CN111650135A

CN111650135A - 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备苯妥英检测试剂中的用途

Info

Publication number: CN111650135A
Application number: CN201911403882.5A
Authority: CN
Inventors: 龚俊; 祁金祥; 张启飞; 肖兰萍; 王贵利; 刘希
Original assignee: Beijing Strong Biotechnologies Inc
Current assignee: Beijing Strong Biotechnologies Inc
Priority date: 2019-01-09
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111487206A; CN112285037B; CN111504920A; CN111537451B; CN111487208A; CN116298257A; CN111504921B; CN116297271A; CN111678874A; CN116626281A; CN116735512A; CN110174363A; CN115808398A; CN116124721A; CN111239060B; CN116679047A; CN111504921A; CN117054643A; CN112285037A; CN116773795A

Abstract

本申请涉及6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备苯妥英检测试剂中的用途。具体而言，本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型6‑磷酸葡萄糖脱氢酶包含选自以下的一个突变：D306C、D375C、G426C。使用本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体所制备的检测试剂盒，其特异性强、灵敏度高、操作方便、检测时间短、定量准确，适合高通量检测。

Description

6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备苯妥英检测试剂中的用途

本申请要求中国专利申请号201910017764.4(优先权日2019年1月9日)和中国专利申请号201910423122.4(优先权日2019年5月21日)《6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途》的优先权，其通过引用并入此处。

技术领域

本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种多位点突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在苯妥英检测试剂盒中的应用。

背景技术

半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。

半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质(如青霉素、磺胺剂等)，称为简单半抗原。

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

苯妥英(Phenytoin，PTN)，作为半抗原的具体实例，苯妥英是一种抗癫痫的外源性小分子药物。正常人的血清与血浆中不存在此物质，临床一般使用其钠盐形式。

苯妥英钠作为传统抗癫痫药物，药理作用机制主要是阻滞电压依赖性Na⁺通道，减少Na⁺内流稳定神经元细胞膜，降低其兴奋性，从而阻止局部异常放电向正常脑组织扩散。

苯妥英钠口服后1.5至30小时达峰浓度，一般连续给药6至10天可达有效血药浓度，其价格低廉、疗效确切，目前在临床广泛使用。但是，因其药代动力学特殊，治疗窗口狭窄，易导致药物过量而中毒，且中毒后临床表现多样，易误诊。所以，在临床诊断的过程中，需要不断的监测苯妥英在血中的药物浓度。

通常血药浓度在10-20μg/ml时能够达到最佳的治疗效果，且不会对人体产生毒害作用。而血药物浓度高于20μg/ml时，能够对人体的肝脏及肾脏产生毒性，轻则昏迷，重则死亡。一般在停止用药2-4周，经人体肝脏及肾脏代谢后，能够将苯妥英的血药浓度降低至0.5μg/ml或者更低的水平。

目前已知的苯妥英检测方法主要有：酶联免疫吸附法、均相酶免疫测定法、化学发光免疫分析法、高效液相色谱法、荧光偏振法等。但这些检测方法均存在较多的缺陷，如放射免疫分析法同位素具有放射性污染、有效期较短、操作不方便等诸多弊端，酶联免疫吸附法操作较为繁琐、耗时较长，不适宜在临床上使用。化学发光尽管灵敏度较好，但需要配套的专用设备，投入使用成本较高不利于推广。在临床检测诊断过程中，以均相酶免疫法(EMIT)检测为主。

均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原(如G6PDH-苯妥英)与非标记抗原(苯妥英)，竞争与定量的抗体(苯妥英抗体)进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物NAD+生成NADH就越多，在340nm波长下检测NADH的吸光度变化，即可推算出液体中苯妥英的含量。

发明内容

鉴于本领域的需求，本申请提供了一种新型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体、及其在制备苯妥英检测试剂盒中的用途。

根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。区别于已有发表的专利US006090567A(Homogeneous immunoassays using mutant glucose-6-phosphatedehydrogenases)的6磷酸葡萄糖脱氢酶的突变体，本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，其包含选自以下的突变：D306C、G426C、D375C。

根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是选自以下的序列所示：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4。

根据一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。

根据一些实施方案，提供了一种表达载体，其包含本申请的多核苷酸。

根据一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其包含本申请的表达载体。宿主细胞可以是原核(如细菌)或真核(如酵母)。

根据一些实施方案，提供了一种偶联物，其是本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：n偶联而成。

在一些实施方案中，n是1至50，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50。

在一些具体的实施方案中，本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比优选为1：1。

在一些具体的实施方案中，半抗原的分子量为100Da至4000Da，例如：100、150、200、250、300、350、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、550、570、600、620、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000。

根据本申请，技术人员将理解，“半抗原”还包含其衍生物的形式。为了便于和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进行偶联，对于那些自身不带有偶联基团(例如，与巯基反应的基团)的半抗原(例如苯妥英)，可以经改造而带有接头，以便和巯基共价结合。因此，在本申请中，半抗原衍生物是指，经改造而带有巯基反应基团的半抗原。

半抗原选自：小分子药物(如抗生素、精神药物)、激素、代谢物、糖、脂质、氨基酸。

半抗原例如但不限于：苯妥英、维生素D、25羟维生素D、1，25双羟维生素D、叶酸、强心甙、酶酚酸、雷帕明、环胞菌素A、乙胺碘复酮、甲胺喋呤、他克莫司、血清氨基酸、胆汁酸、甘胆酸、苯丙氨酸、乙醇、尿尼柯丁代谢产物柯替宁、尿吗啡、尿单羟酚衍生物、神经肽酪氨酸、血浆甘丙素、多胺、组织胺、促甲状腺激素、泌乳素、胎盘泌乳素、生长激素、促卵泡刺激素、促黄体生成素、促肾上腺皮质激素、抗利尿激素、降钙素、降钙素原、甲状旁腺激素、甲状腺素、三碘甲状原氨酸、反三碘甲状原氨酸、游离甲状腺素、游离三碘甲状原氨酸、皮质醇、尿17-羟皮质类固醇、尿17-酮类固醇、脱氢表雄酮及硫酸酯、醛固酮、尿香草苦杏仁酸、血浆肾素、血管紧张素、促红细胞生成素、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、17α羟孕酮、雌酮、雌三醇、雌二醇、孕酮、人绒毛膜促性腺激素、胰岛素、胰岛素原、C肽、胃泌素、血浆前列腺素、血浆6-酮前列腺素F1α、前列环素、肾上腺素、儿茶酚胺、去甲肾上腺素、胆囊收缩素、纳素、环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷、血管活性肽、生长抑素、促胰液素、P-物质、神经降压素、血栓素A2、血栓素B2、5羟色胺、神经肽Y、骨钙素。

在具体的实施方案中，半抗原是苯妥英或其衍生物。

在具体的实施方案中，半抗原是苯妥英衍生物，其带有巯基反应基团，例如来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜或氮丙啶。在具体的实施方案中，半抗原是苯妥英衍生物，如式I所示：

根据一些实施方案，提供了一种试剂，其包含本申请的偶联物。

根据一些实施方案，提供了本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体在制备苯妥英检测试剂中的用途。

根据一些实施方案，提供了本申请的偶联物在制备苯妥英检测试剂中的用途。

在具体的实施方案中，所述的检测试剂选自：酶联免疫法检测试剂、化学发光免疫法检测试剂、均相酶免疫法检测试剂、胶乳增强免疫比浊法检测试剂。

在具体的实施方案中，所述的检测试剂优选是基于竞争法检测的试剂。

根据一些实施方案，提供了一种苯妥英检测试剂盒，其包含：

-第一试剂，所述第一试剂包含底物和苯妥英抗体；所述底物是6-磷酸葡萄糖脱氢酶的底物；

-第二试剂，所述第二试剂包含本申请的偶联物；

-任选地，校准品，所述校准品包含10mM至500mM缓冲液、0mg/L至42mg/L苯妥英；以及

-任选地，质控品，所述质控品包含10mM至500mM缓冲液、0mg/L至42mg/L苯妥英。

根据一个的实施方案，提供了一种苯妥英检测试剂盒，其包含：

第一试剂，其包含：

10mM至500mM缓冲液、

5mM至25mM底物、

0.1mg/L至5mg/L的苯妥英抗体、

10mM至300mM NaCl、

0.1g/L至5g/L稳定剂、

0.1g/L至5g/L表面活性剂、

0.1g/L至5g/L防腐剂；

第二试剂，其包含：

10mM至500mM缓冲液、

0.1mg/L至1mg/L根据本申请的偶联物、

0.1g/L至5g/L稳定剂、

0.1g/L至5g/L表面活性剂、

0.1g/L至5g/L防腐剂。

在一些实施方案中，所述缓冲液选自以下的一种或组合：氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基甲烷缓冲液；优选，磷酸盐缓冲液；所述缓冲液的浓度为10mmol/L至500mmol/L，优选100mM；所述缓冲液的pH为6-8，优选7.2或者7.0。

在一些实施方案中，所述稳定剂选自以下的一种或组合：牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000；优选牛血清白蛋白。

在一些实施方案中，所述表面活性剂选自以下的一种或组合：Brij35、Triton X-100、Triton X-405、Tween20、Tween30、Tween80、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、AEO7，优选Tween20。

在一些实施方案中，所述的防腐剂选自以下的一种或组合：叠氮化物、MIT、PC-300、硫柳汞；所述叠氮化物选自：叠氮钠、叠氮锂。

在一些实施方案中，所述底物包含：6-磷酸葡糖糖、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

在一些实施方案中，提供一种偶联物的制备方法，其包括步骤：

1)提供苯妥英衍生物，优选在非质子性溶剂中提供苯妥英衍生物；

2)提供权利要求2所限定的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，优选在缓冲液中提供所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体；

3)在18℃至28℃，将所述苯妥英衍生物和所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体接触1小时至4小时，优选2小时至3小时，使得所述苯妥英衍生物和所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体发生偶联，得到所述偶联物；

4)任选，对所述偶联物进行纯化，优选脱盐；

步骤1)和2)可互换或并行；

所述缓冲液选自：PBS、Tris、TAPS、TAPSO，所述缓冲液pH为6.0至8.0；

所述非质子性溶剂选自以下一种或组合：乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜；

优选，在步骤3)之前，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体包含一个游离巯基；更优选，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体在第306、375或426位有游离巯基。

附图说明

图1.苯妥英结构图。

图2.苯妥英衍生物结构图。

图3A.G6PDH(野生型)氨基酸序列(SEQ ID No.1)；源自明串珠菌属假肠膜明串珠菌Leuconostoc pseudomesenteroides。

图3B.G6PDH(D306C)氨基酸序列(SEQ ID No.2)。

图3C.G6PDH(D375C)氨基酸序列(SEQ ID No.3)。

图3D.G6PDH(G426C)氨基酸序列(SEQ ID No.4)。

具体实施方式

实施例

实施例1.苯妥英衍生物的合成

1.化合物2的合成

将苯妥英(2.00g，7.94mmol)和K₂CO₃(1.65g，11.90mmol)用DMF(10mL)溶解，向反应体系中加入化合物1(1.42g，6.35mmol)，加热至50℃反应16h。

反应体系恢复至室温(20-25℃)，反应体系中加入水，并使用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂，层析柱(EA/PE＝1:3)纯化，得到无色油状化合物2(2.04g，81.6％)。

2.化合物3的合成

用乙醇(50mL)将化合物2(2.04g，5.20mmol)溶解，反应体系中加入NaOH(2N，10mL)，室温(20-25℃)下搅拌2h。使用HCl(1N)调pH5，减压除去溶剂，层析柱(MeOH/DCM＝1:20)纯化，得到白色固体化合物3(1.20g，60.0％)。

3.苯妥英衍生物的合成

将化合物3(117mg，0.32mmol)和化合物4(56mg，0.32mmol)溶于DCM(5mL)中，向其中滴加三乙胺(98mg，0.96mmol)，加入HATU(147mg，0.39mmol)，室温(20-25℃)搅拌5h。向反应体系中加入水(30mL)，用DCM进行萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压除去溶剂，制备版纯化，得到苯妥英衍生物(100mg，67％)。

本实施例的作用在于使得苯妥英带有一个可以和酶结合的基团。

实施例2.苯妥英衍生物与G6PDH分子的偶联

根据本申请的G6PDH-苯妥英偶联物，按照以下方式进行偶联：苯妥英衍生物分子上的巯基反应性基团(如但不限于马来酰亚胺基团)与G6PDH分子上的巯基共价结合。

1.溶液配制：

苯妥英衍生物溶液：实施例1制备的苯妥英衍生物10mg/ml溶于DMF；

G6PDH溶液：G6PDH(本申请的突变体或现有技术突变体)、PB100mmol、NaCl100mmol、pH＝8.0；

偶联溶液：100mM PB/K、100mM EDTA、150mM NaCl，pH＝7.2；

脱盐溶液：100mM PB/K、100mM EDTA、150mM NaCl，pH＝7.2。

2.偶联操作：4ml G6PDH溶液、15.2ml偶联溶液和0.8ml苯妥英衍生物溶液，在室温(20至25℃)反应4h。

3.将上述反应体系室温振荡反应4h后，用上述脱盐溶液使用脱盐柱进行洗脱，收集蛋白峰，所得产物即G6PDH-苯妥英偶联物。

实施例3.试剂盒的制备

制备以下检测苯妥英的试剂盒，其包含：

试剂R1，包含：

100mM PB缓冲液，pH 7.2

15mM 6-磷酸葡萄糖

15mMβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

2.5mg/L苯妥英抗体(市售抗体，无特殊限制)

150mM NaCl

1g/L牛血清白蛋白

1g/L Tween20

1g/L叠氮钠；

试剂R2，包括：

100mM PB缓冲液，pH 7.2

0.1mg/L G6PDH-苯妥英偶联物

1g/L牛血清白蛋白

1g/L Tween 20

1g/L叠氮钠；

校准品：100mM PB缓冲液，pH 7.2，以及0、2.5、5.0、10、20、42mg/L苯妥英(或按需加入)；

质控品：100mM PB缓冲液，pH 7.2，以及5.0、15、25mg/L苯妥英(或按需加入)。

检测例

反应时间：10min，其中孵育时间为4.7min，加入试剂R2后孵育1min后，测定读取吸光度A1，在孵育1min后，测定读取吸光度A2，计算ΔA＝(A2-A1)/min。通过校准曲线计算样本中苯妥英的含量：苯妥英＝样品管吸光度*校准品浓度/校准品吸光度。

对实施例3中制备的苯妥英检测试剂盒进行性能检测，主要的检测性能为总不精密度、重复性、回收、线性、37℃加速稳定性。

表1.全自动生化仪参数

检测例1.苯妥英检测试剂盒定标吸光度

表2.苯妥英检测试剂盒定标吸光度

注：现有技术中代号为A45C的突变体，其突变位点对应于图3A第46位。

检测例2.苯妥英检测试剂盒总不精密度

表3.总不精密度

检测例3.苯妥英检测试剂盒重复性

表4.重复性

检测例4.苯妥英检测试剂盒回收

表5.回收

检测例5.苯妥英检测试剂盒线性

表6.线性

检测例6.37℃加速稳定性

表7.37℃加速稳定性

本申请试剂37℃加速7天后，定标吸光度下降约15％，对照试剂37℃加速7天后，定标吸光度约95％。

检测例7.抗体抑制率

1.抗体抑制率的检测原理

当抗体与G6PDH-苯妥英偶联物结合时，由于空间位阻导致G6PDH酶活性受到影响，从而使得其催化NAD转化为NADH的效率降低，通过检测NADH量的变化，从而比较加入抗体与未加入抗体的实验组的差异，这种差异即体现为抗体对G6PDH的抑制能力。

2.反应体系

表8.抗体抑制率的检测试剂制备

表9.抗体抑制率检测上机参数

检测机型	雅培C16000
		分析/时间/点	速率/10min/28-32个点
R1/S	120:20
		波长(副/主)	405/340
反应类型	递增

3.结果

比较加入抗体与未加入抗体时，分别检测G6PDH-苯妥英偶联物吸光度测值，即可得到抗体对G6PDH的抑制情况。

抗体抑制率＝[1-(含抗体时G6PDH-苯妥英的吸光度变化值/不含抗体时G6PDH-苯妥英的吸光度变化值)]×100％。

相对于已发表的突变位点，本申请的突变体在抗体抑制率上有明显提高，能达到30％以上，最高达55％。而之前常用的突变位点(例如A45C、K55C)的抑制率只有40％左右甚至更低。

表10.不同G6PDH突变体的抗体抑制率

虽然不限于具体理论，但是可以部分地解释为：和现有技术中的G6PDH突变体相比，本申请酶突变体(D306C、D375C、G426C)中突变位点(即引入游离巯基的位点)是和半抗原(比如激素、小分子药物等)发生偶联的位置所在。半抗原在这个位置上与半抗原特异性抗体结合时，所构成的空间位阻对G6PDH酶的活性影响最小，同时在引入突变后，还不能实质上影响分子的空间折叠。因此，这个突变位点的位置非常重要，需要同时兼顾G6PDH酶的活性、偶联分子的空间折叠、以及半抗原表位的充分暴露。

由于酶的突变体在抗体抑制率上有明显的提高，将酶的突变体与苯妥英偶联后的偶联物配制成试剂盒后，试剂在重复性、总不精密度、线性、稳定性等性能方面有明显的性能提升。

序列表

<110> 北京九强生物技术股份有限公司

<120> 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备苯妥英检测试剂中的用途

<130> 390268CG

<150> 201910017764.4

<151> 2019-01-09

<150> 201910423122.4

<151> 2019-05-21

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 486

<212> PRT

<213> 明串珠菌属假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)

<400> 1

Met Val Ser Glu Ile Lys Thr Leu Val Thr Phe Phe Gly Gly Thr Gly

1 5 10 15

Asp Leu Ala Lys Arg Lys Leu Tyr Pro Ser Val Phe Asn Leu Tyr Lys

20 25 30

Lys Gly Tyr Leu Gln Lys His Phe Ala Ile Val Gly Thr Ala Arg Gln

35 40 45

Ala Leu Asn Asp Asp Glu Phe Lys Gln Leu Val Arg Asp Ser Ile Lys

50 55 60

Asp Phe Thr Asp Asp Gln Ala Gln Ala Glu Ala Phe Ile Glu His Phe

65 70 75 80

Ser Tyr Arg Ala His Asp Val Thr Asp Ala Ala Ser Tyr Ala Val Leu

85 90 95

Lys Glu Ala Ile Glu Glu Ala Ala Asp Lys Phe Asp Ile Asp Gly Asn

100 105 110

Arg Ile Phe Tyr Met Ser Val Ala Pro Arg Phe Phe Gly Thr Ile Ala

115 120 125

Lys Tyr Leu Lys Ser Glu Gly Leu Leu Ala Asp Thr Gly Tyr Asn Arg

130 135 140

Leu Met Ile Glu Lys Pro Phe Gly Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Ala Glu

145 150 155 160

Leu Gln Asn Asp Leu Glu Asn Ala Phe Asp Asp Asn Gln Leu Phe Arg

165 170 175

Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Met Val Gln Asn Ile Ala Ala Leu

180 185 190

Arg Phe Gly Asn Pro Ile Phe Asp Ala Ala Trp Asn Lys Asp Tyr Ile

195 200 205

Lys Asn Val Gln Val Thr Leu Ser Glu Val Leu Gly Val Glu Glu Arg

210 215 220

Ala Gly Tyr Tyr Asp Thr Ala Gly Ala Leu Leu Asp Met Ile Gln Asn

225 230 235 240

His Thr Met Gln Ile Val Gly Trp Leu Ala Met Glu Lys Pro Glu Ser

245 250 255

Phe Thr Asp Lys Asp Ile Arg Ala Ala Lys Asn Ala Ala Phe Asn Ala

260 265 270

Leu Lys Ile Tyr Asp Glu Ala Glu Val Asn Lys Tyr Phe Gly Arg Ala

275 280 285

Gln Tyr Gly Ala Gly Asp Ser Ala Asp Phe Lys Pro Tyr Leu Glu Glu

290 295 300

Leu Asp Val Pro Ala Asp Ser Lys Asn Asn Thr Phe Ile Ala Gly Glu

305 310 315 320

Leu Gln Phe Asp Leu Pro Arg Trp Glu Gly Val Pro Phe Tyr Val Arg

325 330 335

Ser Gly Lys Arg Leu Ala Ala Lys Gln Thr Arg Val Asp Ile Val Phe

340 345 350

Lys Ala Gly Thr Phe Asn Phe Gly Ser Glu Gln Glu Ala Gln Glu Ala

355 360 365

Val Leu Ser Ile Ile Ile Asp Pro Lys Gly Ala Ile Glu Leu Lys Leu

370 375 380

Asn Ala Lys Ser Val Glu Asp Ala Phe Asn Thr Arg Thr Ile Asp Leu

385 390 395 400

Gly Trp Thr Val Ser Asp Glu Asp Lys Lys Asn Thr Pro Glu Pro Tyr

405 410 415

Glu Arg Met Ile His Asp Thr Met Asn Gly Asp Gly Ser Asn Phe Ala

420 425 430

Asp Trp Asn Gly Val Ser Ile Ala Trp Lys Phe Val Asp Ala Ile Ser

435 440 445

Ala Val Tyr Thr Ala Asp Lys Ala Pro Leu Glu Thr Tyr Lys Ser Gly

450 455 460

Ser Met Gly Pro Glu Ala Ser Asp Lys Leu Leu Ala Ala Asn Gly Asp

465 470 475 480

Ala Trp Val Phe Lys Gly

485

<210> 2

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (306)..(306)

<223> G6PDH突变体,相较于野生型，306位的D替换为C

<400> 2

Met Val Ser Glu Ile Lys Thr Leu Val Thr Phe Phe Gly Gly Thr Gly

1 5 10 15

Asp Leu Ala Lys Arg Lys Leu Tyr Pro Ser Val Phe Asn Leu Tyr Lys

20 25 30

Lys Gly Tyr Leu Gln Lys His Phe Ala Ile Val Gly Thr Ala Arg Gln

35 40 45

Ala Leu Asn Asp Asp Glu Phe Lys Gln Leu Val Arg Asp Ser Ile Lys

50 55 60

Asp Phe Thr Asp Asp Gln Ala Gln Ala Glu Ala Phe Ile Glu His Phe

65 70 75 80

Ser Tyr Arg Ala His Asp Val Thr Asp Ala Ala Ser Tyr Ala Val Leu

85 90 95

Lys Glu Ala Ile Glu Glu Ala Ala Asp Lys Phe Asp Ile Asp Gly Asn

100 105 110

Arg Ile Phe Tyr Met Ser Val Ala Pro Arg Phe Phe Gly Thr Ile Ala

115 120 125

Lys Tyr Leu Lys Ser Glu Gly Leu Leu Ala Asp Thr Gly Tyr Asn Arg

130 135 140

Leu Met Ile Glu Lys Pro Phe Gly Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Ala Glu

145 150 155 160

Leu Gln Asn Asp Leu Glu Asn Ala Phe Asp Asp Asn Gln Leu Phe Arg

165 170 175

Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Met Val Gln Asn Ile Ala Ala Leu

180 185 190

Arg Phe Gly Asn Pro Ile Phe Asp Ala Ala Trp Asn Lys Asp Tyr Ile

195 200 205

Lys Asn Val Gln Val Thr Leu Ser Glu Val Leu Gly Val Glu Glu Arg

210 215 220

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225 230 235 240

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Leu Lys Ile Tyr Asp Glu Ala Glu Val Asn Lys Tyr Phe Gly Arg Ala

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340 345 350

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355 360 365

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Asp Trp Asn Gly Val Ser Ile Ala Trp Lys Phe Val Asp Ala Ile Ser

435 440 445

Ala Val Tyr Thr Ala Asp Lys Ala Pro Leu Glu Thr Tyr Lys Ser Gly

450 455 460

Ser Met Gly Pro Glu Ala Ser Asp Lys Leu Leu Ala Ala Asn Gly Asp

465 470 475 480

Ala Trp Val Phe Lys Gly

485

<210> 3

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (375)..(375)

<223> G6PDH突变体,相较于野生型，375位的D替换为C

<400> 3

Met Val Ser Glu Ile Lys Thr Leu Val Thr Phe Phe Gly Gly Thr Gly

1 5 10 15

Asp Leu Ala Lys Arg Lys Leu Tyr Pro Ser Val Phe Asn Leu Tyr Lys

20 25 30

Lys Gly Tyr Leu Gln Lys His Phe Ala Ile Val Gly Thr Ala Arg Gln

35 40 45

Ala Leu Asn Asp Asp Glu Phe Lys Gln Leu Val Arg Asp Ser Ile Lys

50 55 60

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65 70 75 80

Ser Tyr Arg Ala His Asp Val Thr Asp Ala Ala Ser Tyr Ala Val Leu

85 90 95

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100 105 110

Arg Ile Phe Tyr Met Ser Val Ala Pro Arg Phe Phe Gly Thr Ile Ala

115 120 125

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130 135 140

Leu Met Ile Glu Lys Pro Phe Gly Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Ala Glu

145 150 155 160

Leu Gln Asn Asp Leu Glu Asn Ala Phe Asp Asp Asn Gln Leu Phe Arg

165 170 175

Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Met Val Gln Asn Ile Ala Ala Leu

180 185 190

Arg Phe Gly Asn Pro Ile Phe Asp Ala Ala Trp Asn Lys Asp Tyr Ile

195 200 205

Lys Asn Val Gln Val Thr Leu Ser Glu Val Leu Gly Val Glu Glu Arg

210 215 220

Ala Gly Tyr Tyr Asp Thr Ala Gly Ala Leu Leu Asp Met Ile Gln Asn

225 230 235 240

His Thr Met Gln Ile Val Gly Trp Leu Ala Met Glu Lys Pro Glu Ser

245 250 255

Phe Thr Asp Lys Asp Ile Arg Ala Ala Lys Asn Ala Ala Phe Asn Ala

260 265 270

Leu Lys Ile Tyr Asp Glu Ala Glu Val Asn Lys Tyr Phe Gly Arg Ala

275 280 285

Gln Tyr Gly Ala Gly Asp Ser Ala Asp Phe Lys Pro Tyr Leu Glu Glu

290 295 300

Leu Asp Val Pro Ala Asp Ser Lys Asn Asn Thr Phe Ile Ala Gly Glu

305 310 315 320

Leu Gln Phe Asp Leu Pro Arg Trp Glu Gly Val Pro Phe Tyr Val Arg

325 330 335

Ser Gly Lys Arg Leu Ala Ala Lys Gln Thr Arg Val Asp Ile Val Phe

340 345 350

Lys Ala Gly Thr Phe Asn Phe Gly Ser Glu Gln Glu Ala Gln Glu Ala

355 360 365

Val Leu Ser Ile Ile Ile Cys Pro Lys Gly Ala Ile Glu Leu Lys Leu

370 375 380

Asn Ala Lys Ser Val Glu Asp Ala Phe Asn Thr Arg Thr Ile Asp Leu

385 390 395 400

Gly Trp Thr Val Ser Asp Glu Asp Lys Lys Asn Thr Pro Glu Pro Tyr

405 410 415

Glu Arg Met Ile His Asp Thr Met Asn Gly Asp Gly Ser Asn Phe Ala

420 425 430

Asp Trp Asn Gly Val Ser Ile Ala Trp Lys Phe Val Asp Ala Ile Ser

435 440 445

Ala Val Tyr Thr Ala Asp Lys Ala Pro Leu Glu Thr Tyr Lys Ser Gly

450 455 460

Ser Met Gly Pro Glu Ala Ser Asp Lys Leu Leu Ala Ala Asn Gly Asp

465 470 475 480

Ala Trp Val Phe Lys Gly

485

<210> 4

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (426)..(426)

<223> G6PDH突变体,相较于野生型，426位的G替换为C

<400> 5

Met Val Ser Glu Ile Lys Thr Leu Val Thr Phe Phe Gly Gly Thr Gly

1 5 10 15

Asp Leu Ala Lys Arg Lys Leu Tyr Pro Ser Val Phe Asn Leu Tyr Lys

20 25 30

Lys Gly Tyr Leu Gln Lys His Phe Ala Ile Val Gly Thr Ala Arg Gln

35 40 45

Ala Leu Asn Asp Asp Glu Phe Lys Gln Leu Val Arg Asp Ser Ile Lys

50 55 60

Asp Phe Thr Asp Asp Gln Ala Gln Ala Glu Ala Phe Ile Glu His Phe

65 70 75 80

Ser Tyr Arg Ala His Asp Val Thr Asp Ala Ala Ser Tyr Ala Val Leu

85 90 95

Lys Glu Ala Ile Glu Glu Ala Ala Asp Lys Phe Asp Ile Asp Gly Asn

100 105 110

Arg Ile Phe Tyr Met Ser Val Ala Pro Arg Phe Phe Gly Thr Ile Ala

115 120 125

Lys Tyr Leu Lys Ser Glu Gly Leu Leu Ala Asp Thr Gly Tyr Asn Arg

130 135 140

Leu Met Ile Glu Lys Pro Phe Gly Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Ala Glu

145 150 155 160

Leu Gln Asn Asp Leu Glu Asn Ala Phe Asp Asp Asn Gln Leu Phe Arg

165 170 175

Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Met Val Gln Asn Ile Ala Ala Leu

180 185 190

Arg Phe Gly Asn Pro Ile Phe Asp Ala Ala Trp Asn Lys Asp Tyr Ile

195 200 205

Lys Asn Val Gln Val Thr Leu Ser Glu Val Leu Gly Val Glu Glu Arg

210 215 220

Ala Gly Tyr Tyr Asp Thr Ala Gly Ala Leu Leu Asp Met Ile Gln Asn

225 230 235 240

His Thr Met Gln Ile Val Gly Trp Leu Ala Met Glu Lys Pro Glu Ser

245 250 255

Phe Thr Asp Lys Asp Ile Arg Ala Ala Lys Asn Ala Ala Phe Asn Ala

260 265 270

Leu Lys Ile Tyr Asp Glu Ala Glu Val Asn Lys Tyr Phe Gly Arg Ala

275 280 285

Gln Tyr Gly Ala Gly Asp Ser Ala Asp Phe Lys Pro Tyr Leu Glu Glu

290 295 300

Leu Asp Val Pro Ala Asp Ser Lys Asn Asn Thr Phe Ile Ala Gly Glu

305 310 315 320

Leu Gln Phe Asp Leu Pro Arg Trp Glu Gly Val Pro Phe Tyr Val Arg

325 330 335

Ser Gly Lys Arg Leu Ala Ala Lys Gln Thr Arg Val Asp Ile Val Phe

340 345 350

Lys Ala Gly Thr Phe Asn Phe Gly Ser Glu Gln Glu Ala Gln Glu Ala

355 360 365

Val Leu Ser Ile Ile Ile Asp Pro Lys Gly Ala Ile Glu Leu Lys Leu

370 375 380

Asn Ala Lys Ser Val Glu Asp Ala Phe Asn Thr Arg Thr Ile Asp Leu

385 390 395 400

Gly Trp Thr Val Ser Asp Glu Asp Lys Lys Asn Thr Pro Glu Pro Tyr

405 410 415

Glu Arg Met Ile His Asp Thr Met Asn Cys Asp Gly Ser Asn Phe Ala

420 425 430

Asp Trp Asn Gly Val Ser Ile Ala Trp Lys Phe Val Asp Ala Ile Ser

435 440 445

Ala Val Tyr Thr Ala Asp Lys Ala Pro Leu Glu Thr Tyr Lys Ser Gly

450 455 460

Ser Met Gly Pro Glu Ala Ser Asp Lys Leu Leu Ala Ala Asn Gly Asp

465 470 475 480

Ala Trp Val Phe Lys Gly

485

Claims

1.一种偶联物，其是6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：1偶联而成；

所述半抗原是苯妥英或其衍生物；

优选，所述苯妥英衍生物是下式所示：

2.根据权利要求1所述的偶联物，其中：

所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，相较于野生型6-磷酸葡萄糖脱氢酶，包含选自以下的一个突变：D306C、D375C、G426C；

优选地，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是选自以下的序列所示：SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4。

3.一种试剂，其包含权利要求1所述的偶联物。

4.权利要求1所述的偶联物在制备检测试剂中的用途：

所述检测试剂是苯妥英的检测试剂；

优选地，所述检测试剂选自：酶联免疫法检测试剂、化学发光免疫法检测试剂、均相酶免疫法检测试剂、胶乳增强免疫比浊法检测试剂。

5.一种苯妥英检测试剂盒，其包含：

第一试剂，所述第一试剂包含底物、苯妥英抗体；

第二试剂，所述第二试剂包含权利要求1所述的偶联物；

任选地，校准品，所述校准品包含10mM至500mM缓冲液、0mg/L至42mg/L苯妥英；以及

任选地，质控品，所述质控品包含10mM至500mM缓冲液、0mg/L 至42mg/L苯妥英。

6.根据权利要求5所述的苯妥英检测试剂盒，其包含：

第一试剂，其包含：

10mM至500mM，优选100mM至300mM缓冲液、

5mM至25mM，优选10mM至20mM底物、

0.1mg/L至5mg/L，优选1mg/L至2.5mg/L的苯妥英抗体、

10mM至300mM，优选150mM至200mM NaCl、

0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L稳定剂、

0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L表面活性剂、

0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L防腐剂；

第二试剂，其包含：

10mM至500mM，优选100mM至300mM缓冲液、

0.1mg/L至1mg/L权利要求1中所述的偶联物、

0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L稳定剂、

0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L表面活性剂、

0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L防腐剂；

所述缓冲液选自以下的一种或组合：氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基甲烷缓冲液；优选磷酸盐缓冲液；

所述缓冲液的pH为6至8，优选7至7.5；

所述稳定剂选自以下的一种或组合：牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000；优选牛血清白蛋白；

所述表面活性剂选自以下的一种或组合：Brij35、Triton X-100、Triton X-405、Tween20、Tween30、Tween80、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、AEO7；优选Tween20；

所述防腐剂选自以下的一种或组合：叠氮化物、MIT、PC生物防腐剂、硫柳汞；

所述叠氮化物选自：叠氮钠、叠氮锂、PC-300；所述底物包含：6-磷酸葡糖糖、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

7.根据权利要求6所述的苯妥英检测试剂盒，其包含：

第一试剂，其包含：

100mM PB缓冲液，pH 7.2、

15mM 6-磷酸葡萄糖、

15mMβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、

2.5mg/L的苯妥英抗体、

150mM NaCl、

1g/L牛血清白蛋白、

1g/L Tween20、

1g/L叠氮钠；

第二试剂，其包含：

100mM PB缓冲液，pH 7.2、

0.1mg/L权利要求1中所述的偶联物、

1g/L牛血清白蛋白、

1g/L Tween20、

1g/L叠氮钠；

校准品，其包含：

100mM PB缓冲液，pH 7.2，以及

0mg/L至42mg/L苯妥英；

质控品，其包含：

100mM PB缓冲液，pH 7.2，以及

5.0mg/L至25mg/L苯妥英。

8.一种偶联物的制备方法，其包括步骤：

提供权利要求2所限定的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体；

提供苯妥英或其衍生物；

所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与所述苯妥英或其衍生物偶联；

优选，所述苯妥英衍生物是下式所示：

9.根据权利要求8所述的偶联物的制备方法，其包括步骤：

4)任选，对所述偶联物进行纯化，优选脱盐；

步骤1)和2)能够互换或并行；

所述缓冲液选自：PBS、Tris、TAPS、TAPSO，所述缓冲液的pH为6.0至8.0；

优选，在步骤3)之前，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体包含一个或多个游离巯基；更优选，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体在第306、375或426位有游离巯基。