CN114015668B

CN114015668B - 嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN114015668B
Application number: CN202111465186.4A
Authority: CN
Inventors: 郭文斌
Original assignee: Third Institute of Oceanography MNR
Current assignee: Third Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2021-12-03
Filing date: 2021-12-03
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2041-12-03
Also published as: CN114015668A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，公开了嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶及其编码基因与应用，所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶来源于嗜吡啶红球菌，具有较好的序列新颖性，具有良好的短链单体聚合活性，对3‑羟基戊酰辅酶A单体具有更好的底物偏好性，可应用于微生物底盘细胞用于PHBV的合成，具有良好的应用前景。

Description

嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶及其编码基因与应用。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是许多细菌合成脂肪族聚酯，是作为细胞内碳源和能量储存物质。PHA是一种可降解塑料，具有良好的生物降解性，丢弃到环境中后可由环境微生物作用产生水和二氧化碳。PHA用作环保材料有可能解决或减少石油基塑料带来的白色污染等一系列环境问题，可以用于制备可生物降解的薄膜、容器等包装材料。PHA还具有组织相容性特点，因此在组织工程材料领域也有很大的应用前景，可用于外科手术缝合线、药物释放载体、聚合物支架等医用材料。PHA根据聚合单体碳原子数可分为由3-5个碳原子单体组成的短链PHA和由6-14个碳原子单体组成的中长链PHA。

PHA合成酶是PHA生物合成中的关键酶，可聚合羟酰基辅酶A(HA-CoA) 产生高分子量聚合物PHA。迄今为止，PHA合成酶已被广泛发现并根据其氨基酸残基序列、底物特异性和亚基组成分为四大类。I型和II型PHA合成酶由 PhaC亚基组成，该PhaC亚基被认为形成同型二聚体。III型和IV型的PHA 合成酶分别由PhaC-PhaE双亚基和PhaC-PhaR双亚基形成全酶。I型、III型和IV型PHA合成酶偏好聚合C3-C5碳链长度的短链单体，而II类PHA合成酶偏好聚合C6-C14碳链长度的中长链单体。来自罗氏真氧产碱杆菌Ralstonia eutropha的PHA合酶(PhaC_Re)是一种I型PHA合成酶，也是研究最多的PHA 合成酶之一。目前PhaC_Re已经完成了N端和C端的蛋白空间结构解析，明确了其催化单体聚合的机制。

细菌中PHA的工业化生产及应用的产品类型主要是PHB(聚3-羟基丁酸酯)、PHBV(聚3-羟基丁酸3-羟基戊酸酯)以及P3HB4HB(聚3-羟基丁酸4-羟基丁酸脂)，PHB因为结构规整，结晶度高达60％-80％，因而性脆、断裂伸长率很低，大大限制了其应用范围，而PHBV中由于3-羟基戊酸单体的掺入大大提高了其物理性能和加工性能。罗氏真氧产碱杆菌和转基因大肠杆菌都可以用来合成PHBV，发酵时底物中需要添加一定量的丙酸作为碳源，但是由于丙酸具有一定的毒性，因此提高丙酸的添加量会导致合成的PHBV的效率降低，此外，这两种微生物合成的PHBV中3-羟基戊酸单体(3-HV)的含量也相对较低，一般不超过50％。

发明内容

为此，需要提供嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶及其编码基因与应用，解决现有工程微生物合成的PHBV中3-羟基戊酸单体(3-HV)的含量相对较低的问题。

本发明的发明人先前已经在公开号为CN112063567A的发明专利申请中披露一株嗜吡啶红球菌P23及其在生产PHBV中的应用，嗜吡啶红球菌P23以对苯二甲酸为唯一碳源可以合成3-羟基戊酸单体含量大于60％的PHBV。

本发明中所述聚羟基脂肪酸酯合成酶来源于嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans)P23，因此命名为PhaC_Rp。

为实现上述目的，本发明提供了嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶 PhaC_Rp，其氨基酸残基序列如SEQID NO：1所示。

进一步，所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp氨基酸残基序列与已经公开发表的I、II、III和IV型聚羟基脂肪酸酯合成酶的序列进行系统进化树构建，所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp在进化树中处于I型和II型聚羟基脂肪酸酯合成酶之间，单独处于一个分支上，说明具有很强的序列新颖性。

上述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp的编码基因的脱氧核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

本发明第二方面提供了一种异源表达嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp的方法，具体包括：

(1)根据权利要求1中所述的嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶的氨基酸残基序列，在该序列的C端加上6×His标签，后根据大肠杆菌的密码子的偏好性设计基因序列，得到适用于大肠杆菌表达的所述的嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶的优化基因序列；

(2)根据优化基因序列进行全基因合成，连入大肠杆菌pET系列表达载体，构建表达质粒pET-phaC_Rp,之后导入大肠杆菌BL21(DE3)中，进行培养繁殖；

(3)通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导酶的表达后，经分离纯化获得嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶。

进一步，所述优化基因序列如SEQID NO：3所示。

进一步，大肠杆菌BL21(DE3)导入嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶 PhaC_Rp的编码基因的优化基因序列后，在含有卡那霉素抗性的LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.3-0.8，再进行诱导表达。

进一步，异源表达嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp的分离纯化过程为：离心收集菌体，超声破碎菌体细胞，加入尿素对目标蛋白进行变性，经镍离子亲和层析分离纯化获得异源表达的聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp。

上述的方法表达的嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp的应用，聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp应用于催化3-羟基丁酰辅酶A和3-羟基戊酰辅酶 A的活性。

进一步，聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp催化活性是通过观测其催化底物 3-羟基丁酰辅酶A或3-羟基戊酰辅酶A时236nm波长的吸光度值减少来实现。

进一步，首先使用嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp的氨基酸残基序列利用公开的AlphaFold2结构预测网站对其三维结构进行预测，紧接着使用预测结构与小分子底物3-羟基丁酰基辅酶A和3-羟基戊酰基辅酶A进行分子对接，整个分子对接的过程在软件MOE中进行。

进一步，嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3-羟基丁酰辅酶A 的结合打分为-11.0688Kcal/mol，PhaC_Rp与3-羟基戊酰辅酶A的结合打分为 -12.2850Kcal/mol，说明所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与 3-羟基戊酰辅酶A的底物亲和性高于3-羟基丁酰辅酶A。

进一步，根据分子对接结果，所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3-羟基丁酰辅酶A具有结合位点Asp₃₉₃、Ala₅₀₁、Val₅₀₀、His₄₉₉、His₄₇₂、 Asn₄₁₈，所述聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3-羟基戊酰辅酶A具有结合位点 Phe₄₁₂、Asn₄₁₈、His₄₇₂。

嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp具有良好的短链单体催化活性，对3-羟基戊酰辅酶A单体具有更好的底物偏好性，可应用于微生物底盘细胞用于PHBV的合成，具有良好的应用前景。

上述技术方案具有以下有益效果：

本发明提供一种嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp的氨基酸残基序列，所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp一级序列具有很高的新颖性；所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp对底物3-羟基丁酰辅酶A和3-羟基戊酰辅酶A具有高的催化活性；所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp对3-羟基丁酰辅酶A和3-羟基戊酰辅酶A两种底物都具有亲和性，相比较而言对3-羟基戊酰辅酶A具有更高的底物亲和性；所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp可应用于大肠杆菌或其他PHA生产的底盘微生物细胞，用于PHB、PHBV、PHV等PHA的高效生产。

附图说明

图1为嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与四大类的聚羟基脂肪酸酯合成酶的系统进化树。

图2为大肠杆菌中异源表达的嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp分离纯化后SDS-PAGE电泳图，M泳道为蛋白分子量标准，S泳道为分离纯化的PhaC_Rp。

图3为大肠杆菌中异源表达的嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp催化底物3-羟基丁酰辅酶A效果。

图4为利用AlphaFold2预测的嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶 PhaC_Rp三维立体结构。

图5为嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3-羟基丁酰辅酶A 的复合物；图5-1(A)：为嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3- 羟基丁酰辅酶A的二维结合模式图；图5-2(B)：为嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3-羟基丁酰辅酶A的表面结合模式图；图5-2(C)：为嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3-羟基丁酰辅酶A的三维结合模式图；图5-3(D)：为配体3-羟基丁酰辅酶A结合通道。

图6为嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3-羟基戊酰辅酶A 的复合物；图6-1(A)：为嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3- 羟基戊酰辅酶A的二维结合模式图；图6-2(B)：为嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3-羟基戊酰辅酶A的表面结合模式图；图6-2(C)：为嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3-羟基戊酰辅酶A的三维结合模式图；图6-3(D)为配体3-羟基戊酰辅酶A结合通道。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

下述实施例中所使用的实验方法均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径获得。

实施例1

嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp系统进化树的构建

嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)P23已经完成了全基因组测序，嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp的编码基因在基因组中的基因编号为gene3026，选取已经公开发表的I、II、III和IV型聚羟基脂肪酸酯合成酶的序列共20条与本发明所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶 PhaC_Rp选用软件MEGA6进行系统进化树构建。从图1可见嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp在进化树中处于I型和II型聚羟基脂肪酸酯合成酶之间，单独处于一个分支上，说明本发明所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯聚合酶PhaC_Rp一级序列具有很强的新颖性。

实施例2

嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp在大肠杆菌中异源表达、分离纯化

根据本发明的一种嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp的氨基酸残基序列，在该序列的C端加上6×His标签，便于目的蛋白的纯化，后根据大肠杆菌的密码子的偏好性设计基因序列，得到适用于大肠杆菌表达的所述的嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶的优化基因序列，密码子优化后并加上6×His标签的优化基因序列如SEQID NO：3所示，以质粒pET-30a为载体在大肠杆菌中异源表达嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp。

将含有合成的PhaC_Rp编码基因的载体pET-30a-phaC_Rp转化大肠杆菌 BL21(DE3)，在含有卡那霉素抗性的LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.6时，添加1 mM诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导酶的表达后，37℃诱导4 小时，离心收集菌体，超声破碎细胞，通过SDS-PAGE电泳发现目的蛋白主要以包涵体沉淀形式表达，加入8M尿素对包涵体进行变性，经镍离子亲和层析分离纯化获得聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp，大小为65kDa，如图2所示。

实施例3

异源表达嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp的活性测定

将100μM DL-3-羟基丁酰辅酶A与100nM的异源表达嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp在室温进行孵育同时检测236nm波长的吸光度值变化，从图3可以观察到OD₂₃₆在2分钟内迅速减少，说明异源表达嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp具有良好的催化活性。

实施例4

嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp三维结构预测及与底物3-羟基丁酰基辅酶A和3-羟基戊酰基辅酶A的分子对接。

使用公开的AlphaFold2结构预测网站，利用嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp的氨基酸残基序列对其三维结构进行预测，得到三维立体结构如图4所示。

使用预测结构与小分子底物3-羟基丁酰基辅酶A和3-羟基戊酰基辅酶A 进行分子对接，整个分子对接的过程在软件MOE中进行。化合物3-羟基丁酰基辅酶A和3-羟基戊酰基辅酶A的二维结构在MOE中通过能量优化得到低能三维构象。以嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp的单体结构模型作为受体。在正式对接之前，选择AMBER10:EHT力场以及R-field隐式溶剂模型。对接流程采用柔性的induced fit模式，结合口袋氨基酸的侧链可根据配体构象进行优化调整，约束侧链转动的权重设置为10。每个配体共产生1000个构象，其结合模式首先通过London dG打分函数进行排序，前30个构象通过进一步能量优化和GBVI/WSA dG方法对结合自由能再次评价，最终结合打分和经验挑选一个代表性构象。受体和配体间相互作用模式采用软件PyMOL (www.pymol.org)作图。

嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3-羟基丁酰辅酶A的结合打分为-11.0688Kcal/mol，PhaC_Rp与3-羟基戊酰辅酶A的结合打分为-12.2850 Kcal/mol，说明PhaC_Rp与3-羟基戊酰辅酶A的底物亲和性高于3-羟基丁酰辅酶A。

嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3-羟基丁酰辅酶A的结合模式如图5所示。3-羟基丁酰辅酶A与PhaC_Rp的结合口袋形成合适的空间互补，此外，两者之间也形成了氢键作用。3-羟基丁酰辅酶A的硫原子(S)作为氢键供体与Asp₃₉₃的氧原子(O)形成氢键；3-羟基丁酰辅酶A的氧原子(O)作为氢键受体分别与Ala₅₀₁和Val₅₀₀的氮原子(N,N)形成两个氢键；3-羟基丁酰辅酶A的氧原子(O)作为氢键受体与His₄₉₉的氮原子(N)形成氢键；3-羟基丁酰辅酶A的氧原子(O)作为氢键供体与His₄₇₂的氮原子(NE2)形成氢键； 3-羟基丁酰辅酶A的氧原子(O)作为氢键受体与Asn₄₁₈的氮原子(ND2)形成氢键。3-羟基丁酰辅酶A与周围残基也形成了范德华力。以上作用力主要决定了PhaC_Rp和3-羟基丁酰辅酶A的结合能。此外，蛋白结合口袋内也形成了配体结合通道，残基Cys₃₁₆,His₄₇₂,Ala₅₀₁,Phe₃₈₆,Leu₃₉₄,Trp₄₁₇,Phe₄₁₂等形成这一通道。

嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp与3-羟基戊酰辅酶A的结合模式如图6所示。3-羟基戊酰辅酶A与PhaC_Rp的结合口袋形成合适的空间互补，此外，两者之间形成了氢键作用和ππ堆积作用。3-羟基戊酰辅酶A的嘧啶环和Phe₄₁₂的苯环形成三文治型π堆积作用。3-羟基戊酰辅酶A的氧原子(O) 作为氢键受体与Asn₄₁₈的氮原子(ND2)形成氢键。3-羟基戊酰辅酶A的氧原子(O)作为氢键供体与His₄₇₂的氮原子(NE2)形成氢键。3-羟基戊酰辅酶A 与周围残基也形成了范德华力。以上作用力主要决定了嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶PhaC_Rp和3-羟基戊酰辅酶A的结合能。蛋白受体的结合口袋内也形成了通道，主要构成的残基包括Gly₄₉₈，His₄₇₂，Ala₅₀₁，Phe₃₈₆，Ile₄₁₄， Leu₃₉₄。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 自然资源部第三海洋研究所

<120> 嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶及其编码基因与应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 584

<212> PRT

<213> 嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)

<400> 1

Met Arg Ala Ser Val Asp Asp Val Thr Ile Gly Ser Gly Pro Phe Thr

1 5 10 15

Gln Phe Trp Ser Cys Ser Val Leu Asn His Leu Gln Lys Lys Leu Thr

20 25 30

Ser Ser Leu Asp Pro Ile Gly Trp Gly Pro Ala Val Ala Ser Val Ala

35 40 45

Gly Arg Ala Val Lys Asn Pro Arg Ala Val Ala Gly Ala Thr Thr Glu

50 55 60

Tyr Ala Gly Arg Leu Ala Asn Ile Pro Ala Ala Ala Thr Arg Val Trp

65 70 75 80

Asn Ala Ala Asp Pro Gln Pro Pro Val Pro Leu Asp Pro Lys Asp Arg

85 90 95

Arg Phe Ser Asp Ala Ala Trp Lys Glu Asn Pro Ala Tyr Phe Ser Leu

100 105 110

Leu Gln Ser Tyr Leu Ala Thr Arg Glu Tyr Val Glu Asp Leu Ala Asp

115 120 125

Ala Gly Ser Gly Asp Pro Val Gln Asp Gly Lys Ala Arg Gln Phe Ala

130 135 140

Asn Leu Met Phe Asp Ala Leu Ala Pro Ser Asn Phe Leu Ile Asn Pro

145 150 155 160

Gly Val Leu Val Arg Ala Leu Asp Thr Gly Gly Ala Ser Leu Phe Arg

165 170 175

Gly Ala Lys Tyr Ala Ile Glu Asp Val Val His Arg Lys Gly Leu Pro

180 185 190

Leu Lys Val Asp Arg Glu Ala Phe Thr Leu Gly Glu Asn Met Ala Ala

195 200 205

Thr Pro Gly Lys Val Val Phe Arg Asn Asp Leu Ile Glu Val Ile Gln

210 215 220

Tyr Ala Pro Gln Thr Gly Glu Val His Glu Ile Pro Ile Leu Ala Ala

225 230 235 240

Pro Pro Trp Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Leu Asp Leu Ala Pro Gln Arg

245 250 255

Ser Leu Ile Glu Trp Ala Val Gln His Asn Arg Thr Val Phe Ala Ile

260 265 270

Ser Tyr Arg Asn Pro Asp Glu Ser Met His Glu Ile Thr Met Asp Asp

275 280 285

Tyr Tyr Arg Gln Gly Val Ser Ala Ala Leu Asp Val Val Glu Glu Val

290 295 300

Thr Gly Ser Ser Arg Ile Glu Val Leu Ser Ile Cys Leu Gly Gly Ala

305 310 315 320

Met Ala Ala Met Ala Ala Ala Arg Met Gly Lys Leu Gly Asp Lys Arg

325 330 335

Ile Ser Ala Phe Thr Met Leu Asn Thr Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Val

340 345 350

Gly Glu Leu Ala Leu Leu Thr Asp Pro Ala Thr Leu Asp Arg Val Glu

355 360 365

Phe Arg Met Ser Lys Gln Gly Phe Leu Ser Gly Asn Glu Met Ala Gly

370 375 380

Ser Phe Asp Met Ile Arg Ala Arg Asp Leu Ile Phe Asn Tyr Trp Val

385 390 395 400

Ser Arg Trp Met Lys Gly Glu Lys Pro Ala Ala Phe Asp Ile Leu Ala

405 410 415

Trp Asn Glu Asp Ser Thr Arg Met Pro Ala Lys Met His Ser His Tyr

420 425 430

Leu Arg Ser Leu Tyr Gly Arg Asn Glu Leu Ala Arg Gly Val Tyr Glu

435 440 445

Leu Asp Gly Glu Val Leu Asp Leu Ser Asp Ile Thr Cys Asp Thr Tyr

450 455 460

Val Val Gly Ala Ile Asn Asp His Ile Val Pro Trp Thr Ser Ser Tyr

465 470 475 480

Lys Ala Thr Gly Leu Leu Gly Gly Ser Val Arg Tyr Val Leu Thr Ser

485 490 495

Gly Gly His Val Ala Gly Ala Val Asn Pro Pro Asn Pro Lys Ala Trp

500 505 510

Phe Glu Ala Val Gly Ala Pro Asp Ser Glu Lys Leu Pro Lys Leu Pro

515 520 525

Glu Asp Pro Lys Ala Trp Ser Glu Lys Ala Thr Arg Thr Ala Gly Ser

530 535 540

Trp Trp Glu Asp Trp Thr Ala Trp Ser Thr Lys Arg Ala Gly Glu Leu

545 550 555 560

Val Ala Pro Pro Ala Met Gly Ser Ala Gln His Pro Pro Leu Cys Asp

565 570 575

Ala Pro Gly Thr Tyr Val Phe Gly

580

<210> 2

<211> 1755

<212> DNA

<213> 嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)

<400> 2

gtgcgcgcct ccgtcgacga cgtcaccatc ggctccggac cattcaccca gttctggagt 60

tgctcggtgc tcaaccatct gcagaagaag ctcacctcct ccctcgaccc gatcgggtgg 120

ggaccggccg tcgcatccgt cgccggccgt gcagtgaaga atccgcgggc cgtggccggc 180

gcgaccacgg agtacgccgg tcgtctggcg aacatcccgg cggcggcgac acgcgtgtgg 240

aacgccgccg atccgcagcc cccggtgccg ctggatccga aggaccgccg gttctccgat 300

gccgcctgga aggagaatcc ggcctacttc tcgctgctgc agagctatct cgccacccgc 360

gagtacgtcg aggacctcgc cgacgccggc tcgggcgatc ccgtgcagga cggcaaggcc 420

cgtcagttcg cgaacctgat gttcgacgcg ctcgccccgt cgaacttcct catcaacccg 480

ggtgtgctcg tgcgcgcact cgacaccggt ggcgctagcc tgttccgcgg cgcgaagtac 540

gccatcgagg acgtcgtgca ccggaagggc ctgccgctca aggtcgatcg cgaggcgttc 600

accctcggcg agaacatggc cgcgaccccc ggcaaggtcg tcttccgcaa cgacctcatc 660

gaggtcatcc agtacgcccc gcagaccggt gaggtgcacg agatcccgat cctggcggcg 720

ccgccgtgga tcaacaagta ctacatcctc gatctcgcgc cgcagcgcag cctcatcgag 780

tgggccgtgc agcacaaccg caccgtgttc gcgatctcgt accgcaaccc ggacgagtcg 840

atgcacgaga tcacgatgga cgactactac cgccagggag tctccgcggc gctcgacgtc 900

gtcgaggagg tcaccggctc gtcgcgcatc gaggtgctgt cgatctgcct gggcggcgcg 960

atggcagcca tggccgcggc gcgcatgggc aagctgggcg acaagcgcat cagcgcgttc 1020

acgatgctca acacgctcct ggactacagc gaggtcggcg agctcgcgct gctgaccgac 1080

ccggcgacgc tcgaccgtgt cgagttccgg atgagcaagc agggcttcct ctcgggcaac 1140

gagatggccg gcagcttcga catgatccgt gcacgcgatc tgatcttcaa ctactgggtg 1200

tcgcggtgga tgaagggcga gaagcccgcc gccttcgaca tcctggcgtg gaacgaggac 1260

agcacccgca tgccggcgaa gatgcactcg cactacctgc ggtcgctgta cggccgcaac 1320

gagctcgcgc gcggcgtgta cgaactcgac ggcgaggtcc tcgacctgtc ggacatcacg 1380

tgcgacacct acgtggtggg cgccatcaac gaccacatcg tgccgtggac ctcgtcgtac 1440

aaggcgacgg gcctgctcgg cgggtcggtc cggtacgtcc tgaccagcgg tggccacgtg 1500

gccggcgcgg tcaatccccc caacccgaag gcctggttcg aggccgtcgg tgcgcccgac 1560

tccgagaagc tcccgaagct gcccgaggac ccgaaggcgt ggtcggagaa ggccactcgc 1620

accgcagggt cgtggtggga ggactggacc gcatggtcga cgaagcgggc cggtgagctc 1680

gtcgcccccc cggcgatggg cagcgcgcag catccgccgc tgtgcgatgc cccgggaacg 1740

tatgtcttcg ggtga 1755

<210> 3

<211> 1773

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcgtgcga gcgttgacga cgtgaccatc ggtagcggcc cgtttaccca gttctggagc 60

tgcagcgttc tgaatcatct gcaaaaaaag ctgaccagca gcctggaccc gatcggttgg 120

ggtccggcgg tggcgagcgt tgcgggtcgt gcggtgaaaa acccgcgtgc ggtggcgggt 180

gcgaccaccg aatatgcggg ccgtctggcg aacattccgg cggcggcgac ccgtgtgtgg 240

aacgcggcgg acccgcagcc gccggttccg ctggacccga aggatcgtcg tttcagcgat 300

gcggcgtgga aagagaaccc ggcgtatttt agcctgctgc aaagctacct ggcgacccgt 360

gagtatgtgg aagatctggc ggatgcgggt agcggcgacc cggttcagga tggcaaggcg 420

cgtcaattcg cgaacctgat gtttgacgcg ctggcgccga gcaacttcct gatcaacccg 480

ggcgtgctgg ttcgtgcgct ggataccggt ggcgcgagcc tgtttcgtgg tgcgaagtac 540

gcgattgaag acgtggttca ccgtaagggc ctgccgctga aagtggatcg tgaggcgttc 600

accctgggtg aaaacatggc ggcgaccccg ggcaaagtgg tttttcgtaa cgacctgatc 660

gaagtgattc agtatgcgcc gcaaaccggt gaggttcacg aaatcccgat tctggcggct 720

ccgccgtgga tcaacaaata ctatattctg gatctggcgc cgcagcgtag cctgatcgaa 780

tgggcggtgc aacacaaccg taccgttttc gcgatcagct accgtaaccc ggacgagagc 840

atgcacgaaa ttaccatgga cgattactat cgtcagggtg ttagcgcggc gctggatgtg 900

gttgaggaag tgaccggcag cagccgtatc gaggttctga gcatttgcct gggtggcgcg 960

atggcggcga tggcggcggc gcgtatgggc aagctgggtg acaaacgtat cagcgcgttt 1020

accatgctga acaccctgct ggattacagc gaggtgggtg agctggcgct gctgaccgac 1080

ccggcgaccc tggatcgtgt tgaattccgt atgagcaagc aaggttttct gagcggcaac 1140

gagatggcgg gtagcttcga catgatccgt gcgcgtgatc tgatttttaa ctattgggtg 1200

agccgttgga tgaagggcga aaaaccggcg gcgttcgaca tcctggcgtg gaacgaggat 1260

agcacccgta tgccggcgaa aatgcacagc cactacctgc gtagcctgta tggccgtaac 1320

gaactggcgc gtggtgtgta cgagctggac ggcgaagttc tggacctgag cgatattacc 1380

tgcgacacct atgtggttgg tgcgatcaac gatcacattg tgccgtggac cagcagctac 1440

aaagcgaccg gcctgctggg tggcagcgtg cgttatgttc tgaccagcgg tggccatgtg 1500

gcgggtgcgg ttaacccgcc gaacccgaaa gcgtggttcg aagcggttgg tgcgccggac 1560

agcgagaagc tgccgaaact gccggaagat ccgaaggcgt ggagcgagaa agcgacccgt 1620

accgcgggtt cctggtggga agattggacc gcgtggagca ccaagcgtgc gggcgagctg 1680

gttgcgccgc cggcgatggg cagcgcgcag catccgccgc tgtgcgacgc gccgggcacc 1740

tatgtgttcg gtcaccatca ccatcatcat taa 1773

Claims

1.嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶，其特征在于，所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶的氨基酸残基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的脱氧核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.含有权利要求2所述的编码基因的表达载体、基因工程菌和转基因细胞系。

4.一种在大肠杆菌中异源表达嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)根据优化基因序列进行全基因合成，连入大肠杆菌pET系列表达载体，构建表达质粒,之后导入大肠杆菌BL21(DE3)中，进行培养繁殖；

5.根据权利要求4所述的在大肠杆菌中异源表达嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶的方法，其特征在于，优化基因序列如SEQ ID NO：3所示。

6.根据权利要求4所述的在大肠杆菌中异源表达嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶的方法，其特征在于，大肠杆菌BL21(DE3)导入聚羟基脂肪酸酯合成酶的优化基因序列后，在含有卡那霉素抗性的LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.3-0.8，再进行诱导表达。

7.根据权利要求4所述的在大肠杆菌中异源表达嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶的方法，其特征在于，分离纯化过程为：离心收集菌体，超声破碎细胞，加入尿素对目标蛋白进行变性，经镍离子亲和层析分离纯化获得嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶。

8.根据权利要求4所述的在大肠杆菌中异源表达嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶的方法表达的聚羟基脂肪酸酯合成酶的应用，其特征在于，嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶应用于催化3-羟基丁酰辅酶A和3-羟基戊酰辅酶A的活性。

9.根据权利要求8所述的嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶的应用，其特征在于，所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶与3-羟基丁酰辅酶A具有结合位点Asp₃₉₃、Ala₅₀₁、Val₅₀₀、His₄₉₉、His₄₇₂、Asn₄₁₈，所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶与3-羟基戊酰辅酶A具有结合位点Phe₄₁₂、Asn₄₁₈、His₄₇₂。

10.根据权利要求8所述的嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶的应用，其特征在于，所述嗜吡啶红球菌聚羟基脂肪酸酯合成酶与3-羟基戊酰辅酶A的底物亲和性高于3-羟基丁酰辅酶A。