CN108359628A - 利用乙酸和丙酸生产聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

利用乙酸和丙酸生产聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利用乙酸和丙酸生产PHA的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明所提供的制备用于生产PHA的工程菌的方法，包括如下步骤：提高受体菌中乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、聚羟基脂肪酸酯合成酶、β‑酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶、琥珀酸半缩醛脱氢酶、4‑羟基丁酸脱氢酶、4‑羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶、丙酰辅酶A转移酶的表达和/或活性，且降低所述受体菌中非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的表达和/或活性，从而获得所述用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌；所述受体菌为能够以乙酸作为碳源生长的菌。本发明制备的工程菌以乙酸为碳源生产PHA，且PHA产量达到较高的水平，具有较好的工业化应用前景。本发明具有重大的应用价值。

Description

利用乙酸和丙酸生产聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌及其构建 方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术、基因工程和发酵工程领域，具体涉及利用乙酸和丙酸生产聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
基于农业与种植业的可再生生物质资源，包括葡萄糖、木糖、淀粉和纤维素等，是发酵工业中微生物普遍利用的碳源和能源物质。2014年，我国生物发酵行业主要产品的总产量为2420万吨(我国生物发酵产业发展现状及发展趋势，工业微生物，2015，45：62-66)，生产过程中消耗了大量的淀粉等农副产品，存在“与人争粮、与粮争地”的难题。随着粮食短缺和农产品价格的上涨，原料问题逐渐成为制约生物发酵产业健康发展的重要因素，迫切需要开发新的微生物能够利用的大宗生物质资源。一些非传统碳源，例如甲醇、乙酸和合成气等，逐渐成为工业生物技术领域中的研究热点。
乙酸又名醋酸，是一种简单的二碳羧酸。工业制备乙酸的方法包括乙醛氧化法、液态烃液相氧化法、甲醇羰基合成法等。近年来，合成气直接制乙酸工艺等新技术也在开发之中。目前，乙酸市场存在产能严重过剩、市场持续低迷的困境。如果能开发市场前景广阔的下游产品，延伸产业链，将能推动乙酸产业可持续发展。
大肠杆菌、产油酵母、梭菌和盐单胞菌等可以利用乙酸作为碳源生长。产油酵母可以利用乙酸废液作为主要碳源积累油脂。虽然乙酸是一种臭名昭著的细胞生长抑制剂，但代谢工程改造的大肠杆菌已经被用来转化乙酸获得脂肪酸
(EngineeringEscherichiacolitoconvertaceticacidtofreefattyacids.Biochem.Eng.J.76，60–69)和琥珀酸
(ProductionofsuccinatefromacetatebymetabolicallyengineeredEscherichiacoli.ACS.Synth.Biol.5，1299–1307)。
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类广泛存在于微生物细胞内的高分子化合物，一般作为碳源和能量的贮藏物质，在微生物生长代谢不平衡的条件下，由葡萄糖或者脂肪酸等合成。迄今为止，一些PHA产品已经进行了商业化的试生产，包括聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)、3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯(P3HB4HB)和3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚酯(PHBV)等。PHA具有与石油来源的塑料类似的材料学性质，可以作为包装材料和组织工程材料，但其较高的生产成本是限制PHA大规模工业化生产和应用的主要因素。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用乙酸生产聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌。
本发明所提供的制备用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌的方法，可包括如下步骤：提高受体菌中乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、聚羟基脂肪酸酯合成酶、β-酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶、琥珀酸半缩醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶、丙酰辅酶A转移酶的表达和/或活性，且降低所述受体菌中非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的表达和/或活性，从而获得所述用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌；所述受体菌为能够以乙酸作为碳源生长的菌。
所述乙酸激酶，可为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列8所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有乙酸激酶活性的蛋白质。
所述磷酸转乙酰酶，可为如下b1)或b2)或b3)：
b1)氨基酸序列是序列表中序列9所示的蛋白质；
b2)在序列表中序列9所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有磷酸转乙酰酶活性的蛋白质。
所述聚羟基脂肪酸酯合成酶，可为如下c1)或c2)或c3)：
c1)氨基酸序列是序列表中序列10所示的蛋白质；
c2)在序列表中序列10所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c3)将c1)或c2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有聚羟基脂肪酸酯合成酶活性的蛋白质。
所述β-酮硫解酶，可为如下d1)或d2)或d3)：
d1)氨基酸序列是序列表中序列11所示的蛋白质；
d2)在序列表中序列11所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
d3)将d1)或d2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有β-酮硫解酶活性的蛋白质。
所述乙酰乙酰辅酶A还原酶，可为如下e1)或e2)或e3)：
e1)氨基酸序列是序列表中序列12所示的蛋白质；
e2)在序列表中序列12所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
e3)将e1)或e2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有乙酰乙酰辅酶A还原酶活性的蛋白质。
所述琥珀酸半缩醛脱氢酶，可为如下f1)或f2)或f3)：
f1)氨基酸序列是序列表中序列13所示的蛋白质；
f2)在序列表中序列13所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
f3)将f1)或f2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有琥珀酸半缩醛脱氢酶活性的蛋白质。
所述4-羟基丁酸脱氢酶，可为如下g1)或g2)或g3)：
g1)氨基酸序列是序列表中序列14所示的蛋白质；
g2)在序列表中序列14所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
g3)将g1)或g2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有4-羟基丁酸脱氢酶活性的蛋白质。
所述4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶，可为如下h1)或h2)或h3)：
h1)氨基酸序列是序列表中序列15所示的蛋白质；
h2)在序列表中序列15所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
h3)将h1)或h2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶活性的蛋白质。
所述丙酰辅酶A转移酶，可为如下i1)或i2)或i3)：
i1)氨基酸序列是序列表中序列16所示的蛋白质；
i2)在序列表中序列16所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
i3)将i1)或i2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有丙酰辅酶A转移酶活性的蛋白质。
所述非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶可为如下j1)或j2)或j3)：
j1)氨基酸序列是序列表中序列17和/或序列19所示的蛋白质；
j2)在序列表中序列17和/或序列19所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
j3)将j1)或j2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶活性的蛋白质。
上述方法中，所述“提高受体菌中乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、聚羟基脂肪酸酯合成酶、β-酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶、琥珀酸半缩醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶、丙酰辅酶A转移酶的表达和/或活性”具体是通过向所述受体菌中导入乙酸激酶的编码基因(ackA基因)、磷酸转乙酰酶的编码基因(pta基因)、聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因(phaC基因)、β-酮硫解酶的编码基因(phaA基因)、乙酰乙酰辅酶A还原酶的编码基因(phaB基因)、琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sucD基因)、4-羟基丁酸脱氢酶的编码基因(4hbD基因)、4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶的编码基因(orfZ基因)和丙酰辅酶A转移酶的编码基因(pct基因)来实现的。所述“降低所述受体菌中非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的表达和/或活性”是通过敲除所述受体菌中非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sad基因和gabD基因)来实现的。
所述乙酸激酶的编码基因(ackA基因)可为如下A1)或A2)或A3)或A4)所示的DNA分子：A1)编码区是序列表中序列1自5’末端起第70-1272位所示的DNA分子；A2)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第70-1272位所示的DNA分子；A3)与A1)或A2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述乙酸激酶的DNA分子；A4)在严格条件下与A1)或A2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述乙酸激酶的DNA分子。
所述磷酸转乙酰酶的编码基因(pta基因)可为如下B1)或B2)或B3)或B4)所示的DNA分子：B1)编码区是序列表中序列1自5’末端起第1347-3491位所示的DNA分子；B2)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第1347-3491位所示的DNA分子；B3)与B1)或B2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述磷酸转乙酰酶的DNA分子；B4)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述磷酸转乙酰酶的DNA分子。
所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因(phaC基因)可为如下C1)或C2)或C3)或C4)所示的DNA分子：C1)编码区是序列表中序列2自5’末端起第70-1839位所示的DNA分子；C2)核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第70-1839位所示的DNA分子；C3)与C1)或C2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的DNA分子；C4)在严格条件下与C1)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的DNA分子。
所述β-酮硫解酶的编码基因(phaA基因)可为如下D1)或D2)或D3)或D4)所示的DNA分子：D1)编码区是序列表中序列2自5’末端起第1924-3105位所示的DNA分子；D2)核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第1924-3105位所示的DNA分子；D3)与D1)或D2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述β-酮硫解酶的DNA分子；D4)在严格条件下与D1)或D2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述β-酮硫解酶的DNA分子。
所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的编码基因(phaB基因)为如下E1)或E2)或E3)或E4)所示的DNA分子：E1)编码区是序列表中序列2自5’末端起第3180-3920位所示的DNA分子；E2)核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第3180-3920位所示的DNA分子；E3)与E1)或E2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的DNA分子；E4)在严格条件下与E1)或E2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的DNA分子。
所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sucD基因)可为如下F1)或F2)或F3)或F4)所示的DNA分子：F1)编码区是序列表中序列3自5’末端起第70-1431位所示的DNA分子；F2)核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第70-1431位所示的DNA分子；F3)与F1)或F2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的DNA分子；F4)在严格条件下与F1)或F2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的DNA分子。
所述4-羟基丁酸脱氢酶的编码基因(4hbD基因)可为如下G1)或G2)或G3)或G4)所示的DNA分子：G1)编码区是序列表中序列3自5’末端起第1468-2583位所示的DNA分子；G2)核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第1468-2583位所示的DNA分子；G3)与G1)或G2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述4-羟基丁酸脱氢酶的DNA分子；G4)在严格条件下与G1)或G2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述4-羟基丁酸脱氢酶的DNA分子。
所述4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶的编码基因(orfZ基因)可为如下H1)或H2)或H3)或H4)所示的DNA分子：H1)编码区是序列表中序列4自5’末端起第70-1359位所示的DNA分子；H2)核苷酸序列是序列表中序列4自5’末端起第70-1359位所示的DNA分子；H3)与H1)或H2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶的DNA分子；H4)在严格条件下与H1)或H2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶的DNA分子。
所述丙酰辅酶A转移酶的编码基因(pct基因)可为如下I1)或I2)或I3)或I4)所示的DNA分子：I1)编码区是序列表中序列5自5’末端起第70-1623位所示的DNA分子；I2)核苷酸序列是序列表中序列5自5’末端起第70-1623位所示的DNA分子；I3)与I1)或I2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述丙酰辅酶A转移酶的DNA分子；I4)在严格条件下与I1)或I2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述丙酰辅酶A转移酶的DNA分子。
所述非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sad基因和/或gabD基因)可为如下J1)或J2)或J3)或J4)所示的DNA分子：J1)编码区是序列表中序列18和/或序列20所示的DNA分子；J2)核苷酸序列是序列表中序列18和/或序列20所示的DNA分子；J3)与J1)或J2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的DNA分子；J4)在严格条件下与J1)或J2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的DNA分子。
sad基因的核苷酸序列如序列表中序列18所示，编码序列表中序列17所示的蛋白质。gabD基因的核苷酸序列如序列表中序列20所示，编码序列表中序列19所示的蛋白质。
上述方法中，所述乙酸激酶的编码基因(ackA基因)和磷酸转乙酰酶的编码基因(pta基因)是通过序列表中序列1所示的DNA分子导入所述受体菌中的。所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因(phaC基因)、所述β-酮硫解酶的编码基因(phaA基因)和所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的编码基因(phaB基因)是通过序列表中序列2所示的DNA分子导入所述受体菌中的。所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sucD基因)和所述4-羟基丁酸脱氢酶的编码基因(4hbD基因)是通过序列表中序列3所示的DNA分子导入所述受体菌中的。所述4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶的编码基因(orfZ基因)是通过序列表中序列4所示的DNA分子导入所述受体菌中的。所述丙酰辅酶A转移酶的编码基因(pct基因)是通过序列表中序列5所示的DNA分子导入所述受体菌中的。
上述方法中，所述非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sad基因和gabD基因)是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列6和序列7。
更加具体的，在本发明中，所述乙酸激酶的编码基因(ackA基因)、所述磷酸转乙酰酶的编码基因(pta基因)、所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(sucD基因)和所述4-羟基丁酸脱氢酶的编码基因(4hbD基因)是通过重组表达载体1导入到所述受体菌中的；所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因(phaC基因)、所述β-酮硫解酶的编码基因(phaA基因)、所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的编码基因(phaB基因)和所述4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶的编码基因(orfZ基因)是通过重组表达载体2导入到所述受体菌中的；所述丙酰辅酶A转移酶的编码基因(pct基因)是通过重组表达载体3导入到所述受体菌中的。所述重组表达载体1为将质粒pBBR1MCS-2的EcoRI识别序列和XbaI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第9至3491位所示的DNA分子，XbaI识别序列和SacI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第9至2583位所示的DNA分子。所述重组表达载体2为将质粒pUC19的HindIII识别序列和BamHI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第9至3920位所示的DNA分子，BamHI识别序列和EcoRI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列4自5’末端起第9至1359位所示的DNA分子。所述重组表达载体3为将质粒pUC19的HindIII识别序列和BamHI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第9至3920位所示的DNA分子，BamHI识别序列和EcoRI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列5自5’末端起第9至1623位所示的DNA分子。
上述方法中，所述受体菌可为大肠杆菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌E.coliJM109。
由上述任一所述的方法制备得到的用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌也属于本发明的保护范围。
上述任一所述用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌在生产聚羟基脂肪酸酯中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述生产聚羟基脂肪酸酯(如P3HB、P3HB4HB)以乙酸作为底物。
上述应用中，所述生产聚羟基脂肪酸酯(如PHBV)以乙酸和丙酸作为底物。
本发明还保护一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法，包括如下步骤：以乙酸作为碳源，发酵培养所述工程菌，收集发酵产物，从中获得聚羟基脂肪酸酯。
上述方法中，根据生产聚羟基脂肪酸酯的种类(如PHBV)，还可以在发酵体系中同时加入丙酸作为底物。
其中，所述发酵培养的条件可为：37℃摇瓶震荡培养24-72h(如48h)。摇瓶的转速具体可为200rpm。所采用的培养基可为MMYE液体培养基。
所述MMYE液体培养基的组成可如下：每升培养基含6g乙酸、2gNH4Cl、5.0g(NH4)2SO4、6.0gKH2PO4、8.214gMOPS、0.5gNaCl、1mL微量元素溶液、0.1g氨苄青霉素、0.05g卡那霉素和10g酵母粉，余量为水。所述微量元素溶液的组成可如下：每升微量元素溶液含3.6gFeCl2·4H2O、5gCaCl2·2H2O、1.3gMnCl2·2H2O、0.38gCuCl2·2H2O、0.5gCoCl2·6H2O、0.94gZnCl2、0.0311gH3BO3、0.4gNa2EDTA·2H2O、1.01gthiamine-HCl，其余为0.5MHCl。
上述任一所述聚羟基脂肪酸酯具体可为P3HB、P3HB4HB或PHBV。
本发明通过在大肠杆菌中表达9个代谢途径相关的基因和敲除2个内源基因，获得以乙酸为主要碳源生产PHA的工程菌(中PHBV的合成还需要添加丙酸作为辅助碳源)，并且该工程菌生产PHA的产量达到较高的水平，具有较好的工业化应用前景。本发明提供了一种将乙酸转变为高附加值生物可降解材料(即PHA)的方法，对拓展乙酸应用和降低PHA的发酵成本具有重要意义。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中涉及分子生物学操作所用的酶，均购于NEB(NewEnglandBiolabs，http://www.neb-china.com/)公司；质粒提取和DNA片段回收所用的试剂盒购自北京博迈德生物技术公司；E.coliJM109为宝生物工程(大连)有限公司的产品；实施例中涉及的DNA合成和测序工作由北京博迈德生物技术公司完成。质粒pUC19为NEB(NewEnglandBiolabs)公司的产品，货号N3041S。
质粒pKD13、质粒pKD46和质粒pCP20公众均可以从E.coliGeneticResourcesatYaleCGSC，TheColiGeneticStockCenter(http://cgsc2.biology.yale.edu/)获得，编号依次为CGSC#7633、CGSC#7739和CGSC#7637。
质粒pBBR1MCS-2：公众可根据NCBIaccessionnumberU23751.1的序列自行提交基因合成公司获得，该质粒记载在如下文献中：
Fournewderivativesofthebroad-host-rangecloningvectorpBBR1MCS，
carryingdifferentantibiotic-resistancecassettes，1995，Gene，166:175-176。
MMYE液体培养基的组成如下：每升培养基含6g乙酸、2gNH4Cl、5.0g(NH4)2SO4、6.0gKH2PO4、8.214gMOPS、0.5gNaCl、1mL微量元素溶液、0.1g氨苄青霉素、0.05g卡那霉素和10g酵母粉，余量为水。其中，微量元素溶液的组成如下：每升微量元素溶液含3.6gFeCl2·4H2O、5gCaCl2·2H2O、1.3gMnCl2·2H2O、0.38gCuCl2·2H2O、0.5gCoCl2·6H2O、0.94gZnCl2、0.0311gH3BO3、0.4gNa2EDTA·2H2O、1.01gthiamine-HCl，其余为0.5MHCl。
实施例1、重组菌E.coliJM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)的构建
一、重组质粒pMCS-pta-ackA的构建
1、人工合成序列表中序列1所示的DNA，含有pta-ackA表达盒，上游为EcoRI位点，下游为XbaI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1272位核苷酸为ackA基因序列，第1347-3491位核苷酸为pta基因序列。
2、用EcoRI和XbaI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小为3489bp的DNA片段；用EcoRI和XbaI双酶切质粒pBBR1MCS-2，回收大小为5114bp的DNA片段；将上述3489bp和5114bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli JM109中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用EcoRI和XbaI进行酶切验证，酶切产物大小为3489bp和5114bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pMCS-pta-ackA或pMCS-pta-ackA。将重组质粒pMCS-pta-ackA进行测序。根据测序结果，对重组质粒pMCS-pta-ackA进行结构描述如下：将质粒pBBR1MCS-2的EcoRI识别序列和XbaI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第9至3491位所示的DNA分子。
重组质粒pMCS-pta-ackA表达序列表的序列8所示的乙酸激酶(由ackA基因编码)和序列表的序列9所示的磷酸转乙酰酶(由pta基因编码)。
二、重组质粒pUC19-phaCAB的构建
1、人工合成序列表中序列2所示的DNA，含有phaCAB表达盒，上游为HindIII位点，下游为BamHI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1839位核苷酸为phaC基因序列，第1924-3105位核苷酸为phaA基因序列，第3180-3920位核苷酸为phaB基因序列。
2、用HindIII和BamHI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小为3918bp的DNA片段；用HindIII和BamHI双酶切质粒pUC19，回收大小为2656bp的DNA片段；将上述3918bp和2656bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coliJM109中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用HindIII和BamHI进行酶切验证，酶切产物大小为3918bp和2656bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pUC19-phaCAB或pUC19-phaCAB。将重组质粒pUC19-phaCAB进行测序。根据测序结果，对重组质粒pUC19-phaCAB进行结构描述如下：将质粒pUC19的HindIII识别序列和BamHI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第9至3920位所示的DNA分子。
重组质粒pUC19-phaCAB表达序列表的序列10所示的聚羟基脂肪酸酯合成酶合成酶(由phaC基因编码)、序列表的序列11所示的β-酮硫解酶(由phaA基因编码)和序列表的序列12所示的乙酰乙酰辅酶A还原酶(由phaB基因编码)。
三、重组菌E.coliJM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)的构建
1、将上述一得到的重组质粒pMCS-pta-ackA和上述二得到的重组质粒pUC19-phaCAB通过化学转化的方法转化到大肠杆菌E.coliJM109，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有两个重组质粒的重组菌E.coliJM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)。
E.coliJM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)为将pta基因、ackA基因、phaC基因、phaB基因和phaA基因转入大肠杆菌E.coliJM109中得到的重组菌。
四、对照菌株E.coliJM109(pUC19-phaCAB+pBBR1MCS-2)的构建
1、将质粒pBBR1MCS-2和上述二得到的重组质粒pUC19-phaCAB通过化学转化的方法转化到大肠杆菌E.coliJM109，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有两个质粒的重组菌E.coliJM109(pUC19-phaCAB+pBBR1MCS-2)。
E.coliJM109(pUC19-phaCAB+pBBR1MCS-2)为将phaC基因、phaB基因和phaA基因转入大肠杆菌E.coliJM109中得到的重组菌。
实施例2、重组菌E.coliJM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-pta-ackA-sucD-4hbD)的构建
一、重组质粒pMCS-pta-ackA-sucD-4hbD的构建
1、人工合成序列表中序列3所示的DNA，含有sucD-4hbD表达盒，上游为XbaI位点，下游为SacI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1431位核苷酸为sucD基因序列，第1468-2583位核苷酸为4hbD基因序列。
2、用XbaI和SacI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小为2585bp的DNA片段；用XbaI和SacI双酶切质粒pBBR1MCS-2，回收大小为5116bp的DNA片段；将上述2585bp和5116bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coliJM109中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用XbaI和SacI进行酶切验证，酶切产物大小为2585bp和5116bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pMCS-sucD-4hbD。将重组质粒pMCS-sucD-4hbD进行测序。根据测序结果，对重组质粒pMCS-sucD-4hbD进行结构描述如下：将质粒pBBR1MCS-2的XbaI识别序列和SacI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第9至2583位所示的DNA分子。
重组质粒pMCS-sucD-4hbD表达序列表的序列13所示的琥珀酸半缩醛脱氢酶(由sucD基因编码)和序列表的序列14所示的4-羟基丁酸脱氢酶(由4hbD基因编码)。
3、用XbaI和SacI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小为2585bp的DNA片段；用XbaI和SacI双酶切重组质粒pMCS-pta-ackA，回收大小为8575bp的DNA片段；将上述2585bp和8575bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coliJM109中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用XbaI和SacI进行酶切验证，酶切产物大小为2585bp和8575bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pMCS-pta-ackA-sucD-4hbD。将重组质粒pMCS-pta-ackA-sucD-4hbD进行测序。根据测序结果，对重组质粒pMCS-pta-ackA-sucD-4hbD进行结构描述如下：将重组质粒pMCS-pta-ackA的XbaI识别序列和SacI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第9至2583位所示的DNA分子。重组质粒pMCS-pta-ackA-sucD-4hbD表达序列表的序列8所示的乙酸激酶(由ackA基因编码)、序列表的序列9所示的磷酸转乙酰酶(由pta基因编码)、序列表的序列13所示的琥珀酸半缩醛脱氢酶(由sucD基因编码)和序列表的序列14所示的4-羟基丁酸脱氢酶(由4hbD基因编码)。
二、重组质粒pUC19-phaCAB-orfZ的构建
1、人工合成序列表中序列4所示的DNA，含有orfZ表达盒，上游为BamHI位点，下游为EcoRI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1359位核苷酸为orfZ基因序列。
2、用BamHI和EcoRI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小为1357bp的DNA片段；用BamHI和EcoRI双酶切重组质粒pUC19-phaCAB，回收大小为6553bp的DNA片段；将上述1357bp和6553bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coliJM109中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用BamHI和EcoRI进行酶切验证，酶切产物大小为1357bp和6553bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pUC19-phaCAB-orfZ。将重组质粒pUC19-phaCAB-orfZ进行测序。根据测序结果，对重组质粒pUC19-phaCAB-orfZ进行结构描述如下：将重组质粒pUC19-phaCAB的BamHI识别序列和EcoRI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列4自5’末端起第9至1359位所示的DNA分子。
重组质粒pUC19-phaCAB-orfZ表达序列表的序列15所示的4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶(由orfZ基因编码)。
三、大肠杆菌E.coli JM109SG的构建
1、敲除sad基因
1)合成sad基因敲除所用的引物sadF和引物sadR。
引物sadF(从5’到3’)：
ATGACCATTACTCCGGCAACTCATGCAATTTCGATAAATCCTGCCACGGGTGAACAACTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG引物sadR(从5’到3’)：
TCTTTTCCCCGCCCAGTAACAAACGCGCACCCTGCGCCAGGGTTTTCTCCACCTGATGATATTCCGGGGATCCGTCGACC。
2)以质粒pKD13为模板，采用引物sadF和引物sadR，PCR扩增得到1500bp左右的DNA片段，命名为sad同源重组片段，琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化。
经过测序，sad同源重组片段的核苷酸序列为序列6，其中，第1-60位为sad基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为sad基因下游同源臂。
3)利用电转化的方法将质粒pKD46转化至受体菌株E.coli JM109中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，30℃培养24h，得到转化子，提质粒验证，获得E.coli JM109(pKD46)。
4)将E.coli JM109(pKD46)接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃培养1h，加入阿拉伯糖至终浓度5g/L，继续培养1.5h，接下来制备E.coli JM109(pKD46)的感受态细胞，将步骤2)中获得的DNA片段转入E.coli JM109(pKD46)的感受态细胞中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h，得到转化子。
5)利用菌落PCR的方法，以引物sadF和引物sadR为引物，将PCR产物纯化之后测序，筛选正确的sad基因已经被替换为Kan抗性基因的克隆，得到E.coli JM109sad-K(pKD46)。
6)将E.coli JM109sad-K(pKD46)接种于LB液体培养基中，42℃培养传代三次，除去质粒pKD46，得到E.coli JM109sad-K；E.coli JM109sad-K是sad基因被Kan基因替换了的E.coli JM109。
7)将E.coli JM109sad-K接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养24h，转接到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h，制备E.coli JM109sad-K感受态细胞。
8)利用电转化的方法将质粒pCP20转化到E.coli JM109sad-K感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，30℃培养48h，得到转化子。
利用菌落PCR的方法验证转化子，以引物sadF引物和sadR为引物，得到202bp片段的为阳性克隆。
将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli JM109基因组上的sad基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去质粒pCP20，命名为突变体E.coliJM109S。
2、敲除gabD基因
与上述1的方法基本相同，不同的是如下：
gabD敲除引物为引物gabDF和引物gabDR。
引物gabDF(从5’到3’)：
ATGAAACTTAACGACAGTAACTTATTCCGCCAGCAGGCGTTGATTAACGGGGAATGGCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG；引物gabDR(从5’到3’)：
TGCTCTTCCACTTTTGCTACCGCTTTTTCATCGATCAGCGGCCCGATGGTGACGCCGTTAATTCCGGGGATCCGTCGACC。
gabD同源重组片段的核苷酸序列为序列7，其中，第1-60位为gabD基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为gabD基因下游同源臂。
转化受体菌株为上述1得到的突变体E.coli JM109S。
利用菌落PCR的方法验证转化子，以引物gabDF和引物gabDR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。
将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli JM109S基因组上的gabD基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去质粒pCP20,命名为突变体E.coliJM109SG。突变体E.coliJM109SG敲除了非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因(即sad基因和gabD基因)。
四、重组菌E.coli JM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-pta-ackA-4hbD-sucD)的构建
1、将上述一得到的重组质粒pMCS-pta-ackA-sucD-4hbD和上述二得到的重组质粒pUC19-phaCAB-orfZ通过电转化的方法转化到大肠杆菌E.coli JM109SG，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有两个质粒的重组菌E.coliJM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-pta-ackA-4hbD-sucD)。
E.coli JM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-pta-ackA-4hbD-sucD)为将pta基因、ackA基因、phaC基因、phaB基因、phaA基因、orfZ基因、4hbD基因和sucD基因转入大肠杆菌E.coli JM109SG中得到的重组菌。
五、对照菌株E.coli JM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-4hbD-sucD)的构建
1、将上述一得到的重组质粒pMCS-4hbD-sucD和上述二得到的重组质粒pUC19-phaCAB-orfZ通过电转的方法转化到大肠杆菌E.coli JM109SG，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有质粒的重组菌E.coliJM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-4hbD-sucD)。
E.coli JM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-4hbD-sucD)为将phaC基因、phaB基因、phaA基因、orfZ基因、4hbD基因和sucD基因转入大肠杆菌E.coli JM109SG中得到的重组菌。
实施例3、重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct+pMCS-pta-ackA)的构建
一、重组质粒pUC19-phaCAB-pct的构建
1、人工合成序列表中序列5所示的DNA，含有pct表达盒，上游为BamHI位点，下游为EcoRI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1623位核苷酸为pct基因序列。
2、用BamHI和EcoRI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小为1621bp的DNA片段；用BamHI和EcoRI双酶切重组质粒pUC19-phaCAB，回收大小为6553bp的DNA片段；将上述1621bp和6553bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coliJM109中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用BamHI和EcoRI进行酶切验证，酶切产物大小为1621bp和6553bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pUC19-phaCAB-pct。将重组质粒pUC19-phaCAB-pct进行测序。根据测序结果，对重组质粒pUC19-phaCAB-pct进行结构描述如下：将重组质粒pUC19-phaCAB的BamHI识别序列和EcoRI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列5自5’末端起第9至1623位所示的DNA分子。
重组质粒pUC19-phaCAB-pct表达序列表的序列16所示的丙酰辅酶A转移酶(由pct基因编码)。
二、重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct+pMCS-pta-ackA)的构建
1、将实施例1中一构建的重组质粒pMCS-pta-ackA和上述二得到的重组质粒pUC19-phaCAB-pct通过化学转化的方法转化到大肠杆菌E.coli JM109，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有两个质粒的重组菌E.coliJM109(pUC19-phaCAB-pct+pMCS-pta-ackA)。
E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct+pMCS-pta-ackA)为将pta基因、ackA基因、phaC基因、phaB基因、phaA基因和pct基因转入大肠杆菌E.coli JM109中得到的重组菌。
三、对照菌株E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct)的构建
1、把上述二得到的重组质粒pUC19-phaCAB-pct通过化学转化的方法转化到大肠杆菌E.coli JM109，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有一个质粒的重组菌E.coliJM109(pUC19-phaCAB-pct)。
E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct)为将phaC基因、phaB基因、phaA基因和pct基因转入大肠杆菌E.coli JM109中得到的重组菌。
四、对照菌株E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)的构建
如实施例1中三所述。
实施例4、重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)在生产P3HB中的应用
一、重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)摇瓶培养生产P3HB
1、将实施例1中三构建的重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。
2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到MMYE液体培养基中，500mL摇瓶中装液量为50mL，于37℃、转速200rpm条件下培养48h，收集菌体，冷冻干燥，酯化。
3、通过气相色谱对基因工程菌产生的P3HB进行定量检测。具体条件如下：
使用福立公司GC-9790II型气相色谱仪，色谱柱为DB-5毛细管柱，非极性。用氮气作为载气，氢气作为燃气，空气为助燃气。进样量为1μL。进样口：温度为200℃，使用分流模式，分流比为30。检测器：温度为220℃，氢气流量40mL/min，空气流量400mL/min。升温程序如下：第一步，温度80℃，维持时间为2min；第二步，温度变化由80℃到140℃，升温速率30℃/min，然后维持0.5min；第三步，温度变化由140℃到220℃，升温速率40℃/min，然后维持3min。
重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)在摇瓶培养中获得的细胞干重为3.02g/L，其中P3HB含量为42.02％，P3HB产量为1.27g/L。结果表明，该重组菌具有较好的将乙酸转化为P3HB的能力。
二、对照菌株E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pBBR1MCS-2)摇瓶培养生产P3HB
按照一的方法，将“重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)”替换为实施例1中四构建的重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pBBR1MCS-2)，其它步骤均不变。
重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pBBR1MCS-2)在摇瓶培养中获得的细胞干重为2.22g/L，其中P3HB含量为13.80％，P3HB产量为0.31g/L。
上述结果表明，pta基因和ackA基因的表达能够明显提高在乙酸为碳源时P3HB的产量，由0.31g/L提高到1.27g/L。由此可见，含有pta基因和ackA基因的重组菌在乙酸为碳源合成P3HB时具有明显的优势。
三、重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)在无乙酸条件下的摇瓶培养
按照一的方法，将MMYE液体培养基替换为不含乙酸的MMYE培养基(与MMYE液体培养基的区别仅在于组分中不含有乙酸)，其它步骤均不变。
结果如下：重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pBBR1MCS-2)在摇瓶培养中获得的细胞干重为1.15g/L，其中P3HB含量为3.23％，P3HB产量为0.04g/L。结果表明，虽然重组菌能够在不含乙酸的MMYE培养基中生长，但P3HB的产量很低。由此可见，在不添加乙酸的条件下，重组菌能够在培养基中生长，但酵母粉等所含的碳源不足以支撑有效的P3HB合成。上述一中所积累的P3HB主要由乙酸产生，乙酸是该培养条件下用于合成P3HB的主要碳源。
实施例5、E.coli JM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-pta-ackA-4hbD-sucD)在生产P3HB4HB中的应用
一、重组菌E.coli JM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-pta-ackA-4hbD-sucD)摇瓶培养生产P3HB4HB
1、将实施例2中四构建的重组菌E.coli JM109SG
(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-pta-ackA-4hbD-sucD)在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。
2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到MMYE液体培养基中，500mL摇瓶中装液量为50mL，于37℃、转速200rpm条件下培养48h，收集菌体，冷冻干燥，酯化。
3、通过气相色谱对基因工程菌产生的P3HB4HB进行定量检测。
重组菌E.coli JM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-pta-ackA-4hbD-sucD)在摇瓶培养中获得的细胞干重为2.96g/L，其中P3HB4HB含量为58.00％，P3HB4HB产量为1.71g/L，4HB单体含量为5.79mol％。结果表明，该重组菌具有较好的将乙酸转化为P3HB4HB的能力。
二、对照菌株E.coli JM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-4hbD-sucD)摇瓶培养生产P3HB4HB
按照一的方法，将“重组菌E.coli JM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-pta-ackA-4hbD-sucD)”替换为实施例2中五构建的重组菌E.coli JM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-4hbD-sucD)，其它步骤均不变。
重组菌E.coli JM109SG(pUC19-phaCAB-orfZ+pMCS-4hbD-sucD)在摇瓶培养中获得的细胞干重为2.37g/L，其中P3HB4HB含量为35.79％，P3HB4HB产量为0.85g/L，4HB单体含量为9.48mol％。
上述结果表明，pta基因和ackA基因的表达能够明显提高在乙酸为碳源时P3HB4HB的产量，由0.85g/L提高到1.71g/L。由此可见，含有pta基因和ackA基因的重组菌在乙酸为碳源合成P3HB4HB时具有明显的优势。
实施例6、E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct+pMCS-pta-ackA)在生产PHBV中的应用
一、重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct+pMCS-pta-ackA)摇瓶培养生产PHBV
1、将实施例3中二构建的重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct+pMCS-pta-ackA)在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。
2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到MMYE液体培养基中，500mL摇瓶中装液量为50mL，于37℃、转速200rpm条件下培养6h；然后加入丙酸并使丙酸在体系中的浓度为1.5g/L，继续培养42h，收集菌体，冷冻干燥，酯化。
3、通过气相色谱对基因工程菌产生的PHBV进行定量检测。
重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct+pMCS-pta-ackA)在摇瓶培养中获得的细胞干重为2.42g/L，其中PHBV含量为13.43％，PHBV产量为0.33g/L，3HV单体含量为13.71mol％。结果表明，该重组菌具有较好的将乙酸和丙酸转化为PHBV的能力。
二、对照菌株E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct)摇瓶培养生产PHBV
按照一的方法，将“重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct+pMCS-pta-ackA)”替换为实施例3中三构建的重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct)，其它步骤均不变。
重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct)在摇瓶培养中获得的细胞干重为2.21g/L，其中PHBV含量为9.43％，PHBV产量为0.19g/L，3HV单体含量为10.11mol％。
根据一和二的结果，pta基因和ackA基因的表达能够明显提高在乙酸和丙酸为碳源时PHBV的产量，由0.19g/L提高到0.33g/L。由此可见，含有pta基因和ackA基因的重组菌在乙酸和丙酸为碳源合成PHBV时具有明显的优势。
三、对照菌株E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)摇瓶培养生产PHBV
按照一的方法，将“重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB-pct+pMCS-pta-ackA)”替换为实施例3中四构建的重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)，其它步骤均不变。
重组菌E.coli JM109(pUC19-phaCAB+pMCS-pta-ackA)在摇瓶培养中获得的细胞干重为2.40g/L，其中PHBV含量为39.37％，PHBV产量为0.959g/L，3HV单体含量仅为2.43mol％。
根据一和三的结果，pct基因的表达能够明显提高在乙酸和丙酸为碳源时PHBV中3HV单体的含量，其丙酰辅酶A转移酶活性有助于提供更多的丙酰辅酶A前体，用于3HV的聚合。
<110> 北京化工大学
<120> 利用乙酸和丙酸生产聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌及其构建方法和应用
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>
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aagaattctt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60
aaatatacca tgtcgagtaa gttagtactg gttctgaact gcggtagttc ttcactgaaa 120
tttgccatca tcgatgcagt aaatggtgaa gagtaccttt ctggtttagc cgaatgtttc 180
cacctgcccg aagcacgtat caaatggaaa atggacggca ataaacagga agcggcttta 240
ggtgcaggcg ccgctcacag cgaagcgctc aactttatcg ttaatactat tctggcacaa 300
aaaccagaac tgtctgcgca gctgactgct atcggtcacc gtatcgtaca cggcggcgaa 360
aagtatacca gctccgtagt gatcgatgag tctgttattc agggtatcaa agatgcagct 420
tcttttgcac cgctgcacaa cccggctcac ctgatcggta tcgaagaagc tctgaaatct 480
ttcccacagc tgaaagacaa aaacgttgct gtatttgaca ccgcgttcca ccagactatg 540
ccggaagagt cttacctcta cgccctgcct tacaacctgt acaaagagca cggcatccgt 600
cgttacggcg cgcacggcac cagccacttc tatgtaaccc aggaagcggc aaaaatgctg 660
aacaaaccgg tagaagaact gaacatcatc acctgccacc tgggcaacgg tggttccgtt 720
tctgctatcc gcaacggtaa atgcgttgac acctctatgg gcctgacccc gctggaaggt 780
ctggtcatgg gtacccgttc tggtgatatc gatccggcga tcatcttcca cctgcacgac 840
accctgggca tgagcgttga cgcaatcaac aaactgctga ccaaagagtc tggcctgctg 900
ggtctgaccg aagtgaccag cgactgccgc tatgttgaag acaactacgc gacgaaagaa 960
gacgcgaagc gcgcaatgga cgtttactgc caccgcctgg cgaaatacat cggtgcctac 1020
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catgaacgca acctggctgc acgtttcggc aaatctggtt tcatcaacaa agaaggtacc 1200
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ctgactgcct gatttcacac cgccagctca gctggcggtg ctgttttgta acccgccaaa 1320
tcggcggtaa cgaaagagga taaaccatgt cccgtattat tatgctgatc cctaccggaa 1380
ccagcgtcgg tctgaccagc gtcagccttg gcgtgatccg tgcaatggaa cgcaaaggcg 1440
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tcgaactgac ccgcaacagc ttcggcggtg ccaaaaacac caacatcacc ggcgttatcg 1860
ttaacaaact gaacgcaccg gttgatgaac agggtcgtac tcgcccggat ctgtccgaga 1920
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aagtttagat caactttatt taaagatgga aaaataaaca gcaagattat aggtaaatcc 960
gtccaaatta ttgcggatct tgcaggagta aaagtaccag aaggtactaa ggttatagta 1020
cttaagggta aaggtgcagg agaaaaagat gtactttgta aagaaaaaat gtgtccagtt 1080
ttagtagcat tgaaatatga tacttttgaa gaagcagttg aaatagctat ggctaattat 1140
atgtatgaag gagctggtca tacagcaggc atacattctg acaatgacga gaacataaga 1200
tatgcaggaa ctgtattacc tataagcaga ttagttgtaa atcagcctgc aactactgct 1260
ggaggaagtt tcaataatgg atttaaccct actactacac taggctgcgg atcatggggc 1320
agaaacagta tttcagaaaa tcttacttac gagcatctta taaatgtttc aagaataggg 1380
tatttcaata aagaagcaaa agttcctagc tatgaggaaa tatggggata agtcctgtta 1440
ttaaaaagta tataaggagg aaaaaatatg aagttattaa aattggcacc tgatgtttat 1500
aaatttgata ctgcagagga gtttatgaaa tactttaagg ttggaaaagg tgactttata 1560
cttactaatg aatttttata taaacctttc cttgagaaat tcaatgatgg tgcagatgct 1620
gtatttcagg agaaatatgg actcggtgaa ccttctgatg aaatgataaa caatataatt 1680
aaggatattg gagataaaca atataataga attattgctg tagggggagg atctgtaata 1740
gatatagcca aaatcctcag tcttaagtat actgatgatt cattggattt gtttgaggga 1800
aaagtacctc ttgtaaaaaa caaagaatta attatagttc caactacatg tggaacaggt 1860
tcagaagtta caaatgtatc agttgcagaa ttaaagagaa gacatactaa aaaaggaatt 1920
gcttcagacg aattatatgc aacttatgca gtacttgtac cagaatttat aaaaggactt 1980
ccatataagt tttttgtaac cagctccgta gatgccttaa tacatgcaac agaagcttat 2040
gtatctccaa atgcaaatcc ttatactgat atgtttagtg taaaagctat ggagttaatt 2100
ttaaatggat acatgcaaat ggtagagaaa ggaaatgatt acagagttga aataattgag 2160
gattttgtta taggcagcaa ttatgcaggt atagcttttg gaaatgcagg agtgggagcg 2220
gttcacgcac tctcatatcc aataggcgga aattatcatg tgcctcatgg agaagcaaat 2280
tatctgtttt ttacagaaat atttaaaact tattatgaga aaaatccaaa tggcaagatt 2340
aaagatgtaa ataaactatt agcaggcata ctaaaatgtg atgaaagtga agcttatgac 2400
agtttatcac aacttttaga taaattattg tcaagaaaac cattaagaga atatggaatg 2460
aaagaggaag aaattgaaac ttttgctgat tcagtaatag aaggacagca gagactgttg 2520
gtaaacaatt atgaaccttt ttcaagagaa gacatagtaa acacatataa aaagttatat 2580
taagagctca a 2591
<210> 4
<211> 1367
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
aaggatcctt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60
aaatatacca tggagtggga agagatatat aaagagaaac tggtaactgc agaaaaagct 120
gtttcaaaaa tagaaaacca tagcagggta gtttttgcac atgcagtagg agaacccgta 180
gatttagtaa atgcactagt taaaaataag gataattata taggactaga aatagttcac 240
atggtagcta tgggcaaagg tgaatataca aaagagggta tgcaaagaca ttttagacat 300
aatgctttat ttgtaggcgg atgtactaga gatgcagtaa attcaggaag agcagattat 360
acaccttgtt ttttctatga agtgccaagt ttgtttaaag aaaaacgttt gcctgtagat 420
gtagcactta ttcaggtaag tgagccagat aaatatggct actgcagttt tggagtttcc 480
aatgactata ccaagccagc agcagaaagt gctaagcttg taattgcaga agtgaataaa 540
aacatgccaa gaactcttgg agattctttt atacatgtat cagatattga ttatatagtg 600
gaagcttcac acccattgtt agaattgcag cctcctaaat tgggagatgt agaaaaagcc 660
ataggagaaa actgtgcatc tttaattgaa gatggagcta ctcttcagct tggaataggt 720
gctataccag atgcggtact tttattctta aagaacaaaa agaatttagg aatacattct 780
gagatgatat cagatggtgt gatggaactg gtgaaggcag gggttatcaa taacaagaaa 840
aagaccctcc atccaggcaa aatagttgta acatttttaa tgggaacaaa aaaattatat 900
gattttgtaa acaataatcc aatggtagaa acttattctg tagattatgt aaataatcca 960
ctggtaatta tgaaaaatga caatatggtt tcaataaatt cttgtgttca agtagactta 1020
atgggacaag tatgttctga aagtatagga ttgaaacaga taagtggagt gggaggccag 1080
gtagatttta ttagaggagc taatctatca aagggtggaa aggctattat agctatacct 1140
tccacagctg gaaaaggaaa agtttcaaga ataactccac ttctagatac tggtgctgca 1200
gttacaactt ctagaaatga agtagattat gtagttactg aatatggtgt tgctcatctt 1260
aagggcaaaa ctttaagaaa tagggcaaga gctctaataa atatcgctca tccaaaattc 1320
agagaatcat taatgaatga atttaaaaag agattttagg aatccaa 1367
<210> 5
<211> 1631
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
aaggatcctt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60
aaatatacca tgagaaaagt agaaatcatt acagctgaac aagcagctca gctcgtaaaa 120
gacaacgaca cgattacgtc tatcggcttt gtcagcagcg cccatccgga agcactgacc 180
aaagctttgg aaaaacggtt cctggacacg aacaccccgc agaacttgac ctacatctat 240
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ttggcaggtc ataagctcgg cgtcttcacc gacatcggtc tggaaacttt cctcgatccc 480
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gtcgatggtc atgaacagct tttctacccg accttcccgg tcaacgtagc tttcctccgc 600
ggtacgtatg ctgatgaatc cggcaatatc accatggacg aagaaatcgg gcctttcgaa 660
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taagaatcca a 1631
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<211> 1424
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
atgaccatta ctccggcaac tcatgcaatt tcgataaatc ctgccacggg tgaacaactt 60
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<211> 1424
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<223>
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<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
Met Ser Ser Lys Leu Val Leu Val Leu Asn Cys Gly Ser Ser Ser Leu
1 5 10 15
Lys Phe Ala Ile Ile Asp Ala Val Asn Gly Glu Glu Tyr Leu Ser Gly
20 25 30
Leu Ala Glu Cys Phe His Leu Pro Glu Ala Arg Ile Lys Trp Lys Met
35 40 45
Asp Gly Asn Lys Gln Glu Ala Ala Leu Gly Ala Gly Ala Ala His Ser
50 55 60
Glu Ala Leu Asn Phe Ile Val Asn Thr Ile Leu Ala Gln Lys Pro Glu
65 70 75 80
Leu Ser Ala Gln Leu Thr Ala Ile Gly His Arg Ile Val His Gly Gly
85 90 95
Glu Lys Tyr Thr Ser Ser Val Val Ile Asp Glu Ser Val Ile Gln Gly
100 105 110
Ile Lys Asp Ala Ala Ser Phe Ala Pro Leu His Asn Pro Ala His Leu
115 120 125
Ile Gly Ile Glu Glu Ala Leu Lys Ser Phe Pro Gln Leu Lys Asp Lys
130 135 140
Asn Val Ala Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Met Pro Glu Glu
145 150 155 160
Ser Tyr Leu Tyr Ala Leu Pro Tyr Asn Leu Tyr Lys Glu His Gly Ile
165 170 175
Arg Arg Tyr Gly Ala His Gly Thr Ser His Phe Tyr Val Thr Gln Glu
180 185 190
Ala Ala Lys Met Leu Asn Lys Pro Val Glu Glu Leu Asn Ile Ile Thr
195 200 205
Cys His Leu Gly Asn Gly Gly Ser Val Ser Ala Ile Arg Asn Gly Lys
210 215 220
Cys Val Asp Thr Ser Met Gly Leu Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met
225 230 235 240
Gly Thr Arg Ser Gly Asp Ile Asp Pro Ala Ile Ile Phe His Leu His
245 250 255
Asp Thr Leu Gly Met Ser Val Asp Ala Ile Asn Lys Leu Leu Thr Lys
260 265 270
Glu Ser Gly Leu Leu Gly Leu Thr Glu Val Thr Ser Asp Cys Arg Tyr
275 280 285
Val Glu Asp Asn Tyr Ala Thr Lys Glu Asp Ala Lys Arg Ala Met Asp
290 295 300
Val Tyr Cys His Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Thr Ala Leu
305 310 315 320
Met Asp Gly Arg Leu Asp Ala Val Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Glu
325 330 335
Asn Ala Ala Met Val Arg Glu Leu Ser Leu Gly Lys Leu Gly Val Leu
340 345 350
Gly Phe Glu Val Asp His Glu Arg Asn Leu Ala Ala Arg Phe Gly Lys
355 360 365
Ser Gly Phe Ile Asn Lys Glu Gly Thr Arg Pro Ala Val Val Ile Pro
370 375 380
Thr Asn Glu Glu Leu Val Ile Ala Gln Asp Ala Ser Arg Leu Thr Ala
385 390 395 400
<210> 9
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
Met Ser Arg Ile Ile Met Leu Ile Pro Thr Gly Thr Ser Val Gly Leu
1 5 10 15
Thr Ser Val Ser Leu Gly Val Ile Arg Ala Met Glu Arg Lys Gly Val
20 25 30
Arg Leu Ser Val Phe Lys Pro Ile Ala Gln Pro Arg Thr Gly Gly Asp
35 40 45
Ala Pro Asp Gln Thr Thr Thr Ile Val Arg Ala Asn Ser Ser Thr Thr
50 55 60
Thr Ala Ala Glu Pro Leu Lys Met Ser Tyr Val Glu Gly Leu Leu Ser
65 70 75 80
Ser Asn Gln Lys Asp Val Leu Met Glu Glu Ile Val Ala Asn Tyr His
85 90 95
Ala Asn Thr Lys Asp Ala Glu Val Val Leu Val Glu Gly Leu Val Pro
100 105 110
Thr Arg Lys His Gln Phe Ala Gln Ser Leu Asn Tyr Glu Ile Ala Lys
115 120 125
Thr Leu Asn Ala Glu Ile Val Phe Val Met Ser Gln Gly Thr Asp Thr
130 135 140
Pro Glu Gln Leu Lys Glu Arg Ile Glu Leu Thr Arg Asn Ser Phe Gly
145 150 155 160
Gly Ala Lys Asn Thr Asn Ile Thr Gly Val Ile Val Asn Lys Leu Asn
165 170 175
Ala Pro Val Asp Glu Gln Gly Arg Thr Arg Pro Asp Leu Ser Glu Ile
180 185 190
Phe Asp Asp Ser Ser Lys Ala Lys Val Asn Asn Val Asp Pro Ala Lys
195 200 205
Leu Gln Glu Ser Ser Pro Leu Pro Val Leu Gly Ala Val Pro Trp Ser
210 215 220
Phe Asp Leu Ile Ala Thr Arg Ala Ile Asp Met Ala Arg His Leu Asn
225 230 235 240
Ala Thr Ile Ile Asn Glu Gly Asp Ile Asn Thr Arg Arg Val Lys Ser
245 250 255
Val Thr Phe Cys Ala Arg Ser Ile Pro His Met Leu Glu His Phe Arg
260 265 270
Ala Gly Ser Leu Leu Val Thr Ser Ala Asp Arg Pro Asp Val Leu Val
275 280 285
Ala Ala Cys Leu Ala Ala Met Asn Gly Val Glu Ile Gly Ala Leu Leu
290 295 300
Leu Thr Gly Gly Tyr Glu Met Asp Ala Arg Ile Ser Lys Leu Cys Glu
305 310 315 320
Arg Ala Phe Ala Thr Gly Leu Pro Val Phe Met Val Asn Thr Asn Thr
325 330 335
Trp Gln Thr Ser Leu Ser Leu Gln Ser Phe Asn Leu Glu Val Pro Val
340 345 350
Asp Asp His Glu Arg Ile Glu Lys Val Gln Glu Tyr Val Ala Asn Tyr
355 360 365
Ile Asn Ala Asp Trp Ile Glu Ser Leu Thr Ala Thr Ser Glu Arg Ser
370 375 380
Arg Arg Leu Ser Pro Pro Ala Phe Arg Tyr Gln Leu Thr Glu Leu Ala
385 390 395 400
Arg Lys Ala Gly Lys Arg Ile Val Leu Pro Glu Gly Asp Glu Pro Arg
405 410 415
Thr Val Lys Ala Ala Ala Ile Cys Ala Glu Arg Gly Ile Ala Thr Cys
420 425 430
Val Leu Leu Gly Asn Pro Ala Glu Ile Asn Arg Val Ala Ala Ser Gln
435 440 445
Gly Val Glu Leu Gly Ala Gly Ile Glu Ile Val Asp Pro Glu Val Val
450 455 460
Arg Glu Ser Tyr Val Gly Arg Leu Val Glu Leu Arg Lys Asn Lys Gly
465 470 475 480
Met Thr Glu Thr Val Ala Arg Glu Gln Leu Glu Asp Asn Val Val Leu
485 490 495
Gly Thr Leu Met Leu Glu Gln Asp Glu Val Asp Gly Leu Val Ser Gly
500 505 510
Ala Val His Thr Thr Ala Asn Thr Ile Arg Pro Pro Leu Gln Leu Ile
515 520 525
Lys Thr Ala Pro Gly Ser Ser Leu Val Ser Ser Val Phe Phe Met Leu
530 535 540
Leu Pro Glu Gln Val Tyr Val Tyr Gly Asp Cys Ala Ile Asn Pro Asp
545 550 555 560
Pro Thr Ala Glu Gln Leu Ala Glu Ile Ala Ile Gln Ser Ala Asp Ser
565 570 575
Ala Ala Ala Phe Gly Ile Glu Pro Arg Val Ala Met Leu Ser Tyr Ser
580 585 590
Thr Gly Thr Ser Gly Ala Gly Ser Asp Val Glu Lys Val Arg Glu Ala
595 600 605
Thr Arg Leu Ala Gln Glu Lys Arg Pro Asp Leu Met Ile Asp Gly Pro
610 615 620
Leu Gln Tyr Asp Ala Ala Val Met Ala Asp Val Ala Lys Ser Lys Ala
625 630 635 640
Pro Asn Ser Pro Val Ala Gly Arg Ala Thr Val Phe Ile Phe Pro Asp
645 650 655
Leu Asn Thr Gly Asn Thr Thr Tyr Lys Ala Val Gln Arg Ser Ala Asp
660 665 670
Leu Ile Ser Ile Gly Pro Met Leu Gln Gly Met Arg Lys Pro Val Asn
675 680 685
Asp Leu Ser Arg Gly Ala Leu Val Asp Asp Ile Val Tyr Thr Ile Ala
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Leu Thr Ala Ile Gln Ser Ala Gln Gln Gln
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
Met Ala Thr Gly Lys Gly Ala Ala Ala Ser Thr Gln Glu Gly Lys Ser
1 5 10 15
Gln Pro Phe Lys Val Thr Pro Gly Pro Phe Asp Pro Ala Thr Trp Leu
20 25 30
Glu Trp Ser Arg Gln Trp Gln Gly Thr Glu Gly Asn Gly His Ala Ala
35 40 45
Ala Ser Gly Ile Pro Gly Leu Asp Ala Leu Ala Gly Val Lys Ile Ala
50 55 60
Pro Ala Gln Leu Gly Asp Ile Gln Gln Arg Tyr Met Lys Asp Phe Ser
65 70 75 80
Ala Leu Trp Gln Ala Met Ala Glu Gly Lys Ala Glu Ala Thr Gly Pro
85 90 95
Leu His Asp Arg Arg Phe Ala Gly Asp Ala Trp Arg Thr Asn Leu Pro
100 105 110
Tyr Arg Phe Ala Ala Ala Phe Tyr Leu Leu Asn Ala Arg Ala Leu Thr
115 120 125
Glu Leu Ala Asp Ala Val Glu Ala Asp Ala Lys Thr Arg Gln Arg Ile
130 135 140
Arg Phe Ala Ile Ser Gln Trp Val Asp Ala Met Ser Pro Ala Asn Phe
145 150 155 160
Leu Ala Thr Asn Pro Glu Ala Gln Arg Leu Leu Ile Glu Ser Gly Gly
165 170 175
Glu Ser Leu Arg Ala Gly Val Arg Asn Met Met Glu Asp Leu Thr Arg
180 185 190
Gly Lys Ile Ser Gln Thr Asp Glu Ser Ala Phe Glu Val Gly Arg Asn
195 200 205
Val Ala Val Thr Glu Gly Ala Val Val Phe Glu Asn Glu Tyr Phe Gln
210 215 220
Leu Leu Gln Tyr Lys Pro Leu Thr Asp Lys Val His Ala Arg Pro Leu
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Leu Met Val Pro Pro Cys Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Leu Asp Leu Gln
245 250 255
Pro Glu Ser Ser Leu Val Arg His Val Val Glu Gln Gly His Thr Val
260 265 270
Phe Leu Val Ser Trp Arg Asn Pro Asp Ala Ser Met Ala Gly Ser Thr
275 280 285
Trp Asp Asp Tyr Ile Glu His Ala Ala Ile Arg Ala Ile Glu Val Ala
290 295 300
Arg Asp Ile Ser Gly Gln Asp Lys Ile Asn Val Leu Gly Phe Cys Val
305 310 315 320
Gly Gly Thr Ile Val Ser Thr Ala Leu Ala Val Leu Ala Ala Arg Gly
325 330 335
Glu His Pro Ala Ala Ser Val Thr Leu Leu Thr Thr Leu Leu Asp Phe
340 345 350
Ala Asp Thr Gly Ile Leu Asp Val Phe Val Asp Glu Gly His Val Gln
355 360 365
Leu Arg Glu Ala Thr Leu Gly Gly Gly Ala Gly Ala Pro Cys Ala Leu
370 375 380
Leu Arg Gly Leu Glu Leu Ala Asn Thr Phe Ser Phe Leu Arg Pro Asn
385 390 395 400
Asp Leu Val Trp Asn Tyr Val Val Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Asn Thr
405 410 415
Pro Val Pro Phe Asp Leu Leu Phe Trp Asn Gly Asp Ala Thr Asn Leu
420 425 430
Pro Gly Pro Trp Tyr Cys Trp Tyr Leu Arg His Thr Tyr Leu Gln Asn
435 440 445
Glu Leu Lys Val Pro Gly Lys Leu Thr Val Cys Gly Val Pro Val Asp
450 455 460
Leu Ala Ser Ile Asp Val Pro Thr Tyr Ile Tyr Gly Ser Arg Glu Asp
465 470 475 480
His Ile Val Pro Trp Thr Ala Ala Tyr Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ala
485 490 495
Asn Lys Leu Arg Phe Val Leu Gly Ala Ser Gly His Ile Ala Gly Val
500 505 510
Ile Asn Pro Pro Ala Lys Asn Lys Arg Ser His Trp Thr Asn Asp Ala
515 520 525
Leu Pro Glu Ser Pro Gln Gln Trp Leu Ala Gly Ala Ile Glu His His
530 535 540
Gly Ser Trp Trp Pro Asp Trp Thr Ala Trp Leu Ala Gly Gln Ala Gly
545 550 555 560
Ala Lys Arg Ala Ala Pro Ala Asn Tyr Gly Asn Ala Arg Tyr Arg Ala
565 570 575
Ile Glu Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Val Lys Ala Lys Ala
　 　 580 585
<210> 11
<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
Met Thr Asp Val Val Ile Val Ser Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Lys
1 5 10 15
Phe Gly Gly Ser Leu Ala Lys Ile Pro Ala Pro Glu Leu Gly Ala Val
20 25 30
Val Ile Lys Ala Ala Leu Glu Arg Ala Gly Val Lys Pro Glu Gln Val
35 40 45
Ser Glu Val Ile Met Gly Gln Val Leu Thr Ala Gly Ser Gly Gln Asn
50 55 60
Pro Ala Arg Gln Ala Ala Ile Lys Ala Gly Leu Pro Ala Met Val Pro
65 70 75 80
Ala Met Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Lys Ala Val Met
85 90 95
Leu Ala Ala Asn Ala Ile Met Ala Gly Asp Ala Glu Ile Val Val Ala
100 105 110
Gly Gly Gln Glu Asn Met Ser Ala Ala Pro His Val Leu Pro Gly Ser
115 120 125
Arg Asp Gly Phe Arg Met Gly Asp Ala Lys Leu Val Asp Thr Met Ile
130 135 140
Val Asp Gly Leu Trp Asp Val Tyr Asn Gln Tyr His Met Gly Ile Thr
145 150 155 160
Ala Glu Asn Val Ala Lys Glu Tyr Gly Ile Thr Arg Glu Ala Gln Asp
165 170 175
Glu Phe Ala Val Gly Ser Gln Asn Lys Ala Glu Ala Ala Gln Lys Ala
180 185 190
Gly Lys Phe Asp Glu Glu Ile Val Pro Val Leu Ile Pro Gln Arg Lys
195 200 205
Gly Asp Pro Val Ala Phe Lys Thr Asp Glu Phe Val Arg Gln Gly Ala
210 215 220
Thr Leu Asp Ser Met Ser Gly Leu Lys Pro Ala Phe Asp Lys Ala Gly
225 230 235 240
Thr Val Thr Ala Ala Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Gly Ala Ala Ala
245 250 255
Val Val Val Met Ser Ala Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Leu Thr Pro
260 265 270
Leu Ala Thr Ile Lys Ser Tyr Ala Asn Ala Gly Val Asp Pro Lys Val
275 280 285
Met Gly Met Gly Pro Val Pro Ala Ser Lys Arg Ala Leu Ser Arg Ala
290 295 300
Glu Trp Thr Pro Gln Asp Leu Asp Leu Met Glu Ile Asn Glu Ala Phe
305 310 315 320
Ala Ala Gln Ala Leu Ala Val His Gln Gln Met Gly Trp Asp Thr Ser
325 330 335
Lys Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Ile Gly His Pro Ile Gly
340 345 350
Ala Ser Gly Cys Arg Ile Leu Val Thr Leu Leu His Glu Met Lys Arg
355 360 365
Arg Asp Ala Lys Lys Gly Leu Ala Ser Leu Cys Ile Gly Gly Gly Met
370 375 380
Gly Val Ala Leu Ala Val Glu Arg Lys
385 390
<210> 12
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
Met Thr Gln Arg Ile Ala Tyr Val Thr Gly Gly Met Gly Gly Ile Gly
1 5 10 15
Thr Ala Ile Cys Gln Arg Leu Ala Lys Asp Gly Phe Arg Val Val Ala
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Asn Ser Pro Arg Arg Glu Lys Trp Leu Glu Gln Gln
35 40 45
Lys Ala Leu Gly Phe Asp Phe Ile Ala Ser Glu Gly Asn Val Ala Asp
50 55 60
Trp Asp Ser Thr Lys Thr Ala Phe Asp Lys Val Lys Ser Glu Val Gly
65 70 75 80
Glu Val Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Val Val
85 90 95
Phe Arg Lys Met Thr Arg Ala Asp Trp Asp Ala Val Ile Asp Thr Asn
100 105 110
Leu Thr Ser Leu Phe Asn Val Thr Lys Gln Val Ile Asp Gly Met Ala
115 120 125
Asp Arg Gly Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asn Gly Gln
130 135 140
Lys Gly Gln Phe Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Thr Ala Lys Ala Gly Leu
145 150 155 160
His Gly Phe Thr Met Ala Leu Ala Gln Glu Val Ala Thr Lys Gly Val
165 170 175
Thr Val Asn Thr Val Ser Pro Gly Tyr Ile Ala Thr Asp Met Val Lys
180 185 190
Ala Ile Arg Gln Asp Val Leu Asp Lys Ile Val Ala Thr Ile Pro Val
195 200 205
Lys Arg Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Ala Ser Ile Cys Ala Trp Leu
210 215 220
Ser Ser Glu Glu Ser Gly Phe Ser Thr Gly Ala Asp Phe Ser Leu Asn
225 230 235 240
Gly Gly Leu His Met Gly
245
<210> 13
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
Met Ser Asn Glu Val Ser Ile Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ala Lys Val
1 5 10 15
Ala Gln Lys Lys Leu Glu Ala Tyr Ser Gln Glu Gln Val Asp Val Leu
20 25 30
Val Lys Ala Leu Gly Lys Val Val Tyr Asp Asn Ala Glu Met Phe Ala
35 40 45
Lys Glu Ala Val Glu Glu Thr Glu Met Gly Val Tyr Glu Asp Lys Val
50 55 60
Ala Lys Cys His Leu Lys Ser Gly Ala Ile Trp Asn His Ile Lys Asp
65 70 75 80
Lys Lys Thr Val Gly Ile Ile Lys Glu Glu Pro Glu Arg Ala Leu Val
85 90 95
Tyr Val Ala Lys Pro Lys Gly Val Val Ala Ala Thr Thr Pro Ile Thr
100 105 110
Asn Pro Val Val Thr Pro Met Cys Asn Ala Met Ala Ala Ile Lys Gly
115 120 125
Arg Asn Thr Ile Ile Val Ala Pro His Pro Lys Ala Lys Lys Val Ser
130 135 140
Ala His Thr Val Glu Leu Met Asn Ala Glu Leu Lys Lys Leu Gly Ala
145 150 155 160
Pro Glu Asn Ile Ile Gln Ile Val Glu Ala Pro Ser Arg Glu Ala Ala
165 170 175
Lys Glu Leu Met Glu Ser Ala Asp Val Val Ile Ala Thr Gly Gly Ala
180 185 190
Gly Arg Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Arg Pro Ala Tyr Gly Val
195 200 205
Gly Pro Gly Asn Ser Gln Val Ile Val Asp Lys Gly Tyr Asp Tyr Asn
210 215 220
Lys Ala Ala Gln Asp Ile Ile Thr Gly Arg Lys Tyr Asp Asn Gly Ile
225 230 235 240
Ile Cys Ser Ser Glu Gln Ser Val Ile Ala Pro Ala Glu Asp Tyr Asp
245 250 255
Lys Val Ile Ala Ala Phe Val Glu Asn Gly Ala Phe Tyr Val Glu Asp
260 265 270
Glu Glu Thr Val Glu Lys Phe Arg Ser Thr Leu Phe Lys Asp Gly Lys
275 280 285
Ile Asn Ser Lys Ile Ile Gly Lys Ser Val Gln Ile Ile Ala Asp Leu
290 295 300
Ala Gly Val Lys Val Pro Glu Gly Thr Lys Val Ile Val Leu Lys Gly
305 310 315 320
Lys Gly Ala Gly Glu Lys Asp Val Leu Cys Lys Glu Lys Met Cys Pro
325 330 335
Val Leu Val Ala Leu Lys Tyr Asp Thr Phe Glu Glu Ala Val Glu Ile
340 345 350
Ala Met Ala Asn Tyr Met Tyr Glu Gly Ala Gly His Thr Ala Gly Ile
355 360 365
His Ser Asp Asn Asp Glu Asn Ile Arg Tyr Ala Gly Thr Val Leu Pro
370 375 380
Ile Ser Arg Leu Val Val Asn Gln Pro Ala Thr Thr Ala Gly Gly Ser
385 390 395 400
Phe Asn Asn Gly Phe Asn Pro Thr Thr Thr Leu Gly Cys Gly Ser Trp
405 410 415
Gly Arg Asn Ser Ile Ser Glu Asn Leu Thr Tyr Glu His Leu Ile Asn
420 425 430
Val Ser Arg Ile Gly Tyr Phe Asn Lys Glu Ala Lys Val Pro Ser Tyr
435 440 445
Glu Glu Ile Trp Gly
450
<210> 14
<211> 371
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
Met Lys Leu Leu Lys Leu Ala Pro Asp Val Tyr Lys Phe Asp Thr Ala
1 5 10 15
Glu Glu Phe Met Lys Tyr Phe Lys Val Gly Lys Gly Asp Phe Ile Leu
20 25 30
Thr Asn Glu Phe Leu Tyr Lys Pro Phe Leu Glu Lys Phe Asn Asp Gly
35 40 45
Ala Asp Ala Val Phe Gln Glu Lys Tyr Gly Leu Gly Glu Pro Ser Asp
50 55 60
Glu Met Ile Asn Asn Ile Ile Lys Asp Ile Gly Asp Lys Gln Tyr Asn
65 70 75 80
Arg Ile Ile Ala Val Gly Gly Gly Ser Val Ile Asp Ile Ala Lys Ile
85 90 95
Leu Ser Leu Lys Tyr Thr Asp Asp Ser Leu Asp Leu Phe Glu Gly Lys
100 105 110
Val Pro Leu Val Lys Asn Lys Glu Leu Ile Ile Val Pro Thr Thr Cys
115 120 125
Gly Thr Gly Ser Glu Val Thr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Lys Arg
130 135 140
Arg His Thr Lys Lys Gly Ile Ala Ser Asp Glu Leu Tyr Ala Thr Tyr
145 150 155 160
Ala Val Leu Val Pro Glu Phe Ile Lys Gly Leu Pro Tyr Lys Phe Phe
165 170 175
Val Thr Ser Ser Val Asp Ala Leu Ile His Ala Thr Glu Ala Tyr Val
180 185 190
Ser Pro Asn Ala Asn Pro Tyr Thr Asp Met Phe Ser Val Lys Ala Met
195 200 205
Glu Leu Ile Leu Asn Gly Tyr Met Gln Met Val Glu Lys Gly Asn Asp
210 215 220
Tyr Arg Val Glu Ile Ile Glu Asp Phe Val Ile Gly Ser Asn Tyr Ala
225 230 235 240
Gly Ile Ala Phe Gly Asn Ala Gly Val Gly Ala Val His Ala Leu Ser
245 250 255
Tyr Pro Ile Gly Gly Asn Tyr His Val Pro His Gly Glu Ala Asn Tyr
260 265 270
Leu Phe Phe Thr Glu Ile Phe Lys Thr Tyr Tyr Glu Lys Asn Pro Asn
275 280 285
Gly Lys Ile Lys Asp Val Asn Lys Leu Leu Ala Gly Ile Leu Lys Cys
290 295 300
Asp Glu Ser Glu Ala Tyr Asp Ser Leu Ser Gln Leu Leu Asp Lys Leu
305 310 315 320
Leu Ser Arg Lys Pro Leu Arg Glu Tyr Gly Met Lys Glu Glu Glu Ile
325 330 335
Glu Thr Phe Ala Asp Ser Val Ile Glu Gly Gln Gln Arg Leu Leu Val
340 345 350
Asn Asn Tyr Glu Pro Phe Ser Arg Glu Asp Ile Val Asn Thr Tyr Lys
355 360 365
Lys Leu Tyr
370
<210> 15
<211> 429
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
Met Glu Trp Glu Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Leu Val Thr Ala Glu Lys
1 5 10 15
Ala Val Ser Lys Ile Glu Asn His Ser Arg Val Val Phe Ala His Ala
20 25 30
Val Gly Glu Pro Val Asp Leu Val Asn Ala Leu Val Lys Asn Lys Asp
35 40 45
Asn Tyr Ile Gly Leu Glu Ile Val His Met Val Ala Met Gly Lys Gly
50 55 60
Glu Tyr Thr Lys Glu Gly Met Gln Arg His Phe Arg His Asn Ala Leu
65 70 75 80
Phe Val Gly Gly Cys Thr Arg Asp Ala Val Asn Ser Gly Arg Ala Asp
85 90 95
Tyr Thr Pro Cys Phe Phe Tyr Glu Val Pro Ser Leu Phe Lys Glu Lys
100 105 110
Arg Leu Pro Val Asp Val Ala Leu Ile Gln Val Ser Glu Pro Asp Lys
115 120 125
Tyr Gly Tyr Cys Ser Phe Gly Val Ser Asn Asp Tyr Thr Lys Pro Ala
130 135 140
Ala Glu Ser Ala Lys Leu Val Ile Ala Glu Val Asn Lys Asn Met Pro
145 150 155 160
Arg Thr Leu Gly Asp Ser Phe Ile His Val Ser Asp Ile Asp Tyr Ile
165 170 175
Val Glu Ala Ser His Pro Leu Leu Glu Leu Gln Pro Pro Lys Leu Gly
180 185 190
Asp Val Glu Lys Ala Ile Gly Glu Asn Cys Ala Ser Leu Ile Glu Asp
195 200 205
Gly Ala Thr Leu Gln Leu Gly Ile Gly Ala Ile Pro Asp Ala Val Leu
210 215 220
Leu Phe Leu Lys Asn Lys Lys Asn Leu Gly Ile His Ser Glu Met Ile
225 230 235 240
Ser Asp Gly Val Met Glu Leu Val Lys Ala Gly Val Ile Asn Asn Lys
245 250 255
Lys Lys Thr Leu His Pro Gly Lys Ile Val Val Thr Phe Leu Met Gly
260 265 270
Thr Lys Lys Leu Tyr Asp Phe Val Asn Asn Asn Pro Met Val Glu Thr
275 280 285
Tyr Ser Val Asp Tyr Val Asn Asn Pro Leu Val Ile Met Lys Asn Asp
290 295 300
Asn Met Val Ser Ile Asn Ser Cys Val Gln Val Asp Leu Met Gly Gln
305 310 315 320
Val Cys Ser Glu Ser Ile Gly Leu Lys Gln Ile Ser Gly Val Gly Gly
325 330 335
Gln Val Asp Phe Ile Arg Gly Ala Asn Leu Ser Lys Gly Gly Lys Ala
340 345 350
Ile Ile Ala Ile Pro Ser Thr Ala Gly Lys Gly Lys Val Ser Arg Ile
355 360 365
Thr Pro Leu Leu Asp Thr Gly Ala Ala Val Thr Thr Ser Arg Asn Glu
370 375 380
Val Asp Tyr Val Val Thr Glu Tyr Gly Val Ala His Leu Lys Gly Lys
385 390 395 400
Thr Leu Arg Asn Arg Ala Arg Ala Leu Ile Asn Ile Ala His Pro Lys
405 410 415
Phe Arg Glu Ser Leu Met Asn Glu Phe Lys Lys Arg Phe
420 425
<210> 16
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 16
Met Arg Lys Val Glu Ile Ile Thr Ala Glu Gln Ala Ala Gln Leu Val
1 5 10 15
Lys Asp Asn Asp Thr Ile Thr Ser Ile Gly Phe Val Ser Ser Ala His
20 25 30
Pro Glu Ala Leu Thr Lys Ala Leu Glu Lys Arg Phe Leu Asp Thr Asn
35 40 45
Thr Pro Gln Asn Leu Thr Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gln Gly Lys Arg
50 55 60
Asp Gly Arg Ala Ala Glu His Leu Ala His Thr Gly Leu Leu Lys Arg
65 70 75 80
Ala Ile Ile Gly His Trp Gln Thr Val Pro Ala Ile Gly Lys Leu Ala
85 90 95
Val Glu Asn Lys Ile Glu Ala Tyr Asn Phe Ser Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
His Trp Phe Arg Ala Leu Ala Gly His Lys Leu Gly Val Phe Thr Asp
115 120 125
Ile Gly Leu Glu Thr Phe Leu Asp Pro Arg Gln Leu Gly Gly Lys Leu
130 135 140
Asn Asp Val Thr Lys Glu Asp Leu Val Lys Leu Ile Glu Val Asp Gly
145 150 155 160
His Glu Gln Leu Phe Tyr Pro Thr Phe Pro Val Asn Val Ala Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Thr Tyr Ala Asp Glu Ser Gly Asn Ile Thr Met Asp Glu Glu
180 185 190
Ile Gly Pro Phe Glu Ser Thr Ser Val Ala Gln Ala Val His Asn Cys
195 200 205
Gly Gly Lys Val Val Val Gln Val Lys Asp Val Val Ala His Gly Ser
210 215 220
Leu Asp Pro Arg Met Val Lys Ile Pro Gly Ile Tyr Val Asp Tyr Val
225 230 235 240
Val Val Ala Ala Pro Glu Asp His Gln Gln Thr Tyr Asp Cys Glu Tyr
245 250 255
Asp Pro Ser Leu Ser Gly Glu His Arg Ala Pro Glu Gly Ala Thr Asp
260 265 270
Ala Ala Leu Pro Met Ser Ala Lys Lys Ile Ile Gly Arg Arg Gly Ala
275 280 285
Leu Glu Leu Thr Glu Asn Ala Val Val Asn Leu Gly Val Gly Ala Pro
290 295 300
Glu Tyr Val Ala Ser Val Ala Gly Glu Glu Gly Ile Ala Asp Thr Ile
305 310 315 320
Thr Leu Thr Val Glu Gly Gly Ala Ile Gly Gly Val Pro Gln Gly Gly
325 330 335
Ala Arg Phe Gly Ser Ser Arg Asn Ala Asp Ala Ile Ile Asp His Thr
340 345 350
Tyr Gln Phe Asp Phe Tyr Asp Gly Gly Gly Leu Asp Ile Ala Tyr Leu
355 360 365
Gly Leu Ala Gln Cys Asp Gly Ser Gly Asn Ile Asn Val Ser Lys Phe
370 375 380
Gly Thr Asn Val Ala Gly Cys Gly Gly Phe Pro Asn Ile Ser Gln Gln
385 390 395 400
Thr Pro Asn Val Tyr Phe Cys Gly Thr Phe Thr Ala Gly Gly Leu Lys
405 410 415
Ile Ala Val Glu Asp Gly Lys Val Lys Ile Leu Gln Glu Gly Lys Ala
420 425 430
Lys Lys Phe Ile Lys Ala Val Asp Gln Ile Thr Phe Asn Gly Ser Tyr
435 440 445
Ala Ala Arg Asn Gly Lys His Val Leu Tyr Ile Thr Glu Arg Cys Val
450 455 460
Phe Glu Leu Thr Lys Glu Gly Leu Lys Leu Ile Glu Val Ala Pro Gly
465 470 475 480
Ile Asp Ile Glu Lys Asp Ile Leu Ala His Met Asp Phe Lys Pro Ile
485 490 495
Ile Asp Asn Pro Lys Leu Met Asp Ala Arg Leu Phe Gln Asp Gly Pro
500 505 510
Met Gly Leu Lys Lys
515
<210> 17
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
Met Thr Ile Thr Pro Ala Thr His Ala Ile Ser Ile Asn Pro Ala Thr
1 5 10 15
Gly Glu Gln Leu Ser Val Leu Pro Trp Ala Gly Ala Asp Asp Ile Glu
20 25 30
Asn Ala Leu Gln Leu Ala Ala Ala Gly Phe Arg Asp Trp Arg Glu Thr
35 40 45
Asn Ile Asp Tyr Arg Ala Glu Lys Leu Arg Asp Ile Gly Lys Ala Leu
50 55 60
Arg Ala Arg Ser Glu Glu Met Ala Gln Met Ile Thr Arg Glu Met Gly
65 70 75 80
Lys Pro Ile Asn Gln Ala Arg Ala Glu Val Ala Lys Ser Ala Asn Leu
85 90 95
Cys Asp Trp Tyr Ala Glu His Gly Pro Ala Met Leu Lys Ala Glu Pro
100 105 110
Thr Leu Val Glu Asn Gln Gln Ala Val Ile Glu Tyr Arg Pro Leu Gly
115 120 125
Thr Ile Leu Ala Ile Met Pro Trp Asn Phe Pro Leu Trp Gln Val Met
130 135 140
Arg Gly Ala Val Pro Ile Ile Leu Ala Gly Asn Gly Tyr Leu Leu Lys
145 150 155 160
His Ala Pro Asn Val Met Gly Cys Ala Gln Leu Ile Ala Gln Val Phe
165 170 175
Lys Asp Ala Gly Ile Pro Gln Gly Val Tyr Gly Trp Leu Asn Ala Asp
180 185 190
Asn Asp Gly Val Ser Gln Met Ile Lys Asp Ser Arg Ile Ala Ala Val
195 200 205
Thr Val Thr Gly Ser Val Arg Ala Gly Ala Ala Ile Gly Ala Gln Ala
210 215 220
Gly Ala Ala Leu Lys Lys Cys Val Leu Glu Leu Gly Gly Ser Asp Pro
225 230 235 240
Phe Ile Val Leu Asn Asp Ala Asp Leu Glu Leu Ala Val Lys Ala Ala
245 250 255
Val Ala Gly Arg Tyr Gln Asn Thr Gly Gln Val Cys Ala Ala Ala Lys
260 265 270
Arg Phe Ile Ile Glu Glu Gly Ile Ala Ser Ala Phe Thr Glu Arg Phe
275 280 285
Val Ala Ala Ala Ala Ala Leu Lys Met Gly Asp Pro Arg Asp Glu Glu
290 295 300
Asn Ala Leu Gly Pro Met Ala Arg Phe Asp Leu Arg Asp Glu Leu His
305 310 315 320
His Gln Val Glu Lys Thr Leu Ala Gln Gly Ala Arg Leu Leu Leu Gly
325 330 335
Gly Glu Lys Met Ala Gly Ala Gly Asn Tyr Tyr Pro Pro Thr Val Leu
340 345 350
Ala Asn Val Thr Pro Glu Met Thr Ala Phe Arg Glu Glu Met Phe Gly
355 360 365
Pro Val Ala Ala Ile Thr Ile Ala Lys Asp Ala Glu His Ala Leu Glu
370 375 380
Leu Ala Asn Asp Ser Glu Phe Gly Leu Ser Ala Thr Ile Phe Thr Thr
385 390 395 400
Asp Glu Thr Gln Ala Arg Gln Met Ala Ala Arg Leu Glu Cys Gly Gly
405 410 415
Val Phe Ile Asn Gly Tyr Cys Ala Ser Asp Ala Arg Val Ala Phe Gly
420 425 430
Gly Val Lys Lys Ser Gly Phe Gly Arg Glu Leu Ser His Phe Gly Leu
435 440 445
His Glu Phe Cys Asn Ile Gln Thr Val Trp Lys Asp Arg Ile
　 450 455 460
<210> 18
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18
atgaccatta ctccggcaac tcatgcaatt tcgataaatc ctgccacggg tgaacaactt 60
tctgtgctgc cgtgggctgg cgctgacgat atcgaaaacg cacttcagct ggcggcagca 120
ggctttcgcg actggcgcga gacaaatata gattatcgtg ctgaaaaact gcgtgatatc 180
ggtaaggctc tgcgcgctcg tagcgaagaa atggcgcaaa tgatcacccg cgaaatgggc 240
aaaccaatca accaggcgcg cgctgaagtg gcgaaatcgg cgaatttgtg tgactggtat 300
gcagaacatg gtccggcaat gctgaaggcg gaacctacgc tggtggaaaa tcagcaggcg 360
gttattgagt atcgaccgtt ggggacgatt ctggcgatta tgccgtggaa ttttccgtta 420
tggcaggtga tgcgtggcgc tgttcccatc attcttgcag gtaacggcta cttacttaaa 480
catgcgccga atgtgatggg ctgtgcacag ctcattgccc aggtgtttaa agatgcgggt 540
atcccacaag gcgtatatgg ctggctgaat gccgacaacg acggtgtcag tcagatgatt 600
aaagactcgc gcattgctgc tgtcacggtg accggaagtg ttcgtgcggg agcggctatt 660
ggcgcacagg ctggagcggc actgaaaaaa tgcgtactgg aactgggcgg ttcggatccg 720
tttattgtgc ttaacgatgc cgatctggaa ctggcggtga aagcggcggt agccggacgt 780
tatcagaata ccggacaggt atgtgcagcg gcaaaacgct ttattatcga agagggaatt 840
gcttcggcat ttaccgaacg ttttgtggca gctgcggcag ccttgaaaat gggcgatccc 900
cgtgacgaag agaacgctct cggaccaatg gctcgttttg atttacgtga tgagctgcat 960
catcaggtgg agaaaaccct ggcgcagggt gcgcgtttgt tactgggcgg ggaaaagatg 1020
gctggggcag gtaactacta tccgccaacg gttctggcga atgttacccc agaaatgacc 1080
gcgtttcggg aagaaatgtt tggccccgtt gcggcaatca ccattgcgaa agatgcagaa 1140
catgcactgg aactggctaa tgatagtgag ttcggccttt cagcgaccat ttttaccact 1200
gacgaaacac aggccagaca gatggcggca cgtctggaat gcggtggggt gtttatcaat 1260
ggttattgtg ccagcgacgc gcgagtggcc tttggtggcg tgaaaaagag tggctttggt 1320
cgtgagcttt cccatttcgg cttacacgaa ttctgtaata tccagacggt gtggaaagac 1380
cggatctga 1389
<210> 19
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 19
Met Lys Leu Asn Asp Ser Asn Leu Phe Arg Gln Gln Ala Leu Ile Asn
1 5 10 15
Gly Glu Trp Leu Asp Ala Asn Asn Gly Glu Ala Ile Asp Val Thr Asn
20 25 30
Pro Ala Asn Gly Asp Lys Leu Gly Ser Val Pro Lys Met Gly Ala Asp
35 40 45
Glu Thr Arg Ala Ala Ile Asp Ala Ala Asn Arg Ala Leu Pro Ala Trp
50 55 60
Arg Ala Leu Thr Ala Lys Glu Arg Ala Thr Ile Leu Arg Asn Trp Phe
65 70 75 80
Asn Leu Met Met Glu His Gln Asp Asp Leu Ala Arg Leu Met Thr Leu
85 90 95
Glu Gln Gly Lys Pro Leu Ala Glu Ala Lys Gly Glu Ile Ser Tyr Ala
100 105 110
Ala Ser Phe Ile Glu Trp Phe Ala Glu Glu Gly Lys Arg Ile Tyr Gly
115 120 125
Asp Thr Ile Pro Gly His Gln Ala Asp Lys Arg Leu Ile Val Ile Lys
130 135 140
Gln Pro Ile Gly Val Thr Ala Ala Ile Thr Pro Trp Asn Phe Pro Ala
145 150 155 160
Ala Met Ile Thr Arg Lys Ala Gly Pro Ala Leu Ala Ala Gly Cys Thr
165 170 175
Met Val Leu Lys Pro Ala Ser Gln Thr Pro Phe Ser Ala Leu Ala Leu
180 185 190
Ala Glu Leu Ala Ile Arg Ala Gly Val Pro Ala Gly Val Phe Asn Val
195 200 205
Val Thr Gly Ser Ala Gly Ala Val Gly Asn Glu Leu Thr Ser Asn Pro
210 215 220
Leu Val Arg Lys Leu Ser Phe Thr Gly Ser Thr Glu Ile Gly Arg Gln
225 230 235 240
Leu Met Glu Gln Cys Ala Lys Asp Ile Lys Lys Val Ser Leu Glu Leu
245 250 255
Gly Gly Asn Ala Pro Phe Ile Val Phe Asp Asp Ala Asp Leu Asp Lys
260 265 270
Ala Val Glu Gly Ala Leu Ala Ser Lys Phe Arg Asn Ala Gly Gln Thr
275 280 285
Cys Val Cys Ala Asn Arg Leu Tyr Val Gln Asp Gly Val Tyr Asp Arg
290 295 300
Phe Ala Glu Lys Leu Gln Gln Ala Val Ser Lys Leu His Ile Gly Asp
305 310 315 320
Gly Leu Asp Asn Gly Val Thr Ile Gly Pro Leu Ile Asp Glu Lys Ala
325 330 335
Val Ala Lys Val Glu Glu His Ile Ala Asp Ala Leu Glu Lys Gly Ala
340 345 350
Arg Val Val Cys Gly Gly Lys Ala His Glu Arg Gly Gly Asn Phe Phe
355 360 365
Gln Pro Thr Ile Leu Val Asp Val Pro Ala Asn Ala Lys Val Ser Lys
370 375 380
Glu Glu Thr Phe Gly Pro Leu Ala Pro Leu Phe Arg Phe Lys Asp Glu
385 390 395 400
Ala Asp Val Ile Ala Gln Ala Asn Asp Thr Glu Phe Gly Leu Ala Ala
405 410 415
Tyr Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Ser Arg Val Phe Arg Val Gly Glu Ala
420 425 430
Leu Glu Tyr Gly Ile Val Gly Ile Asn Thr Gly Ile Ile Ser Asn Glu
435 440 445
Val Ala Pro Phe Gly Gly Ile Lys Ala Ser Gly Leu Gly Arg Glu Gly
450 455 460
Ser Lys Tyr Gly Ile Glu Asp Tyr Leu Glu Ile Lys Tyr Met Cys Ile
465 470 475 480
Gly Leu
<210> 20
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
atgaaactta acgacagtaa cttattccgc cagcaggcgt tgattaacgg ggaatggctg 60
gacgccaaca atggtgaagc catcgacgtc accaatccgg cgaacggcga caagctgggt 120
agcgtgccga aaatgggcgc ggatgaaacc cgcgccgcta tcgacgccgc caaccgcgcc 180
ctgcccgcct ggcgcgcgct caccgccaaa gaacgcgcca ccattctgcg caactggttc 240
aatttgatga tggagcatca ggacgattta gcgcgcctga tgaccctcga acagggtaaa 300
ccactggccg aagcgaaagg cgaaatcagc tacgccgcct cctttattga gtggtttgcc 360
gaagaaggca aacgcattta tggcgacacc attcctggtc atcaggccga taaacgcctg 420
attgttatca agcagccgat tggcgtcacc gcggctatca cgccgtggaa cttcccggcg 480
gcgatgatta cccgcaaagc cggtccggcg ctggcagcag gctgcaccat ggtgctgaag 540
cccgccagtc agacgccgtt ctctgcgctg gcgctggcgg agctggcgat ccgcgcgggc 600
gttccggctg gggtatttaa cgtggtcacc ggttcggcgg gcgcggtcgg taacgaactg 660
accagtaacc cgctggtgcg caaactgtcg tttaccggtt cgaccgaaat tggccgccag 720
ttaatggaac agtgcgcgaa agacatcaag aaagtgtcgc tggagctggg cggtaacgcg 780
ccgtttatcg tctttgacga tgccgacctc gacaaagccg tggaaggcgc gctggcctcg 840
aaattccgca acgccgggca aacctgcgtc tgcgccaacc gcctgtatgt gcaggacggc 900
gtgtatgacc gttttgccga aaaattgcag caggcagtga gcaaactgca catcggcgac 960
gggctggata acggcgtcac catcgggccg ctgatcgatg aaaaagcggt agcaaaagtg 1020
gaagagcata ttgccgatgc gctggagaaa ggcgcgcgcg tggtttgcgg cggtaaagcg 1080
cacgaacgcg gcggcaactt cttccagccg accattctgg tggacgttcc ggccaacgcc 1140
aaagtgtcga aagaagagac gttcggcccc ctcgccccgc tgttccgctt taaagatgaa 1200
gctgatgtga ttgcgcaagc caatgacacc gagtttggcc ttgccgccta tttctacgcc 1260
cgtgatttaa gccgcgtctt ccgcgtgggc gaagcgctgg agtacggcat cgtcggcatc 1320
aataccggca ttatttccaa tgaagtggcc ccgttcggcg gcatcaaagc ctcgggtctg 1380
ggtcgtgaag gttcgaagta tggcatcgaa gattacttag aaatcaaata tatgtgcatc 1440
ggtctttaa 1449

Claims (10)

1.制备用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌的方法，包括如下步骤：提高受体菌中乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、聚羟基脂肪酸酯合成酶、β-酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶、琥珀酸半缩醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶、丙酰辅酶A转移酶的表达和/或活性，且降低所述受体菌中非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的表达和/或活性，从而获得所述用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌；所述受体菌为能够以乙酸作为碳源生长的菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述乙酸激酶，为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列8所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有乙酸激酶活性的蛋白质；
所述磷酸转乙酰酶，为如下b1)或b2)或b3)：
b1)氨基酸序列是序列表中序列9所示的蛋白质；
b2)在序列表中序列9所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有磷酸转乙酰酶活性的蛋白质；
所述聚羟基脂肪酸酯合成酶，为如下c1)或c2)或c3)：
c1)氨基酸序列是序列表中序列10所示的蛋白质；
c2)在序列表中序列10所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c3)将c1)或c2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有聚羟基脂肪酸酯合成酶活性的蛋白质；
所述β-酮硫解酶，为如下d1)或d2)或d3)：
d1)氨基酸序列是序列表中序列11所示的蛋白质；
d2)在序列表中序列11所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
d3)将d1)或d2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有β-酮硫解酶活性的蛋白质；
所述乙酰乙酰辅酶A还原酶，为如下e1)或e2)或e3)：
e1)氨基酸序列是序列表中序列12所示的蛋白质；
e2)在序列表中序列12所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
e3)将e1)或e2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有乙酰乙酰辅酶A还原酶活性的蛋白质；
所述琥珀酸半缩醛脱氢酶，为如下f1)或f2)或f3)：
f1)氨基酸序列是序列表中序列13所示的蛋白质；
f2)在序列表中序列13所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
f3)将f1)或f2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有琥珀酸半缩醛脱氢酶活性的蛋白质；
所述4-羟基丁酸脱氢酶，为如下g1)或g2)或g3)：
g1)氨基酸序列是序列表中序列14所示的蛋白质；
g2)在序列表中序列14所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
g3)将g1)或g2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有4-羟基丁酸脱氢酶活性的蛋白质；
所述4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶，为如下h1)或h2)或h3)：
h1)氨基酸序列是序列表中序列15所示的蛋白质；
h2)在序列表中序列15所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
h3)将h1)或h2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶活性的蛋白质；
所述丙酰辅酶A转移酶，为如下i1)或i2)或i3)：
i1)氨基酸序列是序列表中序列16所示的蛋白质；
i2)在序列表中序列16所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
i3)将i1)或i2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有丙酰辅酶A转移酶活性的蛋白质；
所述非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶为如下j1)或j2)或j3)：
j1)氨基酸序列是序列表中序列17和/或序列19所示的蛋白质；
j2)在序列表中序列17和/或序列19所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
j3)将j1)或j2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶活性的蛋白质。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述“提高受体菌中乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、聚羟基脂肪酸酯合成酶、β-酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶、琥珀酸半缩醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶、丙酰辅酶A转移酶的表达和/或活性”是通过向所述受体菌中导入乙酸激酶的编码基因、磷酸转乙酰酶的编码基因、聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因、β-酮硫解酶的编码基因、乙酰乙酰辅酶A还原酶的编码基因、琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因、4-羟基丁酸脱氢酶的编码基因、4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶的编码基因和丙酰辅酶A转移酶的编码基因来实现的；
所述“降低所述受体菌中非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的表达和/或活性”是通过敲除所述受体菌中非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因来实现的。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述乙酸激酶的编码基因为如下A1)或A2)或A3)或A4)所示的DNA分子：
A1)编码区是序列表中序列1自5’末端起第70-1272位所示的DNA分子；
A2)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第70-1272位所示的DNA分子；
A3)与A1)或A2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求2所述乙酸激酶的DNA分子；
A4)在严格条件下与A1)或A2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求2所述乙酸激酶的DNA分子；
所述磷酸转乙酰酶的编码基因为如下B1)或B2)或B3)或B4)所示的DNA分子：
B1)编码区是序列表中序列1自5’末端起第1347-3491位所示的DNA分子；
B2)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第1347-3491位所示的DNA分子；
B3)与B1)或B2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求2所述磷酸转乙酰酶的DNA分子；
B4)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求2所述磷酸转乙酰酶的DNA分子；
所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因为如下C1)或C2)或C3)或C4)所示的DNA分子：
C1)编码区是序列表中序列2自5’末端起第70-1839位所示的DNA分子；
C2)核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第70-1839位所示的DNA分子；
C3)与C1)或C2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求2所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的DNA分子；
C4)在严格条件下与C1)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求2所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的DNA分子；
所述β-酮硫解酶的编码基因为如下D1)或D2)或D3)或D4)所示的DNA分子：
D1)编码区是序列表中序列2自5’末端起第1924-3105位所示的DNA分子；
D2)核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第1924-3105位所示的DNA分子；
D3)与D1)或D2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求2所述β-酮硫解酶的DNA分子；
D4)在严格条件下与D1)或D2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求2所述β-酮硫解酶的DNA分子；
所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的编码基因为如下E1)或E2)或E3)或E4)所示的DNA分子：
E1)编码区是序列表中序列2自5’末端起第3180-3920位所示的DNA分子；
E2)核苷酸序列是序列表中序列2自5’末端起第3180-3920位所示的DNA分子；
E3)与E1)或E2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求2所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的DNA分子；
E4)在严格条件下与E1)或E2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求2所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的DNA分子；
所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因为如下F1)或F2)或F3)或F4)所示的DNA分子：
F1)编码区是序列表中序列3自5’末端起第70-1431位所示的DNA分子；
F2)核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第70-1431位所示的DNA分子；
F3)与F1)或F2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求2所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的DNA分子；
F4)在严格条件下与F1)或F2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求2所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的DNA分子；
所述4-羟基丁酸脱氢酶的编码基因为如下G1)或G2)或G3)或G4)所示的DNA分子：
G1)编码区是序列表中序列3自5’末端起第1468-2583位所示的DNA分子；
G2)核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第1468-2583位所示的DNA分子；
G3)与G1)或G2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求2所述4-羟基丁酸脱氢酶的DNA分子；
G4)在严格条件下与G1)或G2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求2所述4-羟基丁酸脱氢酶的DNA分子；
所述4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶的编码基因为如下H1)或H2)或H3)或H4)所示的DNA分子：
H1)编码区是序列表中序列4自5’末端起第70-1359位所示的DNA分子；
H2)核苷酸序列是序列表中序列4自5’末端起第70-1359位所示的DNA分子；
H3)与H1)或H2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求2所述4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶的DNA分子；
H4)在严格条件下与H1)或H2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求2所述4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶的DNA分子；
所述丙酰辅酶A转移酶的编码基因为如下I1)或I2)或I3)或I4)所示的DNA分子：
I1)编码区是序列表中序列5自5’末端起第70-1623位所示的DNA分子；
I2)核苷酸序列是序列表中序列5自5’末端起第70-1623位所示的DNA分子；
I3)与I1)或I2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求2所述丙酰辅酶A转移酶的DNA分子；
I4)在严格条件下与I1)或I2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求2所述丙酰辅酶A转移酶的DNA分子；
所述非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因为如下J1)或J2)或J3)或J4)所示的DNA分子：
J1)编码区是序列表中序列18和/或序列20所示的DNA分子；
J2)核苷酸序列是序列表中序列18和/或序列20所示的DNA分子；
J3)与J1)或J2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求2所述非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的DNA分子；
J4)在严格条件下与J1)或J2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求2所述非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的DNA分子。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述乙酸激酶的编码基因和磷酸转乙酰酶的编码基因是通过序列表中序列1所示的DNA分子导入所述受体菌中的；
所述聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因、所述β-酮硫解酶的编码基因和所述乙酰乙酰辅酶A还原酶的编码基因是通过序列表中序列2所示的DNA分子导入所述受体菌中的；所述琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因和所述4-羟基丁酸脱氢酶的编码基因是通过序列表中序列3所示的DNA分子导入所述受体菌中的；所述4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶的编码基因是通过序列表中序列4所示的DNA分子导入所述受体菌中的；所述丙酰辅酶A转移酶的编码基因是通过序列表中序列5所示的DNA分子导入所述受体菌中的。
6.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述非辅酶A循环的琥珀酸半缩醛脱氢酶的编码基因是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列6和序列7。
7.如权利要求1至6任一所述的方法，其特征在于：所述受体菌为大肠杆菌。
8.由权利要求1至6中任一所述的方法制备得到的用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌。
9.权利要求8中所述工程菌在生产聚羟基脂肪酸酯中的应用。
10.一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法，包括如下步骤：以乙酸作为碳源，发酵培养权利要求8中所述工程菌，收集发酵产物，从中获得聚羟基脂肪酸酯。
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