JPH03175976A - シゾサッカロミセス・ポンベによる動物蛋白質の分泌生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　）による動
物蛋白質の分泌生産に関する。

〔従来の技術〕

近年、遺伝子組換え技術を用いて、エシェリキア・コリ
（Ｅｓｃｈｓｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　、バチルス・
サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、
サツカロミセス・セレビシｘ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの微生物で有用蛋
白質を生産させるための研究がさかんに行われており、
その一部はすでに工業化されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、これらの微生物によって生産された蛋白質の中
には、動物の生体内で生産される天然型とは異なり、活
性を持たないものがある。従って、動物細胞でこれらの
天然型蛋白質を生産する方法が試みられているが、一般
に動物細胞には生産性が低いという欠点がある。

〔問題点を解決するための手段〕

シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒ。

ｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　）は酵母に属するが、サツカ
ロミセス・セレビシェよりも動物細胞に近縁であると考
えられている。従って、シゾサッカロミセス・ポンベで
動物遺伝子を発現させることしこよって、動物細胞の場
合と同様に天然型の遺伝子産物が得られることが期待さ
れる。

しかし、シゾサッカロミセス・ポンベを用いた遺伝子組
換えに関する研究はサツカロミセス・セレビシェを用い
た場合に比べてかなり遅れており、遺伝子発現に関する
研究はきわめて少ない。シゾサッカロミセス・ポンベに
よる動物遺伝子の発現に関しては、ヒトα−アンチトリ
プシン遺伝子（特開昭６１−１８１３９７号）およびヒ
トＣＤＣ２遺伝子（Ｍ、Ｇ、Ｌｅｅ　＆　Ｐ、Ｎｕｒｓ
ｅ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　＋３２７、３１（１
９８７））が報告されているが、これらの遺伝子産物は
いずれも菌体内に生産される。

有用な動物蛋白の多くは、分泌蛋白であり、ｉ）活性型
とし、て生産させること、ｉｉ）その生産量が高いこと
、ｈｉ）精製が容易であること、などを期待する場合に
は、目的とする有用蛋白を菌体外に生産（分泌生産）さ
せることが必要である。しかし、シゾサッカロミセス・
ポンベによる動物蛋白の分泌生産はこれまで、まったく
知られていない。

一方、前述のとおり、シゾサッカロミセス・ポンベにお
ける遺伝子発現の例は少ないが、これは強力なプロモー
ター、およびシグナルペプチドが用いられていないため
であると本発明者等は考えた。そして、本発明者らはシ
グナルペプチドをコードするＤＮＡの３′末端に動物蛋
白をコードするＤＮＡを有するＤＮＡをシゾサッカロミ
セス・ポンベで機能するプロモーターの下流に連結させ
たＤＮＡをシゾサッカロミセス・ポンベに導入し、得ら
れた形質転換体を培養することによって、従来の方法と
異なり、シゾサッカロミセス・ポンベを用いて該動物蛋
白を培地中に分泌生産する方法を提供するものである。

即ち、本発明は、（１）シゾサッカロミセス・ポンベで
機能できるプロモーター領域を含有するＤＮＡの３′末
端にシグナルペプチドおよび動物蛋白質をコードするＤ
ＮＡを結合させたＤＮＡを保持するシゾサッカロミセス
・ポンベ、（２）プロモーターがグリセラルデヒド−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤ）遺伝子のプロモー
ターである上記１記載のシゾサッカロミセス・ポンベ、
（３）動物蛋白質がヒトリゾチームである上記ｌ記載の
シゾサッカロミセス・ポンベ、（４）動物蛋白質がヒト
神経成長因子である上記ｌ記載のシゾサッカロミセス・
ポンベ、および（５）上記ｌ記載のシゾサッカロミセス
・ポンベを培養し、培養物中に動物蛋白を生成蓄積させ
ることを特徴とする動物蛋白質の製造法に関する。

本発明の遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、シ
ゾサッカロミセス・ポンベで機能するものであればいず
れでもよく、その具体例としては、サツカロミセス・セ
レビシェのグリセラルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＧＬＤ）遺伝子のプロモーター　ＳＶ４０プロモ
ーター（Ｎ、　Ｆ、　Ｋａｕｆｅｒ　らネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）、３１８．７８（１９８５）’］　などが
挙げられ、その他シゾサッカロミセス・ポンベの遺伝子
のプロモーターであれば何でもよい。

シグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては、それぞ
れの動物遺伝子に本来台まれているＤＮＡを用いるか、
あるいは酵母や糸状菌の分泌蛋白遺伝子のＤＮＡを用い
ても良い。また、これらのＤＮＡを化学合成したものを
用いることもできる。

シグナルペプチドとしてはシゾサッカロミセス・ポンベ
で機能するものであれば何でもよく、例えばヒトリゾチ
ーム、卵白リゾチームおよびその改良型、糸状菌のグル
コアミラーゼ、酵母のα−ファクター、キラー因子、フ
ォスファターゼなどのシグナルペプチドなどが挙げられ
る。

本発明において、シゾサッカロミセス・ポンベで発現さ
れる遺伝子の産物としては、動物の酵素、成長因子、ホ
ルモン、サイト力イン、ウィルス蛋白などがあり、その
具体例としては、ヒトリゾチーム、プロティンジスルフ
ィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ヒトＥ　Ｇ　Ｆ　（ｅｐ
ｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒａｗｔｈ　ｆａｃｔａｒ）、ヒト
Ｎ　Ｇ　Ｆ　（ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏ
ｒ）　、成長ホルモン、インシュリン、インターフェロ
ンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、イン
ターロイキン２、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原、リンホト
キシンなどが挙げられる。これらの遺伝子は相補Ｄ　Ｎ
　Ａ　（ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　）　、ジェノミックＤＮＡ（
ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　）を用いてもよく、また
化学合成をしたものを用いてもよい。

発現させたい遺伝子のシグナルペプチドコード領域と成
熟蛋白コード領域との間にプロペプチドをコードする領
域が存在する場合には、その遺伝子をそのまま発現させ
てもよい。また、プロペプチドコード領域が存在しない
場合には、該プロペプチドコード領域をシグナルコード
領域と成熟蛋白コード領域の間に挿入し、その遺伝子を
発現させてもよい。

本発明の発現に用いるベクターとしては、シゾサッカロ
ミセス・ポンベで複製できるものなら何でもよく、具体
的にはｐ　Ｄ　Ｂ　２４８　ＣＤ、　ＢｅａｃｈとＰ。

Ｎｕｒｓｅ、ネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ）、　２９０．１
４０　（１９８１））。

ｐ　Ｐ　Ａ　−４（Ｓ、　Ｅｌｌｉｏｔｔら、ジャーナ
ルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、）。

２６１、２９３６　（１９８６））、　　ｐ　Ｓ　ＨＩ
３　（Ｓ、　Ｈａｒａｓｈｉｍａ　ら。

モレキュラーセルラーバイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ
。

Ｂｉｏｌ、）、　４．７７１　（１９８４））などが挙
げられる。

遺伝子を発現させるプラスミド（発現プラスミド）は、
上記のベクターにプロモーターを挿入し、そのプロモー
ターの下流に発現させたい遺伝子を連結するか、あるい
は、プロモーターの下流に遺伝子を連結させたＤＮＡ断
片を該ベクターに挿入することなどによって得られる。

この場合、遺伝子の下流にシゾサッカロミセス・ポンベ
で機能できるターミネータ−を挿入することによって該
遺伝子の発現量を高めることも可能である。

本発明における発現プラスミドを構築するための方法は
公知であり、文献たとえば〔「モレキュラー・クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（１９
８２）、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−（Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）］に記載されている。

発現プラスミドは酵母で遺伝子を発現できるプラスミド
であれば何でもよく、ヒトリゾチーム発現プラスミドと
しては、実施例１および２に記載されているｐＤＢ７お
よびＰＤＢＬＩＯＩなどが挙げられる。また、ヒトＮＧ
Ｆ発現プラスミドとしては実施例５に記載されているｐ
ＤＢＮＩＯＩなどが挙げられる。

本発明で用いるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉ
ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　）の菌
株としては、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃ
ｈ　ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）
　Ａ　Ｔ　ＣＣ３８３９９（ｈ　”−１ｅｕｌ　−３２
）。

シゾサッカロミセス・ポンベＴ　Ｈ１６８（ｈ　”ａｄ
ｅ６−Ｍ２］Ｏｕｒａ　１　１ｅｕ　↓）（阿、　Ｋ１
５ｈｉｄａ　ａｎｄ　Ｃ，Ｓｃｈｉｍａｄａ、カレント
ジエネテイクス（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｕｓ
、）、　１０．４４３　（１９８６）　）などが挙げら
れ、シゾサッカロミセス・ポンベＡＴＣＣ３８３９９は
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ）から入手することができる。

上記のようにして得られた発現プラスミドを用いてシゾ
サッカロミセス・ポンベを形質転換する。

形質転換の方法それ自体は公知であり、たとえばリチウ
ム法〔伊藤等（Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、）　、　　ｒジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、）」。

１５３、１６３　（１９８３）Ｌプロトプラスト法〔ヒ
ンネン等（Ｈｉｎｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）　、　　ｒプ
ロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、ＵＳＡ）Ｊ　、　７５．１９２７　（１９７８
））などが挙げられる。このようにして発現プラスミド
を有するシゾサッカロミセス・ポンベ（組換え体）を得
る。

このようにして得られた形質転換株（組換え体）をそれ
自体公知の方法で培養する。

培地としては、例えばパークホルダー（Ｂｕｒｋｈ。

１ｄｅｒ）　Ｒ少培地〔「アメリカンジャーナルオブボ
タニー（Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｂｏｔ、）　、　３０．２０６
　（１９４３））あるいはその改変培地〔東江等（Ｔｏ
ｈ−ｅ　、Ａ、ｅｔ　ａｌ、）「ジャーナルオブバクテ
リオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　Ｊ　、　１
１３．７２７　（１９７３））、または低リン酸培地〔
東江等（Ｔｏｈ−ｅ　、Ａ、ｅｔ　ａｌ、）　　ｒジャ
ーナルオブバクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｓｒｉｏ
ｌ、）Ｊ　＋　１１３＋７２７　（１９７３））などが
挙げられる。培養は通常１５℃〜４０℃、好ましくは２
４°Ｃ〜３７℃で１０〜１６８時間、好ましくは４８〜
９６時間行う。振どう培養でも静置培養でも良いが、必
要に応じて通気や攪拌を加えることもできる。

培養終了後、それ自体公知の方法で細胞と上清とを分離
する。たとえば、細胞内に残存する遺伝子産物は、当分
野における通常の方法、たとえば超音波破砕法、フレン
チプレスなどを利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕
法、細胞溶解酵素による破砕法などにより細胞を破砕す
る。さらに必要ならば、トリトン−Ｘ１００、デオキシ
コーレートなどの界面活性剤を加えることによって産生
された遺伝子産物を抽出する。このようにして得られた
培養上清、あるいは抽出液中に含まれる遺伝子産物は通
常の蛋白質精製法、例えば塩析、等電点沈殿、ゲルろ過
、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ，ＦＰＬＣ等）などにしたがって精
製され、目的とする遺伝子産物を得ることができる。

上記で得られるヒトリゾチーム活性は例えばミクロコツ
カスルーテラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕ
、ｓ）菌体の吸光度の減少を指標とした言付（ｙｏｓｈ
ｉｍｕｒａＪら〔バイオケミカルアンドバイオフィジカ
ルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｎ＋ｕｎ、）」、１４５
，７１２　（１，９８７））によって記載されている方
法で測定することができる。また、ＮＧＦの活性は例え
ばＰＣ１２細胞における神経線維（ｎｅｕｒｏｎ）の伸
長を指標とした方法［Ｌ、Ａ。

Ｇｒｅｅｎｅ　、プレインリサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ）、　１３３．３５０　（１９７７）；　
Ｒ，Ｈｅｕｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、エクスペリメンタ
ルセルリサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、　１４５，１７９　（１９８３
））で測定することができる。

ヒトリゾチーム、ヒトＮＧＦ以外の遺伝子産物について
も公知の方法に従って分離精製される。

以下に、実施例をもって本発明を更に詳しく説明するが
、本発明はこれに限定されることはない。

また、実施例１で開示するエシェリキア・コリＤＨＩ／
ｐＤＢ２４８およびエシェリキア・コリＤＨ１／ｐＤＢ
Ｋ７は財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にそれぞれ受託番
号ＩＦＯ１４７９４および工ＦＯ１４７９５として、ま
た、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲ
Ｉ）に昭和６３年１２月７日から、それぞれＦＥＲＭ　
　Ｐ−１０４４０およびＦＥＲＭ　　Ｐ−１０４３９と
して寄託されている。

プラスミドＰＧＦＬ７３５を保持するサツ力ロマイセス
ーセレビシｘ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）Ａ　Ｈ２２Ｒ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａ　Ｈ２２Ｒ／　ｐ
　Ｇ　Ｆ　Ｌ７３５）はＩＦＯに受託番号ＩＦ○　１０
２２７として、また、ＦＲＩに昭和６２年２月５日から
受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−４３４６として寄託されて
いる。プラスミドｐ　ＧＨＬ　１３０を保持するサツカ
ロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒ。

ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＡＨ２２Ｒ−（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　
Ａ　Ｈ２２Ｒ／　ｐ　Ｇ　ＨＬ　１３０）はＩＦＯに受
託番号ＩＦ○　１０４２４として、また、ＦＲＩに昭和
６２年８月２２日から受託番号ＦＥＲＭＰ−９５３０と
して寄託されている。

また、実施例７および３で得られたシゾサツカロミセス
０ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
ｐｏｍｂｅ）Ａ　Ｔ　ＣＣ３８３９９／　ｐ　Ｄ　Ｂ　
Ｎｌ０１．およびシゾサツカロミセス０ポンベ（Ｓｃｈ
ｉｚｏｓａｃｃｈａ’ｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）Ａ
ＴＣＣ３８３９９／ｐＤＢＫ７は、財団法人発酵研究所
（ＩＦＯ）にそれぞれ受託番号ＩＦ○１０４７６および
ＩＦＯ１４７７７として、また、通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に平成１年９月２０日
から、それぞれＦＥＲＭ　　ＢＰ−２６０２およびＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−２６０３として寄託されている。

実施例１゜ ヒトリゾチーム　　プラスミドの　　　エサッ力ロミセ
ス・セレビシェ−用のヒトリゾチーム発現プラスミドｐ
ＧＦＬ７３５（ヨーロッパ特許公開Ｅ　Ｐ　−Ａ−０２
５１７３０）の化学合成したヒトリゾチーム遺伝子の下
流にあるＸｈｏ１部位をＳｍａＩ部位に変換したプラス
ミドｐＧＦＬ　７３５　Ｓｍより、グリセラルデヒド−
３−リン酸デヒドロゲナ−ゼ（ＧＬＤ）遺伝子のプロモ
ーターおよび改良型卵白リゾチームシグナルペプチドと
ヒトリゾチームをコードする領域を含む１．５ｋ　ｂ　
　Ｂａｎ　ＨＩ　−５ｍａｌ断片を単離した。該断片に
ＢａｍＨＩリンカ−ｐＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結したのち、ＢａｍＨＩで処理し、１．
５ｋｂＢａｍＨＩ断片を得た。

一方、シゾサッカロミセス・ポンベで複製が可能なプラ
スミドｐ　Ｄ　Ｂ　２４８　（Ｄ、　ＢａａｃｈとＰ、
　Ｎｕｒｓｅ、ネイチ’ｒ−（Ｎａｔｕｒｅ）、　２９
０．１４０　（１９８１））をＢａｍＨＩで切断し、上
記の１．．５ｋ　ｂ　　Ｂａｍ　ＨＩとＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結したのち、これを用いてエシェリキア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＤＨ工の形質
転換を行った。

アンピシリン耐性・テトラサイクリン感受性の形質転換
体の中からプラスミドを単離し、これをＰＤＢＫ７と命
名した（第１図）。

実施例２゜ ヒト１ゾ　−ム　　プラスミ′の　　　２サツカロミセ
ス用のヒトリゾチーム発現プラスミドｐ　Ｇ　ＨＬ　１
３０　［Ｋ、　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、バイオケミカル
バイオフィジカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｓｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ
、）、１５０゜７９４　（１９８ｇ））をＢａｍＨＩで
完全に切断したのちＸｈｏＩで部分的に切断し、ＧＬＤ
プロモーター（１，０５ｋ　ｂ　）とヒトリゾチームｃ
ＤＮＡ　（１，５ｋｂ）を含む２．５５ｋ　ｂ　　Ｂａ
ｍ　ＨＩ−Ｘｈｏｌ断片を単離した。この２．５５ｋ　
ｂ　　Ｂａｎ　ＨＩ−Ｘｈｏｌ断片にＸｈｏｌ　−Ｂａ
ｍ　ＨＩアダプターをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したの
ち、プラスミドｐＤ８２４８〔前出〕に挿入し、プラス
ミｐＤＢＬ１０１を得た。

実施例３゜ 畏！女栓壜− 実施例１で得たｐＤＢＫ７および実施例２で得たｐＤＢ
Ｌｌｏｌを用いてリチウム法（Ｉｔｏら、（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、）、　１５３．１６３　（１９８
３））でシゾサツカロミセスｅポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　）ＡＴＣＣ３
８３９９の形質転換を行うことにより、形質転換体シゾ
サッカロミセス・ポンベ（５ｃｈｉｚ。

ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）　Ａ　Ｔ　
ＣＣ３８３９９／　ｐ　Ｄ　ＢＫ７、およびシゾサッカ
ロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏａ＋
ｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３８３９９／　
ｐ　ＤＢＬＩＯＩを得た。

実施例４゜ ヒトリゾチームの　”生産 実施例３で得られた形質転換体シゾサツカロミセス０ポ
ンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏ
ｍｂｅ）　ＡＴＣＣ３８３９９／ＰＤＢＫ７、およびシ
ゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＡＴＣＣ３８３９９／ｐ
　ＤＢ　Ｌ　　１０１をシヨ糖８．９％。

グル’：１−ス１．１％、硫安０．５％、　ＫＨ，Ｐｏ
、　０．０４４％を含む改変パークホルダー（Ｂｕｒｋ
ｈｏｌｄｅｒ）培地１：Ａ、　Ｔｏｈ−ｅら、ジャーナ
ルオブバクテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
）、１１３．７２７　（１９８３））に接種し、３０℃
で３日間振どう下で培養した。この培養液１　ｍ　Ｑを
４ｒｎＱの同じ培地を含む試験管に移し、３０℃で１日
間振どう下で培養した。次に、その培養液２ｍαを１８
ｍ　Ｑの同じ培地を含む２００　ｍＱ容三角フラスコに
移し、３０℃で６日静置または振とう下で培養した。得
られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。

ミクロコツカス・リソデイクチカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ　１ｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）の凍結乾燥菌体
（シグマ社製）の０．５ｇを１００ｍ　Ｑの０．１Ｍカ
リウムリン酸緩衝液ｐＨ６，２に懸濁した。この懸濁液
に１．５ｇの寒天を加え、１２０℃で１５分間加熱した
のち、そのｌｏｍ　Ｑを直径９ｃｍのプラスチック製シ
ャーレにまき、固化した。固化した寒天層に直径３ｍｎ
の穴をあけた。この穴に上記の培養上清（５μＱ）を入
れ、３７℃でｌ夜保温すると穴の周囲にミクロコツカス
・リソデイクチカスの溶菌内がｔＲ察され、該培養上清
中にヒトリゾチームが存在することが分かった。

一方、対照としてのシゾサツカロミセス・ボン／＜ＡＴ
ＣＣ３８３９９の培養上清あるいはプラスミドｐＤ８２
４８（前出）を保持するシゾサッカロミセス・ポンベＡ
ＴＣＣ３８３９９の培養上清では溶菌内が観察されなか
ったことがら、本発明の形質転換されたシゾサッカロミ
セス・ポンベによってヒトリゾチームが分泌生産されて
いることが分った。

上記の培養上清のヒトリゾチーム活性をミクロコツカス
ルーテラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓ　
）菌体の吸光度の減少を指標とした方法〔バイオケミカ
ルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーション
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃ
ｏｍｍｕｎ、）＋１４５、７１２（１，９８７））で測
定した。シゾサツカロミセス０ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　）ＡＴＣＣ３
８３９９／ｐＤＢＫ７の培地中には著量のヒトリゾチー
ムが生産されており、その生産量は撮とう下で培養した
場合よりも静置下で培養した場合の方が約５倍多かった
（第２図）。一方、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃ
ｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ　）Ａ
ＴＣＣ３８３９９／ｐＤＢ２４８の培養上清中にはヒト
リゾチーム活性は検出されなかった。

実施例Ｓ　ヒトリゾチームの精 実施例３で得られた形質転換体を実施例４と同様の方法
で大量に培養した。

得られた培養上清ＩＱを０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，
０−５ｍＭ　ＥＤＴＡで平衡化したＳ　−５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ（ファルマシア）に吸着させ、同じ緩衝液で洗浄
したのちＯ，］、Ｍリン酸緩衝液ｐ　Ｈ６，０−０，５
Ｍ　Ｎａｃｆ２−５ｍＭ　ＥＤＴＡで溶出した。ヒトリ
ゾチームを含む画分を集め、セントリプレツブ（アミコ
ン社）で濃縮した。得られた濃縮液からヒトリゾチーム
を逆相ＨＰＬＣでさらに精製した。即ち、濃縮液をＴＳ
Ｋゲル○ＤＳ１２０Ｔにかけ、蒸留水＋０．１％トリフ
ルオロ酢ｍ　（ＴＦＡ）で洗浄したのち０．１％ＴＦＡ
を含む０−１００％アセトニトリルで溶出し、ヒトリゾ
チームのＭ製標品８０μｇを得た。逆相ＨＰＬＣで調べ
たところ、得られたヒトリゾチームは単一ピークを示し
、そのｒａｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ（３０，７分）は
人乳由来の標準品（Ｓｉｇｍａ製）のそれと一致した。

実施例６　　　ヒトリゾチームの物性および゛実施例５
で得られたヒトリゾチームの精製標品を用いて諸性質を
調べた６ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べたとこ
ろ、精製ヒトリゾチーム分子量は１４．７キロダルトン
（ｋＤａ）であり、人乳由来のヒトリゾチーム（Ｓｉｇ
ｍａ社製）のそれと一致した。

精製ヒトリゾチームをガラス製加水分解用試験管にとり
、減圧下で乾燥後、４％チオグリコール酸を含む５．７
Ｎ塩酸を加え減圧下で封管したのち、１１０℃、２４時
間加水分解した。加水分解後、塩酸を減圧下で除去し、
残渣を０．０２Ｎ塩酸に溶解してアミノ酸分析を行った
。その結果を第１表に示す。

第１表　　　アミノ酸組成 アミノ酸　　　実験値　ｌ）　　　　理論値Ａｓｘ２）
　　　１５．３　　　　　１８Ｔｈｒ　　　　　　４．
７　　　　　　５Ｓｅｒ　　　　　　６．４　　　　　
　６Ｇｌｘ３）　　　１０．５　　　　　　９Ｐｒｏ　
　　　　　１．９　　　　　　２Ｇｌｙ　　　　　１３
．０　　　　　１１Ａｌａ　　　　　１１．５　　　　
　１４Ｖａｌ　　　　　　７．５　　　　　　８Ｍｅｔ
　　　　　　２．０　　　　　　２ＩＩｓ　　　　　　
４．８　　　　　　５Ｌｅｕ　　　　　　　　　　８．
　２ Ｔｙｒ　　　　　　　　　５．４ Ｐｈｅ　　　　　　　　　　２．　５ Ｌｙｓ　　　　　　　　　５．０ Ｈｉｓ　　　　　　　　　　１．３ Ｔｒｐ　　　　　　　　　３・　３ Ａｒｇ　　　　　　　１０．　９ １）Ｌｙｓを５として計算した。

２）Ａｓｐ＋Ａｓｎ ３）Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ 精製ヒトリゾチームのＮ末端アミノ酸配列を気相プロテ
ィンシーケンサ−（アプライドバイオシステム社モデル
４７０Ａ）を用いて決定した。その結果、精製ヒトリゾ
チームのＮ末端アミノ酸配列は天然型と一致しているこ
とが明らかとなった（第２表）。

第２表　　Ｎ末端アミノ酸配列 サイクル　ＰＴＨ−アミノ酸　　ＤＮＡより推定さＲｅ
５ｉｄｕｅ　　　ｐ　ｍｏｌｅ　　れるアミノ酸配列Ｌ
ｙｓ　　　　１９９　　　　Ｌｙｓ Ｖａｌ　　　　１３６　　　　Ｖａｌ Ｐ　ｈ、　ｅ　　　　１３９　　　　Ｐ　ｈ　ｅＧｌｕ
　　　　１０８　　　　Ｇｌｕ Ａｒｇ　　　　１０７　　　　Ａｒｇ ７　　　　Ｇｌｕ ８　　　　Ｌｅｕ ９　　　　Ａｌａ １０　　　　Ａｒｇ １１　　　　Ｔｈｒ １２　　　　Ｌｅｕ １３　　　　Ｌｙｓ １４　　　　Ａｒｇ １５　　　　Ｌｅｕ １６　　　　Ｇｌｙ １７　　　　Ｍｅｔ ６４　　　　　　Ｇｌｕ ６９　　　　　Ｌｓｕ １０２　　　　　　Ａｌａ ６８　　　　　Ａｒｇ ２２　　　　　Ｔｈｒ ５５　　　　　　Ｌｅｕ ３９　　　　　Ｌｙｓ ６０　　　　　Ａｒｇ ５２　　　　　　Ｌｅｕ ３６　　　　　Ｇｌｙ ３４　　　　　　Ｍ　ｅ　ｔ １８　　　　Ａｓｐ　　　　　　３１　　　　　Ａｓｐ
１９　　　　Ｇｌｙ　　　　　　３４　　　　　Ｇｌｙ
２０　　　　Ｔｙｒ　　　　　　２９　　　　　Ｔｙｒ
２１　　　　Ａｒｇ　　　　　　３５　　　　　Ａｒｇ
２２　　　　Ｇｌｙ　　　　　　３０　　　　　Ｇｌｙ
２３　　　　ＩＩｓ　　　　　　２２　　　　　　ｒｌ
ｅ２４　　　　Ｓｅｒ　　　　　　　　４　　　　５ｅ
ｒ２５　　　　Ｌｅｕ　　　　　　１８　　　　　　Ｌ
ｅｕ２６　　　　Ａｌａ　　　　　　２７　　　　　　
Ａｌａ２７　　　　Ａｓｎ　　　　　　２０　　　　　
Ａｓｎ２８　　　　Ｔｒｐ　　　　　　　４　　　　　
Ｔｒｐ２９　　　　Ｍｅｔ　　　　　　　　７　　　　
　Ｍｅｔ得られたヒトリゾチーム精製標品の溶菌酵素活
性をミクロコッカスルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ
　１ｕｔｓｕｓ）の菌体懸濁液の吸光度の減少を指標と
した方法（前出）で測定した結果、精製標品の比活性は
ｓ４１品（Ｓｉｇｍａ社製〉のそれとほぼ一致した。

以上の結果から、シゾサッカロミセス・ポンベでヒトリ
ゾチーム遺伝子を発現させると、シグナルペプチドと成
熟蛋白との間の切断（プロセッシング）が正確に行われ
、天然型と同一のヒトリゾチームが培地中に生産される
ことが明らかになった。

実施例７　ヒトＮＧＦ　　　プラスミドのヒト白血球Ｄ
ＮＡより作製されたλＥＭＢ　Ｌ　３ゲノムライブラリ
ー〔クロンチック（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）社〕を大腸菌Ｎ
Ｍ５３８に感染させたのち、軟寒天プレート上に約３Ｘ
１０’クローンずつ撒いた。プラークをナイロンメンプ
ラン（アマジャム社、ハイボンド−Ｎ）上に移した後、
０．５Ｎ　ＮａＯＨ−１，５ＭＮａＣ１溶液に６分間浸
し、ファージＤＮＡを変性させた後、０．５Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣ１（ｐ　Ｈ８゜０）　−１，５Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ
１溶液に６分１？ｌｆｆ浸した。本メンプランを２ＸＳ
ＳＣ溶液に浸し、風乾後８０℃、２時間処理することに
よりＤＮＡをメンプランに固定した。

一方、既知〔アルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ、Ａ、）ら、
ネイチ’ｒ−（Ｎａｔｕｒｅ）　３０３，８２１（１９
８３）ＥのヒトＮＧＦ遺伝子を参考にしてヒトβＮＧＦ
をコードするＤＮＡ　（０，３３ｋｂ）を化学合成し、
これをＤＮＡラベリングキットにツボンジーン社）を用
いて”Ｐで標識したものをプローブとした。

ＤＮＡを固定したフィルターを、標識プローブを含む、
６ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣｌ　、０
．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）　ｒ　５　ＸＤａｎｈ
ａｒｄｔ’ｓ、　０．５％ＳＤＳ、２０μｇ／ｍＱ変性
サケ精子ＤＮＡ溶液中１０ｍＱ中で６５℃、１６時間、
保温した。

反応後、フィルターを２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ溶液
中で室温で５分ずつ３回、ｌＸ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ
溶液中で、６０℃で６０分洗浄した。洗浄したフィルタ
ーを乾燥させた後、ラジオオートグラムをとり、プロー
ブと反応するクローンを検索した。この方法により得ら
れたクローンλβＬＮ２１１３よりデイヴイス（Ｄａｖ
ｉｓ）らの方法（Ｄａｖｉｓら、「アドバンスト・バク
チリアル・ジェネティクス（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）Ｊ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　ＩＩａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１
９８０）によりファージＤＮＡを抽出した。

次にλβＬＮ２１１３をＳｍａ　ＩとＡ　ｐ　ａ　Ｉで
切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ（約１　ｋｂ）
を切り出し、プラスミドｐ　Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　
ＩＩ　Ｋ　（トーヨーボーより購入）のＳｍａｒ、Ａｐ
ａ１部位を挿入し、プラスミドｐＮＧＦＰ１０７Ｇを得
た。

挿入された部分の塩基配列をシークナーゼ（トーヨーボ
ー）を用いて決定した（第３図）。決定された塩基配列
はネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０３，８２１（１，
９８３）に記載されている配列と、蛋白コード領域では
完全に一致した。

得られたプラスミドｐＮＧＦ１０７Ｇを制限酵素１３ｃ
ｌＩおよびＡｐａＩで切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片（０，８ｋｂ）を単離した。

この０．８ｋｂ　Ｂｃｌ　Ｉ−ＡｐａＩ断片と化学合成
アダプター（第４図参照）とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結した後、ＸｈｏＩで切断することによって０
．８ｋｂ　Ｘ　ｈ　ｏ　Ｉ　　ＤＮＡ断片が得られた。

このＸｈｏＩ　　ＤＮＡ断片とＸｈｏＩで切断したＰＧ
ＬＤ９０６−１　（伊藤等、ＢＢＲＣ凍μ：２６８−２
７４　（１９８６）　；ＥＰ−Ａ−０２３５４３０：ｌ
　とを連結することによってプラスミドｐＧＧＮ２２８
　（ＦＥＲＭＢＰ−２５３１，ＩＦＯ１０４７３）を得
た（第４図）。

上記で得られたｐＧＧＮ２２８をＸ　ｈ、　ｏ　Ｉで切
断した後、ＰｓｔＩで部分切断し、ヒトＮＧＦの全シグ
ナル配列及びプロ領域のＮ末１０アミノ酸（ｉｏ個）を
コードするＤＮＡを除去した０、７ＫｂのＰｓｔ−Ｘｈ
ｏｌ　　ＮＧＦ断片を得た。

また、改良型シグナル配列（特開昭６４−１０９８７）
及びヒトＮＧＦのプロ領域のＮ末１０アミノ酸をコード
する合成ＤＮＡオリゴマー（＃工〜＃６及びｍｎ　１１
．　ｍｎ　１２）をＴ４−リガーゼにより連結し、改良
型シグナル配列とＮＧＦのプロ領域のＮ末端１０アミノ
酸をコードするＸｈｏＩ−Ｐｓｔｌ断片を単離した。

上記の０．７Ｋｂ　　Ｐｓ　ｔ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ　　Ｄ
ＮＡ断片及び改良型シグナル配列をコードするＸｈｏｌ
−Ｐｓｔｌ　　ＤＮＡ断片を結合し、０．８Ｋ　ｂのｘ
ｈｏＩＤＮＡ断片得た。

このＤＮＡ断片をＸｈｏｌで切断したＰＧＬＤ９０６−
１（前出）と結合することによってプラスミドｐＧＧＮ
３０１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２５３２，ＩＦＯ１０４７４
）を得た（第５図）。

プラスミドｐＧＧＮ３０１をＢａｍＨＩで切断し、ＧＬ
Ｄプロモーター、改良型シグナル配列をコードするＤＮ
Ａ　（ＭＥｓｉｇ）およびプロ領域とヒトＮＧＦをコー
ドするＤ　Ｎ　Ａ　（ｐｒｏＮ　Ｇ　Ｆ　）を含む１．
９ｋｂ　ＢａｍＨＩ　　ＤＮＡ断片を単離した。得られ
た１、９ｋｂＢａｎ＋ＨＩ　　ＤＮＡ断片をｐＤＢ２４
８（前出）のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ヒトＮＧＦ発現
プラスミドｐ　Ｄ　Ｂ　Ｎ　１０１を得た（第６図）。

実施例８ 敷叉鮫逸生囚生髪 実施例７で得られたヒトＮＧＦ発現プラスミドｐＤＢＮ
１０１を用いてシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉ
ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　）　Ａ
　Ｔ　ＣＣ３８３９９の形質転換を行ない、形質転換体
シゾサツカロミセス”ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐ。

ｍｂｅ　）ＡＴＣＣ３８３９９／ｐＤＢＮ１０１を得た
。

実施例９ ヒトＮＧＦの　゛生産 実施例８で得られた形室転換体Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　ＡＴＣＣ３８３９９／
　ｐ　ＤＢＮ　１０１を実施例４と同様の方法で静置下
で３日間培養した。培養液を遠心分離し、その上清中の
ＮＧＦ活性をＰＣ１２細胞を用いた方法（Ｌ、　Ａ、　
Ｇｒｅｅｎｅ　、プレイン　リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ）　、　１３３゜３５０（１９７７）　
；　　Ｒ，Ｈｅｕｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、エクスペリ
メンタルセルリサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃ
ｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、　１４５，１７９（１
９８３））で測定した。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｉｓ　ｐｏｍｂｅ　Ａ　Ｔ　ＣＣ３８３９９／
　ｐ　Ｄ　ＢＮＩＯＩ培養上清にはＰＣ１２細胞の神経
突起（ｎｅｕｒｉｔｅ　）を誘導する活性が認められた
。一方、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐ
ｏｍｂｅ　Ａ　Ｔ　ＣＣ３８３９９／　ｐ　Ｄ　Ｂ　２
４８の培養上清には本活性は認められなかった。本活性
に基づき、マウスＮＧＦ（２゜５Ｓ、　Ｃａ１ｌａｂｏ
ｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）を標準品としてヒ
トＮＧＦを定量したところ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｅｓｓ　ｐｏｍｂｅ　ＡＴＣＣ３８３９９／ｐ
ＤＢＮ１０１の培地中には約１μｇ／Ｌ　（マウスＮＧ
Ｆとして）のヒトＮＧＦが生産されていることが分かっ
た。

鬼朋！ソか４ 本発明のシゾサッカロミセス・ポンベ形質転換体で動物
蛋白質遺伝子を発現させると、シグナルペプチドと成熟
蛋白との間の切断（プロセッシング）が正確に行われ、
天然型と同一の蛋白質が培地中に生産されるものである
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に示したヒトリゾチームの発現プラ
スミドｐＤＢＫ７の構築図を示す。 （−一一は改良型卵白リゾチームシグナルペプチドをコ
ードする領域を、杉酵該はヒトリゾチームをコードする
領域を、ＧＬＤ−ｐはＧＬＤプロモーターをそれぞれ示
す）。 第２図は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
ｐｏｍｂｅ　ＡＴＣＣ３８３９９／ｐＤＢＮ１０２の培
養の経時的変化の１例を示す。実線はヒトＮＧＦの培地
中での生産量を示し、破線はクレット比色計で測定した
該形質転換体の生育をクレットユニットで示した。 第３図は、実施例７で得られたクローン化したヒトＮＧ
Ｆ遺伝子の塩基配列及びこれから翻訳されるアミノ酸配
列を示す。 第４図はプラスミドｐＧＧＮ２２８の構築図を示す。 第５図はプラスミドｐＧＧＮ３０１の構築図を示す。 第６図はヒトＮＧＦ発現プラスミドｐＤＢＮ１０１の構
築図を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）シゾサッカロミセス・ポンベで機能できるプロモ
   ーター領域を含有するＤＮＡの３′末端にシグナルペプ
   チドおよび動物蛋白質をコードするＤＮＡを結合させた
   ＤＮＡを保持するシゾサッカロミセス・ポンベ。
2. （２）プロモーターがグリセラルデヒド−３−リン酸デ
   ヒドロゲナーゼ（ＧＬＤ）遺伝子のプロモーターである
   請求項１記載のシゾサッカロミセス・ポンベ。
3. （３）動物蛋白質がヒトリゾチームである請求項１記載
   のシゾサッカロミセス・ポンベ。
4. （４）動物蛋白質がヒト神経成長因子である請求項１記
   載のシゾサッカロミセス・ポンベ。
5. （５）請求項１記載のシゾサッカロミセス・ポンベを培
   養し、培養物中に動物蛋白を生成蓄積させることを特徴
   とする動物蛋白質の製造法。