CN116179569A - 编码弓形虫sag抗原的核酸及其应用、该抗原的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及编码弓形虫SAG抗原的核酸及其应用、该抗原的制备方法。本本发明对SAG抗原的编码序列进行了优化，获得了一种高效表达SAG抗原的核苷酸序列(SEQIDNO:1)，并构建了含该SAG抗原的重组载体。与SAG未优化的编码序列相比，优化后的序列表达量显著提高，对IgM抗体表现出更高的灵敏度。本发明通过控制发酵过程DO及罐压，以及对起始诱导菌体量并采用甲醇‑山梨醇共补碳源的策略，对获得的上清通过改进分离纯化工艺，可获得高纯度＞95％的SAG抗原。

Description

编码弓形虫SAG抗原的核酸及其应用、该抗原的制备方法
技术领域
本发明涉及免疫学领域，尤其涉及编码弓形虫SAG抗原的核酸及其应用、该抗原的制备方法。
背景技术
弓形虫是一种属孢子纲真球虫目的专性细胞内寄生原虫，可以寄生在温血动物的细胞内，可以感染人体引起弓形虫病。弓形虫病流行于世界各地，几乎所有的哺乳动物都有弓形虫寄生。目前已知的弓形虫基因重组抗原主要包括膜表面抗原、棒状体蛋白、微线体蛋白、基质抗原等。目前已知的弓形虫抗体检测方法包括ELISA、Western-blot等血清学检测，检测抗体的包被抗原仍主要来源于鼠/组织培养的T.gondii速殖子制备的虫体抽提抗原，含有大量非特异性抗原物质，且制备程序烦琐，不易标准化，因此，需通过基因工程技术制备高度纯化的诊断抗原有着十分广阔的应用前景。
弓形虫速殖子表膜是宿主免疫系统识别并杀伤虫体的主要部位，SAG是弓形虫速殖子表膜的重要抗原之一，具有较强的免疫原性。由于弓形虫感染绝大多数都是由母婴传播，所以对孕妇做产前IgG和IgM检查就显得尤为重要，一般感染弓形虫后，宿主体内抗体IgM和IgG水平会显著增高。而胎儿时期检测是为了阻止弓形虫对其他器官进一步的影响，弓形虫一旦侵染眼部，会造成视网膜和视神经不可逆的破坏，最终导致失明。可见，对于弓形虫病的产前诊断对优生优育具有重要的意义。
利用酶联免疫吸附试验法(ELISA)定性检测人血清或血浆中的IgG和IgM是弓形虫病诊断的主要方法，目前，对于血清特异性抗体进行检测时常用的是虫源性粗抗原，因其成分复杂，导致特异性较差，并容易产生交叉反应，最终影响诊断效果。对弓形虫表面抗原SAG进行构建，利用毕赤酵母表达系统表达目的蛋白，并对发酵产物进行分离纯化，可以获得纯度不低于95％且免疫学活性正常的SAG抗原，为进一步优化弓形虫血清学诊断方法和研制弓形虫病疫苗奠定基础。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了编码弓形虫SAG抗原的核酸及其应用、该抗原的制备方法。该核酸经过密码子优化，使弓形虫SAG抗原的表达效率得到提明显提高。利用本发明提供的制备方法制得的SAG抗原纯度不低于95％。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种编码弓形虫SAG重组抗原的核酸，其为I～III中任意一种：
I、如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的核酸；或
II、SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸获得的核酸；或
III、与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同源性且编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的核酸。
本发明还提供了包含权利要求1所述核酸的重组载体。
一些实施方案中，所述重组载体的骨架载体为pPIC9K。
本发明还提供了转化有所述重组载体的宿主菌。
一些实施方案中，所述宿主菌为毕赤酵母菌株。
本发明还提供了所述的核酸、所述的重组载体、所述的宿主菌在制备SAG重组抗原中的应用。
本发明还提供了SAG重组抗原的制备方法，将转化有本发明宿主菌制成种子液，发酵培养，诱导SAG重组抗原的表达。
其中，所述宿主菌种子液的制备方法包括以下步骤：
将-80℃保存的所述宿主菌的甘油菌接种至BMGY培养基中，培养至菌体OD600达到3-5，得到一级种子液；
将所述一级种子液按10vol％的接种量转接至BMMY培养基中，培养至菌体OD600达到10-15，得到二级种子液。
所述培养的条件为：以pH值5.0±0.2的BMGY为种子培养基，30℃，摇床转速为200-300rpm，培养时间为16-20h；
所述BMGY培养基包括水、生物素和酵母粉10g/L、胰蛋白胨20g/L、甘油10ml/L；所述生物素按1：1000的体积比添加。
一些实施方案中，所述发酵培养包括分批培养阶段、甘油富集阶段以及甲醇诱导阶段，具体包括以下步骤：
将二级种子液转接至发酵罐中进行发酵培养，直至基础发酵培养基中的碳源(甘油)消耗完毕，此时菌体湿重达70-100g/L；其中，培养条件：30±2℃，通气量1-1.5vvm，搅拌转速500-700rpm，调控溶氧≥30％，pH值5.0±0.2。
(2)甘油富集阶段：流加含微量元素的50％甘油，继续培养6-10h，至菌体湿重达220-240g/L；所述培养的条件为30±2℃，通气量1-1.5vvm，搅拌转速700rpm，补加甘油饿速率为10ml/h/L，溶氧≥30％，pH值5.0±0.2。
(3)甲醇诱导阶段：所述富集阶段结束后，停止流加甘油，溶氧跳升至接近95±5％后，使菌体饥饿0.5h以上，然后流加含微量元素的甲醇-山梨糖醇共补碳源进行诱导表达；
所述诱导表达的条件为：28±2℃，通气量1-1.5vvm，搅拌转速500-700rpm，调控溶氧10％-30％，pH值5.0±0.2，罐内压维持在0.05-0.065MPa；所述甲醇-山梨糖醇共补诱导的时间为110-120h，当菌体湿重无明显增加后停止发酵，此时菌体湿重达350-370g/L。
所述BSM培养基包括水和如下组分：
85％磷酸26.7ml/L，硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，氢氧化钾4.31g/L，七水合硫酸镁14.9g/L，甘油200g/L，微量元素溶液12ml/L。
一些实施方案中，所述微量元素溶液包括水和如下组分：
CuSO4·5H2O 6g/L，碘化钠0.08g/L，MnSO4·H2O 3g/L，钼酸钠0.2g/L，氯化钴0.5g/L，生物素0.2g/L，硫酸锌20g/L，七水硫酸亚铁65g/L，硫酸5ml/L。
所述BSM培养基按以上用量称取后，用0.22μm滤膜过滤除菌。
一些实施方案中，所述甲醇-山梨糖醇共补培养基包括：山梨糖醇500g/L，丙氨酸12g/L，纯化水溶解后采用0.22um滤膜过滤除菌，每升甲醇中添加22ml。
一些具体实施例中，本发明制备方法具体包括如下步骤：
本发明还提供了SAG膜表面抗原的制备方法，包括：培养本发明所述的重组宿主，诱导SAG膜表面抗原的表达。
(1)种子制备
将甘油管保存的毕赤酵母菌种接种至50ml BMGY培养基中，30±2℃、200-300rpm培养16-20h，使菌体OD600达到3-5，获得一级种子。二级种子液是将一级种子按10％的接种量转接至500ml BMGY培养基中(100ml/瓶)，30℃、200-300rpm培养12-16h，使菌体OD600达到10-15。
(2)发酵培养及诱导表达
发酵培养过程包括分批培养阶段、甘油富集阶段以及甲醇诱导阶段。其中，分批培养阶段是指将二级种子转接至发酵罐中开始发酵培养，控制培养温度30±2℃，通气量1-1.5vvm，搅拌转速300-700rpm，调控溶氧≥30％，氨水调节pH值5.0±0.2。直至基础发酵培养基中的碳源(甘油)消耗完毕，此时菌体湿重达70-100g/L。
甘油富集阶段是指基础发酵培养基中的甘油消耗完毕后，往发酵罐内流加含PTM1的50％甘油，继续培养6-10h，至菌体湿重达220-240g/L。
甲醇-山梨糖醇共补碳源进行诱导阶段是指富集阶段结束后，停止流加甘油，溶氧跳升至接近100％后，使菌体饥饿0.5h以上以耗尽培养基中的甘油，然后流加含PTM1、甘氨酸、山梨糖醇的甲醇进行诱导表达，诱导条件：28±2℃，通气量1-1.5vvm，搅拌转速700rpm，调控溶氧10％-30％，氨水调节pH值5.0±0.2。补加甲醇诱导110-120h，当菌体湿重无明显增加后停止发酵，此时菌体湿重达350-370g/L。
(3)收集发酵液上清
发酵结束后，利用离心的方法实现固液分离，具体操作是：将发酵液转移至1000ml离心杯中，4℃、8000rpm条件下离心20min。收集发酵液上清，4℃存放。
本发明提供的制备方法中，在所述诱导之后还包括对发酵液进行分离纯化获得SAG重组抗原的步骤；所述分离纯化步骤包括：
利用中空纤维柱将发酵液进行浓缩、洗滤，依次经DEAE离子交换层析柱、ConA柱，获得纯度≥95％的SAG重组抗原。
本发明利用中空纤维柱对发酵液进行浓缩、洗滤，同时进行缓冲溶液的置换，以利于后续纯化。然后经过DEAE离子交换层析的方法进行目的蛋白的分离纯化，再利用ConA柱去除部分糖基化的蛋白，最终蛋白经SDS-PAGE及HPLC检测分析，纯度可接近100％。
本发明还提供了由以上方法制得的SAG重组抗原在制备检测弓形虫病的免疫抗体和/或免疫检测试剂盒中的应用。
所述免疫抗体包括IgG和/或IgM。
所述免疫检测试剂盒为弓形虫IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)。所述检测的样品为血清。
本发明对SAG抗原的编码序列进行了优化，获得了一种高效表达SAG抗原的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，并构建了含该SAG抗原的重组载体。与SAG未优化的编码序列相比，优化后的序列表达量显著提高，对IgM抗体表现出更高的灵敏度。另外，本发明还具有如下有益效果：
①与重组大肠杆菌表达系统相比，克服了易形成包涵体、复性困难且易丧失免疫学活性的问题；
②通过对外源基因密码子优化，保证目的蛋白氨基酸序列不变的基础上，将外源基因的密码子优化为毕赤酵母偏嗜类型，降低GC含量，提高了外源蛋白表达量，每升发酵液的SAG抗原含量可达120-150mg；
③通过对发酵过程DO及罐压的优化，以及对起始诱导菌体量的优化控制，采用甲醇-山梨醇共补碳源的策略，对获得的上清通过改进分离纯化工艺，可获得高纯度＞95％的SAG抗原产品。
附图说明
图1为发酵培养过程甲醇-山梨醇共补诱导表达阶段不同时间点取样的SDS-PAGE电泳结果，均为发酵上清原液，未经过浓缩处理；其中泳道1中M是Marker，泳道1-5分别为诱导60h、72h、96h、108h、120h；
图2为样品经ConA柱亲和层析过程以及浓缩后终样的SDS-PAGE电泳结果；其中，泳道1为ConA层析上样，泳道2为第一次流穿液(含目的蛋白)，泳道3为解离液①，泳道4为解离液②，泳道5为第二次流穿液(目的蛋白)，泳道6为解离液③，泳道7为样品浓缩目的蛋白浓缩过程的流穿液，泳道8为最终样品，纯度达95.9％，泳道9为是Marker；
图3为重组抗原SAG的WesternBlot检测结果；
图4为HPLC法对蛋白纯度鉴定结果；
图5为发酵液上清浓度的变化情况；
图6为诱导阶段菌体湿重的变化情况；
图7为优化后序列与野生编码序列相似度对比结果。
具体实施方式
本发明提供了编码弓形虫SAG重组抗原的核酸及其应用、该重组抗原的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
野生型SAG基因的长度为960bp，序列如SEQ ID NO:3所示。本发明中对SAG基因进行了优化，所进行的优化包括但不限于，密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量。
通过分析和试验筛选，最终得到如SEQ ID NO:1所示的优化序列。该序列经过特殊优化，转录水平略有提高，SAG抗原表达量显著提高。优化后的SEQ ID NO:1所示的编码序列与SEQ ID NO:3所示的野生编码序列相似度为73.56％，如图7所示。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1制备大量表达SAG抗原的重组毕赤酵母
第一步，经对弓形虫SAG膜表面抗原的分析和免疫效果比对，选取膜表面抗原SAG，经序列分析、优化后，利用同源克隆技术合成一个全长为960bp的SAG基因，该基因序列SEQID No:1为：
第二步，根据得到的基因序列和多克隆酶切位点，设计特异性引物进行扩增：
5’端引物为SAG-F1:5’-GTGTCGACATGTTTCCGAAGGCA-3’(SEQ ID No:4)
3’端引物为SAG-R1:5’-GGAAGCTTTCACGCGACACAAGCT-3’(SEQ ID No:5)
其中两条引物的5’端分别引入Sal I和HandIII限制性内切酶位点。引物序列包含起始密码子ATG和终止密码子TCA，GT和GG是两条引物5’端的保护性碱基。
以步骤一所得基因组DNA作为模板扩增反应；PCR反应使用50ul的反应体系，反应体系如下：
50μl PCR反应体系如下：
Figure BDA0003210992150000061
Figure BDA0003210992150000071
补H2O至50μl，
反应条件如下：
Figure BDA0003210992150000072
冷却至4℃，
反应结束，用移液枪吸取10μl进行电泳鉴定，胶回收得到扩增片段，并进行测序。
第三步，将第二步得到的正确的扩增片段与pPIC9K载体连接，整合到毕赤酵母GS115中而获得的基因工程菌，挑取阳性转化子，提取质粒经酶切鉴定后测序，最终得到重组产SAG膜表面抗原抗原的毕赤酵母。
实施例2SAG膜表面抗原的制备
第一步，种子液制备
取1支-80℃保存的甘油菌菌种，融化后，转接至含有50ml BMGY培养基的250ml锥形瓶中，于30℃，230rpm培养20h，得到一级种子。以10％的接种量将一级种子接入装有100ml BMGY培养基的1L锥形瓶中，30℃，230rpm培养15h，制备得到二级种子。
第二步，发酵培养
以8％的接种量将800ml二级种子转接至发酵罐中开始发酵培养，初始发酵条件设定为：转速300rpm，通气量1vvm，温度30℃，pH至用氨水调控至5.0左右。发酵过程维持通气量≥1vvm，并且通过调整转速使溶氧保持≥30％。待基础发酵培养基中的甘油消耗完毕后，溶氧出突然跳升至接近100％，经取样测定，菌体湿重达92.6g/L。然后，往发酵罐内流加含PTM1的50％甘油，进行富集培养，培养条件为30±2℃，通气量1-1.5vvm，搅拌转速700rpm，补加甘油饿速率为10ml/h/L，溶氧≥30％，pH值5.0±0.2；培养8.5h，菌体湿重达235.8g/L。
第三步，诱导表达
甘油富集阶段结束后，停止流加甘油，溶氧跳升至接近100％后，使菌体饥饿0.5h以上以耗尽培养基中的甘油，然后缓慢流加含PTM1的甲醇进行诱导表达，诱导条件：温度28℃，通气量1.5vvm，搅拌转速700rpm，调控溶氧20％-30％，氨水调节pH值5.0±0.1。诱导过程，持续补加甲醇114.5h，当菌体湿重无明显增加后停止发酵，此时菌体湿重达354.4g/L。
第四步，收集发酵液上清
发酵结束后，发酵液转移至1000ml离心杯中，4℃、8000rpm条件下离心20min。收集发酵液上清，共收获上清12.85L，4℃存放。
实施例3SAG抗原的分离纯化
第一步，目的蛋白的解离
将实施例2制得的发酵液利用中空纤维柱用20mM Tris-HCl pH 8.5进行浓缩、洗滤。将浓缩后的1L样品通过离子交换层析对目的蛋白进行初步纯化，用20mM Tris-HCl+0.02M NaClpH8.5平衡层析柱，上样，用20mM Tris-HCl+0.02M NaCl再次平衡层析柱至电导和紫外平衡，然后用20mM Tris-HCl+0.2MNaCl解离目的蛋白，解离样品进行样品透析处理。
第二步，糖基化处理
所收集样品再利用ConA柱去除部分糖基化的蛋白，首先，通过3次透析将样品透析至20mM Tris-HCl+500mM NaCl pH 7.4缓冲溶液中，冰浴条件下上样，收集流穿，然后将样品浓缩至2mg/ml，共收获样品405ml。分装后于-20℃保存。最终蛋白样品经SDS-PAGE、及HPLC检测分析，纯度达到95.9％。
对比例1
未优化的工艺：
1.甘油培养扩增阶段：搅拌速度为≤700rpm，温度控制在30±2℃，调节转速和通气量，维持DO在30％以上；
2.甘油富集阶段：当溶氧下降后又升至50％以上，开始流加50％甘油，起始流加速度为10ml/h/L，并观察DO变化，若30min后DO仍然大于30％，说明甘油不足，应增加补料速度，反之奕然，调节至合适补料速度
3.甲醇诱导；甘油流加完毕，饥饿2h，确保甘油全部消耗尽，开始甲醇诱导；
4.诱导表达后，每隔12h取样1次，测定湿重分析酵母生长状态，上清进行含量测定与电泳蛋白分析；
测试例1重现性验证试验
按照实施例2和对比例1的步骤进行发酵，取发酵后的上清液测定上清液浓度和菌体湿重，结果见图5和图6。
对实施例2和对比例1的发酵工艺进行重复性验证，测定目的蛋白的含量，计算得率，结果见表1。将实施例2制得的发酵液经纯化后，测定样品的纯度，样品纯度≥95％，说明本发明实施例2的发酵工艺稳定，重复性好，结果可靠。
表1
Figure BDA0003210992150000091
结果显示，相比对比例1的发酵工艺，本发明实施例2的工艺优化后，上清浓度较优化前提高了23.9％，诱导结束后菌体湿重较优化前提高了21.87％；经三次重复性验证，重现性结果较好，上清体积维持在12-13L之间，目的蛋白含量较优化前提高了36.84％；
测试例2
采用本发明SEQ ID No:4～5所示的引物对弓形虫病进行检测，分析检测的灵敏度和特异性，结果显示，分析灵敏度的最低检测限为0.22IU/ml，检测范围由优化前的0.31-650IU/mL提升至0.22-650IU/mL(由低浓度检测限制和主曲线最大值确定)，检测结果更加可靠。
备注：最低标准值+2SD(标准差)(母定标液，标准1+2SD，重复性研究，样本数21)；低于检测限制的值报告为＜0.22IU/mL，高于检测范围上限的值报告为＞650IU/mL(或大于13000IU/mL，对于20倍稀释样本)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州伊美诺生物技术有限公司
<120> 编码弓形虫SAG抗原的核酸及其应用、该抗原的制备方法
<130> MP21010792
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgttcccga aagcagttcg ccgcgccgtt accgccggtg tgtttgccgc cccgaccctg 60
atgtgttttc tgcgttgtgg cgtgatggcc agcgatccgc cgctggttgc caatcaggtt 120
gttacctgcc cggataaaaa aagtaccgcc gccgtgattg ttaccccgac cgaaaatcat 180
tttaccctga aatgcccgaa aaccgcactg accgaaccgc cgaccctggc atatagcccg 240
aatcgtgaaa tttgtccggc aggtaccacc agtagttgca cctgtaaagc cgtgaccctg 300
agtagcctga ttccggaagc cgaagatagt tggtggaccg gcgatagtgc aagcctggat 360
accgcaggca ttaaactgac cgttccgatt gaaaaatttc cggtgaccac ccagaccttt 420
gttgttggtt gtattaaagg tgatgatgcc cagagttgta tggtgaccgt taccgtgcag 480
gcacgcgcaa gcagcgtggt taataatgtg gcacgttgta gctatggtgc agatagtacc 540
ctgggcccgg tgaaactgag cgccgaaggc ccgaccacca tgaccctggt gtgcggtaaa 600
gatggtgtga aagttccgca ggataataat cagtattgca gcggtaccac cctgaccggc 660
tgcaatgaaa aaagctttaa agatattctg ccgaaactga ccgaaaatcc gtggcagggc 720
aatgcaagca gcgataaagg tgcaaccctg accattaaaa aagaagcctt tccggccgaa 780
agtaaaagtg tgattattgg ttgtaccggc ggcagcccgg aaaaacatca ttgtaccgtt 840
aaactggaat ttgccggcgc cgccggtagt gcaaaaagcg cagcaggtac cgcaagccat 900
gtgagcattt ttgccatggt tattggtctg attggtagta ttgccgcatg tgttgcctaa 960
<210> 2
<211> 319
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Phe Pro Lys Ala Val Arg Arg Ala Val Thr Ala Gly Val Phe Ala
1 5 10 15
Ala Pro Thr Leu Met Cys Phe Leu Arg Cys Gly Val Met Ala Ser Asp
20 25 30
Pro Pro Leu Val Ala Asn Gln Val Val Thr Cys Pro Asp Lys Lys Ser
35 40 45
Thr Ala Ala Val Ile Val Thr Pro Thr Glu Asn His Phe Thr Leu Lys
50 55 60
Cys Pro Lys Thr Ala Leu Thr Glu Pro Pro Thr Leu Ala Tyr Ser Pro
65 70 75 80
Asn Arg Glu Ile Cys Pro Ala Gly Thr Thr Ser Ser Cys Thr Cys Lys
85 90 95
Ala Val Thr Leu Ser Ser Leu Ile Pro Glu Ala Glu Asp Ser Trp Trp
100 105 110
Thr Gly Asp Ser Ala Ser Leu Asp Thr Ala Gly Ile Lys Leu Thr Val
115 120 125
Pro Ile Glu Lys Phe Pro Val Thr Thr Gln Thr Phe Val Val Gly Cys
130 135 140
Ile Lys Gly Asp Asp Ala Gln Ser Cys Met Val Thr Val Thr Val Gln
145 150 155 160
Ala Arg Ala Ser Ser Val Val Asn Asn Val Ala Arg Cys Ser Tyr Gly
165 170 175
Ala Asp Ser Thr Leu Gly Pro Val Lys Leu Ser Ala Glu Gly Pro Thr
180 185 190
Thr Met Thr Leu Val Cys Gly Lys Asp Gly Val Lys Val Pro Gln Asp
195 200 205
Asn Asn Gln Tyr Cys Ser Gly Thr Thr Leu Thr Gly Cys Asn Glu Lys
210 215 220
Ser Phe Lys Asp Ile Leu Pro Lys Leu Thr Glu Asn Pro Trp Gln Gly
225 230 235 240
Asn Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ala Thr Leu Thr Ile Lys Lys Glu Ala
245 250 255
Phe Pro Ala Glu Ser Lys Ser Val Ile Ile Gly Cys Thr Gly Gly Ser
260 265 270
Pro Glu Lys His His Cys Thr Val Lys Leu Glu Phe Ala Gly Ala Ala
275 280 285
Gly Ser Ala Lys Ser Ala Ala Gly Thr Ala Ser His Val Ser Ile Phe
290 295 300
Ala Met Val Ile Gly Leu Ile Gly Ser Ile Ala Ala Cys Val Ala
305 310 315
<210> 3
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtttccga aggcagtgag acgcgccgtc acggcagggg tgtttgccgc gcccacactg 60
atgtgcttct tgcgatgtgg tgttatggca tcggatcccc ctcttgttgc caatcaagtt 120
gtcacctgcc cagataaaaa atcgacagcc gcggtcattg tcacaccgac ggagaaccac 180
ttcactctca agtgccctaa aacagcgctc acagagcctc ccactcttgc gtactcaccc 240
aacagggaaa tctgcccagc gggtactaca agtagctgta catgcaaggc tgtaacattg 300
agctccttga ttcctgaagc agaagatagc tggtggacgg gggattctgc tagtctcgac 360
acggcaggca tcaaactcac agttccaatc gagaagttcc ccgtgacaac gcagacgttt 420
gtggtcggtt gcatcaaggg agacgacgca cagagttgta tggtcacagt gacagtacaa 480
gccagagcct catcggtcgt caataatgtc gcaaggtgct cctacggtgc agacagcact 540
cttggtcctg tcaagttgtc tgcggaagga cccactacaa tgaccctcgt gtgcgggaaa 600
gatggagtca aagttcctca agacaacaat cagtactgtt ccgggacgac gctgactggt 660
tgcaacgaga aatcgttcaa agatattttg ccaaaattaa ctgagaaccc gtggcagggt 720
aacgcttcga gtgataaggg tgccacgcta acgatcaaga aggaagcatt tccagccgag 780
tcaaaaagcg tcattattgg atgcacaggg ggatcgcctg agaagcatca ctgtaccgtg 840
aaactggagt ttgccggggc tgcagggtca gcaaaatcgg ctgcgggaac agccagtcac 900
gtttccattt ttgccatggt gatcggactt attggctcta tcgcagcttg tgtcgcgtga 960
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgtcgacat gtttccgaag gca 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggaagctttc acgcgacaca agct 24

Claims (13)

1.编码弓形虫SAG抗原的核酸，其为I～III中任意一种：
I、如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的核酸；或
II、SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸获得的核酸；或
III、与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同源性且编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的核酸。
2.包含权利要求1所述核酸的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，其骨架载体为pPIC9K。
4.转化有权利要求2或3所述重组载体的宿主菌。
5.根据权利要求4所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为毕赤酵母菌株。
6.权利要求1所述的核酸、权利要求2或3所述的重组载体、权利要求4或5所述的宿主菌在制备SAG重组抗原中的应用。
7.一种SAG重组抗原的制备方法，将权利要求4或5所述的宿主菌制成种子液，发酵培养，诱导SAG抗原的表达。
8.根据权利要求6所述的制备方法其特征在于，所述宿主菌种子液的制备方法包括以下步骤：
将-80℃保存的所述宿主菌的甘油菌接种至BMGY培养基中，培养至菌体OD600达到3-5，得到一级种子液；
将所述一级种子液按10vol％的接种量转接至BMMY培养基中，培养至菌体OD600达到10-15，得到二级种子液。
所述培养的条件为：以pH值5.0±0.2的BMGY为种子培养基，30℃，摇床转速为200-300rpm，培养时间为16-20h；
所述BMGY培养基包括水、生物素和酵母粉10g/L、胰蛋白胨20g/L、甘油10ml/L；所述生物素按1：1000的体积比添加。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养包括分批培养阶段、甘油富集阶段以及甲醇诱导阶段，具体包括以下步骤：
将二级种子液转接至发酵罐中进行发酵培养，直至基础发酵培养基中的碳源(甘油)消耗完毕；培养条件：30±2℃，通气量1-1.5vvm，搅拌转速500-700rpm，调控溶氧≥30％，pH值5.0±0.2。此时菌体湿重达70-100g/L。
(2)甘油富集阶段：流加含微量元素的50％甘油，继续培养6-10h，至菌体湿重达220-240g/L；所述培养的条件为30±2℃，通气量1-1.5vvm，搅拌转速700rpm，补加甘油饿速率为10ml/h/L，溶氧≥30％，pH值5.0±0.2。
(3)甲醇诱导阶段：所述富集阶段结束后，停止流加甘油，溶氧跳升至接近95±5％后，使菌体饥饿0.5h以上，然后流加含微量元素的甲醇-山梨糖醇共补碳源进行诱导表达；
所述诱导表达的条件为：28±2℃，通气量1-1.5vvm，搅拌转速500-700rpm，调控溶氧10％-30％，pH值5.0±0.2，罐内压维持在0.05-0.065MPa；所述甲醇-山梨糖醇共补诱导的时间为110-120h。
所述BSM培养基包括水和如下组分：
85％磷酸26.7ml/L，硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，氢氧化钾4.31g/L，七水合硫酸镁14.9g/L，甘油200g/L，微量元素溶液12ml/L。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述微量元素溶液包括水和：CuSO4·5H2O 6g/L，碘化钠0.08g/L，MnSO4·H2O 3g/L，钼酸钠0.2g/L，氯化钴0.5g/L，生物素0.2g/L，硫酸锌20g/L，七水硫酸亚铁65g/L，硫酸5ml/L，0.22μm滤膜过滤除菌。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述甲醇-山梨糖醇共补培养基包括：山梨糖醇500g/L，丙氨酸12g/L，纯化水溶解后采用0.22um滤膜过滤除菌，每升甲醇中添加22ml。
12.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在所述诱导之后还包括对发酵液进行分离纯化获得SAG重组抗原的步骤；所述分离纯化步骤包括：
利用中空纤维柱将发酵液进行浓缩、洗滤，依次经DEAE离子交换层析柱、ConA柱，获得纯度≥95％的SAG重组抗原。
13.权利要求7-12任一项所述方法制备的SAG重组抗原在制备检测弓形虫病的免疫抗体和/或免疫检测试剂盒中的应用。
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