CN111254134B - 腈基水解酶突变体及其在(s)-单腈单酸合成中的应用 - Google Patents
腈基水解酶突变体及其在(s)-单腈单酸合成中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种腈基水解酶突变体及其在(S)‑单腈单酸化合物合成中的应用，具体地，本发明提供了一种合成(S)‑单腈单酸化合物的腈基水解酶突变体，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有催化二腈类化合物生成(S)‑单腈单酸催化活性，并且所述突变蛋白在野生型的腈基水解酶的2个或2个以上的与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变。本发明的腈基水解酶突变体可以显著提高腈基水解酶的催化活性、提高(S)单腈单酸的产率、时空产率、和ee。
Description
技术领域
本发明涉及酶及酶工程领域，具体地，本发明涉及腈基水解酶突变体及其在(S)-单腈单酸化合物合成中的应用。
背景技术
二腈类化合物选择性水解生成的(S)-单腈单酸化合物是合成γ-氨基酸的重要前体物质，γ-氨基酸因其生物活性及药物重要性而受到越来越多的关注。他们是市售药物关键的前体物质。例如，巴氯酚，及其前体药物普阿氯芬；闭环产物咯利普兰等。如图1。
3-(4-氯苯基)戊二腈的氰基的选择性水解是合成巴氯酚关键中间体的有效途径。巴氯酚(式I)属于手性γ-氨基酸，是作用于神经递质GABA药物之一，为解痉药。巴氯酚能抑制单突触和多突触的脊髓传递，机制在于激动GABA-受体而使兴奋性氨基酸谷氨酸及天门冬氨酸的释放受到抑制。因而减轻脊髓病变、多发性硬化、脊髓损伤所致的机体肌张力增高。用于脊髓及大脑疾病或损伤引起的肌肉痉挛。巴氯酚目前是我国市场上治疗癫痫以及脑卒中后偏瘫等痉挛疾病的主要口服药物试剂，且是目前最有效而副作用最少的肌肉松弛剂。
制备过程:
目前巴氯酚的合成方法是由对氯苯甲醛与乙酰乙酸乙酯缩合生成对氯代苯甲基-双-乙酰乙酸乙酯。加热水解得对氯代苯基戊二酸。用乙酐脱水环合生成对氯代苯基戊二酸酐。再用浓氨水胺化生成对氯代苯基戊二酸亚酰胺，最后开环、降解得对氯苯胺酪酸。其最后开环、降解具体操作方法如下：将42.24gβ-(对氯苯基)戊二酸亚酰胺在搅拌下加入到含8.32g氢氧化钠的200ml水溶液中。混合物于50℃加热10min，冷却至10-15℃，滴加含有40.9g氢氧化钠的200ml水溶液，20min后，加38.8g溴，在20-25℃搅拌8h，用浓盐酸仔细地将反应液的pH值调至7，随后即沉降出细的β-(对氯苯基)-γ-氨基丁酸结晶，再由水中重结晶。该方法需添加强酸强碱溶液，反应条件苛刻，同时伴有大量盐类形成，对环境不友好。且合成过程中ee值较低。
采用微生物或者酶水解，能够解决化学合成路线中存在的反应条件苛刻，ee值过低，及二腈到单腈单酸的区域选择性水解的问题，而且对环境友好，符合原子经济学原理和国家绿色化学发展的前进方向。2000年，王梅祥等利用红球菌Rhodococcus sp.AJ270细胞在催化转化72h后选择性水解3-(4-氯苯基)-戊二腈生成(S)-4-氰基-(3-4-氯苯基)-丁酸，转化产物ee值仅为26％，在体系中添加丙酮后提高至63％。本课题组徐美珍构建来源于G.intermedia的重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-Nit用于催化水解3-(4-氯苯基)-戊二腈生成(S)-4-氰基-(3-4-氯苯基)-丁酸，ee值可达到99％，时空产率为11.2g/(L.d)。催化效率较低。
因此本领域迫切需要开发高效的腈水解酶，从而实现(S)-单腈单酸的高立体选择性、高产量的转化。
发明内容
本发明提供了一种高效的腈基水解酶，从而实现(S)-单腈单酸的高立体选择性合成。
本发明第一方面提供了一种腈基水解酶突变蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有水解二腈类化合物生成(S)单腈单酸的催化活性，并且所述突变蛋白在野生型的腈基水解酶的对应于SEQ ID NO.:1的选自下组的三个或三个以上与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：
第59位酪氨酸(I)；
第64位苯丙氨酸(E)；
第139位苏氨酸(T)；
第140位酪氨酸(Y)；
第141位组氨酸(H)；
第142位谷氨酸(E)；
第170位色氨酸(W)；
第193位苯丙氨酸(F)；
第194位脯氨酸(P)；
第197位甲硫氨酸(M)；
第198位缬氨酸(V)；
第201位异亮氨酸(I)；
第202位苯丙氨酸(F)；和
第205位谷氨酰胺(Q)；
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的腈基水解酶的对应于SEQ ID NO.:1的选自下组与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：
第59位酪氨酸(I)；
第64位苯丙氨酸(E)；
第139位苏氨酸(T)；
第140位酪氨酸(Y)；
第141位组氨酸(H)；
第142位谷氨酸(E)；
第170位色氨酸(W)；
第193位苯丙氨酸(F)；
第194位脯氨酸(P)；
第197位甲硫氨酸(M)；
第198位缬氨酸(V)；
第201位异亮氨酸(I)；
第202位苯丙氨酸(F)；和
第205位谷氨酰胺(Q)；
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的腈基水解酶的对应于SEQ ID NO.:1的选自下组与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：
第64位苯丙氨酸(E)；
第140位酪氨酸(Y)；
第141位组氨酸(H)；
第194位脯氨酸(P)；
第197位甲硫氨酸(M)；
第198位缬氨酸(V)；
第201位异亮氨酸(I)；
第202位苯丙氨酸(F)；和
第205位谷氨酰胺(Q)；
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的腈基水解酶的对应于SEQ ID NO.:1的选自下组与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：
第141位组氨酸(H)；
第194位脯氨酸(P)；
第197位甲硫氨酸(M)；
第201位异亮氨酸(I)；和
第202位苯丙氨酸(F)；
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的腈基水解酶的对应于SEQ ID NO.:1的选自下组与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：
第194位脯氨酸(P)；
第201位异亮氨酸(I)；和
第202位苯丙氨酸(F)；
在另一优选例中，第59位酪氨酸(Y)突变为丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、或其组合，优选苯丙氨酸(F)。
在另一优选例中，所述第64位苯丙氨酸(F)突变为丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)、或其组合，优选酪氨酸(Y)。
在另一优选例中，所述第139位苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、或其组合，优选丝氨酸(S)。
在另一优选例中，所述第140位酪氨酸(Y)突变为丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、或其组合，优选苯丙氨酸(F)。
在另一优选例中，所述第141位组氨酸(H)突变为丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、天门冬氨酸(D)、精氨酸(R)、或其组合，优选天门冬氨酸(D)。
在另一优选例中，所述第142位组氨酸(H)突变为丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、天门冬氨酸(D)、或其组合，优选天门冬氨酸(D)。
在另一优选例中，所述第170位色氨酸(W)突变为苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、或其组合，优选苯丙氨酸(F)。
在另一优选例中，所述第193位苯丙氨酸(F)突变为丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、丝氨酸(S)、或其组合，优选丙氨酸(A)。
在另一优选例中，所述第194位脯氨酸(P)突变为缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、或其组合，优选缬氨酸(V)和/或甘氨酸(G)，更优选丙氨酸(A)。
在另一优选例中，所述第197位甲硫氨酸(M)突变为半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、或其组合，优选缬氨酸(V)。
在另一优选例中，所述第198位缬氨酸(V)突变为甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天门冬氨酸(N)、丙氨酸(A)、或其组合，优选甘氨酸(G)。
在另一优选例中，第201位异亮氨酸(I)突变为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)、或其组合，优选亮氨酸(L)和/或精氨酸(R)，更优选丙氨酸(A)。
在另一优选例中，所述第202位苯丙氨酸(F)突变为半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、异亮氨酸(I)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)、或其组合，优选丙氨酸(A)和/或丝氨酸(S)和/或异亮氨酸(I)，更优选缬氨酸(V)。
在另一优选例中，所述第205位谷氨酰胺(Q)突变为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、天门冬酰胺(N)、或其组合，优选天门冬酰胺(N)。
在另一优选例中，所述野生型的腈基水解酶为HsNIT。
在另一优选例中，所述的突变蛋白除所述突变(如59位、64位、139位、140位、114位、142位、193位、194位、197位、198位、201位、202位、和/或205位)外，其余的氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示的序列相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白仍具有催化生成S构型单腈单酸化合物的催化活性。
在另一优选例中，与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％或90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％或99％。
在另一优选例中，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.：6-9中的任一所示。
在另一优选例中，所述腈基水解酶来源于Synechocystis sp.strain PCC 6803.。
在另一优选例中，所述腈基水解酶的催化底物包括二腈类化合物。
在另一优选例中，二腈类化合物选择下组：
其中R为苯基，4-氯苯基，4-甲基苯基，4-异丙基苯基，4-叔丁基苯基，4-氟苯基，4-溴苯基，2-氯苯基，3-氯苯基，4-甲氧基苯基，4-硫甲基苯基，4-氮乙基苯基，4-三氟甲基苯基，4-羟基苯基，2-羟基苯基，3-(1H-吲哚-2-),异丙基及异丁基。
在另一优选例中，所述腈基水解酶的突变蛋白催化二腈类化合物反应生成(S)-单腈单酸。
在另一优选例中，所述的腈基水解酶的突变蛋白催化如下反应：
在另一优选例中，所述反应具有选自下组的一个或多个特点：
(i)反应体系的pH为6.0-10.0，较佳地，6-9，更佳地，6.5-7.5；
(ii)反应温度为20-60℃，较佳地，25-50℃，更佳地，28-32℃；
(iii)反应时间为0.5-24小时，较佳地，0.5-12小时，更佳地，0.5-4小时。
在另一优选例中，所述腈基水解酶的突变蛋白催化二腈类化合物生成(S)-单腈单酸的催化活性为野生型腈基水解酶(SEQ ID NO.:1)的100-10000％，较佳地，1000％-10000％。
在另一优选例中，所述腈基水解酶的突变蛋白具有选自下组的一个或多个特征：
(a)与野生型的腈基水解酶相比，催化获得的(S)-单腈单酸的产率≥95％，较佳地，≥99％；
(b)与野生型的腈基水解酶相比，催化获得的(S)-单腈单酸的时空产率为100-600g/L.d，较佳地，450-500g/L.d；
(c)与野生型的腈基水解酶相比，催化获得的(S)-单腈单酸的ee值≥95％，较佳地，>99％；
(d)与野生型的腈基水解酶相比，催化获得的(S)-单腈单酸含量>99％。
本发明第二方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的突变蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:6－9任一所示的多肽；
(b)序列如SEQ ID NO.：2-5任一所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:2-5任一所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:1，6-9任一所示多肽的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的多核苷酸在腈基水解酶的突变蛋白的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。
在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列、或其组合。
本发明第三方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或植物细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。
本发明第五方面提供了一种产生本发明第一方面所述的腈基水解酶的突变蛋白的方法，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出腈基水解酶的突变蛋白；和/或分离所述腈基水解酶的突变蛋白。
本发明第六方面提供了一种酶制剂，所述酶制剂包含本发明第一方面所述的腈基水解酶的突变蛋白。
在另一优选例中，所述的酶制剂包括注射剂、和/或冻干制剂。
本发明第七方面提供了一种制备(S)-单腈单酸的方法，包括步骤：
(i)将本发明第一方面所述的腈基水解酶的突变蛋白与反应底物接触，进行催化反应，从而获得所(S)-单腈单酸；和
(ii)任选地，分离并纯化所述(S)-单腈单酸。
在另一优选例中，所述(S)-单腈单酸为手性化合物。
在另一优选例中，所述反应底物为二腈类化合物。
在另一优选例中，在步骤(i)中，所述催化反应的时间为0.5-20h，较佳地，0.5-10h，更佳地，0.5-4h。
在另一优选例中，在步骤(i)中，所述催化反应的温度为20-60℃，较佳地，25-50℃，更佳地，28-32℃。
本发明第八方面提供了一种本发明第一方面所述的突变蛋白的用途，所述的突变蛋白用于催化二腈类化合物生成(S)-单腈单酸，或被用于制备催化二腈类化合物生成(S)-单腈单酸的催化制剂。
本发明第九方面提供了一种本发明第一方面所述的突变蛋白或本发明第四方面所述的宿主细胞的用途，用于制备(S)-单腈单酸。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了SsNIT突变体蛋白经过纯化后结果。
其中，M表示Marker，1为代表性突变体蛋白
具体实施方式
通过广泛而深入的研究，本发明人通过大量筛选，筛到了可显著提高腈基水解酶的突变蛋白催化活性的关键氨基酸位点。本发明发现，对本发明的野生型的腈基水解酶中的关键位点进行改造后，可以显著提高腈水解酶的催化活性、提高(S)-单腈单酸的产率、时空产率、ee值。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如“Y59A”表示第59位的氨基酸Y突变为A，以此类推。
本发明突变蛋白及其编码核酸
如本文所用，术语“突变蛋白”、“本发明突变蛋白”、“本发明腈水解酶突变蛋白”、“本方面腈基水解酶突变体”可互换使用，均指非天然存在的腈基水解酶突变蛋白，且所述突变蛋白为基于SEQ ID NO.:1所示蛋白进行人工改造的蛋白，其中，所述的突变蛋白含有与酶催化活性相关的核心氨基酸，且所述核心氨基酸中至少有一个是经过人工改造的；并且本发明突变蛋白具有催化二腈类化合物形成(S)-单腈单酸的酶活性。
术语“核心氨基酸”指的是基于SEQ ID NO.:1，且与SEQ ID NO.:1同源性达至少80％，如84％、85％、90％、92％、95％、98％的序列中，相应位点是本文所述的特定氨基酸，如基于SEQ ID NO.:1所示的序列，核心氨基酸为：
第59位酪氨酸(I)；和/或
第64位苯丙氨酸(E)；和/或
第139位苏氨酸(T)；和/或
第140位酪氨酸(Y)；和/或
第141位组氨酸(H)；和/或
第142位谷氨酸(E)；和/或
第170位色氨酸(W)；和/或
第193位苯丙氨酸(F)；和/或
第194位脯氨酸(P)；和/或
第197位甲硫氨酸(M)；和/或
第198位缬氨酸(V)；和/或
第201位异亮氨酸(I)；和/或
第202位苯丙氨酸(F)；和/或
第205位谷氨酰胺(Q)。
且对上述核心氨基酸进行突变所得到的突变蛋白具有催化二腈类化合物形成(S)-单腈单酸的酶活性。
优选地，在本发明中，对本发明的所述核心氨基酸进行如下突变，如表1所示。
表1
| 位置 | 野生型 | 最优选突变体 |
| 突变位点1(第59位氨基酸) | Y | F |
| 突变位点2(第64位氨基酸) | F | Y |
| 突变位点3(第139位氨基酸) | T | A |
| 突变位点4(第140位氨基酸) | Y | F |
| 突变位点5(第141位氨基酸) | H | D |
| 突变位点6(第142位氨基酸) | E | A |
| 突变位点7(第170位氨基酸) | W | F |
| 突变位点8(第193位氨基酸) | F | A |
| 突变位点9(第194位氨基酸) | P | V或A |
| 突变位点10(第197位氨基酸) | M | V |
| 突变位点11(第198位氨基酸) | V | G |
| 突变位点12(第201位氨基酸) | I | L或R或A |
| 突变位点13(第202位氨基酸) | F | A或V |
| 突变位点14(第205位氨基酸) | Q | N |
应理解，本发明突变蛋白中的氨基酸编号基于SEQ ID NO.:1作出，当某一具体突变蛋白与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性达到80％或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于SEQ ID NO.:1)的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的N末端或C末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％(如90％、95％、98％)的、具有相同或相似产生(S)-单腈单酸催化活性的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。
本发明突变蛋白是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的突变蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的突变蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括所述突变蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述突变蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。
本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(iii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据表I进行氨基酸替换而产生。
表I
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro；Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
本发明的活性突变蛋白具有催化二腈类化合物形成(S)-单腈单酸的酶活性。
优选地，所述的突变蛋白如SEQ ID NO.:6，7，8，9所示。应理解，本发明突变蛋白与SEQ ID NO.:6，7，8，9所示的序列相比，通常具有较高的同源性(相同性)，优选地，所述的突变蛋白与SEQ ID NO.:6，7，8，9所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％，最佳地，≥99％。此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。
术语“编码突变蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明突变蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或突变蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的突变蛋白的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明的突变蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明的腈基水解酶具有宽广的底物谱，对一系列二腈类底物均具有高的反应活性及立体选择性。
在本发明的一优选实施方式中，本发明所述重组腈基水解酶的制备方法为：培养如上所述的重组表达转化体，获得重组表达的腈基水解酶。其中所述的培养重组表达转化体所用的培养基为本领域任何可使转化体生长并产生本发明的重组腈基水解酶的培养基。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同，按本领域常规知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并生产腈基水解酶即可。
在本发明的一优选实施方式中，本发明的腈基水解酶突变体(SsNIT突变体)的制备方法如下：大肠杆菌作为表达宿主。
具体地，该制备方法包括以下步骤：(1)SsNIT相应突变位点的基因构建到pET15b表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。(2)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌Rosetta2(DE3)pLysS)，获得相应的工程菌株。
(3)将工程菌株接种至L-B培养基中，37℃培养6小时，加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，30℃培养12小时。(4)离心收集菌体。
本发明还提供了利用SsNIT及突变体重组菌作为生物催化剂转化二腈类化合物的方法。具体地，将底物二腈类化合物与重组菌或者破菌液、纯酶构建反应体系，反应体系为pH 6.0-9.0的缓冲溶液，反应温度为20℃到50℃。待水解反应结束后，反应液用等量本领域常规的水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醚、甲基叔丁基醚等进行萃取，重复萃取三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂，即得光学纯手性产物，进一步通过常规方法，比如减压蒸馏、重结晶等方法进行纯化即可得高度化学纯和光学纯的产物。
野生型腈基水解酶
如本文所用，“野生型腈基水解酶”是指天然存在的、未经过人工改造的腈基水解酶，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型腈基水解酶的氨基酸序列如SEQID NO.:1所示。
上述涉及的野生蛋白、本发明突变蛋白的序列信息如表2(见实施例)所示。
表达载体
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的突变蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明突变蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码突变蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明突变蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs
和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于
宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的所述腈基水解酶基因的启动子可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或使用不同来源的更有效的启动子进行完全替换，可提高所述腈基水解酶的表达水平。
本发明的所述重组表达载体可通过本领域常规方法将上述腈基水解酶基因克隆到各种载体上构建而成。所述的表达载体较佳地包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述载体对于大肠杆菌优选地为pET15b质粒。
本发明的主要优点包括：
(i)经大量筛选和改造，本发明改造了相关位点后，能够显著提高腈基水解酶的催化活性、提高(S)-单腈单酸的产率(等同于产量)、时空产率、以及ee值。
(ii)本发明的腈基水解酶具有宽广的底物谱，对一系列二腈类化合物底物均具有高的反应活性及立体选择性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非有特别说明，否则本发明实施例中的试剂和材料均为市售产品。
实施例1:SsNIT腈基水解酶重组表达质粒和重组表达转化体的制备
将SEQ ID No.1的序列全合成后连接到pET 15b空质粒同时用限制性内切酶NcoI和BamHI双酶切过夜，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA试剂盒回收。将回收的酶切目的片段和空载体在T4DNA连接酶的作用下，于4℃连接12小时，得到重组质粒pET15b-SsNIT，进一步转化至Rosetta2(DE3)pLysS，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli Rosetta2(DE3)pLysS/pET15b-SsNIT。
实施例2:腈基水解酶SsNIT突变体构建
腈基水解酶SsNIT丙氨酸扫描：根据SsNIT的晶体结构，选取其底物结合口袋内非保守残基，进行丙氨酸突变扫描。以pET15b-SsNIT作为模板，采用两步法PCR，用高保真聚合酶I 5进行PCR。PCR反应条件如下：round 1：总体积为20μL的PCR反应体系中，加入模板0.5～20ng，10μL 2×I 5(mix)，一对突变引物各0.4μL(10μM)，加灭菌蒸馏水至20μL。PCR反应程序：(1)95℃变性10sec，(2)58℃退火30sec，(3)72℃延伸8sec，步骤(1)～(3)共进行30个循环。Round 2：总体积为50μL的PCR反应体系中，加入模板0.5～50ng，25μL 2×I 5(mix)，突变引物1μL(round 1产物)，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序：(1)95℃变性10sec，(2)58℃退火30sec，(3)72℃延伸2min，步骤(1)～(3)共进行25个循环。4℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后加入限内酶DpnI在37℃消化2h。将消化产物转入E.coliRosetta2(DE3)pLysS感受态细胞并涂布于含有氨苄抗生素的平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。将所得到的单克隆菌落挑取到含4ml LB培养基的试管中进行培养，对相应的基因进行测序。对表达的蛋白进行活力检测。
构建腈水解酶的SsNIT突变库：根据丙氨酸扫描结果构建饱合突变体库，采用简并密码子NDT设计突变引物。PCR体系及程序同上。将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对表达的蛋白进行高通量活力筛选，对活性较高的突变体进行相应的基因测序。
构建腈水解酶SsNIT组合突变：根据饱和突变结果构建组合突变。将所得到的单克隆菌落挑取到含4ml LB培养基的试管中进行培养，对表达的蛋白进行活力检测。
其中，代表性的突变体1的蛋白序列如SEQ ID NO.:6所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO.:2所示。
突变体2的蛋白序列如SEQ ID NO.:7所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
突变体3的蛋白序列如SEQ ID NO.:8所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
突变体4的蛋白序列如SEQ ID NO.:9所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
表2提供本发明的具有相关活性以及较高ee值的特定序列的腈基水解酶SsNIT突变体的列表。
在下表中，序列标号分别指表1后面的一系列序列，在活性列中，一个加号“+”表示突变体蛋白比由序列表中SEQ ID No.1(野生型腈水解酶)所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了1～5倍；两个加号“++”表示突变体蛋白比SEQ ID No.1所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了5～10倍，三个加号“+++”表示突变体蛋白比SEQ ID No.1所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了10倍以上。
表2
实施例3：腈基水解酶SsNIT突变体的诱导表达及纯化
配置种子液50mL，培养基为LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，用接种环挑取基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基(LB培养基)，37℃，200rpm培养至A6000.6-1.0左右，加入0.1mM的IPTG，并置于30℃，200rpm诱导10～12h。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体，用磷酸钠缓冲液(100mM，pH 7.0)清洗两遍，并用高压匀浆机破碎，13000rpm离心留取上清液，然后采用金属亲和层析(镍柱)法纯化回收目的蛋白，目的蛋白经透析除去咪唑后即得SsNIT突变体纯酶液。SDS-PAGE电泳图谱显示纯化所得蛋白条带单一，如图1所示。
结果表明，本实施例的方法能够获得较纯的蛋白突变体，分子量为40KD，纯度>95％。
实施例4:腈水解酶SsNIT突变体的底物谱
构建反应检测底物转化率及产物立体选择性：1mL，pH 7.0-7.5，浓度为100mM的磷酸钠缓冲液，10mM的不同二腈底物，加入适量纯酶液，反应过夜后HPLC检测。产物测定方法：Aglient高效液相色谱仪，色谱柱：Daicel OD-H(3μm，4.6×150mm)，流动相：正己烷-异丙醇-三氟乙酸(V/V/V＝20:80:1)，检测波长：210nm，柱温：30℃，流速：0.5mL/min。
结果表明，腈水解酶SsNIT突变体能够高效的转化二腈类化合物为(S)-单腈单酸，转化产物的ee>96％。
实施例5：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(4-氯苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
(1)取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-氯苯基)戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为20.5g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为488g/(L.d)，ee值>99％。
(2)取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-氯苯基)戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为25.6g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，5h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为600g/(L.d)，ee值>99％。
实施例6：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(4-甲基苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-甲基苯基)-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为11.5g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为277g/(L.d)，ee值>99％。
实施例7：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(4-异丙基苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-异丙基苯基)-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为2g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为45g/(L.d)，ee值>98％。
实施例8：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(4-叔丁基苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-叔丁基苯基)-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为1g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为23g/(L.d)，ee值>99％。
实施例9：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(4-氟苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-氟苯基)-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为33g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为780g/(L.d)，ee值>99％。
实施例10：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(4-溴苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-溴苯基)-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为25g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为581g/(L.d)，ee值>99％。
实施例11：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(2-氯苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(2-氯苯基)-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为6.3g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为149g/(L.d)，ee值>97％。
实施例12：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(3-氯苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(3-氯苯基)-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为10.7g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为255g/(L.d)，ee值>97％。
实施例13：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(4-甲氧基苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-甲氧基苯基)-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为10.5g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为250g/(L.d)，ee值>99％。
实施例14：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(4-硫甲基苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-硫甲基苯基)-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为2g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为45.4g/(L.d)，ee值>99％。
实施例15：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-异丙基-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-异丙基-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为13g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为322g/(L.d)，ee值>99％。
实施例16：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-异丁基-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-异丁基-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为11g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为268g/(L.d)，ee值>99％。
实施例17：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(4-氮乙基苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-氮乙基苯基)-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为2.6g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为62g/(L.d)，ee值>99％。
实施例18：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(4-三氟甲基苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-三氟甲基苯基)-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为14.6g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为342g/(L.d)，ee值>96％。
实施例19：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(4-羟基苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(4-羟基苯基)-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为6.6g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为159g/(L.d)，ee值>99％。
实施例20：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(2-羟基苯基)-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(2-羟基苯基)-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为6g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为127g/(L.d)，ee值>99％。
实施例21：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-(3-(1H-吲哚-2-))-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-(3-(1H-吲哚-2-基))-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为2.5g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为40g/(L.d)，ee值>99％。
实施例22：腈水解酶SsNIT重组菌催化3-苯基-戊二腈的方法
按照实施例3的方法诱导表达本发明的SsNIT突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
取菌体重悬于10mL磷酸钠缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为20g/L，加入底物3-苯基-戊二腈(10％v/v DMSO)至终浓度为15.1g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，4h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，HCl调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率(等同于产量)为99％，时空产率为366g/(L.d)，ee值>99％。
结果表明，与野生型的腈基水解酶相比，本发明的腈基水解酶的突变蛋白可显著提高(S)-单腈单酸的产率、时空产率、ee值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 1
中国科学院天津工业生物技术研究所
1, 1
<120> 腈基水解酶突变体及其在(S)-单腈单酸合成中的应用
<130> 1
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Ala Ala Gln Ile Ser Pro Val Leu Phe Ser Gln Gln Gly Thr Met Glu
20 25 30
Lys Val Leu Asp Ala Ile Ala Asn Ala Ala Lys Lys Gly Val Glu Leu
35 40 45
Ile Val Phe Pro Glu Thr Phe Val Pro Tyr Tyr Pro Tyr Phe Ser Phe
50 55 60
Val Glu Pro Pro Val Leu Met Gly Lys Ser His Leu Lys Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Glu Ala Val Thr Val Pro Gly Lys Val Thr Gln Ala Ile Ala Gln Ala
85 90 95
Ala Lys Thr His Gly Met Val Val Val Leu Gly Val Asn Glu Arg Glu
100 105 110
Glu Gly Ser Leu Tyr Asn Thr Gln Leu Ile Phe Asp Ala Asp Gly Ala
115 120 125
Leu Val Leu Lys Arg Arg Lys Ile Thr Pro Thr Tyr His Glu Arg Met
130 135 140
Val Trp Gly Gln Gly Asp Gly Ala Gly Leu Arg Thr Val Asp Thr Thr
145 150 155 160
Val Gly Arg Leu Gly Ala Leu Ala Cys Trp Glu His Tyr Asn Pro Leu
165 170 175
Ala Arg Tyr Ala Leu Met Ala Gln His Glu Gln Ile His Cys Gly Gln
180 185 190
Phe Ala Gly Ser Met Val Gly Gln Ala Val Ala Asp Gln Met Glu Val
195 200 205
Thr Met Arg His His Ala Leu Glu Ser Gly Cys Phe Val Ile Asn Ala
210 215 220
Thr Gly Trp Leu Thr Ala Glu Gln Lys Leu Gln Ile Thr Thr Asp Glu
225 230 235 240
Lys Met His Gln Ala Leu Ser Gly Gly Cys Tyr Thr Ala Ile Ile Ser
245 250 255
Pro Glu Gly Lys His Leu Cys Glu Pro Ile Ala Glu Gly Glu Gly Leu
260 265 270
Ala Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ser Leu Ile Ala Lys Arg Lys Arg Met
275 280 285
Met Asp Ser Val Gly His Tyr Ala Arg Pro Asp Leu Leu Gln Leu Thr
290 295 300
Leu Asn Asn Gln Pro Trp Ser Ala Leu Glu Ala Asn Pro Val Thr Pro
305 310 315 320
Asn Ala Ile Pro Ala Val Ser Asp Pro Glu Leu Thr Glu Thr Ile Glu
325 330 335
Ala Leu Pro Asn Asn Pro Ile Phe Ser His
340 345
Claims (9)
1.一种腈基水解酶突变蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有催化二腈类化合物生成(S)-单腈单酸的催化活性，并且所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9任意所示。
2.一种多核苷酸，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ IDNO.4, SEQ ID NO.5任意所示。
3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求3所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
5.一种产生权利要求1所述的腈基水解酶的突变蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出腈基水解酶的突变蛋白；和/或分离所述腈基水解酶的突变蛋白。
6.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含权利要求1所述的腈基水解酶的突变蛋白。
7.一种制备(S)-单腈单酸的方法，其特征在于，包括步骤：(i)将权利要求1中腈基水解酶的突变蛋白与反应底物接触，进行催化反应，从而获得(S)-单腈单酸；（ii)分离并纯化所述(S)-单腈单酸。
8.一种权利要求1所述的突变蛋白的用途，其特征在于，所述的突变蛋白用于催化二腈类生成(S)-单腈单酸，或被用于制备催化二腈类化合物生成(S)-单腈单酸的催化制剂。
9.一种权利要求1所述的突变蛋白或权利要求4所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于制备(S)-单腈单酸。
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