PT1084248E

PT1084248E - Novos análogos de insulina com poder de ligação ao zinco aumentado

Info

Publication number: PT1084248E
Application number: PT99925023T
Authority: PT
Inventors: Karl Geisen; Paul Habermann; Gerhard Seipke; Johann Ertl; Axel Wollmer
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 1998-06-06
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2006-11-30
Also published as: ZA200006835B; NO20006177L; HUP0102217A2; AR019852A1; JP4402296B2; CA2330183A1; ATE334201T1; WO1999064598A3; JP2002517247A; CN1304450A; CZ20004525A3; CN1304450B; CZ301377B6; NO20006177D0; US6686177B1; EP1084248A2; AU4145499A; HK1036808A1; DK1084248T3; HU228908B1

Description

DESCRIÇÃO

"NOVOS ANÁLOGOS DE INSULINA COM PODER DE LIGAÇÃO AO ZINCO AUMENTADO" A presente invenção refere-se a análogos de insulina, os quais apresentam uma capacidade de ligação ao zinco aumentada, bem como a complexos de zinco estáveis dos mesmos, que apresentam um perfil de acção retardado em comparação com a insulina humana, a um processo para a sua preparação e à sua utilização, em particular em preparações farmacêuticas para a terapia da Diabetes mellitus do tipo I, como também do tipo II.

No mundo inteiro, aproximadamente 120 milhões de pessoas sofrem de Diabetes mellitus. Entre estas, aproximadamente 12 milhões são do tipo I, para quem a substituição da secreção de insulina endócrina em falta representa a única terapia possível actualmente. As pessoas afectadas estão dependentes de injecções de insulina ao longo de toda a vida, em regra, várias vezes ao dia. Ao contrário da diabetes do tipo I, na diabetes do tipo II não existe fundamentalmente uma carência em insulina, numa multiplicidade de casos contudo, sobretudo em estádios mais avançados, o tratamento com insulina, eventualmente em combinação com um antidiabético oral, é visto como a forma de terapia mais favorável.

No ser humano saudável a libertação de insulina pelo pâncreas é acoplada rigorosamente à concentração da glicose sanguínea. Níveis de glicose sanguínea aumentados, como ocorrem após as refeições, são compensados rapidamente por um 1 correspondente aumento da secreção de insulina. No estado de jejum, o nivel de insulina do plasma decresce para um valor basal que é suficiente para garantir um abastecimento continuo com glicose de órgãos e tecidos sensíveis à insulina e para manter a produção de glicose hepática baixa durante a noite. A substituição da secreção endógena de insulina por aplicação exógena, maioritariamente subcutânea, de insulina, em regra, não alcança, nem de longe, a qualidade da regulação fisiológica da glicose sanguínea descrita acima. Frequentemente, surgem descontrolos da glicose sanguínea para cima e para baixo que, nas suas formas mais severas, podem pôr a vida em perigo. A par disso, niveis elevados da glicose sanguínea ao longo de anos, sem sintomas iniciais, representam contudo também um risco considerável para a saúde. 0 estudo em grande escala da DCCT nos EUA (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N, Engl. J. Med. 329, 977-986) demonstrou claramente que níveis de glicose sanguínea cronicamente elevados são responsáveis, no essencial, pelo desenvolvimento de sequelas diabéticas. Sequelas diabéticas são danos micro e macrovasculares que se manifestam, em certas circunstâncias, como retino, nefro ou neuropatias e conduzem à cegueira, insuficiência renal, bem como a perda de extremidades e, para além disso, implicam um risco aumentado de doenças cardiovasculares. Pode ser deduzido disto que uma terapia melhorada da diabetes deve visar em primeiro lugar a manutenção da glicose sanguínea o mais próximo possível da gama fisiológica. Segundo o conceito da terapia de insulina intensificada, isto deve ser alcançado por múltiplas injecções diárias de preparações de insulina de acção rápida e lenta. Formulações de acção rápida são dadas às refeições, para compensar a subida pós-prandial da glicose sanguínea. Insulinas basais de acção lenta devem garantir o abastecimento basal com 2 insulina, em particular durante a noite, sem conduzir a uma hipoglicemia.

As insulinas basais actualmente disponíveis preenchem apenas insuficientemente estes requisitos. Em especial as insulinas NPH frequentemente utilizadas, apresentam um máximo de acção demasiadamente pronunciado e possuem uma acção global demasiado curta. Na aplicação à noite, isto alberga o risco de uma hipoglicemia nocturna e uma hiperglicemia matinal.

No pedido de patente internacional WO95/07931 são descritos derivados de insulina de acção retardada que também podem apresentar-se como complexos de zinco.

No pedido de patente internacional W095/00550 são descritos cristais de insulina que contêm protamina,e em que na posição B28 na insulina se apresenta o resíduo de aminoácido ácido asparagmico (Asp ) .

No pedido de patente europeia EP 0214826 A2 são descritos novos análogos de insulina de acção rápida que possuem uma tendência reduzida para a auto-associação na forma de dímeros, tetrâmeros, hexâmeros ou polímeros. A partir do documento EP 0821006 são conhecidos análogos de insulina com capacidade de ligação ao zinco aumentada que, em associação com zinco, apresentam um perfil de acção retardado face à insulina humana. Estes análogos diferenciam-se da insulina humana, no essencial, por variação do aminoácido na posição A21 da cadeia A e por adição de um resíduo de histidina ou um péptido com 2 até 35 resíduos de aminoácido, o qual contém 1 até 5 resíduos de histidina, na posição B30 da cadeia B. 3 0 objectivo da presente invenção é o de disponibilizar outros análogos de insulina (análogos de insulina humana e animal) que apresentam uma capacidade de ligação ao zinco aumentada, formam um complexo estável contendo um hexâmero do análogo de insulina e zinco e possibilitam, em preparação adequada, na injecção subcutânea, uma terapia melhorada da Diabetes mellitus do tipo I, como também do tipo II, em consequência do perfil de acção retardado em comparação com a insulina humana.

Os análogos de insulina derivam de insulinas ocorrentes naturalmente, nomeadamente insulina humana (ver SEQ. ID NO: 1: cadeia A de insulina humana e SEQ. ID NO: 2: cadeia B de insulina humana) ou insulinas animais, por substituição ou ausência de pelo menos um residuo de aminoácido ocorrente naturalmente e/ou adição de pelo menos um residuo de aminoácido na cadeia A e/ou B da insulina ocorrente naturalmente. O objectivo é solucionado por 1. um análogo de insulina ou um sal fisiologicamente

aceitável do mesmo da fórmula I S-—-s (A1 ~A5>-Cys-Cys- R8-R9-R1ó-Cys“Q®f-Leu-*R14-{A15-A19)-Cys~R21 Q)

S S Z-Ri-R2-R3-R4-His-Leujys--— (S8-B18) - Cys (B20-B29)-R30 4 onde significam (A1-A5) os resíduos de aminoácido nas posições AI até A5 da cadeia A de insulina humana (comparar SEQ ID NO: 1) ou insulina animal, (A15-A19) os resíduos de aminoácido nas posições AI5 até AI9 da cadeia A de insulina humana (comparar SEQ ID NO: 1) ou insulina animal, (B8-B18) os resíduos de aminoácido nas posições B8 até B18 da cadeia B de insulina humana (comparar SEQ ID NO: 2) ou insulina animal, (B20-B29) os resíduos de aminoácido nas posições B20 até B29 da cadeia B de insulina humana (comparar SEQ ID NO: 2) ou insulina animal, R8 Thr ou Ala, R9 Ser ou Gly, RIO Ile ou Vai, R14 Tyr, His, Asp ou Glu, R21 Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu ou Gin, RI um qualquer resíduo de aminoácido codificável geneticamente, ausente ou um átomo de hidrogénio, R2 Vai, Ala ou Gly, R3 Asn, His, Glu ou Asp, R4 Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gin, Gly ou Glu, R30 um qualquer resíduo de aminoácido codificável geneticamente ou -OH, Z um resíduo de péptido com 1 até 4 resíduos de aminoácido codificáveis geneticamente, contendo 1 até 4 resíduos de histidina (His), com a condição de o análogo de insulina ou o sal fisiologicamente aceitável do mesmo, da fórmula I, não diferir 5 da insulina humana apenas por variação dos resíduos de aminoácido nas posições R3 ou R3 em combinação com R21 ou R3 em combinação com R4 na fórmula I (comparar SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 1 e SEQ ID N0:2).

De um modo preferido, o análogo de insulina ou o sal fisiologicamente aceitável do mesmo é caracterizado por 2. R8 significar Thr, R9 Ser e RIO Ile, 3. RI significar Phe, His, Asn, Asp ou Gly, 4. R30 significar Thr, Ala ou Ser ou 5. caracterizado por R21 significar Asn e RI Phe. 6. Uma configuração preferida da presente invenção é um análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo, da fórmula I, o qual é caracterizado por R2 significar Vai, R3 Asn e R4 Gin.

Preferido, além disso, é um análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo, da fórmula I, o qual se distingue por R14 significar 7. Tyr, 8 . His 9. Asp ou 10. Glu. 6

Preferido, além disso, é um análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo, da fórmula I, o qual se distingue por R30 significar 11. Thr, 12. Ala, 13. Ser ou 14. -OH.

Preferido em particular é um análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo, da fórmula I, que se distingue por Z significar 15. His, 16. His-Ala- ou 17. His-Ala-Ala-.

Exemplos para análogos de insulina de acordo com a presente invenção são 18. um análogo de insulina ou um sal f isiologicamente aceitável do mesmo, da fórmula I, que se distingue por a cadeia B apresentar a sequência

His Phe Vai Asn Glnn His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys (SEQ ID NO: 3) , por exemplo, a insulina humana His(BO), Des (B30), 7 19. um analogo de insulina ou um sul fisiologicamente aceitavel do rnesino/ da formula I, que so distingue por a cad0ia B apr0sentar a S0quência

His Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu

Ala Lau Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Ph0 Ph0 Tyr Thr

Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 4) , por exemplo a insulina humana His (BO), 20. um analogo de insulina ou um sal f isiologicamente aceitável do mesmo, da fórmula I, que se distingue por a cadeia B apresentar a sequência

His Ala Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai

Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr

Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 5), por exemplo a insulina humana His (B-l), Ala (BO) ou 21. um análogo de insulina ou um sal f isiologicamente aceitável do mesmo, da fórmula I, que se distingue por a cadeia B apresentar a sequência

His Ala Ala Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu

Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe

Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 6), por exemplo a insulina humana His(B-2), Ala(B-l), Ala(BO). A presente invenção refere-se, além disso, a um processo para a preparação do análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com a presente invenção, abrangendo a construção de um veículo de expressão

replicável, o qual contém a sequência de ADN que codifica para um percursor do análogo de insulina com a sequência geral de aminoácidos II

Met-X2m- (Arg)p-Z-Rl-R2-R3-R4-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B29)-RSO-X^-Arg- (A1-A5) -Cys-Cys-R8-R9-R10-Cys-Ser-Leu-R14- (A15-A19) -

Cys-R21 II, onde XXn significa uma cadeia de péptido com n resíduos de aminoácido, em que n significa um número inteiro de 0 até 34, x2m significa uma cadeia de péptido com m resíduos de aminoácido, em que m significa um número inteiro de 0 até 20, p 0, 1 ou 2 R30 significa um qualquer resíduo de aminoácido codificável geneticamente ou está ausente e Z está ausente ou significa um resíduo de péptido com 1 até 4 resíduos de aminoácido codificáveis geneticamente, contendo 1 até 4 resíduos de histidina (His) e as restantes variáveis têm os significados mencionados anteriormente no n° 1, em que são também válidas as condições mencionadas anteriormente, expressão numa célula hospedeira e libertação do análogo de insulina a partir do seu percursor com métodos químicos e/ou enzimáticos. A célula hospedeira é, de um modo preferido, uma bactéria, de um modo preferido em particular a bactéria E. coli. A célula hospedeira é, de um modo preferido, uma levedura, de um modo preferido em particular Saccharomyces cerevisiae. 9

Na expressão em E. coli, as proteínas de fusão mencionadas (SEQ ID NO: 7 até 9) formam, em regra, corpos de inclusão (inclusion bodies) insolúveis gue, após lise celular por centrifugação, podem ser isolados e ser novamente dissolvidos sob utilização de aditivos caotrópicos (p. ex. ureia 8 M ou cloreto de guanidínio 6 M) . A proteína de fusão dissolvida pode ser submetida a uma sulfitólise, na qual os resíduos SH são convertidos em S-sulfonatos (p. ex. R.C. Marshall e A.S. Iglis em „Practical Protein Chemistry - A Handbook", editor A. Darbre (1986), páginas 49-53). Por este meio, a solubilidade da proteína de fusão melhora e facilita a purificação, por exemplo, por meio de cromatografia de troca aniónica ou de permeação em gel. A conversão da proteína de fusão derivatizada em pré-proinsulina com estrutura espacial nativa e pontes de dissulfureto correctamente formadas (dobra) realiza-se em solução aquosa diluída por adição de uma quantidade limitada de um reagente SH, tal como mercaptoetanol, cisteína ou glutatião e subsequente oxidação ao ar. Alternativamente, a proteína de fusão não derivatizada dissolvida pode também ser directamente dobrada sob condições idênticas (documentos EP-A-0600372; EP-A-0668292). A pré-proinsulina é convertida subsequentemente em insulina biologicamente activa por dissociação proteolítica limitada. Para este efeito, pode ser utilizada tripsina, a qual remove a pré-sequência designada na fórmula II com Met-X2m-(Arg)q e dissocia na cadeia de péptido designada com X1n-Arg e deste modo separa a cadeia B e A. Em regra, a sequência X1 inicia com Arg, Arg2 ou não está presente (n=0), de modo que, após a dissociação, apresenta-se um derivado de insulina que está 10 prolongado com Arg ou Arg2 na extremidade C da cadeia B. Estes aminoácidos podem ser removidos com carboxipeptidase B. A dissociação tríptica também pode ser conduzida por aumento da concentração de tripsina ou prolongamento da duração de reacção, de modo a que se dissocie adicionalmente na lisina(B29). Neste caso, tem origem um derivado de insulina, Des(B30). O análogo de insulina originado na dissociação pode ser purificado por processos cromatográficos Standard (p. ex. cromatografia de troca iónica e de fase reversa) e isolado por fim por precipitação, cristalização ou liofilização simples. 0 percursor do análogo de insulina tem, de um modo preferido, a sequência

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

His Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly

Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu

Gin Lys Arg

Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (SEQ ID NO: 7), por exemplo, a sequência da pré-proinsulina His (BO), ou a sequência

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

His Ala Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly

Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu

Gin Lys Arg

Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 11 (SEQ ID NO: 8), por exemplo, a sequência da pré-proinsulina His(B-l), Ala(BO), ou a sequência

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser . Ala Arg His Ala Ala Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys . Asn (SEQ ID NO: 9) , por exemplo, a sequência da pré-proinsulina His (B-2), Ala(B-l), Ala(BO). A presente invenção refere-se também aos percursores dos análogos de insulina de acordo com a invenção mencionados anteriormente, em particular às pré-proinsulinas, às sequências de ADN, as quais codificam para um percursor do análogo de insulina, de acordo com a presente invenção, aos veiculos de expressão que contêm a sequência de ADN que codifica para um percursor de acordo com a invenção do análogo de insulina de acordo com a presente invenção, bem como a uma célula hospedeira isolada que está transformada com um tal veiculo de expressão. A presente invenção refere-se, além disso, a uma preparação farmacêutica contendo pelo menos um análogo de insulina e/ou pelo menos um sal fisiologicamente aceitável de acordo com a presente invenção.

De um modo preferido, a preparação farmacêutica distingue-se por conter o análogo de insulina de acordo com a invenção 12 e/ou o sal fisiologicamente aceitável do mesmo, na forma dissolvida, amorfa e/ou cristalina. A preparação farmacêutica contém opcionalmente, além disso, uma substância auxiliar de depósito, de um modo preferido sulfato de protamina, em que o análogo de insulina e/ou o sal fisiologicamente aceitável do mesmo se apresenta, de um modo preferido, num co-cristalizado com o sulfato de protamina. A preparação farmacêutica de acordo com a presente invenção pode conter, opcionalmente, adicionalmente insulina humana não modificada e/ou outro análogo de insulina, de um modo preferido Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-insulina humana. A presente invenção refere-se, além disso, a uma solução injectável com actividade de insulina, a qual contém a preparação farmacêuitca de acordo com a presente invenção na forma dissolvida, de um modo preferido caracterizada por um conteúdo de 1 pg até 2 mg de zinco por cada mL, de um modo preferido em particular, por um conteúdo de 5 pg até 200 pg de zinco por cada mL. A presente invenção refere-se, além disso, à utilização do análogo de insulina e/ou seu sal fisisiologicamnete aceitável de acordo com a presente invenção, para a preparação de uma preparação farmacêutica, a qual apresenta uma actividade de insulina com entrada em acção retardada. 0 objectivo colocado inicialmente é solucionado, além disso, por um complexo de insulina-zinco, contendo um hexâmero de insulina e 4 até 10 iões de zinco por cada hexâmero de insulina, caracterizado por o hexâmero de insulina consistir em 13 seis moléculas de um análogo de insulina da fórmula I como descrito acima.

De um modo preferido, o complexo de insulina-zinco contém 5 até 8 iões de zinco por cada hexâmero de insulina. O complexo de insulina de acordo com a presente invenção é, de um modo preferido, caracterizado por a cadeia B do análogo de insulina da fórmula I apresentar a sequência

Phe Vai His Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 10), por exemplo a insulina humana His(B3), ou caracterizado por a cadeia B do análogo de insulina da fórmula I apresentar a sequência

Phe Vai Asp Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 11), por exemplo, a insulina humana Asp(B3). A presente invenção refere-se também a uma preparação farmacêutica, contendo pelo menos um complexo insulina-zinco de acordo com a invenção, bem como uma preparação farmacêutica, contendo o complexo insulina-zinco, de acordo com a invenção, em solução ácida. A preparação farmacêutica é, de um modo preferido, caracterizada por conter o complexo insulina-zinco na forma dissolvida, amorfa e/ou cristalina. A presente invenção refere-se também a uma solução injectável com actividade de insulina contendo a preparação farmacêutica na forma dissolvida e é, de um modo preferido, caracterizada por um conteúdo de 1 yg até 2 mg de zinco por cada 14 mL, de um modo preferido em particular, por um conteúdo de 5 yg até 200 yg de zinco por cada mL. A presente invenção refere-se também à utilização do complexo de insulina-zinco para a preparação de uma preparação farmacêutica, a qual apresenta uma actividade de insulina com entrada em acção retardada.

Os análogos de insulina de acordo com a presente invenção são biologicamente activos e exibem uma acção fortemente retardada, após aplicação subcutânea na forma de solução limpida, ligeiramente ácida, com 80 yg Zn++/mL (zinco/mL) no cão. No caso do análogo de insulina, o qual está prolongado na extremidade N da cadeia B com histidina, a insulina humana His (BO) , Des (B30) (ver SEQ ID NO.: 3), o perfil de acção depende, por exemplo, muito fortemente da quantidade em iões de zinco adicionados. Uma preparação isenta de zinco não possui qualquer acção de depósito (acção total: 6 - 8 h, exemplo 8) e, na farmacodinâmica, não se diferencia praticamente da insulina humana, enquanto que após a adição de iões de zinco (80 yg/mL) se encontra um forte retardamento de acção (acção total, aproximadamente 16 h, exemplo 8). O efeito de depósito observado é portanto consideravelmente mais pronunciado do que o da insulina NPH. Para além disso, este análogo possui a vantagem de a farmacodinâmica ser regulável por predeterminação do conteúdo de zinco numa gama, o que não possivel com insulina humana. As formulações com entrada em acção rápida, bem como tais com acção moderada ou fortemente retardada, podem ser preparadas com uma só substância activa, variando o conteúdo de zinco. Deste modo, o perfil de acção pode ser adaptado individualmente às necessidades do doente, pelo médico ou pelo próprio doente, sob utilização de uma preparação com conteúdo de zinco 15 correspondentemente pré-ajustado ou por mistura de preparações com conteúdo de zinco elevado ou baixo.

Os análogos aqui descritos são, além disso, caracterizados por apresentarem uma elevada afinidade para iões de zinco, em comparação com insulina humana.

Em solução aquosa neutra, a insulina humana forma hexâmeros, os quais complexam respectivamente dois iões de zinco através das cadeias laterais His(BlO). Estes iões de zinco não podem ser removidos por diálise contra tampões aquosos em solução neutra. Sob as mesmas condições, os análogos aqui descritos ligam mais de 4 iões de zinco. No caso da insulina His(BO), Des(B30) e His (B3) , de acordo com a invenção, estes são aproximadamente 7 iões de zinco/hexâmero, no caso de insulina Asp(B3) foram medidos 4,2 iões de zinco/hexâmero (exemplo 9). É conhecido que em soluções neutras, o zinco conduz à formação de associados de elevado peso molecular e à precipitação da insulina. Após a injecção de uma preparação contendo zinco ligeiramente ácida, que contém insulina claramente dissolvida, ocorre por conseguinte a formação, por neutralização, de complexos de insulina-zinco no tecido subcutâneo e, em consequência, a precipitação da insulina. A partir deste depósito, a insulina passa novamente para solução e atinge depois de forma retardada à corrente sanguínea e o local de acção. Este retardamento de acção é apenas muito fraco na insulina humana, é contudo fortemente desenvolvido nos análogos aqui descritos devido à afinidade aumentada para com o zinco. A ligação aumentada ao zinco representa por conseguinte a base para o retardamento de acção dependente de zinco descrito acima. 16 A presente invenção não se refere por conseguinte apenas aos análogos de insulina descritos, mas também aos complexos de insulina-zinco associados. Estes complexos diferenciam-se dos complexos de insulina humana - zinco correspondentes por apresentarem uma fracção mais elevada em zinco firmemente ligado. É por conseguinte evidente que a par de zinco, podem ser também empregues outros iões de metais de transição, tal como, por exemplo, cobalto ou cobre, para a formação de complexos correspondentes.

Exemplo 1: Construção do plasmideo pINT345d que codifica para a variante pré-proinsulina His(B3). A patente US com o número de patente 5358857 descreve o plasmideo pINT90d. O ADN deste plasmideo serve como material de partida para a construção do plasmideo pINT345d, o qual é caracterizado por duas novas propriedades face ao pINT90d. Codifica por um lado um análogo de pré-proinsulina que contém o aminoácido histidina em vez de asparagina na posição 3 da cadeia B e suporta, por outro, uma sequência de reconhecimento para a enzima de restrição BssH2 imediatamente antes do inicio da sequência codificante para esta variante de pré-proinsulina, de modo que a sequência codificante para os 10 aminoácidos terminais do análogo de pré-proinsulina se torna facilmente manipulável se se tomar em consideração o local de dissociação Dra3 no decurso da sequência de pré-proinsulina.

Para a construção do plasmideo pINT345d, o ADN do plasmideo pINT90d é dissociado numa mistura de digestão dupla, na posição 248 bp pela enzima de restrição Ncol e na posição 351 17 bp pela enzima de restrição Dra3, de modo que são originados dois fragmentos. Após separação por electroforese em gel da mistura de dissociação isola-se o fragmento de plasmideo residual de ADN grande.

Este fragmento de ADN é depois transformado com o fragmento de ADN sintético da forma *3 Ncol BssH2 BI B2 His B4 B5 B6

5'- C ATG GCA ACA ACA TCA ACA GGA AAT TCG GCG CGC TTT GTG CAC CAG CAC CTG

3'- CGT TGT TGT AGT TGT CCT TTA AGC CGC GCG AAA CAC GTG GTC GTG GAC B7 B8 B9 h Dra3 TGC GGC TCC CAC CTA - 3' ACG CCG AGG GTG -5' numa reacção de ligase T4-ADN. Células de E. Coli K12 competentes são transformadas com a mistura de ligação e a mistura de transformação colocada em placas NA que contêm 20 mg/L de ampicilina. As placas são incubadas a 37 °C durante a noite. O ADN de plasmideo é isolado com a enzima de restrição BssH2 de colónias originadas. O ADN de plasmideo desejado é, neste caso, linearizado e diferencia-se assim de ADN de pINT90d, que não contém qualquer local de corte BssH2, e não é, correspondentemente, dissociado. O ADN de plasmideo de um clone, que se comporta correctamente, é designado por pINT345d.

Este serve de material de partida para a construção das variantes de pré-proinsulina descritas em seguida. 18

Exemplo 2: Construção do plasmídeo pINT342d que codifica para a variante pré-proinsulina His(BO) O ADN do plasmideo pINT345d é digerido duplamente com as enzimas BssH2 e Dra3 e o fragmento de plasmideo residual grande é isolado após separação por electroforese em gel. Este fragmento de ADN é transformado com o fragmento de ADN sintético da forma

His BI B2 B3 04 B5 B6 8? 08 09 B10 5' ~ CG CGÇ CAC TTT GTT AAC CAG CAC CTÚ $SC GGC fCC CAC CT.A - 3" 3'- G GTG MA CM TfÚ QTC GTG QhG hCG CCG hGG GT<3 » 5* % BmE2 Kpal h Drs3 numa reacção de ligase T4-ADN. Tem origem o plasmídeo pINT342d que é caracterizado por um local de corte adicional Hpal, face ao plasmídeo de partida. O plasmídeo codifica para uma variante de pré-proinsulina que apresenta uma histidina na posição BO.

Exemplo 3: Construção do plasmídeo pINT343d que codifica para a variante pré-proinsulina His(B-l), Ala(BO) 0 ADN do fragmento de plasmídeo residual descrito no exemplo b é transformado com um fragmento de ADN sintético da forma 19

Eis Má BI B2 33 34 B5 B6 B? BS 39 B10 311 5'- CQ CSC CftC GCT TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TGC CAC CT& - 3' â"~ £ GTG CGA AAA CAA TTG QIC GTG GAC ACG CCG AGG GTG - S" % BssH2 Hpal % s>ra3 numa reacção de ligase T4-ADN. Tem origem o plasmídeo pINT343d que, como também o pINT342d, contém um local de corte adicional Hpal face ao vector de partida.

Exemplo 4: Construção do plasmídeo pINT344d que codifica para a variante pré-proinsulina His(B-2), Ala(B-l), Ala(BO) 0 ADN do fragmento de plasmídeo residual descrito no exemplo b é transformado com um fragmento de ADN sintético da forma

Ri* Alá Ala SI 82 S3 84 B5 36 37 B8 39 310 311 5"“ OG €QC CAC GCT GCT TTT GTT RRC GRG CAC CTG TGC GÇC TCC CAC CTA - 3' 3'~ G GTG CGA. CG A AAA CSA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG -5' h 8ssH2 upal % numa reacção de ligase T4-ADN. Tem origem o plasmídeo pINT344d que é caracterizado por um local de corte adicional Hpal, face ao vector de partida.

Exemplo 5: Expressão das variantes de insulina construídas

Os plasmídeos pINT 342d, 343d e 344d são transformados, a título de exemplo, respectivamente em E. coli K12 W3110. 20

Bactérias recombinantes que contêm os plasmideos para a respectiva variante são depois fermentadas de acordo com o exemplo 4 da patente US com o número de patente 5227293 e o produto bruto desejado para a obtenção da respectiva variante de insulina é assim obtido.

Exemplo 6: Preparação de insulina His(BO), Des(B30)

De acordo com o exemplo 5, a variante de pré-proinsulina é expressa em E. Coli e é isolada, por centrifugação, na forma de corpos de inclusão (inclusion bodies) após lise celular. Os corpos de inclusão são dissolvidos em ureia (8 mole/L), submetidos a uma sulfitólise e purificados por permutadores de aniões (Q-Sepharose) e cromatografia de permeação em gel

(Sephacryl S 2 00) . Os tampões empregues na cromatografia contêm ureia 4 M e Tris/HCl (tris(hidroximetil)aminometano/HCl) 50 mM de pH 8,5. A eluição fraccionada no permutador de aniões realiza-se por aplicação de um gradiente de NaCl 0 até 0,5 Μ. A concentração da ureia é reduzida subsequentemente por ultrafiltração e diluição a < de 1 M e o sulfonato de pré- proinsulina isolado por precipitação a pH 4 e por fim seco. Para o desenvolvimento das pontes de dissulfureto correctas, como estas se apresentam em proinsulina natural, o sulfonato de pré-proinsulina é dissolvido, a pH 10,8, a uma concentração de 0,3 g/L, num tampão que contém glicina 20 mM, misturado com mercaptoetanol (aproximadamente 25-50 mole/mole de pré-proinsulina) e agitado durante a noite a 4 °C. A mistura é subsequentemente ajustada a pH 3,5 com ácido fosfórico e centrifugada. A pré-proinsulina contida no sobrenadante é ajustada a pH 8,2 para a conversão a insulina, após adição de tris (25 mM), e misturada com tripsina (1,5 mg/g de pré- 21 proinsulina). 0 decurso da dissociação proteolítica é seguido por meio de HPLC de fase reversa. Após aproximadamente 6 horas, a mistura contém uma fracção elevada de insulina His(BO), Des(B30) . A reacção é terminada por acidificação a pH 3,5. A purificaão do análogo de insulina realiza-se por cromatografia de troca iónica (S-Hyper-D, Sepracor) e cromatografia de fase reversa (PLRP-S, RP300, Polymer Laboratories). A cromatografia de troca iónica é realizada num tampão que contém 2-propanol a 30% e ácido láctico 50 mM (pH 3,5). A eluição da insulina ligada realiza-se através de um gradiente linear de NaCl 0 até 0,5 Μ. A cromatografia de fase reversa realiza-se em ácido trifluoroacético a 0,1% ao qual, para a eluição, são misturadas quantidades crescentes em acetonitrilo. O produto é isolado por precipitação a pH 5,4 e liofilizado.

Exemplo 7: Formulação de análogos de insulina para a aplicação parentérica

As preparações contêm, por cada mL, 40 ou 100 IE de insulina (1 IE corresponde aproximadamente a 6,2 nmole), 20 mg de glicerina a 85%, 2,7 mg de m-cresol e eventualmente zinco++ (na forma de cloreto de zinco) em solução aquosa esterilizada a pH 4 .

Exemplo 8: Perfil de acção de insulina His(BO), Des(B30) no cão 6 cães (Beagles), respectivamente, obtiveram aplicações subcutâneas de uma preparação com 40 U/mL (exemplo 7) e o conteúdo indicado em zinco. A dose perfez 0,3 IE/kg. No decurso 22 posterior ao ensaio, foi medida a concentração de glicose sanguínea após os tempos indicados. Os valores foram estandardizados percentualmente em relação ao respectivo valor de partida e calculada a média.

Tempo (horas) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 Isento de 100 59 50 61 75 84 89 98 103 97 104 100 zinco 8 0 pg de 100 97 83 75 65 56 51 58 68 72 78 82

zinco++/mL

Exemplo 9: Ligação ao zinco de análogos de insulina

Uma preparação de insulina (insulina 0,3 mM, NaCl 0,13 M, fenol a 0,1%, 100 pg/mL de zinco++ (na forma de cloreto de zinco), tris/HCl 25 mM, pH 7,4) foi dialisada extensivamente contra tampão neutro isento de zinco (3 h contra NaCl 0,15 M, tris/HCl 10 mM, pH 7,4 à temperatura ambiente, 72 h contra tris/HCl 10 mM, pH 7,4 a 15 °C e novamente 16 h contra tris/HCl 10 mM, pH 7,4 a 15 °C) . Os dialisados foram depois acidificados e analisados. A concentração de insulina foi determinada por HPLC de fase reversa e a do zinco por espectroscopia de absorção atómica. Os valores de zinco foram corrigidos com o conteúdo de zinco de uma mistura controlo que não continha qualquer zinco.

Ligação ao zinco

Insulina

Mole de zinco / mole de hexâmero 23

Insulina humana 2,5 Insulina His(B3) 6, 9 Insulina Asp(B3) 4,2 Insulina His(BO), Des(B30) 6, 8 PROTOCOLO DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:

(A) NOME: Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH (B) RUA: - (C) LOCALIDADE: Frankfurt (D) ESTADO FEDERAL: -

(E) PAÍS: ALEMANHA (F) CÓDIGO POSTAL: 65926 (G) TELEFONE: 069-305-5307 (H) TELEFAX: 069-357175 (I) TELEX: - (ii) TÍTULO DO PEDIDO: Novos derivados de insulina para o tratamento de Diabetes mellitus (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 11 (iv) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE DE DADOS: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatible

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS 24 (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, versão # 1.25 (EPA) (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..21 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

Oly lis Vai Glu Gin Cy» Cys Thr Ser Ile tys Ser Leu fyr Cl» Leu 15 10 15 01« Asm 3*yr Cye Asn .20 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos 25 (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..30 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Fhe Vai Hsn Gin Sis Lau Cys Giy ser Eis teu Vai Glu Ala teu 1 5 iô 15

Leu Vàl Cys Gly 01 u Arg <5iy Phô Phã Tyr Thr Pra tya Thr 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: proteina (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: proteina 26 (B) LOCALIZAÇÃO: 1..30 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Bis Phe Vai Asa Gin Hie Leu Cye Gly Ser Hie Leu Vai Glu Ala Leu 1 S 10 15

Tyr Leu Vai Cye Gly Glu Arg Gly Phe Phô Tyr Thr Pro Lye 20 2B 30 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..31 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Hie Ph» Vâl Aan Gia Bis Leu Cye Gly Ser Hie leu Vai Glu Ala Leu 15 10 IS

Tyr Leu Vai Cye Gly Glu Arg Gly Phe Ph© íyr Thr Pro Lya Thr 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 5: 27 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..32 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

His Ala Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala 1 S 10 xs

Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: proteína 28 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..33 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Mia Aia Ala Phe Vai Asn Gin Mis Leu Cys Gly ser His Leu Vai Glu 15 10 15

Ala Leu Tyr leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr TMr Pro t>fm SO 2B 30

Thr (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 98 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..98 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: 29

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Aan Ser Ala Arg Hie Phe Vai &*n Gin 1 5 10 15

Hia Leu Cys Gly Ser Hie Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cye Gly 20 2S 30

Pro Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pró Gly Ala Gly ser 50 55 60

Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ile Vai

65 70 75 SO

Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr S5 90 95

Cye Aan (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 99 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..99 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: 30 «et Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Eis Ala Phe val Asn 1 5 iô 15 Glft Hia Leu Cya Gly Ser Eis Leu vai Glu Ala Leu Tyr Leu val Cys 20 25 30 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lya Thr Arg ftrg Glu Ala Glu 35 40 45 Asp Pro Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly 50 55 60 Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Giu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ile 65 70 75 80 Val Glu Gin Cya Cys Thr Ser ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn 85 90 95

Tyr Çya Aan (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 100 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..100 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: 31

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly h&n Ser Ala Arg tlia Ala Ala Phe Vai 1 & 10 15

Asn Gin Eis Leu Cys Oiy Ser Bis Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai 20 25 30

Cys ely Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pró Lys Thr Arg Arg Glu Ala 3§ 40 45

Glu Asp Pro Gin Vai Gly Gin Vâl Glu Leu Gly Gly Gly Pró Gly Ala 50 5S 50

Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly ser Leu Gin Lys Arg Gly

65 70 75 SO

Ile Vai Glu Gin Cye Cya Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu S5 50 95

Asn Tyr Cys Asn 100 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..30 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: 32

1 S 10 IS

Leu val Cye Gly Glu Arg ©ly Phe Phe fyr *hr Pro Lye Thr 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1..30 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11:

Lisboa, 26 de Setembro de 2006 33

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo, da fórmula I — § S 8 i $ onde significam (A1-A5) (A15-A19) (B8-B18) (B20-B29) R8 os resíduos de aminoácido nas posições AI até A5 da cadeia A de insulina humana ou insulina animal, os resíduos de aminoácido nas posições A15 até AI9 da cadeia A de insulina humana ou insulina animal, os resíduos de aminoácido nas posições B8 até B18 da cadeia B de insulina humana ou insulina animal, os resíduos de aminoácido nas posições B20 até B29 da cadeia B de insulina humana ou insulina animal, Thr ou Ala, 1 R9 Ser ou Gly, RIO Ile ou Vai, R14 Tyr , His, Asp ou Glu, R21 Asn , Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu ou Gin, Rl um qualquer resíduo de aminoácido codificável geneticamente, ausente ou um átomo de hidrogénio, R2 Vai, Ala ou Gly, R3 Asn, His, Glu ou Asp, R4 Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gin, Gly ou Glu, R30 um qualquer residuo de aminoácido codificável geneticamente ou -OH Z um residuo de péptido com 1 até 4 resíduos de aminoácido codificáveis geneticamente, contendo 1 até 4 resíduos de histidina (His), com a condição de o análogo de insulina ou o sal fisiologicamente aceitável do mesmo, da fórmula I, não diferir da insulina humana apenas por variação dos resíduos de aminoácido nas posições R3 ou R3 em combinação com R21 ou R3 em combinação com R4 na fórmula I.
2. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R8 significar Thr, R9 Ser e RIO Ile.
3. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por Rl significar Phe, His, Asn, Asp ou Gly. 2
4. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 3, caracterizado por R30 significar Thr, Ala ou Ser.
5. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 4, caracterizado por R21 significar Asn e RI Phe.
6. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 5, caracterizado por R2 significar Vai, R3 Asn e R4 Gin.
7. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 6, caracterizado por R14 significar Tyr.
8. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 6, caracterizado por R14 significar His.
9. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 6, caracterizado por R14 significar Asp.
10. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 6, caracterizado por R14 significar Glu.
11. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 10, caracterizado por R30 significar Thr. 3
12. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 10, caracterizado por R30 significar Ala.
13. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 10, caracterizado por R30 significar Ser.
14. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 3 e 5 até 10, caracterizado por R30 significar -OH.
15. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 14, caracterizado por Z significar His.
16. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 14, caracterizado por Z significar His-Ala-.
17. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 14, caracterizado por Z significar His-Ala-Ala-.
18. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a cadeia B apresentar a sequência His Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys (SEQ ID NO: 3). 4
19. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a cadeia B apresentar a sequência His Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 4).
20. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a cadeia B apresentar a sequência His Ala Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 5).
21. Análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a cadeia B apresentar a sequência His Ala Ala Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 6).
22. Processo para a preparação de um análogo de insulina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 21, abrangendo a construção de um veiculo de expressão replicável, o qual contém uma sequência de ADN que codifica para um percursor do análogo de insulina com a sequência geral de aminoácidos II 5 Met-X2m- (Arg)p-Z-Rl-R2-R3-R4-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B29) -R30-X1n~Arg- (A1-A5) -Cys-Cys-R8-R9-R10-Cys-Ser-Leu-Rl4-(A15-A19)-Cys-R21 II, onde significa uma cadeia de péptido com n resíduos de aminoácido , em que n significa um número inteiro de 0 até 34, X2m significa uma cadeia de péptido com m resíduos de aminoácido , em que m significa um número inteiro de 0 até 20, P 0, 1 ou 2 R30 significa um qualquer resíduo de aminoácido codificável geneticamente ou está ausente e Z significa um resíduo de péptido com 1 até 4 resíduos de aminoácido codificáveis geneticamente, contendo 1 até 4 resíduos de histidina (His) e as restantes variáveis têm os significados mencionados na reivindicação 1, em que são também válidas as condições mencionadas na reivindicação 1, expressão numa célula hospedeira e libertação do análogo de insulina a partir do seu percursor com métodos químicos e/ou enzimáticos.
23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por a célula hospedeira ser uma bactéria.
24. Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a bactéria ser E. coli. 6
25. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por a célula hospedeira ser uma levedura.
26. Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a levedura ser Saccharomyces cerevisiae.
27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 até 26 para a preparação de um análogo de insulina de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o percursor do análogo de insulina apresentar a sequência Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (SEQ ID NO: 7).
28 . 22 de o Glu Pro Gly Gly Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações até 26 para a preparação de um análogo de insulina acordo com a reivindicação 20, caracterizado por percursor do análogo de insulina apresentar a sequência Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Ser Leu Gin Lys Arg 7 Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (SEQ ID NO: 8) .
29. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 até 26 para a preparação de um análogo de insulina de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o percursor do análogo de insulina apresentar a sequência Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Ala Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (SEQ ID NO: 9) .
30 . Percursor do análogo de insulina de acordo com a reivindicação 22.
31. Percursor do análogo de insulina de acordo com a reivindicação 27.
32. Percursor do análogo de insulina de acordo com a reivindicação 28.
33. Percursor do análogo de insulina de acordo com a reivindicação 29.
34. Sequência de ADN, a qual codifica para um percursor do análogo de insulina de acordo com a reivindicação 30. 8
35. Sequência de ADN, a qual codifica para um percursor do análogo de insulina de acordo com a reivindicação 31.
36. Sequência de ADN, a qual codifica para um percursor do análogo de insulina de acordo com a reivindicação 32.
37. Sequência de ADN, a qual codifica para um percursor do análogo de insulina de acordo com a reivindicação 33.
38. Veiculo de expressão contendo uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 34.
39. Veiculo de expressão contendo uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 35.
40. Veiculo de expressão contendo uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 36.
41. Veiculo de expressão contendo uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 37.
42. Célula hospedeira isolada que está transformada com um veiculo de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 até 41.
43. Preparação farmacêutica contendo pelo menos um análogo de insulina e/ou pelo menos um sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 21.
44. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 43, caracterizada por conter o análogo de insulina e/ou o sal 9 fisiologicamente aceitável do mesmo, na forma dissolvida, amorfa e/ou cristalina.
45. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracterizada por esta conter, além disso, uma substância auxiliar de depósito.
46. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 45, caracterizada por a substância auxiliar de depósito ser sulfato de protamina, em que o análogo de insulina e/ou o sal fisiologicamente aceitável do mesmo se apresenta com o sulfato de protamina num co-cristalizado.
47. Preparação farmacêutica de acordo com uma ou várias das reivindicações 43 até 46, caracterizada por um conteúdo adicional em insulina humana não modificada.
48. Preparação farmacêutica de acordo com uma ou várias das reivindicações 43 até 47, caracterizada por um conteúdo adicional num outro análogo de insulina.
49. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 48, caracterizada por o outro análogo de insulina ser Gly (A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-insulina humana.
50. Solução injectável com actividade de insulina contendo a preparação farmacêutica de acordo com uma ou várias das reivindicações 43 até 49 na forma dissolvida.
51. Solução injectável de acordo com a reivindicação 50, caracterizada por um conteúdo de 1 pg até 2 mg de zinco por cada mL. 10
52. Solução injectável de acordo com a reivindicação 51, caracterizada por um conteúdo de 5 yg até 200 yg de zinco por cada mL.
53. Utilização do análogo de insulina e/ou seu sal fisiologicamente aceitável de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 21 para a preparação de uma preparação farmacêutica, a qual apresenta uma actividade de insulina com entrada em acção retardada.
54. Complexo de insulina-zinco contendo um hexâmero de insulina e 4 até 10 iões de zinco por cada hexâmero de insulina, caracterizado por o hexâmero de insulina consistir em seis moléculas de uma análogo de insulina da fórmula I de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 21.
55. Complexo de insulina-zinco de acordo com a reivindicação 54, contendo 5 até 8 iões de zinco por cada hexâmero de insulina.
56. Complexo de insulina-zinco de acordo com a reivindicação 54 ou 55, caracterizado por a cadeia B do análogo de insulina da fórmula I apresentar a sequência Phe Vai His Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 10).
57. Complexo de insulina-zinco de acordo com a reivindicação 54 ou 55, caracterizado por a cadeia B do análogo de insulina da fórmula I apresentar a sequência 11 Phe Vai Asp Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 11).
58. Preparação farmacêutica contendo pelo menos um complexo insulina-zinco de acordo com uma ou várias das reivindicações 54 até 57.
59. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 58 contendo uma solução ácida.
60. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 59, contendo uma solução ácida do análogo de insulina e/ou do sal fisiologicamente aceitável do mesmo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 21, com uma quantidade correspondente em iões de zinco, a qual possibilita a formação de um complexo insulina-zinco de acordo com a reivindicação 54.
61. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 59, contendo um complexo insulina-zinco de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 ou 57.
62. Preparação farmacêutica de acordo com uma ou várias das reivindicações 58 até 61, caracterizada por conter o complexo de insulina-zinco na forma dissolvida, amorfa e/ou cristalina.
63. Solução injectável com actividade de insulina, contendo a preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 62 na forma dissolvida. 12
64. Solução injectável de acordo com a reivindicação 63, caracterizada por um conteúdo de 1 yg até 2 mg de zinco por cada mL.
65. Solução injectável de acordo com a reivindicação 64, caracterizada por um conteúdo de 5 yg até 200 yg de zinco por cada mL.
66. Utilização do complexo de insulina-zinco de acordo com uma ou várias das reivindicações 54 até 57 para a preparação de uma preparação farmacêutica, a qual apresenta uma actividade de insulina com entrada em acção retardada. Lisboa, 26 de Setembro de 2006 13