CN102424829B - 一种酶催化合成坦西莫司的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型的酶催化合成坦西莫司的方法，其以雷帕霉素为原料，使雷帕霉素与取代的-1，3-二氧六环-5-羧酸酯衍生物在水解酶的作用下，在溶剂中反应得到坦西莫司前体，坦西莫司前体再经常规的去保护反应即得到坦西莫司，所述的水解酶为蛋白酶、脂肪酶、酰基转移酶中的任一种或多种，酶可以为天然来源或通过分子生物学手段重组获得。本发明与已有方法相比，更方便且更安全有效，成本降低，更适合商业生产坦西莫司。
Description
技术领域
本发明涉及一种坦西莫司的制备方法，特别涉及一种酶催化合成坦西莫司的方法。
背景技术
坦西莫司(temsirolimus)，又名西罗莫司酯化物；雷帕霉素-42-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙烯酸酯，其是一种由惠氏医药(现已合并到辉瑞医药)研发用于治疗进展性肾癌的靶向性抗肿瘤药物，2007年获FDA批文。坦西莫司可以特异性的抑制mTOR激酶，从而抑制肿瘤细胞的增殖、生长，使肿瘤细胞停滞在G1期；同时，它还可以抑制VEGF的合成，从而抑制肿瘤血管的形成。
坦西莫司通过雷帕霉素42位羟基与2，2二羟甲基丙酸酯化得到。雷帕霉素是一个大环内酯类免疫抑制剂，其分子内具有多个羟基，因此区位特异性的酯化反应有一定的困难，特别是31位羟基。美国专利US 5362718(实施例10)提供了一种雷帕霉素42位羟基酯化制备坦西莫司(原研公司代号CCI-779)的方法，该方法的缺点是不具有区位选择性，在得到42位酯化的坦西莫司外，生成31位酯化和31，42二酯化的副产物。美国专利US 6277983提供了一种区位选择性的合成坦西莫司的方法，通过形成31位硅烷化保护的中间产物合成坦西莫司，该方法虽然提高了雷帕霉素42位酯化的区位选择性，但是反应步骤复杂，此外，由于雷帕霉素对酸碱不稳定，反应生成的副产物较多，收率低，成本高。
酶催化方法相对于化学合成方法，反应条件温和，反应特异性高，因而在区位特异性的合成上广受推崇。美国专利US 7268144提供了几个脂肪酶催化合成坦西莫司的方法。该方法将异亚丙基保护的2，2二羟甲基丙酸通过乙烯基或异丙烯基活化，然后用脂肪酶转酰化得到异亚丙基保护的坦西莫司，进一步水解得到坦西莫司。该方法具有反应条件温和，特异性高的优点。但是反应合成烯醇酯侧链需要昂贵的过渡金属钯催化，并在乙酸乙烯酯中回流，存在一定的安全隐患；所合成的烯醇酯侧链不稳定，纯化困难；商业化生产，有必要筛选出价格更低廉的其它酶催化剂；此外，脂肪酶催化反应的时候产生副产物乙醛，乙醛低沸点(21℃)低闪电(-40℃)，容易爆炸，而且对酶、对人体有毒害作用，这些缺点限制了该方法的工业化应用。
综上，需要提供一种成本更加低廉、操作更方便、更加安全有效的坦西莫司的合成方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的酶催化合成坦西莫司的方法，其成本更加低廉、操作更方便、更加安全有效。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种以雷帕霉素为原料通过酶催化合成坦西莫司的方法，该方法采取以下合成路线：
步骤(1)中，使雷帕霉素与化合物1在水解酶的作用下，在溶剂中反应得到化合物2，化合物2经步骤(2)常规的去保护反应得到坦西莫司；
化合物1和2中：
X＝SR1、SC5H4N、OC6H5、OC6H4R1、OC6H4OH、OC6H4OR1、OC6H4CH＝CH2、OC6H4NH2、OC6H4NHR1、OC6H4NR2R5、OC6H4CONH2、OC6H4CONHR1、OC6H4CONR2R5、OC6H4W、OC6H3W2、OC6H2W3、OC6H4CHO、OC6H4COR1、OC6H4COOR1、OC6H4NO2、OC6H3(NO2)2、OC6H2(NO2)3、OC6H3(W)(NO2)、OCnH2nOC6H4NO2、OCnH2nOC6H3(NO2)2、OCnH2nOC6H2(NO2)3、OCnH2nOC6H3(W)(NO2)、OCnH2nOCOC6H4NO2、OCnH2nOCOC6H3(NO2)2、OCnH2nOCOC6H2(NO2)3、OCnH2nOCOC6H3(W)(NO2)、OC10H6NO2、OC10H5(NO2)2、OC10H4(NO2)3、OC10H5(W)(NO2)、OCnH2nOC10H6NO2、OCnH2nOC10H5(NO2)2、OCnH2nOC10H4(NO2)3、OCnH2nOC10H5(W)(NO2)、OCnH2nOCOC10H6NO2、OCnH2nOCOC10H5(NO2)2、OCnH2nOCOC10H4(NO2)3、OCnH2nOCOC10H5(W)(NO2)、OC6H4OR1、OC6H3(OR1)2、OC6H2(OR1)3、OC6H3(W)(OR1)、OCnH2nOC6H4OR1、OCnH2nOC6H3(OR1)2、OCnH2nOC6H2(OR1)3、OCnH2nOC6H3(W)(OR1)、OCnH2nOCOC6H4OR1、OCnH2nOCOC6H3(OR1)2、OCnH2nOCOC6H2(OR1)3、OCnH2nOCOC6H3(W)(OR1)、OC10H6OR1、OC10H5(OR1)2、OC10H4(OR1)3、OC10H5(W)(OR1)、OCnH2nOC10H6OR1、OCnH2nOC10H5(OR1)2、OCnH2nOC10H4(OR1)3、OCnH2nOC10H5(W)(OR1)、OCnH2nOCOC10H6OR1、OCnH2nOCOC10H5(OR1)2、OCnH2nOCOC10H4(OR1)3、OCnH2nOCOC10H5(W)(OR1)、SC6H4NO2、SC6H3(NO2)2、SC6H2(NO2)3、SC6H3(W)(NO2)、OCnH2nSC6H4NO2、OCnH2nSC6H3(NO2)2、OCnH2nSC6H2(NO2)3、OCnH2nSC6H3(W)(NO2)、OCnH2nOCSC6H4NO2、OCnH2nOCSC6H3(NO2)2、OCnH2nOCSC6H2(NO2)3、OCnH2nOCSC6H3(W)(NO2)、OC6H4CF3、OC6H3(CF3)2、OC6H2(CF3)3、OCnH2nOC6H4CF3、OCnH2nOC6H3(CF3)2、OCnH2nOC6H2(CF3)3、OCnH2nOCOC6H4CF3、OCnH2nOCOC6H3(CF3)2、OCnH2nOCOC6H2(CF3)3、OC6H4CN、OC6H3(CN)2、OC6H2(CN)3、OCnH2nOC6H4CN、OCnH2nOC6H3(CN)2、OCnH2nOC6H2(CN)3、OCnH2nOCOC6H4(CN)3、OCnH2nOCOC6H3(CN)2、OCnH2nOCOC6H2(CN)3、OC(OR1)CH2、OC(H)C(H)OR1、ON＝C(R1)(COR2)、ON＝C(R1)(R2)、ON＝C(CN)(COOR2)以及ONHCOR1中的任一种；其中R1，R2，R5为氢或烷基，n为大于零的整数，W＝F、Cl、Br或I；
Y＝CH2、C5H10C、ArCH、CR3R4、BR3、BC6H6中的任一种；其中R3＝H，烷基，R4为烷基，Ar是芳香基；
步骤(1)中，所用的水解酶为蛋白酶、脂肪酶、酰基转移酶中的任一种或多种。
优选地，化合物1中，X＝SR1、SC5H4N、OC6H5、OC6H4R1、OC6H4OH、OC6H4OR1、OC6H4CH＝CH2、OC6H4NH2、OC6H4NHR1、OC6H4NR2、OC6H4CONH2、OC6H4CONHR1、OC6H4CONR2、OC6H4W、OC6H3W2、OC6H2W3、OC6H4CHO、OC6H4COR1、OC6H4COOR1、OC6H4NO2、OC6H3(NO2)2、OC6H2(NO2)3、OC6H3(W)(NO2)、OC10H6NO2、OC10H5(NO2)2、OC10H4(NO2)3、OC10H5(W)(NO2)、SC6H4NO2、SC6H3(NO2)2、SC6H2(NO2)3、SC6H3(W)(NO2)、OC6H4CF3、OC6H3(CF3)2、OC6H2(CF3)3、OC6H4CN、OC6H3(CN)2、OC6H2(CN)3、OC(OR1)CH2、OC(H)C(H)OR1、ON＝C(R1)(COR2)、ON＝C(R1)(R2)、ON＝C(CN)(COOR1)及ONHCOR1中的任一种；更优选地，化合物1中，X＝SR1、SC5H4N、OC6H5、OC6H4R1、OC6H4OH、OC6H4OR1、OC6H4CH＝CH2、OC6H4NH2、OC6H4NHR1、OC6H4NR2、OC6H4CONH2、OC6H4CONHR1、OC6H4CONR2、OC6H4W、OC6H3W2、OC6H2W3、OC6H4CHO、OC6H4COR1、OC6H4COOR1、OC6H4NO2、OC6H3(NO2)2、OC6H2(NO2)3、OC6H3(W)(NO2)、OC10H6NO2、OC10H5(NO2)2、OC10H4(NO2)3、OC10H5(W)(NO2)、SC6H4NO2、SC6H3(NO2)2、SC6H2(NO2)3、SC6H3(W)(NO2)、OC6H4CF3、OC6H3(CF3)2、OC6H2(CF3)3、OC6H4CN、OC6H3(CN)2、OC6H2(CN)3、OC(OR1)CH2或OC(H)C(H)OR1中的任一种；更进一步优选地，X＝SR1、SC5H4N、OC6H4NO2、OC6H3(NO2)2、OC6H2(NO2)3、OC6H3(W)(NO2)、OC10H6NO2、OC10H5(NO2)2、OC10H4(NO2)3、OC10H5(W)(NO2)、SC6H4NO2、SC6H3(NO2)2、SC6H2(NO2)3、SC6H3(W)(NO2)、OC6H4CF3、OC6H3(CF3)2、OC6H2(CF3)3、OC6H4CN、OC6H3(CN)2或OC6H2(CN)3；最优选地，X＝OC6H4NO2、OC6H3(NO2)2、OC6H2(NO2)3、OC10H6NO2、OC10H5(NO2)2或OC10H4(NO2)3。根据本发明的一个具体方面，X＝OC6H4NO2，更具体地，X为4-硝基苯酚基或3-硝基苯酚基。
优选地，化合物1中，Y优选为CR3R4，R3，R4的定义同上。具体地，Y可以为C(CH3)2、C(CH2CH3)2、C(CH2CH2CH3)2，C(CH3)(CH2CH3)2等，其中最优选C(CH3)2。
根据本发明，优选的化合物1为同时具有上述优选的X和Y的基团的化合物。根据一个方面，化合物1中，X为4-硝基苯酚基或3-硝基苯酚基，Y为CR3R4，R3，R4的定义同上。根据本发明，代表性的化合物1有例如2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸3-硝基苯酚酯(X＝3-硝基苯酚基，Y＝C(CH3)2)，2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸4-硝基苯酚酯(X＝4-硝基苯酚基，Y＝C(CH3)2)，2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸乙酰氧肟酸酯(X为ON＝CHCOCH3，Y＝C(CH3)2)，2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸-2-巯基吡啶酯(X＝SC5H4N，Y＝C(CH3)2)，2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸硫代乙醇酯(X＝SCH2CH3，Y＝C(CH3)2)，2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸乙氧烯醇酯(X为OCH＝CHOCH2CH3，Y＝C(CH3)2)等。
根据本发明，所述的脂肪酶为来源于微生物黑曲霉(Aspergillus niger)、皱落假丝酵母(Candida rugosa，Candida cylindracea)、米黑根毛酶(Rhizomucor miehei)、南极假丝酵母(Candida Antarctica)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、嗜热真菌(Thermomyces lanuginose)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani pisi)、产碱杆菌(Alcaligenes sp)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)等微生物的脂肪酶中的任意一种或多种。更优选地，水解酶为来源于嗜热真菌(Thermomyces lanuginosa)、茄病镰刀菌(Fusarium solani pisi)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的脂肪酶中的任意一种或多种。更优选地，所用的脂肪酶是嗜热真菌的脂肪酶TLL和茄病镰刀菌的脂肪酶LipaseNovozyme 51032(cutinase，角质酶，属于脂肪酶)。
根据本发明，所述的烷基优选为碳数1-12个的烷基。化合物1可通过本领域公知和常规的技术手段来合成或通过商购获得。本发明采用的水解酶并不局限于天然来源，还包括通过分子生物学手段重组的酶。所用的酶形态并没有限制性要求，既可以是干粉也可以是固定化的，特别是由于固定化的酶后处理方便，以及在酶的回收方面的优势，因此，水解酶优选为固定化酶。在众多脂肪酶中，我们发现来源于嗜热真菌(Thermomyces lanuginosa)的脂肪酶TLL和茄病镰刀菌(Fusarium solani pisi)的角质酶Lipase Novozyme51032(cutinase，属于脂肪酶)，对很多我们所选择的酰基供体具有很好的活性。特别当与硝基苯酚酯反应，该两个酶优势更加明显。一般采用固定化的酶，使后处理和酶的回收、重复利用更方便，如TLL可以选用树脂固定的IMMOZYME TLL和硅藻土吸附固定化TLL。
步骤(2)去保护反应的方法为该领域专业人员所熟知，很多文献中都有公开。具体的，坦西莫司前体若为缩酮保护基保护的，可以用温和的酸性条件下去保护。如在酸/有机溶剂体系中水解，1N盐酸的THF溶液中反应4小时或更长时间，反应完成后，用乙酸乙酯等溶剂从水介质中回收坦西莫司。如果是用烃基被硼酸(BR1，BC6H6；R1为烷基)取代保护的，去保护的方法为醇解，用醇最好是二醇(如2-甲基-2，5-己二醇)置换保护的烃基取代硼酸。其中异亚丙基保护是最常用和最简单的方法，因此，在大部分实施例都选用了异亚丙基保护。
酶催化反应的溶剂可以为甲苯、叔丁基甲醚、乙醚、异丙醚、四氢呋喃、二氯甲烷、己烷、乙腈等溶剂或它们的混合物。多个实施例中，我们选择叔丁基甲醚作为溶剂，都有很好的转化效果。在另一个实施例中，我们选择甲苯作为溶剂，但是其转化率不如叔丁基甲醚。
酶催化反应温度控制比较宽泛，0℃至75℃都可以反应。在一个实施例中，我们采用0℃、30℃和50℃用于反应，对比37℃的情况，结果显示，虽然温度升高有利于反应速率得提高，但是反应都达到一定的程度停止。但是当反应温度继续提高到70℃，如另一个实施例说描述的，酶的活性将降低，反应转化率也将降低。考虑到温度升高，反应溶剂挥发会增加，因此从环保角度考虑，不建议采用高的反应温度。综合考虑反应速率和溶剂的挥发，在多个实施例中，我们在实施例中采用37℃作为反应条件。但是值得注意的是，反应并不限于37℃。
分子筛可以吸收残余水分和一些小分子杂质，对酶催化反应有一定的帮助作用，我们添加4A、5A、10X、13X或其混合物。对于硝基苯酚酯，由于反应酶催化反应游离出来的硝基苯酚酯分子量较大，选用分子筛13X，可以吸附反应释放出来的对硝基苯酚，从而给酶催化反应提供额外的反应动力，提高反应转化率。在一个实施例中，我们在反应达到平衡后继续添加13X分子筛，从而推动酶催化反应继续进行，使转化率进一步提高到97％以上。当然分步添加只是可以更直观的现实分子筛13X的效果，操作方便，可以一次添加，在另一个实施例中，我们添加跟大量的13X分子筛(3倍前述实施例的量)也可以达到提高转化率的目的。分子筛并不是必须添加，在一个实施例中，在没有添加分子筛的情况下，加入适量硫酸镁，同样达到了良好的转化率。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明是合成坦西莫司的更方便和更安全有效的方法，其成本降低，更适合商业生产坦西莫司。
附图说明
图1为实施例8的反应产物的HPLC谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例中转化率的测量方法：Agilent ZORBAX 3.5um，SB-C18，2.1×50mm；0.3ml/min；40℃；277nm，82％MeOH(0-5.3min)，100％MeOH(5.3min-6.5min)，82％MeOH(6.5min-10min)。转化率＝产物峰面积/(残留雷帕霉素峰面积+产物峰面积)×100％。
实施例中所用的脂肪酶参见表1。
表1
| 代号 | 酶 | 来源 |
| L-001 | Lipase AK“AMANO” | Pseudomonas fluorecens |
| L-002 | Lipase AS“AMANO” | Aspergillus niger |
| L-003 | Lipase AY“AMANO” | Candida rugosa |
| L-005 | Lipase PS“AMANO”IM | Pseudomonas cepacia |
| L-006 | IMMOZYME CALA | Candida antarctica |
| L-007 | IMMOZYME CALB | Candida antarctica |
| L-008 | IMMOZYME RML | Rhizomucor miehei |
| L-009 | IMMOZYME TLL | Thermomyces lanuginosa |
| L-010 | Lipase Novozyme 51032 | Fusarium solani pisi |
| L-011 | IMMOZYME IMMABC | Pseudomonas cepacia |
| L-012 | IMMOZYME APF | Pseudomonas fluorecens |
| L-013 | IMMOZYME AULI | Baciilus subtilis |
实施例1
按照本实施例的坦西莫司前体(化合物2)的合成方法包括如下步骤：
(1)、2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸乙氧烯醇酯(乙氧烯醇酯)的制备：348mg(2mmol)2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸溶于10ml干燥的甲苯中，加入6mg(0.01mmol)钌催化剂双(甲基异丙基苯二氯化钌)，N2保护，0℃保温10min，滴入0.66ml(2.5mmol)乙氧基乙炔，室温反应20min，TLC监控反应。过滤浓缩后，中性氧化铝柱层析，正己烷∶乙酸乙酯(10∶1)快速洗脱得到乙氧烯醇酯约300mg。
(2)、20mg雷帕霉素，40mg酶，25mg乙氧烯醇酯，2粒4A分子筛，1ml叔丁基甲醚，37℃震荡反应16小时，所用酶的种类及对应的转化率参见表2。
表2
| 酶 | 16小时的转化率 |
| L-001 | 5.9％ |
| L-002 | 0.1％ |
| L-003 | 0.2％ |
| L-005 | 13.4％ |
| L-006 | 0.5％ |
| L-007 | 0.3％ |
| L-009 | 13.1％ |
| L-010 | 15.9％ |
实施例2
按照本实施例的坦西莫司前体(化合物2)的合成方法包括如下步骤：
(1)、2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸硫代乙醇酯(硫代乙醇酯)的制备：870mg(5mmol)2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸，1.13g(7mmol，1.4eq)N，N’-羰基双咪唑(CDI)，N2保护，室温下加入5ml甲苯和2ml DMF的混合溶液，保持搅拌反应30min(注意产生CO2气体)。将反应降温到-10℃，加入15ml甲苯和1mlDMF的混合溶液，搅拌10min，缓慢滴加0.43ml(6mmol，1.2eq)硫代乙醇，-10℃反应2小时，TLC监控反应至反应完全。反应完成后，减压浓缩溶剂和残余的硫代乙醇，乙酸乙酯溶解稀释后，水洗两遍，饱和食盐水洗一遍，有机相用无水硫酸钠干燥过夜。浓缩后硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯(15∶1)洗脱得650mg硫代乙醇酯，为略带白色的油状物。
(2)、20mg雷帕霉素，40mg酶，30mg硫代乙醇酯，2粒4A分子筛，1ml叔丁基甲醚，37℃震荡反应16小时，所用酶的种类及对应的转化率参见表3。
表3
| 酶 | 16小时转化率 |
| L001 | 1.5％ |
| L005 | 5.0％ |
| L009 | 1.6％ |
实施例3
按照本实施例的坦西莫司前体(化合物2)的合成方法包括如下步骤：
(1)、2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸2-巯基吡啶酯(巯基吡啶酯)的制备：348mg(5mmol)2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸，421mg(2.6mmol，1.3eq)CDI，N2保护，室温下加入1.5ml甲苯和0.5mlDMF的混合溶液，保持搅拌反应30min(注意产生CO2气体)。将反应降温到-10℃，加入5ml甲苯和0.5mlDMF的混合溶液，搅拌10min后加入222mg(2mmol，1eq)2-硫代吡啶，-10℃反应30min，TLC监控反应至反应完全。反应完成后，减压浓缩，乙酸乙酯溶解稀释后，水洗两遍，饱和食盐水洗一遍，有机相用无水硫酸钠干燥过夜。浓缩后硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯(15∶1)洗脱得黄色的油状物，巯基吡啶酯。
(2)、20mg雷帕霉素，40mg酶，25mg巯基吡啶酯，2粒4A分子筛，1ml叔丁基甲醚，37℃震荡反应3天，所用酶的种类及对应的转化率参见表4。
表4
| 酶 | 3天转化率 |
| L001 | 2.7％ |
| L005 | 3.9％ |
| L009 | 8.6％ |
实施例4
按照本实施例的坦西莫司前体(化合物2)的合成方法包括如下步骤：
(1)、2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸4-硝基苯酚酯(对硝基苯酚酯)的制备：3.48g(20mmol)2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸，2.77g(20mmol，1eq)对硝基苯酚，120mg(1mmol，0.05eq)4-二甲氨基吡啶(DMAP)，5.33g(26mmol，1.3eq)N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)，N2保护，冰浴加入50ml二氯甲烷，冰浴保持10min后于室温反应2小时，TLC监控反应完全。反应完全后，过滤，滤液浓缩去除反应溶剂，硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯(8∶1)洗脱，收集含有对硝基苯酚酯的无色或略带黄色的洗脱液，浓缩。石油醚∶乙酸乙酯(20∶1)结晶，过滤得白色对硝基苯酚酯晶体3.9g。
(2)、20mg雷帕霉素，40mg酶，30mg对硝基苯酚酯，2粒4A分子筛，1ml叔丁基甲醚，37℃搅拌反应，所用酶及对应转化率参见表5。
表5
| 酶 | 16小时转化率 | 4天转化率 |
| L-001 | 0.7％ | 4.4％ |
| L005 | 10.3％ | 21.1％ |
| L-006 | 0.2％ | 0.6％ |
| L-008 | 0.1％ | 0.5％ |
| L-009 | 36.9％ | 78.9％ |
| L-010 | 14％ | 57％ |
| L-012 | 0.1％ | 0.5％ |
| L-013 | 1.3％ | 4％ |
实施例6
按照本实施例的坦西莫司前体(化合物2)的合成方法包括如下步骤：
(1)、2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸乙酰氧肟酸酯(乙酰氧肟酸酯)的制备：870mg(5mmol)2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸，375mg(5mmol，1eq)乙酰氧肟酸，1.23g(6mmol，1.2eq)DCC，N2保护，冰浴加入20ml无水乙腈，冰浴30min后缓慢回复到室温反应过夜，TLC监控反应完全。反应完全后，过滤，滤液浓缩去除反应溶剂，25ml石油醚∶乙酸乙酯的混合溶液(6∶1)结晶，过滤得白色乙酰氧肟酸酯晶体。
(2)、20mg雷帕霉素，40mg酶，30mg乙酰氧肟酸酯，2粒5A分子筛，1ml叔丁基甲醚，37℃搅拌反应，所用酶及对应转化率参见表7。
表7
| 酶 | 16小时的转化率 | 6天的转化率 |
| L-001 | 1.1％ | / |
| L-005 | 3.2％ | / |
| L-009a | 9.1％ | 29.6％ |
| L-010 | 8.6％ | 59％ |
实施例7
按照本实施例的坦西莫司前体(化合物2)的合成方法包括如下步骤：
(1)、2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸3-硝基苯酚酯(间硝基苯酚酯)的制备：348mg(2mmol)2，2，5-三甲基-1，3-二氧六环-5-羧酸，278mg(2mmol，1eq)间硝基苯酚，12mg(0.1mmol，0.05eq)DMAP，533mg(2.6mmol，1.3eq)DCC，N2保护，冰浴加入8ml二氯甲烷，冰浴保持30min后，缓慢回复到室温反应过夜，TLC监控反应完全。反应完全后，过滤，滤液浓缩去除反应溶剂，硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)洗脱，收集含有间硝基苯酚酯的洗脱液，浓缩。石油醚∶乙酸乙酯(20∶1)结晶，过滤得白色间硝基苯酚酯晶体310mg。
(2)、20mg雷帕霉素，40mg脂肪酶TLL，30mg间硝基苯酚酯，2粒13X分子筛，1ml叔丁基甲醚，37℃搅拌反应，24小时转化率为26.7％，4天得转化率为77.2％。
实施例8
按照实施例4合成对硝基苯酚酯，20mg雷帕霉素，40mg脂肪酶TLL，30mg对硝基苯酚酯，2粒13X分子筛，1ml叔丁基甲醚，37℃搅拌反应，18小时转化率为47.2％，2天的转化率为75.7％，3天转化率为85％，4天为85.1％，补加2粒13X分子筛，继续反应2天，转化率达到97.8％。
实施例9
按照实施例4合成对硝基苯酚酯，20mg雷帕霉素，40mg脂肪酶L010，30mg对硝基苯酚酯，2粒13X分子筛，1ml叔丁基甲醚，37℃搅拌反应，18小时转化率为34.1％。
实施例10
温度试验。按照实施例4合成对硝基苯酚酯，20mg雷帕霉素，40mg脂肪酶TLL，30mg对硝基苯酚酯，2粒13X分子筛，1ml叔丁基甲醚，0℃、30℃、50℃各2组反应。0℃反应时，18小时转化率为1.2％；30℃反应时，18小时转化率为30.1％，4天的转化率为83.1％；50℃反应18小时的转化率为49.1％，4天的转化率为84.8％。
实施例11
温度、溶剂试验。按照实施例4合成对硝基苯酚酯，20mg雷帕霉素，40mg脂肪酶TLL，30mg对硝基苯酚酯，2粒13X分子筛，1ml甲苯做溶剂，37℃、70℃各两组搅拌反应。16小时37℃的反应转化率为23.8％，70℃反应转化率为20％。
实施例12
不加酶的试验。按照实施例4合成对硝基苯酚酯，20mg雷帕霉素，30mg对硝基苯酚酯，2粒13X分子筛，1ml叔丁基甲醚，37℃搅拌反应，反应16小时，转化率为0(HPLC方法检测无产物峰)。
实施例13
不加分子筛的试验。按照实施例4合成对硝基苯酚酯，20mg雷帕霉素，40mg脂肪酶TLL，30mg对硝基苯酚酯，10mg无水硫酸镁，1ml叔丁基甲醚，37℃搅拌反应，18小时转化率为29.9％。
实施例14
按照实施例4合成对硝基苯酚酯，20mg雷帕霉素，40mg脂肪酶TLL，30mg对硝基苯酚酯，6粒13X分子筛，1ml叔丁基甲醚，37℃搅拌反应，3天转化率为92.4％。
实施例15
本实施例提供一种坦西莫司的合成方法，包括如下步骤：
(1)、制备坦西莫司前体：按照实施例4合成对硝基苯酚酯，1g雷帕霉素，2g脂肪酶TLL(IMMOZYME TLL)，1.5g对硝基苯酚酯，14g 13X分子筛，2g 5A分子筛，50ml叔丁基甲醚，37搅拌反应，反应5天，转化率91％。过滤回收酶IMMOZYME TLL，并用少量叔丁基甲醚洗涤，浓缩，硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯(2∶1～1∶1)洗脱得到异亚丙基保护的坦西莫司前体，浓缩去除溶剂。
(2)、去保护反应制备坦西莫司：坦西莫司前体置于5ml的THF，滴加1NHCl，4℃搅拌12小时，TLC判断反应终点。反应完成后加入10ml乙酸乙酯稀释，加入5ml水，用20ml乙酸乙酯萃取有机相三次，合并有机相。有机相用用饱和碳酸钠溶液洗涤一遍，饱和食盐水洗涤三遍，无水硫酸钠干燥。浓缩后硅胶柱层析，乙酸乙酯∶正己烷(2∶1～4∶1)快速洗脱，沉淀得坦西莫司。ESI-MS(Na+)1053.5；1H、13C NMR与美国专利US 5362718(实施例11)描述的一致。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种以雷帕霉素为原料通过酶催化合成坦西莫司的方法，其特征在于：所述方法采取以下合成路线：
步骤（1）中，使雷帕霉素与化合物1在水解酶的作用下，在溶剂中反应得到化合物2，化合物2经步骤（2）常规的去保护反应得到坦西莫司；
化合物1中：X为4-硝基苯酚基或3-硝基苯酚基，Y为C(CH3)2；化合物2中，Y为C(CH3)2；
步骤（1）中，所用的水解酶为嗜热真菌的脂肪酶TLL；步骤（1）中，还添加有助于酶催化反应的分子筛，所述分子筛的孔径不超过
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的脂肪酶的形式是固定化的。
3.根据权利要求1述的方法，其特征在于：步骤（1）中，添加的分子筛为4A、5A、10X、13X分子筛或它们的任意组合。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，酶催化反应在温度0～70℃下进行，所述溶剂为甲苯、叔丁基甲醚、乙醚、异丙醚、四氢呋喃、二氯甲烷、己烷、乙腈或它们的任意组合。
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| Lipase-Catalyzed Regioselective Esterification of Rapamycin: Synthesis of Temsirolimus (CCI-779);Jianxin Gu, et al.;《ORGANIC LETTERS》;20051208;第7卷(第18期);3945-3948 * |
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