PT1751292E - Método para a produção de ácido succínico a partir de hidrosilatos em bruto - Google Patents

Description

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO SUCCÍNICO A PARTIR DE HIDROSILATOS EM

BRUTO

Descrição

Antecedentes da Invenção Campo da invenção

Esta invenção refere-se a um método de fermentação para produzir ácido succinico, assim como a determinados mutantes bacterianos capazes de usarem uma variedade açúcares diferentes para produzirem ácido succinico, como um produto principal de fermentação.

Antecedentes da invenção

Os ácidos carboxilicos são uma promessa enquanto potenciais precursores para numerosos químicos. Por exemplo, o ácido succinico pode servir como matéria-prima para os precursores de plástico como 1,4 butanediol (BDO), tetrahidrofurano e gama-butirolactona. Novos produtos derivados do ácido succinico encontram-se em desenvolvimento, sendo o mais notável destes, o poliéster, que é feito da ligação entre o ácido succinico e o BDO. Geralmente, os ésteres do ácido succinico têm o potencial de serem novos solventes "verdes" que podem ultrapassar outros solventes mais prejudiciais. No total, o ácido succinico serve como precursor para milhões de libras de químicos, anualmente num total de valor de mercado de mais de mil milhões de dólares. Juntamente com o ácido succinico, outros ácidos 4 - catão carboxilicos, tais como o ácido málico e o ácido fumárico, também têm potencial como matérias-primas. A produção destes ácidos carboxilicos, a partir de matérias-primas renováveis (neste caso através de processos de fermentação) é um grande caminho para ultrapassar os métodos mais intensos em termos energéticos, para fazer derivar esses ácidos a partir de fontes não-renováveis. 0 succinato é um intermediário para fermentações anaeróbicas através de bactérias que produzem propionatos, mas esses processos resultam em baixos rendimentos e baixas concentrações.

As bactérias anaeróbicas do rúmen, tais como as Bacteroides ruminicola e Bacteroides amylophilus também produzem succinato. No entanto, os organismos rúmen são caracteristicamente instáveis nos processos de fermentação. 1/20 Há muito tempo que se sabe que a mistura de ácidos é feita a partir de fermentação E. coli, tal como elaborado em Stokes, J. L. 1949 "A fermentação de glucose através de suspensões de Escherichia coli", J. Bacteriol. 57: 147 - 158. No entanto, para cada mole de glucose fermentada, são produzidas apenas 1,2 moles de ácido fórmico, 0,1 - 02 moles de ácido láctico e 0,3 - 0,4 moles de ácido succinico. Como tal, os esforços, no sentido de se produzir ácidos carboxilicos de forma fermentada, resultaram em quantidades relativamente grandes de substratos de crescimento, tais como glucose, em vez se converter no produto desejado.

Algumas bactérias, tais como A. Succiniproducens, usadas em processos de fermentação, tal como salientado na Patente Americana Nr. 5 143 834, de Glassner e al., produzem naturalmente ácido succinico em litros moderados até apenas cerca de 35 - 40 grama por litro (g/ L). A corrente hospedeira A. Succiniproducens já mostrou ser não muito osmotolerante, pelo facto de não tolerar concentrações de sal muito altas e é ainda inibida por concentrações moderadas do produto. Por fim, a A. Succiniproducens tem de ser manuseada de tal modo que, como um anaeróbico obrigatório, os procedimentos usando o organismo têm de ser feitos na ausência de oxigénio. Igualmente, a preparação do meio para o inoculo, requere a adição de tritófano.

Esforços anteriores por parte dos inventores para produzir ácido succinico tiveram como resultado o isolamento e a utilização de uma bactéria mutante. 0 mutante, disponível com o número de acesso ATCC 202021, é o assunto da Candidatura de reedição da Patente Norte Americana Nr. 09 / 429 693 (US RE 37 3936; 24 Setembro 2001) . A candidatura de reedição Nr. 09 / 429 693 ensina uma mancha bactéria que produz ácido succinico (AFP 111) que se muta espontaneamente a partir do seu precursor. O mutante é capaz de crescer através da fermentação na glucose para produzir ácido succinico em grande escala, enquanto os seus precursores não são capazes disso. No entanto, um senão óbvio da utilização deste método de produção do ácido succinico é a sua limitação a um único mutante.

Outros esforços (Patente Norte Americana Nr. 6 159 738) por parte dos inventores resultaram num método para construir manchas bacterianas que aumentaram a produção de ácido succinico. O método ensina que a alteração do gene f osf otransf erase de E. coli leva a bactéria a produzir mais ácido succinico. Um senão deste método é a sua limitação a uma única alteração. 2/20

Existe uma necessidade neste campo de um método para a produção de ácido succinico, através de fermentação, em que o método não é relegado a um único mutante ou gene. 0 método deve ser capacitado por qualquer organismo que tenha um genótipo facilmente determinado. 0 método deve ser capaz de ser realizado em condições relativamente inertes, usando-se organismos robustos (isto é, com altas matrizes de inibição de realimentação) e também de modo a evitar a necessidade de medidas sofisticadas de controlo ambiental. 0 método deve produzir resultados superiores de açúcares derivados da hidrólise de materiais lignocelulósicos, até porque estes substratos oferecem uma fonte mais económica de açúcares e, como tal, o seu uso poderia reduzir os custos de produção de ácido succinico. A Patente US 2003/ 017559 apresenta um método para a produção de ácido succinico a partir de hidrolisatos a nível industrial, compreendendo o uso de um organismo que contém mutações para os genes ptsG, pflB e IdhA, o que permite ao referido organismo acumular biomassa e permite ao referido organismo metabolizar o hidrolisato. Apesar de certos mutantes E. coli específicos (AFP 184 e AFP 400) que são mencionados, nenhum deles estava acessível ao público aquando da publicação da Patente US 2003/ 017559. O método referido atrás, de acordo com a Patente US 2003/ 17559, em que o mutante E. coli AFO 184 é usado, é também conhecido desde a apresentação oral de Nghiem et al. "Produção de ácido succinico a partir de materiais lignocelulósicos no 221° encontro da ACS, 2001, páginas 1-24.

Vemuri et al., "A produção de ácido succinico em fermentações de Escherichia de duas fases depende do tempo de transição das condições aeróbicas para anaeróbicas", Jornal de Microbiologia, Vol. 28, 2002, páginas 325 - 332, apresenta um método para a produção de ácido succinico a partir de meios baseados em glucose, usando o mutante AFP 111 da Escherichia Coli. Um método semelhante é também apresentado em Vemuri et al., App. Environ. Microbiol. Abril de 2002, 68 (4): 1715 -27.

RESUMO DA INVENÇÃO É objecto da presente invenção apresentar um método de produção de ácido succinico que ultrapasse muitas das desvantagens, relativamente ao que já existe neste campo. 3/20 É outro objecto da presente invenção apresentar um processo de fermentação que produz grandes quantidades de ácido succinico.

Ainda outro objecto da presente invenção é produzir ácido succinico através da fermentação.

Resumidamente, apresenta-se um método de produção de ácido succinico a partir de hidrolisatos de nível industrial, de acordo com a reivindicação 1.

Apresenta-se igualmente um mutante de bactéria, de acordo com a reivindicação 9.

BREVE DESCRIÇÃO DA IMAGEM A presente invenção, juntamente com o referido anteriormente e outros objectos e vantagens, podem melhor ser compreendidas a partir da seguinte descrição pormenorizada da realização da invenção, ilustrada nas imagens, em que: a Figura 1 é um gráfico que representa uma produção intensificada de ácido succinico, após a transformação de uma bactéria com um gene mutante, de acordo com as características da presente invenção; a Figura 2 é um gráfico que representa uma fermentação de hidrolisato industrial através de um organismo mutante triplo, de acordo com as características da presente invenção; e a Figura 3 é um gráfico que representa uma fermentação de açúcar através de um organismo mutante triplo, de acordo com as características da presente invenção.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Os inventores desenvolveram um método para produzir, através de fermentação, grandes quantidades de ácido succinico. 0 método explora mecanismos de repressão catabólica alterada de organismos seleccionados, de modo a permitir que os organismos produzam ácido succinico, usando misturas de matéria-prima de glucose e não-glucose.

Antes de apresentar a invenção em pormenor, fornecem-se as seguintes definições, sempre que apareçam, de ora em diante: 4/20

Um "vector" é uma replicação, como um plasmido, fage ou cosmídeo, ao qual se pode agregar outro segmento de ADN, de modo a produzir a replicação do segmento agregado.

Uma "replicação" é qualquer elemento genético (por exemplo, plasmido, cromossoma, vírus) que funciona como uma unidade autónoma de replicação de ADN in vivo, isto é, capaz de se replicar sob controlo.

Uma "cassete" refere-se a um segmento de ADN que pode ser inserido num vector em certos locais de restrição. 0 segmento de ADN codifica um polipeptídeo de interesse e a cassete e os locais de restrição são designados para assegurar a inserção da cassete na estrutura de leitura indicada para a transcrição e translação.

Uma célula foi "transfectada" por ADN exógeno ou heterólogo quando esse ADN foi introduzido na célula. Uma célula foi "transformada" por ADN exógeno ou heterólogo quando o ADN transfectado produz uma alteração fenotípica. 0 ADN "heterólogo" refere-se a ADN localizado na célula ou num local cromossomal da célula, de forma não natural. De preferência, o ADN heterólogo inclui um gene estranho à célula.

Uma "molécula de ácido nucleico" refere-se à forma de ribonucleosídeos do fosfato de éster polimérico (adenosina, guanosina, uridina ou citidina; "molécula ARN") ou deoxiribonucleosídeos (deoxiadenosina, deoxiguanosina, deoxitimidina, ou deoxicitidina; "moléculas de ADN"), ou qualquer fosfoester seu análogo, tal como fosforotioatos e tioesteres, em qualquer das formas de cadeia simples, ou uma hélice de duas cadeias. As hélices ADN - ADN, ADN-ARN e ARN - ARN de cadeias duplas são possíveis. 0 termo molécula de ácido nucleico e, em particular molécula de ADN ou ARN, refere-se apenas à estrutura primária e secundária da molécula e não a limita a nenhuma forma terciária particular. Assim, este termo inclui ADN de cadeias duplas encontrado, inter alia, em moléculas de ADN lineares ou circulares (por exemplo, fragmentos de restrição), plasmidos, e cromossomas. Ao discutir-se a estrutura de certas moléculas de ADN de cadeias duplas, podem descrever-se as sequências, de ora em diante, de acordo com a convenção normal de se dar apenas a sequência na direcção 5' a 3' ao longo da cadeia de ADN não transcrita (isto é, a cadeia com a sequência homóloga à mARN). Uma "molécula de ADN recombinante" é uma molécula de ADN que passou por uma manipulação biológica molecular. 5/20

Uma molécula de ácido nucleico é "hibridável" numa outra molécula de ácido nucleico, tal como uma cADN, ADN ou ARN genómico quando uma forma de uma única cadeia da molécula de ácido nucleico pode ser anelada a outra molécula de ácido nucleico sob as condições apropriadas de temperatura e de força iónica de solução (ver Sambrook et al., supra). As condições de temperatura e de força iónica de solução determinam o "rigor" da hibridação. Para uma verificação preliminar de ácidos nucleicos homólogos, pode usar-se condições de hibridação de baixo rigor, o que corresponde a Tm de 55° C, por exemplo, 5X SSC, o, 1% de SDS, 0, 25% de leite, e nenhum formamido; ou 30% de formamido, 5X SSC, 0,5% de SDS). As condições de hibridação de rigor moderado correspondem a um Tm mais alto, por exemplo, 40% de formamido, com 5X ou 6X SSC. As condições de hibridação de rigor muito alto correspondem ao Tm mais alto, por exemplo, 50% de formamido, 5X ou 6X SCC. A hibridação requer que os dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares, embora sejam possíveis ligações erradas entre as bases, dependentemente do rigor da hibridação. O rigor indicado para hibridizar os ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementação, variáveis bem conhecidas nesta área. Quanto maior for o grau de semelhança ou de homologia entre as duas sequências de nucleótidos, tanto maior será o valor de Tm para híbridos de ácidos nucleicos com essas sequências. A relativa estabilidade (que corresponde a um Tm superior) de hibridações do ácido nucleico decresce na seguinte ordem: ARN: ARN, ADN; ARN, ADN: ADN. Para híbridos com um comprimento superior a 100 nucleótidos, as equações para calcular o Tm já foram derivadas (ver Sambrook et al., supra, 9.50 - 0.51) . Para hibridações com ácidos nucleicos mais curtos, isto é, oligonucleótidos, a posição de ligações erradas torna-se mais importante, e o comprimento do oligonucleótidos determina a sua especificidade (ver Sambrook et al., supra, 1.1.7 -11.8). De preferência, um comprimento mínimo para um ácido nucleico hibridável é de pelo menos cerca de 12 nucleótidos; de preferência, de pelo menos cerca de 18 nucleótidos; e de maior preferência, o comprimento é de cerca de pelo menos 27 nucleótidos; e de maior preferência ainda, de cerca de 36 nucleótidos. "Recombinação homóloga" refere-se à inserção de uma sequência ADN estranha de um vector num cromossoma. De preferência, o vector escolhe como alvo um local específico para a recombinação homóloga. Para uma recombinação homóloga específica, o vector irá conter regiões suficientemente longas de homologia para as sequências dos cromossomas 6/20 de modo a permitir uma ligação e incorporação complementar do vector no cromossoma. Regiões mais longas de homologia e maiores graus de semelhanças sequenciais podem levar ao aumento da eficiência de recombinação homóloga.

Uma "sequência de codificação" de ADN é uma sequência de ADN de dupla cadeia que é transcrita e traduzida para uma polipeptideo numa célula in vitro ou in vivo quando colocada sob o controlo de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência de codificação são determinados por um códon de inicio a 5' (amino) término e um códon de paragem de tradução no 3' (carboxil) término. Uma sequência de codificação pode incluir, mas não se limita a, sequências procarióticas, cADN de MRNA eucarióticas, sequências de ADN genómicas de ADN eucariótico (por exemplo, mamífero) , e até sequências de ADN sintético. Se a sequência de codificação for para ser usada para expressão numa célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e uma sequência de terminação de transcrição estarão habitualmente localizados a 3' da sequência de codificação.

As sequências de controlo da tradução e da transcrição são sequências reguladoras do ADN, tais como promotores, incentivadores, terminadores e outros semelhantes, que contribuem para a expressão de uma sequência de codificação numa célula anfitriã. Em células eucarióticas, os sinais de poliadenilação são sinais de sequências de controlo.

Uma "sequência de promoção" é uma região reguladora de ADN capaz de ligar polimerase de ARN a uma célula e de iniciar a transcrição de uma sequência de codificação descendente (na direcção 3'). Por exemplo, a sequência de promoção está ligada no seu término 3' pelo local de iniciação da transcrição e alonga-se no sentido ascendente (na direcção 5') para incluir o menor número de bases de elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis sobre o fundo. Dentro desta sequência de promoção será encontrado um local de iniciação da transcrição (de conveniência, definido por exemplo através da mapeação com nuclease Sl), assim como domínios de ligação de proteínas (sequências de consenso) responsáveis pela ligação de polimerase de ARN).

Uma sequência de codificação está "sob o controlo" de sequências de controlo da transcrição e da tradução numa célula quando a polimerase ARN transcreve a sequência de codificação para um mARN, que é depois dividida em ARN e traduzida numa proteína codificada pela sequência de ADN. 7/20

Tal como será usado de ora em diante, o termo "homologia de sequência" em todas as suas formas gramaticais, refere-se à relação entre proteínas que possuem uma "origem evolucionária comum", incluindo proteínas de superfamílias (por exemplo, a superfamília da imunoglobulina) e proteínas homólogas de diferentes espécies (por exemplo, cadeia leve de miosina, etc) [Reeck et al., Cell, 50:667 (1987)] .

Neste sentido, o termo "semelhança de sequência" em todas as suas formas gramaticais, refere-se ao grau de identidade ou correspondência entre o ácido nucleico ou sequências de aminoácido de proteínas que não partilham uma origem evolucionária comum [ver Reeck at al., 1987, supra] . No entanto, no uso comum, e na aplicação instantânea, o termo "homólogo", quando modificado com um advérbio como "altamente", pode referir-se a semelhança de referência e não a uma origem evolucionária comum.

Duas sequências de ADN são "substancialmente homólogas" ou "substancialmente semelhantes" quando pelo menos 50% (de preferência pelo menos cerca de 75% e, de maior preferência, pelo menos 90%, 95% ou 99,9%) dos nucleótidos combinam com o comprimento definido de sequências de ADN. As sequências que são substancialmente homólogas podem ser identificadas através da comparação de sequências usando o software disponível em bancos de dados de sequências, ou numa experiência de hibridação do sul sob, por exemplo, condições rigorosas, tal como definido para um sistema específico. A definição das condições de hibridação apropriadas está dentro do âmbito deste campo. Ver, por exemplo, Maniatis et al., supra; DAN Cloning, Vols 1 e 2, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Igualmente, duas sequências de aminoácidos são "substancialmente homólogas" ou "substancialmente semelhantes" quando mais do que 30% de aminoácidos são idênticos, ou mais do que cerca de 60% são semelhantes (funcionalmente idênticos). De preferência, as sequências semelhantes ou homólogas são identificadas pelo alinhamento, usando, por exemplo, o Programa de compilação GCG (Genetics Computer Group, Manual do Programa para o pacote GCG, Versão 7, Madison, Wis.) . O termo "corresponde a" é usado de ora em diante para referir sequências semelhantes ou homólogas, quer a posição exacta seja idêntica, quer seja diferente da molécula junto da qual se mede a semelhança ou homologia. Assim, o termo "corresponde a" refere-se à 8/20 semelhança de sequência e não à numeraçao dos resíduos de aminoácidos ou às bases de nucleótidos.

Os mutantes e protocolos resultam num succinato com uma razão de matéria-prima até 1.3:1, e habitualmente 0,9:1. As acumulações de succinato de entre 60 g/ L e 75 g/ L são arquivadas. As durações de protocolo típicas são de mais de 70 horas, e habitualmente entre 120 e 170 horas. Por exemplo, níveis de 70 g/ L são obtidos após 160 horas. 0 processo é viável a, desde entre cerca de 25° C e 45° C, com um alcance preferido de cerca de 30 a 39° C. Um pH de entre cerca de 5 e 9 é apropriado, com uma alcance de maior preferência de cerca de 6.1 e 7.2.

Os mutantes inventados são componentes especialmente viáveis do protocolo fermentativo, na medida em que têm uma tolerância aumentada a produtos fermentativos. Por exemplo, podem arquivar-se concentrações de 72 g/ L para succinato, 22 g/ L para acetato, 14 g/ L para etanol e 8 g/ L para lactato, sem se induzir inibição da matéria-prima.

Pormenor da matéria-prima

Uma característica saliente do método e do mutante inventados é a utilização directa de matérias-primas industriais. Pode usar-se um grande número de matérias-primas, incluindo, mas não se limitando a, água de baixa saturação, hidrolisato lignocelulósico produzido através de vários métodos de hidrólise, soluções de açúcar derivado de milho (tais como licor saturado de milho), lactose de soro de leite, e outros açucares de nível industrial. Por exemplo, o hidrolisato lignocelulósico produzido através de hidrólise de ácido concentrado, ou a hidrólise de ácido diluído, a hidrólise de enzima ou hidrolisatos produzidos através de uma combinação destes processos são todos apropriados. As soluções de açúcar derivado de milho são também apropriadas.

As matérias-primas industriais são geralmente misturas de glucose e outros açúcares, sendo o açúcar não glucose mais comum, o xilose. A Fig. 2 mostra a utilização de glucose e xilose por um dos mutantes inventados. À luz do que já foi dito, quaisquer matérias-primas que contenham açúcares glucose e/ ou não glucose, sorbitol, xilose, arabinose, manose, lactose, ácido glucurónico, galactose, frutose e suas combinações, são apropriados. 9/20

Pormenor do Organismo O método inventado utiliza organismos, de acordo com a reivindicação 9, contendo alterações nos sistemas de repressão catabólicos dos organismos. Especificamente, os inventores descobriram que, como as alterações existem no sistema de fosfotransferase (pts), no sistema de liase formato piruvate (pfl) e no sistema de bactérias de desidrogenase lactato (ldh), estas bactérias são apropriadas para o uso no processo de produção de ácido succínico inventado. Os pfLAB e os IdhA são genes com o código de piruvate: o liase formato e o desidrogenase lactato fermentativo respectivamente.

Os organismos a serem alterados para incluírem os três knockouts são modificados através de transdução em série usando bacteriofage PI. Foram utilizados protocolos de transdução padrão Pl, um protocolo exemplificativo é apresentado em J. H. Miller, ed. Experiments in Molecular Genetics 1972 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor, N. Y.). Usando este método, podem usar-se tipos de cadeias selvagens ou quase selvagens de bactérias (por exemplo, a cadeia C600 de E. coli, ATTC, acesso nr. 23724) para criar sub-cadeias mutantes às quais faltam um, dois ou três genes funcionais seleccionados a partir de pfl, ldh, ptsG.

Um "gene knockout" refere-se a um processo de silenciamento da expressão de um determinado gene numa célula. O processo de silenciamento pode incluir, por exemplo, o alvo de um gene ou o bloqueio antisense. 0 alvo de um gene refere-se a um processo de introdução de uma síntese do ácido nucleico numa célula para se recombinar de forma específica com um alvo de um gene. A síntese do ácido nucleico torna inactivo o gene que era o alvo. A inactivação pode ser através da introdução de códons de terminação numa região codificada ou a introdução de um local de repressão numa sequência reguladora. Bloqueio antisense refere-se à incorporação numa célula de sequências de expressão que direccionam a síntese de ARN antisense para bloquear a expressão de um gene alvo. O ARN antisense híbrida para o mARN do gene alvo para inibir a expressão.

Um exemplo de uma cadeia de E. coli que compreende três mutantes e que pode ser usado na invenção tomou o nome de AFP 184 (ATCC, número de acesso PTA 5132, depositado em 9 de Abril, 2003) (AFP = Programa Alternativo de Matéria-prima) . A AFP 184 tem a eliminação pfl, 1 dh knockout, e a forma diferente do mutante de ptsG deliberadamente inserido numa cadeia quase selvagem de E. coli. Uma outra cadeia 10/20 chamada AFP 415 pode também ser usada. A AFP 415 difere da AFP 184 apenas pelo facto de possuir o knockout de ptsG. Funciona de modo semelhante à AFP 184.

Surpreendente e inesperadamente, os inventores descobriram que a taxa e a titer de metabolismo para a AFP 184 e a AFP 415 são superiores aos derivados W 1485 apresentados na Patente Norte-americana Nr 5 770 435 (agora uma candidatura reeditada nr 09/ 429 693) e 6 159 738. O quadro 1 apresenta uma comparação entre a produção de ácido succinico através da AFP 184 e uma derivada W 1485 (AFP 111) . È de notar que enquanto a derivada W 1485 usada refinou de forma moderada as matérias-primas, a AFP 184 ainda apresentou valores mais altos com hidrolases de nível industrial. A mutação que contém os três knockouts pode também ser gerada usando-se uma bactéria que contenha uma ou duas anomalias genéticas e de seguida induzindo-se o(s) restante(s) knockout(s). Neste caso, um organismo de iniciação viável é o W 1485, ATCC, número de acesso 12435. A AFP 400 (ATCC, número de acesso PTA 5583, depositado em 10 de Outubro, 2003), é um knockout triplo feito deliberadamente. Este contém a eliminação pfl por August Bock, e é inserido no W 1485 por David Clark da Universidade de Illinois para produzir FMJ 123. O FMJ 123 é produzido seguindo o protocolo descoberto em P. K. Bunch et al., (1997) Microbiology 143, 187 - 195. A AFT 400 também contém o knockout ldhA e é inserido na FMJ 123 para produzir DC 1327. O DC 1327 é produzido seguindo o protocolo descoberto em Chatterjee et al., Appl. Environ. Microbiol. 67, pp 148 - 154 e é incorporado nesta patente por referência. A AFP 400 contém os knockout ptsG, tal como é descrito na referência Chatterjee,

Tabela 1: Comparação da Produção de Ácido Succinico por Diferentes linhagens de E. coli.

Cadeia

Concentração Max

Produtividade Max

Alcance (g/g glucose) AFP 111

51 g/ L 0, 87 0, 70 g/ Lh AFP 184

72 g/L 1, 00 g/ Lh 1,00 11/20

Um knockout triplo AFP 404 (ATCC, número de acesso PTA 5133, depositado em 9 de Abril, 2003) foi também construído através da introdução de três knockouts na cadeia C600. O AFP 404 é semelhante ao AFP 184 mas tem um knockout de ptsG, ao invés de uma mutação pontual do gene. Também produz ácido succínico num alcance de aproximadamente 1 mol/ mol de glucose.

Um protocolo para o desenvolvimento da mutação tripla a partir da cadeia selvagem pode ser encontrado em R. Chatterjee et al. Os marcadores antibióticos típicos que indicam a presença de cada knockout incluem, mas não se limitam a Cam, Tet e Kan. As novas cadeias E. coli, AFP 400 e AFP 404 contendo os knockouts e os marcadores antibióticos foram assim gerados. Esse protocolo segue: A construção e introdução de um gene ptsG inactivado de forma incisiva 0 gene nativo ptsG E. coli foi clonado por PCR a partir de ADN genómico preparado de W 1485 usando detonadores com alvo no N - e C -termini da proteína sem amplificação das sequências genómicas adicionais. 0 gene foi clonado no vector pFJ118EH para dar pJFptsG. O gene foi interrompido através da inserção da cassete de resistência canamicina do pUC - 4K (Pharmacia) , removido com EcoRI, para o local do Mfel do gene ptsG no pJFptsG para dar o plasmido pTSGK. Porque o NZN 111 já inclui um marcador de resistência canamicina, construiu-se um equivalente através da transdução do gene TnlO - inactivado ldhA da cadeia SE 1752 para FMJ123. A cadeia resultante, DC 1237 ficou indistinguível na sua fisiologia de NZN 111. O gene interrompido ptsG foi transferido para DC 1237 através da transformação das células com pTSGK, fazendo as células crescerem por aproximadamente 30 gerações na presença de canamicina ena ausência de ampicilina, colocando-se depois a cultura em caixas de Pétri contendo glucose e incubando de forma anaeróbica. As colónias que foram capazes de crescer através da fermentação, foram purificadas e a sua sensibilidade aos dois antibióticos foi examinada, tal como está descrito em pormenor nos exemplos que se seguem. A cadeia AFP400 foi isolada como um resistente canamicina estável, a cadeia sensível de ampicilina que fermentou a glucose para succinato, acetato e etanol. Confirmou a integração própria do gene ptsG interrompido através dp PCR. O gene interrompido foi ampliado a partir de ADN AFP400 usando-se detonadores que correspondiam às sequências laterais aproximadamente 110 pares de base fora da região de 12/20 codificação do gene. Estas sequências não estavam presentes no vector de integração. 0 produto que dai resultou foi 3,0 kb em tamanho, tal como previsto na sequência ptsG já conhecida, nas suas regiões laterais e na inserção de canamicina. O produto foi digerido com Clal (local na cassete de canamicina) e Agel (local no ptsG) e gerou os fragmentos esperados para a inserção da cassete no local de Mfel do ptsG (1,95 e 1,05 kb por Clal, e 2,3 e 0,7 kb por Agel).

Ainda uma outra cadeia que compreende os três knockouts, AFP 404, é também derivada do C600, uma cadeia K12 de E. coli do tipo quase selvagem, usando o protocolo acima. A localização dos knockouts é já conhecida pela pesquisa anterior do inventor (Patente Norte-Americana) nr. 6 159 738 e Chatterjee et al.) discutida supra. Os knockouts são introduzidos usando-se uma cópia do gene knockout com um marcador de resistência para transformar células. A recombinação análoga pode ocorrer, tal como facilitado por enzimas anfitriãs. O cromossoma que contém o marcador é depois seleccionado. O knockout ptsG foi introduzido deste modo. A prova da sua inserção, através de PCR, está em pormenor em Chatterjee, et al...

Pormenor do Crescimento

Os organismos mutantes triplos produzidos pelos inventores não são obrigatoriamente anaeróbicos. Como tal, a acumulação inicial de biomassa pode ocorrer de forma aeróbica, após o que são estabelecidas condições fermentativas. As vantagens deste processo de duas fases (isto é, aeróbico e depois anaeróbico) estão ilustradas na Fig. 2, em que a taxa de produção de ácido succinico é muito maior quando comparada com a curva de crescimento do protocolo anaeróbico de uma só fase da Fig. 1.

Geralmente, quando a biomassa alcança um ponto equivalente ao aproximadamente a 108 a 1011 células por milímetro (ou aproximadamente 2 a 5 gramas de peso escorrido da célula por litro) , o fermentador torna-se anaeróbico. No laboratório, este ponto de concentração foi alcançado após aproximadamente 6 horas.

Nos protocolos industriais, um fermentador é carregado com água de baixa saturação mais o hidrolisato de lignocelulósico. Os antibióticos necessários foram incluídos nas seguintes concentrações: 100 pg de carbenicilina por ml, 30 pg de canamicina por ml, 10 pg de tetraciclina por ml e 30 pg de cloranfenicol por ml. Uma caldo rica contendo (por litro) 10 g de triptone, 5 g de NaCl e 1 g de extracto 13/20 de levedura. Meios sólidos para pratos continham 1,5 porcento (wt/ vol) de Difco Bacto-Agar. Foi preparada um E médio mínimo, tal como descrito em Vogel, H. J. 1956 Acetilornitinase em E. coli, Biol. Chem. 218:97 - 103.

As Condições de Laboratório para a fermentação foram as seguintes: O crescimento fermentativo foi realizado em tubos de soro selados contendo 10 ml de meio LB, com um suplemento de 0,5 g de MgC03 (acrescentado de modo a manter o pH do meio durante a fermentação), de antibióticos e de aproximadamente 10 g/ L de glucose. Pode utilizar-se uma variedade de substratos de crescimento, incluindo mas não se limitando a açúcares, álcoois de açúcar, ácidos açúcares e suas combinações. Os açúcares seguintes foram testados no lugar de glucose numa concentração de 5 g/ L em crescimento anaeróbico: trealose, manose, frutose, sorbitol e ácido glucurónico.

Os inócuos para as culturas de líquido anaeróbico foram preparados através do crescimento de cadeias de forma aeróbica de um dia para o outro em meios laboratoriais, com um suplemento de antibiótico. Uma amostra da cultura que ficou de um dia para o outro foi diluída 100-fold em meios frescos e deixada a crescer de forma aeróbica a um A600 de aproximadamente 1; os meios do crescimento anaeróbico foram inoculados com 1 ml de inócuos.

As amostras foram retiradas dos tubos selados de forma anoxica em momentos apropriados para a análise dos níveis de glucose (ou substratos de açúcar alternativos) restante e os produtos de fermentação foram formados. Para o crescimento anaeróbico acerca de meios sólidos, incubaram-se caixas de agar a 37° C num frasco anaeróbico sob um ambiente de H2 - C02 gerado pelo uso de um Gás-Pak.

Usou-se uma caixa de ensaio para actividade de β - galactosidase para testar a presença de repressão catabólica normal em cadeias. LB ou E-agar médio são dois dos vários meios que podem ser utilizados. O E-agar médio é um meio de nutriente mínimo usado habitualmente e discutido em Vogel, H. j., 1956 Acetilornitase em E. coli, J. Biol. Chem 218:97 - 103. Em protocolos exemplificativos, LB ou E-agar médio tem como suplemento com 4 g/L de glucose, 4 g/L de lactose, 3 mg/L de 5- bromo-4- cloro- 3-indolil- β-D- galactosídeo (X- gal) e antibióticos. Estes meios serão referidos de ora em diante como X-gal/ glucose agar. A formação de colónias azuis indicou expressão de β - galactosidase na presença de glucose devido à ausência de normal 14/20 repressão catabólica. Pelo contrário, a formação de colónias brancas indicou que existiu normal repressão catabólica e, por isso, nenhuma enzima esteve presente para cortar a lactose dissacarideo.

Os inventores também descobriram um método para utilizar o mutante num processo continuo. Neste processo continuo, as experiências repetitivas foram conduzidas na medida em que após a cultura ter produzido aproximadamente 50 g/L de ácido succinico, um milímetro da mistura foi acrescentado a uma caixa refrigerada contendo meios de LB, glucose e MgC03. Este novo inócuo continuou a produzir ácido succinico efectivamente. Este processo foi repetido 3 a 4 vezes, resultando em cada caso numa eficiente produção de ácido succinico.

Exemplo 1- Produção de Ácido Succinico utilizando Hidrolisato Industrial A AFP 184 foi colocada num fermentador com hidrolisato a partir de palha de arroz. Um hidrolisato exemplificativo é o que é preparado comercialmente e tornado disponível por Arkenol Inc., de Mission Viejo, CA, através do processo de hidrólise de ácido concentrado. A palha de arroz contém aproximadamente 600 g/L de glucose e 169 g/L de xilose como principais componentes de açúcar, juntamente com pequenas quantidades de outros açúcares. Os dados da experiência encontram-se no quadro 2 e na Fig. 2.

Segue-se um protocolo do AFP 184 baseado num processo de fermentação: o meio de fermentação continha os seguintes componentes: extracto de levedura Difco 5 g/L, triptone 5 g/L, (NH4)2S04 2 g/L, MgS04- 7H20 0,2 g/L, NaCl lOg/L, K2HP04 7 g/L, KH2P04 3 g/L, hidrosilato de Arquenol 16,5 g/L e canamicina 30 mg/L. O hidrolisato industrial continha 607 g/L de glucose e 169 g/L de xilose como os dois componentes de açúcar principais, mais quantidades menores de outros açúcares. O meio com todos os componentes, à excepção do antibiótico, foi auto-esterilizado a 121° C durante 20 minutos. A seguir acrescentou-se canamacina após arrefecer. Este meio de fermentação foi usado, tanto para os frascos de inócuo, como para o fermentador de um litro. Para o inócuo, colocou-se 50 mg do meio num frasco de 250 mg e inoculou-se com 0,2 mg da cultura de AFP 184 que foi guardada em 30% de glicerol e a -70° C. O frasco foi incubado num agitador de incubador a 37° C e 250 rpm de um dia par o outro (cerca de 16 horas) . Todo o conteúdo do frasco foi depois usado para inocular o fermentador que foi mantido a 37° C. O meio no fermentador foi exposto à acção do ar para permitir o rápido crescimento do organismo. Após seis horas, quando a massa pretendida 15/20 foi conseguida, levaram-se a cabo as seguintes acções: 1. Desligou-se o ar para exercer condições anaeróbicas que iriam iniciar a produção de ácido succínico; 2. 0 gás dióxido de carbono foi injectado no meio a uma razão de 0,03 mg por minuto; e 3. Acrescentou-se ao fermentador uma solução de alimentação que continha o hidrolisato de Arquenol diluído com água deionizada numa concentração de 500 g/L do total de glucose mais xilose para se alcançar uma concentração total de açúcar de 50 g/L no meio de fermentação. Durante o decorrer da experiência, quando a concentração de açúcar no fermentador estava baixa, acrescentou-se mais alimento para garantir os substratos suficientes para a produção de ácido succínico. À medida que as células produziam ácido succínico, o pH descia. Manteve-se a um pH de 6,5, acrescentando-se uma solução de 1,5 M Na2C03 através da acção de um controlador automático de pH. Tiraram-se amostras a intervalos e despistaram-se a densidade óptica, a glucose, xilose, ácido succínico, ácido acético, ácido láctico e etanol.

Tabela 2: Produção de Ácido Succínico , Ácido Acético e etanol a partir de Arkenol com um Mutante que contém ptsG, ldh e Anomalias pfl.

Tempo glucose xilose Ácido succínico Ácido acético etanol 0 7, 04 1,94 0 0 1,60 2 6,85 1,53 0 0, 41 1,35 4,2 4, 41 0 0 0, 85 1,13 6 0 0 0 0, 55 1,04 6,05 29, 27 7, 17 0 0 0,68 24 9, 56 1,69 26,12 2, 24 0, 49 24, 05 27, 25 5,60 26,39 2, 82 0, 72 28, 1 23,7 14, 69 28, 42 2, 98 0, 71 29, 5 22, 8 14, 17 27, 20 3,04 0,67 29, 55 34, 77 7, 95 26,41 2, 63 0, 52 48 20, 98 4, 72 37, 98 3,71 0,62 16/20 54 19, 13 4,30 43, 82 4,10 0, 71 54, 05 46,73 10, 85 43,51 3,69 0, 59 72 35, 14 8, 85 48, 52 4, 01 0, 63 80 33,60 8, 45 51, 44 4, 10 0, 50 104,25 23,02 7, 20 50, 99 4, 64 0 120 19, 73 6,77 52, 12 4, 83 0 192 13,04 5, 87 63,21 4, 88 0

Exemplo 2- Produção de Ácido Succínico a partir de uma mistura de açúcar sintético

Desenvolveu-se um protocolo de fermentação utilizando-se AFP 184 em combinação com uma matéria-prima de açúcar sintético. Como se pode ver na Fig. 3, a produção de sucinato foi rápida até 80 horas e estabilizou algures antes de atingir uma altura final de 60 g/L após aproximadamente 140 horas. O meio de fermentação continha os seguintes componentes: extracto de levedura Difco 5 g/L, triptone 10 g/L, (NH4) 2S04 2 g/L, MgS04- 7H20 0. 2 g/L, NaCl lOg/L, K2HP04 7 g/L, KH2P04 3 g/L, glucose 7,6 g/L, xilose 1.85 g/L e canamicina 30 mg/L. O meio com todos os componentes, à excepção do antibiótico, foi auto-esterilizado a 121° C durante 20 minutos. A seguir acrescentou-se canamicina após arrefecer. Este meio da fermentação foi usado, tanto para os frascos de inócuo, como para o fermentador de um litro. Para o inócuo, colocou-se 50 mg do meio num frasco de 250 mg e inoculou-se com 0,2 mg da cultura de AFP 184 que foi guardada em 30% de glicerol e a -70° C. O frasco foi incubado num agitador de incubador a 37° C e 250 rpm de um dia par o outro (cerca de 16 horas). Todo o conteúdo do frasco foi depois usado para inocular o fermentador que foi mantido a 37° C. O meio no fermentador foi exposto à acção do ar para permitir o rápido crescimento do organismo. Após seis horas, quando a massa pretendida foi conseguida, levaram-se a cabo as seguintes acções: 1. Desligou-se o ar para exercer condições anaeróbicas que iriam iniciar a produção de ácido succínico; 17/20 2. 0 gás dióxido de carbono foi injectado no meio a uma razão de 0,03 mg por minuto; e 3. Acrescentou-se ao fermentador uma solução de alimentação que continha 400 g/L de glucose e 84 g/L de xilose para atingir uma concentração de açúcar total de 50 g/L no meio de fermentação.

Durante o decorrer da experiência, quando a concentração de açúcar no fermentador estava baixa, acrescentou-se mais alimento para garantir os substratos suficientes para a produção de ácido succinico. À medida que as células produziam ácido succinico, o pH descia. Manteve-se a um pH de 6,5, acrescentando-se uma solução de 1,5 M Na2C03 através da acção de um controlador automático de pH. Tiraram-se amostras a intervalos e despistaram-se a densidade óptica, a glucose, xilose, ácido succinico, ácido acético, ácido láctico e etanol. O quadro 3, infra, e a Fig. 3 ilustram a produção de ácido succinico que resultou da utilização de uma mistura de açúcar sintético.

Como se pode ver numa comparação entre o Exemplo 1 e o Exemplo 2, a produção de sucinato do mutante foi equivalente (ver os pontos de tempo 120 e 122 das Tabelas 2 e 3, respectivamente) quando se usou hidrolisato industrial comparado com o uso de matéria-prima sintética. Este resultado ilustra o carácter robusto do protocolo inventado na medida em que os materiais tóxicos inerentes aos hidrolisatos de grau industrial não degradam o alcance.

Tabela 3: Produção de Ácido Succinico num protocolo de fermentação usando açúcar sintético

Tempo glucose xilose sucinato acetato 0 7,65 1,85 0 0 2 7,19 1,03 0 0,32 4,2 3,15 0 0 1,1 4, 45 6,03 0, 84 0 1,1 6 1,04 0 0 2, 02 18/20 6,25 40,2 7,57 0 2, 02 24 7, 76 3,92 24,25 3,43 30 9, 18 2,63 29,34 4,11 30,25 39,3 8,2 29,34 4,11 48 18,6 5,5 39, 8 4,6 54 14, 8 4, 95 42,33 5,26 54,25 27, 4 8,1 40, 77 4, 9 72 19, 7 6, 04 48,33 5, 76 78 17,6 5, 42 50,27 6 78,25 35,5 9, 49 48, 87 5, 75 96,5 30,2 8,25 53,62 5, 87 122 24, 1 6,48 55, 1 5, 87 144 22, 8 5,67 59,35 5, 43

Lisboa, 1 de Outubro de 2010 19/20

Claims (11)

1. Reivindicações 1. Um método para produzir ácido succínico a partir de hidrolisatos de nível industrial, compreendendo: a) Pôr à disposição um organismo a partir de uma cadeia Escherichia coli seleccionado a partir de AFP 184 (ATCC PTA 5132), AFP 400 (ATCC PTA 5583) e AFP 404 (ATCC PTA 5133) ; b) Permitir que o referido organismo acumule biomassa; e c) Permitir que o referido organismo metabolize o hidrolisato. com a reivindicação 1, em que a biomassa aproximadamente 108 a 1011 células por
2. 2. O método, de acordo acumula até entre milímetro.
3. 3. 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que o hidrolisato de nível industrial é um hidrolisato lignocelulósico, ou soluções de açúcar derivado de milho.
4. 4. 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que a temperatura é seleccionada desde entre 25° C e 45° C.
5. 5. 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que a biomassa acumula num ambiente aeróbico.
6. 6. 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que o pH é seleccionado desde entre aproximadamente 5 e 9.
7. 7. O método, de acordo com a reivindicação 1, em que o hidrolisato é contido numa primeira quantidade de matéria-prima.
8. 8. O método, de acordo com a reivindicação 1, em que a segunda quantidade de matéria-prima é acrescentada quando a concentração de ácido succínico é de aproximadamente 50 g/ L.
9. 9. Um mutante da cadeia de Escherichia coli seleccionado a partir de AFP 184 (ATCC PTA 5132), AFP 400 (ATCC PTA 5583) e AFP 404 (ATCC PTA 5133), caracterizado pelo facto de produzir ácido succínico a partir de um substrato contido num hidrolisato de nível industrial numa razão de entre 0.6:1 e 1.3:1 de ácido succínico para o substrato. 1/2
10. 10. O mutante, de acordo com a reivindicação 9, substrato é um açúcar seleccionado a partir do consiste em glucose, lactose, sorbitol, xilose, manose, ácido glucurónico, galactose, fructose combinações.
11. 11. 0 mutante, de acordo com a reivindicação 9, mutante é capaz de usar mais do que um substrato em para produzir ácido succinico em simultâneo. Lisboa, 1 de Outubro de 2010 em que o grupo que arabinose, ou suas em que o simultâneo 2/2