ES2554635T3

ES2554635T3 - Variantes de alfa-amilasa con propiedades alteradas

Info

Publication number: ES2554635T3
Application number: ES05755531.0T
Authority: ES
Inventors: Carsten Andersen; Henrik ØSTDAL; Peter Skagerlind
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2004-07-05
Filing date: 2005-07-05
Publication date: 2015-12-22
Anticipated expiration: 2025-07-05
Also published as: US20080193999A1; JP4955546B2; EP3620523A3; CN107151662B; CN101010429B; JP2008504811A; EP3000887A3; EP4269684A3; CA2571864A1; BRPI0512776A; CN103275951A; WO2006002643A2; CN113549606B; WO2006002643A3; CA2854912A1; EP1781790B1; CN107151662A; US20160053244A1; US9920307B2; AU2005259686B2

Abstract

Variante de una matriz de alfa-amilasa tipo Termamyl, cuya variante tiene actividad de alfa-amilasa, dicha variante comprendiendo las sustituciones Y295F y M202L,I,T,V, donde cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº: 12, donde la variante ha aumentado la estabilidad hacia la oxidación relativa a la matriz de alfa-amilasa y donde la variante de alfa-amilasa tiene una identidad de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID nº 12.

Description

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homóloga al 65% aproximadamente con la alfa-amilasa B. stearothermophilus que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº: 6. Se describen más alfa-amilasas homólogas, incluyendo SP690 y SP722, en WO 95/26397 y se representan con más detalle en SEQ ID nº: 2 y SEQ ID nº: 4 respectivamente. Otras amilasas son las AA560 alfa-amilasas derivadas del Bacillus sp. y mostradas en SEQ ID nº: 12, y la alfaamilasa #707 derivada del Bacillus sp., descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31 .

[0035] La alfa-amilasa KSM AP1378 es descrita en WO 97/00324 (de KAO Corporation). Las alfa-amilasas K38 y K38 descritas en EP 1,022,334 también se contemplan según la invención.

[0036] Se muestran otras alfa-amilasas en SEQ ID núms: 13, 14, 15, 16, 17 y 18.

[0037] Todavía más alfa-amilasas tipo Termamyl homólogas incluyen la alfa-amilasa producida por la cepa B. licheniformis descrita en EP 0252666 (ATCC 27811), y las alfa-amilasas identificadas en WO 91/00353 y WO 94/18314. Hay otras alfa-amilasas tipo Termamyl comerciales en los productos vendidos bajo los siguientes nombres comerciales: Optitherm™ y Takatherm™ (de Solvay); Maxamyl™ (de Gist-brocades/Genencor), Spezym AA™ y Spezime Delta AA™ (de Genencor), y Kejstase™ (de Daiwa), Purastar™ ST 5000E, PURASTRA™ HPAM L (de Genencor Int.).

[0038] Debido a la homología sustancial descubierta entre estas alfa-amilasas, se considera que pertenecen a la misma clase de alfa-amilasas, es decir, a la clase de "alfa-amilasas tipo Termamyl".

[0039] Por consiguiente, en el presente contexto el término "alfa-amilasas tipo Termamyl" se usa para indicar una alfa-amilasa, que, en el nivel aminoácido, muestra una identidad sustancial a Termamyl, es decir, el B. licheniformis alfa-amilasa que posee la secuencia de aminoácidos mostrada aquí en SEQ ID nº: 8.

[0040] En otras palabras, todas las alfa-amilasas siguientes, que tiene las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID núms: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 se consideran aquí que pertenecen a las "alfa-amilasas tipo Termamyl". Otras alfa-amilasas tipo Termamyl son alfa-amilasas i) que son homólogas en al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 99%, con al menos una de dichas secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID núms: 12 y/o ii) se codifica por una secuencia de ADN que hibridiza a las secuencias de ADN que codifican las alfaamilasas especificadas anteriormente que aparecen en SEQ ID núms: 11 y en la presente descripción (cuyas secuencias de codificación codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID núms: 12). [0041] Las amilasas de Termamyl también consisten en 1) un dominio catalítico altamente homólogo a Termamyl y 2) un dominio vinculante de carbohidratos (CBM) que deberían ser entendidos como incluidos en esta solicitud. El dominio vinculante se puede localizar en cualquier N-terminal relativo a la secuencia del dominio catalítico o Cterminal relativo al dominio catalítico, donde puede haber más de un CBM localizado, bien en N-terminal, en Cterminal o en ambos. Las amilasas con CBM pueden provenir de fuentes naturales o pueden ser resultado de la ingeniería genética, fusionando el gen que codifica una amilasa con un gen que codifica un CBM.

Homología (identidad)

[0042] La homología se puede determinar como el grado de identidad entre las dos secuencias que indican una deriva de la primera secuencia a la segunda. La homología se determinar puede adecuadamente mediante programas informáticos conocidos en la técnica como GAP, proporcionado en el paquete de programa GCG (descrito arriba). Así, Gap GCGv8 puede utilizarse con la matriz de puntuación por defecto para la identidad y los siguientes parámetros por defecto: penalización por creación GAP 5.0 y penalización por extensión GAP 0.3, respectivo a la comparación de secuencias ácidas nucleicas, y penalización por creación GAP 3.0 y penalización por extensión GAP 0.1, respectivo a la comparación de secuencias de proteínas. GAP usa el método de Needleman y Wunsch, (1970), J.Mol. Biol. 48; p.443-453, para hacer alineamientos y para calcular la identidad.

[0043] Se puede utilizar un alineamiento estructural entre Termamyl (SEQ ID nº: 8) y, por ejemplo, otra alfa-amilasa para identificar posiciones equivalentes/correspondientes en otras alfa-amilasas tipo Termamyl. Un método de obtención de dicho alineamiento estructural es usar el programa Pile Up del paquete GCG usando los valores por defecto de penalizaciones GAP, es decir, una penalización por creación GAP de 3.0 y penalización por extensión GAP de 0.1. Otros métodos de alineamiento estructural incluyen el análisis del agrupamiento hidrofóbico (Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155) y el embobinado inverso (Huber, T; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1 pp. 142-149 (1998).

Hibridación

[0044] La sonda de oligonucleótidos usada en la caracterización del polipéptido, como la alfa-amilasa tipo Termamyl conforme a propiedad ii) se dice arriba que puede prepararse adecuadamente basándose en el nucleótido completo

o parcial o en la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa en cuestión.

[0045] Las condiciones adecuadas para la hibridación de prueba implican el pre-remojo en 5xSSC y la prehibridación durante 1 hora a ~40°C en una solución de 20% formamida, solución del 5xDenhardt, 50mM de fosfato sódico, pH 6.8, y 50mg de ADN del timo de ternero sónico desnaturalizado, seguido por la hibridación en la misma solución suplementada con 100mM ATP durante 18 horas a ~40°C, seguido de tres lavados del filtro en 2xSSC, 0,2% SDS a 40°C durante 30 minutos (baja astringencia), preferiblemente a 50°C (astringencia media), de forma más preferible a 65°C (astringencia alta), incluso de forma aún más preferible a ~75°C (astringencia muy alta). Para más detalles acerca del método de hibridación véase Sambrook et al., Molecular-Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor, 1989.

[0046] En el presente contexto, "derivado de" indica no solo una alfa-amilasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino también una alfa-amilasa codificada por una secuencia de ADN aislada de tal cepa y producida en un organismo huésped transformado con dicha secuencia de ADN. Finalmente, el término indica una alfa-amilasa que se codifica por una secuencia de ADN sintética y/o ADN original y que en la que se identifican características de la alfa-amilasa en cuestión. El término también indica que la alfa-amilasa original puede ser una variante de una alfa-amilasa de origen natural, es decir, una variante resultado de una modificación (inserción, sustitución, eliminación) de uno o varios residuos aminoácidos de la alfa-amilasa de origen natural.

Matriz de alfa-amilasas tipo Termamyl

[0047] Según la invención, todas las alfa-amilasas tipo Termamyl tal y como se han definido anteriormente se pueden utilizar como el la matriz (es decir; segmento principal) de alfa-amilasa. En una forma de realización preferida de la invención, la matriz de alfa-amilasa se deriva de B. licheniformis, por ejemplo, uno de aquellos referidos anteriormente, como la alfa-amilasa de B. licheniformis con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº: 10.

[0048] En una forma de realización preferida, la matriz de alfa-amilasa tipo Termamyl es SP722 o BSG o AA560, incluyendo cualquiera de los siguientes: SP722+R181*+G182*, SP722+D183*+G184*; SP722+D183*+G184*+N195F; SP722+D183*+G184*+M202L; SP722+D183*+G184*+N195F+M202L; SP722+D183*+G184*+R181Q; SP722+D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K; BSG+1181*+G182*; BSG±1181*+G182*+N193F; BSG+,I181*+G182*+M200L; BSG+1181*+G182*+N193F+M200L; AA560+D183*+G184*; AA560+D183*+G184*+N195F; AA560+D183*+G184*+M202L; AA560+D183*+G184*+N195F+M202L; AA560+D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K. "BSG+I181*+G182*+N193F" significa que la alfa-amilasa de B. stearothermophilus ha mutado de la siguiente manera: supresiones en las posiciones I181 y G182 y una sustitución de Asn (N) a Phe (F) en la posición 193.

Matriz híbrida de alfa-amilasas tipo Termamyl

[0049] La matriz de alfa-amilasa (es decir, el segmento principal de alfa-amilasa) también puede ser una alfa-amilasa híbrida, es decir, una alfa-amilasa que comprende una combinación de secuencias de aminoácidos parciales derivada de al menos una alfa-amilasa.

[0050] La matriz de alfa-amilasa híbrida puede ser una que, basándose en la homología de aminoácido (identidad) y/o hibridación de ADN (como fue definido anteriormente), se puede determinar que pertenece a la familia de alfaamilasa tipo Termamyl. En este caso, la alfa-amilasa híbrida está compuesta normalmente de al menos una parte de una alfa-amilasa tipo Termamyl y parte(s) de una o más alfa-amilasas diferentes seleccionadas de alfa-amilasas tipo Termamyl o alfaamilasas tipo no-Termamyl de origen microbiano (bacteriano o fúngico) y/o mamífero.

[0051] Así, la matriz de alfa-amilasa híbrida puede comprender una combinación de secuencias de aminoácidos parciales que derivan de al menos dos alfa-amilasas tipo Termamyl, o de al menos una tipo Termamyl y al menos una alfa-amilasa bacteriana tipo no-Termamyl, o de al menos una tipo Termamyl y al menos una alfa-amilasa fúngica. La alfa-amilasa tipo Termamyl de la que se deriva una secuencia de aminoácidos parcial puede ser cualquiera de aquellas alfa-amilasas tipo Termamyl específicas referidas aquí.

[0052] Por ejemplo, la matriz de alfa-amilasa puede comprender una parte C-terminal de una alfa-amilasa derivada de una cepa de B. licheniformis, y una parte N-terminal de una alfa-amilasa derivada de una cepa de B. amyloliquefaciens o de una cepa de B. stearothermophilus.

Por ejemplo, la α-amilasa original puede comprender al menos 430 residuos aminoácidos de la parte C-terminal de la alfa-amilasa B. licheniformis, y pueden, por ejemplo, comprender a) un segmento de aminoácido correspondiente a 37 residuos de aminoácidos N-terminal de la alfa-amilasa B. amyloliquefaciens con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº: 10, y un segmento de aminoácido correspondiente a 445 residuos aminoácidos C-terminal de la alfa-amilasa B. licheniformis con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº: 8, o una alfa-amilasa tipo Termamyl híbrida siendo idéntica a la secuencia de Termamyl, es decir, la alfa-amilasa del Bacillus licheniformis mostrada en SEQ ID nº: 8, excepto que el 35 residuos de aminoácidos N-terminal (de proteína madura) han sido sustituidos por 33 residuos N-terminal de BAN (proteína madura), es decir, la alfa-amilasa del Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID nº: 10; o b) un segmento de aminoácido correspondiente a 68 residuos aminoácidos N-terminal de la α-amilasa B. stearothermophilus con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº: 6 y un segmento de aminoácido correspondiente a 415 residuos aminoácidos C-terminal de la alfa-amilasa B. licheniformis con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº: 8.

[0053] Otra matriz de alfa-amilasa híbrida adecuada es la descrita previamente en WO 96/23874 (de Novo Nordisk), constituyendo el N-término de BAN, alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (aminoácidos 1-300 de proteína madura) y el C-término de Termamyl (aminoácidos 301-483 de proteína madura).

[0054] Otra matriz de alfa-amilasa híbrida adecuada consiste en la secuencia de SEQ ID núms: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18, y los últimos 99 aminoácidos de SEQ ID núm:13 (AMY1048).

[0055] En una forma de realización preferida de la invención, la matriz de alfa-amilasa tipo Termamyl es una alfaamilasa híbrida de SEQ ID nº: 8 y SEQ ID nº: 10. Específicamente, la matriz de alfa-amilasa tipo Termamyl híbrida puede ser una alfa-amilasa híbrida que comprende los 445 residuos aminoácidos C-terminal de la alfa-amilasa B. licheniformis mostrada en SEQ ID nº: 8 y los 33 residuos aminoácidos N-terminal de la alfa-amilasa derivada de B. amyloliquefaciens mostrada en SEQ ID nº: 10, que además puede tener las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (utilizando la numeración en SEQ ID nº: 8). El último híbrido mencionado se usa en los ejemplos mencionados abajo y es referido como LE174.

[0056] Otra matriz específica de alfa-amilasa contemplada incluye LE174 con mutaciones menores, es decir, el hídrido anteriormente mencionado posee las siguientes mutaciones: A181T+N190F+A209V+Q264S; N190F+A209V+Q264S; A209V+Q264S; Q264S; H156Y+N190F+A209V+Q264S; H156Y+A209V+Q264S; H156Y+Q264S; H156Y+A181T+A209V+Q264S; H156Y+A181T+Q264S; H156Y+Q264S; H156Y+A181T+N190F+Q264S; H156Y+A181T+N190F; H156Y+A181T+N190F+A209V. Estos híbridos son también considerados parte de la invención.

[0057] En una forma de realización preferida, la matriz de alfa-amilasa tipo Termamyl es LE174 incluyendo cualquiera de LE174+G48A+T491+G107A+1201 F; LE174+M197L; o LE174+G48A+T491+G107A+M197L+1201F.

[0058] Otras matrices de alfa-amilasas contempladas incluyen LE429, que es LE174 con una sustitución adicional en I201F. Según la invención, LE335 es la alfa-amilasa que, en comparación con LE429, tiene sustituciones adicionales en T49I+G107A; LE399 es LE335+G48A, es decir, LE174 con G48A+T49I+G107A+I201F.

Construcción de variantes de la invención

[0059] La construcción de la variante de interés se puede realizar mediante el cultivo de un microorganismo que comprende una secuencia de ADN que codifica la variante bajo condiciones propicias para producir la variante. La variante puede ser recuperada posteriormente del caldo de cultivo resultante. Esto se describe detalladamente más abajo.

Propiedades alteradas

[0060] Lo siguiente discute la relación entre mutaciones que están presentes en variantes de la invención y alteraciones deseables en cuanto a propiedades (con respecto a una matriz de alfa-amilasa tipo Termamyl), lo cual puede resultar de ello.

[0061] Como se ha mencionado anteriormente, la invención se refiere a alfa-amilasas tipo Termamyl con propiedades alteradas, en particular a altas temperaturas y/o a bajo pH, en particular a bajas concentraciones de calcio.

[0062] En el contexto de la presente invención, "alta temperatura" se refiere a temperaturas de 70-120°C, preferiblemente 80-100°C, especialmente 85-95°C.

[0063] En el contexto de la presente invención, el término "pH bajo" se refiere a un pH en el rango de 4-6, preferiblemente 4.2-5.5, especialmente 4.5-5.

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El esquema de dopaje se puede hacer usando el programa DOPE, que, entre otras cosas, evita que la introducción de codones de terminación. Cuando se usa la mutagénesis generada por PCR, un gen codificador de la matriz de alfa-amilasa tratado o no químicamente está sujeto al PCR bajo condiciones que aumentan la no incorporación de nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, pp. 11-15). Una cepa mutágena de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191), S. cereviseae o cualquier otro organismo microbiano se puede utilizar para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica la alfa-amilasa por, por ejemplo, transformación de un plásmido que contiene la matriz de glicosilasa en la cepa mutágena, creciendo la cepa mutágena con el plásmido y aislando el plásmido mutado de la cepa mutágena. El plásmido mutado puede ser posteriormente transformado en un organismo de expresión. La secuencia de ADN que va a ser mutagenizada puede estar convenientemente presente en una genoteca o una biblioteca de ADNc o obtenida a partir de un organismo expresado por la matriz de alfa-amilasa. Alternativamente, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o un bacteriófago, que se puede incubar con o al contrario de lo expuesto al agente mutagenizante. El ADN a ser mutagenizado también puede estar presente en una célula huésped, bien siendo integrado en el genoma de dicha célula o estando presente en un vector albergado en la célula. Finalmente, el ADN que va a ser mutagenizado puede estar en forma aislada. Se entiende que la secuencia de ADN que sometida a mutagénesis aleatoria es preferiblemente un ADNc o una secuencia de ADN genómico. En algunos casos puede ser conveniente amplificar la secuencia de ADN mutada antes de realizar la etapa de expresión b) o el paso de selección c). Tal amplificación se puede realizar conforme a métodos conocidos en la técnica, el método preferido actualmente es la amplificación generada por PCR usando imprimadores oligonucleótidos preparados con una base de ADN o una secuencia de aminoácidos de la enzima matriz. Después de la incubación con o expuesta al agente mutagenizante, el ADN mutado se extrae por cultivo de una célula huésped adecuada que lleva la secuencia de ADN bajo condiciones que permiten que se produzca la extracción. La célula huésped usada para este propósito puede ser una que ha sido transformada con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente en un vector, o una que llevaba la secuencia de ADN que codifica la enzima matriz durante el tratamiento de mutagénesis. Los siguientes son ejemplos de células huésped adecuadas: bacterias Gram positivas, tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; y bacterias Gram negativas como E. coli. La secuencia de ADN mutada puede comprender además una secuencia de ADN que codifica funciones, permitiendo la extracción de la secuencia de ADN mutada.

Mutagénesis aleatoria localizada

[0092] La mutagénesis aleatoria puede ser ventajosamente localizada en una parte de la matriz de alfa-amilasa alfa en cuestión. Este puede, por ejemplo, ser ventajoso cuando ciertas zonas de la enzima han sido identificadas como de particular importancia para una propiedad dada de la enzima, y cuando se modifican se prevé que dan como resultado una variante con propiedades mejoradas. Tales zonas pueden identificarse normalmente cuando la estructura terciaria de la enzima matriz ha sido dilucidada y relacionada con la función de la enzima.

[0093] La mutagénesis aleatoria localizada o específica de una zona se realiza convenientemente usando técnicas generado de mutagénesis por PCR, como se ha descrito anteriormente, o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN a modificar puede aislarse, por ejemplo, mediante inserción en un vector adecuado y dicha parte puede ser sometida posteriormente a mutagénesis usando cualquiera de los métodos de mutagénesis mencionados anteriormente.

Métodos alternativos para suministrar variantes de alfa-amilasa

[0094] Los métodos alternativos para suministrar variantes de la invención incluyen un método de redistribución de gen conocido en la técnica incluyendo, por ejemplo, los métodos descritos en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) y WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S).

Extracción de variantes de alfa-amilasa

[0095] Según la invención, una secuencia de ADN que codifica la variante producida por los métodos anteriormente descritos o por cualquier método alternativo conocido en la técnica, puede ser extraída en la forma enzimática mediante el uso de un vector de extracción que incluye típicamente secuencias de control que codifican un promotor, un operador, el lugar de unión al ribosoma, la señal de iniciación del movimiento, y, opcionalmente, un gen represor

o genes de activador vario.

[0096] El vector de extracción recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa de la invención puede ser cualquier vector que puede ser sometido convenientemente a procedimientos de recombinación de ADN, y la elección de vector dependerá frecuentemente de la célula huésped en la que es introducido. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un cromosoma artificial. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica con el(los) cromosoma(s) en que ha sido integrado.

[0097] En el vector, la secuencia de ADN debería conectarse operativamente a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra actividad transcripcional en la célula huésped elegida y se puede derivar de genes codificadores de proteínas, bien homólogos o heterólogos, a la célula huésped. Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa de la invención, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E.coli, los promotores dagA del gen de agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de alfa-amilasa del Bacillus licheniformis (amyL), los promotores del gen de amilasa maltogénica del Bacillus stearothermophilus (amyM), los promotores de la alfa-amilasa del Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), los promotores de los genes xylA y xylB del Bacillus, etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, los ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica TAKA amilasa de A. oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de A. niger, Amilasa alfa neutro niger, ácido de A. niger con alfa-amilasa estable, glucosamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de A. oryzae, triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o acetamidasa de A. nidulans.

[0098] El vector de extracción de la invención también puede comprender un terminador de transcripción adecuada y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación operativamente conectadas a la secuencia de ADN que codifica la variante de alfa-amilasa de la invención. Las secuencias de terminación y poliadenilación pueden derivarse adecuadamente de las mismas fuentes que el promotor.

[0099] El vector puede comprender además una secuencia de ADN permitiendo al vector replicarse en la célula huésped en cuestión. Los ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19; pACYC177; pUB110; pE194, pAMB1 y pIJ702.

[0100] El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped, tal como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o uno que confiere resistencia antibiótica tal como la ampicilina, la canamicina, el cloranfenicol o la resistencia a la tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que produce resistencia a la higromicina, o la selección se puede realizar por cotransformación, por ejemplo, como se describe en WO 91/17243.

[0101] Mientras que la extracción intracelular puede ser ventajosa en algunos aspectos, por ejemplo, cuando se usan bacterias determinadas como células huésped, generalmente se prefiere la extracción extracelular. En general, las α-amilasas del Bacillus mencionadas aquí comprenden una prezona permitiendo la secreción de la proteasa extraída en el medio de cultivo. Si se desea, esta prezona se puede sustituir por una prezona diferente o una secuencia de señal, convenientemente realizada por sustitución de las secuencias de ADN que codifican las respectivas prezonas.

[0102] Los procedimientos usados para ligar la construcción de ADN de la invención codificando una variante de alfa-amilasa, el promotor, el terminador y otros elementos respectivamente, y para insertarlos en los vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por las personas expertas en la técnica (cf., por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor, 1989).

[0103] La célula de la invención, que bien comprende una construcción de ADN o bien un vector de extracción de la invención tal y como se ha definido anteriormente, se usa ventajosamente como célula huésped en la producción recombinante de una variante de alfa-amilasa de la invención. La célula se puede transformar con la construcción de ADN de la invención codificando la variante, convenientemente integrada en la construcción de ADN (en una o varias copias) en el cromosoma huésped. Esta integración se considera generalmente una ventaja, ya que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga estable en la célula. La integración de las construcciones de ADN en el cromosoma huésped se pueden realizar por los métodos convencionales, por ejemplo, mediante la recombinación homóloga o heteróloga.

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-: Licuefacción

-: Sacarificación

-: Fermentación

Molienda

[0124] El grano se muele para abrir la estructura y permitir otros procesos. Se usan dos procesos: molienda en seco o mojada. En la molienda en seco se muele avellana entera y se usa en la parte restante del proceso. La molienda en húmedo proporciona una separación óptima de germen y harina (gránulos de almidón y proteínas) y tiene algunas excepciones aplicadas a ubicaciones donde hay una producción paralela de jarabes.

Licuefacción

[0125] En el proceso de licuefacción los gránulos de almidón se solubilizan por hidrólisis a maltodextrinas en su mayoría de un DP superior a 4. La hidrólisis se puede realizar por tratamiento ácido o enzimáticamente mediante alfa-amilasa. Hidrólisis ácida se usa en una base limitada. La materia prima se puede moler a grano entero o con un flujo lateral desde el procesamiento de almidón.

[0126] La licuefacción enzimática es típicamente realizada como un proceso de suspensión caliente en tres fases. La suspensión se calienta a una temperatura entre 60-95°C, preferiblemente 80-85°C, y se añade(n) la(s) enzima(s). Entonces se cuece la suspensión a chorro entre 95-140°C, preferiblemente 105-125°C, enfriado a 60-95°C y se añade(n) más enzima(s) para obtener la hidrólisis final. El proceso de licuefacción se realiza con un pH 4,5-6,5, típicamente a un pH entre 5 y 6. El grano molido y licuado es también conocido como mezcla.

Sacarificación

[0127] Para producir azúcares bajos en moléculas DP1-3 que se puedan metabolizar mediante levadura, la maltodextrina de la licuefacción debe estar además hidrolizada. La hidrólisis se suele realizar de forma enzimática por glucoamilasas, alternativamente se pueden usar alfaglucosidasas o alfa-amilasas ácidas. Una fase completa de sacarificación puede durar hasta 72 horas, no obstante es común solo a hacer una presacarificación de normalmente 40-90 minutos y luego una sacarificación completa durante la fermentación (SSF). La sacarificación se realiza normalmente a temperaturas de 30-65°C, típicamente alrededor de 60°C, y a pH 4,5.

Fermentación

[0128] La levadura, normalmente de Saccharomyces spp., se añade a la mezcla y la fermentación se lleva a cabo durante 24-96 horas, normalmente entre 35-60 horas. La temperatura es entre 26-34°C, normalmente alrededor de 32°C, y el pH es de 3-6, preferiblemente alrededor de 4-5.

[0129] Nótese que el proceso más ampliamente usado es un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) donde no hay fase de retención para la sacarificación, lo que significa que la levadura y la enzima se añaden juntas. Cuando se hace SSF es común introducir un pre-paso de sacarificación a una temperatura por encima de 50°C justo antes de la fermentación.

Destilación

[0130] Después de la fermentación, la mezcla se destila para extraer el etanol.

[0131] El etanol obtenido según el proceso de la invención se puede utilizar como, por ejemplo, etanol de combustible; etanol potable, es decir, licores neutros potables; o etanol industrial.

Productos derivados

[0132] Lo que sobra de la fermentación es el grano, que se usa normalmente en pienso para animales, bien en forma líquida o seco.

[0133] Los detalles adicionales sobre cómo para llevar a cabo la licuefacción, sacarificación, fermentación, destilación y recuperación de etanol son bien conocidos para un experto en la materia.

[0134] Según el proceso de la invención, la sacarificación y la fermentación se pueden realizar simultánea o separadamente.

Pulpa y producción de papel

[0135] La alfa-amilasa alcalina de la invención también se puede usar en la producción de materiales lignocelulósicos, tales como pulpa, papel y cartón, a partir de almidón reforzado con desechos de papel y cartón, especialmente dónde el repulpado ocurre a un pH por encima de 7 y donde las amilasas facilitan la desintegración de los desechos a través de la degradación del almidón reforzado. La alfa-amilasa de la invención es especialmente útil en procesos para producir pasta de papel a partir de papel impreso recubierto de almidón. El proceso se puede realizar como se describe en WO 95/14807, comprendiendo las siguientes fases:

1.: a) se desintegra el papel a producir una pulpa,

2.: b) se trata con una enzima de degradación de almidón antes, durante o después de la fase a), y

3.: c) se separan las partículas de tinta de la pulpa después de las fases a) y b).

[0136] Las alfa-amilasas de la invención también pueden ser muy útiles modificando el almidón donde el almidón enzimáticamente modificado se usa en la fabricación de papel junto con productos de relleno alcalino, tales como carbonato cálcico, caolín y arcillas. Con las alfa-amilasas alcalinas de la invención es posible modificar el almidón en presencia del relleno, permitiendo así un proceso integrado más simple.

Desencolado de textiles, tejidos y prendas

[0137] Una alfa-amilasa de la invención también puede ser muy útil en el desencolado de textiles, tejidos o prendas. En la industria del tratamiento textil, las alfa-amilasas se usan generalmente como productos auxiliares en el proceso de desencolado para facilitar la eliminación de cola que contiene almidón, que sirve como recubrimiento de protección de las madejas de trama durante el tejido. La eliminación completa del recubrimiento de almidón después del tejido es importante para asegurar resultados óptimos en los procesos posteriores, donde el tejido es inspeccionado, blanqueado y teñido. La descomposición del almidón enzimático se prefiere porque no implica efectos nocivos en la materia fibrosa. Para reducir el coste del proceso y aumentar el rendimiento del molino, el proceso de desencolado se combina a veces con los pasos de inspección y blanqueo. En tales casos, normalmente se usan productos auxiliares no enzimáticos como agentes alcalinos o de oxidación para descomponer el almidón porque las alfa-amilasas tradicionales no son muy compatibles con niveles altos de pH y agentes blanqueadores. La descomposición no enzimática de la cola de almidón implica cierto dañado de fibra debido a que se usan productos químicos más agresivos. Por consiguiente, sería deseable usar las alfa-amilasas de la invención, ya que tienen un rendimiento mejorado en soluciones alcalinas. Las alfa-amilasas se pueden utilizar solas o en combinación con una celulasa cuando se está desencolando tejido o textiles con celulosa.

[0138] Los procesos de desencolado y blanqueo son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, tales procesos son descritos en WO 95/21247, US. 4,643,736, EP 119,920, incorporados por la presente como referencia.

[0139] Los productos disponibles comercialmente para el desencolado incluyen AQUAZYME® y AQUAZYME® ULTRA de Novozymes A/S.

Fabricación de cerveza

[0140] Las alfa-amilasas de la invención también puede ser muy útiles en un proceso de fabricación de cerveza; las alfa-amilasas serán añadidas típicamente durante el proceso de maceración.

Composiciones detergentes

[0141] La alfa-amilasa de la invención se puede añadir a y convertirse así en un componente de una composición de detergente.

[0142] La composición de detergente de la invención puede, por ejemplo, formularse como una composición de detergente a mano o a máquina que incluye una composición de aditivos de lavandería adecuada para pre

tratamiento de tejidos manchados y una composición de suavizante adicionado al enjuague, o formularse para su uso en operaciones de limpieza de superficies duras del hogar en general, o formularse para operaciones de lavado de vajillas a mano o a máquina.

[0143] En un aspecto específico, la invención proporciona un aditivo de detergente que comprende la enzima de la invención. El aditivo de detergente, al igual que la composición de detergente, puede comprender una o más de otras enzimas tales como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica, por ejemplo, otra alfa-amilasa, glucoamilasa, amilasa maltogénica, CGTasa y/o una celulasa, mananasa (tal como MANNAWAY™ de Novozymes, Dinamarca), pectinasa, liasa de pectina, cutinasa, y/o lacasa.

[0144] En general las propiedades de la(s) enzima(s) elegida(s) deberían ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la(s) enzima(s) debería(n) encontrarse en cantidades eficaces.

[0145] Proteasas: las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. El origen microbiano es el preferido. Se incluyen mutaciones químicamente modificadas o creadas con proteínas. La proteasa puede ser una serín proteasa o una metaloproteasa, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279). Ejemplos de proteasas tipo tripsina son la tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270 y WO 94/25583.

[0146] Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o varias de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224,235 y 274.

[0147] Las enzimas proteásicas disponibles comercialmente preferidas incluyen ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURALASE®, ESPERASE®, y KANNASE® (de Novozymes A/S), MAXATASE®, mAXACAL MAXAPEM®, PROPERASE®, PURAFECT®, OXP® PURAFECT, FN2®, FN3®, FN4® (Genencor International Inc.).

[0148] Lipasas: las lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutaciones químicamente modificadas o creadas con proteínas. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo Thermomyces), por ejemplo, de H. lanuginosa (T. Lanuginosus) como se describe en EP 258 068 y EP 305 216, o de H. insolens como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo, de P. alicagenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, cepa SD 705 Pseudomonas sp. (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, por ejemplo, de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophyisica Acta, 1131,253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422).

[0149] Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como los descritos en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.

[0150] Las enzimas de lipasa disponibles comercialmente preferidas incluyen LIPOLASE™ y LIPOLASE ULTRA™ (Novozymes A/S).

[0151] Amilasas: las amilasas adecuadas (alfa y/o beta) incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutaciones químicamente modificadas o creadas con proteínas. Las amilasas incluyen, por ejemplo, alfa-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de B. licheniformis, descrita con más detalle en GB 1,296,839. Ejemplos de alfa-amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o varias de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444.

[0152] Las alfa-amilasas disponibles comercialmente son DURAMYL™, LIQUEZYME™ TERMAMYL™, NATALASE™, SUPRAMYL™, STAINZYME™, FUNGAMYL™ y BAN™ (Novozymes A/S), RAPIDASE™, PURASTAR™ y PURASTAR OXAM™ (de Genencor International Inc.).

[0153] Celulasas: las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutaciones químicamente modificadas o creadas con proteínas. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum, descritas en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259.

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Enzimas: 0,0001 – 0,1%

Perfume: 0,1 – 0,5%

Agua: 5 -10

3) Composición en polvo para máquina lavavajillas

Surfactante no iónico: 0,5 – 2,0%

Disilicato de sodio: 25 - 40%

Citrato sódico: 30 - 5%

Carbonato de sodio: 0 - 29%

Bicarbonato sódico: 0 - 20%

Monohidrato de perborato sódico: 0 -15%

Tetraacetietilenodiamina (TAED): 0 - 6%

Copolímero de ácido maléico/ acrílico: 0 - 5%

Arcilla: 1 - 3%

Ácidos poliamínicos: 0 - 20%

Poliacrilato de sodio: 0 - 8%

Enzimas: 0,0001 – 0,1%

4) Composición en polvo para máquina lavavajillas

Surfactante no iónico: 1 - 2%

Zeolita MAP: 15 - 42%

Disilicato de sodio: 30 - 34%

Citrato sódico: 0 -12%

Carbonato de sodio: 0 - 20%

Monohidrato de perborato sódico: 7 - 15%

Tetraacetietilenodiamina (TAED): 0 – 3%

Polímero: 0 - 4%

Copolímero de ácido maléico/acrílico: 0 - 5%

Fosfonato orgánico: 0 - 4%

Arcilla: 1 - 2%

Enzimas: 0,0001 – 0,1%

Sulfato de sodio: Equilibrado

5) Composición en polvo para máquina lavavajillas 6) Composición en polvo y líquida para máquina lavavajillas con sistema de limpieza surfactante

Surfactante no iónico: 1 - 7%

Disilicato de sodio: 18 - 30%

Citrato de trisodio: 10 - 24%

Carbonato de sodio: 12 - 20%

Monopersulfato (2 KHSO5.KHSO4.K2SO4): 15 -21%

Estabilizador del blanqueador: 0,1 - 2%

Copolímero de ácido maléico/acrílico: 0 - 6%

Pentaacetato de dietilentriamina, sal de pentasodio: 0 - 2.5%

Enzimas: 0,0001 – 0,1%

Sulfato de sodio, agua: Equilibrado

Surfactante no iónico: 0 – 1,5%

Dihidrato de octadecilo de dimetinamina N-oxido: 0 - 5%

80:20 peso C18/C16 mezcla de dihidrato de octadecilo dimetilamina n-óxido y dihidrato de hexadecildimetilo N-óxido de amina: 0 - 4%

70:30 wt.C18/C16 mezcla de octadecilo bis (n-óxido de hidroxietil)amina N-óxido anhídrico y hexadecilo bis (n-oxido de hidroxietil)amina anhídrico: 0 - 5%

C13 -C15 etoxisulfato de alquilo con un grado medio de etoxilación de 3: 0 - 10%

C12 -C15 etoxisulfato de alquilo con un grado medio de etoxilación de 3: 0 - 5%

C13 -C15 alcohol etoxilado con un grado medio de etoxilación de 12: 0 - 5%

Una mezcla de los alcoholes etoxilados C12 -C15 con un grado medio de etoxilación de 9: 0 – 6,5%

Una mezcla de los alcoholes etoxilados C13 -C15 con un grado medio de etoxilación de 30: 0 - 4%

Disilicato de sodio: 0 - 33%

Tripolifosfato de sodio: 0 - 46%

Citrato sódico: 0 -28%

Ácido cítrico: 0 - 29%

Carbonato de sodio: 0 - 20%

Monohidrato de perborato sódico: 0 – 11,5%

Tetraacetietilenodiamina (TAED): 0 - 4%

Copolímero de ácido maléico/acrílico: 0 – 7,5%

Sulfato de sodio: 0 -12,5%

Enzimas: 0,0001 -0,1%

7) Composicion líquida no acuosa para máquina lavavajillas

Surfactante no iónico líquido (por ejemplo, etoxilados de alcohol): 2,0 -10,0%

Silicato de metal alcalino: 3,0 - 15,0%

Fosfato de metal alcalino: 20,0 - 40,0%

Portador líquido seleccionado de glicoles más altos, poliglicoles, polióxidos, glicoléteres: 25,0 - 45,0%

Estabilizador (por ejemplo, un éster parcial de ácido fosfórico y un C16 - C18 alcanol): 0,5 - 7,0%

Supresor de espuma: 0 - 1,5%

Enzimas: 0,0001- 0,1%

8) Composición líquida para lavavajillas

Silicato sódico: 3,0 -15,0%

Carbonato de metal alcalino: 7,0 - 20,0%

Citrato sódico: 0,0 - 1.5%

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Este ensayo mide la reducción en la sensibilidad de calcio:

10 micro g de la variante fueron incubadas bajo las siguientes condiciones: un 0.1 M de solución de acetato, pH ajustado a 6.0, que contiene 5% p/p de almidón de maíz común (libre de calcio). La incubación fue hecha al baño maría a 95°C durante 30 minutos.

Ensayos para la actividad de alfa-amilasa

1. Ensayo Phadebas

[0196] La actividad de alfa-amilasa se determina por un método que emplea tabletas Phadebas® como sustrato. Las tabletas Phadebas (Prueba de Amilasa Phadebas®, suministrado por Pharmacia Diagnostic) contienen un polímero de almidón reticulado e indisoluble de color azul que ha sido mezclado con albúmina de suero bovino y una sustancia de tampón y en tabletas.

[0197] Para cada medición se suspende una tableta en un tubo que contiene 5 ml de 50 mM de tampón Britton-Robinson (50 mM ácido acético, 50 mM ácido fosfórico, 50 mM ácido bórico, 0,1 mM CaCl2, pH ajustado al valor de interés con NaOH). La prueba se realiza en un baño maría a la temperatura de interés. La alfa-amilasa a evaluar se diluye en x ml de 50 mM de tampón Britton-Robinson. Se añade 1 ml de esta solución de alfa-amilasa al 5 ml de 50 mM de tampón Britton-Robinson. El almidón se hidroliza por la alfa-amilasa dando fragmentos solubles azules. La absorbencia de la solución azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad de la alfa-amilasa.

[0198] Es importante que los 620 nm de absorbencia medidos después de 10 o 15 minutos de incubación (tiempo de prueba) estén en el rango de 0,2 a 2,0 unidades de absorbencia a 620 nm. En esta gama de absorbencia hay linealidad entre actividad y absorbencia (ley de Lambert-Beer). La dilución de la enzima debe por lo tanto ajustarse a este criterio. Bajo un conjunto específico de condiciones (temp., pH, tiempo de reacción, condiciones del tampón) 1 mg de una alfa-amilasa dada hidrolizará una cantidad determinada de sustrato y producirá un color azul. La intensidad del color se mide a 620 nm. La absorbencia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína de alfaamilasa pura) de la alfa-amilasa en cuestión bajo el conjunto dado de condiciones.

2. Método alternativo

[0199] La actividad de la alfa-amilasa se determina por un método que utiliza sustrato PNP-G7. PNP-G7, que es una abreviatura para p-nitrofenil-alfa, D-maltoheptaósido es un oligosacárido bloqueado que se puede dividir mediante una endo-amilasa. Después de la división, la alfa-glucosidasa incluida en el equipo asimila el sustrato para liberar una molécula de PNP libre que tiene un color amarillo y así se puede medir por espectofometría visible a λ=405nm. (400-420 nm.). Los equipos que contienen sustrato PNP-G7 y alfa-glucosidasa son fabricados por Boehringer-Mannheim (nº de catálogo 1054635).

[0200] Para preparar el sustrato se añade una botella de sustrato (BM 1442309) a 5 ml de tampón (BM1442309). Para preparar la α-glucosidasa se añade una botella de alfa-glucosidasa (BM 1462309) a 45 ml del tampón (BM1442309). La solución de trabajo se hace mezclando 5 ml de solución de alfa-glucosidasa con 1 ml de sustrato.

[0201] El ensayo se realiza transformando 20µl de solución enzimática en 96 pozos de placa de microtitulación e incubando a 25°C. Se añade 200 µl de solución de trabajo a 25°C. La solución se mezcla y se preincuba 1 minuto y la absorción se mide cada 15 segundos durante 3 minutos a DO 405 nm.

[0202] La pendiente de la curva de absorción dependiente del tiempo es directamente proporcional a la actividad específica (actividad por mg de enzima) de la alfa-amilasa en cuestión bajo el conjunto dado de condiciones.

Determinación de actividad específica

[0203] La actividad específica se determina como actividad/mg e enzima usando uno de los métodos descritos anteriormente. Las instrucciones de fabricación siguen (véase también más abajo "Ensayo para la actividad de alfa-amilasa").

Determinación de estabilidad de oxidación

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K118Q: 1,1

K37T: 1,1

H421Y: 1,1

V450T: 1,1

K383R: 1,1

N445Q: 1,1

Y178F: 1,2

V318L: 1,2

W482Y: 1,2

N283D+Q361E: 1,2

M105F+M208F: 1,2

M202L+M323T+M430I: 1,3

K446R+N484Q: 1,4

R444Y: 1,5

N106D: 1,8

Y203L: 2,0

G133E+Q361E: 2,9

M323E: 4,1

V214T: 6,8

M202L+M323T+M309L: 13

M202L: 16

M202L+M323T: 23

M202L+M323T+M9L+M382Y+K383R: 25

M202L+M323T+M9L+M382Y: 26

M202L+M323T+M9L (AX413): 27

Tabla 4:

Mutaciones: Mejoras en la actividad

AX413: 1

T461P: 1,1

Y298H: 1,1

G133E+R444E: 1,1

Y298F: 1,1

M202T: 1,2

M202I: 1,6

M202V: 1,6

Y295F: 3,4

5 Ejemplo 3 Determinación de estabilidad durante lavado de vajilla [0213] Las variantes de amilasa fueron construidas utilizando métodos convencionales en la amilasa AX379 o 10 AX413 respecto a aquellas que en la prueba de actividad se usan como referencia (primera línea en la tabla).

La variante AX413 se deriva de AX379 mediante la introducción de mutaciones como se indica en las tablas anteriores.

[0214] La estabilidad de la amilasa fue medida incubando alrededor de 0,1 mg/ml de amilasa en 4 g/l de detergente 5 para lavavajillas automático a 40°C durante 18 horas. La incubación fue detenida añadiendo 9 volúmenes de agua (<5°C) fría y almacenando en hielo. A la hora la actividad fue medida utilizando el equipo de Amilasa de Phadebas y la actividad en muestras detergentes fue comparada con muestras incubadas durante el mismo periodo en detergente pero en el hielo.

10 Tabla 5:

Mutaciones: Mejoras en la actividad residual

AX413: 1

V214T+M323E+M382Y+K383R+N471 E: 1,1

Y178F+G258D+T419N+N437H: 1,1

G149N+N150Q+M382Y+K383R: 1,1

Y160F+V214T+M382Y: 1,2

N128Y+G149A+V214T+D231N+M382Y+F441L: 1,2

R82H+N128Y+G149A+V214T+M382Y: 1,2

N150H+V214T: 1,2

V214T+E345N: 1,2

V214T+G305D+ M382Y+R444E: 1,2

V214T+M382Y+A447Y: 1,2

M202I+V214T+M382Y+K383R+R444Y: 1,2

V214T+G378K: 1,3

V214T+A256K: 1,3

R26S+D30N+N33D+V214T+M382Y: 1,5

Ejemplo 4

15 [0215] Las variantes de amilasa de SEQ. ID nº 12 fueron construidas como se describe en el ejemplo 1 y fermentados en matraces de agitación utilizando un medio rico. A partir del sobrenadante la proteína variante de la amilasa se purificó utilizando métodos de purificación estándar hasta por encima del 90% de pureza. 20 La concentración de proteína fue calculada a partir de la absorbencia A280 y un coeficiente de extensión teórica de

2.9 ml/mg/cm.

[0216] El ensayo de actividad G7-pNP fue usado como se describe en "Métodos" para medir la actividad de las muestras de amilasa y por lo tanto la actividad específica (AE), es decir, la actividad G7-pNP por mg de proteína de 25 amilasa fue calculada y comparada con una amilasa de referencia homóloga.

Rel. AE

M202L (Ref.A) 1,00 Ref.A+M9L+M323T 1,18 Ref.A+M9L+M323T+M382Y+K383R 1,20 Ref.A+M9L+S303Q+M323T+M382Y+K383R 1,31 Ref.A+M9L+V214T+M323T+M382Y 1,37 Ref.A+M9L+M323T+A339S+M382Y+K383R+N471 E 1,55 Ref.A+M9L+V214T+M323T+A339S+N471 E 1,73

Rel. AE

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Claims

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