MX2013000250A - Polipeptidos cortos y que contienen d-aminoacido para conjugados terapeuticos y usos de los mismos. - Google Patents

Polipeptidos cortos y que contienen d-aminoacido para conjugados terapeuticos y usos de los mismos.

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MX2013000250A
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Jean-Paul Castaigne
Christian Che
Carine Thiot
Laurence Peslherbe
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Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos cortos (por ejemplo, con una longitud menor que 19 aminoácidos) y polipéptidos más largos (por ejemplo, con una longitud de 19 o más aminoácidos) que tienen uno o más D-aminoácidos como porciones de activación. Estos polipéptidos, cuando se conjugan a agentes (por ejemplo, agentes terapéuticos o vectores de transporte) son capaces de transportar a los agentes a través de BBB o hacia tipos particulares de célula. En particular, los polipéptidos cortos pueden incluir uno o más D-aminoácidos. Estos compuestos, por lo tanto, son particularmente útiles en el tratamiento de enfermedades neurológicas o enfermedades asociadas con tipos particulares de células, órganos o tejidos.

Description

POLIPÉPTIDOS CORTOS Y QUE CONTIENEN D-AMINOÁCIDO PARA CONJUGADOS TERAPÉUTICOS Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención La presente invención se refiere, en parte, a polipéptidos cortos útiles como porciones de dirección. La presente invención también se refiere a conjugados que incluyen una porción de dirección ligada a un agente terapéutico o un vector de transporte y a usos de los mismos.
Antecedentes de la Invención El cerebro está protegido contra sustancias potencialmente tóxicas mediante la presencia de dos sistemas de barrera: la barrera de sangre-cerebro (BBB) y la barrera de sangre-fluido cerebroespinal (BCSFB). La BBB se considera como la ruta más importante para la captación de ligandos de suero, ya que su área de superficie es de aproximadamente 5000 veces más que la de la BCSFB. El endotelio del cerebro, que constituye la BBB, representa el mayor obstáculo para el uso de fármacos potenciales, contra muchos trastornos del sistema nervioso central (CNS). Como regla general, únicamente las moléculas lipofílicas pequeñas pueden pasar a través de la BBB, es decir, desde la sangre sistémica en la circulación hasta el cerebro. Muchos fármacos que tienen un tamaño más grande o una hidrofobicidad superior, muestran resultados prometedores en estudios en animales para tratar trastornos CNS, aunque con frecuencia no cruzan la BBB. Por lo tanto, los terapéuticos de péptido y proteína generalmente son excluidos del transporte de la sangre al cerebro, debido a la permeabilidad insignificante de la pared endotelial capilar del cerebro a estos fármacos.
El tratamiento de enfermedades cerebrales con frecuencia se ve obstaculizado por la incapacidad que tienen agentes terapéuticos, de otra manera efectivos, de cruzar la BBB. Por lo tanto, se desean nuevas estrategias para transportar agentes dentro del cerebro.
Breve Descripción de la Invención Hemos desarrollado polipéptidos cortos (por ejemplo, menores a 19 aminoácidos de longitud) con la capacidad de cruzar la barrera de sangre-cerebro (BBB), o ingresar a tipos de células particulares (por ejemplo, hígado, ojo, pulmón, riñon, bazo, músculo u ovario) con eficiencia incrementada. También hemos desarrollado polipéptidos tanto cortos (por ejemplo, 6 a 18 aminoácidos de longitud) como más largos (por ejemplo, 19 o más aminoácidos de longitud) que tienen uno o más D-aminoácidos (por ejemplo, 3D-An2 o fragmentos de los mismos). Estos polipéptidos pueden servir como porciones de dirección. Cuando estas porciones de dirección se unen con (por ejemplo, se conjugan para) uno o más agentes o vectores de transporte, se incrementa de igual manera la eficiencia del transporte a través de la BBB o dentro de tipos de células particulares. Por consiguiente, la presente invención presenta porciones de dirección opcionalmente conjugadas para uno o más agentes (por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos) o un vector de transporte (por ejemplo, una nanopartícula o un liposoma) y el uso de dichos compuestos en el tratamiento y diagnóstico de una enfermedad.
En un primer aspecto, la presente invención presenta un polipéptido purificado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, incluyendo la secuencia de aminoácido Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys (fórmula la), en donde X3 es Asn o GIn; X4 es Asn o GIn; y X5 es Phe, Tyr, o Trp; en donde el polipéptido tiene menos de 200 aminoácidos de longitud (por ejemplo, menos de 150, 100, 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 12, 10, 11, 8, o 7 aminoácidos, o cualquier rango entre estos números); en donde el polipéptido incluye opcionalmente uno o más D-isómeros de un aminoácido mencionado en la fórmula la (por ejemplo, un D-isómero de Lys, Arg, X3, X4, X5, o Lys); y en donde el polipéptido no es un péptido de la tabla 2.
En un segundo aspecto, la presente invención presenta un polipéptido purificado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, incluyendo la secuencia de aminoácido Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys (fórmula la), en donde X3 es Asn o GIn; X4 es Asn o GIn; y X5 es Phe, Tyr, o Trp; en donde el polipéptido tiene menos de 19 aminoácidos de longitud (por ejemplo, menos de 18, 17, 16, 15, 14, 12, 10, 11, 8 o 7 aminoácidos, o cualquier rango entre estos números); y en donde el polipéptido incluye opcionalmente uno o más D-isómeros de un aminoácido mencionado en la fórmula la (por ejemplo, D-isómero de Lys, Arg, X3, X4, X5, o Lys).
En cualesquiera de los polipeptidos anteriores, se pueden elaborar adiciones o eliminaciones de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos (por ejemplo, de 1 a 3 aminoácidos) de la secuencia de aminoácido Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys.
En algunas modalidades del primer y segundo aspectos, la secuencia de aminoácido es Z1 -Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2 (fórmula Ib), en donde X3 es Asn o GIn; X4 es Asn o GIn; X5 es Phe, Tyr, o Trp; Z1 está ausente, Cys, Gly, Cys-Gly, Arg-Gly, Cys-Arg-Gly, Ser-Arg-Gly, Cys-Ser-Arg-Gly, Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Gly-Ser-Arg-Gly, Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys- Phe-Tyr-Gly-Gly- Ser-Arg-Gly, Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Phe-Phe-Tyr-Gl -Gly-Ser-Arg-Gly, Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, o Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly; y Z2 está ausente, Cys, Tyr, Tyr-Cys, Cys-Tyr, Thr-Glu-Glu-Tyr, o Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys; y en donde el polipéptido comprende opcionalmente uno o más D-isómeros de un aminoácido mencionado en la fórmula Ib, Z1 o Z2.
En otras modalidades del primero y segundo aspectos, el polipéptido tiene uno o más residuos de cisteina adicionales en la N-terminal del polipéptido, la C-terminal del polipéptido, o ambas. En otras modalidades, el polipéptido tiene uno o más residuos de tirosina adicionales en la N-terminal del polipéptido, la C-terminal del polipéptido, o ambas. Aún en modalidades adicionales, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácido Tyr-Cys y/o Cys-Tyr en la N-terminal del polipéptido, la C-terminal del polipéptido, o ambas.
En ciertas modalidades del primero y segundo aspectos, la secuencia de aminoácido es Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys. En otras modalidades, la secuencia de aminoácido es Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr. Aún en otras modalidades, la secuencia de aminoácido es Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys.
En modalidades particulares del primero y segundo aspectos, la secuencia de aminoácido es X 1 -X2-Asn-Asn-X5-X6 (fórmula lia), en donde X1 es Lys o D-Lys; X2 es Arg o D-Arg; X5 es Phe o D-Phe; y X6 es Lys o D-Lys; y en donde al menos uno (por ejemplo, al menos dos, tres, o cuatro) de X1, X2, X5 o X6 es un D-aminoácido.
En otras modalidades del primero y segundo aspectos, la secuencia de aminoácido es X1 -X2-Asn-Asn-X5-X6-X7 (fórmula llb), en donde X1 es Lys o D-Lys; X2 es Arg o D-Arg; X5 es Phe o D-Phe; X6 es Lys o D-Lys; y X7 es Tyr o D-Tyr; y en donde al menos uno (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, o cinco) de X1, X2, X5, X6 o X7 es D-aminoácido.
En algunas modalidades del primero y segundo aspectos, la secuencia de aminoácido es Z1 -Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2 (fórmula lie), en donde X3 es Asn o Gln; X4 es Asn o Gln; X5 es Phe, Tyr, o Trp; Z1 está ausente, Cys, Gly, Cys-Gly, Arg-Gly, Cys-Arg-Gly, Ser-Arg-Gly, Cys-Ser-Arg-Gly, Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Gly-Ser-Arg-Gly, Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly , Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, o Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly; y Z2 está ausente, Cys, Tyr, Tyr-Cys, Cys-Tyr, Th r-G I u-G I u-Ty r, o Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys; en donde al menos uno de X1, X2, X5, X6, o X7 es D-aminoácido; y en donde el polipéptido comprende opcionalmente uno o más D-isómeros de un aminoácido mencionado en Z1 o Z2.
En modalidades adicionales de cualesquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido es menor a 15 aminoácidos de longitud (por ejemplo, menor a 10 aminoácidos de longitud).
En otras modalidades de cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido es Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gl -D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr (3D-An2); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gl -Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-L s-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1a); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr- Glu-Glu-Tyr-Cys (P1b); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P1c); D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys (P1d); Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P2); Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P3); Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P4); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5b); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P5c); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Tyr-Cys (P6b); y D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr-Cys (P6c); o un fragmento de los mismos.
Aún en otras modalidades de cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido incluye una secuencia que tiene de 0 a 5 (por ejemplo, de 0 a 4, 0 a 3, 0 a 2, 0 a 1 , 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, 2 a 5, 2 a 4, 2 a 3, 3 a 5, 3 a 4, o 4 a 5) sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos relativos a una o más secuencias seleccionadas de Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr (3D-An2); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1a); Phe-Tyr- Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1b); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P1c); D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys (P1d); Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P2); Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P3); Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P4); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5b); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P5c); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Tyr-Cys (P6b); y D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr-Cys (P6c); o fragmentos de los mismos.
En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido es Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; o Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys, o un fragmento de los mismos.
Aún en otras modalidades, el polipéptido es Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr- Glu-Glu-Tyr (3D-An2); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1a); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-P e-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1b); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P1c); D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys (P1d) o un fragmento de los mismos (por ejemplo, la eliminación de 1 a 7 aminoácidos del N-término de P1, P1a, P1b, P1c, o P1d; una eliminación de 1 a 5 aminoácidos del C-término de P1, P1a, P1b, P1c, o P 1 d ; o eliminaciones de 1 a 7 aminoácidos del N -término de P1, P1a, P1b, P1c, o P1d y 1 a 5 aminoácidos del C-término P1, P1a, P1b, P1c, o P1d).
En cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido puede tener un C-término que está anidado. En otras modalidades, el polipéptido es transportado eficientemente a través de la barrera de sangre-cerebro (por ejemplo, el polipéptido se transporta a través de la barrera de sangre-cerebro en forma más eficiente que Angiopep-2).
En un tercer aspecto, la presente invención presenta un polipéptido terapéutico que incluye una porción de dirección que consiste en un polipéptido de cualquiera de los aspectos anteriores y un agente peptídico terapéutico, en donde la porción de dirección está ligada al agente peptídico terapéutico.
En ciertas modalidades, la porción de dirección está ligada al agente terapéutico a través de un enlace covalente (por ejemplo, un enlace de péptido). En otras modalidades, el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión. En modalidades particulares, el polipéptido terapéutico incluye uno o más agentes peptídicos terapéuticos.
La porción de dirección puede ser heterologa con respecto al agente peptídico terapéutico.
En modalidades particulares del tercer aspecto, el agente peptídico terapéutico es neurotensina o un análogo de neurotensina (por ejemplo, neurotensina(6-13), neurotensina(8-13), Lys(7)-D-Tyr(11 )-neurotensina(7-13), p-Glu(1)-neurotensina, p-Glu(1 )-neurotensina-OH, D-Lys(6)-neurotensina(6-13), D-Tyr( 11 )-neurotensina(6-13), D-Lys(6)-D-Tyr(11 )-neurotensina(6- 13), D-Arg(8)-neurotensina(6-13), D-Arg(9)-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(6-13), D-Pro(10)neurotensina(6-13), D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Trp(11 )-neurotensina(6-13), D-Phe(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Tyr( 1 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Trp(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-neurotensina(8-13), D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Pro(10)neurotensina(8-13), D-Tyr(11 )-neurotensina(8-13), D-Trp(11 )-neurotensina(8-13), D-Phe(1 )-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Tyr(11 )-neurotensina(8- 3) y D-Arg(8)-D-Trp(11 )-neurotensina(8-13), o una forma acetilada de la misma, o cualquiera aquí descrito, tal como acetil-Lys(7)-D-Tyr( 11 )-neurotensina(7-13)), un agonista de receptor de neurotenslna, un factor neurotrófico o un análogo de factor neurotrófico (por ejemplo, un factor neurotrófico derivado de neuroglial (GDNF) o un análogo GDNF, o un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) o un análogo BDNF), un agonista GLP-1, o leptina o un análogo de leptina.
En otras modalidades del tercer aspecto, el agente peptídico terapéutico es un polipéptido que se liga específicamente a una molécula biológica, tal como una inmunoglobulina o un fragmento de la misma que retiene la capacidad de ligarse en forma específica a la molécula biológica. Por ejemplo, la inmunoglobulina puede ser un anticuerpo tetramérico o un anticuerpo de cadena simple.
En un cuarto aspecto, la presente invención presenta un conjugado que tiene la fórmula A-X-B, en donde A es una porción de dirección de cualesquiera de los polipéptidos anteriores; X es un enlazador; B es un agente terapéutico o vector de transporte. En modalidades particulares, el conjugado tiene la fórmula A-(X-B)n o A-X-(B)n, en donde n es un entero de uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10). En ciertas modalidades, n es un entero de dos o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10). En algunas modalidades, n es un entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 9, de 1 a 8, de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3, de 2 a 9, de 2 a 8, de 2 a 7, de 2 a 6, de 2 a 5, de 2 a 4, de 3 a 9, de 3 a 8, de 3 a 7, de 3 a 6, de 3 a 5, o de 3 a 4).
En algunas modalidades del cuarto aspecto, X es un enlace de péptido. En otras modalidades, X es al menos un aminoácido; y A y B cada uno son ligados en forma covalente a X a través de un enlace de péptido. En ciertas modalidades, X es un enlazador de éster. En algunas modalidades, X tiene la fórmula -N H-(CH2)n-C(0)0-, en donde n es un entero entre 2 y 10 (por ejemplo, en donde n es un entero entre 2 y 5, 2 y 6, 2 y 7, 2 y 8, 2 y 9, 2 y 10, 3 y 5, 3 y 6, 3 y 7, 3 y 8, 3 y 9, 3 y 10, 4 y 5, 4 y 6, 4 y 7, 4 y 8, 4 y 9, 4 y 10, 5 y 6, 5 y 7, 5 y 8, 5 y 9, y 5 y 10, tal como cuando n es 5 para el ácido aminohexanoico (Ahx)). En ciertas modalidades, X tiene la fórmula: en donde n es un entero entre 2 y 15 (por ejemplo, n es 3, 6, o 11); y cualquier Y es tiol en A, y Z es una amina primaria en B o Y es un tiol en B y Z es una amina primaria en A.
En ciertas modalidades del cuarto aspecto, B es el agente terapéutico, tal como un agente anticáncer (por ejemplo, paclitaxel (Taxol®) o un derivado de paclitaxel, tal como docetaxel (Taxotere®); etoposida; doxorrubicina; o un análogo del mismo), un agente de ácido nucleico terapéutico (por ejemplo, un agente ARNi, tal como siARN, dsARN, miARN, shARN o ptgsARN), un fármaco de molécula pequeña (por ejemplo, un antibiótico, un agente antiproliferativo o un inhibidor de factor de crecimiento), una etiqueta (por ejemplo, un isótopo, una etiqueta de generación de radioimagen, una etiqueta fluorescente o una molécula reportera), o un agente peptídico terapéutico. En modalidades particulares, el conjugado tiene uno o más agentes B o agentes terapéuticos. En ciertas modalidades, el agente terapéutico es el agente peptídico terapéutico, y el conjugado es una proteína de fusión. En modalidades adicionales, el agente peptídico terapéutico se selecciona de neurotensina o un análogo de neurotensina (por ejemplo, neurotensina(6-13), neurotensina(8-13), Lys(7)-D-Tyr(11 )-neurotensina(7-13), p-Glu(1 )-neurotensina, p-Glu(1)-neurotensina-OH , D-Lys(6)-neurotensina(6-13), D-Tyr(11)-neurotensina(6-13), D-Lys(6)-D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-neurotensina(6-13), D-Arg(9)-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(6-13), D-Pro(10)neurotensina(6-13), D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Trp(11 )-neurotensina(6-13), D-Phe(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Tyr( 11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Trp(11 )-neurotensina(6- 13), D-Arg(8)-neurotensina(8- 13), D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Pro(10)neurotensina(8-13), D-Tyr(11 )-neurotensina(8-13), D-Trp( 11 )-neurotensina(8-13), D-Phe(11 )-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Tyr( 11 )- neurotens¡na(8-13), y D-Arg(8)-D-Trp( 11 )-neurotensina(8-13), o una forma acetilada del mismo, o cualquiera aquí descrito, tal como acetil-Lys(7)-D-Tyr(11 )-neurotensina(7-13)), un factor neurotrófico o un análogo de factor neurotrófico (por ejemplo, factor neurotrófico derivado de línea de célula glial (GDNF) o un análogo GDNF y un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) o un análogo BDNF)), un agonista GLP-1 y leptina o un análogo de leptina.
En ciertas modalidades del cuarto aspecto, B es el vector de transporte, tal como un vector lípido (por ejemplo, un liposoma, una micela o un lipoplex), un poliplex, un dendrímero, o una nanopartícula (por ejemplo, una nanopartícula polímérica, una nanopartícula lípida sólida o una micela con tamaño de nanómetro). En otras modalidades, el vector de transporte se liga a, o contiene un agente terapéutico (por ejemplo, un agente anticáncer, un agente de ácido terapéutico, un fármaco de molécula pequeña, una etiqueta y un agente peptídíco terapéutico).
En otras modalidades del cuarto aspecto, el agente peptídico terapéutico es un polipéptído que enlaza específicamente una molécula biológica, tal como una inmunoglobulina o un fragmento de la misma que retiene la capacidad de enlazar específicamente la molécula biológica. Por ejemplo, la inmunoglobulina puede ser un anticuerpo tetramérico o un anticuerpo de cadena simple.
En un quinto aspecto, la presente invención presenta una composición que incluye cualquier polipéptido terapéutico o cualquier conjugado descrito anteriormente. En algunas modalidades, la composición incluye además un transportador farmacéuticamente aceptable.
En un sexto aspecto, la presente invención presenta un método para tratar (por ejemplo en forma profiláctica) a un sujeto (por ejemplo, un humano) que necesita de tratamiento, incluyendo un sujeto que tiene cáncer. Los métodos pueden incluir el paso de administrar al sujeto una cantidad efectiva de un polipéptido terapéutico o conjugado de la presente invención (por ejemplo, un polipéptido o conjugado que incluye, en la forma de un agente peptídico terapéutico, una inmunoglobulina o un fragmento del mismo que enlaza específicamente una molécula biológica). Los cánceres incluyen cáncer de cerebro (por ejemplo, glioma, glioma mezclado, glioblastoma multiforme, astrocitoma, astrocitoma poliquístico, tumor neuroepitelial disembrioplásico, oligodendroglioma , ependimoma, oligoastrocitoma, medulo-blastoma, retinoblastoma, neu roblastoma , germinoma y teratoma). El sujeto puede haber sido diagnosticado como teniendo un cáncer o, pudo haberse determinado que está en alto riesgo de desarrollar un cáncer.
En modalidades particulares, la presente invención presenta un polipéptido o un conjugado aquí descrito para utilizarse en el tratamiento o tratamiento profiláctico de cáncer en un sujeto. En otras modalidades, la presente invención presenta el uso de cualquier polipéptido terapéutico o conjugado aquí descrito en la fabricación de un medicamento para tratar (por ejemplo, en forma profiláctica), cáncer en un sujeto. Los cánceres incluyen cáncer de cerebro (por ejemplo, glioma, glioma mezclado, glioblastoma multiforme, astrocitoma, astrocitoma poliquístico, tumor neuroepitelial disembrioplásico, oligodendroglioma, ependimoma, oligoastrocitoma, meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma, germinoma y teratoma).
En un séptimo aspecto, la presente invención presenta un método para reducir la temperatura del cuerpo de un sujeto, mediante la administración de un polipéptido terapéutico o un conjugado de la presente invención en una cantidad suficiente para reducir la temperatura del cuerpo. El sujeto puede padecer de, o haber padecido de ataque, ataque cardíaco, isquemia cerebral, isquemia cardíaca o lesión nerviosa o está en necesidad de neuroprotección, o hipotermia maligna.
En modalidades particulares, la presente invención presenta cualquier polipéptido terapéutico o conjugado descrito anteriormente, para utilizarse para reducir la temperatura del cuerpo de un sujeto. En otras modalidades, la presente invención presenta el uso de cualquier polipéptido terapéutico o conjugado aquí descrito en la fabricación de un medicamento para reducir la temperatura del cuerpo de un sujeto. El sujeto puede padecer de, o haber padecido de ataque, ataque cardíaco, isquemia cerebral, isquemia cardíaca, lesión nerviosa o está en necesidad de neuroprotección, o hipotermia maligna.
En un octavo aspecto, la presente invención presenta un método para tratar (por ejemplo, en forma profiláctica) hipertensión en un sujeto, mediante la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un polipéptido terapéutico o conjugado de la invención.
En modalidades particulares, la presente invención presenta cualquier polipéptido terapéutico o conjugado aquí descrito para utilizarse en el tratamiento o el tratamiento profiláctico de hipertensión en un sujeto. En otras modalidades, la presente invención presenta el uso de cualquier polipéptido terapéutico o conjugado aquí descrito en la fabricación de un medicamento para tratar (por ejemplo, en forma profiláctica) hipertensión en un sujeto.
En un noveno aspecto, la presente invención presenta un método para tratar (por ejemplo, en forma profiláctica) dolor, o disminuir la sensibilidad a dolor en un sujeto, a través de la administración de un polipéptido terapéutico o un conjugado de la presente invención en una cantidad suficiente para tratar dolor. El dolor puede ser dolor agudo, dolor neuropático periférico o central, dolor inflamatorio, dolor relacionado con migraña, dolor relacionado con dolor de cabeza, dolor relacionado con síndrome de intestino irritable, dolor relacionado con fibromialgia, dolor artrítico, dolor esquelético, dolor de articulaciones, dolor gastrointestinal, dolor muscular, dolor de angina, dolor facial, dolor pélvico, claudicación, dolor postoperatorio, dolor postraumático, dolor de cabeza tipo tensión, dolor obstétrico, dolor ginecológico o dolor inducido por quimioterapia.
En modalidades particulares, la presente invención presenta cualquiera polipéptido terapéutico o conjugado aquí descrito para utilizarse en el tratamiento o el tratamiento profiláctico de dolor o para utilizarse en la disminución de sensibilidad al dolor en un sujeto. En otras modalidades, la presente invención presenta el uso de cualquier polipéptido terapéutico o conjugado aquí descrito en la fabricación de un medicamento para tratar (por ejemplo, en forma profiláctica) dolor, o disminuir la sensibilidad a dolor en un sujeto. El dolor puede ser dolor agudo, dolor neuropático periférico o central, dolor inflamatorio, dolor relacionado con migraña, dolor relacionado con dolor de cabeza, dolor relacionado con síndrome de intestino irritable, dolor relacionado con fibromialgia, dolor artrítico, dolor esquelético, dolor de articulación, dolor gastrointestinal, dolor muscular, dolor de angina, dolor facial, dolor pélvico, claudicación, dolor postoperatorio, dolor post traumático, dolor de cabeza tipo tensión, dolor obstétrico, dolor ginecológico o dolor inducido por quimioterapia.
En aspectos adicionales, la presente invención presenta el tratamiento (por ejemplo, profilácticamente) de un sujeto que tiene un trastorno, a través de la administración de un polipéptido terapéutico o un conjugado de la invención en una cantidad suficiente para tratar el trastorno. Estos trastornos incluyen un trastorno psicótico (por ejemplo, esquizofrenia o cualquier otro trastorno psicótico aquí descrito), adicción a fármacos o abuso a fármacos (por ejemplo, adicción o abuso a anfetamina, metanfetamina, 3,4-metilenodioxi-metanfetamina, nicotina, cocaína, metilfenidata, o arecolina), un trastorno metabólico (por ejemplo, diabetes (por ejemplo, Tipo I o Tipo II), obesidad, diabetes como consecuencia a obesidad, hiperglicemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistencia a insulina, tolerancia dañada a la glucosa (IGT), dislipidemia diabética, hiperlipidemia, enfermedad cardiovascular o hipertensión), un trastorno neurológico (por ejemplo, un trastorno neurodegenerativo; una condición del sistema nervioso central (CNS), el sistema nervioso periférico o el sistema nervioso autónomo; o cualquier trastorno neurológico aquí descrito) en un sujeto.
En modalidades particulares, la presente invención presenta cualquier polipéptido terapéutico o conjugado aquí descrito para utilizarse en el tratamiento o el tratamiento profiláctico de un trastorno en un sujeto. En otras modalidades, la presente invención presenta el uso de cualquier polipéptido terapéutico o conjugado aquí descrito en la fabricación de un medicamento para tratar (por ejemplo, profilácticamente) un trastorno en un sujeto. Estos trastornos incluyen un trastorno psicótico (por ejemplo, esquizofrenia o cualquier otro trastorno psicótico aquí descrito), adicción a fármacos o abuso a fármacos (por ejemplo, adicción o abuso a anfetamina, metanfetamina, 3,4-metilenodioxi-metanfetamina, nicotina, cocaína, metilfenidata, o arecolina), un trastorno metabólico (por ejemplo, diabetes (por ejemplo, Tipo I o Tipo II), obesidad, diabetes como consecuencia a obesidad, hiperglicemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistencia a insulina, tolerancia dañada a la glucosa (IGT), dislipidemia diabética, hiperlipidemia, enfermedad cardiovascular o hipertensión), un trastorno neurológico (por ejemplo, un trastorno neurodegenerativo; una condición del sistema nervioso central (CNS), el sistema nervioso periférico o el sistema nervioso autónomo; o cualquier trastorno neurológico aquí descrito) en un sujeto.
En cualquiera de los métodos o usos anteriores, el sujeto puede ser un humano.
En los métodos de tratamiento o usos de la invención, el conjugado o polipéptido terapéutico se puede administrar en una dosis equivalente inferior (por ejemplo, menor al 95%, 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 10%, 5%, o 1%), en comparación con la dosificación recomendada del agente terapéutico no conjugado o vector de transporte (por ejemplo, enlazado a, o que contiene un agente terapéutico). En otras modalidades, el conjugado o polipéptido terapéutico se administra en una dosis equivalente más alta (1.5x, 2x, 2.5x, 3.0x, 5x, 8x, 10x, 15x, 20x, 25x) que una dosificación recomendada para el agente no conjugado.
La porción de dirección, conjugado o polipéptido terapéutico de la invención, puede ser transportada de manera eficiente en un tipo de célula en particular, órgano o tejido (por ejemplo, cualquiera de una, dos, tres, cuatro o cinco tipos de célula de hígado, ojo, pulmón, riñon, bazo, músculo u ovario, órgano o tejido) o puede atravesar la BBB de mamífero. De acuerdo con la presente invención, la porción de dirección puede promover la acumulación de un agente terapéutico en un tejido tal como, por ejemplo, un hígado, tejido de hígado, un ojo (tejido de ojo), los pulmones (tejido de pulmón), un riñon (tejido de riñon), un bazo (tejido de bazo), músculo (tejido de músculo) y ovario (tejido de ovario) de un sujeto. Por consiguiente, la porción objetivo, conjugado o polipéptido terapéutico se puede utilizar para tratar una enfermedad asociada con estos tejidos (por ejemplo, un cáncer, tal como cualquiera aquí descrito; una infección, tal como una infección bacteriana o una infección viral; o una condición inflamatoria). La porción de dirección puede tener cualquier longitud menor a 50 aminoácidos, por ejemplo, menor a 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 12, 10, 11, 8 o 7 aminoácidos, o cualquier rango entre estos números. En modalidades particulares, la porción de dirección puede tener cualquier longitud menor a 19 aminoácidos, por ejemplo, menor a 18, 17, 16, 15, 14, 12, 10, 11, 8 o 7 aminoácidos, o cualquier rango entre estos números. En ciertas modalidades, la porción de dirección tiene de 6 a 19 aminoácidos de longitud. La porción de dirección puede ser producida mediante tecnología genética recombinante o síntesis química. La porción de dirección, conjugado o polipéptido terapéutico también puede incluir un péptido que es sustancialmente similar (por ejemplo, al menos el 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad) o cualesquiera de los péptidos o polipéptidos aquí descritos.
En cualesquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido terapéutico, conjugado o porción de dirección incluye un polipéptido más corto que Angiopep-2 (An2), que tiene una o más sustituciones de D-aminoácido para una o más de las posiciones 1, 2, 3, 4, 8, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18 y 19 en Angiopep-2 (SEC ID NO:97). En modalidades adicionales, el polipéptido terapéutico, conjugado o porción de dirección tiene cualquier longitud menor a 50 aminoácidos, por ejemplo menor a 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 12, 10, 11, 8 o 7 aminoácidos (por ejemplo, cualquier longitud menor a 19 aminoácidos, tal como menor a 18, 17, 16, 15, 14, 12, 10, 11, 8 o 7 aminoácidos, o cualquier rango entre estos números). En ciertas modalidades, el polipéptido terapéutico, conjugado o porción de dirección tiene 6 a 19 aminoácidos de longitud.
En cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido terapéutico, conjugado o porción de dirección se transporta de manera eficiente a través de la barrera de sangre-cerebro (por ejemplo, el polipéptido terapéutico, conjugado o porción de dirección se transporta a través de la barrera de sangre-cerebro en forma más eficiente que Angiopep-2 o Angiopep-2 conjugado para un agente peptídico terapéutico, cualquier otro agente terapéutico o un vector de transporte).
En ciertas modalidades de cualquiera de los aspectos anteriores, la porción de dirección, conjugado o polipéptido terapéutico aquí descrito está modificado (por ejemplo, tal como aquí se describe). La porción de dirección, conjugado o polipéptido terapéutico puede ser amidado, acetilado o ambos. Dichas modificaciones pueden ser en el término amino o carboxi de la porción de dirección. La porción de dirección, conjugado o polipéptido terapéutico también puede incluir peptidomiméticos (por ejemplo, los aquí descritos) de cualesquiera de los péptidos aquí descritos. La porción de dirección, conjugado o polipéptido terapéutico también puede incluir una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15) sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en forma relativa a una de las secuencias aquí descritas. En particular, estas sustituciones, eliminaciones o adiciones de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos (por ejemplo, de 1 a 3 aminoácidos) se pueden realizar a partir de la secuencia de aminoácido Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys (fórmula la), Z1 -Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2 (fórmula Ib), X 1 -X2-Asn-Asn-X5-X6 (fórmula lia), X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7 (fórmula llb), o Z1 -X 1 -X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2 (fórmula Me), en donde se describen en la presente invención X1-X7, Z1 y Z2 de cada fórmula. Otras modificaciones incluyen procesamiento postraducción o mediante modificación química, incluyendo ubiquitinación, pegilación, acetilación, acilación, ciclado, amidación, oxidación, sulfación, formación de cisteína o adhesión covalente de uno o más agentes terapéuticos. En particular, el cíclaje puede ser una modificación preferida.
En ciertas modalidades de cualquiera de los aspectos anteriores, la porción de dirección, conjugado o polipéptido terapéutico aquí descrito es multimérico (por ejemplo, dimérico, trimérico o multimérico de orden superior, o tal como aquí se describe). La porción de dirección puede ser una porción de dirección multimérica (por ejemplo tal como aquí se describe). El conjugado puede incluir porciones de dirección multiméricas e incluir uno o más agentes terapéuticos o uno o más vectores de transporte (por ejemplo, tal como aquí se describe). En algunas modalidades, las porciones de dirección multiméricas y conjugados incluyen cualesquiera de las modificaciones o conjugados adicionales aquí descritas para polipéptidos (por ejemplo, procesamiento postraducción o mediante modificación química, incluyendo ubiquitinación, pegilación, acetilación, acilación, ciclaje, amidación, oxidación, sulfación, formación de cisteína o adhesión covalente de uno o más agentes terapéuticos).
En ciertas modalidades de cualquiera de los aspectos anteriores, los enlazadores pueden ser monovalentes o polivalentes (por ejemplo, agentes homomultifuncionales, heteromultifuncionales, bifuncionales o trifuncionales). En otras modalidades, los enlazadores pueden incluir un brazo flexible (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 átomos de carbono; o un espaciador de polietilenglicol, tal como (PEG)n , en donde n es 1 a 20).
Definiciones Por el término "conjugado" se entiende un compuesto que tiene una porción de dirección y un agente terapéutico o un vector de transporte (por ejemplo, cualquiera aquí descrito) enlazado a la porción objetivo.
Por el término porción de dirección, la cual es "transportada a través de la barrera de sangre-cerebro", se entiende una porción de dirección que tiene la capacidad de cruzar la BBB (por ejemplo, 25%, 50%, 100%, 200%, 500%, 1,000%, 5,000% o 10,000%) en un grado mayor que cualquiera sustancia de control, o en el caso de un conjugado, en comparación con un agente no conjugado. La capacidad atravesar la BBB puede determinarse utilizando un método conocido en la técnica (por ejemplo, un modelo in vitro de la BBB o una perfusión de cerebro in situ tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 7,557,182).
Por una porción de dirección, conjugado o polipéptido terapéutico el cual es "transportado en forma eficiente a un tipo de célula en particular", se entiende que la porción de dirección, conjugado o polipéptido terapéutico tiene la capacidad de acumularse (por ejemplo, ya sea debido a un transporte incrementado en la célula, el flujo disminuido de la célula o una combinación de los mismos) en dicho tipo celular, en al menos un grado superior al 10% (por ejemplo, 25%, 50%, 100%, 200%, 500%, 1,000%, 5,000% o 10,000%) que cualquier sustancia de control, o en el caso de un conjugado, en comparación con el agente no conjugado. Dichas actividades se describen con detalle en la Publicación de Solicitud Internacional No. WO 2007/009229, la cual está incorporada a la presente invención como referencia.
Por el término "dosificación equivalente" se entiende la cantidad de un conjugado de la invención requerida para lograr la misma cantidad molar de agente en el conjugado de la invención, en comparación con la molécula no conjugada.
Por el término "fragmento" se entiende una porción de aminoácido de longitud total o secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, cualquier secuencia aquí descrita). Los fragmentos pueden incluir al menos 4, 5, 6, 8, 10, 11 , 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos o ácidos nucleicos de la secuencia de longitud total. Un fragmento puede retener al menos una de las actividades biológicas de la proteína de longitud total.
Por una porción de dirección "enlazada a" un agente terapéutico o vector de transporte, se entiende una interacción covalente o no covalente entre la porción de dirección y el agente terapéutico o el vector de transporte. Las interacciones no covalentes incluyen, pero no se limitan a, enlace de hidrógeno, interacciones iónicas entre grupos cargados, enlace electrostático, interacciones de van der Waals, interacciones hidrofóbicas entre grupos no polares, interacciones Iipofóbicas y atracciones a base de LogP.
Por una "porción de dirección multimérica" se entiende un polipéptido que incluye más de una porción de dirección, en donde la porción de dirección puede ser la misma o diferente.
Por un "agente ARNi" se entiende cualquier agente o compuesto que ejerce un efecto de silenciación de gen por medio de una trayectoria de interferencia de ARN. Los agentes ARNi incluyen cualesquiera moléculas de ácido nucleico que tengan la capacidad de transmitir el ARNi específico de la secuencia, por ejemplo, un ARN de interferencia corta (siARN), ARN de hebra doble (dsARN), microARN (miARN), ARN de horquilla corta (shARN), oligonucleótido de interferencia corta, ácido nucleico de interferencia corta, oligonucleótido modificado de interferencia corta, siARN modificada en forma química y ARN de silenciación de gen postranscripción (ptgsARN).
Por "sustancialmente idéntico" se entiende un polipéptido o ácido nucleico que tiene al menos o aproximadamente el 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, o incluso el 99% de identidad en comparación con una secuencia de aminoácido o ácido nucleico de referencia. Para polipéptidos, la longitud de las secuencias de comparación generalmente será de al menos 4 (por ejemplo, al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 50 o 100) aminoácidos. Quedará entendido en la presente invención que se pueden encontrar saltos entre los aminoácidos de las secuencias que son idénticas o similares o a los aminoácidos del polipéptido original. Los saltos pueden no incluir aminoácidos, uno o más aminoácidos que no son idénticos o similares al polipéptido original. El porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, con un algoritmo GAP, BESTFIT o FASTA en el liberación de Paquete de Software de Wisconsin Genetics 7.0, utilizando pesos de salto por omisión.
Por "sujeto" se entiende un humano o animal no humano (por ejemplo, un mamífero).
Por "porción de dirección", se entiende un polipéptido, derivado de polipéptido o peptidomimético que tiene la capacidad de transportar a través de la BBB o en un tipo de célula en particular.
Por "agente terapéutico" se entiende cualquier agente que tiene la capacidad de utilizarse en el tratamiento o tratamiento profiláctico de una enfermedad o condición o en el diagnóstico de una enfermedad o condición.
Por "agente de ácido nucleico terapéutico" se entiende un agente terapéutico a base de proteína o a base de péptido.
Por "agente peptídico terapéutico" se entiende un agente terapéutico a base de proteína o a base de péptido.
Por "polipéptido terapéutico" se entiende un conjugado que tiene una porción de dirección de un agente peptídico terapéutico enlazado a una porción de dirección.
Por "vector de transporte" se entiende cualquier compuesto o composición (por ejemplo, lípido, carbohidrato, polímero o tensoactivo) con la capacidad de enlace o que contiene un agente terapéutico. El vector de transporte puede tener una capacidad de transportar al agente, tal como un fármaco de molécula pequeña o agente peptídico terapéutico. Los vectores de transporte de ejemplo incluyen micelas lípidas, liposomas, lipoplexos, dendrímeros y nanopartículas.
Por "tratamiento" de una enfermedad, trastorno o condición en un sujeto, se entiende la reducción de al menos un signo o síntoma de la enfermedad, trastorno o condición, mediante la administración de un conjugado o polipéptido terapéutico al sujeto.
Por "tratamiento en forma profiláctica" de una enfermedad, trastorno o condición en un sujeto, se entiende la reducción de la frecuencia del surgimiento o severidad de (por ejemplo, prevención) una enfermedad, trastorno o condición mediante la administración al sujeto de un conjugado o polipéptido terapéutico al sujeto, antes de la aparición de un síntoma o síntomas de la enfermedad.
La mención de un residuo de aminoácido se refiere a un L-aminoácido que ocurre naturalmente, a menos que se especifique lo contrario.
Se podrán apreciar otras características y ventajas de la presente invención, a partir de la Descripción Detallada y reivindicaciones que se encuentran más adelante.
Breve Descripción de las Figuras La figura 1, es una gráfica que muestra la perfusión de cerebro in situ en ratones para Angiopep-2 (An2), Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1) y Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5).
La figura 2, es una gráfica que muestra la latencia en la prueba de plantilla caliente en ratones de la respuesta de lamido de pata en ratones de control (vehículo), ratones que reciben ANG2002 (NT-An2, 20 mg kg, en forma intravenosa), ratones que reciben P5-NT (16 mg/kg, en forma intravenosa) y ratones que reciben P6-NT (14 mg/kg, en forma intravenosa).
La figura 3, es una gráfica que muestra el efecto de la temperatura corporal en ratones al momento de la administración de control (vehículo), ANG2002 (NT-An2, 20 mg/kg, en forma intravenosa), P5-NT (16 mg/kg, en forma intravenosa), y P6-NT (14 mg/kg, en forma intravenosa).
La figura 4, muestra los sitios de disociación de pepsina y tripsina para Angiopep-2 y ANGP6a (P6a).
La figura 5, es una gráfica que muestra un ensayo de enlace competitivo de [3H]-neurotensina utilizando células de adenocarcinoma de colon humano (HT29).
La figura 6, es una gráfica que muestra la perfusión de cerebro in situ en ratones para ANG2002, P6-NT y P6a-NT.
La figura 7, es una gráfica que muestra el efecto de la temperatura corporal en ratones al momento de la administración del control, (PBS), AN2-NT (conjugada para neurotensina An2, 20 mg/kg, 4.683 µ?t???/kg, intravenosa), P5-NT (4.683 pmol/kg, intravenosa), y P5a-NT (4.683 µG???/kg, intravenosa).
La figura 8, es una gráfica que muestra el efecto de la temperatura corporal en ratones al momento de la administración de control (PBS), AN2-NT (conjugada para neurotensina An2, 20 mg/kg, 4.683 pmol/kg, intravenosa), P6-NT (4.683 pmol/kg, intravenosa) y P6a-NT (4.683 pmol/kg, intravenosa).
La figura 9, muestra los sitios de disociación de pepsina y tripsina para An2-NT, P6a-NT(6-13) (ANGP6a-NT(6-13)), P6b-NT(6-13, D-Arg8) (ANGP6b-NT(6-13, D-Arg8)) y P6b-NT(6-13, D-Arg8, D-Tyr11) (ANGP6b-NT(6-13, D-Arg8, D-Tyr11)).
La figura 10, es una gráfica que muestra la perfusión de cerebro in situ en ratones para NT, P5a-NT1, P5b-NT1, P5c-NT1 y P6a-NT1.
Descripción Detallada de la Invención Actualmente hemos desarrollado polipéptidos cortos (por ejemplo, 6 a 18 aminoácidos de longitud) que tienen la capacidad de cruzar la barrera de sangre-cerebro (BBB), o que tiene la capacidad de ingresar a tipos de célula en particular (por ejemplo, de hígado, ojo, pulmón, bazo, riñon, músculo u ovario) con eficiencia incrementada. También desarrollamos polipéptidos tanto cortos (por ejemplo, 6 a 18 aminoácidos de longitud) como más largos (por ejemplo, 19 o más aminoácidos de longitud) que tienen uno o más D-aminoácidos (por ejemplo, 3D-An2). Estos polipéptidos pueden transportar un agente a través de la BBB o en células particulares y actuar como porciones de dirección. En algunos casos, la porción de dirección tiene la capacidad de cruzar la BBB o ingresar a tipos de célula en particular de manera más eficiente, o en ciertos casos tal como aquí se describe, mucho más eficiente, que una forma más larga del mismo polipéptido que tiene 19 aminoácidos de longitud o más. Esta eficiencia incrementada en el transporte puede permitir menores dosificaciones del conjugado, en comparación ya sea con el agente no conjugado o con el agente conjugado para una forma más larga de polipéptido. En otros casos, mediante la dirección del agente en forma más eficiente a su tejido(s) objetivo, los compuestos de la presente invención se pueden administrar en dosificaciones mayores que cualquier agente no conjugado o el agente conjugado a una forma más larga del polipéptido, ya que una mayor eficiencia de dirección puede reducir los efectos secundarios. Los compuestos que incluyen dichas porciones de dirección, y su uso en tratamiento de la enfermedad se describen con detalle a continuación.
Porción de Dirección La presente invención comprende polipéptidos cortos que se utilizan como porciones de dirección. Los polipéptidos de la presente invención incluyen una secuencia de consenso (por ejemplo, Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys) como sustituciones conservadoras de la misma, y tienen menos de 19 aminoácidos de longitud (por ejemplo, 18 aminoácidos y más corta).
Los conjugados y polipéptidos terapéuticos de la presente invención, pueden presentar cualquiera porciones de dirección aquí descritas, o un fragmento o análogo de las mismas. En ciertas modalidades, la porción de dirección puede tener al menos el 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o incluso 100% de identidad con un polipéptido aquí descrito. La porción de dirección puede tener una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15) sustituciones relativas a una de las secuencias aquí descritas. La porción de dirección puede tener una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15) adiciones o eliminaciones de aminoácidos en forma relativa a una de las secuencias aquí descritas. Se describen con mayor detalle a continuación otras modificaciones.
Las porciones de dirección de la presente invención incluyen una secuencia de consenso de Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys (fórmula la), en donde X3 es Asn o Gln; X4 es Asn o Gln; y X5 es Phe, Tyr, o Trp.
Las porciones de dirección de la presente invención también incluyen una secuencia de consenso de Z1 -Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2 (fórmula Ib), en donde X3 es Asn o Gln; X4 es Asn o Gln; X5 es Phe, Tyr, o Trp; Z1 está ausente, Cys, Gly, Cys-Gly, Arg-Gly, Cys-Arg-Gly, Ser-Arg-Gly, Cys-Ser-Arg-Gly, Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Gly-Ser-Arg-Gly, Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Phe-Tyr-Gly- Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly- Ser-Arg-Gly, o Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly; y Z2 está ausente, Cys, Tyr, Tyr-Cys, Cys-Tyr, Thr-Glu-Glu- Tyr, o Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys.
La secuencia de consenso de las fórmulas (la) y (Ib) incluyen la secuencia de aminoácido Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys y sustituciones conservadoras. Las sustituciones conservadoras y los derivados de aminoácidos y péptidos son bien conocidos en la técnica y se pueden determinar a través de cualesquiera métodos útiles (por ejemplo, utilizando una matriz de sustitución o cualquier otro método aquí descrito). Un derivado de una porción de dirección incluye una porción de dirección que contiene una o más sustituciones conservadoras seleccionadas de los siguientes grupos, o un subconjunto de estos grupos: Ser, Thr, y Cys; Leu, Me, y Val; Glu y Asp; Lys y Arg; Phe, Tyr, y Trp (por ejemplo, Phe y Tyr); y Gln, Asn, Glu, Asp, y His (por ejemplo, Gln y Asn). Las sustituciones conservadoras también se pueden determinar a través de otros métodos, tal como a través del algoritmo BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica), la matriz de sustitución BLOSUM (por ejemplo, matriz BLOSUM 62) y la matriz de sustitución PAM (por ejemplo, matriz PAM 250).
Las secuencias de consenso también incluyen las que tienen una o más sustituciones de D-aminoácido, en donde uno o más residuos de aminoácido de la fórmula (la) o (Ib) son sustituidos con un D-isómero correspondiente. Las sustituciones de D-aminoácido pueden proporcionar péptidos que tienen resistencia incrementada a la disociación mediante enzimas digestivas (por ejemplo, pepsina y/o tripsina). Por ejemplo, uno o más aminoácidos de la fórmula (la) o (Ib) que tienen posibles sitios de disociación mediante pepsina o tripsina, se pueden sustituir con el D-isómero de dicho aminoácido. Los sitios de disociación de ejemplo en la fórmula (la) o (Ib) mediante pepsina y tripsina, incluyen el enlace que es N-terminal o C-terminal en la posición 1 para Lys; la posición 2 para Arg; la posición 5 para X5 siendo Phe, Tyr o Trp; y la posición 6 para Lys. Por consiguiente, los polipéptidos de la presente invención también incluyen los que tienen uno o más D-isómeros para los aminoácidos mencionados en las posiciones 1, 2, 5 y/o 6 de la fórmula (la) o (Ib).
Otras porciones de dirección de la presente invención incluyen una secuencia de consenso de X1-X2-Asn-Asn-X5-X6 (fórmula lia), en donde X1 es Lys o D-Lys; X2 es Arg o D-Arg; X5 es Phe o D-Phe; y X6 es Lys o D-Lys; y en donde al menos uno de X1, X2, X5 y X6 es un D-aminoácido.
Aún otras porciones de dirección de la presente invención incluyen una secuencia de consenso de X1 -X2-Asn-Asn-X5-X6-X7 (fórmula llb), en donde X1 es Lys o D-Lys; X2 es Arg o D-Arg; X5 es Phe o D-Phe; X6 es Lys o D-Lys; X7 es Tyr o D-Tyr; y en donde al menos uno de X1 , X2, X5, X6 y X7 es un D-aminoácido.
Las porciones de dirección de la presente invención, también incluyen una secuencia de consenso de Z1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2 (fórmula lie), en donde X1 es Lys o D-Lys; X2 es Arg o D-Arg; X5 es Phe o D-Phe; X6 es Lys o D-Lys; X7 es Tyr o D-Tyr; Z1 está ausente, Cys, Gly, Cys-Gly, Arg-Gly, Cys-Arg-Gly, Ser-Arg-Gly, Cys-Ser-Arg-Gly , Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Gly-Ser-Arg-Gly, Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Tyr- Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, o Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly; y Z2 está ausente, Cys, Tyr, Tyr-Cys, Cys-Tyr, Thr-Glu-Glu-Tyr, o Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys; en donde al menos uno de X1, X2, X5, X6, o X7 es un D-aminoácido; y en donde el polipéptido incluye opcionalmente uno o más D-isómeros de un aminoácido mencionado en Z1 o Z2.
Estas secuencias de consenso también incluyen sustituciones conservadoras. Las sustituciones conservadoras y los derivados de los aminoácidos y péptidos son bien conocidos en la técnica y se pueden determinar a través de cualquiera métodos útiles (por ejemplo, mediante el uso de una matriz de sustitución o cualquier otro método aquí descrito). Un derivado de una porción de dirección incluye una porción de dirección que contiene una o más sustituciones conservadoras seleccionadas de los siguientes grupos o un subconjunto de estos grupos: Ser, Thr, y Cys; Leu, He, y Val; Glu y Asp; Lys y Arg; Phe, Tyr, y Trp (por ejemplo, Phe y Tyr); y Gln, Asn, Glu, Asp, y His (por ejemplo, Gln y Asn) como se indicó anteriormente. Las sustituciones conservadoras también se pueden determinar a través de otros métodos, tal como mediante el algoritmo BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica), la matriz de sustitución BLOSUM (por ejemplo, matriz BLOSUM 62), y la matriz de sustitución PAM (por ejemplo, matriz PAM 250).
Las porciones de dirección de la presente invención incluyen adiciones y eliminaciones de aminoácidos a la secuencia de consenso de Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys (fórmula la), en donde X3-X5 son tal como se definió anteriormente; las secuencias de consenso de X 1 -X2-Asn-Asn-X5-X6 y X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7 (fórmulas lia y llb, respectivamente), en donde X1, X2, X5, X6 y X7 son tal como se definió anteriormente; o el polipéptido más largo de 3D-An2, tal como aquí se describe. Las eliminaciones o adiciones pueden incluir cualquier parte de la secuencia de consenso de Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys, X1-X2-Asn-Asn-X5-X6, X1 -X2-Asn-Asn-X5-X6-X7, Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys, D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys, o D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr, o de la secuencia más larga 3D-An2. En algunas modalidades, las eliminaciones o adiciones de 1, 2, 3, 4, o 5 aminoácidos pueden ser elaboradas de la secuencia de consenso de la porción de dirección. En modalidades particulares, las eliminaciones o adiciones pueden ser de 1 a 3 aminoácidos.
Se pueden elaborar cualquiera sustituciones, adiciones o eliminaciones útiles, las cuales no destruyan de manera significativa una actividad biológica deseada (por ejemplo, la capacidad de cruzar la BBB o actividad agonista). La modificación puede reducir (por ejemplo, en al menos el 5%, 10%, 20%, 25%, 35%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% o 95%), pueden no tener efecto, o pueden incrementar (por ejemplo, en al menos 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 500% o 1000%) la actividad biológica de la secuencia de consenso o polipéptido original.
En particular, las sustituciones o adiciones de D-aminoácidos se pueden elaborar dentro de la porción objetivo. Dichas sustituciones o adiciones pueden proporcionar péptidos que tienen resistencia incrementada a disociación mediante enzimas, en donde uno o más aminoácidos para sitios de disociación pueden ser sustituidos con su D-isómero. Las enzimas de ejemplo incluyen pepsina, tripsina, Arg-proteinasa C, Asp-endopeptidasa N, quimotripsina, endopeptidasa de glutamilo, endopeptidasa de lisililo LysC, peptidilo LysN-metaloendopeptidasa Lys, proteinasa K y termolisina; y los sitios de disociación de ejemplo para estas enzimas se describen en la presente invención.
Además, las sustituciones, adiciones o eliminaciones pueden tener o pueden optimizar una característica de la secuencia de consenso o polipéptido, tal como carga (por ejemplo, carga positiva o negativa), hidrofilicidad, hidrofobicidad, estabilidad in vivo, biodisponibilidad, toxicidad, actividad inmunológica, identidad inmunológica y propiedades de conjugación. Por ejemplo, la carga positiva puede ser promovida eliminando uno o más aminoácidos (por ejemplo, de 1 a 3 aminoácidos) que no están cargados en forma básica/positiva (tal como se describe más adelante con base en las propiedades de la cadena lateral común) o cargada en forma menos positiva (por ejemplo, tal como se determina mediante pKa). En otro ejemplo, la carga positiva puede ser promovida insertando uno o más aminoácidos (por ejemplo, de 1 a 3 aminoácidos) que son cargados en forma básica/positiva o cargados en forma más positiva (por ejemplo, tal como se determina mediante pKa).
La estabilidad in vivo puede ser optimizada en cualquier forma útil. Por ejemplo, la estabilidad en la presencia de una o más enzimas de digestión se puede incrementar sustituyendo un L-aminoácido que ocurre naturalmente por su D-isómero. Las enzimas digestivas de ejemplo incluyen pepsina y tripsina. Utilizando la nomenclatura de su sitio para los sitios de disociación, S1-S1' indica el sitio de disociación para un péptido Sn---S4-S3-S2-S -S1 '-S2'-S3'-S4'---Sm. La disociación mediante pepsina ocurre generalmente cuando Phe, Tyr, Trp o Leu es están en la posición S1 o S1"; o cuando Pro está en la posición S3 o S4. La disociación mediante tripsina generalmente ocurre cuando Arg o Lys están en la posición S1; cuando Pro está en la posición S1\ Lys está en la posición S1, y Trp está en la posición S2; cuando Pro está en la posición ST, Arg está en la posición S1, y Met está en la posición S2; o cuando Pro está en la posición S1" y Glu está en la posición S2. Otros sitios de disociación de ejemplo incluyen los que son para disociación mediante Arg-proteinasa C (por ejemplo, Arg en la posición S1), Asp-endopeptidasa N (por ejemplo, Asp o Glu en la posición ST), quimotripsina (por ejemplo, Trp, Tyr o Phe en la posición S1 para disociación con alta especificidad; Leu, Met o His en la posición S1 para disociación con baja especificidad), endopeptidasa de glutamilo (por ejemplo, Glu en la posición S1), endopeptidasa de lisililo LysC (por ejemplo, Lys en la posición S1), peptidilo LysN-metaloendopeptidasa Lys (por ejemplo, Lys en la posición S1'), proteinasa K (por ejemplo, un residuo alifático o de aminoácido, tal como Ala, Glu, Phe, lie, Leu, Thr, Val, Trp, o Tyr, en la posición S1), y termolisina (por ejemplo, un residuo de aminoácido, tal como lie, Leu, Val, Ala, Met o Phe, en la posición S1").
Los modelos predictivos también están disponibles para determinar sitios de disociación, tal como PeptideCutter disponible en el servidor ExPASy. Los sitios de disociación de ejemplo para porciones de dirección se muestran en la figura 4, tal como C-terminal para las posiciones 1, 2, 3, 4, 14, 18 y 19 en Angiopep-2 (SEC ID NO:97) para disociación mediante pepsina y C-terminal para las posiciones 8, 10, 11 y 15 en Angiopep-2 (SEC ID NO:97) para disociación mediante tripsina. Otros sitios de disociación de ejemplo en Angiopep-2 (SEC ID NO:97) incluyen C-terminal para las posiciones 8 y 11 para disociación mediante Arg-proteinasa C; posiciones 16 y 17 para disociación mediante Asp-endopeptidasa N; posiciones 2, 3, 4, 14 y 19 para disociación mediante quimotripsina; posiciones 17 y 18 para disociación mediante endopeptidasa de glutamilo; posiciones 10 y 15 para disociación mediante endopeptidasa lisililo LysC; posiciones 9 y 14 para disociación mediante peptidilo LysN-Lys metaloendopeptidasa; posiciones 1, 2, 3, 4, 14, 16 y 19 para disociación mediante proteinasa K; y posiciones 1, 2 y 13 para disociación mediante termolisina. Por consiguiente, las porciones de dirección de la presente invención también incluyen polipéptidos más cortos que Angiopep-2 (An2) que tienen una o más sustituciones de D-aminoácido para una o más de las posiciones 1, 2, 3, 4, 8, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18 y 19 en Angiopep-2 (SEC ID NO: 97).
Las modificaciones sustanciales en función o la identidad inmunológica se logran seleccionando sustituciones, adiciones o eliminaciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura del esqueleto de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal; (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo; o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que ocurren naturalmente se dividen en grupos con base en propiedades de cadena lateral común; (1) hidrofóbico: norleucina, metionina (Met), Alanina (Ala), Valina (Val), Leucina (Leu), Isoleucina (He), Histidina (His), Triptofan (Trp), Tirosina (Tyr) y Fenilalanina (Phe); (2) hidrofílico neutral: Cisteína (Cys), Serina (Ser) y Treonina (Thr); (3) ácido/cargado en forma negativa: Ácido Aspártico (Asp) y Ácido Glutámico (Glu); (4) Básico: Asparagina (Asn), Glutamina (Gln), Histidina (His), Lisina (Lys) y Arginina (Arg); (5) residuos que influencian la orientación de la cadena: Glicina (Gly) y Prolina (Pro); (6) aromáticos: Triptofan (Trp), Tirosina (Tyr), Fenilalanina (Phe) e Histidina (His); (7) polar: Ser, Thr, Asn, Gln; (8) cargado en forma positiva básico: Arg, Lys, His; y (9) cargado: Asp, Glu, Arg, Lys, His.
Otras sustituciones de aminoácido se describen en la Tabla 1.
Tabla 1; Sustituciones de Aminoácido Generalmente, la porción de dirección incluye la secuencia de aminoácido Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys (fórmula la) y Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2 (fórmula Ib), tal como se describe anteriormente, y tiene opcionalmente una o más sustituciones para un D-isómero correspondiente, y es menor a 50 aminoácidos de longitud. Además, la porción de dirección un péptido en la Tabla 2.
Tabla 2 SEQ ID NO: 1 T F V Y G G C R A K R N N F S A E D 2 T F Q Y G G C M G N G N N F V T E E 3 P F F Y G G C G G N R N N F D T E E Y 4 s F Y Y G G C L G N N N Y L R E E E 5 T F F Y G G C R A K R N N F R A K Y 6 T F F Y G G C R G K R N N F K R A Y 7 T F F Y G G C R A K N N Y K R A Y 8 T F F Y G G C R G K K N N F K R A K Y 9 T F Q Y G G C R A K R N N F R A K Y 10 T F Q Y G G C R G K N N F R A Y 11 T F F Y G G C L G R N N F R A K Y 12 T F F Y G G S L G R N N F R A K Y 13 P F F Y G G c G G K N N F K R A Y 14 T F F Y G G c R G G N N Y K R A K Y 15 P F F Y G G c R G R N N F L R A K Y 16 T F F Y G G c R G K R N N F K R E K Y 17 P F F Y G G c R A K K N N F K R A E 18 T F F Y G G c R G R N N F K R A K D 19 T F F Y G G c R A R N N F D R A Y T F F Y G G C R G K N N F R A E Y ? F F Y G G C G A N R N N F R A K Y ? F F Y G G C G G K N N F T A Y ? F F Y G G C R G N R N N F L R A K Y ? F F Y G G C R G N R N N F T A K Y ? F F Y G G s R G N R N N F K T A K Y ? F F Y G G c L G N G N N F K R A Y t F F Y G G c L G N R N N F L R A K Y t F F Y G G c L G N R N N F K T A Y t F F Y G G c R G N G N N F K S A Y t F F Y G G c R G K N N F D R E Y t F F Y G G c R G R N N F L R E E t F F Y G G c R G G N N F D R A K Y t F F Y G G s R G G N N F D R A K Y t F F Y G G c R G N G N N F V T A K Y ? F F Y G G c G G G N N Y V T A Y t F F Y G G c L G G N N F L T A Y S F F Y G G c L G N N N F L T A Y t F F Y G G c G G N N N F V R E K Y t F F Y G G c M G N K N N F V R E Y t F F Y 0 G s M G N K N N F V R E Y ? F F Y G G c L G N R N N Y V R E Y t F F Y G G c L G N R N N F V R E K Y t F F Y G G c L G N K N N Y V R E K Y t F F Y G G c G G N G N N F L T A Y t F F Y G G c R G N R N N F L T A E Y t F F Y G G c R G N G N N F K S A E Y ? F F Y G G c L G N N N F T A E Y t F F Y G G c R G N R N N F T E E Y t F F Y G G c R G K R N N F K T E E D ? F F Y G G c G G N G N N F V R E Y S F F Y G G c M G N G N N F V R E Y ? F F Y G G c G G N G N N F L R E K Y t F F Y G G c L G N G N N F V R E K Y S F F Y G G c L G N G N N Y L R E Y t F F Y G G s L G N G N N F V R E Y t F F Y G G c R G N G N N F V T A E Y t F F Y G G c L G G N N F V S A E Y t F F Y G G c L G N R N N F D R A E Y t F F Y G G c L G N R N N F L R E E Y t F F Y G G c L G N K N N Y L R E E Y ? F F Y G G c G G N R N N Y L R E E Y ? F F Y a G s G G N R N N Y L R E E Y ? R ? D F C L E P P Y T G P C V A R I A R 1 1 R Y F Y N A A G L C Q T F V Y G G c R A K R N N Y K S A E D C M R ? D F c L E P P Y T G P C V A R I 1 R t F F Y G G c R G R N N F K T E E Y 68 K F F Y G G C R G K R N N F K T E E Y 69 T F Y Y G G C R G K R N N Y K T E E Y 70 T F F Y G G S R G R N N F K T E E Y 7! C T F F Y G C C R G K R N N F T E E Y 72 T F F Y G G C R G R N N F K T E E Y C 73 C T F F Y G S C R G K R N N F T E E Y 74 T F F Y G G S R G K R N N F T E E Y C 75 P F F Y G G C R G R N N F T E E Y 76 T F F Y G G C R G R N N F T E Y 77 T F F Y G G K R G K R N N F K T E E Y 78 T F F Y G G C R G K R N N F T K R Y 79 T F F Y G G K R G K R N N F K T A E Y 80 T F F Y G G K R G K R N N F K T . A G Y 81 T F F Y G G K R G K R N N F K R E K Y 82 T F F Y G G K R G K R N N F K R A K Y 83 T F F Y G G C L G N R N N F K T E E Y 84 T F F Y G C G R G K R N N F K T E E Y 85 T F F Y G G R C G K R N N F K T E E Y 86 T F F Y G G C L G N G N N F D T E E E 87 T F Q Y G G C R G K R N N F K T E E Y 88 Y N K E F G T F N T K G C E R G Y R F 89 R F K Y G G C L G N M N N F E T L E E 90 R F K Y G G C L G N K N N F L R L K Y 91 R F K Y G G C L G N K N N Y L R L K Y 92 K T R K R K K Q R V K I A Y E E I F K N Y 93 K T K R K R K K Q R V K I A Y 94 R G G R L S Y S R R F S T S T G R 95 R R L S Y S R R R F 96 R Q I K I W F Q N R R M K W K K 97 T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y 98 M R P D F C L E P P Y T G P C V A R I I R Y F Y N A K A G L C Q T F V Y G G C R A K R N N F K S A E D C M R T C G G A 99 T F F Y G G C R G K R N N F T K. E Y 100 R F K Y G G C L G N K N N Y L R L K Y 101 T F F Y G G C R A K R N N F K R A K Y 102 N A K A G L C Q T F V Y G G C L A K R N N F E S A E D C M R T C G G A 103 Y G G C R A K R N N F K S A E D C M R T C G G A 104 G L C Q T F V Y G G C R A K R N N F K S A E 105 L c Q T F V Y G G C E A K R M N F K S A 107 T F F Y G G S R G R N N F K T E E Y 108 R F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y 109 R F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y 110 R F F Y G G s R G R N N F R T E E Y 111 T F F Y G G s R G K R N N F R T E E Y 112 T F F Y G G s R G R R N N F R T E E Y 113 c T F F Y G G S R G R N N F K T E E Y 114 T F F Y G G s R G R N N F K T E E Y C 115 c T F F Y G G S R G R R N N F R T E E Y 116 T F F Y G G S R G R R N N F R T E E Y C Los polipéptidos Nos. 5, 67, 76 y 91, incluyen las secuencias de SEC ID NOS: 5, 67, 76 y 91, respectivamente, y se amidan en el C-término.
Los polipéptidos Nos.107, 109 y 110 incluyen las secuencias de SEC ID NOS: 97, 109 y 110, respectivamente, y se acetilan en el N-término.
Las porciones de dirección de la presente invención también incluyen polipéptidos más cortos que Angiopep-2 (An2) o 3D-An2, que tienen la secuencia de aminoácido: 97 T F F Y G G S R G R N N F K T E E Y (An2) T F F Y G G SD-R GD-KD-R 1M N F K T E E Y (3D-An2) En otras modalidades, las porciones de dirección son más cortas que An2-Cys que tiene la secuencia de aminoácido: 114 T F F Y G G S R G K R N N F K T E E Y C Las porciones de dirección de ejemplo incluyen: F Y G G S R G R N N F K T E E Y C (Pl) F Y G G S R G D-K D-R N N D-F K T E E Y C (Pía) F Y G G S R G D-K D-R N N D-F D-K T E E Y C (Plb) F Y G G S R G D-K D-R N N D-F D-K T E ED-Y C (Pie) D-F D-Y G G S D-R G D-K D-R N N D-F D-K T E D E D-Y C (Pld) G G S R G K R N N F K T E E Y C (P2) S R G K R N N F K T E E Y C (P3) G K R N N F K T E E Y C (P4) K R N N V K T E E Y C (P5) D-K D-R N N D-F K E E Y c (P5a) D-K D-R N N D-F D-K E E Y c (P5b) D-K D-R N N D-F D-K E ED-Y c (P5c) K R N N F K c (P6) D-K D-R N N D-F K c (P6a) D-K D-R N N D-F D-K c (P6b) D-K D-R N N D-F D-K D-Y c (P6c) Las porciones de dirección de la presente invención incluyen adiciones y eliminaciones de aminoácidos de las secuencias P1 , P1a, P1 b, P1c, P1d, P2, P3, P4, P5, P5a, P5b, P5c, P6, P6a, P6b y P6c. Las eliminaciones o adiciones pueden incluir cualquier parte de estas secuencias. En algunas modalidades, las eliminaciones o adiciones de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos pueden ser elaboradas a partir de estas secuencias de la porción objetivo. En modalidades particulares, las eliminaciones o adiciones pueden ser de 1 a 3 aminoácidos.
La presente invención también presenta fragmentos de estas porciones de dirección (por ejemplo, un fragmento funcional). En ciertas modalidades, los fragmentos tienen la capacidad de ser transportados de manera eficiente a, o acumularse en un tipo de célula en particular (por ejemplo, hígado, ojo, pulmón, riñon, bazo, músculo o ovario) o transportarse de manera eficiente a través de la BBB. Los truncados del polipéptido pueden ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o más aminoácidos ya sea desde el N-término del polipéptido, el C-término del polipéptido, o una combinación de los mismos. Otros fragmentos incluyen secuencias en donde se eliminan las porciones internas del polipéptido. Las eliminaciones del polipéptido pueden ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o más aminoácidos desde la porción interna de la porción de dirección. En algunas modalidades, las eliminaciones pueden ser de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos desde la secuencia de consenso de la porción de dirección.
Identificaciones de porciones de dirección Las porciones de dirección adicionales pueden ser identificadas utilizando uno de los ensayos o métodos aquí descritos. Por ejemplo, se puede producir un polipéptido candidato a través de síntesis de péptido convencional, conjugado con paclitaxel y administrado a un animal de laboratorio. Se puede identificar un conjugado biológicamente activo, por ejemplo, con base en su capacidad de incrementar la supervivencia de un animal inyectado con células de tumor y tratado con el conjugado, en comparación con un control el cual no ha sido tratado con un conjugado (por ejemplo, tratado con el agente no conjugado). Por ejemplo, se puede identificar un polipéptido biológicamente activo con base en su ubicación en la parénquima en un ensayo de perfusión cerebral in situ.
También se pueden llevar a cabo ensayos para determinar la acumulación en otros tejidos. Los conjugados etiquetados de un polipéptido se pueden administrar a un animal, y se puede medir la acumulación en diferentes órganos. Por ejemplo, un polipéptido candidato conjugado para una etiqueta detectable (por ejemplo, una etiqueta de espectroscopia de fluorescencia casi-IR, tal como Cy5.5) permite la visualización viva in vivo. Dicho polipéptido puede ser administrado a un animal, y se puede detectar la presencia de polipéptido en un órgano, permitiendo de esta forma la determinación del rango y cantidad de acumulación del polipéptido en el órgano deseado. En otras modalidades, el polipéptido puede ser etiquetado con un isótopo radioactivo (por ejemplo, l25l). El polipéptido posteriormente se administra a un animal. Después de un período de tiempo, el animal es sacrificado y los órganos son extraídos. La cantidad de radioisótopo en cada órgano posteriormente se puede medir utilizando cualquier medio conocido en la técnica. Al comparar la cantidad de polipéptido candidato etiquetado en un órgano particular relativa a la cantidad de polipéptido de control etiquetado, se puede confirmar la capacidad del polipéptido candidato de accesar y acumularse en un tejido particular. Los controles negativos adecuados incluyen cualquier péptído o polipéptido conocido pero no transportado de manera eficiente en un tipo de célula en particular (por ejemplo, un péptido relacionado con Angiopep que no cruza la BBB, o cualquier otro péptido).
Conjugados La porción de dirección puede ser enlazada a un agente terapéutico o vector de transporte para formar un conjugado. En un conjugado, la porción de dirección se une mediante enlace químico ya sea directamente (por ejemplo, un enlace covalente tal como un enlace de disulfuro o péptido) o indirectamente (por ejemplo, a través de un enlazador tal como los aquí descritos). En un conjugado que tiene un vector de transporte, un agente terapéutico puede ser liberado después del transporte a través de la BBB, por ejemplo, mediante disociación enzimática o rompimiento del enlace químico entre el vector de transporte y el agente. El agente liberado posteriormente puede funcionar en su capacidad proyectada en la ausencia del vector. Los enlazadores de ejemplo, agentes terapéuticos y vectores de transporte se describen a continuación enlazadores, agentes terapéuticos y vectores de transporte de ejemplo.
Polipéptidos terapéuticos Cuando el conjugado incluye un agente peptídico terapéutico enlazado a la porción de dirección a través de un enlace de péptido o un enlazador de aminoácido o péptido, el conjugado resultante es un polipéptido terapéutico (por ejemplo, una proteína de fusión). En modalidades en donde el agente es un agente peptídico terapéutico, el agente puede ser enlazado al polipéptido a través de un enlace covalente. El enlace covalente puede ser un enlace de péptido (por ejemplo, producido en forma sintética o recombinante como una proteina de fusión). Los agentes peptídicos terapéuticos de ejemplo se describen a continuación.
Unión de la porción de dirección a un vector de transporte Para formar un conjugado que incluye un vector de transporte, se pueden utilizar al menos dos métodos generales. En un primer método, se forma un vector de transporte que contiene el agente (por ejemplo, cualquiera aquí descrito). Posteriormente, se conjuga una porción de dirección aquí descrita al vector de transporte. En un segundo método, la conjugación de la porción de dirección a una molécula que forma el vector de transporte (por ejemplo, cualquiera aquí descrita) se lleva a cabo primero, y posteriormente se forma de manera subsecuente el vector de transporte utilizando la molécula conjugada. En cualquier método, la porción de dirección puede ser conjugada a través de una molécula de anclaje.
Se puede formar en un proceso por pasos un conjugado que incluye un vector de transporte. Por ejemplo, la molécula del vector de transporte se adhiere primero al enlazador y se forman vectores de transporte que contienen la molécula de vector de transporte. Posteriormente, se incuba el vector de trasporte con la porción de dirección para formar un enlace covalente con el enlazador. En un ejemplo en particular, se adhiere una molécula de lípido al enlazador, y se utiliza el compuesto resultante para formar liposomas. Posteriormente, los liposomas se incuban con una solución que contiene una porción de dirección para adherir la porción objetivo al extremo distal del enlazador.
En otro ejemplo, el vector de transporte se enlaza en forma covalente a un enlazador con un grupo activado, la porción de dirección se enlaza en forma covalente a un segundo enlazador, y posteriormente el vector de transporte modificado y la porción de dirección modificada se hacen reaccionar juntos para formar un enlace covalente entre un primer enlazador y un segundo enlazador. Por ejemplo, el grupo amino del vector de transporte forma un enlace covalente, desplazando el grupo N-hidroxisuccinimidilo del enlazador de 4-formilbenzoato de succinimidilo. Este vector de transporte modificado tiene un grupo carbonilo terminal en el enlazador. Posteriormente el grupo amino de la porción de dirección forma un enlace covalente, desplazando el grupo N-hidroxisuccinimidilo del enlazador de hidrazona de acetona de 4-hidrazinonicotinato de succinimidilo. Esta porción de dirección modificada tiene un grupo hidrazina terminal en el enlazador. Finalmente, el vector de transporte modificado y la porción de dirección modificada se combinan para formar un enlace covalente entre el grupo de hidrazina de la porción de dirección modificada y el grupo carbonilo terminal del vector de trasporte.
En otro ejemplo, se utiliza polioxietileno-(p-carbonato de nitrofenilo)-fosfoetanolamina en la formación de micelas lípidas que contienen moléculas siARN. En síntesis, en este ejemplo, se conjuga polioxietileno-bis (p-carbonato de nitrofenilo) ((pNP)2-PEG) para un lípido con la capacidad de formar liposomas o micelas tales como 1 ,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamína (DPPE), dando como resultado la producción de pNP-PEG-PE. Esta molécula posteriormente, a su vez, se puede conjugar a una porción de dirección (por ejemplo, cualquiera aquí descrita) para formar un conjugado péptido-PEG-PE. Este conjugado posteriormente se utilizar en la formación de liposomas que contienen porciones PEG que sirven como anclas para enlazar las moléculas de polipéptido en la cara externa del liposoma. Ver por ejemplo la Publicación de Zhang et al., J. Control. Reléase 112:229-239 (2006).
También se puede lograr la producción de vectores lípidos conjugando una porción objetivo para un liposoma después de su formación. En un ejemplo de este procedimiento, se proporciona una mezcla de lípidos adecuados para encapsular una molécula y que tiene suficiente estabilidad in vivo, en donde algunos de los lípidos se adhieren a una ancla (tal como PEG) que contiene un enlazador (por ejemplo, cualquier enlazador aquí descrito). La mezcla se seca, se reconstituye en solución acuosa con el polinucleótido deseado, y se somete a condiciones con la capacidad de formar liposomas (por ejemplo, exposición a ultrasonido o extrusión). Posteriormente se conjuga una porción de dirección aquí descrita a un enlazador en el ancla. En un ejemplo particular de este método, se proporciona la mezcla de 1 -palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina al 93% (POPC), bromuro de didodecildimetilamonio al 3% (DDAB), distearoilfosfatidiletanolamina al 3% (DSPE)-PEG2000 y DSPE-PEG2000-maleimida al 1%. Posteriormente la mezcla se prepara en cloroformo, se evapora bajo nitrógeno y posteriormente se disuelve en amortiguador Tris al cual se le agrega el polinucleótido deseado. Posteriormente la mezcla se pasa a través de una serie de filtros de policarbonato de tamaño de poro reducido 400 nm a 50 nm para generar liposomas de 80 a 100 nm. Los liposomas se mezclan con una nucleasa o proteasa para eliminar los agentes terapéuticos no encapsulados. Si el agente terapéutico es una molécula de ADN, entonces se puede utilizar endonucleasa I y exonucleasa III de ADN. El vector de transporte aquí descrito posteriormente se puede conjugar para el DSPE-PEG200 que contiene el enlazador (por ejemplo, maleimida o cualquier enlazador de la presente invención). Estos vectores de lípidos que contienen un agente terapéutico y se conjugan a una porción de dirección aquí descrita, pueden ser administrados posteriormente a un sujeto para suministrar el agente terapéutico a través de la BBB o a tejidos específicos. En las publicaciones de Boado, Pharm. Res. 24:1772-1787 (2007); Pardridge, Pharm. Res. 24: 1733-1744 (2007); y Zhang et al., Clin. Canc. Res. 10:3667-3677, 2004 se describen ejemplos adicionales de este método.
Como alternativa, se forma el conjugado sin el uso de un enlazador. Más bien, se utiliza un agente de acoplamiento de longitud cero para activar los grupos funcionales dentro del vector de transporte o la porción de dirección sin introducir átomos adicionales. Los ejemplos de agentes de acoplamiento de longitud cero incluyen diciclohexilcarbodiimida y etilcloroformato.
Enlazadores Se puede enlazar la porción de dirección a un agente terapéutico o un vector de transporte ya sea directamente (por ejemplo, a través de un enlace covalente tal como un enlace de péptido) o se puede enlazar a través de un enlazador. Los enlazadores incluyen agentes de enlace químico (por ejemplo, enlazadores disociables) y péptidos. Cualquiera de los enlazadores descritos más adelante, pueden ser utilizados en los compuestos de la presente invención.
Agentes de enlace químico En algunas modalidades, el enlazador es un agente de enlace químico. La porción de dirección se puede conjugar a través de grupos sulfhidrilo, grupos amino (aminas), o cualquier grupo reactivo adecuado. Los reticuladores homomultifuncionales y heteromultifuncionales (agentes de conjugación, incluyendo agentes bifuncionales y trifuncionales) están disponibles en muchas fuentes comerciales. Se pueden encontrar sitios disponibles para reticulación en las porciones de dirección y agentes terapéuticos o vectores de transporte aquí descritos. El reticulador puede comprender un brazo flexible, por ejemplo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 átomos de carbono. El brazo flexible puede ser el espaciador de polietilenglicol , tal como (PEG)-, en donde n es un entero entre 1 y 20, o un aminoácido, tal como -NH-(CH2)n-C(0)0-, en donde n es un entero entre 2 y 10 (por ejemplo, cuando n es 5).
Los reticuladores de ejemplo incluyen BS3 ([Bis(sulfosuccinimidil)suberato]; BS3 es un éster de N-hidroxisuccinimida homobifuncional que dirige aminas primarias accesibles), NHS/EDC (N-hidroxisuccinimida y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida¡ NHS/EDC permite la conjugación de grupos amina primarios con grupos carboxilo), sulfo-EMCS ([ácido ?-e-maleimidocaproicojhidrazida; sulfo-EMCS son grupos reactivos heterobifuncionales (maleimida y NHS-éster) que son reactivos hacia grupos sulfhidrilo y amino), hidrazida (la mayor parte de las proteínas contienen carbohidratos expuestos y la hidrazida es un reactivo útil para enlazar grupos carboxilo a aminas primarias), SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato; SATA es reactivo hacia aminas y agrega grupos sulfhidrilo protegido) y BMOE (bis-maleimidoetano).
Para formar enlaces covalentes, se puede utilizar un grupo químicamente reactivo, existe una amplia variedad de grupos carboxilo activo (por ejemplo, ésteres) en donde la porción hidroxilo es fisiológicamente aceptable en los niveles requeridos para modificar el péptido. Los agentes particulares incluyen N-hidroxisuccinimida (NHS), N-hidroxi-sulfosuccinimida (sulfo-NHS), maleimida-benzoil-succinimida (MBS), éster de succinimida de gamma-maleimido-butiriloxi (GMBS), ácido propiónico de maleimido (MPA), ácido hexanoico de maleimido (MHA), y ácido undecanoico de maleimido (MUA).
Las aminas primarias son los objetivos principales para ésteres NHS. Los grupos a-amina accesibles presentes en el N-término de proteínas y la e-amina de lisina reaccionan con ésteres NHS. Por lo tanto, los compuestos de la presente invención pueden incluir un enlazador que tiene un éster NHS conjugado para un amino N-terminal de un péptido o para una e-amina de lisina. Se forma un enlace de amida cuando la reacción de conjugación de éster NH reacciona con aminas primarias que liberan N-hidroxisuccinimida. Estos grupos reactivos que contienen succinimida son referidos en la presente invención como grupos succinimidilo. En ciertas modalidades de la presente invención, el grupo funcional en la proteína será un grupo tiol y el grupo químicamente reactivo será un grupo que contiene maleimido tal como gamma-maleimida-butirilamida (GMBA o MPA). Dichos grupos que contienen maleimida son referidos en la presente invención como grupos maleido.
El grupo maleimido es el más selectivo para grupos sulfidrilo en péptidos cuando el pH de la mezcla de reacción es de 6.5 a 7.4. En pH 7.0, el rango de reacción de los grupos maleimido con sulfidrilos (por ejemplo, grupos tiol en proteínas tales como albúmina de suero) es 1000 veces más rápido que con aminas. Por lo tanto, se puede formar una ligadura de tioéter estable entre el grupo maleimido y el sulfidrilo. Por consiguiente, un compuesto de la presente invención puede incluir un enlazador que tiene un grupo maleimido conjugado para un grupo sulfidrilo de una porción de dirección o de un agente.
Los enlazadores de amina-a-amína incluyen ésteres NHS e imidoésteres. Los ésteres NHS de ejemplo son DSG (glutarato de disuccinimidilo), DSS (suberato de disuccinimidilo), BS3 (bis[sulfosuccinimidil] suberato), TSAT (aminotriacetato de tris-succinimidilo), variantes de compuestos activados con éster de bis-succinimida que incluyen un espaciador de polietilenglicol, tal como BS(PEG)n, en donde n es 1 a 20 (por ejemplo, BS(PEG)5 y BS(PEG)9), DSP (propionato de D¡t¡obis[succinimid¡lo]), DTSSP (3,3'-ditiobis[sulfosuccinimidilpropionato]), DST (tartarato de disuccinimidilo), BSOCOES (bis[2- (succ¡nimidoox¡carboniloxi)etil]sulfona), EGS (bis[succinimidilsuccinato] de eti I e ng I icol) , y sulfo-EGS (b¡s[sulfosucc¡n¡midilsuccinato] de etilenglicol). Los imidoésteres incluyen DMA (adipimidato de dimetilo'2 HCI), DMP (pimelimidato de dimetilo»2 HCI), DMS (suberim'idato de dimetilo'2 HCI), y DTBP (3, 3'-ditiobispropionimidato de dimetilo*2 HCI). Otros enlazadores de amina-a-amina incluyen DFDNB (1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno) y THPP (P-[tris(hidroximetil) fosfino] ácido propiónico (betaína)).
El enlazador puede ser un enlazador de sulfh idrilo-a-sulfhidrilo. Los enlazadores incluyen maleimidas y piridilditioles. Las maleimidas de ejemplo incluyen BMOE (bis-maleimidoetano), BMB ( 1 ,4-bismaleimidobutano), BMH (bismaleimidohexano), TMEA (ír/s[2-maleimidoetil]amina), BM(PEG)2 1 ,8-bis-maleimidodietileneglicol) o BM(PEG)n, en donde n es 1 a 20 (por ejemplo, 2 o 3), BMDB (1,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano), y DTME (ditio-bismaleimidoetano). Los piridilditioles de ejemplo incluyen DPDPB (1 ,4-di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido]butano). Otros enlazadores sulfhidrilo incluyen HBVS ( 1 ,6-hexano-bis-vinilsulfona).
El enlazador puede ser un enlazador de amina-a-sulfidrilo, el cual incluye compuestos de éster/maleimida NHS. Dichos enlazadores de amina-a-sulfidrilo pueden incluir enlazadores de éster (por ejemplo, cualquier enlazador aquí descrito que contiene un grupo éster). Los ejemplos de estos compuestos son AMAS (éster de N-(a-maleimidoacetoxi)succinimida), BMPS (éster de N-[ -maleimidopropiloxi]succinimida), GMBS (éster de N-[Y-maleimidobutiriloxi]succinimida), sulfo-GMBS (éster de N-[?-maleimidobutiriloxijsulfosuccinimida), MBS (éster de m-maleimidobenzoil-A-hidroxisuccinimida), sulfo-MBS (éster de m-maleimidobenzoil-A/-hidroxisulfosuccinimida), SMCC (4-[/V-maleimidometil]ciclohexano-1 -carboxilato de succinimidilo), sulfo-SMCC (4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1 -carboxilato de sulfosuccinimidilo), EMCS (éster de [?-e-maleímidocaproiloxijsuccinimida), Sulfo-EMCS (éster de [?-e-maleimidocaproiloxijsulfosuccinimida), SMPB (4-[p-maleimidofeniljbutirato de succinimidilo), sulfo-SMPB (4-[p-maleimidofeniljbutirato de sulfosuccinimidilo), SMPH (succinimidil-6-[ -maleimidopropionamido]hexanoato), LC-SMCC (succinimidil-4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxi-[6-amidocaproatopilon]), sulfo-KMUS (éster de ?-[?-maleimidoundecanoiloxijsulfosuccinimida), SM(PEG)n (éster de succinimidil-([/\/-maleimidopropionamido-polietileneglicol)), en donde n es 1 a 30 (por ejemplo, 2, 4, 6, 8, 12, o 24), SPDP (3-(2-piridilditio)-propionato de A-succinimidilo), LC-SPDP (6-(3-[2-piridilditio]-propionamido)hexanoato de succinimidilo), sulfo- LC-SPDP (6-(3'-[2-piridilditio]-propionamido)hexanoato de sulfosuccinimidilo), SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-[2-piridilditio]tolueno), Sulfo-LC-SMPT (4-sulfosuccinimidil-6-[a-metil-a-(2-piridilditio)toluamido]hexanoato), SIA (yodoacetato de /V-succinimidilo), SBAP (3-[bromoacetamido]propionato de succinimidilo), SIAB (A/-succinimidil[4-yodoacetil]aminobenzoato), y sulfo-SIAB (N-sulfosuccinimidil[4-yodoacetil]aminobenzoato).
En modalidades particulares, el enlazador tiene la fórmula: en donde n es un entero entre 2 y 15 (por ejemplo, n es 3, 6, o 11); y cualquier Y es un tiol en A y Z es una amina primaria en B o Y es un tiol en B y Z es una amina primaria en A.
En otras modalidades, el enlazador es un enlazador amino a no selectivo. Los ejemplos de dichos enlazadores incluyen enlazadores de éster/azida de arilo NHS y éster/diazirina de NHS. Los enlazadores de éster/azida de arilo NHS incluyen NHS-ASA (ácido A/-hidroxisuccinimidil-4-azidosalicílico), ANB-NOS (A-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida), sulfo-HSAB (N-hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato), sulfo-NHS-LC-ASA ([4-azidosalicilamido]hexanoato de sulfosuccinimidilo), SANPAH (A/-succinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato), sulfo- SANPAH (N-sulfosuccinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofertilamino)hexanoato), sulfo-SFAD (sulfosuccinim idil-(perfluoroazidobenzamido)-etil-1,3'-ditioproprionato), sulfo-SAND (sulfosuccinimidil-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-etil-1,3'-proprionato), y sulfo-SAED (2-[7-amino-4-metilcoumarin-3-acetamido]etil-1 ,3'ditiopropionato de sulfosuccinimidilo). Los enlazadores de éster/diazirina NHS incluyen SDA (4,4'-azipentanoato de succinimidilo), LC-SDA (6-(4,4'-azipentanamido)hexanoato de succinimidilo), SDAD (2-([4,4'-azipentanamido]etil)-1 ,3'-ditioproprionato de succinimidilo), sulfo-SDA (4,4'-azipentanoato de sulfosuccinimidilo), sulfo-LC-SDA (6-(4,4'-azipentanamido)hexanoato de sulfosuccinimidilo), y sulfo-SDAD (2-([4,4'-azipentanamido]etil)-1,3'-ditioproprionato de sulfosuccinimidilo).
Los enlazadores de amina-a-carboxilo de ejemplo incluyen compuestos de carbodiimida (por ejemplo, DCC (N,N-diciclohexilcarbodimida) y EDC ( -etil-3-[3-dimetilaminopropiljcarbo-diimida)). Los enlazadores de sulfihidrilo-a-compuestos no selectivos de ejemplo incluyen compuestos de piridilditiol/azida de arilo (por ejemplo, APDP ((A/-[4-(p-azidosalicilamido)butil]-3'-(2'-piridilditio)propion-amida)). Los enlazadores de sulfhidrilo-a-carbohidrato de ejemplo incluyen compuestos de maleimida/hidrazida (por ejemplo, BMPH (N-[ácido ß-maleimidopropiónicojhidrazida), EMCH ([ácido A/-e-maleimidocaproico]hidrazida), MPBH 4-(4-N- male¡midofenil)hidraz¡da de ácido butírico), y compuestos de KMUH (A/-[ácido K-maleimidoundecanoico]hidrazida)) y piridilditiol/hidrazida (por ejemplo, PDPH (3-(2-piridilditio)hidrazida de propionilo)). Los enlazadores de carbohidrato-a-no selectivos de ejemplo incluyen compuestos de hidrazida/azida de arilo (por ejemplo, ABH (hidrazida de p-azidobenzoilo)). Los enlazadores de hidroxilo-a-sulfhidrilo de ejemplo incluyen compuestos isocianato/maleimida (por ejemplo, (A/-[p-maleimidofenil]isocianato)). Los enlazadores de amina-a-ADN de ejemplo incluyen compuestos de éster/psoralen NHS (por ejemplo, SPB (succinimidilo-[4-(psoralen-8-iloxi)]-butirato)).
También se describen enlazadores en la Patente Norteamericana No. 4,680,338 que tienen la fórmula Y=C=N-Q-A-C(0)-Z, en donde Q es un sistema de anillo homoaromático o heteroaromático; A es un enlace simple o un grupo de puenteo Ci-30 divalente no sustituido o sustituido, Y es O o S; y Z es Cl, Br, I, N3, N-succinimidiloxi, imidazolilo, 1 -benzotriazoliloxi , OAr en donde Ar es un grupo arilo con activación deficiente de electrón o OC(0)R en donde R es -A-Q-N = C = Y o alquilo terciario C4-2o- Los enlazadores también se describen en la Patente Norteamericana No.5, 306, 809, la cual describe enlazadores que tienen la fórmula en donde R1 es H, Ci.6 alquilo, C2- 6 alquenilo, C6-12 arilo o aralquilo o éstos acoplados con un -O- -S- orgánico divalente o en donde R' es Ci_6 alquilo, porción de enlace; R2 es H, C1.12 alquilo, C6-12 arilo o C6-12 aralquilo, R3 es estructura química que tiene la capacidad de trasladar solo los electrones en par del nitrógeno adyacente y R4 es un grupo reactivo pendiente con la capacidad de enlazar R3 a una porción objetivo o a un agente.
El enlazador puede ser polivalente o monovalente. Un enlazador monovalente tiene únicamente un grupo activado disponible para formar un enlace covalente. Sin embargo, el enlazador monovalente puede incluir uno o más grupos funcionales que pueden ser modificados químicamente utilizando un agente de acoplamiento, tal como aquí se describe, para formar un segundo grupo activado. Por ejemplo, se puede activar un grupo hidroxilo terminal del enlazador a través de cualquier número de agentes de acoplamiento. Los ejemplos de agente de acoplamiento incluyen N-hidroxisuccinimida, etilcloroformato, diciclohexilcarbodiimida, y cloruro de trifluorometanosulfonilo. Ver por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,395,619 y 6,316,024.
Un enlazador polivalente (por ejemplo, un enlazador multifuncional) tiene dos o más grupos activados. Los grupos activados en el enlazador pueden ser los mismos, como en un enlazador homopolivalente, o diferente, como un enlazador heteropolivalente. Los enlazadores heteropolivalentes permiten la conjugación de un polipéptido y un vector de transporte con diferentes grupos funcionales. Los ejemplos de enlazadores heteropolivalentes incluyen polioxietileno-bis(carbonato de p-nitrofenilo), mal-PEG-DSPE, diisocianato, hidrazona de acetona de 4-hidrazinonicotinato de succinimidilo.
Los ejemplos de enlazadores homopolivalentes con dos grupos activados incluyen glutarato de disuccinimidilo, suberato de disuccinimidilo, suberato de bis(sulfosuccinimidil), bis(NHS)PEG5, bi s(N H S )PEG9, ditiobis(propionato de succinimidilo), 3,3'-ditiobis(sulfosuccinimidilpropionato), tartrato de disuccinimidilo, bis[2-(succinimido oxicarboniloxi)etil]sulfona, bis[succinimidilsuccinato] de etilenglicol), bis[sulfosuccinimidilsuccinato] de etilenglicol), adipimidato de dimetilo, pimelimidato de dimetilo, suberimidato de dimetilo, 3,3'-ditiobispropionimidato de dimetilo, 1 , 5-difluoro-2,4-dinitrobenceno, bis-maleimidoetano, 1,4-bismaleimidobutano, bismaleimidohexano, 1,8-bis-maleimidodietileneglicol, 1,11-bis-maleimido-trietileneglicol, 1l4-d¡-[3'-(2'-piridildit¡o)-prop¡onamido]butano, 1,6-hexano-bis-vinilsulfona, y bis-[b-(4-azidosalicilamido)etil]disulfuro.
Los ejemplos de enlazadores homopolivalentes con tres grupos activados incluyen aminotriacetato de tris-succinimidilo, -[tris(hidroximetil) fosfino] ácido propiónico, y tris[2-maleimidoetil]amina.
Los ejemplos de enlazadores heteropolivalentes incluyen lo que tienen un grupo activado de maleimida y un grupo activado de succinimida, tal como éster de N-[a-maleimidoacetoxijsuccinimida, éster de ?-[ß-maleimidopropiloxij-succinimida, éster de ?-[?-maleimidobutiriloxijsuccinimida, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, 4-[N-maleimidometiljciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, éster de ?-[e-maleimidocaproiloxijsuccinimida, y 4-[p-maleimidofenil]butirato de succinimidilo, incluyendo derivados de /V-sulfosuccinimidilo; los que tienen una molécula espaciadora PEG, tal como succinimidil-([N-maleimidopropionamido]-(etileneglicol)x)éster, en donde x es de 2 a 24; los que tienen un grupo activado piridilditio y un grupo activado succinimida, tal como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato, 6-(3-[2-piridilditio]-propionamido)hexanoato de succinimidilo, 4-succinimidiloxicarbonil-metil-a-[2-piridilditio]tolueno, y 4-sulfosuccinimidil-6-metil-a-(2-p¡ridilditio)toluamido]hexanoato); los que tienen un grupo activado haloacetilo y un grupo activado succinimida, tal como yodoacetato de N-succinimidilo y N-succinimid¡l[4-yodoacetil]am¡nobenzoato; los que tienen un grupo activado azida arilo y grupo activado succinimida, tal como ácido N-hidroxisuccinimidil-4-azidosalicílico, sulfosuccinimidil[4-azidosalicilamidoj-hexanoato, y N-succinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato; los que tienen un' grupo activado diazirina y un grupo activado succinimida, tal como 4,4'-azipentanoaton de succinimidilo y 6-(4,4'-az¡pentanamido)hexanoato de succinimidilo; N-[4-(p-azidosalicilamido)butil]-3'-(2'-piridilditio)propionamida; N-[ácido ß-maleimidopropiónicojhidrazida; N-(ácido e-maleimidocaproico) hidrazida; clorhidrato de hidrazida de ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico; (N-[ácido ?-maleimidoundecanoico]hidrazida); hidrazida de 3-(2-piridilditio)propionilo; hidrazida de p-azidobenzoilo; y N-[p-maleimidofenil] isocianato.
En otras modalidades, el enlazador es un agente de enlace trifuncional, tetrafuncional o mayor. Los enlazadores trifuncionales de ejemplo incluyen TMEA, THPP, TSAT, LC-TSAT ((6-aminocaproil)aminotriacetato de rr/s-succinimidilo), ír/s-succinimidil-1 ,3,5-bencenotri-carboxilato, MDSI (isoftalato de maleimido-3,5-disuccinimidilo), SDMB benzoato de (succinimidil-3,5-dimaleimidofenilo), Mal-4 (tetrakis-(3-maleimidopropil)pentaeritritol, NHS-4 {tetrakis(N-succinimidilcarboxipropil)pentaeritritol)).
TMEA tiene la estructura: TMEA, a través de sus grupos maleimida, pueden reaccionar con grupos sulfhidrilo (por ejemplo, a través de cadenas laterales de aminoácido de cisteína).
THPP tiene la estructura: Los grupos hidroxilo y el grupo carboxi de THPP pueden reaccionar con aminas primarias o secundarias.
Enlazadores de aminoácido y péptido En otras modalidades, el enlazador incluye al menos un aminoácido (por ejemplo, un péptido de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20, 25, 40, o 50 aminoácidos). En ciertas modalidades, el enlazador es un aminoácido simple (por ejemplo, cualquier aminoácido que ocurre naturalmente, tal como Cys). En otras modalidades, se utiliza un péptido con alto contenido de glicina tal como un péptido que tiene la secuencia [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n en donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, tal como se describe en la Patente Norteamericana No.7, 271 ,149. En otras modalidades, se utiliza un enlazador de péptido con alto contenido de serina, tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,525,491. Los enlazadores de péptido con alto contenido de serina incluyen los de la fórmula [X-X-X-X-Gly]y, en donde dos de los X son Thr, y los restantes X son Ser, y y es 1 a 5 (por ejemplo, Ser-Ser-Ser-Ser-Gly, en donde y es mayor a 1). En algunos casos, el enlazador es un aminoácido simple (por ejemplo, cualquier aminoácido, tal como Gly o Cys).
Los enlazadores de aminoácido pueden ser seleccionados para flexibilidad (por ejemplo, flexible o rígido) o se pueden seleccionar sobre las bases de carga (por ejemplo, positiva, negativa, o neutral). Los enlazadores flexibles normalmente incluyen los que tienen residuos Gly (por ejemplo, [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n en donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6).
Otros enlazadores incluyen otros enlazadores rígidos (por ejemplo, PAPAP y (PT)nP, en donde n es 2, 3, 4, 5, 6, o 7) y enlazadores a-helicoidales (por ejemplo, A(EAAA )nA, en donde n es 1 , 2, 3, 4, o 5).
Los ejemplos de enlazadores adecuados son ácido succínico. Lys, Glu, y Asp, o un dipéptido tal como Gly-Lys. Cuando el enlazador es ácido succínico, un grupo carboxilo del mismo puede formar un enlace de amida con un grupo amino del residuo de aminoácido, y el otro grupo carboxilo del mismo, por ejemplo, puede formar un enlace de amida con un grupo amino del péptido o sustituyente . Cuando el enlazador es Lys, Glu, o Asp, el grupo carboxilo del mismo, puede formar un enlace de amida con un grupo amino del residuo del aminoácido, y el grupo amino del mismo, por ejemplo, puede formar un enlace de amida con un grupo carboxilo del sustituyente. Cuando se utiliza Lys como el enlazador, se puede insertar un enlazador adicional entre el grupo e-amino de Lys y el sustituyente. En una modalidad particular, el enlazador adicional es ácido succínico, el cual puede formar una amida con el grupo e-amino de Lys y con un grupo amino presente en el sustituyente. En una modalidad, el enlazador adicional es Glu o Asp (por ejemplo, que forma un enlace amida con el grupo e-amino de Lys y otro enlace amida con un grupo carboxilo presente en el sustituyente), esto es, el sustituyente es un residuo de lisina acilado-N^ En otras modalidades, el enlazador de péptido es un polipéptido ramificado. Los enlazadores de péptido ramificado de ejemplo se describen en la Patente Norteamericana No. 6,759,509. Los enlazadores incluyen los de la fórmula: en donde A es un aceptor t i o I ; W es una porción de puenteo; c es un entero de 0 a 1; a es un entero de 2 a 12; Q es O, NH, o alquilo inferior-N; p es un entero de 0 o 1 ; d es un entero de 0 o 1; E es un átomo polivalente; cada b es un entero de 1 a 10; cada X es de la fórmula: — CO— Y— Zm— Gn en donde Y es dos residuos de aminoácido en la forma L; Z es uno o dos residuos de aminoácido; m es un entero de 0 o 1; G es un espaciador auto-inmolador; y n es un entero de 0 o 1; siempre y cuando n es 0 entonces— Y— Zm es Ala-Leu-Ala-Leu o Gly-Phe-Leu-Gly; o cada X es de la fórmula: en donde cada X1 es de la fórmula— CO— Y— Zm— Gn; y en donde Y, Z, Q, E, G, m, d, p, a, b, y n son tal como se definió anteriormente; o cada X1 es de la fórmula: en donde cada X2 es de la fórmula— CO— Y— Zm— Gn; y en donde Y, Z, G, Q, E, m, d, p, a, b, y n son tal como se definió anteriormente; o cada X es de la fórmula; en donde cada X3 es de la fórmula— CO— Y— Zm— Gn; y en donde Y, Z, G, Q, E, m, d, p, a, b, y n son tal como se definió anteriormente; o cada X3 es de la fórmula: en donde cada X4 es de la fórmula— CO— Y— Zm— G„; y en donde Y, Z, G, Q, E, m, d, p, a, b, y n son tal como se definió anteriormente.
El enlazador ramificado puede emplear una porción espaciadora autoinmoladora intermedia (G), la cual enlaza covalentemente junto el agente o vector de péptido y el enlazador de péptido ramificado. Un espaciador auto-inmolador puede ser una porción química bifuncional con la capacidad de enlazar covalentemente juntas dos porciones químicas, y liberar una de las porciones químicas separadas de la molécula tripartita por medio de disociación enzimática (por ejemplo, cualquier enlazador adecuado aquí descrito). En ciertas modalidades, G es una porción espaciadora auto-inmoladora que separa y enlaza covalentemente juntos el agente o vector de péptido y el enlazador de péptido, en donde el espaciador es enlazado al vector de péptido o agente a través de la porción T (tal como se utiliza en las siguientes fórmulas "T" representa un átomo nucleofílico el cual ya está contenido en el agente o vector de péptido), y el cual puede ser representado mediante en donde T es O, N o S; — HN— R1— COT, en donde T es 0, N o S, y R es 0 .5 alquilo; en donde T es O, N, o S, y R2 es en donde T es O, N o S; o en donde T es O, N, o S. Los Gs preferidos incluyen PABC (p-aminobencil-carbamoil), GABA (ácido ?-aminobutírico), a,a-dimetilo GABA, y ß,ß-dimetilo GABA.
En el enlazador ramificado, el aceptor de tiol "A" se enlaza a un vector de péptido o agente a través de un átomo de azufre derivado del vector de péptido o agente. El aceptor de tiol puede ser, por ejemplo, un grupo acetilo a-sustituido. Dicho grupo tiene la fórmula: en donde Y es un grupo de partida tal como Cl, Br, I, mesilato, tosilato, y similares. Si el aceptor de tiol es un grupo acetilo sustituido-alfa, el aducto de tiol después de la ligadura al ligando, forma el enlace — S— CH2—¦ Preferentemente, el aceptor de tiol es un aceptor de Adición Michael .
Un aceptor de Adición Michael representativo de la Á-presente invención tiene la fórmula Después de la ligadura del grupo tiol de ligando, el aceptor de Adición Michael se convierte en un aducto de Adición Michael, por ejemplo, en donde L es un agente o vector de péptido.
El grupo de puenteo "W" es una porción química bifuncíonal con la capacidad de enlazar covalentemente juntas dos porciones químicas separadas en una molécula tripartatita estable. Los ejemplos de grupos de puenteo se describen en la Publicación de S. S. Wong, Química de Conjugación y Reticulación de Proteína. CRC Press, Florida, (1991); y G. E. Means y R. E. Feeney, Química de Bioconjugado, vol. 1, pp.2-12, (1990), cuyas descripciones están incorporadas a la presente invención como referencia. W puede enlazar covalentemente el aceptor de tiol a una porción ceto. Un grupo de puenteo de ejemplo tiene la fórmula — (CH2)f— (Z)g— (CH2) — , en donde f es 0 a 10; h es 0 a 10; g es 0 o 1 , siempre y cuando g sea 0, entonces f + h es 1 a 10; Z es S, O, NH, S02, fenilo, naftilo, un polietilenglicol , un anillo de hidrocarburo cicloalifático que contiene 3 a 10 átomos de carbono, o un anillo de hidrocarburo héteroaromático que contiene 3 a 6 átomos de carbono y 1 o 2 heteroátomos seleccionados de O, N, o S. Las porciones cicloalifáticas preferidas incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y similares. Las porciones heteroaromáticas incluyen piridilo, polietilenglicol (1 a 20 unidades de repetición), furanilo, piranilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, oxazinilo, pirrolilo, tiazolilo, morfolinilo, y similares. En el grupo de puenteo, se prefiere que cuando g es 0, f + h sea un entero de 2 a 6 (por ejemplo, 2 a 4 tal como 2). Cuando g es 1, se prefiere que f sea 0, 1 o 2; y que h sea 0, 1 o 2. Los grupos de puenteo preferidos acoplados a los aceptores de tiol se muestran en la Publicación de Pierce Catalog, páginas E-12, E-13, E-14, E-15, E-16, y E-17 (1992). Modificaciones para Enlazadores Se pueden modificar cualquiera de los enlazadores aquí descritos (por ejemplo, agentes de enlace químico o enlazadores de aminoácido). Por ejemplo, los enlazadores pueden incluir una molécula espaciadora. La molécula espaciadora dentro del enlazador puede ser cualquier molécula adecuada. Los ejemplos de moléculas espaciadoras incluyen grupos de carbono alifáticos (por ejemplo, grupos alquilo C2-C20), grupos de carbono heteroatómicos disociables (por ejemplo, grupos alquilo C2-C2o con grupos ditio), y grupos de polímero hidrofílicos. Los ejemplos de grupos de polímero hidrofílicos incluyen poli(etilenglicol) (PEG), polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolína, polietiloxazolina, políhidroxipropíloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacrilato, polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietileneglicol, poliaspartamída, y una secuencia de péptido hidrofílica.
En un ejemplo, el polímero hidrofílico es PEG, tal como una cadena PEG que tiene un peso molecular entre 500 a 10,000 Da (por ejemplo, entre 1,000 a 5,000 Da tal como 2,000 Da). También se pueden utilizar análogos de PEG con tapa con sello de metoxi o etoxi. Estos están comercialmente disponibles en tamaños que fluctúan de 120 a 20,000 Da. La preparación de conjugados de ancla-lípido para utilizarse en liposomas, se describe por ejemplo en la Patente Norteamericana No.5,395, 619, incorporada a la presente invención como referencia. Otras moléculas espaciadoras incluyen poiinucleótidos (por ejemplo, ADN o ARN), polisacáridos tales como dextrano o xantan, derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa), poliestireno, alcohol polivin ílico, ácido poli metilacrílico, y poli(NIPAM). Los esquemas de reacción sintética para activar PEG con agentes de acoplamiento se establecen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,631,018, 5,527,528, y 5,395,619. Los esquemas de reacción sintéticos para enlazadores con moléculas espaciadoras PEG se establecen en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,828,401, y 7,217,845.
PEG, por ejemplo, se puede conjugar para un polipéptido de la presente invención a través de cualquier medio conocido en la técnica. En ciertas modalidades, la molécula PEG se deriva con un enlazador, el cual posteriormente se hace reaccionar con la proteína para formar un conjugado. Los enlazadores adecuados incluyen aldehidos, enlazadores de tresilo o tosilo, diclorotriazina o clorotriazina, epóxido, carboxilatos tales como succinato de succinimidilo, carbonatos tales como carbonato de p-nitrofenilo, carbonato de benzotriazolilo, carbonato de 2,3,5-triclorofenilo, y carbonato de PEG-succinimidilo, o tioles reactivos tales como piridildisulfuro, maleimida, vinilsulfona, y acetamida de yodo. La conjugación puede tener lugar en grupos amino, (por ejemplo, el grupo amino o grupos amino N-terminal dentro de la cadena lateral de Usina), o en grupos hidroxilo tiol, o amida, dependiendo del enlazador utilizado. Ver por ejemplo, la Publicación de Veronese et al., Drug Discov. Today 10: 1451-1458, 2005.
Agentes Terapéuticos El conjugado puede incluir cualquier agente terapéutico útil. Cualquiera de los agentes terapéuticos que se describen más adelante se pueden utilizar en los compuestos de la presente invención. Los ejemplos de interés particular incluyen agentes anticáncer (por ejemplo, paclitaxel o un derivado de paclitaxel, tal como docetaxel; etoposida; doxorubicina; y análogos de los mismos), agentes de ácido nucleico terapéuticos y agentes peptídicos terapéuticos (por ejemplo, neurotensina y agonistas de receptor de neurotensina, GDNF y análogos de los mismos, BDNF y análogos de los mismos, agonistas GLP-1, leptina, y agonistas de receptor OB).
Agentes Anticáncer De acuerdo con la presente invención, el agente puede ser un agente anticáncer. Un agente anticáncer comprendido en la presente invención puede incluir, por ejemplo, un fármaco que tiene un grupo que permite su conjugación a la porción objetivo de la presente invención. Los agentes anti-cáncer particulares incluyen los seleccionados del grupo que consiste en paclitaxel (Taxol®), un derivado de paclitaxel (por ejemplo, docetaxel (Taxotere®)), vinblastina, vincristina, etoposida, doxorubicina, ciclofosfamida, melfalan, y clorambucil; derivados (o análogos) de los mismos; sales farmacéuticamente aceptable de los mismos; o una combinación de los mismos. En modalidades particulares, el agente anticáncer es paclitaxel, docetaxel, etoposida, o doxorubicina; una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos; o un derivado de los mismos.
Tal como se utiliza en la presente invención, un "derivado de paclitaxel" se refiere a un compuesto inhibidor mitótico que tiene una actividad biológica que es al menos 70% (por ejemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más) tan efectiva como paclitaxel. La actividad biológica de ejemplo incluye uno o más valores IC50 tal como se determina mediante ensayos ELISA de competición, tal como con antisuero de conejo; ensayos de desensamble de tubulina; y/o ensayos de citotoxicidad; y uno o más parámetros farmacocinéticos, tales como Cmax, AUC, y/o Cm¡n- Los derivados de paclitaxel de ejemplo incluyen docetaxel y análogos de los mismos, tal como aquí se describe. En modalidades particulares, el agente anti-cáncer es paclitaxel o un análogo de paclitaxel o un derivado de paclitaxel. Paclitaxel tiene la fórmula: Los análogos estructurales o derivados de paclitaxel se describen en la Patente Norteamericana No. 6,911,549, y se pueden describir a través de la fórmula: en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en -CH3; -C6H5, o fenilo sustituido con 1, 2 o 3 C1-C4 alquilo, (-M-C3 alcoxi, halo, C1-C3 alquiltio, trifluorometilo, C2-C6 dialquilamino, hidroxilo, o nitro; y 2-furilo, 2-tienilo, 1-naftilo, 2-naftilo o 3,4- metilenedioxifenilo; R2 se selecciona del grupo que consiste en -H, -NHC(0)H,- NHC(0)Ci-Cio alquilo (preferentemente - NHC(0)C4-C6 alquil), -NHC(0)fenilo, -N HC(0)fenilo sustituido con 1, 2, o 3 C1-C4 alquilo, ? -03 alcoxi, halo, C1-C3 alquiltio, trifluorometilo, C2-C6 dialquilamino, hidroxi o nitro, NHC(0)C(CH3) = CHCH3, -N HC(0)OC(CH3)3, -NHC(0)OCH2 fenilo, -NH2, -NHS02-4-metilfenilo, -NHC(0)(CH2)3COOH, -NHC(0)-4-(S03H)fen¡lo, -OH, -NHC(0)-1 -adamantilo, -NHC(0)0-3-tetrahidrofuranilo, -NHC(0)0-4-tetrahidropiranilo, NHC(0)CH2C(CH3)3, -N HC(0)C(CH3)3, - H C(0 )OC 1 -C 1 o alquilo, -NHC(0)NHCi-Cio alquilo, -NHC(0)NHPh, -NHC(0)NHPh sustituido con 1, 2, o 3 Ci-C4 alquilo, Ci-C3 alcoxi, halo, C!-C3 alquiltio, trifluorometilo, C2-C6 dialquilamino, o nitro, NHC(0)C3-C8 cicloalquilo, -NHC(0)C(CH2CH3)2CH3, NHC(0)C(CH3)2CH2CI, -NHC(0)C(CH3)2CH2CH3, ftalimido, -NHC(0)-1 -fenil-1 -ciclopentilo, -NHC(0)-1 -metil-1 -ciclohexilo, -NHC(S)NHC(CH3)3r - N H C( O ) N H C C ( C H 3)3, o - N H C ( O ) N H P h ; R3 se selecciona del grupo que consiste en -H, -NHC(0)fenilo, o -NHC(0)OC(CH3)3, con la provisión general de que uno de R2 y R3 es -H pero R2 y R3 ambos no son -H; R4 es -H o se selecciona del grupo que consiste en -OH, -OAc (-OC(0)CH3), -OC(0)OCH2C(CI)3, -OCOCH2CH2NH3 + HCOO", -N HC(0)fenilo, -NHC(0)OC(CH3)3, -OCOCH2CH2COOH y sales farmacéuticamente aceptable de los mismos, -OCO(CH2)3COOH y sales farmacéuticamente aceptable de los mismos, y -OC(O)-Z-C(0)-R' [en donde Z es etileno (-CH2CH2-), propileno (-CH2CH2CH2-), -CH = CH-, 1 ,2-ciclohexano, o 1 ,2-fenileno, R' es -OH, -OH base, -NR'2R'3, -OR'3, -SR'3, -OCH2C(0)N R'4 '5 en donde R'2 es -H o -CH3, R'3 es -(CH2)nNR'6R'7 o (CH2)nN + R'6R'7R'8X en donde n es 1 a 3, R' es -H o -C1-C4 alquilo, R'5 es -H, -d-C4 alquilo, bencilo, hidroxietilo, -CH2C02H, o dimetilaminoetilo, R'6 y R'7 son -CH3, -CH2CH3, bencilo o R'6 y R'7 junto con el nitrógeno de NR'6R'7 forman un grupo pirrolidino, piperidino, morfolino, o N-metilpiperizino; R'8 es -CH3, -CH2CH3 o bencilo , X" es haluro, y una base es NH3, (HOC2H4)3N, N(CH3)3, CH3N(C2H4)2 H, NH2(CH2)6NH2, N-metilglucamina, NaOH, o KOH], -OC(0)(CH2)„NR2R3 [en donde n es 1 a 3, R2 es -H o -Ci-C3 alquilo y R3 es -H o -Ci-C3 alquil], -OC(0)CH(R")NH2 [en donde R" se selecciona del grupo que consiste en -H, -CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH2 fenilo, -(CH2)4NH2, -CH2CH2COOH, (CH2)3NHC( = NH)NH2], el residuo del aminoácido prolina, -OC(0)CH = CH2, -C(0)CH2CH2C(0)NHCH2CH2S03"Y + , OC(0)CH2CH2C(0)NHCH2CH2CH2S03 Y+ en donde Y+ es Na+ o N + (Bu)4, -OC(0)CH2CH2C(0)OCH2CH2OH; R5 es -H o -OH, con la provisión general de que cuando R5 es -OH, R4 es -H y con la provisión adicional de que cuando R5 es -H, R4 no es -H; R6 es -H: -H cuando R7 es a-R71^-R72 cuando uno de R71 y R72 es -H y el otro de R71 y R72 es -X, cuando X es halo y R8 es -CH3; R6 es -H: -H cuando R7 es a-H: -R74 en donde R7 y R8 se toman juntos para formar un anillo ciclopropilo; R 0 es -H o -C(0)CH3; y sales farmacéuticamente aceptable de los mismos, cuando el compuesto contiene un grupo funcional ya sea ácido o básico.
Las modalidades de ejemplo de derivados de paclitaxel (Taxol®) (o análogos) incluyen derivados descritos y referidos en la Patente Norteamericana No.6, 911, 549 presentada el 28 de Junio del 2005, cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia. Los derivados de paclitaxel particulares incluyen docetaxel (Taxotere®), ((azidofenil)ureido)taxoide, (2a,5a,7ß,9a,10ß,13a)-5,10,13,20-tetraacetoxitax-11-eno-2,7,9-triol, (2a,5a,9a,10ß)-2,9,10-triacetoxi-5-((P-D-glucopiranosil)oxi)-3,11-ciclotax-1 -en-13-ona, 1 ß-hidroxibacatinaa I, 1 ,7-dihidroxitaxinina, 1 -aceti-5,7, 10-deacetil-bacatina I, 1 -dehidroxibacatina VI, 1-hidroxi-2-deacetoxi-5-decinamoil-taxinina j, 1 -hidroxi-7,9-dideacetilbacatina I, 1 -hidroxibacatina I, 10-acetil-4-deacetiltaxotero, 10-deacetoxipaclitaxel, disolvato de sulfóxido de dimetilo de bacatinaa III 10-Deacetilo, 0-deacetil-10-(3-aminobenzoil)paclitaxel, 10-deacetil-10-(7-(dietilamino)coumarin-3-carbonil)paclitaxel, 10-deacetil-9-dihidrotaxol, 10-deacetilbacatinaa III, 10-deacetilpaclitaxel, 10-deacetiltaxinina, 10-deacetiltaxol, docetaxel de 10-desoxi- 10-C-morfolinoetilo, 10-O-acetil-2-O-(ciclohexilcarbonil)-2-debenzoi Itaxotero, docetaxel de 0-O-sec-aminoetilo, 11-desmetillaulimalida, 13-deoxo-13-acetiloxi-7,9-diacetil-1 ,2-dideoxitaxina, 13-desoxibacatina III, 14-hidroxi-1 O-deacetil-2-?-debenzoilbacatina III, 14-hidroxi-10-deacetilbacatina III, 14ß-benzoiloxi-13-deacetilbacatina IV, 14ß-benzoiloxi-2-deacetilbacatina VI, 4-benzoiloxibacatina IV, 19-hidroxibacatina III, 2',2"-metilenodocetaxel, 2', 2"- metilenopaclitaxel , 2'-(valil-leucil-lisil-PABC)paclitaxel, 2'-acetiltaxol, 2'-0-acetil-7-0-(N-(4'-fluoresceincarbonil)alanil)taxol, 2,10,13-triacetoxi-taxa-4(20), 11-dieno-5,7,9-triol, 2,20-O-diacetiltaxumairol N, 2-(4-azidobenzoil)taxol, 2-deacetoxitaxinina J, 2-debenzoil-2-m-metoxibenzoil-7-trietilsilil-13-oxo-14-hidroxibacatina III 1,14-carbonato, 2-0-(ciclohexilcarbonil)-2-debenzoilbacatina III 13-0-(N-(ciclohexilcarbonil)-3-ciclohexilisoserinato), 2a,7ß,9a,1 ?ß, 13a-pentaacetox¡ltaxa-4 (20), 11 -dien-5-ol, 2a,5a,7 ,9a,13a-pentahidroxi-10 -acetoxitaxa-4(20), 11 - di en o, 2a,7ß,9a,10ß, 13-pentaacetoxi-11 ß-?^?"???-5a-(3'-?,?-dimetilamino-3'-fenil)-propionilox¡taxa-4(20), 12-dieno, 2a, 7ß-diacetoxi-5a, 10ß, 13ß-?p?^G???-2(3-20^ß??3?3-4(20)1 11-dien-9-ona, 2a,9a-dihidroxi-10ß,13a-diacetoxi-5a-(3'-metilamino-3'-fenil)-propioniloxitaxa-4(20), 11-dieno, 2a-hidrox¡- 7ß,9a,10 ,13a-tetraacetoxi-5a-(2'-hidroxi-3'- , -dimetilamino-3'-fenil)-propioniloxitaxa-4(20), 11-dieno, 3'-(4-azidobenzamido)taxol, 3'-N-(4-benzoildihidrocinnamoil)-3'-N-debenzoilpaclitaxel, 3'-N-m-am¡nobenzamido-3'-debenzamidopaclitaxel, 3'-p-hidroxipaclitaxel, 3, 11 -ciclotaxinina N-2,4-deacetiltaxol, 5, 13-diacetoxi-taxa-4(20), 1 -dieno-9, 10-diol, taxinina K 5-O-benzoilada, 5-O-fenilpropioniloxitaxinina A, 5a, 3a-diacetoxi-10ß-cinamoiloxi-4(20), 11-taxadien-9a-ol, 6,3'-p-dihidroxipaclitaxel, 6-a-hidroxi-7-desoxi-10-deacetilbacatina-III, 6-fluoro-1 O-acetildocetaxel, 6-hidroxitaxol, 7, 13-diacetoxi-5- cinamiloxi-2(3-20)-abeo-taxa-4(20), 11 -dieno-2, 1 O-diol, 7,9-dideacetilbacatina VI, 7-(5'-Biotinailamidopropanoil)paclitaxel, 7-acetiltaxol, 7-deoxi-1 O-deacetilbacatina-l 11 , 7-desoxi-9-dihidropaclitaxel, 7-epipaclitaxel, 7-metiltiometilpaclitaxel, 7-0-(4-benzoildihidrocinamoil)paclitaxel, 7-0-(N-(4'-fluoresceincarbonil)alanil)taxol, 7-xilosil-10-deacetiltaxol, brevifolina 8,9-simple-epoxi, 9-d¡hidrobacat¡na III, 9-dihidrotaxol, 9a-hidroxi-2a, 1 ?ß, 13a-triacetoxi-5a-(3'-N,N-dimetilamino-3'-fenil)-propioniloxitaxa-4(20), 11-dieno, bacatinaa III, bacatinaa III 13-0-(N-benzoil-3-ciclohexilisoserinato), BAY59, benzoiltaxol, BMS 181339, BMS 185660, BMS 188797, brevifoliol, butitaxel, cefalomanina, dantaxusina A, dantaxusina B, dantaxusina C, dantaxusina D, dibromo- 10-deacetilcefalomanina, DJ927, Flutax 2, glucuronida de 5-aminohexanol de glutarilpaclitaxel, IDN 5109, IDN 5111, IDN 5127, IDN 5390, isolaulimalida, laulimalida, MST 997, N-(paclitaxel-2'-0-(2-amino)fenilpropionato)-0-(p-glucuronil)carbamato, N-(paclitaxel-2'-0-3, 3-d ¡metilo butanoato)-0-(P-glucuron¡l)carbamato, N-debenzoil-N-(3-(dimetilamino)benzoil)paclitaxel, nonataxel, paclitaxel conjugado con ocreótido, Paclitaxel, paclitaxel-transferrina, PNU 166945, paclitaxel-2'-glicinato conjugado con poli(etilenglicol), ácido poliglutámico-paclitaxel, pretax, protaxel, RPR 109881A, SB T-101187, SB T-1102, SB T-1213, SB T-12 4, SB T-1250, SB T-12843, tasumatrol E, tasumatrol F, tasumatrol G, taxa-4(20), acetato de 11 (12)-dien-5-ilo, taxa-4(20), 11 (12)-dieno-5-ol, taxano, taxquinina N, taxcultinaa, taxezopidina M, taxezopidina N, taxina, taxinina, taxinina A, taxinina M, taxinina NN-1, taxinina NN-7, C-7-xilosa de taxol, conjugado de taxol-s i a I i lo , taxumairol A, taxumairol B, taxumairol G, taxumairol H, taxumairol I, taxumairol K, taxumairol M, taxumairol N, taxumairol O, taxumairol U, taxumairol V, taxumairol W, taxumairol-X, taxumairol-Y, taxumairol-Z, taxusin, taxuspinanano A, taxuspinanano B, taxuspina C, taxuspina D, taxuspina F, taxuyunanina C, taxuyunanina S, taxuyunanina T, taxuyunanina U, taxuyunanina V, tRA-96023, y wallifolíol. Otros análogos de paclitaxel incluyen 1 -desoxipaclitaxel, 10-deacetoxi-7-deoxipaclitaxel, éster 10-O-deacetilpaclitaxel 10-monosuccílico, paclitaxel de 10-succinilo, 12b-acetiloxi-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12al12b-dodecahidro-4,1 -dihidroxi-12-(2,5-dimetoxibenciloxi)-4a,8,13,13-tetrametil-5-oxo-7, 3-(ter-butiloxicarbonil)amino-2-hidroxi-5-metil-4-hexaenoato de 11 -metano-1 H-ciclodeca(3,4)benz(1 ,2-b)oxet-9-ilo, paclitaxel enlazado con albúmina 130-nm, succinato de 2-glucopiranosilo de metilo de 2'-paclitaxel, 3'-(4-azidofenil)-3'-defenilpaclitaxel, 4-fluoro paclitaxel, 6,6,8-trimet¡l-4,4a,5,6,7,7a,8,9-octahidrociclopenta(4,5)ciclohepta(l,2-c)-furan-4,8-diol 4-(N-acetil-3-fenilisoserinato), 6,6,8-trimetil-4,4a,5,6,7,7a,8,9-octahidrociclopenta(4,5)ciclohepta(1 ,2-c)-furan-4 ,8-diol 4-(N- ter-butoxicarbonil-3-fen¡l¡soserinato), 7-(3-metil-3-nitrosotiobutiril)pacl¡taxel, 7-desoxipaclitaxel, 7-succinilpaclitaxel, A-Z-CINN 310, AI-850, paclitaxel enlazado con albúmina, AZ 10992, ¡sotaxel, MAC321, MBT-0206, NK105, Pach'ex, poliglumex de paclitaxel, conjugado de paclitaxel-EC-1 , polilactofato, y TXD 258. Otros análogos de paclitaxel se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,814,470, 4,857,653, 4,942,184, 4,924,011, 4,924,012, 4,960,790; 5,015,744; 5,157,049; 5,059,699; 5,136,060; 4,876,399; y 5,227,400.
Los derivados de etoposida de ejemplo (o análogos) incluyen derivados de podofilotoxina. Otros derivados de etoposida incluyen fosfato de etoposida (ETOPOPHOS®), 4'-dimetilglicina de etoposida, etoposidaD G, teniposida, y NK611, o cualquier sales farmacéuticamente aceptable de los mismos (por ejemplo, -OP(0)(ONa)2). Aún otros derivados de podofilotoxina adecuados para uso en la presente invención se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,567,253; 4,609,644; 4,900,814; 4,958,010; 5,489,698; 5,536,847; 5,571,914; 6,051,721; 6,107,284; 6,475,486; 6,610,299; 6,878,746; 6,894,075; 7,087,641; 7,176,236; 7,241 ,595; 7,342,114; y 7,378,419; y en las Publicaciones de Patentes Norteamericanas Nos. 20030064482, 20030162722, 20040044058, 20060148728, y20070249651 , cada una de las cuales está incorporada a la presente invención como referencia.
Los derivados (o análogos) de doxorubicina (hidroxidaunorubicina o Adriamicin®) de ejemplo incluyen epirubicina (Ellence® o Pharmorubicin®). Otros derivados de doxorubicina pueden encontrarse en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,098,884, 4,301,277, 4,314,054, 4,464,529, 4,585,859, 4,672,057, 4,684,629, 4,826,964, 5,200,513, 5,304,687, 5,594,158, 5,625,043, y 5,874,412, cada una de las cuales está incorporada a la presente invención como referencia.
Agentes Terapéuticos de Ácido Nucleico La porción de dirección puede ser conjugada para cualquier agente de ácido nucleico terapéutico, incluyendo vectores de expresión (por ejemplo un plásmido) y agentes de ARNi. El vector de expresión puede codificar un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido terapéutico tal como un interferón, una citocina terapéutica (por ejemplo, IL- 2), o PGF-2) o puede codificar un ácido nucleico terapéutico (por ejemplo, un agente ARNi tal como los aquí descritos). Los ácidos nucleicos incluyen cualquier tipo conocido en la técnica, tal como moléculas de ADN o ARN de hebra doble o simple de cualquier longitud, conformación, carga o forma (por ejemplo, lineal, concatémero, circular (por ejemplo, un plásmido) circular mellada, en espiral, en superespiral, o cargada). Además, el ácido nucleico puede contener modificaciones de terminal 5' o 3' e incluir nucleótidos romos y salientes en estos términos, o combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades de la presente invención, el ácido nucleico es o codifica una secuencia de interferencia de ARN (por ejemplo, una secuencia de nucleótido siARN, shARN, miARN, o dsARN) que puede silenciar un producto de gen dirigido. El ácido nucleico puede ser, por ejemplo, una molécula de ADN, una molécula de ARN, o una forma modificada de la misma.
Los objetivos ARNi de ejemplo incluyen factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor-ß de crecimiento de transformación (TGF-ß)), receptores de factor de crecimiento, incluyendo cinasas de tirosina receptora (por ejemplo, receptor EGF (EGFR), incluyendo Her2/neu (ErbB), receptor VEGF (VEGFR), receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), citocinas, quimiocinas, cinasas, incluyendo tirosina citoplásmica y cinasas de serina/treonina (por ejemplo, cinasa de adhesión focal, cinasa dependiente de ciclina, cinasas SRC, cinasas syk-ZAP70, cinasas BTK, cinasa RAF, cinasas MAP (incluyendo ERK), y cinasas Wnt), fosfatasas, GTPasas de reguladoras (por ejemplo, proteína Ras), factores de transcripción (por ejemplo, MYC), hormonas y receptores de hormona (por ejemplo, estrógeno y receptor de estrógeno), moléculas antiapoptóticas (por ejemplo, survivina, Bcl-2, Bcl-xL), oncógenos (por ejemplo, reguladores de supresor de tumor tal como mdm2), enzimas (por ejemplo, dismutasa de superóxido 1 (SOD-1), a, ß (BACE), y y secretasas, alfa-L-iduronidasa, sulfatasa de iduronato, N-sulfatasa de heparan, alfa-N-acetil-glucosaminidasa, acetiltransferasa de acetil-CoAlfa-glucosaminida, 6-sulfatasa de N-acetilglucosamina, 4-sulfatasa de N-acetilgalactosamina, beta-galactosidasa, esfingomielinasa, glucocerebrosidasa, alfa-galactosidasa-A, ceramidasa, galactosilceramidasa, arilsulfatasa A, aspartoacilasa, hidroxilasa de fitanoil-CoA, peroxin-7, beta-hexosaminidasa A, aspartil-glucosaminidasa, fucosidasa, y alfa-manosidasa, sialidasa), y otras proteínas (por ejemplo, Huntingtina (proteína Htt), proteína precursora amiloide (APP), clasificación de nexinas (incluyendo SNX6), a-sinucleina, LINGO-1, Nogo-A, y receptor 1 Nogo (NgR-1 )), y proteína ácida fibrilar glial. La tabla 3 ilustra la relación entre los objetivos ARNi de ejemplo y las enfermedades.
Las secuencias ARNi de ejemplo para silenciar EGFR son SEQ ID NO: 117 (GGAGCUGCCCAUGAGAAAU) y SEQ ID NO: 118 (AUUUCUCAUGGGCAGCUCC). De igual manera, VEGF se puede silenciar con una molécula de ARNi que tiene la secuencia, por ejemplo, establecida en SEQ ID NO: 119 (GGAGTACCCTGATGAGATC). Las secuencias ARNi adicionales para utilizarse en los agentes de la presente invención pueden ser ya sea comercialmente disponibles (por ejemplo, Dharmacon, Ambion) o el practicante puede utilizar una de las diversas herramientas de software públicamente disponibles para la construcción de secuencias ARNi viables (por ejemplo, The siARN Selection Server, mantenido en MIT/Whitehead; disponible en http://jura.wi.mit.edu/bioc/siARNext/). Los ejemplos de enfermedades o condiciones, y el objetivo ARNi que puede ser útil en el tratamiento de dichas enfermedades, se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3: Enfermedades y Moléculas Objetivo de Ejemplo Fármaco de Molécula Pequeña Cualquier fármaco de molécula pequeña puede enlazarse con la porción objetivo. Los fármacos de molécula pequeña incluyen un agente anticáncer, un antibiótico, un agente citotóxico, un agente de alquilación, un agente antínaeoplásico, un agente antimetabólico, un agente antiprolíferativo, un inhibidor de tubulina, un inhibidor de topoisomerasa I o II, un agonista o antagonista hormonal, un agente apoptótico, un inmunomodulador, y un agente radioactivo (por ejemplo, un isótopo), o cualquier agente aquí descrito. Los fármacos de molécula pequeña de ejemplo incluyen paclitaxel (Taxol®), un derivado de paclitaxel (por ejemplo, docetaxel (Taxotere®)), vinblastina, vincristina, etoposida, doxorubicina, ciclofosfamida, melfalan, clorambucilo, metotrexato, camptotecina, homocamptotecina, tiocolquicina, colquicina, combretastatina, combretasti na A-4, podofilotoxina, rizoxina, rizoxina-d, dolistatina, CC1065, ansamitocina p3, maitansinoide, y cualesquiera sales farmacéuticamente aceptable, etc., y combinaciones de los mismos, así como cualquier fármaco que pueda ser un substrato P-gp.
Los fármacos de molécula pequeña de ejemplo incluyen analgésicos y agentes antinflamatorios (por ejemplo, aloxiprina, auranofina, azapropazona, benorilato, diflunisal, etodolac, fenbufeno, calcio de fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, nabumetona, naproxeno, oxifenbutazona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac), antibióticos (por ejemplo, penicilina, cefalosporinas, aminoglicosidas, macrólidos, quinolonas, y tetraciclinas), antihelmínticos (por ejemplo, albendazol, hidroxinaftoato de befenio, cambendazol, diclorofeno, ivermectina, mebendazol, oxamniquina, oxfendazol, embonato de oxantel, praziquantel, embonato de pirantel, tiabendazol), agentes antiarrítmicos (por ejemplo, amiodarona (por ejemplo, HCI), disopiramida, flecainida (por ejemplo, acetato), quinidina (por ejemplo, sulfato), agentes antibacterianos (por ejemplo, penicilina de benetamina, cinoxacina, ciprofloxacina (por ejemplo, HCI), claritromicina, clofazimina, cloxacilina, demeclociclina, doxiciclina, eritromicina , etionamida, imipenem, ácido nalidíxico, nitrofurantoina, rifampicina, espiramicina, sulfabenzamida, sulfadoxina, sulfamerazina, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfafurazol, sulfametoxazol, sulfapiridina, tetraciclina, tri metoprim ), anticoagulantes (por ejemplo, dicoumarol, dipiridamol, nicoumalona, fenindiona), antidepresivos (por ejemplo, amoxapina, maprotilina (por ejemplo, HCI), mianserina (por ejemplo, HCI), nortriptilina (por ejemplo, HCI), trazodona (por ejemplo, HCI), trimipramina (por ejemplo, maleato)), antidiabéticos (por ejemplo, acetohexamida, clorpropamida, glibenclamida, gliclazida, glipizida, tolazamida, tolbutamida), antiepilépticos (por ejemplo, beclamida, carbamazepina, clonazepam, etotoina, metoina, metsuximida, metilfenobarbitona, oxcarbazepina, parametadiona, fenacemida, fenobarbitona , fenitoina, fensuximida, primidona, sultiame, ácido valproico), agentes antifúngicos (por ejemplo, anfotericina , butoconazol (por ejemplo, nitrato), clotrimazol, econazol (por ejemplo, nitrato), fluconazol, flucitosina, griseofulvina, itraconazol, cetoconazol, miconazol, natamicina, nistatina, sulconazol (por ejemplo, nitrato), terbinafina (por ejemplo, HCI), terconazol, tioeonazol, ácido undecanoico), agentes antigota (por ejemplo, alopurinol, probenecid, sulfin- pirazona), agentes antihipertensión (por ejemplo, amlodipina, benidipina, darodipina, dilitazem (por ejemplo, HCI), diazoxida, felodipina, guanabenz (por ejemplo, acetato), isradipina, minoxidil, nicardipina (por ejemplo, HCI), nifedipina, nimodipina, fenoxibenzamina (por ejemplo, HCI), prazosina (por ejemplo, HCI), reserpina, terazosina (por ejemplo, HCI)), antimalarios (por ejemplo, amodiaquina, cloroquina, clorproguanil (por ejemplo, HCI), halofantrina (por ejemplo, HCI), mefloquina (por ejemplo, HCI), proguanil (por ejemplo1, HCI), pirimetamina, sulfato de quinina), antimigraña (por ejemplo, dihidroergotamina (por ejemplo, mesilato), ergotamina (por ejemplo, tartrato), metisergida (por ejemplo, maleato), pizotifeno (por ejemplo, maleato), succinato de sumatriptan), agentes antimuscarínicos (por ejemplo, atropina, benzhexol (por ejemplo, HCI), biperiden, etopropazina (por ejemplo, HCI), hiosciamina, mepenzolato (por ejemplo, bromuro), oxifencilcimina (por ejemplo, HCI), tropicamida), agentes anticáncer e inmunosupresores (por ejemplo, aminoglutetimida, amsacrina, azatioprina, busulfan, clorambucil, ciclosporina, dacarbazina, doxoru bicina , estramustina, etoposida, lomustina, melfalan, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitozantrona, paclitaxel, procarbazina (por ejemplo, HCI), tamoxifeno (por ejemplo, citrato), testolactona), agentes antiprotozoario (por ejemplo, benznidazol, clioquinol, decoquinato, diyodohidroxiquinolina, diloxanida furoato, dinitolmida, furzolidona, metronidazol, nimorazol, nitrofurazona, ornidazol, tinidazol), agentes antitiroides (por ejemplo, carbimazol, propiltiouracil), anxiolíticos, sedantes, hipnóticos y neurolépticos (por ejemplo, alprazolam, amilobarbitona, barbitona, bentazepam, bromazepam, bromperidol, brotizolam, butobarbitona, carbromal, clordiazepoxida, clormetiazol, clorpromazina, clobazam, clotiazepam, clozapina, diazepam, droperidol, etinamato, flunanisona, flunitrazepam, fluopromazina, decanoato de flupentixol, decanoato de flufenazina, flurazepam, haloperidol, lorazepam, lormetazepam, medazepam, meprobamato, metaqualona, midazolam, nitrazepam, oxazepam, pentobarbitona, pimozida de perfenazina, proclorperazina, sulpirida, temazepam, tioridazina, triazolam, zopiclona), Bloqueadores-ß (por ejemplo, acebutolol, alprenolol, atenolol, labetalol, metoprolol, nadolol, oxprenolol, pindolol, propranolol), agentes inotrópicos cardiacos (por ejemplo, amrinona, digitoxina, digoxina, enoximona, lanatosida C, medigoxina), corticosteroides (por ejemplo, beclometasona, betametasona, budesonida, cortisona (por ejemplo, acetato), desoximetasona, dexametasona, fludrocortisona (por ejemplo, acetato), flunisolida, flucortolona, fluticasona (por ejemplo, propionato), hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), diuréticos (por ejemplo, acetazolamida, amilorida, bendrofluazida, bumetanida, clorotiazida, clortalidona, ácido etacrínico, frusemida, metolazona, espironolactona, triamtereno), agentes antiparkinsonianos (por ejemplo, bromocriptina (por ejemplo, mesilato), lisurida (por ejemplo, maleato)), agentes gastrointestinales (por ejemplo, bisacodilo, cimetidina, cisaprida, difenoxilato (por ejemplo, HCI), domperidona, famotidina, loperamida, mesalazina, nizatidina, omeprazol, ondansetron (por ejemplo, HCI), ranitidina (por ejemplo, HCI), sulfasalazina), antagonistas del receptor de histamina-H (por ejemplo, acrivastina, astemizol, cinnarizina, ciclizina, ciproheptadina (por ejemplo, HCI), dimenhidrinato, flunarizina (por ejemplo, HCI), loratadina, meclozina (por ejemplo, HCI), oxatomida, terfenadina), agentes de regulación de lípidos (por ejemplo, bezafibrato, clofibrato, fenofibrato, gemfibrozil, probucol), nitratos y otros agentes antiangina (por ejemplo, nitrato de amilo, trinitrato de glicerilo, dinitrato de isosorbida, mononitrato de isosorbida, tetranitrato de pentaeritritol ), analgésicos opioides (por ejemplo, codeína, dextropropioxifeno, diamorfina, dihidrocodeína, meptazinol, metadona, morfina, nalbufina, pentazocina), hormonas sexuales (por ejemplo, clomifeno (por ejemplo, citrato), danazol, estradiol de etinilo, medroxiprogesterona (por ejemplo, acetato), mestranol, metiltestosterona , noretisterona, norgestrel, estradiol, estrógenos conjugados, progesterona, estanozolol, estibestrol, testosterona , tibolona), y estimulantes (por ejemplo, anfetamina, dexanfetamina, dexfenfluramina, fenfluramina, mazindol). La presente invención también puede incluir análogos de cualquiera de estos agentes (por ejemplo, análogos terapéuticamente efectivos).
Etiquetas Se puede enlazar una etiqueta a la porción de dirección para permitir el diagnóstico y/o tratamiento terapéutico. Los ejemplos de etiquetas incluyen etiquetas detectables, tales como isótopo, un agente de generación de radioimagen, un marcador, un trazador, una etiqueta fluorescente (por ejemplo, rodamina), y una molécula reportera (por ejemplo, biotina).
Los ejemplos de agentes de generación de radioimagen que emiten radiación (radioetiquetas detectables) que pueden ser adecuados, se ejemplifican mediante indio-111, tecnitio-99, o yodo-131 de dosis baja. Las etiquetas o marcadores detectables para utilizarse en la presente invención, pueden ser una radioetiqueta, una etiqueta fluorescente, una etiqueta activa de resonancia magnética nuclear, una etiqueta luminiscente, una etiqueta de cromoforo, un isótopo de emisión de positrones para escáner PET, etiqueta de quimioluminiscencia, o una etiqueta enzimática. Las etiquetas fluorescentes incluyen pero no se limitan a, proteína fluorescente verde (GFP), fluoresceína y rodamina. Las etiquetas de quimioluminiscencia incluyen pero no se limitan a luciferasa y ß-galactosidasa . Las etiquetas enzimáticas incluyen pero no se limitan a peroxidasa y fosfatasa. Una etiqueta de histamina también puede ser una etiqueta detectable. Por ejemplo, los conjugados pueden comprender una porción transportadora y una porción de anticuerpo (anticuerpo o fragmento de anticuerpo) y pueden comprender además una etiqueta. La etiqueta puede ser, por ejemplo, un isótopo médico, tal como por ejemplo, y sin limitación tecnetio-99, yodo-123 y -131, talio-201, galio-67, fluoro-18, indio-111 , etc. Agentes Peptídicos Terapéuticos Los agentes peptídicos terapéuticos incluyen una amplia clase de agentes basados en proteínas o péptidos (por ejemplo, cualquier fármaco peptídico o a base de proteínas útil). Los agentes peptídicos terapéuticos de ejemplo incluyen, sin limitación, un fármaco peptídico o a base de proteínas (por ejemplo, un modulador (agonista) farmacológico positivo o un inhibidor (antagonista) farmacológico), etc.
El conjugado puede ser un polipéptido terapéutico (por ejemplo, una proteína de fusión) que consiste esencialmente en la porción de dirección y una proteína. Los agentes peptídicos terapéuticos de ejemplo incluyen toxinas celulares (por ejemplo, auristatina de monometilo E (MMAE), endotoxinas y exotoxinas bacterianas, toxinas de difteria, toxina de botulinio, toxinas de tétano, toxinas de perusis, enterotoxinas de estafilococo, toxina de síndrome de choque tóxico TSST-1, toxina de ciclasa de adenilato, toxina shiga, y enterotoxina de cólera), compuestos anti-angiogénicos (por ejemplo, endostatinas, quimiocinas, inhibidores de metaloproteinasa de matriz (MMPIs), anastelina, vitronectina, antitrombina, inhibidores de cinasa de tirosina, e inhibidores VEGF), hormonas (por ejemplo, hormona de crecimiento), y citocinas (por ejemplo, factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago, interleucinas, linfocinas, y quimiocinas).
Otros agentes peptídicos terapéuticos que pueden ser incluidos en un conjugado de la presente invención, son hormonas adrenocortiocotrópicas (ACTH, corticotropina), péptidos de hormona de crecimiento (por ejemplo, lactogen de placenta humana (hPL), hormonas de crecimiento, y prolactina (Prl)), hormonas de estimulación de melanocito (MSH), oxitocina, vasopresina (ADH), factor de liberación de corticotropina (CRF), péptidos asociados con hormona de liberación de gonadotropina (GAP), factor de liberación de hormona de crecimiento (GRF), hormonas de liberación de hormona de lutenización (LH-RH), orexinas, péptidos de liberación de prolactina, somatostatina, hormona de liberación de tirotropina (THR), calcitonina (CT), péptido precursor de calcitocina, péptido relacionado con gen de calcitoninas (CGRP), hormonas paratiroides (PTH), proteínas relacionadas con hormona paratiroides (PTHrP), amilina, glucagon, insulina y péptidos tipo insulina, neuropéptido Y, polipéptido pancreático (PP), péptido YY, somatostatina, colecistocinina (CCK), péptido de liberación de gastrina (GRP), gastrina, péptido inhibidor de gastrina, motilina, secretina, péptido intestinal vasoactivo (VIP), péptidos natriuréticos (por ejemplo, péptido natriurético atrial (ANP), péptido natriurético tipo-B (BNP), péptido natriurético de cerebro, y péptido natriurético tipo-C (CNP)), taquiquininas (por ejemplo, neuroquinina A, neuroquinina B, y substancia P), substancia P, angiotensinas (por ejemplo, angiotensina I y angiotensina II), renina, endotelinas (por ejemplo, endotelina-1 , endotelina-2, endotelina-3, sarafotoxina (veneno de serpiente) y toxina de escorpión), péptidos de sarafotoxina, péptidos opioides (por ejemplo, péptidos de casomorfina, demorfinas, endorfinas, encefalinas, deltorfinas, dinorfinas), péptidos tímicos (por ejemplo, timopoyetina, timulina, timopentina, timosina, factor humoral tímico (THF)), péptidos de adrenomedulina (AM), péptidos de alatostatina, fragmentos de proteína beta amiloide (fragmentos ?ß), péptidos antimicrobianos (por ejemplo, defensina, cecropina, buforina, y magainina), péptidos antioxidantes (por ejemplo, factor de incremento de exterminador natural B (NKEF-B), bombesina, péptidos de proteína Gla de hueso (por ejemplo, osteocalcina (proteína-Gla de hueso, o BGP), péptidos CART, péptidos de adhesión celular, péptidos de cortistatina, fragmentos de fibronectina y péptidos relacionados con fibrina, péptidos FMRF, galanina, guanilina y uroguanilina, y péptidos de inhibina.
En particular, el agente peptidico terapéutico es neurotensina o un análogo de neurotensina, un agonista de receptor de neurotensina, un factor neurotrófico o un análogo de factor neurotrófico (por ejemplo, factor neurotrófico derivado de línea de célula glial (GDNF) o un análogo GDNF, o factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) o un análogo BDNF), un agonista GLP-1, o leptina o un análogo de leptina. A continuación se proporcionan más detalles con respecto a estos agentes.
Neurotensina o un Análogo de Neurotensina La neurotensina (NT) es un péptido de 13 aminoácidos encontrado en el sistema nervioso central y en el tracto gastrointestinal. En el cerebro, NT está asociada con receptores dopaminérgicos y otro sistema neurotransmisor. NT periférica actúa como un péptido paracrino y endocrino, en los sistemas tanto digestivos como cardiovasculares. Para ejercer sus efectos biológicos en el cerebro, NT tiene que ser inyectada o suministrada directamente en el cerebro, debido a que NT no cruza la BBB y es degradado rápidamente por peptidasas después de la administración sistemática. Los estudios farmacológicos preclínicos, la mayoría de los cuales implican una inyección directa de NT en el cerebro, sugieren fuertemente que un agonista de receptores NT puede ser clínicamente útil para el tratamiento de condiciones neuropsiquiátricas incluyendo psicosis, esquizofrenia, enfermedad de Parkinson, dolor, y el abuso de psicoestimulantes. En particular, en diversos estudios animales, la inyección intraventricular de NT conduce a hipotermia y analgesia en experimentos de antinocicepción.
El terapéutico de péptido, puede ser neurotensina o un análogo del mismo. La neurotensina humana es un péptido de trece aminoácidos que tiene la secuencia QLYENKPRRPYIL. Los análogos de neurotensina de ejemplo incluyen antagonista híbrido (VI P-neurotensina), acetilneurotensina(8-13), JMV 1193, péptido KK13, neuromedina N, precursor de neuromedina N, neurotensina(1-10), neurotensina(1 -11 ), neurotensina(1 -13), neurotensina( 1 -6), neu rotensi na ( 1 -8), neurotensina(4- 13), neurotensina(6-13), neurotensina(8-13), Asp(12)-neurotensina(8-13), Asp(13)-neurotensina(8-13), C i t( 8 )-neurotensina(8-13), Lys(8)-neurotensina(8-13), Cit(9)-neurotensina(8-13), Lys(9)-neurotensina(8-13), N-metil-Arg(8)-Lys(9)-neo-Trp(11)-neo-Leu(12)-neurotensina(8- 3), neurotensina(9-13), neurotensina 69L, Arg(9)-neurotensina, azidobenzoil-Lys(6)-Trp(11)-neurotensina, Gln(4)-neurotensina, yodo-Tyr(11 )-neurotensina, yodo-Tyr(3)-neurotensina, N-a-(fluoresceiniltiocarbamil)glutamil(1)-neurotensina, Lys(7)-D-Tyr(11 )-neurotensina(7-13) (por ejemplo, NT 1 o KRRP(D-Y)IL), p-Glu(1 )-neurotensina o p-Glu(1 )-neurotensina-OH (por ejemplo, pELYENKPRRPYIL o pELYENKPRRPYIL-OH, en donde "pE" representa ácido L-piroglutámico), Phe( 1 )-neurotensina, Ser(7)-neurotensina, Trp(11 )-neurotensina, Tyr(11)- neurotensina, NT77 de rata, PD 149163, proneurotensina, estearil-Nle(17)-neurotensina(6-11)VIP(7-28), 99mTc-NT-XI, TJN 950, y un híbrido intestinal vasoactivo de péptido-neurotensina.
Otros análogos de neurotensina incluyen péptidos de neurotensina acortados que tienen una o más substituciones, incluyendo substituciones para D-isómeros correspondientes de los mismos residuos de aminoácido-L. Los análogos de neurotensina de ejemplo incluyen los de neurotensina(6-13) (KPRRPYIL) o neurotensina(7-13) (PRRPYIL), tal como D-Lys(6)-neurotensina(6-13), D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Lys(6)-D-Tyr(11)-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-neurotensina(6-13), D-Arg(9)-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(6- 13), D-Pro(10)neurotensina(6-13), D-Tyr(11)-neurotensina(6-13), D-Trp( 11 )-neurotensina(6-13), D-Phe(11)-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Trp( 1 )-neurotensina(6-13), y Lys(7)-D-Tyr(11 )-neurotensina(7- 3) (por ejemplo, NTI o KRRP(D-Y)IL); y para neurotensina(8-13), tal como D-Arg(8)-neurotensina(8-13), D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Pro(10)neurotensina(8-13), D-Tyr(11 )-neurotensina(8-13), D-Trp(11 )-neurotensina(8-13), D-Phe(11 )-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Tyr(11 )-neurotensina(8-13), y D-Arg(8)-D-Trp(11 )-neurotensina(8-13), y análogos acetilados de cualquiera de las anteriores.
Los análogos de neurotensina adicionales incluyen los que tienen una o más substituciones de D-aminoácidos para uno o más sitios de disociación de pepsina y tripsina. Los sitios de disociación de ejemplo para neurotensina se muestran en la figura 9, tal como C-terminal para las posiciones 1, 2, 3, 11, 12, y 13 para disociación mediante pepsina y C-terminal para la posición 8 para disociación mediante tripsina. Por consiguiente, los análogos de neurotensina de la presente invención también incluyen polipéptidos más cortos que la neurotensina que tienen una o más substituciones de D-aminoácidos para una o más de las posiciones 1, 2, 3, 8, 11, 12, y 13 en neurotensina.
Aún otros análogos de neurotensina incluyen NT64L [L-neo-Trp11]NT(8-13), NT72D [D-Lys9 , D-neo-Trp 11 , ter- Leu12]NT(9-13), NT64D [D-neo-Trp 11 ]NT(8-13), NT73L [D-Lys9,L-neo-Trp11]NT(9-13), NT65L [L-neo-Trp 1 , ter-Leu12]NT(8-13), NT73D [D-Lys9,D-neo-Trp11 ]NT(9-13), NT65D [D-neo-Trp11 , ter-Leu 12]NT(8-13), NT74L [DAB9, L-neo-Trp11 ,ter-Leu12]NT(9-13), NT66L [D-Lys8, L-neo-Trp11, ter-Leu 12]NT(8-13), NT74D [DAB9,Pro,D-neo-Trp11 , ter-Leu 12]NT(9-13), NT66D [D-Lys8, D-neo-Trp11, ter-Leu12]NT(8-13), NT75L [DAB8 L-neo-Trp11 ]NT(8-13), NT67L [D-Lys8, L-neo-Trp11]NT(8-13), NT75D [DAB8,D-neo-Trp11 ]NT(8-13), NT67D [D-Lys8, D-neo-Trp11]NT(8-13), NT76L [D-Orn9 , L-neo-Trp11]NT(8-13), NT69L [N-metil-Arg8 , L-Lys9 L-neo-Trp1 , ter-Leu 12]NT(8- 13), NT76D [D-Orn9,D-neo-Trp 1 ]NT(8-13), NT69D [N-metil-Arg8 L-Lys9,D-neo-Trp11 ,ter-Leu12]NT(8-13), NT77L [D-Orn9,L-neo-Trp11 ,ter-Leu12]NT(8-13), NT71L [N-metil-Arg8, DAB9 L-neo-Trp11 ,ter-leu 12]NT(8-13), NT77D [D-Orn9,D-neo-Trp11 ,ter-Leu 12]NT(8-13), NT71D [N-metil-Arg8, DAB9, D-neo-Trp 1 ,ter-leu12]NT(8-13), NT78L [N-metil-Arg8, D-Orn9 L-neo-Trp 1 ,ter-Leu 12]NT(8-13), NT72L [D-Lys9,L-neo-Trp11.ter-Leu 12]NT(9-13), y NT78D [N-metil-Arg8, D-Orn9, D-neo-Trp1 ,ter-Leu12]NT(8-13), en donde neo-Trp es (ácido 2-amino-3-[1 H-indolil]propanoico). Otros análogos de neurotensina incluyen Beta-lactotensi na (selectivo NTR2), JMV-449, y PD-149 o PD-163 (selectivo NTR1; enlace de amida reducida de fragmento de neurotensina 8-13).
Otros análogos de neurotensina incluyen los que tienen aminoácidos modificados (por ejemplo, cualquiera de los aquí descritos). El análogo de neurotensina también puede ser un agonista receptor de neurotensina. Por ejemplo, el análogo de neurotensina puede ser selectivo para NTR1, NTR2, o NTR3 (por ejemplo, puede enlazar a, o activar uno de NTR1, NTR2, o NTR3 al menos 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000, 50,000, o 100,000 mayor) en comparación con al menos uno de los otros receptores NTR, o ambos.
Factor Neurotrófico Derivado de Línea de Célula Glial (GDNF) o un Análogo GDNF GDNF se segrega como un homodímero enlazado por disulfuro, y tiene la capacidad de soportar la supervivencia de neuronas dopaminérgicas, células de Purkinje, motoneuronas, y neuronas simpáticas. Los análogos o fragmentos GDNF que tienen una o más de estas actividades, se pueden utilizar en la presente invención, y se puede probar la actividad de dichos análogos y fragmentos, utilizando cualquier medio conocido en la técnica.
GDNF humano se expresa como una proteína de 211 aminoácidos (isoforma 1); una proteína de 185 aminoácidos (isoforma 2), y una proteína de 133 aminoácidos. GDNF maduro es una secuencia de 134 aminoácidos que incluye los aminoácidos 118 a 211 de la isoforma 1, aminoácidos 92 a 185 de la isoforma 2. La isoforma 3 incluye un dominio tipo factor de transformación de crecimiento de los aminoácidos 40 a 133. Otras formas de GDNF incluyen los aminoácidos 78 a 211 de la isoforma 1.
En ciertas modalidades, el análogo GDNF es una variante de división de GDNF. Dichas proteínas se describen en la Publicación PCT No. WO 2009/053536, e incluyen la variante de división pre-(a)pro-GDNF, pre-(p)pro-GDN F, y pre-(y)pro-GDNF, así como las variantes que carecen de la región pre-pro: (a)pro-GDNF, (3)pro-GDNF, y pre-(y)pro-GDNF.
Los análogos GDNF también incluyen fragmentos de una proteína precursora GDNF o la variante biológicamente activa. Los análogos GDNF ejemplares incluyen Pro-Pro-Glu-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Arg-Ser-Leu-Gly-Arg-Arg; Phe-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Lys-Arg; FPLPA-amida, PPEAPAEDRSL-amida, LLEAPAEDHSL-amida, SPDKQMAVLP, SPDKQAAALP, SPDKQTPIFS, ERNRQAAAAN PENSRGK-amida, ERNRQAAAASPENSRGK-amida, y ERNRQSAATNVENSSKK-amida. Otros análogos GDNF se describen en las Publicaciones de Solicitud de Patente Norteamericana Nos. 2009/0069230 y 2006/0258576; y en la Publicación PCT No. WO 2008/069876. Factor Neurotrófico Derivado de Cerebro (BDNF) o un Análogo BDNF BDNF es una glucoproteína de la familia de proteínas de factor de crecimiento nervioso. La proteína se codifica como un polipéptido de 247 aminoácidos (isoforma A), un polipéptido de 255 aminoácidos (isoforma B), un polipéptido de 262 aminoácidos (isoforma C), un polipéptido de 276 aminoácidos (isoforma D), y un polipéptido de 329 aminoácidos (isoforma E). la glucoproteína madura de 119 aminoácidos se procesa a partir del precursor más grande para producir un factor neurotrófico que promueve la supervivencia de poblaciones de célula neuronal. La proteína madura incluye los aminoácidos 129 a 247 de la preproteína de isoforma A, los aminoácidos 137 a 255 de la preproteína de isoforma B, los aminoácidos 144 a 162 de la preproteína de isoforma C, los aminoácidos 158 a 276 de la preproteína de isoforma D, o los aminoácidos 211 (o 212) a 329 de la preproteína de isoforma E. BDNF actúa como el receptor TrkB y con baja afinidad del receptor de factor de crecimiento nervioso (LNGFR o p75). BDNF tiene la capacidad de soportar la supervivencia neuronal de neuronas existentes, y también puede promover el crecimiento y diferenciación de nuevas neuronas. Los fragmentos o análogos BDNF de la presente invención, pueden tener cualquiera de las actividades antes mencionadas. La actividad de dichos análogos y fragmentos se puede probar utilizando cualquier medio conocido en la técnica. Otros análogos BDNF se describen en la Patente Norteamericana No. 6,800,607, Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2004/0072291, y Publicación PCT No. WO 96/15146.
Agonista GLP-1 Las porciones de dirección aquí descritas se pueden conjugar para un agonista GLP-1. Los agonistas GLP-1 particulares incluyen GLP-1, exendina-4, y análogos o fragmentos de los mismos. Los análogos de ejemplo se describen más adelante.
GLP-1 y los análogos GLP-1 se pueden utilizar en conjugados y polipéptidos terapéuticos de la presente invención. En ciertas modalidades, el análogo GLP-1 es un péptido, el cual puede ser truncado, puede tener una o más substituciones de la secuencia tipo natural (por ejemplo, la secuencia tipo natural humana), o puede tener otras modificaciones químicas. Los agonistas GLP-1 también pueden ser compuestos sin péptido, por ejemplo, tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,927,214. Los análogos particulares incluyen LY548806, CJC-1131, y Liraglutida.
El análogo GLP-1 puede ser truncado a partir de GLP-1. El péptido GLP-1 puede ser truncado mediante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 20, o más residuos de su N-término, su C-término, o una combinación de los mismos. En ciertas modalidades, el análogo GLP-1 truncado es el péptido humano GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), o GLP-1(7-37) o las formas amidadas C-terminal del mismo.
El análogo GLP-1 puede incluir substituciones, tal como un aminoácido diferente a alanina en la posición 8 o un aminoácido diferente a glicina en la posición 22 (por ejemplo, [Glu2 ]GLP- 1(7-37)OH, [Asp22]GLP-1 (7-37)OH, [ Arg 22] G L P- 1 ( 7 - 37 )0 H , [Lys22]GLP-1 (7-37)OH, [Cya22]GLP-1 (7-37)OH, [Val8,Glu22]GLP-1(7-37)OH, [Val8,Asp22]GLP-1 (7-37)OH, [Val8, Arg2 ]GLP-1 (7-37)OH, [Val8,Lys22]GLP-1(7-37)OH, [Val8,Cya22]GLP-1 (7-37)OH, [Gly8,Glu2 ]GLP-1(7-37)OH, [Gly8,Asp22]GLP-1 (7-37)OH, [Gly8,Arg22]GLP-1(7-37)OH, [Gly8, Lys2 ]G LP- 1 (7-37 )0 H , [Gly8,Cya22]GLP-1 (7-37)OH, [Glu22]GLP-1 (7-36)N H2, [Asp2 ]GLP-1(7-36)NH2, [Arg2 ]GLP-1 (7-36)NH2, [Lys22]GLP-1 (7-36)NH2, [Cya22]GLP-1 (7-36)NH2, [Val8,Glu 2]GLP-1 (7-36)NH2, [Val8, Asp22]GLP-1 (7-36) NH2, [Val8, Arg22]GLP-1 (7-36 )NH2, [Val8,Lys2 ]GLP-1(7-36)NH2, [Val8 , Cya ]G LP- 1 (7-36 )N H2, [Gly8,Glu22]GLP-1(7-36)NH2, [Gly8, Asp2 ]GLP-1 (7-36 )NH2, [Gly8,Arg ]GLP-1(7-36)NH2, [G ly8, Lys22]G LP- 1 (7-36 ) N H2, [Gly8,Cya22]GLP-1(7-36)NH2, [ Va I8, Lys2]G L P- 1 (7-37 )0 H , Glu30]GLP-1 (7-37)OH, [Gly8,Glu30]GLP-1(7-37)OH, [Val8, His35]GLP-1 (7-37 )0H, [ Val8, His37]GLP-1 (7-37 )OH, [Val8, Glu , Lys23]GLP-1 (7-37 )0H, [Val8, Glu22,Glu2]GLP-1 (7-37 )OH, 37)OH, [Val8,Gly3\Lys35]GLP-1(7-37)OH, [Val8, His37]GLP-1 (7-37)OH, [Gly8,His37]GLP-1(7-37)OH); o una substitución en la posición 7 con aminoácidos N-acilados o N-alquilados (por ejemplo, [D-His7]GLP-1 (7-37), [Tyr7]GLP-1 (7-37), [N-acetil-His7]GLP-1(7-37), [N-isopropil-His7]GLP-1 (7-37), [D-Ala8]GLP-1(7-37), [D-Glu9]GLP-1(7-37), [Asp9]GLP-1 (7-37), [D-Asp9]GLP-1(7-37), [D-Phe'10]GLP-1(7-37), [Ser22, Arg23, Arg24,Gln26]GLP-1(7-37), y [Ser8,Gln9,Tyrie,Lys18,Asp21]GLP-1(7-37)). En las Patentes Norteamericanas Nos. 5,545,618, 5,574,008, 5,981,488, 7,084,243, 7,101,843, y 7,238,670, se describen otros análogos GLP-1.
Exendina-4 y los análogos de exendina-4 también se pueden utilizar en los conjugados y polipéptidos terapéuticos de la presente invención. Los compuestos de la presente invención pueden incluir fragmentos de la secuencia de exendina-4. Exendina-4 tiene la secuencia: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Pro-Ser- NH2.
Los análogos de exendina-4 particulares incluyen los que tienen una substitución de cisteína (por ejemplo, [Cys 2]exendina-4); una substitución de Usina (por ejemplo, [Lys39]exendina-4); una substitución de leucina (por ejemplo, [Leu ,Phe25]exendina-4 amida, [Leu14, Phe25]exendina-4( 1 -28) amida, y [Leul ,Ala22,Phe25]exendina-4(1 -28) amida); o fragmentos de exendina (por ejemplo, exendina-4(1 -30), exendina-4(1 -30) amida, exendina-4( 1 -28) amida, y exendina-4(1-31)). Otros análogos de exendina se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 7,157,555, 7,220,721, y 7,223,725; y en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2007/0037747.
Leptina y Análogos de Leptina La leptina es una adipoquina, y por lo tanto el agente peptídico terapéutico puede incluir una adipoquina o un análogo de la misma. Las adipoquinas incluyen adiponectina, leptina, y resistina. Las adiponectinas incluyen adiponectina de humano, ratón, y rata. Las leptinas incluyen leptina(116-130), leptina(22-56), leptina(57-92), leptina(93-105), LY396623, metreleptina, análogo de leptina de múrido, leptina pegilada, y leptina humana de metionilo. Las resistinas incluyen resistina de humano, ratón, y rata. La leptina puede ser una secuencia disociada (por ejemplo, los aminoácidos 22 a 167 de la secuencia humana) o la proteína de longitud total. El polipéptido utilizado en la presente invención puede ser cualquiera de estos péptidos o proteínas, o puede ser substancialmente idéntico a cualquiera de estos péptidos o proteínas.
El análogo de leptina puede ser un agonista del receptor OB. En ciertas modalidades, el agonista del receptor OB es un agonista para la forma OB-Rb, el cual es el receptor predominante encontrado en el hipotálamo o la OB-R, el cual se encuentra en la barrera de sangre-cerebro y está implicado en el transporte de leptina.
Inmunoglobulinas y Fragmentos de los Mismos El agente peptídico terapéutico puede ser una inmunoglobulina (también referida como un "anticuerpo" y queda entendido en la técnica que comprende proteínas que consisten en uno o más polipéptidos substancialmente codificados por genes de inmunoglobulina). Los genes de inmunoglobulina humanos reconocidos incluyen los genes de región constante de kappa, lambda, alfa (lgA1 y lgA2), gamma (lgG1, lgG2, lgG3, lgG4), delta, epsilon, y mu, así como la infinidad genes de región variable de inmunoglobulina, y las inmunoglobulinas codificadas por dichos genes son útiles dentro de las composiciones de la presente invención. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud total (aproximadamente 25 kDa y 214 aminoácidos) son codificadas por un gen de región variable en el término-amino (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de región constante kappa o lambda en el término carboxi. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina de longitud total (aproximadamente 50 kDa y 446 aminoácidos), son codificadas en forma similar a través de un gen de región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de región constante antes mencionados, por ejemplo, gamma (que codifican aproximadamente 330 aminoácidos). Los anticuerpos o inmunoglobulinas incorporados de manera útil en las composiciones de la presente invención, pueden incluir CDRs de una fuente humana o no humana. La estructura de la inmunoglobulina puede ser humana, humanizada, o no humana, por ejemplo, una estructura de múrido modificada para disminuir la antigenicidad en humanos, o una estructura sintética, por ejemplo, una secuencia de consenso.
Tal como se observa, los fragmentos de una inmunoglobulina que enlazan específicamente una molécula biológica también pueden incluirse en las composiciones de la presente invención, y nos podemos referir a estos fragmentos como "porciones de enlace de antígeno" de un anticuerpo, ya que enlazan en forma específica o selectiva a la misma molécula biológica enlazada por la inmunoglobulina completa de la cual se derivan. Los ejemplos de porciones de enlace comprendidas dentro del término "fragmento" incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VLC, VHC, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab').sub.2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VHC y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VLC y VHC de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y asociados, Nature 341: 544 a 546 (1989)), que consiste en un dominio VHC; y (vi) una región de determinación de complementariedad aislada (CDR) que tiene una estructura suficiente para enlazar en forma específica, por ejemplo, una porción de enlace de antígeno de una región variable. Un fragmento o porción de enlace de antígeno de una región variable de cadena ligera y una parte de enlace de antígeno de una región variable, de cadena pesada, por ejemplo, los dos dominios del fragmento Fv, VLC y VHC, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, a través de un enlazador sintético que les permite ser elaborados como una cadena de proteína simple, en la cual las regiones VLC y VHC, se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como una cadena simple Fv (scFv); comprendidas dentro del término "inmunoglobulina" tal como aquí se utiliza; ver por ejemplo, las publicaciones de Bird y asociados. Science 242: 423 a 426 (1988); y Huston y asociados. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: 5879 a 5883 (1988)). Las inmunoglobulinas y los fragmentos de las mismas se pueden obtener utilizando técnicas convencionales conocidas para los expertos en la técnica, y los fragmentos se pueden clasificar para utilidad en la misma forma ya que son anticuerpos intactos. Un fragmento Fab puede resultar de la disociación de un anticuerpo tetramérico con papaína; los fragmentos Fab' y F(ab')2 pueden ser generados mediante disociación con pepsina.
También útiles en las composiciones de la presente invención son las inmunoglobulinas o anticuerpos humanos, que incluyen polipéptidos en los cuales los residuos de estructura corresponden a secuencias de línea germinal humana, y las CDRs resultan de la recombinación V(D)J y mutaciones somáticas. Sin embargo, los anticuerpos humanos también pueden comprender residuos de aminoácido no codificados en las secuencias de ácido nucleico de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro). Se ha demostrado que la mutación somática ¡n vivo de los genes variables humanos da como resultado la mutación de residuos de estructura (ver la publicación de Nat. Immunol. 2: 537, (2001 )). Dicho anticuerpo puede ser denominado "humano" debido a su fuente, a pesar de las mutaciones de estructura. Los dominios variables de anticuerpo de ratón también contienen mutaciones somáticas en los residuos de estructura (ver la publicación de Sem. Immunol. 8: 159 (1996)). Las inmunoglobulinas también pueden ser policlonales o monoclonales, y pueden ser mono, bi, o tríespecífícas. Las inmunoglobulinas pueden ser maduradas por afinidad, y cualquiera de las inmunoglobulinas incorporadas pueden haber sido aisladas (por ejemplo, purificadas hasta cierto grado de un animal o células en las cuales se producen). Los anticuerpos de cadena simple, y los anticuerpos quiméricos, humanizados o con injerto CDR, así como los anticuerpos de cadena simple quiméricos o injertados CDR, que comprenden porciones derivadas de especies diferentes, también están comprendidos en la presente invención, y el término "inmunoglobulina".
Las inmunoglobulinas incorporadas en las composiciones de la presente invención pueden incluir una etiqueta (por ejemplo, un polipéptido que sirve como una secuencia marcadora o reportera o que facilita la purificación de la secuencia de anticuerpo a la cual se adhiere). Las etiquetas adecuadas incluyen una etiqueta FLAG, una etiqueta de histidina, o una proteína fluorescente o enzimáticamente activa. Como alternativa, o en forma adicional, los anticuerpos pueden incluir una toxina.
Vectores de Transporte El conjugado puede incluir cualquier vector de transporte útil para enlazar o contener cualquier agente terapéutico (por ejemplo, tal como aquí se describe). Los vectores de transporte de la presente invención, pueden incluir cualquier composición a base de lipidos, carbohidratos, o polímero con la capacidad de transportar un agente (por ejemplo, un agente terapéutico tal como los aquí descritos). Los vectores de transporte incluyen vectores lipidos (por ejemplo, liposomas, micelas, y poliplexos) y vectores a base de polímero tales como dendrímeros. Otros vectores de transporte incluyen nanopartículas, que pueden incluir sílice, lípido, carbohidrato, u otros polímeros farmacéuticamente aceptables. Los vectores de transporte pueden proteger contra la degradación de un agente (por ejemplo, cualquiera aquí descrito), para incrementar de esta forma la vida media farmacológica y la biodisponibilidad de estos compuestos.
Los vectores lípidos pueden formarse utilizando cualquier lípido biocompatible o combinación de lípidos con la capacidad de formar vectores de lípidos (por ejemplo, liposomas, micelas, y lípoplexos). La encapsulación de un agente en un vector lípido puede proteger al agente de daño o degradación, o facilitar su entrada en una célula. Los vectores lípidos, como resultado de interacciones de carga (por ejemplo, un vector de lípido catiónico y una membrana de célula aniónica), interactúan y se fusionan con la membrana celular, para liberar de esta forma el agente dentro del citoplasma. Un liposoma es una vesícula de dos capas que comprende una o más moléculas de lípido, conjugados de polipéptido-lípido, y componentes de lípido. Un lipoplexo es un liposoma formado con moléculas de lípido catiónico para impartir una carga general positiva al liposoma. Una micela es una vesícula con una capa simple de tensoactivos o moléculas de lípidos.
Liposomas En ciertas modalidades, el vector lípido es un liposoma.
Normalmente, los lípidos utilizados tienen la capacidad de formar una bicapa y son catiónicos. Las clases de moléculas de lípidos adecuados incluyen fosfolípidos (por ejemplo, fosfotidilcolina), ácidos grasos, glucolípidos, ceramidas, glicéridos, y colesteroles, o cualquier combinación de los mismos. En forma alternativa o adicional, el vector lípido puede incluir lípidos neutrales (por ejemplo, dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE)). Otros lípidos que pueden formar vectores lípidos, son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento.
Tal como se describe en la presente invención, una "molécula de lípido" es una molécula con una porción de cabeza hidrofóbica y una porción de cola hidrofílica y puede tener la capacidad de formar liposomas. La molécula de lípido puede ser modificada opcionalmente para incluir grupos de polímero hidrofílicos. Los ejemplos de dichas moléculas de lípido incluyen 1 ,2-d¡stearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi(poli-etilénglicol)-2000] y 1 ,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[carboxi(polietilénglicol)-2000].
Los ejemplos de moléculas de lípido incluyen lípidos naturales, tal como cardiolipina (CL), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidili nositol (Pl), y serina de fosfatídilo (PS)¡ esfingolípídos, tales como esfingosina, ceramida, esfingomielina, cerebrosidas, sulfatidas, gangliosidas, y fitosfingosina; lípidos catiónicos, tales como 1 ,2-dioleoil-3-trimetilamon¡o-propano (DOTAP), 1 ,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP), bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDAB), 3-ß-[?-(?', ?'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol), bromuro de N-[1 - (2,3,-ditetradecilox¡)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxiet¡lamon¡o (DMRIE), bromuro de N-[1 -(2 , 3 , -d i o lei loxí )prop i l]-N ,N-dimetil-N-hidroxi etilamonio (DORIE), y propano de 1 ,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio (DOTMA); fosfatidilcolinas, tales como 1,2-d¡lauro¡l-sr?-glicero-3-etilfosfo colina, 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), 1 ,2-dimiristoil-S 7-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1 ,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1 ,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), y 1 -palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (POPC); fosfoetanolaminas, tales como 1,2-dibutiril-sn-glicero-3-fosfoetan ola mina, 1,2-distearoil-SA7-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), 1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DMPE), 1 ,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE), 1 ,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), y 1 ,2-dioleoil-s/?-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(glutaril); ácidos fosfatídicos, tales como 1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfato, 1,2-d¡palmitoil-sn-glicero-3-fosfato, y 1 ,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfato; fosfatidilgliceroles, tales como fosfatidilglicerol de dipalmitoilo (DMPC), 1,2-dimiristoil-sj-glicero-3-fosfo-( 1 '-rac-glicerol), y 1 ,2-dioleoil-s/7- glicero-3-fosfo-(1 '-rac-glicerol); fosfatidilserinas, tales como 1,2-dimiristoil-s/7-glicero-3-fosfo-L-serina, 1,2-dipalmitoil-s/7-glicero-3-fosfo-L-serina, y 1 ,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina; cardiolipinas, tales como 1',3'-bis[1 ,2,dimiristoil-sn-gl¡cero-S-fosfo]-sn-glicerol; y conjugados de PEG-lípido, tales como 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietiléngl¡col)-750], 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilénglicol)-2000], 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilénglicol)-5000], 1,2-distearoil-sn-gl¡cero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilénglicol)-2000], y 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[carboxi(poliet¡lénglicol)-2000].
Las composiciones de lípido comercialmente disponibles incluyen Lipofectamina™ 2000 y Lipofectina® de Invitrogen Corp.; Transfectam® y Transfast™ de Promega Corp.; NeuroPORTER™ y Escort™ de Sigma-Aldrich Co.; FuGENE® 6 de Roche; y LipoTAXI® de Strategene. Las composiciones de lípido conocidas incluyen la tecnología de Trojan Horse Lipsome, tal como se describe en la publicación de Boado, Pharm. Res. 24: 1772 a 1787 (2007).
Los liposomas también pueden incluir otros componentes que ayudan a la formación o estabilidad de liposomas. Los ejemplos de componentes incluyen colesterol, antioxidantes (por ejemplo, a-tocoferol, ß-hidroxitoluidina), tensoactivos, y sales.
Una molécula de lípido puede enlazarse a una porción de dirección a través de un enlace covalente o un enlace no covalente (por ejemplo, interacción iónica, atrapamiento o encapsulación física, enlace de hidrógeno, absorción, adsorción, fuerzas de van der Waals, o cualquier combinación de los mismos) con o sin el uso de un enlazador.
El liposoma puede ser de cualquier combinación útil que comprenda moléculas de lípidos, incluyendo conjugados de polipéptido-lípido y otros componentes que ayudan a la formación o estabilidad de liposomas. Un experto en la técnica conocerá como optimizar la combinación que favorece la encapsulación de un agente en particular, la estabilidad del liposoma, las condiciones de reacción del escalado ascendente, o cualquier otro factor pertinente. Las combinaciones de ejemplo se describen en la publicación de Boado, Pharm. Res. 24: 1772 a 1787 (2007). En un ejemplo, el liposoma comprende 93% de POPC, 3% de DDAB, 3% de distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE)-PEG2000, y 1% de DSPE-PEG2000 enlazados en forma covalente a una porción de dirección.
La producción de liposomas normalmente ocurre a través de un proceso general de dos pasos. En el primer paso, los lípidos y componentes de lípidos se mezclan en un solvente orgánico volátil o mezclas de solventes, para asegurar una mezcla de lípidos homogénea. Los ejemplos de solventes incluyen cloroformo, metanol, ciclohexano, y t-butanol. El solvente posteriormente se elimina para formar una mezcla de lípido seco en una película, polvo, o pellet. El solvente también se puede eliminar utilizando cualesquiera técnicas analíticas conocidas, tal como mediante el uso de nitrógeno, evaporación rotatoria, secado con rocío, liofilización, y secado al vacío.
En el segundo paso, la mezcla de lípido seca se hidrata con una solución acuosa para formar liposomas. El agente se puede agregar a la solución acuosa, lo cual da como resultado la formación de liposomas con un agente encapsulado. Como alternativa, los liposomas se forman primero con una primera solución acuosa y posteriormente se exponen a otra solución acuosa que contiene el agente. La encapsulación del agente puede ser promovida a través de cualquier técnica conocida, tal como mediante ciclos repetidos de congelación-descongelación, exposición a ultrasonido o mezclado. Un ejemplo adicional de este método se describe en la publicación de Boado, Pharm. Res. 24: 1772 a 1787 (2007). Como alternativa, el agente se acopla a una porción hidrofóbica (por ejemplo, colesterol) para producir un derivado lipofílíco, y el derivado lipofílíco se utiliza con otras moléculas de lípido para formar liposomas.
Durante el segundo paso, la mezcla de lípido seca puede o no contener el conjugado de polipéptido-lípido. El proceso puede incluir opcionalmente varios pasos adicionales, incluyendo calentar la solución acuosa más allá de la temperatura de transición de fase de las moléculas de lípidos, antes de agregarla a la mezcla de lípido seca, en donde los rangos de temperatura en particular incluyen de aproximadamente 40°C hasta aproximadamente 70°C; incubar la combinación de la mezcla de lípido seca y la solución acuosa, en donde los rangos de tiempo en particular incluyen de aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 2 horas; mezclar la mezcla de lípido seca y la solución acuosa durante la incubación, tal como mediante mezclado vortex, agitación, revoltura, o mezclado; la adición de nonelectrolitos a la solución acuosa para asegurar la osmolaridad fisiológica, tal como una solución de 0.9% de solución salina, 5% de dextrosa, y 10% de sacarosa; interrupción de vesículas multilamelares grandes, tal como mediante extrusión o exposición a ultrasonido; e incubación adicional de los liposomas preformados con un conjugado de polipéptido-lípido, en donde la mezcla de lípido seca no contenía moléculas de lípidos. Un experto en la técnica tendrá la capacidad de identificar la temperatura y los tiempos de incubación en particular durante este paso de hidratación, para asegurar la incorporación de la molécula de lípido derivada en los liposomas o para obtener liposomas estables.
El conjugado de polipéptido-lípido puede ser agregado en cualquier punto en el proceso de formación de liposomas. En un ejemplo, el conjugado de polipéptido-lípido se agrega a los lípidos y los componentes de lípidos durante la formación de la mezcla de lípido seca. En otro ejemplo, el conjugado de polipéptido-lípido se agrega a los liposomas que son formados previamente con una mezcla de lípido seca que contiene los lípidos y los componentes de lípidos. Aún en otro ejemplo, se forman micelas con el conjugado de polipéptido-lípido, se forman liposomas con una mezcla de lípido seca que contiene lípidos y componentes de lípidos, y posteriormente las micelas y liposomas se incuban juntas. La solución acuosa puede incluir componentes adicionales para estabilizar el agente o el liposoma, tal como amortiguadores, sales, agentes de quelación, solución salina, dextrosa, sacarosa, etc.
En un ejemplo de este procedimiento, la película seca compuesta de la mezcla de lípido se hidrata con una solución acuosa que contiene un agente. Esta mezcla se calienta primero a una temperatura de 50°C durante 30 minutos, y posteriormente se enfría a temperatura ambiente. Posteriormente, la mezcla es transferida en una película seca que contiene el conjugado de polipéptido-lípido. Posteriormente, la mezcla se incuba a una temperatura de 37°C durante dos horas para incorporar el conjugado de polipéptido-lípido en los liposomas que contienen el agente. Ver, por ejemplo, la publicación de Zhang y asociados, J. Control. Reléase 112: 229 a 239 (2006).
Poliplexos Los complejos de polímeros con agentes son llamados poliplexos. Los poliplexos normalmente consisten en polímeros catiónicos y su producción está regulada por interacciones iónicas con un agente aniónico (por ejemplo, un polinucleótido). En algunos casos, los poliplexos no pueden liberar el agente enlazado en el citoplasma. Para este fin, debe ocurrir la co-transfección con agentes líticos-endosoma (para Usar el endosoma que se elaborar durante la endocitosis), tal como un adenovirus desactivado. En ciertos casos, los polímeros, tales como polietilénimina, tienen su propio método de interrupción de endosomas, como el quitosan y trimetilquitosan. Los poliplexos se describen, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente Norteamericana Nos. 2002/0009491; 2003/0134420; y 2004/0176282.
Los poliplexos se pueden formar con cualquier polímero y copolímero aquí descrito, en donde los polímeros aniónicos o no cargados pueden ser derivados en forma adicional para incluir cadenas laterales catiónicas. Los ejemplos de cadenas laterales catiónicas son aminas, las cuales normalmente son protonadas bajo condiciones fisiológicas. Los polímeros de ejemplo que se pueden utilizar para formar poliplexos incluyen poliaminas, tales como polilisina, poliarginina, poliamidoamina, y polietilénimina.
Dendrímeros Un dendrímero es una macromolécula altamente ramificada con una forma esférica. La superficie de la partícula puede ser funcionalizada en muchas formas y muchas de las propiedades de la construcción resultante se determinan a través de su superficie. En particular, es posible construir un dendrímero catiónico (es decir, uno con una carga de superficie positiva). Cuando en la presencia de material genético tal como ADN o ARN, la complementariedad de la carga conduce a una asociación temporal del polinucleótido con el dendrímero catiónico. En el proceso de alcanzar su destino, el complejo de dendrímero-polinucleótido se toma en la célula mediante endocitosis o a través de la BBB mediante transcitosis. Los dendrímeros se describen, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,113,946 y 7,261,875.
Los dendrímeros se pueden producir a través de cualquier proceso conocido en la técnica. Bajo el método divergente, el centro del dendrímero se construye primero y se elaboran pasos sucesivos hacia afuera del centro para formar estructuras ramificadas. Bajo el método convergente, las cuñas del dendrímero (o dendrones) se construyen por separado, en donde se construyen pasos sucesivos hacia dentro desde las moléculas que cubrirán la superficie externa del dendrímero. Los diferentes dendrones pueden ser formados con los mismos o diferentes monómeros políméricos. Posteriormente, los dendrones se enlazan en forma covalente a una molécula o estructura central para formar el dendrímero. Los ejemplos adicionales de estos métodos se describen en la publicación de Svenson y asociados, Adv. Drug. Deliv. Rev. 57: 2106 a 2129 (2005).
Para dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM), el núcleo del dendrímero normalmente comprende un grupo amino. Las moléculas del núcleo de ejemplo incluyen amonia; moléculas de diamina, tales como etiléndiamina, 1 ,4-diaminobutano, 1,6-diaminohexano, 1 , 12-diaminododecano, y cistamina; y moléculas de triamina, tal como trietanolamina. En el primer paso de la reacción de adición, se utilizan monómeros poliméricos para construir el núcleo haciendo reaccionar monómeros con los grupos amino del centro para formar una molécula tetraramificada. Las reacciones de adición subsecuentes con la molécula de diamina y el monómero polimérico, se construyen en forma adicional en el dendrímero.
Los ejemplos de monómeros poliméricos que reaccionan con grupos amino incluyen metacrilato para formar dendrímeros PAMAM; y acrilonitrilo para formar dendrímeros de poli(propilénimina). Los ejemplos de dendrímeros PAMAM y reacciones sintéticas de dendrímeros se establecen en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,507,466, 5,527,524, y 5,714,166. Los ejemplos de dendrímeros PAMAM formados con un núcleo de trietanolamina se establecen en las publicaciones de Wu y asociados, Chem. Comm. 3: 313 a 315 (2005); y Zhou y asociados, Chem. Comm. 22: 2362 a 2364 (2006). La síntesis de los dendrímeros pueden incluir pasos adicionales, tal como la adición de grupos de protección a grupos activados con el objeto de prevenir las interacciones intramoleculares; y agregar un paso de desprotección para eliminar los grupos de protección.
Además de los dendrímeros PAMA , se pueden utilizar otros tipos de dendrímeros. Para dendrímeros de fósforo, el núcleo del dendrímero comprende un grupo P = 0. La molécula del núcleo de ejemplo incluye un grupo ciclotrifosfaceno y un grupo tiofosforilo. Los ejemplos de monómeros poliméricos incluyen grupos fenoximetil(metilhidrazono). Como alternativa, el dendrímero es un polímero hiperamificado con una estructura de núcleo de poliéster. Los ejemplos de dichos dendrímeros incluyen poliéster-16-hidroxilo de ácido 2,2-bis(hidroximetil)propiónico hiper- ramificado.
Los grupos de superficie externa del dendrímero pueden tener una variedad de grupos funcionales, incluyendo grupos amidoetanol, amidoetiletanolamina, amino, hexilamida, carboxilato, succinamidilo, trimetoxisililo, tris(hidroximetil)amidometano, y 3-carbometoxipirrolidinona. Además, estos grupos funcionales pueden ser tratados en forma adicional con un agente de acoplamiento para formar grupos activados (tal como aquí se define).
En un ejemplo particular, el dendrímero de poliamidoamina se conjuga a un enlazador polivalente que contiene un grupo de polímero hidrofílico: un a-malemidil^-N-hidroxisuccinimidil polietilénglicol (MW 3400). El grupo amino en la superficie del dendrímero de poliamidoamina se hace reaccionar con el grupo activado por N-hidroxisuccinimidilo terminal del enlazador. Posteriormente el dendrímero derivado se purifica, filtra, y disuelve en solución salina. Posteriormente, el grupo malemidilo terminal del dendrímero derivado se hace reaccionar con un grupo sulfhidrilo de la porción de dirección. Si el polipéptido no contiene un grupo sulfhidrilo, entonces el grupo amino presente en el polipéptido puede ser reactivado con N-succinimidil-S-acetiltioacetato o N-succinimidil-S-acetiltiopropionato para introducir un grupo sulfhidrilo protegido. Como alternativa, el polipéptido puede ser sintetizado para incluir un grupo de cisteína adicional. El agente se asocia con un dendrímero derivado incubando el agente y el dendrímero derivado en un solvente y vortizando la mezcla. Los ejemplos adicionales de estos métodos se describen en las publicaciones de Ke y asociados, J. Pharm. Sci. 97: 2208 a 2216 (2008); Huang y asociados, J. Gene Med. 11: 754 a 763 (2009); Huang y asociados, Biomaterials 29: 238 a 246 (2008); y Liu y asociados. Biomaterials 30: 4195 a 4202.
En otro ejemplo particular, el dendrímero de poliamidoamina se conjuga para un enlazador polivalente que contiene un grupo alifático: 4-sulfosuccinimidil-6-metil-a-(2-piridilditio)toluamido]hexanoato. El grupo amino en la superficie del dendrímero de poliamidoamina se hace reaccionar por el grupo activado por sulfosuccinimidilo terminal del enlazador. El dendrímero derivado posteriormente se purifica y se disuelve en solución salina. Posteriormente, el grupo piridilditio terminal del dendrímero derivado se hace reaccionar con un grupo sulfhidrilo del polipéptido. El agente se asocia con el dendrímero derivado incubando el agente y el dendrímero derivado en un solvente y vortizando la mezcla. Los ejemplos adicionales de estos métodos se describen en la publicación de Kang y asociados, Pharm. Res. 22: 2099 a 2106 (2005).
Los agentes se pueden asociar con el dendrímero derivado a través de cualquier número de métodos, tal como mediante asociaciones covalentes y no covalentes (por ejemplo, interacción iónica, atrapamiento o encapsulado físico, enlace de hidrógeno, absorción, adsorción, fuerzas de van der Waals, o cualquier combinación de las mismas).
Nanopartículas Las nanopartículas se pueden utilizar como un vector de transporte en la presente invención. Tal como se utiliza en la presente invención, una "nanopartícula" es una partícula coloidal, polimérica, o elemental que fluctúa en tamaño de aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 1000 nm. Las nanopartículas se pueden elaborar de moléculas de sílice, carbohidrato, lípido, o polímero. Las moléculas pueden ser ya sea incrustadas en la matriz de nanopartícula, o pueden ser absorbidas en su superficie. En un ejemplo, la nanopartícula puede ser elaborada de un polímero biodegradable tal como poli(butilcianoacrilato) (PBCA). Los ejemplos de nanopartículas elementales incluyen nanopartículas de carbono y nanopartículas de óxido de hierro, que posteriormente pueden recubrirse con ácido oleteo (OA)-Pluronic. En este método, un fármaco (por ejemplo, un fármaco hidrofóbico o insoluble en agua) se carga en la nanopartícula, tal como se describe en la publicación de Jain y asociados, Mol. Pharm. 2: 194 a 205 (2005). Otras nanopartículas se elaboran de sílice, e incluyen las descritas, por ejemplo, en la publicación de Burns y asociados, Nano Lett. 9: 442 a 448 (2009).
Las nanopartículas se pueden formar de cualquier polímero útil. Los ejemplos de polímeros incluyen polímeros biodegradables, tales como poli(cianoacrilato de butilo), poli(lactida), poli(glucolida), ???-?-caprolactona, poli(succinato de butileno), poli(succinato de etileno), y poli(p-dioxanona); poli(etilénglicol); poli-2-hidroxietilmetacrilato (poli(HEMA)); copolímeros, tales como poli(lactida-co-glucolida), poli(lactida)-poli(etilénglicol), poli(poli(etilénglicol)cianoacrilato-co-hexadecilcianoacrilato, y poli[ácido HEMA-co-metacrílico]; proteínas, tales como fibrinógeno, colágeno, gelatina, y elastina; y polisacáridos, tales como amilopectina, a-amilosa, y quitosan .
Las nanopartículas poliméricas se pueden producir a través de cualquier proceso útil. Utilizando el método de evaporación de solvente, el polímero y el agente se disuelven en un solvente para formar una nanoemulsión y el solvente se evapora. Se pueden utilizar sistemas de solvente y tensoactivos adecuados para obtener nanoemulsiones ya sea de aceite en agua o de agua en aceite. Este método puede incluir opcionalmente filtración, centrifugación, exposición a ultrasonido, o liofilización. Utilizando el método de nanoprecipitación, se forma una solución del polímero y un agente en el primer solvente. Posteriormente, la solución se agrega al segundo solvente que se puede mezclar con el primer solvente, pero no solubiliza el polímero. Durante la separación de fase, se forman de manera espontánea las nanopartículas. Utilizando el método de polimerización de emulsión, el monómero se dispersa en una solución acuosa para formar micelas. Los radicales iniciadores (por ejemplo, iones de hidroxilo) en la solución acuosa inician la polimerización aniónica de los monómeros. En otra variación del método de polimerización de emulsión, el agente actúa como el radical iniciador que promueve la polimerización aniónica. Por ejemplo, un agente que es un fotosensibilizador, puede iniciar la polimerización de los monómeros de cianoacrilato. Los métodos adicionales incluyen diálisis, gelatinización iónica, polimerización ¡nterfacial, y fusión de solvente con porogenos.
En un ejemplo del método de evaporación del solvente, el polímero es un copolímero de cianoacrilato que contiene un grupo de polímero hidrofílico: poli(cianoacrilato de aminopoli(etilénglicol)cianoacrilato-co-hexadecilo), que se sintetizó tal como se describe en la publicación de Stella y asociados, J. Pharm. Sci. 89: 1452 a 1464 (2000). El polímero y el agente se agregan a un solvente orgánico, en donde la mezcla se emusifica agregando una solución acuosa. Posteriormente, el solvente orgánico se evapora bajo presión reducida y las nanopartículas resultantes se lavan y se liofilizan. En el ejemplo particular del agente que es transferrina, el grupo hidroxilo terminal en la porción de carbohidrato de transferrina, se trata con periodato de sodio para formar un grupo aldehido y la transferrina oxidada se agrega a las nanopartículas. Los ejemplos adicionales de este método se describen en las publicaciones de Li y asociados, Int. J. Pharm. 259: 93 a 101 (2003); y Yu y asociados, Int. J. Pharm. 288: 361 a 368 (2005).
En un ejemplo del método de polimerización de emulsión, el monómero se agrega en forma de gotas a una solución ácida acuosa. La mezcla se agita para promover la polimerización y posteriormente se neutraliza. Posteriormente, las nanopartículas se filtran, centrifugan, se exponen a ultrasonido, y se lavan. En un ejemplo particular de este método, se proporciona el monómero del monómero de cianoacrilato de butilo y la solución acuosa también incluye dextrano en una solución acuosa diluida de ácido hidroclórico. Para introducir el agente, las nanopartículas de poli(cianoacrilato de butilo) se liofilizan y posteriormente se vuelven a suspender en solución salina. Se agregan agentes a la solución salina con las nanopartículas bajo agitación constante. Como alternativa, se agrega el agente durante el proceso de polimerización. Las nanopartículas se recubren opcionalmente con un tensoactivo, tal como polisorbato 80. Los ejemplos adicionales de este método se describen en las publicaciones de Kreuter y asociados, Brain Res. 674: 171 a 174 (1995); Kreuter y asociados, Pharm. Res. 20: 409 a 416 (2003); y Steiniger y asociados, Int. J. Cáncer 109: 759 a 767 (2004).
Otras nanopartículas incluyen nanopartículas lípidas sólidas (SLN). Los métodos de SLN se describen, por ejemplo, en la publicación de Kreuter, Capítulo 24, In V. P. Torchilin (ed), Nanopartículas como Transportadores de Fármacos, páginas. 527 a 548, Imperial College Press, 2006). Los ejemplos de moléculas de lípido para nanopartículas lípidas sólidas incluyen ácido esteárico y ácido esteárico modificado, tal como ácido esteárico-PEG 2000; lecitina de frijol de soya; y cera emulsificante. Las nanopartículas lípidas sólidas pueden incluir opcionalmente otros componentes, incluyendo tensoactivos, tales como Epicuron® 200, poloxámero 188 (Pluronic® F68), Brij 72, Brij 78, polisorbato 80 (Tween 80); y sales, tal como sodio de taurocolato. Los agentes se pueden introducir en las nanopartículas lípidas sólidas a través de un número de métodos descritos para las liposomas, en donde dichos métodos pueden incluir en forma adicional homogenización de alta presión, y dispersión de microemulsión.
En un ejemplo, las SLNs incluyen ácido esteárico, Epicuron 2000 (tensoactivo), y sodio de taurocolato cargado con un agente (por ejemplo, un agente anticáncer, tal como doxorubicina, tobramicina, idarubicina, o paclitaxel, o un derivado de paclitaxel). En otro ejemplo, las SLNs incluyen ácido esteárico, lecitina de frijol de soya, y poloxámero 188. Las SLNs también se pueden elaborar de éter 2-estearílico de polioxilo (Brij 72), o una mezcla de cera emulsificante y éter 20-estearílico de polioxilo (Brij 78) (ver, por ejemplo, la publicación de Koziara y asociados, Pharm. Res. 20: 1772 a 1778, 2003). En un ejemplo para elaborar nanopartículas lípidas sólidas, se forma una microemulsión agregando un tensoactivo (por ejemplo, Brij 78 o Tween 80) a una mezcla de cera emulsificante en agua a una temperatura de 50°C a 55°C. La cera emulsificante es un sólido de cera que se prepara a partir de alcohol cetoestearílico y contiene un derivado de polioxietileno de éster de ácido graso de sorbitan. Las nanopartículas se forman enfriando la mezcla con agitación. El agente se puede introducir agregando el agente a la mezcla calentada que contiene la cera emulsificante en agua. Los ejemplos adicionales de este método se describen en la publicación de Koziara y asociados, Pharm. Res. 20: 1772 a 1778 (2003).
Las nanopartículas también pueden incluir micelas con tamaño de nanómetro. Las micelas se pueden formar a partir de cualquiera de los polímeros aquí descritos. Los polímeros de ejemplo que forman micelas incluyen copolímeros de bloque, tales como poli(etilénglicol) y poli(e-caprolactona). En un ejemplo particular, el copolímero de bloque PEO-b-PCL se sintetiza mediante polimerización de abertura de anillo controlada de e-caprolactona, utilizando un a-metoxi-co-hidroxi-poli(etilénglicol) como un macroiniciador. Para formar micelas, los copolímeros de bloque PEO-b-PCL se disuelven en un solvente orgánico (por ejemplo, tetrahidrofurano) y posteriormente se agrega agua desionizada para formar una solución micelar. El solvente orgánico se evapora para obtener micelas con tamaño de nanómetro.
En ciertas modalidades, las propiedades de la nanopartícula se alteran recubriendo con un tensoactivo. Se puede utilizar cualquier tensoactivo biocompatible, por ejemplo, tensoactivos de polisorbato, tales como polisorbato 20, 40, 60, y 80 (Tween 80); Epicuron® 200; tensoactivos de poloxámero, tales como 188 (Pluronic® F68) poloxámero 908 y 1508; y tensoactivos Brij, tales como Brij 72 y Brij 78. En otras modalidades, el tensoactivo se adhiere en forma covalente a la nanopartícula, tal como se describe en la Publicación PCT No. WO 2008/085556. Dicho método puede reducir la toxicidad evitando que el tensoactivo se filtre fuera de la nanopartícula. Las nanopartículas pueden ser cubiertas opcionalmente con un tensoactivo.
Las nanopartículas pueden ser modificadas opcionalmente para incluir grupos de polímero hidrofílico (por ejemplo, poli(etilénglicol) o poli(propilénglicol)). La superficie de la nanopartícula puede ser modificada mediante grupos de polímero hidrofílico de adhesión en forma covalente. Como alternativa, las nanopartículas de pueden formar utilizando polímeros que contienen grupos de polímero hidrofílico, tales como cianoacrilato de pol¡[metoxi poli(etilénglicol)-cianoacrilato de co-hexadecilo]. Las nanopartículas pueden ser reticuladas en forma opcional, las cuales pueden ser para el uso particular de nanopartículas a base de proteínas.
Los agentes terapéuticos se pueden introducir a nanopartículas mediante cualquier método útil. Los agentes pueden ser incorporados en la nanopartícula en, durante o después de la formación de la nanopartícula. En un ejemplo, se agrega el agente al solvente con el polímero o monómero antes de la formación de las nanopartículas. En otro ejemplo, el agente se incorpora en nanopartículas preformadas mediante adsorción. Aún en otro ejemplo, el agente se enlaza en forma covalente a la nanopartícula. El agente puede ser adsorbido físicamente a la superficie de la nanopartícula con el paso opcional de recubrir en forma adicional la nanopartícula con un tensoactivo. Los ejemplos de tensoactivos incluyen polisorbato 80 (Tween 80). Los ejemplos adicionales de este método se describen en la publicación de Kreuter, Trasportadores Nanoparticulares para Suministro de Fármacos al Cerebro, Capítulo 24, en Torchilin (ed.), Nanoparticulados como Transportadores de Fármaco (2006), Imperial College Press. Métodos de Suministro a Base de Carbohidratos Los polímeros a base de carbohidratos, tal como quitosan, se pueden utilizar como un vector de transporte, por ejemplo, en la formación de micelas o nanopartículas. Ya que los polímeros de quitosan pueden ser anfifílicos, estos polímeros son especialmente útiles en el suministro de agentes hidrofóbicos (por ejemplo, los aquí descritos). Los polímeros de quitosan de ejemplo incluyen quitosan de glicol de palmitoilo de amonio cuaternario, que se pueden sintetizar tal como se describe en la publicación de Qu y asociados, Biomacromoléculas 7: 3452 a 3459, 2006.
Métodos Híbridos Algunos métodos híbridos combinan dos o más técnicas, y pueden ser útiles para administrar los conjugados de la presente invención a una célula, tejido, u órgano de un sujeto. Los virosomas, por ejemplo, combinan liposomas con un virus inactivado. Esta combinación tiene una transferencia de gen más eficiente en las células epiteliales respiratorias que cualquiera métodos virales o liposomales solos. Otros métodos implican mezclar otros vectores virales con lípidos catiónicos o virus de hibridación.
Porciones de Dirección Multimérica, Conjugados, y Polipéptidos Terapéuticos Los compuestos de la presente invención también comprenden formas multiméricas (por ejemplo, diméricas o triméricas) de las porciones de dirección, conjugados, y polipéptidos terapéuticos aquí descritos. Las porciones de dirección se unen a través de un enlace químico ya sea directamente (por ejemplo, un enlace covalente tal como disulfuro o un enlace de péptido) o indirectamente (por ejemplo, a través de un enlazador tal como los aquí descritos). Las porciones de dirección multiméricas, conjugados, y polipéptidos terapéuticos de ejemplo se describen a continuación. Cualquier enlazador aquí descrito puede ser utilizado para porciones de dirección multiméricas, conjugados, y polipéptidos terapéuticos (por ejemplo, enlazadores polivalentes).
Porciones de Dirección Multiméricas En ciertas modalidades, la porción de dirección multimérica es un dímero que tiene la fórmula: A1-X-A2, en donde A1 y A2 cada una son independientemente, una porción de dirección (por ejemplo, cualquier porción de dirección aquí descrita) y X es un enlazador. El enlazador puede ser cualquier enlazador aquí descrito. En modalidades particulares, el enlazador contiene una porción de maleimido y enlaza a una cisteína presente en el vector de péptido (por ejemplo, un vector de péptido al cual se ha agregado un residuo de cisteína N-terminal o C-terminal).
En otras modalidades, la porción de dirección multimérica tiene o incluye una fórmula seleccionada del grupo que consiste en: en donde A1, A2, A3, Am, y cada Ap, son independientemente, una porción de dirección (por ejemplo, cualquier porción de dirección aquí descrita); X, X1, y cada Xp, son independientemente, un enlazador (por ejemplo, cualquier enlazador aquí descrito) que une juntas dos porciones de dirección; n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; m es n + 2; y p es un entero de 2 a n + 1. En modalidades particulares, n es 1, y el compuesto tiene la fórmula: Las porciones de dirección multiméricas de orden superior también se pueden describir a través de la fórmula: en donde A1, A2, cada Aq, cada Ar, y cada As, son independientemente, porciones de dirección (por ejemplo, cualquiera de las aquí descritas); A3 es una porción de dirección o está ausente; X, cada Xq, cada Xr, y cada Xs, son independientemente, enlazadores que unen porciones de dirección; m, n, y p, cada uno son independientemente, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; q es un entero de 4 a m + 3; r es un entero de m + 4 a m + n + 3; y s es un entero de m + n + 4 a m + n + p + 3.
En algunas modalidades, las porciones de dirección multiméricas incluyen cualquiera de las modificaciones o conjugaciones adicionales aquí descritas para polipéptidos (por ejemplo, procesamiento postraducción o mediante modificación química, incluyendo ubiquitinación, pegilación, acetilación, acilación, ciclaje, amidación, oxidación, sulfación, formación de cisteína, o adhesión covalente de uno o más agentes terapéuticos).
Conjugados Multiméricos El agente terapéutico o vector de transporte se puede unir a una o más porciones de dirección multiméricas unidas (por ejemplo, mediante un enlace covalente) para formar un conjugado multimérico o un polipéptido terapéutico.
Los compuestos que incluyen un agente terapéutico y una porción de dirección dimérica se pueden conjugar ya sea a través de la parte de la porción de dirección de la molécula o a través de la parte del enlazador de la molécula. Los compuestos de la presente invención en los cuales se une el agente (por ejemplo, a través de un enlazador en donde el enlazador es un enlazador químico, péptido, o un enlace covalente, tal como un enlace de péptido) a la porción de dirección se pueden representar a través de la fórmula: en donde A1 y A2 cada una son independientemente, porciones de dirección (por ejemplo, cualquiera de las aquí descritas); X es un enlazador (por ejemplo, enlazador químico, péptido, o enlace covalente) que une A1 y A2; B1 es un agente terapéutico o vector de transporte; e Y es un enlazador que une B1 y A1.
En ciertas modalidades, dos o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10) agentes terapéuticos o vectores de transporte se unen a una o ambas de las porciones de dirección. Los compuestos pueden ser representados a través de la fórmula: en donde A1, A2, y X son tal como se definió; m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; p es un entero de 1 a m; q es un entero de m + 1 a m + n; cada Bp y cada Bq, son independientemente, un agente terapéutico o vector de transporte (por ejemplo, cualquiera aquí descrito); y cada Yp y cada Yq, son independientemente, un enlazador que une cada Bp o cada Bq a A1 o A2, respectivamente.
En otras modalidades, el agente terapéutico o vector de transporte se une (por ejemplo, a través de un enlace covalente o un enlazador químico tal como los aquí descritos) al dimero a través del enlazador que une las porciones de dirección que forman el dimero. Los compuestos pueden tener la fórmula: en donde A1 y A2, son porciones de dirección (por ejemplo, cualquiera aquí descrita); B es un agente terapéutico o vector de transporte; y X es un enlazador que une a A1, A2, y B.
En otras modalidades, el agente terapéutico o vector de transporte se puede unir tanto al enlazador como a la porción de dirección. Los compuestos pueden ser representados por la fórmula: en donde A1 y A2, son independientemente, porciones de dirección; Bz es un agente o está ausente; m es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; p es un entero de 1 a m; q es un entero de m + 1 a m + n; cada Bp y Bq, es independientemente, un agente terapéutico o vector de transporte (por ejemplo, cualquiera aquí descrito); y cada Yp y Yq, es independientemente, un enlazador que une cada Bp o cada Bq a A1 o A2, respectivamente, en donde al menos uno (por ejemplo, al menos dos) de lo siguiente es cierto (i) B1 está presente; (ii) m es al menos 1; y (iii) n es al menos 1.
Los compuestos de la presente invención también pueden incluir una porción de dirección trimérica. Cuando la porción de dirección trimérica se une a un agente simple a través de una de las porciones de dirección, el compuesto puede tener una de las siguientes fórmulas: en donde A1, A2, y A3, cada uno son independientemente, una porción de dirección (por ejemplo, cualquiera aquí descrita); X1 y X2 son enlazadores; B1 es un agente terapéutico o vector de transporte; e Y es un enlazador que une B a una porción de dirección (por ejemplo, A1, A2, y A3) o al enlazador X1.
En otras modalidades, la porción de dirección trimérica se conjuga para uno o más de un agente terapéutico o un vector de transporte. La conjugación puede ser a través ya sea de la porción de dirección, o a través del enlazador(s). Los compuestos pueden incluir una de las siguientes fórmulas: en donde A1, A2, y A3 son porciones de dirección; n, m, y j son 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; cada Bp, cada Bq, y cada Br, son independientemente, agentes terapéuticos o vectores de transporte (por ejemplo, cualquiera aquí descrito); Bz y By, son independientemente, agentes terapéuticos o vectores de transporte o están ausentes; X1 es un enlazador que une A1, A2, y Bz, si está presente; X2 es un enlazador que une A2, A3, y By, si está presente. En ciertas modalidades, al menos uno de n, m, o j es al menos uno, Bz está presente, o By está presente. En otras modalidades, al menos dos (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, o 30) de Bp, Bq, Br, By, y Bz están presentes.
Los compuestos de la presente invención también pueden incluir multímeros de porción de dirección de un orden superior (por ejemplo, cuatrómeros, pentómeros, etc.). Dichos multimeros pueden ser descritos a través de la fórmula: en donde A1, A2, cada Aq, cada Ar, y cada As, son independientemente, porciones de dirección; A3 es una porción de dirección o está ausente; X, cada Xq, Xr y Xs, son independientemente, enlazadores que unen porciones de dirección; m, n, y p, cada una son independientemente, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; q es un entero de 4 a m + 3; r es un entero de m + 4 a m + n + 3; y s es un entero de m + n + 4 a m + n + p + 3. Uno o más agentes se pueden unir a cualquier enlazador (X, cualquier Xq, Xr, o Xs) o las porciones de dirección (A1, A2, A3, cada Aq, cada Ar, y cada As) de esta fórmula, con el objeto de formar conjugados de multímero de orden superior.
Polipéptidos Terapéuticos Multiméricos Los polipéptidos terapéuticos multiméricos también están comprendidos en la presente invención. En una modalidad, el polipéptido terapéutico multimérico está en la forma de una proteína de fusión. La proteína de fusión puede contener 2, 3, 4, 5, o más porciones de dirección, ya sea unidas directamente a través de un enlace de péptido, o a través de enlazadores de péptido. En un ejemplo, los dímeros de la proteína de fusión se describen a través de la fórmula: A1-X-A2 en donde A1 y A2, son independientemente, una porción de dirección (por ejemplo, cualquiera aquí descrita) y X es cualquier (a) un enlace de péptido que une A1 y A2 o (b) uno o más aminoácidos unidos a A1 y A2 mediante enlaces de péptido. En ciertas modalidades, el enlazador de péptido es un aminoácido simple (por ejemplo, un aminoácido que ocurre naturalmente), un enlazador flexible, un enlazador rígido, o un enlazador alfa-helicoidal. Los enlazadores de péptido de ejemplo que se pueden utilizar en la presente invención se describen en la sección titulada "Aminoácido y enlazadores de péptido" que se encuentra más adelante. En ciertas modalidades, A1 y A2 son la misma porción de dirección.
Los multímeros de proteína de fusión pueden describirse a través de la fórmula: A1-(Xn-Am)n en donde n es o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; m es un entero de 2 a n + 1; A1 y cada Am, son independientemente, una porción de dirección (por ejemplo, cualquiera aquí descrita); y cada Xn, es independientemente, ya sea (a) una porción de dirección que une A1 y A2 o (b) uno o más aminoácidos unidos a la porción de dirección adyacente (A1 o An) mediante enlaces de péptido.
Las porciones de dirección que forman el multímero, en ciertas modalidades, cada una puede tener menos de 50, 40, 35, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, o 6 aminoácidos de longitud. La proteina de fusión puede tener menos de 1,000, 500, 250, 150, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, o 35 aminoácidos de longitud. Polipéptidos Modificados Las porciones de dirección, los agentes peptídicos terapéuticos, y los polipéptidos terapéuticos utilizados en la presente invención, pueden tener una secuencia de aminoácido modificada. En ciertas modalidades, la modificación no destruye significativamente una actividad biológica deseada (por ejemplo, la capacidad de atravesar la BBB o actividad agonista). La modificación puede reducir (por ejemplo, al menos el 5%, 10%, 20%, 25%, 35%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, o 95%), o puede no tener efecto, o puede incrementar (por ejemplo, en al menos el 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 500%, o 1000%) la actividad biológica del polipéptido original. El péptido o polipéptido modificado pueden tener o pueden optimizar una característica de un polipéptido, tal como la estabilidad, biodisponibilidad, toxicidad, actividad inmunológica, identidad inmunológica, y propiedades de conjugación in vivo.
Las modificaciones incluyen las que son mediante procesos naturales, tal como procesamiento de postraducción, o mediante técnicas de modificación química conocidas en el arte.
Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier parte en un polipéptido incluyendo el esqueleto de polipéptido, las cadenas laterales de aminoácido y el término amino- o carboxi. El mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o diversos grados en diversos sitios en un polipéptido determinado, y un polipéptido puede contener más de un tipo de modificación. Los polipéptidos pueden ser ramificados como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados, y cíclicos ramificados pueden resultar de los procesos naturales de posttraducción o pueden elaborarse en forma sintética. Otras modificaciones incluyen pegilación, acetilación, acilación, adición de un grupo acetomidometilo (Acm), ADP-ribosilación, alquilación, amidación, biotinilación, carbamoilación, carboxietilación, esterificación, adhesión covalente a flavina, adhesión covalente a una porción heme, adhesión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, adhesión covalente de fármaco, adhesión covalente de un marcador (por ejemplo, fluorescente o radioactivo), adhesión covalente de un lípido o derivado de lípido, adhesión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclaje, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de ancla GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición transmitida por trasferencia de A N de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación.
Un polipéptido modificado también puede incluir una inserción, eliminación o substitución de aminoácido, ya sea en forma conservadora o no conservadora (por ejemplo, D-aminoácidos, desaminoácidos) en la secuencia de polipéptido (por ejemplo, en donde los cambios no alternan substancialmente la actividad biológica del polipéptido). En particular, la adición de uno o más residuos de cisteína al término amino o carboxi de cualquiera de los polipéptidos de la presente invención puede facilitar la conjugación de estos polipéptidos, por ejemplo, mediante enlace de disulfuro. Por ejemplo, P1 tiene un residuo de cisteína en el N-término. Las substituciones de aminoácido pueden ser conservadoras (es decir, en donde un residuo se reemplaza por otro del mismo tipo o grupo general) o no conservadoras (es decir, en donde un residuo se reemplaza por un aminoácido de otro tipo). Además, se puede substituir un aminoácido que no ocurre naturalmente por un aminoácido que ocurre naturalmente (es decir, substitución de aminoácidos conservadora que no ocurre naturalmente o una substitución de aminoácido no conservadora que no ocurre naturalmente).
Los polipéptidos elaborados en forma sintética pueden incluir substituciones de aminoácidos no codificados naturalmente por ADN (por ejemplo, aminoácido no natural o que no ocurre naturalmente). Los ejemplos de aminoácidos que no ocurren naturalmente incluyen D-aminoácidos, un aminoácido que tiene un grupo acetilaminometilo adherido a un átomo de azufre de una cisteína, un aminoácido pegilado, los aminoácidos omega de la fórmula NH2(CH2)nCOOH en donde n es 2-6, aminoácidos no polares neutrales, tales como sarcosina, t-butil alanina, t-butil glicina, N-metil isoleucina y norleucina. La fenilglicina puede substituir para Trp, Tyr, o Phe; citrulina y sulfóxido de metionina son no polares neutrales, el ácido cisteico es ácido, y la ornitina es básica. La prolina puede ser substituida con hidroxiprolina y retener las propiedades que confieren la conformación.
Los análogos se pueden generar mediante mutagénesis de substitución y retener la actividad biológica del polipéptido original. Los ejemplos de substituciones identificadas como "substituciones conservadoras" se muestran en la Tabla 1. Si dichas substituciones dan como resultado un cambio no deseado, entonces se introducen otros tipos de substituciones, denominadas "substituciones de ejemplo" en la Tabla 1, o tal como se describe en forma adicional con referencia a las clases de aminoácido, y se clasifican los productos.
Derivados de Polipéptido y Peptidom iméticos Además de los polipéptidos que consisten en aminoácidos que ocurren naturalmente, los peptidomiméticos o análogos de polipéptido también están comprendidos en la presente invención, y pueden formar la porción de dirección o los agentes de péptido/polipéptido utilizados en los compuestos de la presente invención. Los análogos de polipéptido son comúnmente utilizados en la industria farmacéutica como fármacos sin péptido con propiedades análogas a los del polipéptido de plantilla. Los compuestos sin péptido son denominados "miméticos de péptido" o peptidomiméticos (Fauchere y asociados, Infecí. Immun. 54: 283 a 287 (1986) y Evans y asociados, J. Med. Chem. 30: 1229 a 1239 (1987)). Los miméticos de péptido que están estructuralmente relacionados con péptidos o polipéptidos terapéuticamente útiles pueden ser utilizados para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente o incrementado. Generalmente, los peptidomiméticos son similares en estructura al polipéptido de paradigma (por ejemplo, un polipéptido que tiene una actividad biológica o farmacológica) tal como polipéptidos de enlace de receptor que ocurren naturalmente, pero tienen una o más ligaduras de péptido opcionalmente reemplazadas por ligaduras tales como -CH2NH-, -CH2S- -CH2-CH2- -CH = CH- (cis y trans), -CH2SO-, -CH(OH)CH2-, -COCH2-, etc., a través de métodos bien conocidos en la técnica (Spatola, Modificaciones de Esqueleto de Péptido, Vega Data, 1: 267, 1983; Spatola y asociados, Life Sci. 38: 1243 a 1249, 1986; Hudson y asociados, Int. J. Pept.
Res. 14: 177 a 185, 1979; y Weinstein, 1983, Química y Bioquímica, de Aminoácidos, Péptidos y Proteínas, Weinstein eds, Marcel Dekker, Nueva York). Dichos miméticos de polipéptido pueden tener ventajas significativas con respecto a polipéptidos que ocurren naturalmente incluyendo una producción más económica, mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas incrementadas (por ejemplo, vida media, absorción, potencia, y eficacia), antigenicidad reducida, y otras.
Aunque las porciones de dirección aquí descritas pueden atravesar eficientemente la BBB o dirigirse a tipos de células en particular (por ejemplo, las aquí descritas), su efectividad puede ser reducida por la presencia de proteasas. De igual manera, la efectividad de los agentes de péptido/polipéptido utilizados en la presente invención, puede ser reducida en forma similar. Las proteasas de suero tienen requerimientos de substrato específico, incluyendo L-aminoácidos y enlaces de péptido para disociación. Además, las exopeptidasas, que representan el componente más prominente de la actividad de proteasa en suero, normalmente actúan en el primer enlace de péptido del polipéptido y requieren N-término libre (Powell y asociados, Pharm. Res. 10: 1268 a 1273, (1993)). A la luz de esto, con frecuencia es conveniente utilizar versiones de polipéptidos modificados. Los polipéptidos modificados retienen las características estructurales de los polipéptidos de L- aminoácido originales, aunque convenientemente no son fácilmente susceptibles a disociación mediante proteasa y/o exopeptidasas.
La substitución sistemática de uno o más aminoácidos de la secuencia de consenso con D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, un enantiómero; D-lisina en lugar de L-lisina) se puede utilizar para generar polipéptidos más estables. Por lo tanto, un derivado de polipéptido o peptidomimético tal como aquí se describe puede ser polipéptidos completos L-, completos D-, o D, L mezclados. La presencia de un D-aminoácido N-terminal o C-terminal incrementa la estabilidad in vivo de un polipéptido debido a que las peptidasas no pueden utilizar un D-aminoácido como substrato (Powell y asociados, Pharm. Res. 10: 1268 a 1273 (1993)). Los polipéptidos inversos-D son polipéptidos que contienen D-aminoácidos, organizados en una secuencia inversa relativa a un polipéptido que contiene L-aminoácidos. Por lo tanto, el residuo C-terminal de un polipéptido L-aminoácido se vuelve N-terminal para el polipéptido D-aminoácido, y así sucesivamente. Los polipéptidos-D inversos retienen la misma conformación terciaria y por consiguiente la misma actividad, que los polipéptidos de L-aminoácidos, aunque son más estables a degradación enzimática in vitro e in vivo, y por lo tanto tienen mayor eficacia terapéutica que el polipéptido original (Brady y Dodson, Nature 368: 692 a 693, 1994, y Jameson y asociados. Nature 368: 744 a 746 (1994)). Además de los polipéptidos-D inversos, los polipéptidos restringidos que incluyen una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso substancialmente idéntica, se pueden generar a través de los métodos bien conocidos en la técnica (Rizo y asociados, Ann. Rev. Biochem, 61: 387 a 418, (1992)). Por ejemplo, los polipéptidos restringidos pueden ser generados agregando residuos de cisteína con la capacidad de formar puentes de disulfuro, y de esta forma, obtener como resultado un polipéptido cíclico. Los polipéptidos cíclicos no tienen un N-o C-término libre. Por consiguiente, no son susceptibles a proteólisis mediante exopeptidasas, aunque por supuesto, son susceptibles a endopeptidasas, que no se disocian en un término de polipéptido. Las secuencias de aminoácido de los polipéptidos con D-aminoácidos N-terminal o C-terminal y los polipéptidos cíclicos son normalmente idénticos a las secuencias de los polipéptidos a los cuales corresponden, excepto por la presencia del residuo del D-aminoácido N-terminal o C-terminal, o su estructura circular, respectivamente.
Un derivado cíclico que contiene un enlace de disulfuro intramolecular puede ser preparado mediante síntesis de fase sólida convencional, incorporando al mismo tiempo residuos de cisteína u homocisteína protegidos-S adecuados en las posiciones seleccionadas para ciclaje, tal como el término amino y carboxi (Sah y asociados, J. Pharm. Pharmacol . 48: 197 (1996)). Al término del ensamble de la cadena, se puede llevar a cabo el ciclaje ya sea (1) mediante eliminación selectiva del grupo de protección-S con una oxidación en el soporte consecuente de las dos funciones SH libres correspondientes, para formar enlaces S-S, seguido de eliminación convencional del producto a partir del soporte, y el procedimiento de purificación adecuado o (2) mediante eliminación del polipéptido del soporte junto con la desprotección completa de la cadena lateral, seguido de oxidación de las funciones-SH libres en una solución acuosa altamente diluida.
El derivado cíclico que contiene un enlace de amida intramolecular se puede preparar mediante síntesis de fase sólida convencional, incorporando al mismo tiempo derivados de aminoácido protegido de cadena lateral amino y carboxi adecuadas, en la posición seleccionada para ciclaje. Los derivados cíclicos que contienen enlaces -S-alquilo intramoleculares se pueden preparar mediante química de fase sólida convencional, incorporando al mismo tiempo un residuo de aminoácido con una cadena lateral protegida con amino adecuada, y un residuo de cisteína y homocisteína protegido-S adecuado en la posición seleccionada para ciclaje.
Otro método efectivo para conferir resistencia a peptidasas que actúan en los residuos N-terminal o C-terminal de un polipéptido, es agregar grupos químicos en el término polipéptido, de modo que el polipéptido modificado ya no sea un substrato para la peptidasa. Una modificación química es glucosilación de los polipéptidos en cualquiera o ambos de los términos. Ciertas modificaciones químicas, en particular glucosilación N-terminal, han mostrado incrementar la estabilidad de polipéptidos en suero humano (Powell y asociados, Pharm. Res. 10: 1268 a 1273 (1993)). Otras modificaciones químicas que incrementan la estabilidad de suero incluyen, pero no se limitan a, la adición de un grupo alquilo N-terminal, que consiste en un alquilo inferior de uno a veinte carbonos, tal como un grupo acetilo, y/o la adición de una amida o grupo amida substituido C-terminal. En particular, la presente invención incluye polipéptidos modificados que consisten en polipéptidos que contienen un grupo acetilo N-terminal y/o un grupo amida C-terminal.
También se incluyen en la presente invención otros tipos de derivados de potipéptido que contienen porciones químicas adicionales que normalmente no son parte del polipéptido, siempre que el derivado retenga la actividad funcional deseada del polipéptido. Los ejemplos de dichos derivados incluyen (1) derivados N-acilo del grupo amino terminal o de otro grupo amino libre, en donde el grupo acilo puede ser un grupo alcanoilo (por ejemplo, acetilo, hexanoilo, octanoilo), un grupo aroilo (por ejemplo, benzoilo) o un grupo de bloqueo tal como F-moc (fluorenilmetil-O-CO-); (2) ésteres de la termina carboxi o de otro grupo carboxi o hidroxilo libre; (3) amida del carboxi- terminal o de otro grupo carboxi libre producido mediante la reacción con amonia o con una amina adecuada; (4) derivados fosforilados; (5) derivados conjugados para un anticuerpo u otro ligando biológico y otros tipos de derivados.
Las secuencias de polipéptido más largas que resultan de la adición de residuos de aminoácido adicionales a los polipéptidos aquí descritos, también están comprendidas en la presente invención. Se puede esperar que dichas secuencias de polipéptido más largas tengan la misma actividad y especificidad biológica (por ejemplo, tropismo celular) que los polipéptidos descritos anteriormente. Aunque los polipéptidos que tienen un número substancial de aminoácidos adicionales no están excluidos, se reconoce que algunos polipéptidos grandes pueden asumir una configuración que cubre la secuencia efectiva, evitando de esta forma el enlace a un objetivo (por ejemplo, un miembro de la familia del receptor LRP tal como LRP o LRP2). Estos derivados pueden actuar como antagonistas competitivos. Por lo tanto, aunque la presente invención comprende polipéptidos o derivados de los polipéptidos aquí descritos que tienen una extensión, en forma conveniente la extensión no destruye la actividad de dirección celular de los polipéptidos o sus derivados.
Otros derivados incluidos en la presente invención son polipéptidos duales que consisten en dos de los mismos, o dos diferentes polipéptidos, tal como aquí se describe, enlazados en forma covalente a otro ya sea directamente o a través de un espaciador, tal como a través de un estiramiento corto de residuos de alanina o mediante un sitio putativo para proteólisis (por ejemplo, mediante catepsina, ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,126,249 y la Patente Europea No. 495 049).
La presente invención también comprende derivados de polipéptido que son proteínas quiméricas o de fusión que contienen un polipéptido aquí descrito, o un fragmento del mismo, enlazado en su extremo amino- o carboxi-terminal, o ambos, a una secuencia de aminoácido de una proteína diferente. Dicha proteína quimérica o de fusión puede ser producida mediante expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica la proteína. Por ejemplo, una proteína quimérica o de fusión puede contener al menos 7 aminoácidos compartidos con uno de los polipéptidos descritos, lo cual da como resultado en forma conveniente una proteína quimérica o de fusión que tiene una actividad funcional equivalente o mayor.
Ensayos para Identificar Peptidomiméticos Tal como se describió anteriormente, los compuestos sin peptidilo generados para replicar la geometría del esqueleto y el despliegue de farmacóforo (peptidomiméticos) de los polipéptidos aquí descritos, con frecuencia poseen atributos de mayor estabilidad metabólica, mayor potencia, mayor duración de acción, y mejor biodisponibilidad.
Se pueden obtener compuestos peptidomiméticos utilizando cualquiera de numerosos métodos en métodos de biblioteca de combinación conocidos en la técnica, incluyendo bibliotecas biológicas, bibliotecas de fase de solución o fase sólida paralela dirigibles, métodos de biblioteca sintética que requieren desconvolución, el método de biblioteca de "un gránulo un compuesto", y los métodos de biblioteca sintética que utilizan selección de cromatografía por afinidad. El método de biblioteca biológica se limita a bibliotecas de péptido, aunque son aplicables otros cuatro métodos para bibliotecas de compuestos de péptido, oligómero sin péptido, o de molécula pequeña (Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145 (1997)). En la técnica se pueden encontrar ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares, por ejemplo, en las publicaciones de: DeWitt y asociados. (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 6909 (1993)); Erb y asociados. (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91: 11422 (1994)); Zuckermann y asociados. (J. Med. Chem. 37: 2678 (1994)); Cho y asociados. (Science 261: 1303 (1993)); Carell y asociados. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059 (1994) e ibid 2061); y en Gallop y asociados. (Med. Chem. 37: 1233 (1994)). Las bibliotecas de compuestos se pueden presentar en solución (por ejemplo, Houghten, Biotechniques 13: 412 a 421 (1992)) o en gránuios (Lam, Nature 354: 82 a 84 (1991 )), chips (Fodor, Nature 364: 555 a 556 (1993)), bacterias o esporas (Patente Norteamericana No. 5,223,409), plásmidos (Culi y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89: 1865 a 1869 (1992)) o en fago (Scott and Smith, Science 249: 386 a 390 (1990)), o luciferasa, y la etiqueta enzimática detectada mediante determinación de conversión de un substrato adecuado para el producto.
Una vez que se identifica un poiipéptido tal como aquí se describe, se puede aislar y purificar a través de cualquier número de métodos estándar incluyendo pero sin limitarse a solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación), centrifugación, cromatografía (por ejemplo, afinidad, intercambio de iones y exclusión por tamaño) o mediante cualquiera otras técnicas estándar utilizadas para purificación de péptidos, peptidomiméticos o proteínas. Las propiedades funcionales de un poiipéptido identificado de interés, se pueden evaluar utilizando cualquier ensayo funcional conocido en la técnica. En forma deseable, se utilizan ensayos para evaluar la función de receptor de corriente descendente en la señalización intracelular (por ejemplo, proliferación celular).
Por ejemplo, los compuestos peptidomiméticos de la presente invención pueden obtenerse utilizando los siguientes procesos de tres fases: (1) exploración de los polipéptidos aquí descritos para identificar regiones de una estructura secundaria necesaria para dirigir los tipos de células particulares aquí descritos; (2) utilizar substitutos de dipéptido restringidos en forma conformacional para refinar la geometría del esqueleto y proporcionar plataformas orgánicas que correspondan a estos substitutos; y (3) utilizar las mejores plataformas orgánicas para desplegar farmacoforos orgánicos en bibliotecas de candidatos diseñados para mimetizar la actividad deseada del polipéptido nativo. Con más detalle, las tres fases son como se indica. En la fase 1, los polipéptidos candidatos principales se exploran y su estructura se abreviada para identificar los requerimientos para su actividad. Se sintetiza una serie de análogos de polipéptido del original. En la fase 2, se investigan los mejores análogos de polipéptido utilizando los substitutos de dipéptido restringidos en forma conformacional. Se utilizan aminoácidos de indolizidin-2-ona, indolizidin-9-ona y quinolizidinona (l2aa, l9aa y Qaa respectivamente) como plataformas para estudiar la geometría del esqueleto de los mejores candidatos de péptido. Estas plataformas y las relacionadas (revisadas en las Publicaciones de Halab ef al., Biopolimers 55: 101-122 (2000) y Hanessian et al., Tetrahedron 53: 12789-12854 (1997)) se pueden introducir en regiones específicas del polipéptido para orientar los farmacoforos en diferentes direcciones. La evaluación biológica de estos análogos identifica polipéptidos principales mejorados que mimetizan los requerimientos geométricos para actividad. En la fase 3, las plataformas de los polipéptidos principales más activos se utilizan para desplegar sustitutos orgánicos de los farmacoforos responsables de la actividad del péptido nativo. Los farmacoforos o andamios se combinan en un formato de síntesis paralela. La derivación de polipéptidos y las fases anteriores se puede lograr a través de otros medios utilizando métodos conocidos en la técnica.
Se pueden utilizar relaciones de función de estructura determinadas a partir de los polipéptidos, derivados de polipéptido, peptidomiméticos u otras moléculas pequeñas aquí descritas, para retinar y preparar estructuras moleculares análogas que tienen propiedades similares o mejores. Por consiguiente, los compuestos de la presente invención también incluyen moléculas que comparte la estructura, polaridad, características de carga y propiedades de cadena lateral de los polipéptidos aquí descritos.
En síntesis, con base en la descripción aquí presentada, los expertos en la técnica pueden desarrollar ensayos de clasificación de péptidos y peptidomiméticos que son útiles para identificar compuestos para dirigir un agente a tipos de células particulares (por ejemplo, los aquí descritos). Los ensayos de la presente invención se pueden desarrollar para formatos de clasificación de bajo rendimiento, alto rendimiento o rendimiento ultraalto. Los ensayos de la presente invención incluyen ensayos adaptables para automatización.
Enfermedades y condiciones Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar para tratar una variedad de enfermedades y condiciones. Debido a que los compuestos de la presente invención tienen la capacidad de cruzar la BBB o ingresar a tipos de células particulares (por ejemplo, hígado, ojos, pulmón, riñon, bazo, músculo u ovario), se pueden incrementar los tratamientos de trastornos neurológicos, incluyendo trastornos neurodegenerativos y cáncer, y tratamientos de trastornos relacionados con tipos de células particulares, utilizando conjugados o polipéptidos terapéuticos de la presente invención.
Suministro a tipos de células objetivo y tejidos objetivo particulares Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar para suministrar agentes terapéuticos o vectores de transporte a diversos órganos y tejidos (por ejemplo, hígado, ojo, pulmón, riñon, bazo, músculo u ovario). De acuerdo con la presente invención, la porción de dirección puede promover la acumulación de un agente terapéutico en un tejido tal como por ejemplo un hígado (tejido de hígado), un ojo (tejido de ojo), los pulmones (tejido de pulmón), un riñon (tejido de riñon), un bazo (tejido de bazo), músculo (tejido de músculo) y ovario (tejido de ovario) de un sujeto. Por consiguiente, los compuestos se pueden utilizar para tratar una enfermedad asociada con estos tejidos (por ejemplo, cáncer, tal como cualquiera aquí descritos; una infección, tal como una infección bacteriana o infección viral; o una condición inflamatoria.
Las enfermedades de hígado de ejemplo incluyen abscesos de hígado por amibas, cirrosis, coccidioidomicosis diseminado, colestasis inducida por fármacos, hemocromatosis, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, carcinoma hepatoceluiar, cáncer de hígado, enfermedad de hígado debido a alcohol, cirrosis biliar primaria, abscesos de hígado pirogénicos, síndrome de Reye, colangitis esclerosante y enfermedad de Wilson. Los abscesos de hígado por amibas pueden ser tratados mediante la administración de una porción terapéutica conjugada para metronidazol . La Hepatitis B se puede tratar, por ejemplo, mediante administración de una porción terapéutica conjugada para interferón alfa, lamivudina, dipivoxil de adefovir, entecavir, u otro agente antiviral. La Hepatitis C se puede tratar por ejemplo, mediante la administración de una porción terapéutica conjugada para un interferón pegilado o ribavirina, o una combinación de los mismos. Las enfermedades de pulmón de ejemplo incluyen cánceres de pulmón tal como carcinoma de célula pequeña (por ejemplo, cáncer de oat-cell), carcinoma de célula grande/célula pequeña mezclada, carcinoma de célula pequeña combinada y tumores metastáticos. Los tumores metastáticos se pueden originar de cáncer de cualquier tejido, incluyendo cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, sarcoma, cáncer de vejiga, neuroblastoma y tumor de Wilm. Las enfermedades de bazo de ejemplo incluyen cánceres, tales como linfoma, linfoma de no Hodgkin y ciertos linfomas de célula T.
Las porciones de elección aquí descritas, tienen la capacidad de dirigir agentes terapéuticos o vectores de transporte a un tipo de célula particular (por ejemplo, los aquí descritos). Debido a que los conjugados de la presente invención transportan agentes terapéuticos o vectores de transporte a tejidos específicos, los conjugados pueden dar como resultado menor toxicidad (por ejemplo, menos efectos secundarios), mayor eficacia (por ejemplo, debido a que el agente se concentra en un tejido objetivo debido a la captación incrementada o eflujo disminuido del tejido o células o debido a que el agente tiene mayor estabilidad cuando se conjuga), o una combinación de los mismos. Dichas actividades se describen más adelante en la Publicación Internacional No. WO 2007/009229, la cual está incorporada a la presente invención como referencia. Por consiguiente, la presente invención también presenta un método para tratar un sujeto que tiene una enfermedad o condición (por ejemplo, cualquier enfermedad o condición asociada con un tejido objetivo, tal como cáncer), mediante la administración al sujeto de un conjugado o una composición incluyendo un conjugado de la presente invención, en donde el conjugado incluye un agente terapéutico en una dosis inferior (por ejemplo, del 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% menor) que la dosis del agente terapéutico solo.
Terapia de cáncer Los compuestos de la presente invención, incluyendo agentes anticáncer se pueden utilizar para tratar cualquier enfermedad del cerebro o del sistema nervioso central (por ejemplo, cáncer de cerebro tal como glioblastoma, astrocitoma, glioma, meduloblastoma y oligodendroma, neuroglioma, ependimoma y meningioma). Los compuestos de la presente invención (por ejemplo, P1 a P6) se pueden utilizar para transportar al hígado, ojo, pulmón, riñon, bazo, músculo u ovario o se pueden utilizar también, junto con un agente terapéutico adecuado, para tratar una enfermedad asociada con estos tejidos (por ejemplo, un cáncer tal como carcinoma hepatocelular, cáncer de hígado, carcinoma de célula pequeña (por ejemplo, cáncer de oat-cell), carcinoma de célula grande/célula pequeña mezclado, carcinoma de célula pequeña combinada y tumores metastáticos). Los tumores metastáticos se pueden originar de cáncer de cualquier tejido, incluyendo cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, sarcoma, cáncer de vejiga, neuroblastoma, tumor de Wilm, linfoma, linfoma de no Hodgkin y ciertos linfomas de célula T). Los cánceres de ejemplo adicionales que se pueden tratar utilizando una composición de la presente invención incluyen carcinoma hepatocelular, cáncer de seno, cánceres de la cabeza y cuello incluyendo diversos linfomas tal como linfoma de célula de manto, linfoma de no Hodgkin, adenoma, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de laringe, cánceres de la retina, cánceres del esófago, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer uterino, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pulmón (incluyendo carcinoma de pulmón de célula no pequeña), cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, carcinoma nasofaríngeo, liposarcoma, carcinoma epitelial, carcinoma de célula renal, adenocarcinoma de vesícula, adenocarcinoma de paratiroides, sarcoma endometrial, cánceres resistentes a fármacos múltiples; y enfermedades y condiciones proliferativas tales como neovascularización asociada con angiogenesis de tumor, degeneración macular (por ejemplo, AMD húmeda/seca), neovascularización de córnea, retinopatía diabética, glaucoma neovascular, degeneración de miopía y otras enfermedades y condiciones proliferativas tal como restenosis y enfermedad de riñon poliquística. Los cánceres de cerebro que se pueden tratar con el vector que se transporta de manera eficiente a través de la BBB, incluyen glioma, glioma mezclado, glioma multiforme, astrocitoma, astrocitoma poliquístico, tumor neuroepitelial disembrioplásico, oligodendroglioma, ependimoma, oligoastrocitoma, meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma, germinoma y teratoma.
Terapia a Base de Neurotensina Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar en cualquier aplicación terapéutica adecuada, en donde es benéfica la actividad de neurotensina. En cerebro, la NT está asociada con receptores dopaminérgicos y otros sistemas neurotransmisores. La NT periférica actúa como un péptido parácrino o endocrino en sistemas tanto digestivos como cardiovasculares. Se han sugerido para neurotensina varias aplicaciones terapéuticas, incluyendo trastornos psiquiátricos, trastornos metabólicos y dolor. Debido a que neurotensina ha mostrado modular la neurotransmisión en áreas del cerebro asociadas con esquizofrenia, neurotensina y agonistas de receptor de neurotensina, ha sido propuesta como agentes antipsicóticos.
Debido a que los polipéptidos aquí descritos tienen la capacidad de transportar un agente a través de la BBB, los compuestos de la presente invención también son útiles para el tratamiento de enfermedades neurológicas, tal como enfermedades neurodegenerativas y otras condiciones del sistema nervioso central (CNS), sistema nervioso periférico o el sistema nervioso autónomo (por ejemplo, en donde las neuronas se pierden o deterioraran). La neurotensina ha sido sugerida como terapia antipsicótica, y por lo tanto puede ser útil en el tratamiento de enfermedades tales como esquizofrenia y trastorno bipolar. Muchas enfermedades neurodegenerativas están caracterizadas por ataxia (es decir movimientos musculares no coordinados) y/o pérdida de memoria. Las enfermedades neurodegenerativas incluyen enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS; por ejemplo, enfermedad de Lou Gehrig), telangiectasia de ataxia, enfermedad de Batten (enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten), encefalopatía espongiforme de bovino (BSE), enfermedad de Canavan, síndrome de Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Huntington, demencia asociada con VIH, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, demencia de cuerpo de Lewy, enfermedad de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelar tipo 3), esclerosis múltiple, atrofia del sistema múltiple, narcolepsia, neuroborreliosis, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedad de prion, enfermedad de Refsum, enfermedad de Schilder (por ejemplo, adrenoleucolistrofia), esquizofrenia, ataxia espinocerebelar, atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele-Richardson, Olszewski y tabes dorsalis.
Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar para reducir la temperatura del cuerpo de un sujeto. Debido a la reducción en la temperatura corporal ha mostrado ser benéfica en sujetos que pueden padecer de, o que recientemente han padecido de ataque, isquemia cerebral, isquemia cardíaca o lesión nerviosa, tal como lesión de médula espinal, el tratamiento por consiguiente puede ser útil para reducir complicaciones de estas condiciones.
La neurotensina también es conocida por tener efectos analgésicos. Por lo tanto los compuestos de la presente invención se pueden utilizar para reducir dolor en un sujeto. El sujeto puede padecer de un dolor agudo (por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en dolor mecánico, dolor caliente, dolor frío, dolor isquémico y dolor inducido por químicos). Otros tipos de dolor incluyen dolor neuropático periférico o central, dolor inflamatorio, dolor relacionado con migraña, dolor relacionado con dolor de cabeza, dolor relacionado con síndrome del intestino irritable, dolor relacionado con fibromialgia, dolor artrítico, dolor esquelético, dolor de articulación, dolor gastrointestinal, dolor muscular, dolor de angina, dolor facial, dolor pélvico, claudicación, dolor postoperatorio, dolor pos traumático, dolor de cabeza tipo tensión, dolor obstétrico, dolor ginecológico o dolor inducido por quimioterapia.
Existe la evidencia que la neurotensina se puede utilizar para tratar trastornos metabólicos; ver por ejemplo la Solicitud de Patente Norteamericana No. 2001/0046956. Por lo tanto, los compuestos de la presente invención pueden utilizarse para tratar los trastornos. Los trastornos metabólicos pueden ser diabetes (por ejemplo, Tipo I o Tipo II), obesidad, diabetes como consecuencia de obesidad, hiperglicemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistencia a insulina, tolerancia a glucosa dañada (IGT), dislipidemia diabética, hiperlipidemia, enfermedad cardiovascular, o hipertensión. El sujeto puede tener sobrepeso, ser obeso o bulímico.
La neurotensina también ha sido sugerida por tener la capacidad de tratar la adicción a fármacos o reducir el abuso de fármacos en sujetos, particularmente con psicoestimulantes. Por lo tanto los compuestos de la presente invención, pueden ser útiles para tratar la adicción a o abuso de fármacos tales como anfetamina, metanfetamina, 3,4-metilenodioximetanfetamina, nicotina, cocaína, metilfenidato y arecolina.
Terapia a base de GDNF/BNDF Se pueden utilizar compuestos a base de GDNF o BNDF para tratar cualquier enfermedad o condición en donde es benéfico el incremento de la supervivencia neuronal (por ejemplo, disminución de rango de muerte neuronal) o el incremento del rango de formación neuronal. Dichas condiciones incluyen trastornos neurodegenerativos, por ejemplo un trastorno seleccionado del grupo que consiste en un trastorno de expansión de poliglutamina (por ejemplo, enfermedad de Huntington (HD), atrofia dentatorubropalidoluisiana, enfermedad de Kennedy (también referida como atrofia muscular espinobulbar) y ataxia espinocerebelar (por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3 (también referida como enfermedad de Machado-Joseph), tipo 6, tipo 7 y tipo 17)), otro trastorno de expansión de repetición de trinucleótido (por ejemplo, síndrome X frágil, retardo mental XE frágil, ataxia de Friedreich, distrofia miatónica, ataxia espinocerebelar tipo 8 y ataxia espinocerebelar tipo 12), enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), telangiectasia de ataxia, enfermedad de Batten (también referida como enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten), enfermedad de Canavan, síndrome Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, ataque de isquemia, enfermedad de Krabbe, demencia por cuerpo de Lewy, esclerosis múltiple, atrofia del sistema múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder, lesión de médula espinal, atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski y Tabes dorsalis. Otras condiciones incluyen lesión (por ejemplo, lesión de médula espinal), conmoción, ataque isquémico y ataque hemorrágico.
Terapia a base de GLP-1 Los compuestos de la presente invención, incluyen un agonista GLP-1 se puede utilizar en cualquier aplicación terapéutica en donde la actividad de agonista GLP-1 en el cerebro, o en un tejido en particular, es recomendable. La actividad de agonista GLP-1 se asocia con estimulación de secreción de insulina (es decir para actuar como una hormona de incretina) e inhibición de secreción de glucagon, para contribuir de esta forma a limitar las excursiones de glucosa postprandiales. Los agonistas GLP-1 también pueden inhibir la motilidad y secreción gastrointestinal, actuando de esta forma como una enterogastrona y parte del mecanismo de "freno ¡leal". GLP-1 también parece ser un regulador psicológico de apetito e ingesta de alimentos. Debido a estas acciones, los agonistas de receptor GLP-1 y GLP-1 se pueden utilizar para terapia de trastornos metabólicos, tal como se revisa en la Publicación de Kinzig et al., J. Neurosci. 23:6163-6170 (2003). Dichos trastornos incluyen obesidad, hiperglicemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistencia a insulina, IGT, dislipidemia diabética, hiperlipidemia, una enfermedad cardiovascular e hipertensión.
GLP-1 también tiene efectos neurológicos incluyendo efectos sedantes o anti-ansiolíticos, tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,846,937. Por lo tanto, los agonistas GLP-1 se pueden utilizar en el tratamiento de ansiedad, agresión, psicosis, convulsiones, ataques de pánico, histeria, o trastornos de sueño. Los agonistas GLP-1 también se pueden utilizar para tratar enfermedad de Alzheimer, ya que los agonistas GLP-1 han mostrado proteger las neuronas contra apoptosis inducida por glutamato y péptido amiloide-ß (Perry et al., Curr. Alzheimer Res. 2:377-85 (2005)).
Otros usos terapéuticos para agonistas GLP-1 incluyen mejorar el aprendizaje, incrementar la neuroprotección y aliviar un síntoma de una enfermedad o trastorno del sistema nervioso central, por ejemplo a través de la modulación de neurogenesis, y por ejemplo enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, ALS, ataque, ADD, y síndromes neuropsiquiátricos (Patente Norteamericana No. 6,969,702 y Solicitud de Patente Norteamericana No. 2002/0115605). La estimulación de la neurogenesis utilizando agonistas GLP-1, ha sido descrita por ejemplo en la Publicación de Bertilsson et al., J. Neurosci. Res. 86:326-338 (2008).
Aún otros usos terapéuticos incluyen cubrir las células progenitoras/madre del hígado en células pancreáticas funcionales (Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2005/0053588); prevenir el deterioro de célula beta (Patente Norteamericana Nos. 7,259,233 y 6,569,832) y estimulación de proliferación de célula beta (Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2003/0224983); tratar obesidad (Patente Norteamericana No. 7,211,557); suprimir apetito e inducir saciedad (Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2003/0232754); tratar síndrome de intestino irritable (Patente Norteamericana No. 6,348,447); reducir la morbididad y/o mortalidad asociada con infarto del miocardio (Patente Norteamericana No. 6,747,006) y ataque (Publicación PCT No. WO 00/16797); tratar síndrome coronario agudo caracterizado por ausencia de infarto del miocardio de onda Q (Patente Norteamericana No. 7,056,887); atenuar cambios catabólicos post-quirúrgicos (Patente Norteamericana No. 6,006,753); tratar hibernación de miocardio o cardiomiopatía diabética (Patente Norteamericana No. 6,894,024); suprimir niveles de norepinefrina en sangre de plasma (Patente Norteamericana No. 6,894,024); incrementar excreción de sodio urinaria, disminuir concentración de potasio urinaria (Patente Norteamericana No. 6,703,359); tratar condiciones o trastornos asociados con hipervolemia tóxica, por ejemplo, falla renal, falla cardíaca congestiva, síndrome nefrótico, cirrosis, edema pulmonar e hipertensión (Patente Norteamericana No. 6,703,359); inducir una respuesta inotrópica e incrementar la contractilidad cardíaca (Patente Norteamericana No. 6,703,359); tratar síndrome de ovario poliquístico (Patente Norteamericana No. 7,105,489); tratar incomodidad respiratoria (Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2004/0235726); mejorar la nutrición mediante una ruta no alimenticia, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular, peritoneal u otra inyección o infusión (Patente Norteamericana No. 6,852,690); tratar nefropatía (Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2004/0209803); tratar disfunción sistólica ventricular izquierda, por ejemplo, con fracción de eyección ventricular izquierda anormal (Patente Norteamericana No. 7,192,922); inhibir la motilidad antro-duodenal, por ejemplo, para el tratamiento o prevención de trastornos gastrointestinales tales como diarrea, síndrome de bajada postoperatorio y síndrome de intestino irritable, y como un premedicamento en procedimientos endoscópicos (Patente Norteamericana No. 6,579,851 ); tratar polineuropatía de enfermedad crítica (CIPN) y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) (Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2003/0199445); modular niveles de triglicéridos y tratar dislipídemia (Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana Nos. 2003/0036504 y 2003/0143183); tratar lesión de tejido de órganos originada por reperfusión de flujo de sangre después de isquemia (Patente Norteamericana No. 6,284,725); tratar síndrome de factor de riesgo de enfermedad cardíaca coronaria (CHDRF) (Patente Norteamericana No. 6,528,520); y otros.
Terapia a Base de Leptina Los compuestos de la presente invención que incluyen leptina o una molécula relacionada, se pueden utilizar para tratar trastornos metabóiicos, trastornos neurológícos, así como otras indicaciones.
En ciertas modalidades, el compuesto de la presente invención se utiliza para tratar un trastorno metabólico. Los trastornos incluyen diabetes, obesidad, hiperglicemia, dislipídemia, hipertrigliceridemia, síndrome X, resistencia a insulina, IGT, dislipidemia diabética, hiperlipidemia, una enfermedad cardiovascular e hipertensión. La leptina disminuye la ingesta de alimentos y por lo tanto se puede utilizar para reducir peso o para tratar enfermedades en donde es benéfica una ingesta reducida de alimentos o pérdida de peso.
Administración y Dosificación La presente invención también presenta composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido terapéutico o un conjugado de la presente invención. La composición se puede formular para utilizarse en una variedad de sistemas de suministro de fármacos. También se pueden incluir en la composición para una formulación adecuada, uno o más excipientes o transportadores fisiológicamente aceptables. Las formulaciones adecuadas para utilizarse en la presente invención, se encuentran en la Publicación de Ciencias Farmacéuticas de Remington Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, edición 17, 1985. Para una breve revisión de los métodos para suministro de fármacos, ver por ejemplo la Publicación de Langer (Science 249: 1527-1533, 1990).
Las composiciones farmacéuticas están proyectadas para administración parenteral, intranasal, tópica, oral o local, tal como mediante un medio transdérmico, para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en forma parenteral (por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea) o mediante ingestión oral, o mediante aplicación tópica o inyección intraarticular en áreas afectadas por la condición vascular o de cáncer. Las rutas de administración adicionales incluyen intravascular, intra-arterial, intratumor, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural, así como nasal, oftálmica, intraescleral, intraorbital, rectal, tópica o administración por inhalación en aerosol. La administración de liberación sostenida también está incluida específicamente en la presente invención, a través de un medio tal como inyecciones de depósito o implantes o componentes erosionables. Por lo tanto la presente invención proporciona composiciones para administración parenteral que incluyen los agentes mencionados anteriormente disueltos o suspendidos en un transportador aceptable, preferentemente un transportador acuoso por ejemplo agua, agua amortiguada, solución salina, PBS y similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas, tal como agentes de ajuste y amortiguación de pH, agentes de ajuste de tonicidad, agentes de humectación, detergentes y similares. La presente invención también proporciona composiciones para el suministro oral, lo cual puede contener ingredientes inertes tales como enlazadores o rellenadores para la formulación de una tableta, una cápsula o similares. Además, la presente invención proporciona composiciones para la administración local, que pueden contener ingredientes inertes tales como solventes o emulsificantes para la formulación de una crema, un ungüento y similares.
Estas composiciones pueden ser esterilizadas mediante técnicas de esterilización convencionales, o pueden ser filtradas estériles. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser empacadas para utilizarse como están, o liofilizarse, siendo combinada la preparación liofilizada con un transportador acuoso estéril antes de la administración. El pH de las preparaciones normalmente será de entre 3 y 11, más preferentemente entre 5 y 9 o entre 6 y 8, y lo más preferentemente entre 7 y 8, tal como 7 a 7.5. Las composiciones resultantes en forma sólida pueden ser empacadas en unidades de dosificación simple múltiple, en donde cada una contiene una cantidad fija del agente o agentes mencionados anteriormente, tal como en un empaque sellado de tabletas o cápsulas. La composición en forma sólida, también puede ser empacada en un contenedor para una cantidad flexible, tal como en un tubo exprimible diseñado para una crema o ungüento que se aplica en forma tópica.
Las composiciones que contienen una cantidad efectiva se pueden administrar para tratamientos profilácticos o terapéuticos. En aplicaciones profilácticas, las composiciones se pueden administrar a un sujeto con una predisposición clínicamente determinada o con susceptibilidad incrementada a una enfermedad neurológica o neurodegenerativa. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar al sujeto (por ejemplo un humano) en una cantidad suficiente para retardar, reducir o preferentemente prevenir la generación de la enfermedad clínica. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un sujeto (por ejemplo un humano) que ya padece de la enfermedad (por ejemplo, una condición neurológica o enfermedad neurodegenerativa) en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los síntomas de la condición y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr este propósito se define como una "cantidad terapéuticamente efectiva", una cantidad de un compuesto suficiente para mejorar sustancialmente ciertos síntomas asociados con una enfermedad o una condición médica. Por ejemplo, en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo las aquí descritas), podría ser terapéuticamente efectivo un agente o compuesto que disminuye, previene, retarda, suprime o detiene cualquier síntoma de la enfermedad o condición. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente o compuesto no es requerida para curar una enfermedad o condición, pero proporcionará un tratamiento para una enfermedad o condición, de modo que se retarde, obstaculice o evite el desarrollo de la enfermedad o condición, o se disminuyan los síntomas de la enfermedad o condición, o se cambie el término de la enfermedad o condición, por ejemplo, sea menos severa o se acelere la recuperación de un individuo.
Las cantidades efectivas para este uso, pueden depender de la severidad de la enfermedad o condición, y el peso y estado general del sujeto, aunque generalmente fluctúan de aproximadamente 0.05 pg a aproximadamente 1000 pg (por ejemplo, 0.05 pg a 100 pg) de una cantidad equivalente del agente por dosis por sujeto. Los regímenes adecuados para administración inicial y administraciones de refuerzo son tipificados a través de una administración inicial seguida de dosis repetidas en uno o más intervalos por hora, por día, por semana o por mes a través de una administración subsecuente. La cantidad efectiva total de un agente presente en las composiciones de la presente invención, se puede administrar un mamífero como una dosis simple, ya sea como un bolo o mediante infusión durante un período de tiempo relativamente corto, o se pueden administrar utilizando un protocolo de tratamiento fraccionado, en donde se administran múltiples dosis durante un período de tiempo más prolongado (por ejemplo, una dosis cada 4 a 6, 8 a 12, 14 a 16, o 18 a 24 horas, o cada 2 a 4 días, 1 a 2 semanas, una vez al mes). Como alternativa, las infusiones intravenosas continuas suficientes para mantener concentraciones terapéuticamente efectivas en la sangre están contempladas. La cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes presentes dentro de las composiciones de la presente invención y utilizadas en los métodos de la presente invención aplicadas a mamíferos (por ejemplo humanos) puede ser determinada por un experto en la técnica con consideración de las diferencias individuales en edad, peso y la condición del mamífero. Debido a que ciertos compuestos de la presente invención exhiben una capacidad incrementada de cruzar la BBB, la dosificación de los compuestos de la presente invención puede ser menor a (por ejemplo, menor o igual a aproximadamente a 90%, 75%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, o 0.1% de) la dosis equivalente a la requerida para un efecto terapéutico de un agente no conjugado. Los agentes de la presente invención se administran a un sujeto (por ejemplo un mamífero, tal como un humano) en una cantidad efectiva, la cual es una cantidad que produce un resultado deseado en un sujeto tratado (por ejemplo, conservación de neuronas, nuevo crecimiento neuronal). Las cantidades terapéuticamente efectivas también se pueden determinar en forma empírica a través de los expertos en la técnica.
El sujeto también recibe un agente dentro del rango de una dosis equivalente de aproximadamente 0.05 a 1,000 µg, en comparación con un agente no conjugado por dosis en una o más veces a la semana (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 o más veces por semana), 0.1 a 2,500 por ejemplo, 2,000, 1,500, 1,000, 500, 100, 10, 1, 0.5 o 0.1) µg de dosis por semana. Un sujeto también puede recibir un agente de la composición dentro del rango de 0.1 a 3,000 pg por dosis una vez cada dos semanas o tres semanas.
Las administraciones simples o múltiples de las composiciones de la presente invención, incluyendo una cantidad efectiva, se pueden llevar a cabo con niveles y un patrón de dosificación que se seleccionan a través del médico tratante. El programa de dosis y administración se puede determinar y ajustar con base en la severidad de la enfermedad o condición en el sujeto, lo cual se puede monitorear a lo largo del curso de tratamiento de acuerdo con los métodos comúnmente llevados a cabo por los especialistas o los aquí descritos.
Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar en combinación con cualquiera métodos de tratamiento o terapia convencionales, o se pueden desear por separado de los métodos de tratamiento o terapia convencionales.
Cuando los compuestos de la presente invención se administran en terapias de combinación con otros agentes, se pueden administrar en secuencias o en forma concurrente a un individuo. Como alternativa, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden estar comprendidas de una combinación de un compuesto de la presente invención en asociación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como aquí se describe, y otro agente terapéutico o profiláctico conocido en la técnica.
Conjugación adicional En las composiciones y métodos de la presente invención, el conjugado o polipéptido terapéutico puede estar enlazado en forma adicional a otro agente, tal como un agente terapéutico, una etiqueta detectable o cualquier otro agente aquí descrito. El conjugado puede ser etiquetado con una etiqueta detectable tal como un agente de generación de radioimagen, tal como los que emiten radiación, para detección de una enfermedad o condición. En otras modalidades, el transportador o derivado funcional del mismo de la presente invención o mezclas del mismo, pueden enlazarse a un agente terapéutico para tratar una enfermedad o condición, o pueden enlazarse o etiquetarse con mezclas de los mismos. El tratamiento se puede efectuar administrando un conjugado de la presente invención que ha sido conjugado en forma adicional para un compuesto terapéutico a un individuo bajo condiciones que permiten el transporte del agente a través de la BBB o a otras células o tejidos, tratamiento es benéfico.
Un agente terapéutico aquí utilizado puede ser un fármaco, una medicina, un agente que emite radiación, una toxina celular (por ejemplo, un agente quimioterapéutico) y/o un fragmento biológicamente activo del mismo, y/o mezclas de los mismos para permitir el exterminio celular o puede ser un agente para tratar, curar, aliviar, mejorar, disminuir o inhibir una enfermedad o condición en un individuo tratado. Un agente terapéutico puede ser un producto sintético o un producto de un microorganismo fúngico, bacteriano u otro, tal como micoplasma, viral, etc., animal, tal como réptil, o de origen de plantas. Un agente terapéutico y/o fragmento biológicamente activo del mismo, puede ser un agente enzimáticamente activo y/o fragmento del mismo, o puede actuar inhibiendo o bloqueando una trayectoria celular importante y/o esencial o compitiendo con un componente celular que ocurre naturalmente importante y/o esencial.
Las modificaciones covalentes de los compuestos, conjugados y composiciones de la presente invención, están incluidas dentro del alcance de la presente invención. Se puede preparar en forma conveniente un derivado químico mediante síntesis química directa, utilizando métodos conocidos en el arte. Las modificaciones pueden ser por ejemplo, introducidas en un polipéptido, agente o conjugado, haciendo reaccionar residuos de aminoácido dirigidos con un agente de derivación orgánica que tiene la capacidad de reaccionar con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados. Un derivado de vector de transporte puede tener la capacidad, por ejemplo, de atravesar la BBB y de adherirse a, o conjugarse con otro agente, para transportar de esta forma el agente a través de la BBB. El conjugado de la presente invención puede unirse (es decir conjugarse) sin limitación, a través de grupos sulfhidrilo, grupos amino (aminas) y/o carbohidratos a etiquetas detectables o agentes terapéuticos adecuados. Los reticuladores homobifuncionales y heterobifuncionales (agentes de conjugación) están disponibles en muchas fuentes comerciales. Las regiones disponibles para reticulación se pueden encontrar en los transportadores de la presente invención. El reticulador puede comprender un brazo flexible, tal como por ejemplo, un brazo corto (cadena de > 2 carbonos), un brazo de tamaño medio (de cadena de 2 a 5 carbonos), o un brazo largo (cadenas de 3 a 6 carbonos). Los reticuladores de ejemplo incluyen BS3 ([Bis(sulfosuccinimidil)suberato]; BS3 es un éster de N-hidroxisuccinimida homobifuncional que dirige las aminas primarias accesibles), NHS/EDC (N-hidroxisuccinimida y N-etil-'(dimetilaminopropil)carbodimida; NHS/EDC permite la conjugación de grupos amina primarios con grupos carboxilo), sulfo-EMCS ([ácido N-e-Maleimidocaproico]; sulfo-EMCS son grupos reactivos heterobifuncionales (maleimida y éster NHS) que son reactivos hacia grupos sulfhidrilo y amino), hidrazida (la mayor parte de las proteínas contienen carbohidratos expuestos y la hidrazida es un reactivo útil para el enlace de grupos carboxilo a aminas primarias) y SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato; SATA es reactivo hacia aminas y agrega grupos sulfhidrilo protegidos).
Ejemplo 1 Síntesis de análogos más cortos de Angiopep-2-Cys (P1 a P6) Se llevó a cabo SPPS (Síntesis de péptido de fase sólida) en un sintetizador de péptido Protein Technologies, Inc. Symphony® utilizando protección de término Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonil)amino. Se sintetizaron Angiopeps más cortos en una escala de 100 pmoles utilizando un exceso de 5 veces de Fmoc-aminoácidos (200 mM) relativos a la resina. El péptido crudo fue precipitado utilizando éter enfriado con hielo, y purificado mediante cromatografía RP-HPLC (Waters Delta Prep 4000). El acetonitrilo se evaporó de las fracciones recolectadas y se liofilizó para producir un sólido blanco puro (pureza >95 %). La masa se confirmó mediante ESI-TOF MS (Bruker Daltonics). La tabla 4 proporciona las secuencias de Angiopep-2-Cys (AN2-Cys) y diversos análogos más cortos a P6).
Tabla 4. Análogos más cortos de Angiopep-2-Cys (Pa a Péptido N Hidrofilicidad Mw Secuencia (AA) promedio AN2Cys-NH2 20 + 3 0.2 2403.6 TFFYGGSRG KRNNFK TEEYC-NH2 P1 18 + 3 0.4 2155.4 FYGGSRG KRNNFK TEEYC-NH2 P2 16 + 3 0.8 1845.0 GGSRG KRNNFK TEEYC-NH2 P3 14 + 3 0.9 1730.9 SRG KRNNFK TEEYC-NH2 P4 12 + 2 0.8 1487.7 G KRNNFK TEEYC-NH2 P5 11 + 2 0.8 1430.6 KRNNFK TEEYC-NH2 P6 8 + 4 0.5 1071.3 KRNNFK YC-NH2 Ejemplo 2 Transporte de análogos más cortos P1 y P5 Para confirmar que los análogos más cortos P1 y P5 atraviesan la BBB, se llevó a cabo perfusión de cerebro in situ utilizando métodos estándar en la técnica. Se midió el transporte inicial como una función de tiempo. Los resultados indican que la captación del cerebro de P1 y P5 es similar o superior a la de Angiopep-2 (An2) (figura 1). También se llevó a cabo la reducción de capilaridad para cuantificar la cantidad de análogo encontrado en la parénquima cerebral (figura 1). Se encontraron niveles de P5 similares o superiores en la parénquima cerebral, cuando se comparó con An2 y P1. Además, estos resultados indican que los análogos atrapados en los capilares cerebrales. En forma general, nuestros resultados demuestran que los nuevos análogos P1 y P5 más cortos atraviesan de manera efectiva la BBB.
Ejemplo 3 Caracterización de derivados de neurotensina de P5 y P6 Llevamos a cabo experimentos para probar si los análogos más cortos tuvieron la capacidad de inducir analgesia o hipotermia sostenida en ratones, en comparación con ANG2002 (neurotensina modificada (NT) conjugada para Angiopep-2 a través de un enlazador EMCS que tiene la estructura: pELYEN PR PYIL— OH AN2Cys-NH2. conjugados probados incluyeron P5-NT que tiene la secuencia KRNNFKTEEYC-pELYENKPRRPYIL y P6-NT que tiene la secuencia KRNNFKYC-pELYENKPRRPYIL, en donde P5 y P6 ambos son conjugados en la lisina de NT a través de un enlazador EMCS y pE denota un ácido piro-L-glutámico.
Para determinar la inducción de analgesia, probamos la latencia entre la exposición a una plantilla caliente y el comportamiento de lamido de pata en ratones de control y en ratones que reciben ANG2002, P5-NT y P6-NT en una dosis de neurotensina equivalente. Por lo tanto, los ratones que recibieron ya sea una inyección intravenosa de bolo 20 mg/kg de ANG2002, una inyección intravenosa de bolo 16 mg/kg de P5-NT, o una inyección intravenosa de bolo 14 mg/kg de P6-NT. Todos los conjugados probados incrementaron la latencia del comportamiento de lamido de pata 15 minutos después de la inyección, lo que indica que ANG2002, P5-NT y P6-NT pueden actuar como un analgésico (figura 2).
Llevamos a cabo experimentos adicionales para probar si los análogos más cortos tuvieron la capacidad de inducir hipotermia sostenida en ratones, en comparación con ANG2002.
Los ratones recibieron una inyección intravenosa de bolo 20 mg/kg de ANG2002, una inyección intravenosa de bolo 16 mg/kg de P5-NT, o una inyección intravenosa de bolo 14 mg/kg de P6-NT. La temperatura del cuerpo continuó disminuyendo después de la inyección, por lo tanto, ANG2002, P5-NT y P6-NT tuvieron actividad comparable en inducir hipotermia (figura 3).
Ejemplo 4 Formulaciones orales de ejemplo de análogos más cortos que tienen D-isómeros Las formulaciones orales se pueden elaborar teniendo Angoipep-2 y análogos más cortos del mismo. Los análogos más cortos se prepararon determinando los sitios de disociación de pepsina y tripsina y sustituyendo aminoácidos particulares con sus D-isómeros correspondientes. La figura 4 muestra sitios de disociación anticipados para Angiopep-2 (es decir, C-terminal de las posiciones 1, 2, 3, 4, 14, 18 y 19 para pepsina y posiciones 8, 10, 11 y 15 para tripsina) y P6a (es decir, C-terminal de posición 6 para tripsina).
La estabilidad de las formulaciones orales (por ejemplo 1 mg/mL de péptido Angiopep) se determinó en la presencia de 1 mg/25 mL de pepsina (diluido 41 veces, pH = 1.4), una enzima presente en fluido gástrico a una temperatura de 37°C. La tabla 5 proporciona la vida media (ti 2) para la degradación de varios péptidos Angiopep.
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Tabla 5 Estabilidad de formulaciones orales de péptidos Angiopep Generalmente, la vida media incrementó para análogos que tienen D-isómeros en comparación con análogos que tienen todos los L-isómeros de los mismos residuos de aminoácido. En particular, un análogo acortado que tiene sustituciones de D-aminoácido (que corresponden a las posiciones 10, 11 y 14 de An2) proporcionó un polipéptido que tiene una vida media de > 18 horas y únicamente un sitio de disociación para tripsina (ver P6a en la tabla 5 y la figura 4). En general, nuestros resultados demuestran que los nuevos análogos más cortos que tienen D-isómeros generalmente son más estables contra degradación.
Ejemplo 5 Caracterización in vitro de derivados de neurotensina de análogos que tienen D-isómeros Llevamos a cabo experimentos para probar si los conjugados más cortos que tienen D-isómeros tuvieron la capacidad de enlazar en forma competitiva el receptor de neurotensina en un ensayo de célula de adenocarcinoma de colon humano (HT29) con [3H]-neurotensina . Los conjugados probados incluyeron ANG2002, P5a-NT, P6-NT y P6a-NT, en donde las secuencias para P5a, P6 y P6a se proporcionan en la tabla 5. Para estos conjugados, "NT" es pELYENKPRRPYIL, en donde pE indica ácido piro-L-glutámico, y P5a, P6 y P6a se conjugan en la lisina de NT mediante un enlazador EMCS.
P5a-NT y P6a-NT incluyeron tres sustituciones de D-aminoácido, tal como se muestra en la tabla 6. Los resultados indican que P5a, P6 y P6a son más potentes que Angiopep-2 (por ejemplo, como ANG2002) (figura 5 y tabla 6). En particular, P6a-NT que tiene tres sustituciones de D-aminoácido, tuvo un valor IC5o comparable con P6-NT que tiene la misma secuencia, pero únicamente residuos de -.-aminoácido.
Tabla 6. Enlace de derivados de neurotensina de análogos más ND: no determinado *: ver estructura para ANG2002 proporcionada en el Ejemplo 3 de la presente invención Ejemplo 6 Transporte de derivados de neurotensina de P6a que tienen D-isómeros Para confirmar que los conjugados más cortos que tienen D-isómeros atraviesan la BBB, se llevó a cabo perfusión de cerebro in situ utilizando métodos estándar en la técnica. El transporte inicial fue medido como una función de tiempo. Los conjugados probados incluyeron P6-NT, P6a-NT y ANG2002, tal como se describió anteriormente en los Ejemplos 3 y 5. Los resultados indican que la captación del cerebro de P6-NT y P6a-NT es similar a la de ANG2002, y que la captación del cerebro de P6a-NT es mayor que la de P6-NT (figura 6). También se llevó a cabo una reducción capilar para cuantificar la cantidad de análogo encontrado en la parénquima cerebral, y P6a-NT mostró presencia incrementada en la parénquima en comparación con P6-NT (figura 6). Además, nuestros resultados demuestran que el nuevo conjugado más corto P6a-NT que tiene residuos D-aminoácido atraviesa la BBB en forma más efectiva que el conjugado P6-NT que carece de los residuos de D-aminoácido.
Ejemplo 7 Inducción de hipotermia mediante derivados de neurotensina que tienen D-isómeros Hemos llevado a cabo experimentos para probar si los conjugados más cortos que tienen D-isómeros tuvieron la capacidad de inducir hipotermia sostenida en ratones, en comparación con AN2-NT (una proteína de fusión que incluye Angiopep-2 y neurotensina, tal como se muestra en la figura 9).
Los conjugados probados incluyeron P5-NT, P5a-NT, P6-NT y P6a-NT, tal como se proporciona en la tabla 6 anterior. Los ratones recibieron una inyección intravenosa de bolo 4.682 pmol/kg (equivalente a 20 mg kg de AN2-NT) de AN2-NT, P5-NT, P5a-NT, P6-NT y P6a-NT. La temperatura corporal continuó disminuyendo después de la inyección de los conjugados probados (figuras 7 y 8). En particular, los conjugados más cortos P5a-NT y P6a-NT que tienen D-isómeros tuvieron un efecto incrementado en la temperatura corporal en ratones en comparación con AN2-NT, y péptidos más cortos que carecen de D-isómeros.
Ejem pío 8 Síntesis de conjugados que tienen derivados de neurotensina NT1 más cortos Para reducir la longitud del conjugado, también se prepararon derivados de neurotensina (NT1) acortados en forma adicional. Se llevó a cabo SPPS (Síntesis de péptido de fase sólida) en un sintetizador de péptido Protein Technologies, Inc. Symphony® utilizando protección de término Fmoc (9-fluorenilmetil oxicarbonil) amino. Los Angiopeps más cortos con o sin análogos de neurotensina, fueron sintetizados en una escala de 100 pmoles utilizando un exceso de 5 veces de Fmoc-aminoácidos (200 mM) relativos a la resina. El péptido crudo fue precipitado utilizando éter enfriado con hielo, y purificado mediante cromatografía RP-HPLC (Waters Delta Prep 4000). Se evaporó el acetonitrilo de las fracciones recolectadas y se liofilizó para proporcionar un sólido blanco puro (pureza >95%). La masa se confirmó mediante ESI-TOF MS (Bruker Daltonics). La tabla 7 proporciona las secuencias de diversos análogos más cortos (P5a a P6c) y conjugados correspondientes que tienen un derivado de neurotensina NT1: Ac-KRRP(D-Y)l L, en donde los análogos más cortos (P5a a P6c) son conjugados en la Usina de NT1 a través de un enlazador E CS.
Tabla 7. Análogos más cortos y conjugados más cortos que tienen derivados de neurotensina NT1 Ejemplo 9 Sitios de disociación para conjugados de análogos de neurotensina(6-13) que tienen D-isómeros También se diseñaron conjugados más cortos, determinando los sitios de disociación posibles para pepsina y tripsina y reemplazando residuos de aminoácido en los sitios de disociación con uno o más D-isómeros del mismo residuo de aminoácido. La figura 9 muestra sitios de disociación de ejemplo para An2-NT y conjugados más cortos determinados mediante PeptideCutter, un modelo predictivo para determinar los sitios de disociación enzimática, y la tabla 8 proporciona una alineación de las secuencias de la figura 9. En general, se anticipó la disociación reducida incluyendo sustituciones de D-aminoácido en la porción de dirección (es decir en la secuencia P6a o P6b) y en la porción de derivado de neurotensina (figura 9).
Tabla 8. Alineación de conjugados más cortos que tienen análogos NT (6-13) Ejemplo 10 Transporte de conjugados de derivados de neurotensina NT1 más cortos Para confirmar que los conjugados tienen tanto análogos de Angiopep más cortos como derivados de neurotensina más cortos que atraviesan BBB, se llevó a cabo perfusión de cerebro in situ utilizando métodos estándar en la técnica. El transporte inicial de P5a-NT1, P5b-NT1, P5c-NT1 y P6a-NT1 se midió como una función de tiempo. Las secuencias de estos péptidos se describen en el Ejemplo 8. Los resultados indican que la captación en el cerebro de estos péptidos es mayor que la de neurotensina (NT) (figura 10). También se llevó a cabo la reducción capilar para cuantificar la cantidad de análogo encontrado en la parénquima cerebral (figura 10). En general, nuestros resultados demuestran que los nuevos conjugados más cortos que tienen residuos D-aminoácido atraviesan la BBB.
Ejemplo 11 Comparación de actividad de diversos derivados de neurotensina Llevamos a cabo experimentos para probar si los conjugados más cortos tuvieron la capacidad de inducir analgesia, hipotermia y/o hipotensión sostenida en ratones, en comparación con ANG2002 (tal como se muestra anteriormente en el Ejemplo 3), AN2-Ahx-NT (Angiopep-2 conjugado para neurotensina que tiene la secuencia ELYENKPRRPYIL mediante el ácido aminohexanoico (Ahx) enlazador) y AN2-NT (Angiopep-2 directamente conjugado (es decir, sin enlazador) a neurotensina que tiene la secuencia ELYENKPRRPYIL, tal como se muestra en la figura 9). Los conjugados probados incluyeron P5-NT, P5a-NT, P6-NT, P6a-NT, P5a-NT1 y P6a-NT1 (tal como se describe anteriormente en los Ejemplos 5 y 8).
La tabla 9 proporciona una síntesis de estos resultados. An2-Ahx-NT indujo analgesia, hipotermia e hipotensión en forma similar a ANG2002, en donde el uso de un enlazador mantuvo la actividad. Los péptidos más cortos P5a-NT y P6a-NT incluyendo D-isómeros, proporcionaron un efecto incrementado en la temperatura corporal en ratones y retuvieron sus propiedades analgésicas en comparación con ANG2002. Los Angiopeps cortos que tienen el fragmento de neurotensina NT1 (Ac-KRRP(D-Y)IL), dieron como resultado actividad disminuida, aunque la actividad puede ser retenida utilizando un enlazador entre la porción de dirección y NT1, o reemplazando la secuencia NT1 con una secuencia NT más larga.
Tabla 9. Comparación de analgesia, hipotermia e hipotensión Otras Modalidades Todas las publicaciones, solicitudes de patente y patentes mencionadas en la presente especificación están incorporadas a la misma como referencia.
Los expertos en la técnica podrán apreciar diversas modificaciones y variaciones del método y sistema descrito de la presente invención, sin apartarse del alcance y espíritu de la misma. Aunque la presente invención ha sido descrita en relación con modalidades deseadas específicas, deberá quedar entendido que la invención tal como se reivindica, no deberá ser limitada en forma indebida a las modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la presente invención que son obvios para los expertos en los campos de medicina, farmacología y campos relacionados, están proyectadas para estar dentro del alcance de la presente invención.

Claims (75)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptído purificado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que comprende la secuencia de aminoácido Lys-Arg-X3-X4-X5-I_ys (fórmula la), en donde: X3 es Asn o Gln; X4 es Asn o Gln; y X5 es Phe, Tyr, o Trp; en donde polipéptido tiene menos de 50 aminoácidos de longitud; en donde el polipéptido comprende opcionalmente uno o más D-isómeros de un aminoácido mencionado en la fórmula la; y en donde el polipéptido no es un péptido en la tabla 2.
2. Un polipéptido purificado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que comprende la secuencia de aminoácido Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys (fórmula la), en donde: X3 es Asn o Gln; X4 es Asn o Gln; y X5 es Phe, Tyr, o Trp; en donde el polipéptido tiene menos de 19 aminoácidos de longitud, y en donde el polipéptido comprende opcionalmente uno o más D-isómeros de un aminoácido mencionado en la fórmula la.
3. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la secuencia de aminoácido es Z1 -Lys-Arg-X3-X4-X5-I_ys-Z2 (fórmula Ib), en donde: X3 es Asn o Gln; X4 es Asn o Gln; X5 es Phe, Tyr, o Trp; Z1 está ausente, Cys, Gly, Cys-Gly, Arg-Gly, Cys-Arg-Gly, Ser-Arg-Gly, Cys-Ser-Arg-Gly, Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Gly-Ser-Arg-Gly, Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Phe-Phe-Tyr-Gly- Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, o Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly; y Z2 está ausente, Cys, Tyr, Tyr-Cys, Cys-Tyr, Thr-Glu-Glu-Tyr, o Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys; y en donde el polipéptido comprende opcionalmente uno o más D-isómeros de un aminoácido mencionado en la fórmula 1b, Z1 o Z2.
4. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la secuencia de aminoácido es Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys.
5. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la secuencia de aminoácido es Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr.
6. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la secuencia de aminoácido es X 1 -X2-Asn-Asn-X5-X6 (fórmula lia), en donde: X1 es Lys o D-Lys; X2 es Arg o D-Arg; X5 es Phe o D-Phe; y X6 es Lys o D-Lys; y en donde al menos uno de X1, X2, X5 o X6 es un D-aminoácido.
7. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la secuencia de aminoácido es X 1 -X2-Asn-Asn-X5-X6-X7 (fórmula llb), en donde: X1 es Lys o D-Lys; X2 es Arg o D-Arg; X5 es Phe o D-Phe; X6 es Lys o D-Lys; y X7 es Tyr o D-Tyr; y en donde al menos uno de X1, X2, X5, X6 o X7 es un D-aminoácido.
8. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la secuencia de aminoácido es Z 1 -X 1 -X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2 (fórmula lie), en donde: X1 es Lys o D-Lys; X2 es Arg o D-Arg; X5 es Phe o D-Phe; X6 es Lys o D-Lys; X7 es Tyr o D-Tyr; Z1 está ausente, Cys, Gly, Cys-Gly, Arg-Gly, Cys-Arg-Gly, Ser-Arg-Gly, Cys-Ser-Arg-Gly, Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Gly-Ser-Arg-Gly, Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Phe-Phe-Tyr-Gly- Gly-Ser-Arg-Gly, Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly, o Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly; y Z2 está ausente, Cys, Tyr, Tyr-Cys, Cys-Tyr, Thr-Glu-Glu- Tyr, o Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys; en donde al menos uno de X1, X2, X5, X6 o X7 es D-aminoácido; y en donde el polipéptido comprende opcionalmente uno o más D-isómeros de un aminoácido mencionado en Z1 o Z2.
9. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, caracterizado porque el polipéptido tiene menos de 15 aminoácidos de longitud.
10. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, caracterizado porque el polipéptido tiene menos de 10 aminoácidos de longitud.
11. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr (3D-An2); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1a); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1 b); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P1c); D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys (P1d); Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P2); Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P3); Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P4); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5b); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P5c); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Tyr-Cys (P6b); y D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr-Cys (P6c); o un fragmento de los mismos.
12. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia que tiene de 0 a 5 sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos relacionados con una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr (3D-An2); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1a); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1b); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P1c); D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys (P1 d); Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P2); Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P3); Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P4); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5b); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P5c); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Tyr-Cys (P6b); y D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr-Cys (P6c); o un fragmento del mismo.
13. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; y Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys, o un fragmento del mismo.
14. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el polipéptido es Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr (3D-An2); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1a); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1b); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P1c); D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys (P1d); o un fragmento del mismo.
15. El polipéptido tal como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque el fragmento tiene una eliminación de 1 a 7 aminoácidos del N-término de P1, P1a, P1b, P1c o P1d; una eliminación de 1 a 5 aminoácidos del C-término de P1, P1a, P1b, P1c o P1d; o eliminaciones de 1 a 7 aminoácidos del N-término P1, P1a, P1b, P1c o P1d y 1 a 5 aminoácidos del C-término de P1, P1a, P1b, P1c o P1d.
16. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, caracterizado porque el C-término está amidado.
17. El polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, caracterizado porque el polipéptido es transportado de manera eficiente a través de la barrera de sangre-cerebro.
18. El polipéptido tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque el polipéptido se transporta a través de la barrera de sangre-cerebro en forma más eficiente que Angiopep-2.
19. Un polipéptido terapéutico que comprende: una porción objetivo que consiste en un polipéptido tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 1 a la 18 y un agente peptídico terapéutico, en donde la porción de dirección se enlaza al agente peptídico terapéutico.
20. El polipéptido terapéutico tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque la porción de dirección se enlaza al agente terapéutico a través de un enlace covalente.
21. El polipéptido terapéutico tal como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque el enlace covalente es un enlace de péptido.
22. El polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 21, caracterizado porque el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión.
23. El polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 22, caracterizado porque el agente peptídico terapéutico se selecciona del grupo que consiste en neurotensina o un análogo de neurotensina, un agonista de receptor de neurotensina, un factor neurotrófico o un análogo de factor neurotrófico, un agonista GLP-1 y leptina o un análogo de leptina.
24. El polipéptido terapéutico tal como se describe en la reivindicación 23, caracterizado porque el agente peptídico terapéutico es el análogo de neurotensina, y el análogo de neurotensina se selecciona del grupo que consiste en neurotensina(6-13), neurotensina(8-13), Lys(7)-D-Tyr(11 )-neurotensina(7-13), p-Glu(1 )-neurotensina, p-Glu(1)-neurotensina-OH, D-Lys(6)-neurotensina(6-13), D-Tyr(11)-neurotensina(6-13), D-Lys(6)-D-Tyr( 11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-neurotensina(6-13), D-Arg(9)-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(6-13), D-Pro( 10)neurotensina(6-13), D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Trp(11 )-neurotensina(6-13), D-Phe(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Trp( )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-neurotensina(8-13), D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Pro( 10)neurotensina(8- 13), D-Tyr(11 )-neurotensina(8-13), D-Trp(11 )-neurotensina(8-13), D-Phe(11 )-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Tyr( 11 )-neurotensina(8-13) y D-Arg(8)-D-Trp( 11 )-neurotensina(8-13), o una forma acetilada de las mismas.
25. El polipéptido terapéutico tal como se describe en la reivindicación 23, caracterizado porque el agente peptídico terapéutico es el factor neurotrófico o el análogo de factor neurotrófico, y el factor neurotrófico o el análogo de factor neurotrófico se selecciona del grupo que consiste en un factor neurotrófico derivado de neuroglial (GDNF), un análogo GDNF, un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), y un análogo BDNF.
26. Un conjugado que tiene la fórmula A-X-B, en donde: A es una porción de dirección de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 18; X es un enlazador; y B es un agente terapéutico o un vector de transporte.
27. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 26, caracterizado porque X es un enlace de péptido.
28. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 26, caracterizado porque X es al menos un aminoácido; y A y B cada una se enlazan covalentemente a X a través de un enlace de péptido.
29. El conjugado tal como se describe en I; reivindicación 26, caracterizado porque X es un enlazador d< éster.
30. El conjugado tal como se describe en l¡ reivindicación 26, caracterizado porque X tiene la fórmula -NH (CH2)n-C(0)0-y en donde n es un entero entre 2 y 10.
31. El conjugado tal como se describe en I reivindicación 26, caracterizado porque X tiene la fórmula: en donde n es un entero entre 2 y 15; y ya sea Y es a tiol en A y Z es una amina primaria en B, o Y es a tiol en B y Z es una amina primaria en A.
32. El conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 31, caracterizado porque B es el agente terapéutico y el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un agente anticáncer, un agente de ácido nucleico terapéutico, un fármaco de molécula pequeña, una etiqueta o un agente peptídico terapéutico.
33. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque el agente terapéutico es el agente anticáncer.
34. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 33, caracterizado porque el agente anticáncer es paclitaxel, docetaxel, etoposida, doxorrubicina, o un análogo de los mismos.
35. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque el agente terapéutico es el agente de ácido nucleico terapéutico.
36. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 35, caracterizado porque el agente de ácido nucleico terapéutico es un agente ARNi.
37. El conjugado tai como se describe en la reivindicación 36, caracterizado porque el agente de ARNi es un siARN.
38. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque el agente terapéutico es el agente peptídico terapéutico.
39. El ' conjugado tal como se describe en la reivindicación 38, caracterizado porque el conjugado es una proteína de fusión.
40. El conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 38 y 39, caracterizado porque el agente peptídico terapéutico se selecciona del grupo que consiste en neurotensina o un análogo de neurotensina, un agonista de receptor de neurotensina, un factor neurotrófico o un análogo de factor neurotrófico, un agonista GLP-1 y leptina o un análogo de leptina.
41. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el agente peptídico terapéutico es el análogo de neurotensina, y el análogo de neurotensina se selecciona del grupo que consiste en neurotensina(6-13), neurotensina(8-13), Lys(7)-D-Tyr(11 )-neurotensina(7- 3), p-Glu(1 )-neurotensina, p-Glu(1)-neurotensina-OH , D-Lys(6)-neurotensina(6-13), D-Tyr(11)-neurotensina(6-13), D-Lys(6)-D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-neurotensina(6-13), D-Arg(9)-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(6-13), D-Pro(10)neurotensina(6-13), D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Trp(11 )-neurotensina(6-13), D-Phe(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Trp( 11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-neurotensina(8-13), D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Pro( 10)neurotensina(8-13), D-Tyr( 1 )-neurotensina(8-13), D-Trp(11 )-neurotensina(8-13), D-Phe(11 )-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Tyr( 11 )-neurotensina(8-13) y D-Arg(8)-D-Trp( 11 )-neurotensina(8-13), o una forma acetilada de las mismas.
42. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 41, caracterizado porque el agente peptídico terapéutico es el factor neurotrófico o el análogo de factor neurotrófico, y el factor neurotrófico o el análogo del factor neurotrófico se selecciona del grupo que consiste en un factor neurotrófico derivado de neuroglial (GDNF), un análogo GDNF, un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) y un análogo BDNF.
43. El conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 31, caracterizado porque B es el vector de transporte, y un vector de transporte se seleccionado del grupo que consiste en un vector de lípido, un poliplexo, un dendrímero, o una nanopartícula.
44. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 43, caracterizado porque vector de transporte se enlaza a o contiene un agente terapéutico.
45. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un agente anticáncer, un agente de ácido nucleico terapéutico, un fármaco o molécula pequeña, una etiqueta o un agente peptídico terapéutico.
46. Una composición que comprende un polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 25 o un conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 45.
47. La composición tal como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque comprende además un transportador farmacéuticamente aceptable.
48. Un método para tratar o tratar en forma profiláctica a un sujeto que tiene cáncer, en donde el método comprende administrar al sujeto un polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 19 a 25 o un conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 45 en una cantidad suficiente para tratar el cáncer.
49. El método tal como se describe en la reivindicación 48, caracterizado porque el cáncer es cáncer de cerebro.
50. El método tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque el cáncer de cerebro se selecciona del grupo que consiste en glioma, glioma mezclado, glioblastoma multiforme, astrocitoma, astrocitoma poliquístico, tumor neuroepitelial disembrioplásico, oligodendroglioma, ependimoma, oligoastrocitoma, med uloblastoma , retinoblastoma, neuroblastoma , germinoma y teratoma.
51. Un método para reducir la temperatura corporal de un sujeto, en donde el método comprende administrar un polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 25 o un conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 45 en una cantidad suficiente para reducir la temperatura corporal.
52. El método tal como se describe en la reivindicación 51, caracterizado porque el sujeto padece de, o ha padecido de ataque cardíaco, isquemia cerebral, isquemia cardíaca, una lesión nerviosa o está en necesidad de neuroprotección o hipotermia maligna.
53. El método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 51 y la 52, caracterizado porque el polipéptido terapéutico o el conjugado comprenden un análogo de neurotensina que se selecciona del grupo que consiste en neurotensina(6-13), neurotensina(8-13), Lys(7)-D-Tyr( 11 )-neurotensina(7-13), p-Glu(1 )-neurotensina, p-Glu(1)-neurotensina-OH , D-l_ys(6)-neurotensina(6-13), D-Tyr(11)-neurotensina(6-13), D-Lys(6)-D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-neurotensina(6-13), D-Arg(9)-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(6- 3), D-Pro(10)neurotensina(6-13), D-Tyr( )-neurotensina(6-13), D-Trp(11 )-neurotensina(6-13), D-Phe( 1 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Trp(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-neurotensina(8-13), D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Pro(10)neurotensina(8-13), D-Tyr(11 )-neurotensina(8-13), D-Trp(11 )-neurotensina(8-13), D-Phe(11 )-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Tyr( 11 )-neurotensina(8-13) y D- Arg (8 )-D-Trp( 11 )-neu rotensi na (8- 13), o una forma acetilada de las mismas.
54. Un método para tratar hipertensión o para tratar hipertensión en forma profiláctica en un sujeto, en donde el método comprende administrar un polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 25 o un conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 45 en una cantidad suficiente para tratar la hipertensión.
55. El método tal como se describe en la reivindicación 54, caracterizado porque el polipéptido terapéutico o el conjugado comprende un análogo de neurotensina que se selecciona del grupo que consiste en neurotensina(6-13), neurotensina(8-13), Lys(7)-D-Tyr(11 )-neurotensina(7-13), p-Glu(1 )-neurotensina, p-Glu(1 )-neurotensina-OH, D-Lys(6)-neurotensina(6-13), D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Lys(6)-D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-neurotensina(6-13), D-Arg(9)-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(6-13), D-Pro(10)neurotensina(6-13), D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Trp(11 )-neurotensina(6-13), D-Phe(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D-Tyr(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-D- Trp(11 )-neurotensina(6-13), D-Arg(8)-neurotensina(8-13), D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Arg(9)-neurotensina(8-13), D-Pro(10)neurotensina(8-13), D-Tyr(11 )-neurotensina(8-13), D-Trp(11 )-neurotensina(8-13), D-Phe(11 )-neurotensina(8-13), D-Arg(8)-D-Tyr(11 )-neurotensina(8-13) y D-Arg(8)-D-Trp(11 )-neurotensina(8-13), o una forma acetilada de las mismas.
56. Un método para tratar dolor o tratar dolor en forma profiláctica, o disminuir sensibilidad al dolor en un sujeto, en donde el método comprende administrar un polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 25 o un conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 45 en una cantidad suficiente para tratar dolor.
57. El método tal como se describe en la reivindicación 56, caracterizado porque el dolor es dolor agudo, dolor neuropático periférico o central, dolor inflamatorio, dolor relacionado con migraña, dolor relacionado con dolor de cabeza, dolor relacionado con síndrome de intestino irritable, dolor relacionado con fibromialgia, dolor artrítico, dolor esquelético, dolor de articulaciones, dolor gastrointestinal, dolor muscular, dolor de angina, dolor facial, dolor pélvico, claudicación, dolor postoperatorio, dolor post traumático, dolor tipo tensión, dolor obstétrico, dolor ginecológico o dolor inducido con quimioterapia.
58. Un método para tratar un sujeto que tiene un trastorno psicótico, en donde el método comprende administrar un polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 25 o un conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 45 en una cantidad suficiente para tratar el trastorno.
59. Un método para tratar adicción a fármacos o abuso a fármacos en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto un polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 25 o un conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 45 en una cantidad suficiente para tratar la adicción o abuso.
60. Un método para tratar un sujeto que tiene un trastorno metabólico, en donde el método comprende administrar un polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 25 o un conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 45 en una cantidad suficiente para tratar el trastorno.
61. Un método para tratar o tratar en forma profiláctica un trastorno neurológico en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto el polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 25 o un conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 45, en una cantidad suficiente para tratar o prevenir el trastorno.
62. El polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 22, caracterizado porque el agente peptídico terapéutico es un polipéptido que enlaza específicamente a una molécula biológica.
63. El polipéptido terapéutico tal como se describe en la reivindicación 62, caracterizado porque el polipéptido que enlaza específicamente una molécula biológica es una inmunoglobulina o un fragmento de la misma que retiene la capacidad de enlazar específicamente la molécula biológica.
64. El polipéptido terapéutico tal como se describe en la reivindicación 63, caracterizado porque la inmunoglobulina es un anticuerpo tetramérico o un anticuerpo de cadena simple.
65. Una composición que comprende un polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 62 a la 64.
66. La composición tal como se describe en la reivindicación 65, caracterizada porque comprende un transportador farmacéuticamente aceptable.
67. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 32 o en la reivindicación 45, caracterizado porque el agente peptídico terapéutico es un polipéptido que enlaza específicamente una molécula biológica.
68. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 67, caracterizado porque el polipéptido que enlaza específicamente una molécula biológica, es una inmunoglobulina o un fragmento de la misma que retiene la capacidad de enlazar específicamente la molécula biológica.
69. El conjugado tal como se describe en la reivindicación 68, caracterizado porque la inmunoglobulina es un anticuerpo tetramérico o un anticuerpo de cadena simple.
70. Una composición que comprende un conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 67 a la 69.
71. La composición tal como se describe en la reivindicación 70, caracterizado porque comprende un transportador farmacéuticamente aceptable.
72. Un método para tratar o tratar en forma profiláctica a un sujeto que necesita de tratamiento, en donde el método comprende administrar al sujeto un polipéptido terapéutico tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 62 a la 64 o un conjugado tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 67 a la 69 en una cantidad suficiente para tratar al sujeto.
73. El método tal como se describe en la reivindicación 72, caracterizado porque el sujeto tiene cáncer o tiene el riesgo de desarrollar cáncer.
74. El método tal como se describe en la reivindicación 73, caracterizado porque el cáncer es cáncer de cerebro.
75. El método tal como se describe en la reivindicación 74, caracterizado porque el cáncer de cerebro se selecciona del grupo que consiste en glioma, glioma mezclado, glioblastoma multiforme, astrocitoma, astrocitoma poliquístico, tumor neuroepitelial disembrioplácido, oligodendroglioma, ependimoma, oligoastrocitoma, meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma, germinoma y teratoma.
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