物活性肽可包括来自不同生物活性肽、融合在一起(例如作为杂合体或嵌合体)的片段或部分，只要这些部分整合为一个肽且不分别连接到接头即可。然而，如果两个不同生物活性肽分别连接到接头的N端和C端，则不是如本申请中所使用的单个生物活性肽。
如本文所用，术语“生物活性肽”意指具有生物功能或活性，例如生理功能或治疗功能的肽。在某些实施方式中，生物活性肽具有治疗活性。单独时不具有生物功能的肽不是生物活性肽。举例来说，肽接头不是生物活性肽，除非其具有其自身的生物功能或活性，例如单独使用时。
生物活性肽包含胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂。
术语“胰高血糖素样肽-1(GLP-1)”(也称为GLP1R)是在胰腺β细胞和脑神经元上发现的受体蛋白，包含一个细胞外结构域和一个跨膜结构域。细胞外结构域可结合GLP-1的C端螺旋，并且跨膜结构域可结合GLP-1的N端区。GLP-1受体通过增强胰岛素分泌参与血糖水平控制。当在脑中表达时，GLP-1受体还可参与食欲控制。
如本文所用，术语“胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂”或“GLP-1受体激动剂”是指能够结合并且激活GLP-1受体的分子。GLP-1受体激动剂可引发与天然配体类似或为其部分的GLP-1受体反应的量值。
如本文所用，术语“清除率修饰部分”或“CRM”是指可改变一种或多种药代动力学(PK)特性(例如延长体内半衰期)的部分。CRM的实施例可包括但不限于脂肪酸、聚乙二醇(PEG)、葡萄糖醛酸或其它基于糖的接头，极性、带正电或负电的基团，其可提高丁二酰亚胺基环的水解率并且降低或最小化反向迈克尔(Michael)反应的速率，因此降低或最小化药物和接头基团从生物活性肽损失到其它含硫醇蛋白质和小分子的比率。
如本文所用，“CRM残基”是指与CRM缀合的氨基酸残基。
如本文所用，术语“缀合物”是指由两个或更多个分子连接在一起形成一个物理实体而得到的化合物。举例来说，本申请的缀合物意指由多肽与一个或多个清除率修饰部分连接在一起而得到的化合物。分子可通过共价键、非共价键、接头、化学修饰或蛋白质融合或通过本领域的技术人员已知的任何手段连接在一起。优选地，分子可通过共价键连接在一起。接合可以是永久性的或可逆的。在一些实施方式中，可包括某些可裂解或不可裂解连接。
尽管CRM与GLP-1受体激动剂的缀合可延长GLP-1受体激动剂的半衰期，但也可能不利地影响GLP-1受体激动剂的生物活性，使其活性低于未缀合的参照物。举例来说，索玛鲁肽，一种缀合的GLP-1衍生物，具有显著延长的半衰期，但相对于其未缀合参照物，其在人血清白蛋白(HSA)存在下，GLP-1受体结合受到939倍的损失(《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》2015,58,7370-7380)。
发明人出乎意料地发现，包含GLP-1受体激动剂的某些CRM缀合的多肽可以既具有延长的半衰期也具有保留的生物活性，如果CRM缀合到在GLP-1受体激动剂之外的连接到其C末端的肽接头上的话。有意思的是，发明人发现，GLP-1受体激动剂的C端与缀合位点之间的距离尤其重要。如果肽接头上的CRM缀合到靠近GLP-1受体激动剂的C端的位置处，则其将显著降低生物活性，甚至可能比在GLP-1受体激动剂自身上缀合还要低得多。然而，如果缀合到足够远离GLP-1受体激动剂的C端的位置处，则CRM缀合的GLP-1受体激动剂可以既具有延长的半衰期又具有保留的生物活性。上述预料不到的效果在某些GLP-1受体激动剂和某些CRM中被发现。
在本文中，根据多肽缀合物的一些实施方式，第一CRM残基与生物活性肽(例如GLP-1受体激动剂)的C端氨基酸残基相距至少5个氨基酸残基(不包括CRM残基)，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、33、35、38、40、43、45、48、50、53、55、58、60、63、65、68、70、73、75或78个等氨基酸残基。在多肽缀合物的一些实施方式中，肽接头的长度可以是至少10个氨基酸残基，例如至少12、24、32、40、48、50、60、70或80个氨基酸残基。
在某些实施方式中，第一CRM残基布置于肽接头中靠近肽接头C端的位置处，其可以与生物活性肽(例如GLP-1受体激动剂)的C端氨基酸残基相距20与50个氨基酸残基之间。下文将提供更多细节。
根据一些实施方式，多肽缀合物是单缀合的，即第一CRM是唯一的缀合物并且多肽缀合物仅在第一CRM残基(在肽接头中)处与第一CRM缀合。
根据一些其他实施方式，多肽缀合物是双缀合的，即多肽缀合物与两个缀合物缀合。一个此类缀合物为第一CRM，其在第一CRM残基(在肽接头中)处与多肽缀合物缀合。另一此类缀合物为第二CRM，其在布置于生物活性肽(即GLP-1受体激动剂，如GLP)中的第二CRM残基处与多肽缀合物缀合。
下文提供GLP-1受体激动剂、CRM和CRM残基以及多肽缀合物的更多细节。
GLP-1受体激动剂
在某些实施方式中，GLP-1受体激动剂包含GLP-1。如本文所用，术语“胰高血糖素样肽-1”或“GLP-1”旨在广泛涵盖天然GLP-1肽和其所有功能形式，如其功能变体、片段、融合体、衍生物和模拟物。
如本文所用，术语“天然GLP-1肽”是指天然人胰高血糖素样肽-1(GLP-1(7-37))，其序列在SEQ ID NO:1中列出。如本文所用，当提及SEQ ID NO:1(即GLP-1(7-37))中的特定氨基酸残基时，遵循GLP-1(1-37)的编号。换句话说，SEQ ID NO:1对应于GLP-1(7-37)，并且因此SEQ ID NO:1中的第1残基(其为组氨酸(H))称为7H，意指其对应于GLP(1-37)中的第7残基；并且SEQ ID NO:1中的第31残基(其为甘氨酸(G))称为37G，意指其对应于GLP(1-37)中的第37残基。
天然GLP-1肽的功能形式能够以与天然GLP-1肽的水平相当，或不低于其约20％(或不低于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)的水平激活GLP-1受体。GLP-1受体的激活典型地启动信号转导通路，产生促胰岛素作用或如本领域中已知的其它生理效应。天然GLP-1肽的功能形式可相对于SEQ ID NO:1含有一个或多个取代、添加或缺失。天然GLP-1肽的许多功能形式是本领域中已知的，例如但不限于利拉鲁肽、索玛鲁肽、杜拉鲁肽、阿必鲁肽以及WO2000055203A1、WO 98/08871、WO 2006/097537中所公开的那些，所述专利的公开内容全文并入本文中。
在某些实施方式中，本文所提供的GLP-1包含与SEQ ID NO:1具有至少70％(例如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)序列同一性的氨基酸序列，同时保留SEQ ID NO:1的基本生物活性。
在某些实施方式中，GLP-1相对于SEQ ID NO:1包含不超过9、8、7、6、5、4、3或2个突变(例如添加、缺失、取代)，同时保留SEQ ID NO:1的基本生物活性。在某些实施方式中，GLP-1相对于SEQ ID NO:1包含至少2、3、4、5、6、7、8或9个突变(例如添加、缺失、取代)，同时保留SEQ ID NO:1的基本生物活性。
本领域的普通技术人员应了解，可在本文所描述的任何多肽片段的序列中进行各种氨基酸取代，例如保守氨基酸取代，而不必定降低其活性。氨基酸取代的实施例包括将L-氨基酸取代为其对应的D-氨基酸，将半胱氨酸取代为高半胱氨酸或具有含硫醇侧链的其它非天然氨基酸，将赖氨酸取代为高赖氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、鸟氨酸或具有含氨基侧链的其它非天然氨基酸，或将丙氨酸取代为正缬氨酸等。
已将各种取代引入到天然GLP-1肽中，并且已显示所述取代能够保留或甚至改善其生物活性。在本文所提供的多肽缀合物的一些实施方式中，GLP-1相对于SEQ ID NO:1包含选自下组的位置处的一个或多个突变或由其组成：A8、G22、K26、K34和R36或其任何组合。举例来说，据信A8处的取代适用于防止残基处的DPP4酶促裂解，G22处的取代合乎改善活性和溶解度的需要，并且R36处的取代适用于降低免疫原性。这些位置处的取代的实施例包括但不限于A8G、A8Aib、A8T、G22E、K34R、R36G，以及美国专利第8,273,854号中所描述的取代，所述专利全文并入本文中。
在多肽缀合物的一些实施方式中，GLP-1包含选自下组的一个或多个取代或由其组成：A8Aib、G22E、K26R、K34R和R36G或其任何组合。
在多肽缀合物的一些实施方式中，GLP-1是基本上具有野生型人GLP-1(SEQ IDNO:1)的生物活性的分子，并且包含具有与野生型人GLP-1具有至少50％(例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)序列同一性的氨基酸序列的多肽片段。
在一些实施方式中，GLP-1包含与SEQ ID NO:1具有至少70％(例如至少70％、75％、80％、85％、90％或95％)序列同一性的氨基酸序列，同时保留SEQ ID NO:1的基本生物活性。
在一些实施方式中，GLP-1包含氨基酸序列X7X8EGTFTSDVSSYLEX22X23AAX26X27FIX30WLVX34GX36G(SEQ ID NO:2)，其中X7为H、咪唑-4-乙酸(IA)或咪唑丙酸(IPA)；X8为A、G、S、V、Aib、T、I或L；X22为G或E；X23为Q、C或K；X26为K、R或C；X27为E、K或C；X30为A、C或K；X34为R、K或C；并且X36为R或G。
在GLP-1的一些实施方式中，X7为H；并且X8为G或Aib。
在某些实施方式中，GLP-1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1和3-9，其列于以下(基因型在序列识别号之后指示)：
SEQ ID NO:1(WT GLP-1)
SEQ ID NO:3(8Aib、34R、36G)，
SEQ ID NO:4(8Aib、26C、34R、36G)，
SEQ ID NO:5(8Aib、26R、34R、36G)，
SEQ ID NO:6(8Aib、22E、34R、36G)，
SEQ ID NO:7(8Aib、22E、26C、34R、36G)，
SEQ ID NO:8(8Aib、22E、26R、34R、36G)，
SEQ ID NO:9(8G、22E、26R、34R、36G)。
在某些实施方式中，多肽缀合物中的GLP-1受体激动剂包含或为本申请中提供的GLP-1。在一些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物中的GLP-1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3-9。
肽接头
在本文所公开的多肽缀合物中，生物活性肽，即GLP-1受体激动剂(例如GLP-1)连接到肽接头的N端。
在本文中，GLP-1受体激动剂可任选地通过直接连接(例如共价键，如肽键)连接到肽接头，并且肽接头可任选地由通过肽键连接在一起的氨基酸残基构成。任选地，肽接头可进一步包含一个或多个非天然氨基酸。
在多肽缀合物的一些实施方式中，肽接头的长度可以是至少10个氨基酸残基，例如至少12、24、32、40、48、50、60、70或80个氨基酸残基。
可使用任何合适的多肽接头。举例来说，多肽接头可包含选自以下的氨基酸残基或由其组成：氨基酸甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、半胱氨酸(C)和赖氨酸(K)。在一些实施方式中，多肽接头可由大部分非空间位阻的氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸构成。在一些实施方式中，接头为聚甘氨酸、聚丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合(如聚(Gly-Ala))或甘氨酸和丝氨酸的组合(如聚(Gly-Ser))。
在一些实施方式中，除第一CRM残基以外，肽接头由选自下组的氨基酸残基组成：G、Q、A、E、P、S和T。
在一些实施方式中，肽接头包含第一序列和第二序列。第一序列由重复序列的一个或多个重复组成，并且连接到第二序列的N端。第一CRM残基在第二序列中，并且可以任选地为赖氨酸残基或半胱氨酸残基。
在某些实施方式中，重复序列包含选自下组的序列或由其组成：SEQ ID NO:10-40和GS。
在一些实施方式中，重复序列具有SEQ ID NO:13(GAQP)的序列。
在本文中任选地，重复序列的一个或多个重复的数目为1与30之间的整数。在某些实施方式中，重复序列的一个或多个重复的数目选自下组：5、7、9和11。
在某些实施方式中，肽接头的第二序列具有SEQ ID NO:41(GQKP)或SEQ ID NO:42(GQCP)的序列。
在某些实施方式中，多肽接头包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:43-50和82-84。
应注意，除肽接头包含第一序列和第二序列，其中第一序列由重复序列的一个或多个重复组成的以上布置之外，还可存在其它布置。在某些情况下，肽接头可包含多于一个重复序列或由其组成。举例来说，多肽接头包含2、3或4个不同重复序列或由其组成。在某些实施方式中，多肽接头包含不同重复序列的顺序或串联重复或由其组成。
CRM残基
不希望受任何理论束缚，据信CRM(或脂肪酸)与GLP-1的缀合会降低其在HSA存在下的活性。举例来说，GLP-1活性降低在索玛鲁肽中被报道过，索玛鲁肽具有与GLP-1(8Aib、36R)的K26缀合的脂肪酸，并且与其未缀合的参照物相比，显示在HSA存在下活性显著降低。由于HSA存在于人血液中并且在生理条件下不可避免，因此认为，在HSA存在下，GLP-1受体激动剂活性的降低会削弱蛋白质缀合物的治疗活性。然而，尽管存在CRM缀合，但本文所提供的一些多肽缀合物却可在HSA存在下保留大部分GLP-1活性。在此类实施方式中，本文所提供的多肽缀合物是单缀合的，并且具有与肽接头缀合而非与生物活性肽(例如GLP-1)缀合的CRM。
在这些实施方式中的部分实施方式中，与不具有肽接头且具有在GLP-1上缀合的CRM的参比多肽缀合物相比，本文所提供的此类单缀合的多肽缀合物具有更高的在人血清白蛋白(HSA)存在下的GLP-1受体激动剂活性。在某些实施方式中，如本领域中已知，在HSA存在下的GLP-1受体激动剂活性可通过GLP-1受体激活的体外分析，无细胞分析(如cAMP分析)或基于细胞的分析(如报告细胞分析)来确定。在某些实施方式中，参比多肽缀合物为索玛鲁肽。在某些实施方式中，如在相同或相当的分析中所确定，本文所提供的单缀合的多肽缀合物在人血清白蛋白(HSA)存在下激活GLP-1受体，其EC50不超过索玛鲁肽在HSA存在下的EC50的50％(或不超过40％、30％、20％、10％、5％或3％)。在某些实施方式中，如在相同或相当的分析中确定，本文所提供的单缀合的多肽缀合物在不存在HSA的情况下激活GLP-1受体，其EC50与索玛鲁肽在不存在HSA的情况下相当(例如为其20％到300％)。在某些实施方式中，人血清白蛋白(HSA)的量允许评定HSA结合对GLP-1受体激活的影响。在某些实施方式中，GLP-1受体激活的体外分析在至少0.5％、1％、1.2％、1.5％、1.8％或2％HSA存在下进行。
在某些实施方式中，本文所提供的单缀合的多肽缀合物结合HSA，结合亲和力(KD)与索玛鲁肽相当(例如为其约70％到约500％)，如在相同或相当的分析中确定。
在某些实施方式中，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中确定，与不具有肽接头且具有在GLP-1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本文所提供的单缀合的多肽缀合物具有至少相当的终末半衰期。适用于确定终末半衰期的动物包括例如小鼠、大鼠、小型猪或猴。在某些实施方式中，在合适的动物中，在以适合于提供疗效的剂量单剂量静脉内施用或皮下施用或口服施用后，确定终末半衰期。
在某些实施方式中，多肽缀合物进一步包含与第二CRM残基缀合的第二CRM。换句话说，本申请还提供双缀合的多肽缀合物。发明人出乎意料地发现，第二CRM缀合可进一步延长多肽缀合物的半衰期。在某些实施方式中，具有第一和第二CRM缀合两者的双缀合的多肽缀合物可具有延长的半衰期，其比仅具有一个CRM缀合的对应多肽缀合物(例如索玛鲁肽)长至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍或甚至更长。
第二CRM残基可处于任何合适的位置。在某些实施方式中，第二CRM残基在GLP-1受体激动剂中或在肽接头中。
在某些实施方式中，第二CRM残基在GLP-1肽的K26处。据报道，在GLP-1肽上与两个脂肪酸部分缀合可显著降低活性，或者甚至使缀合的GLP-1肽失去活性。因此，发明人出乎意料地发现，在GLP-1(例如K26)上以及在足够远离GLP-1肽C端的肽接头上都进行缀合时，可以使脂肪酸缀合对GLP-1多肽在HSA存在下的生物活性的负面影响最小化。
在这些实施方式中的部分实施方式中，与不具有肽接头且具有在GLP-1上缀合的CRM的参比多肽缀合物相比，本文所提供的此类双缀合的多肽缀合物具有相当的或者可接受的在HSA存在下的GLP-1受体激动剂活性。在某些实施方式中，如在相同或相当的分析中所确定，本文所提供的双缀合的多肽缀合物在HSA存在下可激活GLP-1受体，其EC50不超过不具有肽接头且具有在GLP-1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)在HSA存在下的EC50的2000％(或不超过1500％、1000％、900％、800％、700％、600％或500％)。在某些实施方式中，如在相同或相当的分析中所确定，本文所提供的双缀合的多肽缀合物在不存在HSA的情况下可激活GLP-1受体，其EC50与不具有肽接头且具有在GLP-1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)的EC50相当(例如不超过其500％、400％、300％或200％，或甚至更低)。在某些实施方式中，本文所提供的双缀合的多肽缀合物在HSA存在下以第一EC50，且在不存在HSA的情况下以第二EC50激活GLP-1受体，并且第一EC50高于第二EC50但不超过第二EC50的1000倍，例如第一EC50(在HSA存在下)不超过第二EC50(在不存在HSA的情况下)的900倍、800倍、700倍、600倍或500倍。在某些实施方式中，在GLP-1受体激活的体外实验中，HSA存在的量适合于评定HSA结合对GLP-1受体激活的影响。在某些实施方式中，GLP-1受体激活的体外分析在允许评定HSA结合对GLP-1受体激活的影响的合适量的人血清白蛋白(HSA)存在下进行。在某些实施方式中，GLP-1受体激活的体外分析在至少0.5％、1％、1.2％、1.5％、1.8％或2％HSA存在下进行。
在某些实施方式中，如在相同或相当的分析中确定，本文所提供的双缀合的多肽缀合物以较高结合亲和力结合HSA，其KD值显著低于(例如不超过其50％、40％、30％或20％)不具有肽接头且具有在GLP-1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)。
在某些实施方式中，与不具有肽接头且具有在生物活性肽(例如GLP-1)上缀合的CRM的参比多肽缀合物相比，本文所提供的双缀合的多肽缀合物具有增强的药代动力学特性，其中药代动力学特性由在向受试者施用治疗有效剂量之后测量多肽缀合物的血液浓度来确定。
在某些实施方式中，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中确定，与不具有肽接头且具有在GLP-1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本文所提供的双缀合的多肽缀合物的终末半衰期延长至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、300％或400％。适用于确定终末半衰期的动物包括例如小鼠、大鼠、小型猪或猴。在某些实施方式中，在合适的动物中在以适合于提供疗效的剂量单剂量静脉内施用或皮下施用后确定终末半衰期。
在某些实施方式中，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中确定，本申请所提供的双缀合的多肽缀合物的血液或血浆或血清浓度保持在多肽缀合物的治疗窗内的时间段，比不具有肽接头且具有在GLP-1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)长至少约50％(长60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、300％或400％)。如本文所用，“治疗窗”意指多肽缀合物在血液或血浆或血清中的对待治疗的病况提供治疗益处或功效而无不可接受的毒性的浓度水平范围。浓度水平的范围可以从产生治疗效应的最小浓度到提供治疗效应但不导致不可接受的毒性的最大浓度。
在某些实施方式中，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中确定，与不具有肽接头且具有在GLP-1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本文所提供的双缀合的多肽缀合物提供延长的疗效持续时间。此类延长的疗效可由时间效应曲线的曲线下面积(AUC)表征，其可在单剂量或重复剂量后绘制，所述剂量适合于在患有代谢病况的受试者(例如疾病模型动物)中提供预期治疗效果。延长的疗效持续时间还可由治疗效应的持续时间表征。
在某些实施方式中，治疗效应包含体重减轻、食物摄入量减少或血糖水平降低(空腹血糖水平或非空腹血糖水平)。在某些实施方式中，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中确定，与不具有肽接头且具有在GLP-1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本文所提供的双缀合的多肽缀合物的时间效应曲线的AUC增加至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％。在某些实施方式中，如在相当的体内研究条件下且在相同类型的实验动物中确定，与不具有肽接头且具有在GLP-1上缀合的CRM的参比多肽缀合物(如索玛鲁肽)相比，本文所提供的双缀合的多肽缀合物的治疗效应的持续时间延长至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、300％、400％。在某些实施方式中，用于治疗效应的实验动物是疾病模型动物，如db/db小鼠或饮食诱导肥胖(DIO)动物。
CRM残基
在本文所提供的本申请的范围内，取决于所使用的不同CRM，可在多肽缀合物中使用不同CRM残基，并且多肽缀合物中可存在介导CRM与多肽缀合物的缀合的一个或两个CRM残基。
在某些实施方式中，多肽缀合物可与CRM单缀合。
在某些实施方式中，存在于肽接头中的第一CRM残基为赖氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含一个赖氨酸残基。在此类实施方式中，肽接头仅包含一个赖氨酸残基，并且GLP-1受体激动剂不包含赖氨酸残基，并且因此天然GLP-1(1-37)序列中发现的天然存在的残基，即K26和K34可任选地被取代为非赖氨酸残基(例如R、Q、A、G、H、S和T等)。在某些实施方式中，GLP-1包含K26R和K34R的取代。
应注意，在整个说明书中，当CRM残基(例如K或C)存在于GLP-1中时，CRM残基的位置参考GLP-1(1-37)的氨基酸序列来鉴别。举例来说，K26指示参考GLP-1(1-37)的氨基酸序列的第26位(其对应于参考GLP-1(7-37)，即SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第20位)为K。类似地，K34指示参考GLP-1(1-37)的氨基酸序列的第34位(其对应于参考GLP-1(7-37)，即SEQID NO:1的氨基酸序列的第28位)为K。
在某些实施方式中，存在于肽接头中的第一CRM残基为半胱氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含一个半胱氨酸残基。在此类实施方式中，肽接头仅包含一个半胱氨酸残基，并且GLP-1受体激动剂不包含半胱氨酸残基。在某些实施方式中，多肽缀合物中的单个生物活性肽多肽包含GLP-1。天然GLP-1不含任何半胱氨酸残基，并且因此可使用任何GLP-1衍生物(包括本文所提供的那些)，只要其不含半胱氨酸残基即可。
在某些实施方式中，第一CRM残基为非天然氨基酸残基，并且多肽缀合物仅包含一个非天然氨基酸残基作为CRM残基。非天然氨基酸可含有多种官能团或反应性基团，其可提供额外功能和/或反应性。有益于将部分缀合到本申请的融合多肽的目的的特定非天然氨基酸包括带具有叠氮、炔烃、烯烃、环炔烃或卤基的侧链的非天然氨基酸。
在单缀合的多肽缀合物中，当存在于肽接头中的第一CRM残基为赖氨酸残基时，GLP-1可包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在本文中，肽接头可任选地包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。在某些实施方式中，多肽缀合物包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:52、55、56和60-62，其列于以下(第一CRM残基在序列识别号之后指示)：
SEQ ID NO:52(76K)，
SEQ ID NO:55(68K)，
SEQ ID NO:56(60K)，
SEQ ID NO:60(76K)，
SEQ ID NO:61(68K)，或
SEQ ID NO:62(60K)。
在单缀合的多肽缀合物中，当存在于肽接头中的第一CRM残基为半胱氨酸残基时，GLP-1可包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、5、6和9。在本文中，肽接头可任选地包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50。在某些实施方式中，多肽缀合物包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:66-71和75-80，其列于以下(第一CRM残基在序列识别号之后指示)：
SEQ ID NO:66(76C)，
SEQ ID NO:67(68C)，
SEQ ID NO:68(60C)，
SEQ ID NO:69(76C)，
SEQ ID NO:70(68C)，
SEQ ID NO:71(60C)，
SEQ ID NO:75(76C)，
SEQ ID NO:76(68C)，
SEQ ID NO:77(60C)，
SEQ ID NO:78(76C)，
SEQ ID NO:79(68C)，
SEQ ID NO:80(60C)。
在某些实施方式中，多肽缀合物进一步包含第二CRM残基，即多肽缀合物是双缀合 的，其具有分别在两个CRM残基(即第一CRM残基和第二CRM残基)处缀合的两个CRM(即第一CRM和第二CRM)。
在某些实施方式中，第二CRM残基在肽接头中，正如第一CRM残基一样。在此类实施方式中，第二CRM残基可与第一CRM残基相距任何合适的距离，只要两个CRM残基可适当地缀合即可。
在某些实施方式中，第二CRM残基在GLP-1受体激动剂，例如GLP-1中。在某些实施方式中，第二CRM残基是在天然GLP-1序列中发现的天然存在的残基，或引入的残基，例如通过取代天然存在的残基或通过插入新的残基。
在某些实施方式中，第一和第二CRM残基均为赖氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含两个赖氨酸残基。在某些实施方式中，第二赖氨酸残基在GLP-1中，并且选自下组：K23、K26、K27、K30和K34。在某些实施方式中，第二CRM残基是天然GLP-1序列中发现的天然存在的残基，例如K26或K34。在某些实施方式中，第二CRM残基是引入的残基。CRM残基可例如通过取代在任何合适的位置处引入GLP-1序列，只要此类取代基本上不降低GLP-1的GLP-1R激动剂活性即可。第二CRM残基可例如通过Q23K、E27K或A30K的取代引入。在某些实施方式中，GLP-1中除CRM残基外的赖氨酸残基取代为非赖氨酸残基，使得多肽缀合物不包含除CRM残基以外的额外赖氨酸残基。举例来说，如果K26为第二CRM残基，则K34取代为非赖氨酸残基，或反之亦然。非赖氨酸残基可由本领域的技术人员选择，并且实施例包括精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。
在双缀合的多肽缀合物中，当第一和第二CRM残基均为赖氨酸残基时，GLP-1可包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在本文中，肽接头可任选地包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:43-45或83。在某些实施方式中，多肽缀合物包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:51、53、54、57-59、85和86，其列于以下(第一和第二CRM残基在序列识别号之后指示)：
SEQ ID NO:51(26K、76K)，
SEQ ID NO:53(26K、84K)，
SEQ ID NO:54(26K、68K)，
SEQ ID NO:57(26K、76K)，
SEQ ID NO:58(26K、84K)，
SEQ ID NO:59(26K、68K)，
SEQ ID NO:85(26K、96K)或
SEQ ID NO:86(26K、60K)。
在某些实施方式中，第一和第二CRM残基均为半胱氨酸残基，并且多肽缀合物仅包含两个半胱氨酸残基。在某些实施方式中，第二半胱氨酸残基在GLP-1中。在某些实施方式中，第二半胱氨酸残基在肽接头中。
在某些实施方式中，第一和第二CRM残基都是非天然氨基酸残基，并且多肽缀合物仅包含两个非天然氨基酸残基作为CRM残基。
在某些实施方式中，GLP-1中的半胱氨酸残基或非天然氨基酸残基通过选自下组的位置处的取代引入：相对于SEQ ID NO:1的Q23、K26、E27、A30和K34。在某些实施方式中，GLP-1中的半胱氨酸残基或NNAA通过相对于SEQ ID NO:1的K26或E27的位置处的取代引入。在某些实施方式中，GLP-1中的第二CRM残基为半胱氨酸，并且通过选自下组的位置处的取代引入：Q23C、K26C、E27C、A30C和K34C。
在双缀合的多肽缀合物中，当第一和第二CRM残基均为半胱氨酸残基时，GLP-1可包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在本文中，肽接头可任选地包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:47-49。在某些实施方式中，多肽缀合物包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:63-65和72-74，其列于以下(第一和第二CRM残基在序列识别号之后指示)：
SEQ ID NO:63(26C、84C)，
SEQ ID NO:64(26C、76C)，
SEQ ID NO:65(26C、68C)，
SEQ ID NO:72(26C、84C)，
SEQ ID NO:73(26C、76C)，
SEQ ID NO:74(26C、68C)。
CRM
在某些实施方式中，第一CRM和/或第二CRM中的每一者(或一般来说，CRM)包含血浆蛋白结合部分、聚合物、Fc、人血清白蛋白(HSA)和其功能片段、Xten序列或PAS序列。在某些实施方式中，Xten序列为具有以下中所描述的氨基酸序列的延伸重组多肽序列：WO2007103515、WO2009023270、WO2010091122、WO2011123813、WO2013130683、WO2017146979、WO2011084808、WO2013040093、WO2013122617、WO2014011819、WO2013184216、WO2014164568、WO2015023891、WO2016077505和WO2017040344，其公开内容已全文并入。在某些实施方式中，术语“PAS”(也可与术语“APS”互换使用)是指由Ala、Ser和Pro残基组成的氨基酸重复，如US8563521B2中所描述，其公开内容已全文并入。
在某些实施方式中，CRM包含白蛋白结合部分。术语“白蛋白结合部分”是指能够以足够的特异性，优选非共价地结合白蛋白(例如人血清白蛋白)或其任何功能片段的任何功能部分。连接到治疗性融合多肽、多肽或多肽复合物的白蛋白结合部分对人血清白蛋白的亲和力典型地低于10μM，并且优选低于1pM。白蛋白结合部分可包括但不限于白蛋白结合结构域、来自合成肽的白蛋白结合序列以及白蛋白结合化学部分。举例来说，白蛋白结合部分选自来自链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域、来自大消化链球菌(Peptostreptococcusmagnus)蛋白质PAB的白蛋白结合结构域、具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:81)的白蛋白结合肽。《生物化学杂志》277,38(2002)35035-35043中已描述许多作为白蛋白结合部分的小肽。再例如，白蛋白结合部分选自含有4-40个碳原子的直链和支链亲脂部分，具有环戊并菲骨架的化合物等。举例来说，白蛋白结合部分为式CH3(CH2)vCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-的基团，其中v为10到24的整数。
在某些实施方式中，白蛋白结合部分包含以下结构：*-A-B-C-D-E，其中A、B、C、D和E通过酰胺键互连，并且A的*端连接到多肽复合物上可缀合残基的反应性基团，并且其中：
A选自键、其中a、b、c和d独立地为0到4的整数，R1为氢或-COOH；
B选自键、其中e为1到4的整数，其中位置α连接位置α'；
C为键或其中R2为-CH2SO3H或-COOH，f为1到4的整数，n为1到25的整数，其中当B不为键时，则位置β'连接位置β，或者当B为键时，则位置β'连接位置α'；
D选自键、其中g和h独立地为0或1，并且R3为H或-CH2COOH，其中：
当B不为键且C为键时，则位置γ'连接位置β；
当C不为键时，则位置γ'连接位置γ；并且
当B为键且C为键时，则位置γ'连接位置α'；
E为具有下式的酸性基团：
其中W表示-(CR4R5)l-，其中R4和R5独立地选自下组：氢、卤素、氰基、羟基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羟烷基、氨基、氨基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧基、芳氧基和羧酰胺，R6选自羟基或NR7R8，其中R7和R8独立地选自下组：氢、烷基、羟基和并且l为10到20的整数，并且其中：
当D不为键时，则位置δ连接位置δ'，
当C不为键且D为键时，则位置δ连接位置γ，
当B不为键、C为键且D为键时，则位置δ连接位置β，
当A不为键且B、C和D都为键时，则位置δ连接位置α'。
在某些实施方式中，
A为键或其中d为1到4的整数，R1为氢；
B为键或其中e为1到4的整数，其中位置α连接位置α'；
C为其中R2为-COOH，f为1到4的整数，并且n为1到25的整数，其中：当B不为键时，则位置β'连接位置β，或者当B为键时，则位置β'连接位置α'；
D为键；
关于E，R4和R5中的每一者为氢，R6为羟基，l为10到20的整数，并且位置δ连接位置γ。
进一步任选地，d为1，e为2，f为1，n为1，并且l为14到20的整数。
在某些实施方式中，CRM与赖氨酸残基缀合，任选地赖氨酸残基在肽接头中或在GLP-1中。在本文中，A可为键且B可为
在此类实施方式中，CRM包含下式结构(也称为-HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO，其中2XADO意指两个连续ADO部分，并且ADO为8-氨基-3,6-二氧杂辛酸的缩写)：
在某些实施方式中，CRM与半胱氨酸残基缀合，任选地半胱氨酸残基在肽接头中或在GLP-1中。在本文中，A可为并且B可为/>其中位置α连接位置α'。
在此类实施方式中，CRM包含下式结构(也称为HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2)或HOOC-(CH2)20-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2)：
进一步根据一些实施方式，CRM包含下式结构(也称为HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2)：
多肽缀合物
在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物包含选自下组的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:51-80和85-88。
在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物是单缀合的，即单个CRM在多肽缀合物的多肽部分中的单个CRM残基处缀合。在本文中，GLP-1包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:3、5、6、8和9。在本文中，多肽缀合物的多肽部分可包含选自下组的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:52、55、56、60-62、66-71和75-80，CRM残基可以是多肽部分的肽接头中选自下组的位置处的赖氨酸残基或半胱氨酸残基：60、68和76，并且CRM可包含A基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO)的结构用于赖氨酸缀合，或B基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2)的结构用于半胱氨酸缀合。
在CRM残基为赖氨酸残基的单缀合的多肽缀合物中，多肽缀合物的各种实施方式列于以下，各自指示多肽部分的氨基酸序列和CRM残基的位置：SEQ ID NO:52(76K)；SEQ IDNO:55(68K)；SEQ ID NO:56(60K)；SEQ ID NO:60(76K)；SEQ ID NO:61(68K)；和SEQ ID NO:62(60K)。在某些实施方式中，多肽缀合物包含多肽部分，所述多肽部分包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列或由其组成，并且第一CRM残基为76K。在某些实施方式中，多肽缀合物包含多肽部分，所述多肽部分包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列或由其组成，并且第一CRM残基为76K。每个多肽缀合物具有A基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO)作为CRM。
在CRM残基为半胱氨酸残基的单缀合的多肽缀合物中，多肽缀合物的各种实施方式列于以下，各自指示多肽部分的氨基酸序列和CRM残基的位置：SEQ ID NO:66(76C)；SEQID NO:67(68C)；SEQ ID NO:68(60C)；SEQ ID NO:69(76C)；SEQ ID NO:70(68C)；SEQ IDNO:71(60C)；SEQ ID NO:75(76C)；SEQ ID NO:76(68C)；SEQ ID NO:77(60C)；SEQ ID NO:78(76C)；SEQ ID NO:79(68C)；和SEQ ID NO:80(60C)。在某些实施方式中，多肽缀合物包含多肽部分，所述多肽部分包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列或由其组成，并且分别在26K和76K处与第一CRM和第二CRM缀合。每个多肽缀合物具有B基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2)作为CRM。
在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物是双缀合的，即两个CRM分别在多肽缀合物的多肽部分的两个CRM残基处缀合，一个在GLP-1中并且另一个在肽接头中。在本文中，GLP-1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、4、6和7。
在本文中，多肽缀合物的多肽部分可包含选自下组的氨基酸序列或由其组成：SEQID NO:51、53、54、57-59和63-65、72-74、85和86。两个CRM残基可以是赖氨酸残基或半胱氨酸残基，其中一个处于位置26处，并且另一个处于选自下组的位置处：68、76和84。两个CRM相同，包含A基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO)的结构用于赖氨酸缀合，或B基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2)的结构用于半胱氨酸缀合。
在两个CRM残基均为赖氨酸残基的双缀合的多肽缀合物中，多肽缀合物的各种实施方式列于以下，各自指示多肽部分的氨基酸序列和两个CRM残基的位置：SEQ ID NO:51(26K、76K)；SEQ ID NO:53(26K、84K)；SEQ ID NO:54(26K、68K)；SEQ ID NO:57(26K、76K)；SEQ ID NO:58(26K、84K)；SEQ ID NO:59(26K、68K)；SEQ ID NO:85(26K、96K)；和SEQ IDNO:86(26K、60K)。每个多肽缀合物具有A基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO)作为两个CRM。
在两个CRM残基均为半胱氨酸残基的双缀合的多肽缀合物中，多肽缀合物的各种实施方式列于以下，各自指示多肽部分的氨基酸序列和两个CRM残基的位置：SEQ ID NO:63(26C、84C)；SEQ ID NO:64(26C、76C)；SEQ ID NO:65(26C、68C)；SEQ ID NO:72(26C、84C)；SEQ ID NO:73(26C、76C)；和SEQ ID NO:74(26C、68C)。每个多肽缀合物具有B基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2)作为两个CRM。
在某些实施方式中，CRM与融合多肽中的非天然氨基酸残基缀合。在某些实施方式中，CRM与多肽中的非天然氨基酸残基缀合。
下表1显示某些示范性多肽缀合物的详细信息，包括多肽部分、GLP-1和肽接头的SEQ ID NO以及CRM残基。还显示GLP-1中的突变以及肽接头序列中的重复序列和重复数。
表1.示范性多肽缀合物序列
/>
**：GLP-1中的突变意指相对于SEQ ID NO:1的突变，其中第一残基为7H，并且最后一个残基为37G；
#：CRM残基意指CRM残基在含有C端连接到肽接头的GLP-1(其中第一残基为7H)的多肽序列中从N到C计数的位置。
&：A基团是指HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO或
&&：B基团是指HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2，或以下结构：
/>
在某些实施方式中，多肽缀合物包含以下所示的结构(包括单缀合的分子002和分子019以及双缀合的分子012)，其中氨基酸残基表示为圆圈中的一个字母缩写：
分子002：
或分子019：
或分子012：
制备方法
本申请提供编码本文所提供的多肽缀合物的多肽部分(或其片段)的分离的核酸或多核苷酸。
如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非明确限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的多核苷酸，所述类似物具有与参照核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另外指示，否则特定多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列，以及明确指示的序列。具体来说，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(参见Batzer等人,《核酸研究》19:5081(1991)；Ohtsuka等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,《分子细胞探针(Mol.Cell.Probes)》8:91-98(1994))。
编码本文所提供的多肽(或其片段)的核酸或多核苷酸可使用重组技术构建。为此目的，可获得编码GLP-1受体激动剂(如GLP-1)的DNA和编码肽接头的DNA并且可操作地连接，以允许在宿主细胞中转录和表达以产生融合多肽。如果需要，还可操作地连接编码一个或多个接头的多核苷酸序列以允许表达所需产物。
编码多核苷酸序列可进一步可操作地连接到一个或多个调控序列，任选地在表达载体中，使得融合多肽或多肽复合物的表达或产生可行并且在适当控制下。
可使用本领域中已知的重组技术将编码多核苷酸序列插入到载体中以用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。许多载体是可供使用的。载体组件一般包括但不限于以下中的一者或多者：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子(例如原核启动子，如T7、T7lac、Sp6、araBAD、trp、lac、tac、pLm、A3、lac、lpp、npr、pac、syn、trc和T3，或真核启动子，如SV40、CMV和EF-1α)以及转录终止序列。
载体和宿主细胞
在另一方面，本申请提供一种载体，其包含本文所提供的多核苷酸。
可将包含本文所提供的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中进行克隆或基因表达。如本文所用，短语“宿主细胞”是指已将外源多核苷酸和/或载体引入其中的细胞。在其它实施方式中，载体是染色体外的。必要时，可分离宿主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
适用于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞主要是原核生物。用于此目的的合适原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性(Gram-negative)或革兰氏阳性(Gram-positive)生物体，例如肠内菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)；和志贺杆菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如绿脓杆菌(P.aeruginosa)；和链霉菌属(Streptomyces)。在一些实施方式中，宿主细胞为真核生物，如酵母和哺乳动物细胞(例如永生化哺乳动物细胞)。
可使用本领域的技术人员已知的任何合适方法，例如转化、转染或转导，将包含本文所提供的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中。在一个实施例中，可将编码GLP-1多肽的多核苷酸序列亚克隆到表达载体中，其在宿主细胞中表达为包涵体。载体可为病毒载体，并且在这一能力中可使用任何合适病毒载体。
在另一方面，本申请提供一种宿主细胞，其包含本文所提供的载体。宿主细胞为原核细胞或真核细胞。用上述表达或克隆载体转化的宿主细胞可在常规营养培养基中培养，所述培养基视需要经修饰以诱导启动子、选择转化体或扩增克隆载体。
在另一方面，本申请提供一种产生本文所提供的多肽缀合物的方法，其包括在允许本文所提供的多核苷酸表达的条件下培养本文所提供的宿主细胞以获得多肽缀合物的多肽部分。
为了产生本文所提供的多肽部分，可在多种培养基中培养用表达载体转化的宿主细胞。市售细菌生长培养基，如Terrific肉汤、LB肉汤、LB琼脂、M9基本培养基、MagiaMedia培养基以及ImMedia培养基(赛默飞世尔(ThermoFisher))适用于培养细菌宿主细胞。市售培养基，如Ham's F10(西格玛(Sigma))、最小必需培养基(MEM)(西格玛)、RPMI-1640(西格玛)以及杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)，西格玛)适用于培养真核宿主细胞。这些培养基中的任一种都可以视需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。还可以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必要的补充剂。培养条件(如温度、pH等)是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，并且对普通技术人员来说将是显而易见的。
在一个方面，本申请提供一种表达本文所提供的多肽缀合物的多肽部分的方法，其包括在表达多肽部分的条件下培养本文所提供的宿主细胞。在某些实施方式中，多肽部分表达为可溶性多肽。
当使用重组技术时，本文所提供的多肽可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果产物在细胞内产生，那么作为第一步，例如通过离心或超滤去除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等人,《生物技术(Bio/Technology)》10:163-167(1992)描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间的蛋白质的程序。简单来说，将细胞糊状物在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻约30min。细胞碎片可通过离心去除。在产物被分泌到培养基中的情况下，一般首先使用市售的蛋白质浓缩过滤器，例如艾米康(Amicon)或密理博(Millipore)Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。可在前述任一步骤中包含蛋白酶抑制剂，如PMSF，以抑制蛋白水解，且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括分离多肽。
由细胞制备的本文所提供的多肽可使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱纯化。
用于蛋白质纯化的其它技术，如离子交换柱分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、肝素SEPHAROSETM色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)色谱、色谱焦聚、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀也是可用的，取决于待回收的蛋白质。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括将CRM与多肽缀合。多肽可通过合适的缀合反应在例如赖氨酸残基、半胱氨酸残基或非天然氨基酸处缀合。
举例来说，具有一个或多个CRM残基(如赖氨酸)的多肽可与氨基反应性试剂反应。在某些实施方式中，CRM在酰化反应中通过酰基与赖氨酸残基缀合。酰化反应的示范性方法描述于例如WO2009083549和WO2010029159中，其内容全文并入本文中。待在酰化反应中缀合的CRM可含有羧酸基、α,ω-脂肪二酸残基、活化酯或活化N-羟基酰亚胺酯等。活化酯的实施例包括O-丁二酰亚胺试剂，如N-羟基丁二酰亚胺基(NHS)或磺基-NHS酯和酰亚胺酯化合物，如特劳特氏试剂(Traut's reagent)，其可与可缀合赖氨酸残基的ε-氨基反应以形成酰胺或脒键。合适的氨基反应性试剂的额外实施例包括O-酰基异脲、N-羟基三唑酯、酸酐、苯基活性酯、P-异羟肟活性酯、酰基咪唑、酰基苯并三唑、酰基叠氮化物、酰卤、鏻盐、铵/脲阳离子盐。
再例如，具有一个或多个CRM残基(如半胱氨酸)的多肽可连接到硫醇反应性试剂。在某些实施方式中，CRM在烷基化反应中与半胱氨酸残基缀合。在某些实施方式中，CRM通过顺丁烯二酰亚胺或碘乙酰胺与可缀合半胱氨酸残基缀合以形成碳-硫键。在某些实施方式中，CRM通过二硫化物与可缀合半胱氨酸残基缀合以形成二硫键。合适的硫醇反应性基团的额外实施例包括二烯基砜、α-卤酰基或其它硫醇反应性缀合搭配物。关于细节，参见Haugland,2003,《分子探针公司荧光探针与研究化合物手册(Molecular Probes Handbookof Fluorescent Probes and Research Chemicals)》,分子探针公司(Molecular Probes,Inc.)；Brinkley,1992,《生物缀合化学(Bioconjugate Chem.)》3:2；Garman,1997,《非放射性标记：实践方法(Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach)》,学术出版社(Academic Press),伦敦(London)；Means(1990)《生物缀合化学》1:2；Hermanson,G.在《生物缀合技术(Bioconjugate Techniques)》(1996)学术出版社,圣迭戈(San Diego),第40-55,643-671页中。
举例来说，具有一个或多个CRM残基(非天然氨基酸残基(NNAA))的多肽可与CRM缀合，使得可在融合多肽的NNAA与CRM之间形成稳定连接。举例来说，含酮基或醛或β-二酮部分的NNAA可与含酰肼或O-烷基羟胺、羟胺的试剂反应以形成腙或O-烷基化肟键。再例如，含有叠氮基的NNAA可与炔衍生物反应，通过铜(I)催化的[3+2]环加成形成稳定三唑接头(且反之亦然)。再例如，含有叠氮基的NNAA可与适当的水溶性含膦试剂连接，通过施陶丁格连接(Staudinger ligation)形成酰胺键。此外，NNAA中的硫酯部分可与含胺试剂反应以形成酰胺键。并入NNAA的本文所提供的融合多肽可通过环加成反应与试剂缀合，如二烯与亲二烯物之间的(4+2)环加成(狄尔斯-阿尔德反应(Diels-Alder reaction))、通过1,3-偶极胡伊斯根环加成(Huisgen cycloaddition)的(3+2)环加成以及通过硝酮-烯烃环加成的(3+2)环加成。适用于抗体缀合的环加成方法已描述于例如WO05003294、US20120004183、WO06009901、WO07130453和美国专利6,737,236中。
再例如，多肽可与生物素缀合，接着与CRM间接缀合，所述CRM与抗生物素蛋白缀合。再例如，融合多肽或多肽复合物可连接到偶联剂，所述偶联剂进一步连接到CRM。偶联剂的实施例包括双官能部分，如N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、丁二酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二丁二酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)以及双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。尤其优选的偶联剂包括N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人,《生物化学杂志(Biochem.J.)》173:723-737(1978))和N-丁二酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)以提供二硫键。
用于将CRM与多肽缀合的额外方法发现于例如美国专利第5,208,020号；美国专利第6,4411,163号；WO2005037992；WO2005081711；和WO2006/034488中，其以全文引用的方式并入本文中。制备本申请的缀合物的方法的具体实施例也包括于本申请的实验部分中。
药物组合物
在另一方面，本申请还提供一种药物组合物，其包含本文所提供的多肽缀合物。在某些实施方式中，药物组合物是用于口服施用的固体组合物。
在本文中，多肽缀合物基本上充当药物组合物中的活性药物成分(API)。除多肽缀合物之外，药物组合物进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
术语“药学上可接受的”是指，给定的赋形剂一般在化学上和/或物理上与构成配制物的其它成分相容，并且在生理上与其接受者相容。
“药学上可接受的赋形剂”是指药物调配物中除了活性成分以外的生物活性可接受且对受试者无毒的成分。
用于口服固体配制物的药学上可接受的赋形剂的实施例可包括抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂，如糖和环糊精。口服固体配制物可包括标准载剂，如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
适用于片剂配制物的药学上可接受的赋形剂包括例如惰性稀释剂，如乳糖、碳酸钠、磷酸钙或碳酸钙；成粒剂和崩解剂，如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，如淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石；防腐剂，如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯；和抗氧化剂，如抗坏血酸。片剂配制物可以未包覆包衣或包覆包衣，以调节其崩解和后续活性成分在胃肠道内的吸收，或改进其稳定性和/或外观，在任一种情况下，均使用所属领域中熟知的常规包衣剂和程序。
在某些实施方式中，本文所描述的多肽缀合物以适用于口服施用的形式配制。可采用标准药物配制技术，如《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science andPractice of Pharmacy)》(D.B.Troy编,第21版,Lippincott,Williams&Wilkins,2006)中所描述的那些。
口服配制物
在另一方面，本文所提供的药物组合物适用于口服施用。在另一方面，本文所提供的药物组合物包含本文所提供的多肽缀合物和吸收增强赋形剂。
根据一些实施方式，吸收增强赋形剂包含N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，例如钠盐、钾盐或铵盐。在某些实施方式中，吸收增强赋形剂为N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸钠(SNAC)。N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸盐(例如SNAC等)作为吸收增强赋形剂或吸收增强剂的用途已在国际申请公开号WO2021023855A1中描述。
虽然已知SNAC可用于增强口服施用后小肽的吸收，但对于分子量为4kDa(大致36个氨基酸残基)或更大的分子，吸收增强作用减弱。然而，在本申请中出乎意料地发现，尽管本文所提供的多肽缀合物的长度比36或40个氨基酸残基大得多，但在组合物中与SNAC配制时可具有增强的口服吸收。
根据一些实施方式，本文所公开的药物组合物中的另一种药学上可接受的赋形剂包括至少一种润滑剂，其选自下组：硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、胶态二氧化硅、二十二酸甘油酯、聚氧化乙烯聚合物、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁、油酸钠、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸、氢化植物油、轻质矿物油、二氧化硅、烷基硫酸盐、苯甲酸钠、聚乙二醇、滑石、蜡和甘油酯。在本文所公开的药物组合物某些实施方式中，硬脂酸镁用作润滑剂。
根据一些实施方式，本文所公开的药物组合物中的药学上可接受的赋形剂可任选地包括至少一种填充剂，其选自下组：微晶纤维素(MCC)、纤维素粉末、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、磷酸氢钙、玉米淀粉和预胶化淀粉。
根据一些实施方式，本文所公开的药物组合物中的药学上可接受的赋形剂可任选地包括至少一种粘合剂，其选自下组：聚维酮、乳糖、羟丙基纤维素、L-羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素(HPMC)、甲基纤维素聚合物、羟乙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、其它纤维素衍生物、蔗糖、糊精、麦芽糊精、淀粉、乳酸钙、碳酸钙、阿拉伯胶、海藻酸钠、琼脂、角叉菜胶、明胶、瓜尔豆胶、果胶和PEG。
如上文所提及的润滑剂、填充剂和/或粘合剂在药物组合物中的用途已描述于国际申请公开号WO2012080471A1、WO2013139694A1和WO2013139694A1中。
根据一些实施方式，本文所提供的药物组合物不包含填充剂或粘合剂。
根据一些实施方式，本文所提供的药物组合物由多肽缀合物、N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸钠(SNAC)和硬脂酸镁组成。
本申请进一步提供一种药物组合物，并且根据某些实施方式其包含：大致0.5-100mg的多肽缀合物；以及大致50-500mg的SNAC。在某些实施方式中，药物组合物以单位剂型提供。
如本文所用，术语“单位剂型(unit dosage form)”、“单位剂型(unit doseform)”等是指用于药物施用的单个实体，或产生和分配药物的物理形式，如片剂、胶囊、药囊或注射剂。“单位剂型”也可称为“固定剂型(fixed dosage form)”(或“固定剂型(fixeddose form)”)或固定剂量组合(fixed dosage combination)(或固定剂量组合(fixeddose combination))，并且在其它方面是可互换的。
在药物组合物某些实施方式中，SNAC占单位剂型的至少60％w/w(例如至少62％、65％、68％、70％、72％、75％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97、98％或99％等)。
在药物组合物某些实施方式中，SNAC占单位剂型的约60％到约99％、60％到约96％、60％到约95％、60％到约93％、60％到约92％、60％到约91％、60％到约90％、60％到约89％、60％到约88％、60％到约87％、60％到约86％、60％到约85％、60％到约70％、80％到约98％w/w。
在药物组合物某些实施方式中，其单位剂型包含至多500mg、至多450mg、至多400mg、至多350mg、至多300mg、至多250mg、至多200mg、至多150mg、至多100mg、至多50mgSNAC。
在药物组合物某些实施方式中，其单位剂型包含约50mg到约500mg、约50mg到约450mg、约50mg到约400mg、约50mg到约350mg、约50mg到约300mg、约75mg到约300mg、约100mg到约300mg、约100mg到约500mg、约150mg到约300mg、约200mg到约300mg SNAC。
在药物组合物某些实施方式中，多肽缀合物占单位剂型的至少大致0.1％w/w(例如0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、2％等)且至多大致32％(例如18％、19％、20％等)。
在药物组合物某些实施方式中，其单位剂型包含至多100mg、至多90mg、至多80mg、至多70mg、至多60mg、至多50mg、至多40mg、至多30mg、至多20mg、至多10mg的多肽缀合物。
在药物组合物某些实施方式中，其单位剂型包含0.5-100mg、0.5-90mg、0.5-80mg、0.5-70mg、0.5-60mg、0.5-50mg、0.5-40mg、0.5-30mg、0.5-20mg、0.5-10mg、0.5-5mg、0.5-2.5mg、2.5-5mg、2.5-10mg、2.5-15mg、2.5-20mg、5-10mg、10-20mg、10-30mg、10-100mg、20-100mg或20-50mg的多肽缀合物。
在某些实施方式中，药物组合物进一步包含1-20mg润滑剂，任选地所述润滑剂为硬脂酸镁。
在如上文所提及的药物组合物的任何实施方式中，其剂型可呈选自下组的形式：片剂、胶囊、药囊、口香糖和散剂。
在某些实施方式中，药物组合物的剂型呈片剂形式。
用于单缀合的多肽缀合物的药物组合物
在某些实施方式中，多肽缀合物是单缀合的，并且第一CRM为多肽缀合物的缀合物部分中的唯一一个CRM。任选地，第一CRM残基为赖氨酸残基，并且进一步任选地，并且第一CRM包含A基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO)，所述A基团具有下式结构：
并且单位剂型包含：大致0.5-50mg(例如0.5-10mg、0.5-2.5mg、2.5-5mg、5-10mg、10-20mg或20-50mg)的多肽缀合物；以及大致50-300mg(例如100-300mg)的SNAC。在某些实施方式中，药物组合物进一步包含1-10mg润滑剂。
在药物组合物的某些实施方式中，多肽缀合物的多肽部分包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，并且在76K处与第一CRM缀合。
在药物组合物的某些实施方式中，多肽缀合物的多肽部分包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，并且在76K处与第一CRM缀合。
在某些实施方式中，SNAC占单位剂型的至少80％w/w(例如至少80％、89.7％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97、97.3％、98％)。
在某些实施方式中，SNAC占单位剂型的约80％到约98％、约81％到约98％、约82％到约98％、约83％到约98％、约84％到约98％、约85％到约98％、约86％到约98％、约87％到约98％、约88％到约98％、约89％到约98％、约90％到约98％w/w。
在某些实施方式中，其单位剂型包含至多300mg、至多250mg、至多200mg、至多150mg、至多100mg或至多50mg SNAC。
在某些实施方式中，其单位剂型包含约50mg到约300mg、约75mg到约300mg、约100mg到约300mg、约100mg到约500mg、约150mg到约300mg、约200mg到约300mg SNAC。
在某些实施方式中，SNAC占单位剂型中的赋形剂的约91％到约98％w/w。
在某些实施方式中，多肽缀合物占单位剂型的约0.1％w/w到约20％w/w。
在某些实施方式中，多肽缀合物占单位剂型的约0.1％到约20％、约0.1％到约19％、约0.1％到约18％、约0.1％到约17％、约0.1％到约16％、约0.1％到约15％、约0.1％到约14％、约0.1％到约13％、约0.1％到约12％、约0.1％到约11％、约0.1％到约10％、约0.1％到约9％、约0.1％到约8％、约0.1％到约7％、约0.1％到约6％或约0.1％到约5％w/w。
在某些实施方式中，其单位剂型包含至多50mg、至多40mg、至多30mg、至多20mg或至多10mg的多肽缀合物。
在某些实施方式中，其单位剂型包含0.5-50mg、0.5-40mg、0.5-30mg、0.5-20mg、0.5-10mg、0.5-5mg、0.5-2.5mg、2.5-5mg、2.5-10mg、2.5-15mg、2.5-20mg、5-10mg、10-20mg、10-100mg、10-30mg或20-50mg的多肽缀合物。
在某些实施方式中，单位剂型包含1-10mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含大致0.5-50mg的多肽缀合物、大致50-300mg的SNAC和大致1-10mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含：大致0.5-10mg的多肽缀合物、大致50-300mg的SNAC和大致1-10mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含：大致10-20mg的多肽缀合物、大致100-300mg的SNAC和大致1-10mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含：大致20-50mg的多肽缀合物、大致200-300mg的SNAC和大致1-10mg硬脂酸镁。
在某些实施方式中，单位剂型包含大致10-20mg的多肽缀合物和大致100-300mg的SNAC。
在某些实施方式中，单位剂型包含大致0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg或20mg的多肽缀合物。
在某些实施方式中，单位剂型包含大致20-50mg的多肽缀合物和大致100-300mg或200-300mg的SNAC。
根据一些实施方式，当在标准崩解测试中分析时，药物组合物的单位剂型在小于大致13分钟14秒(例如13分钟、12分钟、11分钟、10分钟、9分钟等)内完成崩解。
根据一些实施方式，当在37℃下在500mL含有0.05％Brij 35的pH 6.8的磷酸盐缓冲液介质中分析单位剂型时，超过大致32.3％(例如33％、35％、40％等)的多肽缀合物在5分钟时溶解。
根据一些实施方式，当在37℃下在500mL含有0.05％Brij 35的pH 6.8的磷酸盐缓冲液介质中分析单位剂型时，超过大致72.1％(例如73％、75％、80％等)的多肽缀合物在大致15分钟时溶解。
根据一些实施方式，当在37℃下在500mL含有0.05％Brij 35的pH 6.8的磷酸盐缓冲液介质中分析单位剂型时，超过大致38.7％(例如39％、40％、50％等)的SNAC在大致5分钟时溶解。
根据一些实施方式，当在比格犬中分析单位剂型的口服暴露时，超过大致78.7％(例如79％、80％、82％、85％等)的SNAC在大致15分钟时溶解。
用于双缀合的多肽缀合物的药物组合物
在药物组合物的某些实施方式中，多肽缀合物是双缀合的，并且多肽缀合物的缀合物部分进一步包含与多肽部分中的第二CRM残基缀合的第二CRM。任选地，第二CRM残基为赖氨酸残基，并且进一步任选地，第一CRM和第二CRM中的每一者包含A基团(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO)，所述A基团具有下式结构：
其中药物组合物的剂型包含：大致10-100mg(例如10-20mg、20-30mg、20-40mg、20-50mg、50-70mg或80-100mg等)的多肽缀合物；以及大致50-500mg(例如50-100mg、100-200mg、250-500mg等)的SNAC。在一些实施方式中，药物组合物进一步包含1-20mg润滑剂。
在药物组合物的一些实施方式中，多肽缀合物的多肽部分包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，并且分别在26K和76K处与第一CRM和第二CRM缀合。
在一些实施方式中，SNAC占单位剂型的约60％到约96％、约62％到约96％、约65％到约96％、约66％到约96％、约67％到约96％、约68％到约96％、约70％到约96％、约72％到约96％、约75％到约96％、约78％到约96％、约80％到约96％、约86％到约96％、约87％到约96％w/w。
在一些实施方式中，其单位剂型包含至多500mg、至多450mg、至多400mg、至多350mg、至多300mg、至多250mg、至多200mg、至多150mg、至多100mg SNAC。
在一些实施方式中，其单位剂型包含约100mg到约500mg、约100mg到约450mg、约100mg到约400mg、约100mg到约350mg、约100mg到约300mg SNAC。
在一些实施方式中，SNAC占单位剂型中的赋形剂的约91％到约98％w/w。
在一些实施方式中，多肽缀合物占单位剂型的至少1％w/w且至多32％w/w。
在一些实施方式中，其单位剂型包含至多100mg、至多90mg、至多80mg、至多70mg、至多60mg、至多50mg、至多40mg、至多30mg、至多20mg、至多10mg的所述多肽缀合物。
在一些实施方式中，其单位剂型包含10-100mg、10-90mg、10-80mg、10-70mg、10-60mg、10-50mg、10-40mg、20-100mg、20-90mg、20-80mg、20-70mg、20-60mg、20-50mg、20-40mg的多肽缀合物。
在一些实施方式中，单位剂型包含1-20mg硬脂酸镁。
在一些实施方式中，其单位剂型包含：大致10-100mg的多肽缀合物；大致100-500mg的SNAC，和大致1-20mg硬脂酸镁。
在一些实施方式中，单位剂型包含：大致10-20mg的多肽缀合物、大致100-300mg的SNAC和大致1-20mg硬脂酸镁。
在一些实施方式中，单位剂型包含：大致20-40mg的多肽缀合物、大致200-300mg的SNAC和大致1-20mg硬脂酸镁。
在一些实施方式中，单位剂型包含：大致20-50mg的多肽缀合物、大致200-300mg的SNAC和大致1-20mg硬脂酸镁。
在一些实施方式中，单位剂型包含：大致40-50mg的多肽缀合物、大致200-300mg的SNAC和大致1-20mg硬脂酸镁。
在一些实施方式中，单位剂型包含：大致50-100mg的多肽缀合物、大致300-500mg的SNAC和大致1-20mg硬脂酸镁。
在一些实施方式中，单位剂型包含大致0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg或100mg的多肽缀合物。
在一些实施方式中，单位剂型包含大致10-20mg(例如10-15mg或15-20mg)的多肽缀合物和大致50-300mg的SNAC，任选地100-300mg(例如大致50-100mg、100-200mg、200-300mg等)的SNAC。
在一些实施方式中，单位剂型包含大致10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg或20mg的多肽缀合物。
在一些实施方式中，单位剂型包含大致20-50mg的多肽缀合物和大致100-300mg，或任选地200-300mg的SNAC。
在一些实施方式中，单位剂型包含大致20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg或50mg的多肽缀合物。
在一些实施方式中，单位剂型包含大致50-100mg的多肽缀合物和大致100-500mg，或任选地200-500mg，或任选地300-500mg的SNAC。
在一些实施方式中，单位剂型包含大致50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg或100mg的多肽缀合物。
在本文中，根据药物组合物的一些实施方式，当在标准崩解测试分析剂型时，剂型在小于11分钟，或优选地小于10分钟、9分钟、8分钟、7分钟或6分钟内完成崩解。
在本文中，根据药物组合物的一些实施方式，当在37℃下在500mL含有0.05％Brij35的pH 6.8的磷酸盐缓冲液介质中分析剂型时，超过40％，优选地超过50％、75％或80％的多肽缀合物在5分钟时溶解。
在本文中，根据药物组合物的一些实施方式，当在37℃下在500mL含有0.05％Brij35的pH 6.8的磷酸盐缓冲液介质中分析剂型时，超过82％，优选地超过85％、90％或95％的多肽缀合物在15分钟时溶解。
在本文中，根据药物组合物的一些实施方式，当在37℃下在500mL含有0.05％Brij35的pH 6.8的磷酸盐缓冲液介质中分析单位剂型时，超过大致37.4％(例如37.4％、38％、40％等)的SNAC在大致5分钟时溶解。
在本文中，根据药物组合物的一些实施方式，当在比格犬中分析单位剂型的口服暴露时，超过大致82.1％(例如82.1％、83％、85％等)的SNAC在大致15分钟时溶解。
治疗方法
在另一方面，本申请提供一种预防或治疗有需要的受试者的代谢病症的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物或药物组合物。
还提供治疗方法，其包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物，从而治疗或预防病况或病症。在某些实施方式中，受试者已被鉴别为患有可能对本文所提供的多肽缀合物响应的病症或病况。
在某些实施方式中，代谢病症为糖尿病、肥胖症、超重、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、心血管如血脂异常、动脉粥样硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、糖尿病肾病、妊娠期糖尿病、代谢综合征如代谢综合征X、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、终末期肝病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝硬化或原发性胆汁性肝硬化(PBC)或阿尔茨海默病。
在某些实施方式中，病况糖尿病包括所有任何形式的糖尿病，如高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低、1型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、青年的成年发病型糖尿病(MODY)、妊娠期糖尿病和/或HbA1 C水平升高。
在某些实施方式中，病况糖尿病包括糖尿病并发症，如血管病。
在某些实施方式中，本申请提供一种预防或治疗有需要的受试者的阿尔茨海默病的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物或药物组合物。如本文所用，术语“阿尔茨海默病”旨在涵盖阿尔茨海默病的所有形式和阶段。阿尔茨海默病是一种逐渐损害记忆、认知功能和行为的进行性、退化性脑部病症。阿尔茨海默病分为五个阶段，其包括临床前阿尔茨海默病、由阿尔茨海默病引起的轻度认知障碍、由阿尔茨海默病引起的轻度痴呆、与阿尔茨海默病相关的中度痴呆和与阿尔茨海默病相关的重度痴呆。术语“痴呆”用于指显著影响智力和社交能力，最终干扰日常功能的一系列症状。阿尔茨海默病有两种主要形式：家族性阿尔茨海默病和散发性或迟发性阿尔茨海默病。家族性阿尔茨海默病典型地由遗传基因突变引起，包括以下三个基因之一的突变：APP、PSEN1或PSEN2。这种疾病形式是一种罕见的破坏性疾病，可能在中年发病。疾病的第二种且更为常见的形式是散发性或迟发性阿尔茨海默氏病，这是最常见的形式，并且在没有任何已知遗传原因的情况下发生。在一些实施方式中，受试者患有或罹患阿尔茨海默病可具有选自下组的症状：认知缺陷，包括记忆障碍、语言功能障碍和视觉空间技能；可涵盖职业和社会问题(例如日常生活活动)的功能障碍；以及随着疾病的严重程度进展，还可能出现包括抑郁、焦虑、攻击性和精神病的行为症状。
在某些实施方式中，受试者患有临床前阿尔茨海默病、由阿尔茨海默病引起的轻度认知障碍、由阿尔茨海默病引起的轻度痴呆、与阿尔茨海默病相关的中度痴呆或与阿尔茨海默病相关的重度痴呆。
在某些实施方式中，受试者患有家族性阿尔茨海默病或散发性阿尔茨海默病。
据报道，缀合的GLP-1激动剂，例如索玛鲁肽，可适用于治疗阿尔茨海默病，参见例如公开的美国专利申请US2022/0280612A1，其全文并入本文中。据报道，在与阿尔茨海默病相关的动物研究中，GLP-1激动剂索玛鲁肽降低神经炎症的测量值，这可能影响认知和功能。此外，现实世界的证据表明，痴呆风险降低与用GLP-1激动剂治疗之间可能存在联系。在接受GLP-1激动剂治疗的受试者中，罹患痴呆的比率显著较低。
本申请显示本文所提供的多肽缀合物可有效治疗阿尔茨海默病。在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物可有效改善认知功能(如记忆和注意力)，和/或延迟阿尔茨海默病的发作或进展。在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物在治疗阿尔茨海默病方面比索玛鲁肽更有效。
在另一方面，本申请提供一种管理有需要的受试者的体重的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物。
在另一方面，本申请提供一种减少有需要的受试者的食物摄入量的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物。
在另一方面，本申请提供一种减轻有需要的受试者的体重的方法，其包括施用治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物。
在某些实施方式中，可使用本文所提供的多肽缀合物治疗或改善的病况或代谢病症包括人受试者的空腹血糖水平为125mg/dL或更大，例如130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200或大于200mg/dL的病况。可在进食或禁食状态下或随机确定血糖水平。代谢病况或病症还可包含受试者罹患代谢病况的风险增加的病况。对于人受试者，此类病况包括100mg/dL的空腹血糖水平。
在某些实施方式中，可使用本文所提供的多肽缀合物治疗或改善的病况或代谢病症包括人受试者的身体质量指数(BMI)为至少或高于25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40的病况。在某些实施方式中，人受试者的BMI在25到30、26到30、27到30、28到30、25到29或25到28的范围内。
本文所提供的多肽缀合物的治疗有效量将取决于本领域中已知的各种因素，例如受试者的体重、年龄、既往病史、目前的药物治疗、健康状况和交叉反应的可能性、过敏、敏感性和不良副作用，以及施用途径和疾病发展的程度。本领域普通技术人员(例如医生或兽医)可如这些和其它情况或要求所指示按比例减少或增加剂量。治疗有效量可为本文所提供的融合多肽、多肽复合物和缀合物引发研究人员、医生或其它临床医师寻求的组织系统、动物或人的生物或医学效应的量，所述效应包括减轻或改善所治疗的疾病或病症的症状，即，支持可观察水平的一种或多种所需生物或医学效应，例如降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平；减轻体重；或改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰岛素敏感性的量。
在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物可以0.01mg/kg到约100mg/kg(例如约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)的治疗有效剂量施用。在这些实施方式中的某些中，本文所提供的多肽缀合物以约50mg/kg或更低的剂量施用，并且在这些实施方式中的某些中，剂量是10mg/kg或更低、5mg/kg或更低、1mg/kg或更低、0.5mg/kg或更低或0.1mg/kg或更低。在某些实施方式中，施用剂量可在治疗过程中改变。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可以高于后续施用剂量。在某些实施方式中，取决于受试者的响应，施用剂量可在治疗过程中改变。
在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物按以下或不超过以下的给药方案向受试者(例如人)口服施用：每天两次、每天一次、每2天一次、每3天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次。在某些实施方式中，本文所提供的多肽缀合物可以每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次的给药间隔向受试者(例如人)施用。在低给药频率情况下的疗效具有提高患者的依从性和长期治疗成功的潜能。当前可用的治疗索玛鲁肽每周给药一次。不希望受任何理论束缚，据信本文所提供的某些多肽缀合物具有显著延长的半衰期并且适合于比索玛鲁肽更不频繁给药来治疗病况，例如不超过每周给药一次(例如每8天一次、每9天一次、每10天一次、每11天一次、每12天一次、每13天一次、每14天一次、每18天一次、每三周一次、每24天一次、每4周一次或每月一次)。在某些实施方式中，给药方案为选自以下的连续给药方案：每周给药两次、每周给药一次、每两周给药一次、每三周给药一次、每月给药一次或每两月给药一次。在某些实施方式中，给药方案的给药间隔在约每3天一次到约每月一次，或约每周一次到约每月一次的范围内。
可以调整剂量方案以提供最优的期望效应(例如治疗效应)。举例来说，可施用单次剂量，或可随时间推移施用若干分次剂量。
本文所提供的药物组合物可口服施用。
多肽缀合物可单独施用或与一种或多种额外治疗手段或药剂组合施用。
在某些实施方式中，当用于治疗代谢疾病时，本文所提供的多肽缀合物可与用于治疗代谢疾病或相关的任何医学病症的任何其它治疗剂组合施用。如本文所用，“组合施用”包括作为相同药物组合物的部分同时施用、作为独立组合物同时施用或作为独立组合物在不同时间施用。在本文使用短语“组合”时，在另一药剂之前或之后施用的组合物视为与所述药剂“组合”施用，即使组合物和第二药剂通过不同途径使用。在可能的情况下，与本文所提供的融合多肽、多肽复合物或缀合物组合施用的额外治疗剂是根据额外治疗剂的产品信息表单中所列的时程，或根据《医师案头参考(Physicians'Desk Reference)》(《医师案头参考》,第70版(2016))或本领域中众所周知的方案施用。可与包含本文所提供的多肽缀合物药物组合物组合施用的化合物的实施例的非限制性列表包括罗格列酮(rosiglitizone)、吡格列酮(pioglitizone)、瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglitinide)、二甲双胍(metformin)、艾塞那肽(exenatide)、司格列汀(stiagliptin)、普兰林肽(pramlintide)、格列吡嗪(glipizide)、格列美脲阿卡波糖(glimeprirideacarbose)和米格列醇(miglitol)。
试剂盒
还提供用于实践所公开方法的试剂盒。此类试剂盒可包含如本文所描述的药物组合物，其包括编码本文所提供的多肽缀合物的核酸，包含此类核酸的载体和细胞，以及包含此类含核酸化合物的药物组合物，其可提供于无菌容器中。任选地，还可包括关于如何使用所提供的药物组合物治疗代谢病症的说明书，或使患者或医疗服务提供者可获得所述说明书。
在一个方面，试剂盒包含(a)药物组合物，其包含治疗有效量的本文所提供的多肽缀合物或其突变形式；和(b)用于药物组合物的一个或多个容器。此类试剂盒还可包含其用途的说明书；所述说明书可根据所治疗的精确代谢病症进行定制。说明书可描述试剂盒中所提供的材料的用途和性质。在某些实施方式中，试剂盒包括患者进行施用以治疗代谢病症的说明书，所述代谢病症如血糖水平升高、胰岛素水平升高、糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、心血管如血脂异常、动脉粥样硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、糖尿病肾病、妊娠期糖尿病、代谢综合征如代谢综合征X、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、终末期肝病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝硬化或原发性胆汁性肝硬化(PBC)或阿尔茨海默病。
说明书可以印刷在基材(如纸或塑料等)上，并且可以作为包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器或其组件的标签中(即与包装相关联)等。在其它实施方式中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如CD-ROM、软盘等)上的电子存储数据文件存在。在又一种其它实施方式中，实际说明书不存在于试剂盒中，而是提供用于如通过互联网从远程源获得说明书的手段。此实施方式的一个实施例是包括网址的试剂盒，在所述网址上可以查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。通常希望将试剂盒的一些或所有组件包装在合适的包装中以维持无菌。试剂盒的组件可以包装在试剂盒容纳元件中以制造单个易于处置的单元，其中试剂盒容纳元件(例如盒子或类似结构)可为或可不为气密容器，例如以进一步保持试剂盒的一些或全部组件的无菌性。
实施例1：GLP-1蛋白的重组表达和纯化
表1中列出的GLP-1融合多肽(即SEQ ID NO:51-80、85-88)使用BL21(DE3)衍生菌株，由细菌大肠杆菌表达系统产生。编码加标签的GLP-1融合多肽的DNA针对大肠杆菌表达进行密码子优化，从头合成并且亚克隆到PET衍生表达载体(Novagen)中。氨基酸取代通过修饰相应遗传密码实现。当在Terrific肉汤(TB)培养基中细胞密度达到2.0的OD600时，用0.5mM异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导加标签的GLP-1融合多肽的过表达。在37℃下进行蛋白质诱导20-22小时之后收集细胞。收集细胞，并且在20mM Tris pH 8.0，0.15M NaCl中通过细胞粉碎机(900巴，两次)溶解。通过离心(8,000×g，30min)收集含有加标签的GLP-1融合多肽的可溶性级分。通过蛋白酶去除标签之后，通过反相色谱纯化GLP-1融合多肽。每个步骤中的样品通过LC/MS表征以确认正确分子量。
实施例2：在重组蛋白中并入非蛋白氨基酸
将N端His-Aib-Glu-Gly四肽或His-Aib二肽溶解在有机溶剂中，并加入到溶于有机溶剂的GLP-1融合多肽溶液中。在室温下搅拌反应3小时。然后将哌啶加入反应溶液中以去除Fmoc保护基。
实施例3：GLP-1多肽缀合物的制备
向实施例2中获得的GLP-1融合多肽的NaOH溶液中逐滴添加CRM试剂(例如HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO、HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2等)的有机溶剂溶液。在室温下搅拌反应1小时。随后，将产物施加到反相色谱。由此得到如上文所示的表1中列出的GLP-1多肽缀合物。
遵循供应商手册，使用针对不同缀合物优化的条件，用沃特世(Waters)BioAccordLC-MS系统通过LC-MS方法，或用沃特世Acquity UPLC系统通过UPLC检测并表征GLP-1多肽缀合物。
实施例4a：体外活性
方法：在具有或不具有1％人血清白蛋白(HSA)的情况下，使用过表达人GLP-1受体和CRE荧光素酶报告基因的BHK细胞系测定体外GLP-1活性。当不存在或存在1％HSA时，以最高浓度为1nM或100nM对待测GLP-1多肽缀合物进行测试，并进行3倍连续稀释。用分子处理细胞4小时之后，通过Steadylite plus试剂盒(珀金埃尔默(Perkin Elmer)，6066751)测量荧光素酶活性。
每种GLP-1多肽缀合物的活性表示为从非线性回归分析导出的EC50。
结论：在不含HSA补充剂的分析中，几乎所有分子(即GLP-1多肽缀合物)显示与索玛鲁肽相当或甚至更好的效力。然而，在1％HSA存在下，不同分子展现不同程度的GLP-1活性减少(即增加的EC50)。表2a和2b中的数据表明，接头长度、脂肪酸位置和缀合脂肪酸部分的数目可能与GLP-1活性相关。如表2所示，与具有较长接头长度的分子相比，具有短接头长度(即12个氨基酸残基)的分子(无论单酰化还是双酰化)都具有显著降低的GLP1活性。随着GLP-1的C端残基与CRM残基(即接头中的赖氨酸)之间的距离增加，分子在HSA存在下的GLP-1活性看起来稳步提高。
如表2a所示，在1％HSA存在下，单酰基化分子002、010和011显示出比索玛鲁肽高得多的活性。对于双酰基化的分子012、016、004、006、007、005、001和061，在1％HSA存在下，均显示与索玛鲁肽相比相对较低的GLP-1活性，但仍在可接受范围内。
表2a.GLP-1多肽缀合物的体外活性。为了测量体外GLP-1活性，使用过表达人GLP-1受体的BHK细胞系。
实施例4b：体外活性
方法：在具有或不具有1％人血清白蛋白(HSA)的情况下，使用过表达人GLP-1受体和CRE荧光素酶报告基因的CHO细胞系测定体外GLP-1活性。当不存在或存在1％HSA时，以最高浓度为30nM或600nM对待测GLP-1多肽缀合物进行测试，并进行3倍连续稀释。用分子处理细胞5小时之后，通过Bright-Glo荧光素酶分析系统(普洛麦格(Promega),E2620)测量荧光素酶活性。每种GLP-1多肽缀合物的活性表示为从非线性回归分析导出的EC50。
结论：如表2b所示，在1％HSA存在下，单酰基化分子002(1006)和019(1023)显示出比索玛鲁肽高得多的活性。
表2b.GLP-1多肽缀合物的体外活性。为了测量体外GLP-1活性，使用过表达人GLP-1受体的CHO细胞系。
实施例5：C57瘦型小鼠中的体内活性
方法：在第1天，10周龄雄性C57BL/6小鼠用蛋白质皮下注射一次。每天测量体重，并且每个处理组使用五只动物。监测每只动物的体重。BW减轻％＝100*(第n天的BW-第1天的BW)/(第1天的BW)。数据指示为平均值和标准误差(SEM)。计算0到8天的体重减轻(％)的曲线下面积(AUC△BW 0-8d)。
结论：分子001和012显示对体重控制的剂量依赖性效果(图1A和表3)。如图1A和表3所示，分子007和008较于分子012和016具有更低的效果，这与体外活性数据一致。具有双脂肪酸的分子001、016和012都展现比索玛鲁肽更持久的效果，表明分子001、016和012可具有更长的半衰期(图1A和1B)。
表3：C57瘦型小鼠研究中0到8天的体重减轻(％)的曲线下面积(AUC△BW 0-8d)。
实施例6a：db/db小鼠中的体内活性
方法：10周龄雄性db/db小鼠用GLP-1多肽缀合物皮下注射一次。在不同时间测量空腹血糖，并且每组使用三只动物。Δ血糖是血糖减去基线水平。数据指示为平均值和标准误差(SEM)。
结论：分子001和002都显示对血糖控制的剂量依赖性效果(图2A和2B)。具有双脂肪酸的分子001展现比索玛鲁肽更持久的效果，表明分子001可具有更长的半衰期。
方法：10周龄雄性db/db小鼠用GLP-1多肽缀合物皮下注射一次。在不同时间测量非空腹血糖，并且每组使用五只动物。Δ血糖是血糖减去基线水平。数据指示为平均值和标准误差(SEM)。计算0到192小时的Δ血糖的曲线下面积(AUC△BG 0-192h)。
结论：分子012显示对血糖控制的剂量依赖性效果(图2C，表4)。具有双脂肪酸的分子012展现比索玛鲁肽更持久的效果。
表4：图2C的db/db小鼠中0到192小时的非空腹Δ血糖(％)的曲线下面积(AUC△BG0-192h)。
组 AUC△BG 0-192h(hr*mmol/L)
索玛鲁肽3nmol/kg -317.0
索玛鲁肽10nmol/kg -583.4
索玛鲁肽30nmol/kg -527.1
分子012 3nmol/kg -424.5
分子012 10nmol/kg -1004.5
分子012 30nmol/kg -1447.0
实施例6b：db/db小鼠中的体内活性
方法：10周龄雄性db/db小鼠用分子019皮下注射一次。在不同时间测量随机血糖，并且每组使用五只动物。Δ血糖是血糖减去基线水平。数据指示为平均值和标准误差(SEM)。
结论：分子019显示对血糖控制的剂量依赖性效果(图2D和2E)和比索玛鲁肽显著更高的效力。
实施例7：药代动力学测量
方法：6-8周龄雄性C57BL/6小鼠以30nmol/kg蛋白质的单次皮下剂量施用(n＝3/组)。在注射前(-5分钟)、注射后0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时和192小时收集血浆样品。通过ELISA分析测量血浆中GLP-1多肽缀合物的浓度。基于显示每种GLP-1多肽缀合物的血浆浓度与皮下注射后时间的图，通过WinNonlin计算药代动力学参数。
结论：分子001和012在小鼠中显示比索玛鲁肽和分子002更长的半衰期(表5)，与体内功效一致。
表5：GLP-1多肽缀合物在小鼠中的药代动力学参数。通过WinNonlin软件分析药代动力学数据。计算每种分子的Tmax、Cmax、T1/2、AUC。
方法：6-8周雄性SD大鼠分别以15nmol/kg GLP-1多肽缀合物的单次皮下剂量(n＝3/组)和15nmol/kg GLP-1多肽缀合物的单次静脉内剂量(n＝3/组)施用。在施用前(-5分钟)、皮下施用后0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、32小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时、216小时和240小时收集血浆样品。在施用前(-5分钟)、静脉内施用后0.083小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、32小时、48小时、72小时、96小时和120小时收集血浆样品。通过LC-MS/MS方法测量血浆中多肽缀合物的浓度。基于显示每种多肽缀合物的血浆浓度与皮下注射后时间的图，通过WinNonlin计算药代动力学参数。
结论：如表6中所示，分子001和012在大鼠中显示比索玛鲁肽更长的半衰期，据报道索玛鲁肽T1/2为12小时(皮下施用，数据来自FDA的非临床综述资料)。
表6：GLP-1多肽缀合物在大鼠中的药代动力学参数。通过WinNonlin软件分析药代动力学数据。计算每种分子的Tmax、Cmax、T1/2、AUC。
NA：不可用。
方法：10月龄雄性巴马小型猪(Bama minipig)分别用5nmol/kg GLP-1多肽缀合物的单次皮下剂量(n＝2/组)和5nmol/kg蛋白质的单次静脉内剂量(n＝2/组)施用。在施用前(-5分钟)、皮下施用后0.5小时、1小时、3小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、168小时、336小时、504小时和672小时收集分子012和索玛鲁肽组的血浆样品。在施用前(-5分钟)、静脉内施用后0.083小时、0.5小时、1小时、3小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、168小时、336小时和504小时收集分子012和索玛鲁肽组的血浆样品。对于索玛鲁肽组，通过ELISA分析测量血浆中GLP-1多肽缀合物的浓度。对于分子012组，通过LC-MS/MS方法测量血浆中的蛋白质浓度。基于显示每种GLP-1多肽缀合物的血浆浓度与施用后时间的图，通过WinNonlin计算药代动力学参数。
结论：分子012在小型猪中显示比索玛鲁肽更长的半衰期(表7)。
表7：GLP-1多肽缀合物在小型猪中的药代动力学参数。通过WinNonlin软件分析药代动力学数据。计算每种分子的Tmax、Cmax、T1/2、AUC。
实施例8a：疾病模型中的功效研究
在疾病动物模型(如db/db小鼠)中评定所选分子以确定体重、食物摄入量、血糖功效以及长期研究中的剂量效应。还测量一些生物标记，包括空腹胰岛素、血浆甘油三酯、胆固醇、肝甘油三酯和炎症生物标记(ALT、AST和CRP)。
方法：22周龄DIO雄性C57BL/6小鼠(约50g)每隔一天(Q2D)用指定GLP-1多肽缀合物(即，分子012)皮下注射一次，持续25天。一周两次测量食物摄入量和体重，并且一周一次测量空腹血糖。每个治疗组使用五只动物。对每只动物分别监测体重和空腹血糖，但在一起测量每组动物的食物摄入量。第1天和第25天是分子给药的第一天和最后一天。数据指示为平均值和标准误差(SEM)或合并值。通过单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析。第25天的体重减轻通过-1*(BW减轻％-媒剂组的BW减轻％)计算；累积食物摄入量减少通过-100*(累积食物摄入量-媒剂的累积食物摄入量)/媒剂的累积食物摄入量计算。
结论：在DIO研究中，如图3A、3B和表8所示，分子012显示对体重减轻、食物摄入量减少和血糖控制的剂量依赖性功效。
表8第25天DIO小鼠的食物摄入量减少和体重减轻
实施例8b：疾病模型中的功效研究
在阿尔茨海默病动物模型(APP/PS1，APPswe/PSEN1dE9小鼠)中评定所选分子以确定认知功能(莫里斯水迷宫和Y迷宫)、脑Aβ斑块沉积和海马锥体神经元数目以及研究中的剂量效应。
为了评定动物的认知功能，利用莫里斯水迷宫和Y迷宫测试。还测量分子对皮质和海马(受阿尔茨海默病影响的脑部区域)中β-淀粉样斑块沉积的影响。此外，海马中锥体神经元的数目被评定为药物的潜在神经保护作用的量度。这些方法允许在临床前环境中全面评估分子在减轻与阿尔茨海默病相关的病理变化方面的功效。
方法：6月龄APP/PS1雄性小鼠每天一次(QD)或每隔一天一次(Q2D)用指定GLP-1多肽缀合物(分子012)皮下注射，持续10周。每个治疗组使用15只动物。每周监测体重和食物摄入量。给药之后进行认知功能行为实验，包括莫里斯水迷宫和Y迷宫。取脑组织进行免疫组织化学染色以评估皮质和海马中的Aβ含量。通过HE染色测量海马锥体神经元的数目。数据指示为平均值和标准误差(SEM)。通过单因素方差分析进行统计分析。索玛鲁肽用作阳性对照。
结论：在APP/PS1研究中，如图5A、5B、5C、5D和5E所示，分子012显示对认知功能改善、脑Aβ斑块沉积减少和海马锥体神经元保护的剂量依赖性功效。发现分子012可有效增加象限占有率，这是指在导航任务期间在目标象限中花费的时间的百分比；以及增加交替百分比，这是指在迷宫任务期间在不同位置之间交替的频率。另外，观察到分子012减少脑的皮质和海马区域(典型地受阿尔茨海默病影响)两者中的Aβ斑块沉积。分子012还改善了海马(对记忆至关重要的区域)中的神经元数目。这些发现表明分子012对认知功能具有正面影响，并且减少与阿尔茨海默病相关的病理变化。在动物研究中，分子012在治疗阿尔茨海默病方面显示比索玛鲁肽显著更好的功效。
实施例8c：疾病模型中的功效研究
所选分子在阿尔茨海默病动物模型中评定散发性阿尔茨海默痴呆，所述模型为快速老化小鼠8(SAMP8)模型。SAMP8小鼠展现年龄相关的认知衰退和神经病理学变化，类似于在人阿尔茨海默病中观察到的那些变化，包括β-淀粉样斑块沉积和神经炎症。其还显示行为异常和突触可塑性降低。
7月龄SAMP8小鼠每隔一天(Q2D)用指定GLP-1多肽缀合物(分子012)皮下注射一次，持续16周，剂量分别是30nmol/kg、100nmol/kg和300nmol/kg。每个治疗组使用15只动物。每周监测体重和食物摄入量。给药之后进行认知功能行为实验，包括莫里斯水迷宫和Y迷宫。取脑组织进行免疫组织化学染色以评估皮质和海马中的Aβ含量。通过HE染色测量海马锥体神经元的数目。数据指示为平均值和标准误差(SEM)。通过单因素方差分析进行统计分析。索玛鲁肽和多奈哌齐(Donepezil)用作阳性对照。
分子012在SAMP8小鼠中显示对认知功能改善、脑Aβ斑块沉积减少和海马锥体神经元保护的剂量依赖性功效。分子012还在治疗SAMP8小鼠的阿尔茨海默病方面显示出比阳性对照显著更好的功效。
实施例9a：非人灵长类动物中的PK研究。
在猴中评定所选分子的药代动力学。进行皮下和静脉注射两种给药方式。
方法：3-5岁雄性食蟹猴以5nmol/kg GLP-1多肽缀合物的单次皮下剂量(n＝2/组)施用。在注射前(-5分钟)、注射后2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、216小时、288小时、360小时、432小时和504小时收集索玛鲁肽组的血浆样品。在注射前(-5分钟)、注射后0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、48小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时、216小时、288小时、432小时和504小时收集分子012组的血浆样品。对于索玛鲁肽组，通过ELISA分析测量血浆中的蛋白质浓度。对于分子012组，通过LC-MS/MS方法测量血浆中GLP-1多肽缀合物的浓度。基于显示每种蛋白质的血浆浓度与皮下注射后时间的图，通过WinNonlin计算药代动力学参数。
结论：分子012在猴中显示比索玛鲁肽和分子002更长的半衰期(表9a)。
表9a：GLP-1多肽缀合物在食蟹猴中的药代动力学参数。通过WinNonlin软件分析药代动力学数据。计算每种分子的Tmax、Cmax、T1/2、AUC。
PK参数 单位 索玛鲁肽 分子012
Tmax hr 7 24
Cmax nmol/L 48.1 58.0
终末t1/2 hr 65 122
AUCtau hr*nmol/L 2876(Tau＝96h) 10989(Tau＝504h)
实施例9b：非人灵长类动物中的PK研究。
方法：3-5岁雄性食蟹猴对于索玛鲁肽和分子019分别以4nmol/kg和5nmol/kg的单次静脉内剂量(n＝2/组)施用。在注射前(-5分钟)、注射后0.083小时、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时和168小时收集索玛鲁肽组的血浆样品。在注射前(-5分钟)、注射后0.083小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时和168小时收集分子012组的血浆样品。通过LC-MS/MS方法测量血浆中的蛋白质浓度。基于显示每种蛋白质的血浆浓度与静脉内施用后时间的图，通过WinNonlin计算药代动力学参数。
结论：分子019在猴中显示与索玛鲁肽类似的半衰期(表9b)，其潜在地支持对人每周给药一次。进一步鉴于分子019的强效GLP-1活性(比索玛鲁肽高10倍)，预期分子019是有前景的候选物，其不仅提供比索玛鲁肽更好的功效而且支持希望的每周一次给药频率(或潜在地甚至更低的频率)。
表9b：GLP-1多肽缀合物在食蟹猴中的药代动力学参数。通过WinNonlin软件分析药代动力学数据。计算每种分子的C0、T1/2和AUC。
PK参数 单位 索玛鲁肽 分子019
C0 nmol/L 85.1 176.5
Vz L/kg 0.09 0.06
Cl mL/min/kg 0.026 0.015
终末t1/2 hr 42.8 49.0
AUCtau hr*nmol/L 2402(t＝168hr) 5302(t＝168hr)
实施例10：免疫原性评定。
还通过计算机模拟(iTope和TCED方法)和离体(EpiScreen)方法评定所选GLP-1多肽缀合物的免疫原性。
实施例11：人血清白蛋白结合
方法：在Biacore 8K仪器中通过表面等离子体共振表征分子与血清白蛋白的结合。使来自不同物种的血清白蛋白共价结合到CM5传感器芯片表面，直到达到4000RU。用1M乙醇胺以10μL/min的流动速率封闭芯片420s。将每种分子样品稀释并且以30μL/min的流动速率注射，以允许与芯片结合的白蛋白结合120s并且解离300s。将不含分子的结合缓冲液以20秒的流动速率在芯片上传送，以允许结合的分子自发解离30秒。
结论：分子004、001、006和012显示出比索玛鲁肽、分子019和分子002更高的人血清白蛋白结合亲和力(参见表10)，这与PK数据一致。
表10：人血清白蛋白结合亲和力
实施例12：片剂组合物的制备
方法：
喷雾干燥化合物制备：GLP-1多肽缀合物可根据如本文所提供的实施例1、2和3中所描述的方法制备，接着使用反相C4柱将缓冲液交换为50-70％w/w乙醇。通过将溶液进料到喷雾干燥器中获得喷雾干燥的GLP-1多肽缀合物。
干式造粒：干式造粒通过辊压进行，辊速度为6-10rpm且辊压力为25-55巴，间隙为0.6-1.0mm。粉碎速度设置为100-150rpm，接着是网目0.5-1.5mm筛网。在干式造粒之前，使用掺合器开创同和(Kai chuang tong he)KCLD-10混合器掺合组合物。
压片：片剂在标准压缩旋转压片机上以10-20rpm的压片速度进行压片。压缩力设置为6-15kg。在主压缩之前进行预压缩以去除夹带的空气。
测试组合物A1和B1：掺合SNAC、硬脂酸镁和MCC，之后进行干式造粒。获得的颗粒称为SNAC颗粒。掺合GLP-1多肽缀合物(即分子012或分子019)、聚维酮和MCC，之后进行干式造粒。获得的颗粒称为GLP-1颗粒。然后将SNAC颗粒和GLP-1颗粒与额外的硬脂酸镁掺合，然后压片。
测试组合物A2：掺合SNAC、硬脂酸镁和MCC，之后进行干式造粒。将获得的颗粒(称为SNAC颗粒)与GLP-1多肽缀合物和额外的硬脂酸镁掺合，之后压片。
测试组合物A3、A5-A17、A19 B2-B14、B17-B21：掺合SNAC、硬脂酸镁，之后进行干式造粒。将获得的颗粒(称为SNAC颗粒)与GLP-1多肽缀合物和额外的硬脂酸镁掺合，之后压片。
测试组合物A4和A18、B15和B16：掺合SNAC、硬脂酸镁和GLP-1多肽缀合物，之后进行干式造粒。获得的颗粒随后进行压片。
表11A和11B分别概述分子012(表11A)和分子019(表11B)的药物组合物的不同实施方式。
表11A分子012片剂的组合物
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注意：*包括于SNAC颗粒中的量
表11B分子019片剂的组合物
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注意：*包括于SNAC颗粒中的量
实施例13：崩解测试
方法：根据中国药典2020使用TDTF ZB-3A崩解设备进行标准崩解测试。崩解设备中有2个篮架，每个篮容纳6个试管。将片剂放置在试管中，并且通过篮顶部上的相机自动监测崩解。将篮浸没于含有800mL 37℃纯化水的烧杯中。测量完全崩解的时间。结果报告为3个片剂的平均值。表3显示实施例12中所描述的测试组合物的结果。
结论：对于分子012，测试组合物A3、A5、A8、A9、A11、A12、A17和A18展现比测试组合物A1、A2、A7、A10、A13和A16显著更快的崩解(参见表12A)。对于分子019，测试组合物B2-B6、B8-B16、B18和B19显示比测试组合物B1显著更快的崩解(参见表12B)。
表12A分子012组合物的崩解测试
表12B分子019组合物的崩解测试
实施例14.溶出度测试
方法：根据中国药典2020使用汉森(Hanson)ELITE 8溶出设备进行溶出度测试。在37℃下使用500mL含有0.05％Brij 35的pH 6.8的磷酸盐缓冲液介质。桨转速设置为70rpm。以预定义间隔收集样品。GLP-1和SNAC浓度使用RP-UPLC方法确定，分别在215nm和335nm进行UV检测。
结论：对于分子012，与测试组合物A1和A2相比，测试组合物A3、A4、A5、A8、A11、A18和A19显示显著更快的分子012和SNAC释放(参见表13A以及图4A和4B)。对于分子019，与测试组合物B1相比，所有测试组合物B2、B8、B9、B10、B12、B15、B16、B18和B19都显示显著更快的分子019和SNAC释放(参见表13B以及图4C和4D)。
表13A.溶液中的GLP-1多肽缀合物和SNAC(％)
表13B.溶液中的GLP-1多肽缀合物和SNAC(％)
实施例15.比格犬中的口服暴露。
方法：雄性比格犬(N＝4，1-5岁，体重7.5-15kg)在给药前禁食过夜并且在给药后禁食0到4小时。狗在给药前1小时直到给药后4小时限制饮水，否则随意饮水。如表11A和11B中所提供的测试组合物口服(p.o.)施用于狗。在预定义时间点获取血液样品：给药前(-5分钟)、给药后0.25小时、0.5小时、0.75小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时。将血液样品收集到含有EDTA的试管中并且保持在冰上。然后通过离心从全血中分离血浆并且在-20℃下储存。通过LC-MS/MS方法测量血浆中GLP-1多肽缀合物的浓度。通过WinNonlin v.6.3或Phoenix v.6.2(Pharsight Inc.，美国加利福尼亚州山景城(Mountain View,CA,USA))中的非房室模型分析个体血浆浓度-时间曲线。确定在t＝30分钟时测量的GLP-1多肽缀合物暴露并且将其通过(剂量/千克体重)归一化。在口服施用后(通过Pharsight程序)计算前30分钟的血浆浓度与时间曲线下面积(AUC，[时间×浓度])，并且将其通过((剂量/千克体重)×100)归一化以获得剂量校正暴露。获得的平均值提供于表14A中，并且所有值表示为几何平均值。
结论：如表14A所示，对于分子012，与测试组合物A1相比，测试组合物A8显示前30分钟期间的暴露增加几乎4倍。与测试组合物A1相比，测试组合物A19显示前30分钟期间的暴露增加8倍。
对于分子019，与测试组合物B1(数据未显示)相比，测试组合物B2和B8也显示前30分钟期间的暴露显著增加，这类似于实施例13和14中所示的溶出度和崩解测试结果中观察到的趋势。如表14B所示，测试组合物B2和B8分别显示约0.772和0.600(nmol/L×h)/(nmol/kg)×100的剂量校正AUC 0-30min，这证明极好的口服吸收曲线。所有测试组合物B2-B18都可用于分子019，并且可提供比参考组合物B1更好的口服吸收曲线。
表14A：口服施用测试组合物后比格犬中的平均暴露。
表14B：口服施用测试组合物后比格犬中的平均暴露。
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Claims (148)

1.一种药物组合物，其包含多肽缀合物和增强吸收的赋形剂，其中
所述多肽缀合物包含多肽以及两个连接到所述多肽的赖氨酸残基上的清除率降低部分CRM，其中所述多肽的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:51、53、54、57、59和85，并且其中
所述CRM的结构如下所示：
其中所述赋形剂包含N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐。
2.一种药物组合物，其包含多肽缀合物和增强吸收的赋形剂，其中：
所述多肽缀合物包含多肽以及一个连接到所述多肽的赖氨酸残基上的清除率降低部分CRM，其中所述多肽的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:52、56、60和88，并且其中所述CRM的结构如下所示：
其中所述赋形剂包含N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述多肽缀合物具有如下所示的结构：
4.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述多肽缀合物具有以下所示的结构：
5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述盐选自下组：钠盐、钾盐和铵盐。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述盐为钠盐。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其进一步包含至少一种润滑剂，所述润滑剂各自选自下组：硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、聚氧化乙烯聚合物、油酸钠、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸、氢化植物油、轻质矿物油、二氧化硅、烷基硫酸盐、苯甲酸钠、聚乙二醇、滑石、蜡和甘油酯。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述至少一种润滑剂包含硬脂酸镁。
9.根据权利要求5所述的药物组合物，其进一步包含至少一种填充剂。
10.根据权利要求5所述的药物组合物，其进一步包含至少一种粘合剂。
11.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述药物组合物不包含填充剂或粘合剂。
12.根据权利要求7所述的药物组合物，其由所述多肽缀合物、N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸钠(SNAC)和硬脂酸镁组成。
13.根据权利要求2或4所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含：
0.5-50mg的所述多肽缀合物；以及
50-300mg的SNAC。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含0.5-40mg的所述多肽缀合物。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含0.5-30mg的所述多肽缀合物。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含0.5-20mg的所述多肽缀合物。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含0.5-10mg的所述多肽缀合物。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含0.5-5mg的所述多肽缀合物。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含0.5-2.5mg的所述多肽缀合物。
20.根据权利要求13所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含2.5-20mg的所述多肽缀合物。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含2.5-15mg的所述多肽缀合物。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含2.5-10mg的所述多肽缀合物。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含2.5-5mg的所述多肽缀合物。
24.根据权利要求13所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含5-10mg的所述多肽缀合物。
25.根据权利要求13所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含10-30mg的所述多肽缀合物。
26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含10-20mg的所述多肽缀合物。
27.根据权利要求13所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含20-50mg的所述多肽缀合物。
28.根据权利要求13所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含75-300mg的SNAC。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含100-300mg的SNAC。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含150-300mg的SNAC。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含200-300mg的SNAC。
32.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述SNAC占单位剂型的80％到98％w/w。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述SNAC占单位剂型的81％到98％w/w。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述SNAC占单位剂型的82％到98％w/w。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述SNAC占单位剂型的83％到98％w/w。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述SNAC占单位剂型的84％到98％w/w。
37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述SNAC占单位剂型的85％到98％w/w。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述SNAC占单位剂型的86％到98％w/w。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述SNAC占单位剂型的87％到98％w/w。
40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述SNAC占单位剂型的88％到98％w/w。
41.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述SNAC占单位剂型的89％到98％w/w。
42.根据权利要求41所述的药物组合物，其中所述SNAC占单位剂型的90％到98％w/w。
43.根据权利要求13所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多300mg SNAC。
44.根据权利要求43所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多250mg SNAC。
45.根据权利要求44所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多200mg SNAC。
46.根据权利要求45所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多150mg SNAC。
47.根据权利要求46所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多100mg SNAC。
48.根据权利要求47所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多50mg SNAC。
49.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型中的所述赋形剂的91％到98％w/w。
50.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述多肽缀合物占所述单位剂型的0.1％w/w到20％w/w。
51.根据权利要求13所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多50mg的所述多肽缀合物。
52.根据权利要求51所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多40mg的所述多肽缀合物。
53.根据权利要求52所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多30mg的所述多肽缀合物。
54.根据权利要求53所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多20mg的所述多肽缀合物。
55.根据权利要求54所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多10mg的所述多肽缀合物。
56.根据权利要求13所述的药物组合物，其进一步包含1-10mg润滑剂。
57.根据权利要求56所述的药物组合物，其中所述单位剂型包含1-10mg硬脂酸镁。
58.根据权利要求57所述的药物组合物，其中所述单位剂型包含：
a)0.5-10mg的所述多肽缀合物、50-300mg的SNAC和1-10mg硬脂酸镁；
b)10-20mg的所述多肽缀合物、100-300mg的SNAC和1-10mg硬脂酸镁；或
c)20-50mg的所述多肽缀合物、200-300mg的SNAC和1-10mg硬脂酸镁。
59.根据权利要求1或3所述的药物组合物，其中所述药物组合物的单位剂型包含：
10-100mg的所述多肽缀合物；以及
50-500mg的SNAC。
60.根据权利要求59所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含10-100mg的所述多肽缀合物。
61.根据权利要求60所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含10-90mg的所述多肽缀合物。
62.根据权利要求61所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含10-80mg的所述多肽缀合物。
63.根据权利要求62所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含10-70mg的所述多肽缀合物。
64.根据权利要求63所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含10-60mg的所述多肽缀合物。
65.根据权利要求64所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含10-50mg的所述多肽缀合物。
66.根据权利要求65所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含10-40mg的所述多肽缀合物。
67.根据权利要求66所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含10-20mg的所述多肽缀合物。
68.根据权利要求59所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含20-100mg的所述多肽缀合物。
69.根据权利要求68所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含20-90mg的所述多肽缀合物。
70.根据权利要求69所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含20-80mg的所述多肽缀合物。
71.根据权利要求70所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含20-70mg的所述多肽缀合物。
72.根据权利要求71所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含20-60mg的所述多肽缀合物。
73.根据权利要求72所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含20-50mg的所述多肽缀合物。
74.根据权利要求73所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含20-40mg的所述多肽缀合物。
75.根据权利要求59所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含40-50mg的所述多肽缀合物。
76.根据权利要求59所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含100-500mg的SNAC。
77.根据权利要求76所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含100-450mg的SNAC。
78.根据权利要求77所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含100-400mg的SNAC。
79.根据权利要求78所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含100-350mg的SNAC。
80.根据权利要求79所述的药物组合物，其中药物组合物的单位剂型包含100-300mg的SNAC。
81.根据权利要求59所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型的60％到96％w/w。
82.根据权利要求81所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型的62％到96％w/w。
83.根据权利要求82所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型的65％到96％w/w。
84.根据权利要求83所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型的66％到96％w/w。
85.根据权利要求84所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型的67％到96％w/w。
86.根据权利要求85所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型的68％到96％w/w。
87.根据权利要求86所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型的70％到96％w/w。
88.根据权利要求87所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型的72％到96％w/w。
89.根据权利要求88所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型的75％到96％w/w。
90.根据权利要求89所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型的78％到96％w/w。
91.根据权利要求90所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型的80％到96％w/w。
92.根据权利要求91所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型的86％到96％w/w。
93.根据权利要求92所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型的87％到96％w/w。
94.根据权利要求59所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多500mg SNAC。
95.根据权利要求94所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多450mg SNAC。
96.根据权利要求95所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多400mg SNAC。
97.根据权利要求96所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多350mg SNAC。
98.根据权利要求97所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多300mg SNAC。
99.根据权利要求98所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多250mg SNAC。
100.根据权利要求99所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多200mg SNAC。
101.根据权利要求100所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多150mg SNAC。
102.根据权利要求101所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多100mg SNAC。
103.根据权利要求59所述的药物组合物，其中所述SNAC占所述单位剂型中的所述赋形剂的91％到98％w/w。
104.根据权利要求59所述的药物组合物，其中所述多肽缀合物占所述单位剂型的至少1％w/w且至多32％w/w。
105.根据权利要求59所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多100mg的所述多肽缀合物。
106.根据权利要求105所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多90mg的所述多肽缀合物。
107.根据权利要求106所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多80mg的所述多肽缀合物。
108.根据权利要求107所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多70mg的所述多肽缀合物。
109.根据权利要求108所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多60mg的所述多肽缀合物。
110.根据权利要求109所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多50mg的所述多肽缀合物。
111.根据权利要求110所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多40mg的所述多肽缀合物。
112.根据权利要求111所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多30mg的所述多肽缀合物。
113.根据权利要求112所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多20mg的所述多肽缀合物。
114.根据权利要求113所述的药物组合物，其中其单位剂型包含至多10mg的所述多肽缀合物。
115.根据权利要求59所述的药物组合物，其进一步包含1-20mg润滑剂。
116.根据权利要求115所述的药物组合物，其中所述单位剂型包含1-20mg硬脂酸镁。
117.根据权利要求116所述的药物组合物，其中所述单位剂型包含：
a)10-20mg的所述多肽缀合物、100-300mg的SNAC和1-20mg硬脂酸镁；
b)20-40mg的所述多肽缀合物、200-300mg的SNAC和1-20mg硬脂酸镁；
c)20-50mg的所述多肽缀合物、200-300mg的SNAC和1-20mg硬脂酸镁；
d)40-50mg的所述多肽缀合物、200-300mg的SNAC和1-20mg硬脂酸镁；或
e)50-100mg的所述多肽缀合物、300-500mg的SNAC和1-20mg硬脂酸镁。
118.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述单位剂型包含0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg或50mg的所述多肽缀合物。
119.根据权利要求59所述的药物组合物，其中所述单位剂型包含10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg或100mg的所述多肽缀合物。
120.根据权利要求5所述的药物组合物，其中其单位剂型呈选自下组的形式：片剂、胶囊、药囊、口香糖和散剂。
121.根据权利要求120所述的药物组合物，其中其所述单位剂型呈片剂形式。
122.根据权利要求5所述的药物组合物，其进一步包含至少一种润滑剂，所述润滑剂各自选自下组：二十二酸甘油酯、胶态二氧化硅、月桂基硫酸钠和月桂基硫酸镁。
123.根据权利要求1至122中任一项所述的药物组合物在制备用于预防或治疗有需要的受试者的阿尔茨海默病的药物中的用途。
124.根据权利要求1至122中任一项所述的药物组合物在制备用于预防或治疗有需要的受试者的代谢病症的药物中的用途。
125.根据权利要求124所述的用途，其中所述代谢病症为糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、动脉粥样硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、糖尿病肾病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、终末期肝病、肝脂肪变性。
126.根据权利要求124所述的用途，其中所述代谢病症为代谢综合征。
127.根据权利要求125所述的用途，其中所述肝脂肪变性为脂肪肝。
128.根据权利要求125所述的用途，其中所述终末期肝病为肝硬化。
129.根据权利要求128所述的用途，其中所述肝硬化为原发性胆汁性肝硬化(PBC)。
130.根据权利要求125所述的用途，其中糖尿病包括一种或多种选自下组的病况：高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、青年的成年发病型糖尿病(MODY)和妊娠期糖尿病。
131.根据权利要求1至122中任一项所述的药物组合物在制备用于管理有需要的受试者的体重的药物中的用途。
132.根据权利要求1至122中任一项所述的药物组合物在制备用于减少有需要的受试者的食物摄入量的药物中的用途。
133.根据权利要求1至122中任一项所述的药物组合物在制备用于减轻有需要的受试者的体重的药物中的用途。
134.根据权利要求123至133中任一项所述的用途，其中所述受试者为人。
135.根据权利要求134所述的用途，其中所述受试者的空腹血糖水平为125mg/dL或更高。
136.根据权利要求134所述的用途，其中所述受试者的身体质量指数(BMI)为至少25。
137.根据权利要求123至133中任一项所述的用途，其中所述药物组合物以不超过每天两次的给药方案施用。
138.根据权利要求123至133中任一项所述的用途，其中所述药物组合物以不超过每天一次的给药方案施用。
139.根据权利要求123至133中任一项所述的用途，其中所述药物组合物以不超过每2天一次的给药方案施用。
140.根据权利要求123至133中任一项所述的用途，其中所述药物组合物以不超过每3天一次的给药方案施用。
141.根据权利要求123至133中任一项所述的用途，其中所述药物组合物以不超过每周一次的给药方案施用。
142.根据权利要求123至133中任一项所述的用途，其中所述药物组合物以不超过每两周一次的给药方案施用。
143.根据权利要求123至133中任一项所述的用途，其中所述药物组合物以不超过每三周一次的给药方案施用。
144.根据权利要求123至133中任一项所述的用途，其中所述药物组合物以不超过每月一次的给药方案施用。
145.根据权利要求123至133中任一项所述的用途，其中所述药物组合物以每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两月一次的给药方案施用。
146.根据权利要求123至133中任一项所述的用途，其中给药方案的给药间隔在每3天一次到每月一次的范围内。
147.根据权利要求123至133中任一项所述的用途，其中给药方案的给药间隔在每周一次到每月一次的范围内。
148.根据权利要求123至133中任一项所述的用途，其中所述药物组合物通过口服施用。
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