CN106244637A - 一种双酶催化外消旋环氧苯乙烷制备(r)‑苯乙二醇的方法 - Google Patents

一种双酶催化外消旋环氧苯乙烷制备(r)‑苯乙二醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双酶催化外消旋环氧苯乙烷制备(R)‑苯乙二醇的方法，属于生物催化技术领域。本发明以外消旋环氧苯乙烷(rac‑SO)为底物，以双环氧化物水解酶：环氧化物水解酶突变体AuEH2A250I和环氧化物水解酶VrEH3对映归一性水解外消旋环氧苯乙烷(rac‑SO)制备高对映纯产物(R)‑苯乙二醇(PED)。本发明是首次把来源于绿豆的VrEH3和来源于宇佐美曲霉的AuEH2A250I结合对映归一性水解rac‑SO。催化10mM rac‑SO制备(R)‑PED的ee值为96.0％。具有适合于工业应用的理想特性，本发明为该酶的产业化生产奠定了理论基础，有较大的工业化应用潜力及经济价值。

Description

一种双酶催化外消旋环氧苯乙烷制备(R)-苯乙二醇的方法
技术领域
本发明涉及一种双酶催化外消旋环氧苯乙烷制备(R)-苯乙二醇的方法，属于生物催化技术领域。
背景技术
手性环氧化物和邻二醇能与多种亲核试剂、亲电试剂、酸和碱等发生反应，是一类高附加值的多功能合成子或砌块，可用于药物、精细化学品、农药和功能性材料等的合成，如白三烯、昆虫信息素、甾类物质、β-肾上腺素阻断剂、神经保护剂和艾滋病毒蛋白酶抑制剂等。
环氧化物水解酶(Epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)能特异性催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，获得对映纯的环氧化物或相应的邻二醇。由于EHs具有来源广、对映选择性和区域选择性较高、不需要辅助因子参与、反应条件温和、对环境友好等特点，是一种很有潜力的生物催化剂。迄今为止，已报道了约40种对映选择性较高的EHs(对映选择率E>30)，其中大部分来源于微生物，主要用于催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分，该方法固有的缺陷是获得单一构型环氧化物或邻二醇的理论产率仅为50％。与水解动力学拆分不同，对映归一性水解可以突破这种局限，产物的最大产率可达100％。两种具有互补对映选择性和区域选择性的EHs催化外消旋环氧化物水解，可以完全转化为单一构型的邻二醇。
目前，虽已有一些有关利用双酶对映归一性水解环氧苯乙烷底物的方法，普遍存在催化底物浓度、催化效率、产物得率和对映体纯度低等缺陷，主要是由于底物溶解度较低、酶对底物的特异性及受产物抑制的影响，从而限制其工业化应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用双酶法(AuEH2A250I和VrEH3)对映归一性水解外消旋环氧苯乙烷(rac-SO)制备高对映纯产物(R)-苯乙二醇(PED)的方法。VrEH3是自身对映归一性水解的酶，在攻击(S)-SO的过程中同时攻击(R)-SO，而AuEH2A250I主要攻击(R)-SO。
所述方法是向缓冲体系添加终浓度为20～200mM的rac-SO作为底物，同时加入环氧化物水解酶突变体AuEH2A250I和环氧化物水解酶VrEH3，反应温度为10℃至30℃。
在本发明的一种实施方式中，所述环氧化物水解酶突变体AuEH2A250I是以重组表达该环氧化物水解酶突变体AuEH2A250I的重组细胞的形式添加到缓冲体系中。
在本发明的一种实施方式中，所述环氧化物水解酶VrEH3是以重组表达该环氧化物水解酶VrEH3的重组细胞的形式添加到缓冲体系中。
在本发明的一种实施方式中，将重组大肠杆菌E.coli/(AuEH2A250I)制成菌浓度为100mg/mL的、酶比活力为78mU/mg湿菌体的菌悬液，然后用于催化反应。
在本发明的一种实施方式中，将重组大肠杆菌E.coli/VrEH3制成菌浓度为100mg/mL的、酶比活力为6mU/mg湿菌体的菌悬液，然后用于催化反应。
在本发明的一种实施方式中，环氧化物水解酶突变体AuEH2A250I与环氧化物水解酶VrEH3的用量参照两酶活力比39：(24～42)。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲体系是100mmol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，底物的初始反应浓度为50mM。
在本发明的一种实施方式中，环氧化物水解酶突变体AuEH2A250I与环氧化物水解酶VrEH3的用量参照两酶活力比39：42。
在本发明的一种实施方式中，反应温度为25℃。
本发明以rac-SO为底物，E.coli/(VrEH3)和E.coli/(AuEH2A250I)全细胞作为催化剂，利用两种酶在催化水解rac-SO时具有互补的对映选择性和区域选择性的特性对映归一性水解底物得到高对映纯产物(R)-PED。本发明显著提高了底物rac-SO的浓度、催化效率和(R)-苯乙二醇PED的对映体纯度。与单酶催化相比，双酶催化相同底物(10mM)的时间由5.5h缩短到了70min。底物浓度从20mM提高到了200mM，克服了单酶催化时底物浓度较高所产生的产物抑制酶活性及催化效率低的问题。催化10mM rac-SO制备(R)-PED的ee值为96.0％，与单酶催化的91％(VrEH3)和18.6％(AuEH2A250I)相比有很大的提高。催化200mM rac-SO制备(R)-PED的ee值为94％。本发明是首次把来源于绿豆的VrEH3和来源于宇佐美曲霉的AuEH2A250I结合对映归一性水解rac-SO。具有适合于工业应用的理想特性，本发明为该酶的产业化生产奠定了理论基础，有较大的工业化应用潜力及经济价值。
附图说明
图1：双酶先后催化反应进程图
图2：双酶同时催化反应进程图
具体实施方式
实施例1
编码VrEH3的基因的核酸序列参见GenBank:KR013755.1。表达VrEH3的E.coli/VrEH3工程菌的构建步骤如下：合成目的基因，以pET-28a为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主构建得到重组菌E.coli/VrEH3。挑取E.coli/VrEH3单菌落于2mL LB培养基中37℃条件下培养12h，以2％(v/v)的接种量转接入新鲜的100mL的LB培养基中，37℃条件下培养2h后，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.05mM，35℃培养10h，诱导VrEH3的高效表达，8000rpm离心收集菌体，按照1g湿菌体10mL缓冲液的比例加入100mM，pH 7.0磷酸盐缓冲液悬浮制备成菌浓为100mg/mL菌悬液保存待用。
AuEH2的氨基酸序列及重组表达该酶的工程菌E.coli/(reAuEH2)的构建参见公开号为CN102994470A的发明专利申请。突变体AuEH2A250I是将公开号为CN102994470A的发明专利申请中的SEQ ID NO.2的氨基酸序列的第250位的丙氨酸突变为异亮氨酸，重组表达突变体AuEH2A250I的重组大肠杆菌E.coli/(AuEH2A250I)的方法参照上述E.coli/(reAuEH2)的构建方法。挑取E.coli/(AuEH2A250I)单菌落于2mL LB培养基中37℃条件下培养12h，以2％(v/v)的接种量转接入新鲜的100mL的LB培养基中，37℃条件下培养2h后，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mM，25℃培养8h，诱导AuEH2A250I的高效表达，8000rpm离心收集菌体，按照1g湿菌体10mL缓冲液的比例加入100mM，pH 7.0磷酸盐缓冲液悬浮制备成菌浓为100mg/mL菌悬液待用。
实施例2
VrEH3全细胞比酶活的测定方法：在1.5mL的EP管中加入800μL VrEH3菌悬液和150μL磷酸钾缓冲液(100mM，pH＝7.0)，25℃预热5min；加入50μL 200mM的rac-SO，反应15min后取100μL于1mL乙酸乙酯含(1mg/mL的正己醇为内标)进行萃取，经无水硫酸镁干燥后过0.22μm的有机膜。
AuEH2A250I比酶活的测定方法：在1.5mL的EP管中加入33μLAuEH2A250I菌悬液和917μL磷酸钾缓冲液(100mM，pH＝7.0)，35℃预热2min；加入50μL 200mM的rac-SO，反应15min后取100μL于1mL乙酸乙酯含(1mg/mL的正己醇为内标)进行萃取，经无水硫酸镁干燥后过0.22μm的有机膜。
上述有机膜过滤后的样品分析采用气相色谱仪GC-2010PLUS、手性气相色谱柱CYCLOSIL-B和氢火焰离子化检测器。进样口和检测器温度均为250℃；初始柱温100℃，以5℃/min升温至210℃；载气为氮气，流速3.0mL/min，分流比1:50。在此检测条件下，正己醇、(R)-SO、(S)-SO、(S)-PED和(R)-PED的保留时间分别为3.738、6.368、6.492、17.437和17.574min。产物的对映过剩率eep(％)＝[(SP-RP)/(SP+RP)]×100％；转化率c(％)＝1-(S+R)/(S0+R0)；比酶活＝(S0+R0)×c/15min×100mg/mL×菌悬液体积。其中：S0和R0分别代表(S)-和(R)-SO的初始底物浓度，S和R分别代表(S)和(R)-SO的最终摩尔浓度。SP和RP分别代表(S)-和(R)-PED的最终摩尔浓度。AuEH2A250I和VrEH3的全细胞比酶活分别为78mU/mg和6mU/mg湿菌体。
实施例3双酶加入顺序对转化率和产物eep的影响
双酶依次加入催化体系：在1mL的反应体系中，400μl VrEH3全细胞菌悬液于517μl100mmol/L，pH 7.0的磷酸盐缓冲液后25℃预热5min，加入50μlrac-SO(终浓度为10mmol/L)开始反应，定期取样GC检测直至(S)-SO水解完全，此时加入33μlAuEH2A250I全细胞菌悬液进行催化剩余构型底物(R)-SO。
双酶同时加入催化体系：在1mL的反应体系中，400μl VrEH3与33μlAuEH2A250I全细胞悬液加入到于517μl的100mmol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液，25℃预热5min，加入50μlrac-SO(终浓度为10mmol/L)开始反应。在反应过程中定时取样于1mL的乙酸乙酯中(含1mg/mL的正己醇为内标)，震荡混匀，吸取上层有机相于适量的无水MgSO4进行干燥，过0.22μm的有机膜后通过高效气相色谱分析仪进行分析测定。
结果显示，双酶依次加入进行催化时反应3h时底物完全转化，转化率为100％，eep为95.1％。双酶同时加入进行催化时底物完全转化所需时间为100min，转化率为100％，eep为95.2％。从eep和转化率来看，这两种催化模式没有明显的区别，但双酶同时加入进行催化时所需的时间明显比依次催化少。所以应选择同时加入双酶对外消旋环氧苯乙烷进行催化水解。
实施例4双酶比例和温度对对映归一性水解的影响
AuEH2A250I全细胞菌悬液和VrEH3全细胞菌悬液的比酶活分别为78mU/mg湿菌体和6mU/mg湿菌体，VrEH3是自身对映归一性水解的酶，在攻击(S)-SO的过程中同时攻击(R)-SO，而AuEH2A250I主要攻击(R)-SO。反应体系中VrEH3和AuEH2A250I全细胞菌悬液体积比在8:1至18:1(即400μl:50μl至400μl:25μl)范围内变化时，在8:1到14:1的小范围内，产物eep从91.9％升高到96.0％，在14:1到16:1的小范围内，eep则降低到95.5％。
分别在10℃至30℃温度条件下进行上述双酶同时加入到催化体系中的催化水解反应，外消旋底物浓度为10mM，待底物完全水解完全时取样，处理后气相检测，数据分析结果发现随着温度的升高，酶的对映选择性降低，eep降低。当温度从10℃升高到30℃时，eep从97％降低为94.9％。虽然低温条件下可以提高酶的对映选择性，但是低温条件下不易操作，因此选择25℃为最适的反应温度(96％)。
实施例5初始底物浓度对双酶对映归一性水解的影响
在有关双酶对映归一性水解外消旋环氧苯乙烷的相关报道中，产物抑制是制约初始底物的最大障碍。
在1mL的反应体系中，400μl VrEH3与33μlAuEH2A250I全细胞悬液加入到于517μl的100mmol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，25℃预热5min，加入100μl rac-SO使其终浓度为20mmol/L，开始反应，定期取样GC检测直至(S)-SO水解完全。同理，当反应体系中加入250μlrac-SO时底物终浓度为50mM。加入400μlrac-SO时终浓度为80mM。
当底物浓度为80mM，反应进行16h时底物转化率为68.7％、产物eep为73.9％，即使继续延长反应时间，底物依然不能被完全转化。因此综合考虑反应时间(13h)与产物eep(94.4％)，50mM底物作为最适的初始底物浓度。
VrEH3和AuEH2A250I全细胞悬液的浓度为100mg/mL，400μlVrEH3中湿菌体的重量为40mg，33μlAuEH2A250I中湿菌体的重量为0.33mg，所以在1mL反应体系中VrEH3的湿菌体浓度为40mg/mL，AuEH2A250I湿菌体的浓度为0.33mg/mL。
同样的反应体系(1mL)，等比例扩大底物与酶的浓度，当底物浓度分别扩大2倍，4倍，8倍即底物浓度为100mM,200mM，400mM时，反应体系中AuEH2A250I的湿菌体的浓度为0.66mg/mL，1.32mg/mL和2.64mg/mL，VrEH3的菌悬液的浓度为80mg/mL，160mg/mL和320mg/mL。当底物浓度为400mM时，底物不能被完全催化，分析原因为产物抑制了酶的活性。因此最高的底物浓度为200mM，此时反应时间和产物eep分别为13.5h和94％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种利用双环氧化物水解酶制备(R)-苯乙二醇(PED)的方法，其特征在于，以外消旋环氧苯乙烷(rac-SO)为底物，所述双环氧化物水解酶是指环氧化物水解酶突变体AuEH2A250I和环氧化物水解酶VrEH3；所述环氧化物水解酶突变体AuEH2A250I是将来源于宇佐美曲霉的环氧化物水解酶的第250位的丙氨酸突变为异亮氨酸得到的，所述环氧化物水解酶VrEH3来源于绿豆。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是向缓冲体系添加终浓度为20～200mM的rac-SO作为底物，然后将环氧化物水解酶突变体AuEH2A250I和环氧化物水解酶VrEH3同时加入，于10℃～30℃对映归一性水解外消旋环氧苯乙烷。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述环氧化物水解酶突变体AuEH2A250I是以重组表达该环氧化物水解酶突变体AuEH2A250I的重组细胞的形式添加到缓冲体系中。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述环氧化物水解酶VrEH3是以重组表达该环氧化物水解酶VrEH3的重组细胞的形式添加到缓冲体系中。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将重组大肠杆菌E.coli/(AuEH2A250I)制成菌浓度为100mg/mL的、酶比活力为78mU/mg湿菌体的菌悬液，然后用于催化反应。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将重组大肠杆菌E.coli/VrEH3制成菌浓度为100mg/mL的、酶比活力为6mU/mg湿菌体的菌悬液，然后用于催化反应。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，环氧化物水解酶突变体AuEH2A250I与环氧化物水解酶VrEH3的用量参照两酶活力比39：(24～42)。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系是100mmol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，底物的初始反应浓度为50mM。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，环氧化物水解酶突变体AuEH2A250I与环氧化物水解酶VrEH3的用量参照两酶活力比39：42，反应温度为25℃。
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