CN111944792A

CN111944792A - 腈水解酶RmNIT的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法

Info

Publication number: CN111944792A
Application number: CN202010839142.2A
Authority: CN
Inventors: 罗会颖; 张亨; 姚斌; 王亚茹; 柏映国; 黄火清; 苏小运; 王苑; 涂涛; 张�杰
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2020-08-19
Filing date: 2020-08-19
Publication date: 2020-11-17

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及腈水解酶RmNIT的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法。本发明发现来自Rhizobium multihospitium的蛋白酶具有腈水解酶特性，有良好的热稳定性，酶的最适反应温度为55‑60℃，在60℃时具有90%以上的酶活力。热稳定性实验表明：该腈水解酶在55℃处理5 min约剩余80%酶活力，55℃处理1 h约剩余40%酶活力。另外该腈水解酶能有效地催化菜籽粕中3‑羟基‑4‑戊烯腈、4‑戊烯腈、3‑丁烯腈、3‑吲哚乙腈等。具有很高的工业化应用潜力。

Description

腈水解酶RmNIT的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及腈水解酶RmNIT的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法。

背景技术

腈水解酶（Nitrilase；EC 3.5.5.1）是腈水解酶超级家族中的一种重要催化剂，它作为一种重要的工业酶不仅能将腈类化合物转化为高附加值的工业、食品和医药等产品的中间体，还能够直接将有毒腈化物转化为相应的无毒酸和氨，处理环境中的腈类污染物。然而腈水解酶的应用仍受到诸多因素的制约，如腈水解酶种类仍偏少、比酶活不够高、稳定性较差等问题。

菜籽粕是杂粕资源中的一大类别，消除菜籽粕中的抗营养物质对其在饲料中的应用具有重大推动作用。菜籽粕中一类抗营养物质为硫代葡糖苷，简称硫苷，是广泛存在于十字花科及相关物种含硫次生代谢物，目前已从数百种植物中发现120多种硫苷。硫苷能引起饲用动物甲状腺肿大，从而造成其生长发育迟缓，使菜籽粕难以作为优质饲料蛋白资源加以充分应用。硫代葡糖苷本身无毒，其降解产物如腈类化合物对动物生长发育有害。菜籽粕中的腈种类有很多，主要有：3-羟基-4-戊烯腈、4- 戊烯腈、3-丁烯腈、3-吲哚乙腈等。

因此，如何消除饲料中的有毒腈化物成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供Rhizobium multihospitium来源的蛋白酶作为腈水解酶的应用。

本发明的再一目的是提供一种消除饲料中腈化物毒性的方法。

本发明确定氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶具有腈水解酶特性。

上述蛋白酶可以用于将饲料中的有毒腈化物转化为无毒物质。因此，该酶适合于在食品、饲料、医药等行业中应用。其中，该酶全长379个氨基酸，理论分子量为41.9 kDa。

本发明确定该腈水解酶RmNIT的最适pH为8.0，最适温度为55-60 ℃。50 ℃处理1小时剩余80 %酶活。在pH 12范围内37℃处理1 h，剩余60 %酶活力。

编码上述腈水解酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

根据本发明的技术方案，运用基因工程手段来产业化生产腈水解酶。该腈水解酶有效地催化菜籽粕中3-羟基-4-戊烯腈、4- 戊烯腈、3-丁烯腈、3-吲哚乙腈等。

本发明发现来自Rhizobium multihospitium的蛋白酶具有腈水解酶特性，有良好的热稳定性，酶的最适反应温度为55-60℃，在60℃时具有90%以上的酶活力。热稳定性实验表明：该腈水解酶在55 ℃ 处理5 min约剩余80%酶活力，55℃处理1 h约剩余40%酶活力。另外该腈水解酶能有效地催化菜籽粕中3-羟基-4-戊烯腈、4- 戊烯腈、3-丁烯腈、3-吲哚乙腈等。具有很高的工业化应用潜力。

附图说明

图1显示本发明的腈水解酶的最适pH值。

图2显示本发明的腈水解酶的pH稳定性。

图3显示本发明腈水解酶的最适反应温度。

图4显示本发明的腈水解酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：pET28a，大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）购自诺维赞生物技术有限公司。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶购自NEB公司；FastPfuDNA聚合酶购自诺维赞生物技术有限公司；从OMEGA公司购买DNA回收试剂盒；从天根生化科技有限公司购买质粒小提中量试剂盒。所用试剂均为国产分析纯试剂。

3、培养基：

（1）LB液体培养基：5 g/L酵母粉，10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl。

（2）LB固体培养基：在固体培养基的基础上加15 g/L琼脂粉。

（3）卡纳霉素：100 mg/mL，0.22 μM滤膜滤灭。

（4）50×TAE：57.1 mL/L冰醋酸，242 g/L Tris碱，50 M EDTA，调至pH8.0。

（5）A液：2.5 g氢氧化钠、18.7 g磷酸氢二钠和15.9 g磷酸钠,含250 mg有效氯的次氯酸钠溶液，pH为11.7,ddH2O定容至500 mL，得氢氧化钠与次氯酸钠复配液。

B液：5.0 g苯酚和0.025 g亚硝基铁氰化钠，,ddH₂O定容至 500 mL,制得苯酚与亚硝基铁氰化钠复配液。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J．萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1 RmNIT基因的合成及表达载体构建

利用NCBI数据库数据检索得到Rhizobium multihospitium来源的腈水解酶 (NCBIReference Sequence: WP_092720209.1)，命名RmNIT。根据该腈水解酶的氨基酸序列，并依据大肠杆菌偏好的密码子进行密码子优化，并根据表达载体pET28a的特点设计了酶切位点NcoI和XhoI。

表1 本实验所需的引物

引物名称	引物序列(5'---3')	引物长度(bp)
			<i>RmNIT</i>F	AAGGAGATATACCATGGTTAGCTACACCAG	30
<i>RmNIT</i>R	ATGGTGGTGGTGCTCGAGGCGACCTTCGGCGCCGATA	37

以合成的RmNIT基因为模板，设计合成了带有NcoI和XhoI限制性酶切位点的引物F和R（见表1），对RmNIT基因进行扩增。并利用NcoI和XhoI酶切PCR产物，连接进入表达载体pET28a (Invitrogen, San Diego)，腈水解酶RmNIT的序列插入到上述表达载体的下游，形成正确的阅读框架，构建成大肠杆菌表达载体pET28a-RmNIT，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。表达质粒载体DNA，转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），37℃培养1天，挑取在LB平板上生长的转化子进行进一步的表达实验。

实施例2重组腈水解酶的制备

（1）将重组菌株挑取单菌落于20 mL的LB液体培养基中（含卡那霉素50 mg/mL），37 ℃，220rpm过夜培养。

（2）将种子液按1：100转接于500 mL LB液体培养基中（含卡那霉素50 mg/mL），37 ℃，220 rpm培养。

（3）OD600约0.6～0.8时加入终浓度为1.0 mM的IPTG。16 ℃，180 rpm培养约20个小时。

（4）取诱导后的菌液，4℃，4000 rpm离心8 min,收集菌体。

（5）将收集的细胞用20 mL A液悬浮，加入200 μL 蛋白酶抑制剂，混匀。

（6）用超声波破碎仪对细胞进行破碎。破碎细胞频率为每间隔4s破碎3s，超声破碎时间为2 h。可适当延长时间使细胞澄清。

（7）破碎后，4℃，13000 rpm离心50 min，取上清纯化。

（8）制备层析柱。加入2-3 mLNTA树脂于层析柱中，静止30 min左右用10倍树脂体积的ddH₂O进行洗脱，之后用10倍树脂体积的A液平衡。

（9）将离心后的上清蛋白加入到层析柱中，降低初始流速，收集穿透液。重复上样一次。

（10）以A,B液为母液配制咪唑浓度分别为10 mM、20 mM、50 mM和200 mM的洗脱液。依次加入洗脱液收集蛋白。

（11）取少量样品加入蛋白上样缓冲液，混匀后于沸水煮沸5 min,12000 rpm离心1min。取8 μL进行SDS-PAGE电泳。

（12）根据电泳条带确定最适洗脱体积并收集纯度较高的融合蛋白，采用Brandford法测定蛋白浓度。蛋白在液氮速冻后于-80 ℃保存。

实施例3重组腈水解酶部分性质分析

采用苯酚-次氯酸钠法对本发明的腈水解酶进行活性分析。具体方法如下：反应介质采用 100 mM、pH 7.2的磷酸钠缓冲液，反应底物为 20 mM 戊烯腈，反应体系体积为 500 uL，反应在 30°C的水浴锅上进行。将蛋白样品在 30℃ 下温浴20 min，随后加入到含有底物的磷酸缓冲液中开始计时。反应结束后加入1 M HCl (0.5 mL)终止反应。反应终止后，取10μL加入到含有ddH₂O 500 μL的EP管中,依次加入 B 液、A 液各 250μL,混合均匀,37 ℃恒温水浴加热20 min后,测定612 nm 处吸光度,绘制标准曲线。酶活(1 U)的定义为：在标准反应条件下，每 min 形成1 µmol氨所对应的酶量，测定需重复 3 次。

（1）腈水解酶RmNIT的最适pH及pH稳定性

实施例2经纯化的表达的腈水解酶RmNIT在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 1.0～3.0 甘氨酸-盐酸缓冲液，pH3.0～8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液及pH 8.0～l0.0是Tris-HCl系列缓冲液。纯化的腈水解酶BnNIT2在不同pH的缓冲体系。如图1所示，55℃下测定的最适pH结果为RmNIT的最适pH为8.0，在pH5-pH8范围内，该酶能够维持其80%以上的酶活力。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60 min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果如图2所示，该酶在pH5.0-pH9.0之间能够维持80%以上的酶活力。

（2）腈水解酶RmNIT反应最适温度及热稳定性

纯化的腈水解酶RmNIT在pH 8.0条件下，测定40-65℃不同温度下的酶活性，如图3所示，分析实验结果表明显示，该酶的最适反应温度为55-60℃，在60℃时具有90%以上的酶活力。耐温性测定为腈水解酶在不同温度下处理不同时间，再在55°C下进行酶活性测定。

如图4所示，热稳定性实验表明：该腈水解酶在55 ℃ 处理5 min约剩余80%酶活力，55℃处理1 h约剩余40%酶活力。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 具体涉及腈水解酶RmNIT的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 379

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Val Ser Tyr Thr Ser Thr Phe Lys Ala Ala Ala Val Gln Ala Glu

1 5 10 15

Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Glu Lys Ala Ile Lys Ile

20 25 30

Met Asp Glu Ala Ala Ser Asn Gly Ala Gln Leu Ile Ala Phe Pro Glu

35 40 45

Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Phe Trp Ala Trp Met Gly Asp Gln Lys

50 55 60

Trp Gly Leu Lys Phe Leu Leu Lys Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu

65 70 75 80

Gly Asp Glu Arg Met Arg Arg Leu Gln Val Ala Ala Arg Arg Asn Asn

85 90 95

Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Asp Ala Gly Ser Arg Tyr

100 105 110

Ile Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu His Gly Gln Ile Val Ala Asn Arg

115 120 125

Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Ser Val Phe Gly Glu Gly

130 135 140

Asn Gly Ser Asp Ile Leu Thr His Asp Phe Ser Phe Gly Arg Val Gly

145 150 155 160

Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Met Gln Pro Leu Thr Lys Tyr Val Met

165 170 175

Phe Ser Leu Asp Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Pro Met Ser

180 185 190

Val Phe Gln Pro Asp Ile Val Gln Leu Ser Val Glu Ala Asn Ala Thr

195 200 205

Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Val Phe Val Val Gly Ala

210 215 220

Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Val Glu Val Phe Cys Asp Thr Glu

225 230 235 240

Glu Arg Gln Ala Met Leu Pro Leu Gly Gly Gly Trp Ala Arg Met Tyr

245 250 255

Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Gln Asp Ala Glu

260 265 270

Gly Ile Leu Tyr Ala Asp Ile Asp Leu Ser His Ile Leu Tyr Ala Lys

275 280 285

Ala Ala Ala Asp Pro Thr Gly His Tyr Ala Arg Ala Asp Val Leu Ser

290 295 300

Leu Asn Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val Arg Tyr Val Gly Ala

305 310 315 320

Asp Gly Arg Ser Glu Ile Glu Ala Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg

325 330 335

Leu Lys Gln Leu Ser Glu Gln His Arg Val Asn Glu Leu Ser Ala Val

340 345 350

Gly Gln Ile Gly Ser Ile Pro Ile Thr Arg Glu His Val Pro Met Leu

355 360 365

Ala Ala Val Pro Val Ile Gly Ala Glu Gly Arg

370 375

<210> 2

<211> 1137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggttagct acaccagcac cttcaaagcg gccgcggttc aagccgaacc agtttggctg 60

gatgcggacg cgaccatcga aaaggcgatc aagatcatgg acgaagcggc cagcaatggc 120

gcccagctga ttgccttccc ggaagttttc atcccgggct acccgttctg ggcgtggatg 180

ggcgatcaga aatggggtct gaagtttctg ctgaagtacc acgaaaacag tctggaactg 240

ggtgatgaac gcatgcgtcg tctgcaagtt gcggcgcgtc gcaacaacat cgccctcgtg 300

atgggttaca gcgaacgtga tgccggcagt cgctacatca gtcaagtttt catcgacgag 360

cacggccaga tcgtggcgaa tcgtcgcaaa ctcaaaccga cccacgtgga acgcagcgtg 420

ttcggcgaag gcaatggcag cgacattctg acccacgatt tcagcttcgg ccgcgttggt 480

ggtctgaatt gctgggaaca catgcagccg ctgacgaagt acgtgatgtt cagtctggac 540

gaacaagttc atgtggccag ctggccgccg atgagcgttt tccagccgga tatcgtgcag 600

ctgagcgtgg aagccaacgc caccgttacc cgtagctacg cgatcgaagg ccaagttttc 660

gtggtgggtg cgacccaagt tatcggtccg agcgcggtgg aagtgttctg cgataccgaa 720

gaacgccaag ccatgctgcc actgggtggt ggttgggccc gcatgtatgg cccagatggc 780

agtgaactgg cgaaaccgct ggcccaagat gcggaaggta ttctgtacgc cgatatcgat 840

ctgagccaca ttctctacgc gaaagccgcc gccgatccaa cgggtcatta cgcgcgcgcc 900

gatgtgctga gtctgaactt cgacccacgc aatcacaccc cagtgcgcta tgttggtgcg 960

gatggtcgca gtgagatcga agcccgtagc cgcgttgaaa atttccgtct gaagcagctg 1020

agcgaacagc atcgcgtgaa tgaactcagt gcggttggtc agatcggtag catcccgatc 1080

acccgcgaac atgttccgat gctggcggcc gttccagtta tcggcgccga aggtcgc 1137

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶作为腈水解酶的应用，所述蛋白酶作用的最适反应温度为55-60℃，所述蛋白酶作用的pH范围为pH5.0-pH9.0。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白酶作用的最适反应温度为60℃。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白酶作用的最适pH为8.0。

4.一种消除饲料中腈化物毒性的方法，其特征在于，所述方法包括使用氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶水解饲料中腈化物的步骤，所述蛋白酶在55-60℃、pH5.0-pH9.0的条件下水解饲料中腈化物。

5.根据权利要求4所述的消除饲料中腈化物毒性的方法，其特征在于，所述蛋白酶在60℃、pH8.0的条件下水解饲料中腈化物。

6.根据权利要求4所述的消除饲料中腈化物毒性的方法，其特征在于，所述饲料为菜籽粕。