JP2013519365A5 - - Google Patents

Claims (14)

1. 親α−アミラーゼの変異体であって、配列番号６の番号付けを用いて、１９５の位置に置換を含むと共に、２０６及び／又は２４３の位置に更に置換を含み、前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し、且つ、配列番号６の成熟ポリペプチドに対して７０％以上の配列同一性を有する、変異体。
2. 配列番号６の番号付けを用いて、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３、１１６、１１８、１２９、１３３、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、及び４５８からなる群より選択される位置に対応する１又は２以上の位置に更に改変を含み、
   前記改変が各々独立に、
   （i）前記位置の下流側に隣接するアミノ酸の挿入、
   （ii）前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
   （iii）前記位置を占めるアミノ酸の置換である、請求項１に記載の変異体。
3. 配列番号６の番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域内に、少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含む、請求項１又は２に記載の変異体。
4. 前記親α−アミラーゼの配列が、位置１９３の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ又はＭ］による；位置１９５の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換；位置１９７の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による；位置１９８の［Ｑ又はＮ］による；位置２００の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による；位置２０３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による；位置２０６の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｎ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｈ，Ｑ，Ｄ又はＥ］による；位置２１０の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による；位置２１２の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による；位置２１３の［Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ又はＭ］；又は位置２４３の［Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｉ又はＶ］による置換のうち、少なくとも１つの置換により修飾される、請求項１〜３の何れか一項に記載の変異体。
5. 前記変異体が、キレート剤を含む組成物中で、親α−アミラーゼ又は配列番号６と比較して改善された安定性を有し、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１〜４の何れか一項に記載の変異体。
6. 前記変異体が１８時間後、ｐＨ８で、キレート剤の存在下、少なくとも６０％の残存活性をし、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るとともに、前記残存活性が「材料及び方法」の記載に従い測定される、請求項１〜５の何れか一項に記載の変異体。
7. 前記変異体が、「材料及び方法」の記載に従いＡＭＳＡで測定した場合に、親α−アミラーゼと比較して改善された洗浄性能を有する、請求項１〜６の何れか一項に記載の変異体。
8. アミロース分解活性を有する前記変異体が、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２０の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有する、請求項１〜７の何れか一項に記載の変異体。
9. 請求項１〜８の何れか１項に記載の変異体をコード化する単離ヌクレオチド配列。
10. 請求項９に記載のヌクレオチド配列を含む組換宿主細胞。
11. 請求項１〜８の何れか１項に記載の変異体を含む組成物であって、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物。
12. 前記変異体が１８時間後、ｐＨ８及び３１℃で、キレート剤の存在下少なくとも６０％の残存活性を有し、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記変異体が１８時間後、ｐＨ８及び３１℃で、キレート剤の存在下少なくとも７０％の残存活性を有し、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るとともに、前記残存活性が「材料及び方法」の記載に従い測定される、請求項１１又は１２に記載の組成物。
14. ポリペプチドを調製する方法であって、
    （ａ）アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を用意し、
    （ｂ）配列番号６の成熟ポリペプチドの位置１９５の位置、並びに、２０６及び／又は２４３の位置を占めるアミノ酸を選択し、
    （ｃ）前記選択されたアミノ酸残基を置換することにより前記配列を修飾し、
    （ｄ）前記修飾された配列を有する変異ポリペプチドを生成し、
    （ｅ）前記変異ポリペプチドをアミラーゼ活性及び安定性について検証し、
    （ｆ）アミラーゼ活性を有すると共に、前記親ポリペプチドと比較してキレート剤存在下の安定性が向上した変異ポリペプチドを選択し、
    前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、方法。