JPH03279861A - 分析物の測定方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
［０００１］
本発明は、不均質酵素−免疫測定法による試料液中の分
析物の検出方法およびそのための適切な試験薬に関する
ものである。 ［０００２］
析物の検出方法およびそのための適切な試験薬に関する
ものである。 ［０００２］
酵素−免疫測定法は、ますます、従来の慣用の放射免疫
測定法に取って代わりつつある。免疫測定法において免
疫学的に反応性の化合物を標識するために酵素を使用す
ることは、特に、安全性に関する技術的利点を有してい
る。このような酵素−免疫測定法は、例えば、米国特許
ＵＳ−Ａ−４，４４６，２３２に開示されている。この
方法は、試料中に含有される分析物によって第１帯域か
ら酵素結合抗体を放出させることに基づいており、該酵
素標識は適切な酵素基質との反応によって第２帯域にお
いて可視化される。第１および第２帯域は、多孔性物質
からなっている。しかしながら、この方法は、第２帯域
の多孔性物質がほとんど透明ではないので、形成された
色素を透過測光法（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｐｈｏ
ｔｏｍｅｔｒｙ）によって測定することができないとい
う欠点を有していることが分かった。 ［０００３］ 免疫学的反応後、遠心分離によって第１帯域から液体を
取り出し、キュベツトに供給し、次いで、呈色反応を測
定する酵素−免疫測定法が欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０１
８５３７２に開示されている。第１帯域の多孔性物質か
ら液体を完全に取り出すことは、固相が検出を妨げない
という利点を有しているが、しかし、固相から液体の完
全な分離を行わなければならない追加の工程が不便であ
る。 ［０００４］ 不均質酵素−免疫測定法は、しばしば、いわゆる管の中
でも行われる。この管の滑らかな内側は固相としての役
をする。これらの管試、験は、分析物が固定され得る免
疫学的に活性な物質が少量しか固相に固定されないとい
う欠点を有する。 さらに、このような試験に関するインキュベーション時
間は、非常に長い。これらの管試験は、管の中に残って
いる残存物が測定に影響を与えるので、インキュベーシ
ョン後、該管からインキュベーション溶液をできる限り
完全に除去しなげればならないという欠点も有する。 ［０００５］
測定法に取って代わりつつある。免疫測定法において免
疫学的に反応性の化合物を標識するために酵素を使用す
ることは、特に、安全性に関する技術的利点を有してい
る。このような酵素−免疫測定法は、例えば、米国特許
ＵＳ−Ａ−４，４４６，２３２に開示されている。この
方法は、試料中に含有される分析物によって第１帯域か
ら酵素結合抗体を放出させることに基づいており、該酵
素標識は適切な酵素基質との反応によって第２帯域にお
いて可視化される。第１および第２帯域は、多孔性物質
からなっている。しかしながら、この方法は、第２帯域
の多孔性物質がほとんど透明ではないので、形成された
色素を透過測光法（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｐｈｏ
ｔｏｍｅｔｒｙ）によって測定することができないとい
う欠点を有していることが分かった。 ［０００３］ 免疫学的反応後、遠心分離によって第１帯域から液体を
取り出し、キュベツトに供給し、次いで、呈色反応を測
定する酵素−免疫測定法が欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０１
８５３７２に開示されている。第１帯域の多孔性物質か
ら液体を完全に取り出すことは、固相が検出を妨げない
という利点を有しているが、しかし、固相から液体の完
全な分離を行わなければならない追加の工程が不便であ
る。 ［０００４］ 不均質酵素−免疫測定法は、しばしば、いわゆる管の中
でも行われる。この管の滑らかな内側は固相としての役
をする。これらの管試、験は、分析物が固定され得る免
疫学的に活性な物質が少量しか固相に固定されないとい
う欠点を有する。 さらに、このような試験に関するインキュベーション時
間は、非常に長い。これらの管試験は、管の中に残って
いる残存物が測定に影響を与えるので、インキュベーシ
ョン後、該管からインキュベーション溶液をできる限り
完全に除去しなげればならないという欠点も有する。 ［０００５］
本発明は、従来技術の欠点を回避すること、特に、より
簡単な、より速い、またはより感受性のある酵素−免疫
測定法を提供することである。 ［０００６］
簡単な、より速い、またはより感受性のある酵素−免疫
測定法を提供することである。 ［０００６］
この目的は、以下に記載の本発明によって達成される。
［０００７］
本発明は、酵素−標識化合物を固相と液相の間で分配し
、固相以外の液相中の酵素標識の量を分析物の濃度に関
する尺度として測定する酵素−免疫測定法による試料液
中の分析物の検出方法であって、この測定が非孔質成形
品中で行われ、その中に含まれる液相が固相と接してい
ることを特徴とする検出方法を提供するものである。 ［０００８］ 本発明方法は、今までに知られているいわゆる不均質酵
素−免疫測定法に基づく改良方法である。このような免
疫測定法は、例えば、ミットタイルンゲン・デル・ドイ
ッチェン・ゲゼルシャフト・ヒュール・クリニッシエ・
ヒエミー（Ｍｉｔｔｅｉｌｕｎｇｅｎ ｄｅｒ Ｄｅｕ
ｔｓｃｈｅｎ Ｇｅ５ｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｆｕｅｒ
Ｋ１１ｎｉｓｃｈｅ Ｃｈｅｍｉｅ）、第５巻、第２９
１頁〜第３０２頁（１９８６年）に開示されている。こ
れら酵素−免疫測定法の全ての基礎は、酵素標識された
免疫学的に活性な化合物ならびに固相および液相の使用
である。免疫学的に活性な化合物を固相に固定し、酵素
標識化合物と直接または、例えば測定されるべき分析物
を介して間接的に反応させそれを固定することができる
。この試験方法によって、固定された免疫学的に活性な
化合物は、分析物との免疫学的反応の成分または分析物
類似体または分析物である。この反応は酵素標識化合物
の一部分を固定するかまたは固定したまま行うことがで
き、結果、規定された量の酵素標識化合物が液相中に残
存し、そして固相上または液相中のいずれかの酵素標識
の量が分析物の濃度に関する尺度となる。本発明方法に
おいて、酵素標識の量は、液相中で測定される。 ［０００９］ 全ての免疫学的に活性な化合物が分析物として考慮され
る。このような化合物は、免疫学的な対または複合物の
成分であり、特に、ハプテン、抗原または抗体である。 ［００１０１ 試料液は、特に、体液またはそれから誘導される液体と
して理解される。体液としては、例えば、血液および尿
が挙げられる。これらの液体から誘導される試料液は、
例えば、これらの液体の希釈もしくは濃縮によって、ま
たはこの液体からの固有成分、例えば血清もしくは血漿
の添加もしくは除去によって得ることができるものであ
る。 ［００１１］ 大きい活性表面を有する全ての物質が本発明の範囲内の
固相として好適である。これは、上記液体を吸収する能
力があり、これら液体をそれらを介して流通させること
ができる全ての多孔性固体を含む。フリースげ１ｅｅｃ
ｅ）および織物が特に好適である。固相に関して好適な
物質は、例えば米国特許ＵＳ−Ａ−４，４４６゜２３２
によって当業者に公知である。これらは、セルロースお
よびセルロースと好適なプラスチックとの混合物も含む
。さらに、この固相は、酵素標識化合物の固定化に関係
する酵素−免疫測定法を行うのに適している固定された
免疫学的に活性な化合物も含有する。このような面相を
用いる試験が迅速な免疫測定法に特によく適しているこ
とが分かっている。 ［００１２］ 酵素標識化合物は、免疫学的反応の成分および酵素から
なる化学的化合物である。免疫学的反応の成分は、ハプ
テン、抗原または抗体からなる群から選択され分析物の
タイプおよび試験方法のタイプに依存する。特に、ヒド
ロラーゼおよびレドックス反応を触媒化する酵素は、酵
素活性の測定を可能にする基質が入手可能である酵素と
して考えられる。β−ガラクトシダーゼおよびペルオキ
シダーゼは、特に適していることが証明されている。 ［００１３］ 酵素標識の量の測定は、固相と液相との間で酵素標識化
合物を分配させた後、非孔を容器中で行われる。このた
めに、液相の少なくとも一部分が固相の孔から取り出さ
れ、その表面上に出される。その時、液相は固相と接触
したままである。試料液は、好ましくは、別の液体によ
って固相の孔から追い出される。 ［００１４］ 酵素標識の量は、適切な基質と酵素との反応をモニター
することによって測定される。酵素標識および適切な基
質との反応を行うことの長所は、得られる試験の高い感
受性である。該基質が検出可能な化合物へ酵素反応によ
って転換されるか、または検出可能な化合物がそれから
放出されるか、または次の反応において検出可能にする
ことができる量の化合物を生じる。酵素がヒドロラーゼ
である場合、例えば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０１５６
３４７に開示されているように、色素産生およびフッ素
産生げ１ ｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）基質を使用することが
できる。酵素基質を、例えば、非孔質成形品中で液相に
添加することができる。しかしながら、該基質は、好ま
しくは、多孔性物質から試料液体を追い出す液体中に含
有される。この場合、使用される置換液体の量は、該液
体の少なくとも一部分が非孔質成形品中に溢れる程度で
ある。該成形品は、例えば、キュベツトのような容器の
内部または２つの壁の間の狭い空間であり得る。非孔質
成形品の使用の長所は、感受性が明らかに増大すること
である。これは、反射測光法および透過測光法の場合に
適用される。 ［００１５］ 結合した酵素が検出可能な物質を実際に絶えず放出する
ことができ、これを成形品中に拡散させることができる
ので、非孔質成形品と液体接触する固相に結合した酵素
標識がこの成形品中での測定を妨害しないことは非常に
驚くことである［００１６］ この測定法は非孔質成形品中で行われるので、測定は、
透過測光法によって行うことができる。従来技術の試験
ストリップと比較して、非孔質成形品中での測定は非常
によりよい感受性であり得るという長所を有している。 ［００１７］ 本発明の方法は、図１に示されるようなキュベツトまた
は図２（縦断面図）に示されるような試、験ストリップ
における分析物の検出に特に適している。図３は、図２
の試験ストリップの製造工程を示す。 ［００１８］ 図１の助けをかりて、好ましい具体例を説明する。装置
１は、上部領域２ａと多孔性物質３（マトリックス）が
固定されている下部２ｂを有するキュベツト２とからな
る。キュベツトにマトリックスを接着することによって
固定することができるか、またはマトリックスをキュベ
ツト中に嵌め込むことができる。少なくともキュベツト
の一部分２ａは、電磁波に対して透過性であり、特に、
標識を測定するのに必要とされる波長の光に対して透過
性である。試料および、所望により、補助試薬を多孔性
物質３上にピペットで移す。ピペットで移される液体の
量は、好ましくは、多孔性物質の飽和量を越えるべきで
ない。 ［００１９］ 酵素標識化合物を孔質マトリックスと液相との間で分配
するインキュベーション期間の後、該装置は、例えばマ
トリックスの上に降ろした針５の助けをかりてマトリッ
クスを介して充填される。この方法において、マトリッ
クスの孔中に含まれる液相は、溶液によってマトリック
スから実質的に完全に追い出される。 該置換溶液は、酵素標識に関する基質を含有する。 ［００２０］ 第２のインキュベーション期間の後、色素展開を上澄み
液４（領域２ａ中）中で測定する。しかしながら、上澄
み液中における色素展開は、動力学的測定によって第２
のインキュベーション期間なしで直接測定することもで
きる。 ［００２１］ 多孔性物質を介して、基質を含有しない緩衝液で装置を
部分的に満たし、次に上澄み液に基質溶液を添加するこ
とも可能である。 ［００２２］ さらなる具体例によって、本発明の方法は、図２の試験
ストリップ中で行われる。試験ストリップ１０は、ベー
スホイル１１上に、少なくとも部分的にホイル１３によ
って覆われている多孔性マトリックス１２を有する。多
孔性マトリックス１２と接するホイル１３およびベース
ホイル１１は、非孔質空間１５を形成する。この空間は
、好ましくは、通気口１４を含む。該ホイルとしては、
試験ストリップに関する公知の不活性プラスチックホイ
ルが好適である。 ［００２３］ 試験ストリップ１０によって本発明の方法を行うために
、試料液および、所望により酵素免疫検査法に必要な他
の試薬を多孔性マトリックス１２に適用する。 これは、例えば、試料適用装置１６を介して行うことが
できる。インキュベーション期間の後、容器１５は、置
換液でマトリックス１２を介して満たされる。これに関
して、置換液は、充填口１７を介して充填されることが
できる。置換液は、既に酵素基質を含んでいることがで
きる。置換液は、マトリックスから液相を追い出す。酵
素標識の量は、キュベツト様空間１５中における色素展
開の測定によって決定される。レミッション（ｒｅｍ
ｉ ｓｓ ｉ ｏｎ ）測光法による測定に関して、ホ
イル１３および１１のうちの一方は透明であり、他方は
光を反射させる。両ホイルは、好ましくは、透過測光法
による測定のために透明である。図面の平面に対して垂
直方向の測定も可能である。 ［００２４］ 図２の試験ストリップは、図３に従って３つのホイルと
固体マトリックス１２を一緒に接着させることによって
製造され得る。 ［００２５］ この場合、ベースホイル１１は、反射されるかまたは透
明であり、ホイル１８の一部は穴があけられており、好
ましくはホイル１１および１３よりも厚く、好ましくは
固体担体１２と同じくらい厚い。ホイル１３は試料適用
装置１６、充填口１７および通気口１４を有する。
、固相以外の液相中の酵素標識の量を分析物の濃度に関
する尺度として測定する酵素−免疫測定法による試料液
中の分析物の検出方法であって、この測定が非孔質成形
品中で行われ、その中に含まれる液相が固相と接してい
ることを特徴とする検出方法を提供するものである。 ［０００８］ 本発明方法は、今までに知られているいわゆる不均質酵
素−免疫測定法に基づく改良方法である。このような免
疫測定法は、例えば、ミットタイルンゲン・デル・ドイ
ッチェン・ゲゼルシャフト・ヒュール・クリニッシエ・
ヒエミー（Ｍｉｔｔｅｉｌｕｎｇｅｎ ｄｅｒ Ｄｅｕ
ｔｓｃｈｅｎ Ｇｅ５ｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｆｕｅｒ
Ｋ１１ｎｉｓｃｈｅ Ｃｈｅｍｉｅ）、第５巻、第２９
１頁〜第３０２頁（１９８６年）に開示されている。こ
れら酵素−免疫測定法の全ての基礎は、酵素標識された
免疫学的に活性な化合物ならびに固相および液相の使用
である。免疫学的に活性な化合物を固相に固定し、酵素
標識化合物と直接または、例えば測定されるべき分析物
を介して間接的に反応させそれを固定することができる
。この試験方法によって、固定された免疫学的に活性な
化合物は、分析物との免疫学的反応の成分または分析物
類似体または分析物である。この反応は酵素標識化合物
の一部分を固定するかまたは固定したまま行うことがで
き、結果、規定された量の酵素標識化合物が液相中に残
存し、そして固相上または液相中のいずれかの酵素標識
の量が分析物の濃度に関する尺度となる。本発明方法に
おいて、酵素標識の量は、液相中で測定される。 ［０００９］ 全ての免疫学的に活性な化合物が分析物として考慮され
る。このような化合物は、免疫学的な対または複合物の
成分であり、特に、ハプテン、抗原または抗体である。 ［００１０１ 試料液は、特に、体液またはそれから誘導される液体と
して理解される。体液としては、例えば、血液および尿
が挙げられる。これらの液体から誘導される試料液は、
例えば、これらの液体の希釈もしくは濃縮によって、ま
たはこの液体からの固有成分、例えば血清もしくは血漿
の添加もしくは除去によって得ることができるものであ
る。 ［００１１］ 大きい活性表面を有する全ての物質が本発明の範囲内の
固相として好適である。これは、上記液体を吸収する能
力があり、これら液体をそれらを介して流通させること
ができる全ての多孔性固体を含む。フリースげ１ｅｅｃ
ｅ）および織物が特に好適である。固相に関して好適な
物質は、例えば米国特許ＵＳ−Ａ−４，４４６゜２３２
によって当業者に公知である。これらは、セルロースお
よびセルロースと好適なプラスチックとの混合物も含む
。さらに、この固相は、酵素標識化合物の固定化に関係
する酵素−免疫測定法を行うのに適している固定された
免疫学的に活性な化合物も含有する。このような面相を
用いる試験が迅速な免疫測定法に特によく適しているこ
とが分かっている。 ［００１２］ 酵素標識化合物は、免疫学的反応の成分および酵素から
なる化学的化合物である。免疫学的反応の成分は、ハプ
テン、抗原または抗体からなる群から選択され分析物の
タイプおよび試験方法のタイプに依存する。特に、ヒド
ロラーゼおよびレドックス反応を触媒化する酵素は、酵
素活性の測定を可能にする基質が入手可能である酵素と
して考えられる。β−ガラクトシダーゼおよびペルオキ
シダーゼは、特に適していることが証明されている。 ［００１３］ 酵素標識の量の測定は、固相と液相との間で酵素標識化
合物を分配させた後、非孔を容器中で行われる。このた
めに、液相の少なくとも一部分が固相の孔から取り出さ
れ、その表面上に出される。その時、液相は固相と接触
したままである。試料液は、好ましくは、別の液体によ
って固相の孔から追い出される。 ［００１４］ 酵素標識の量は、適切な基質と酵素との反応をモニター
することによって測定される。酵素標識および適切な基
質との反応を行うことの長所は、得られる試験の高い感
受性である。該基質が検出可能な化合物へ酵素反応によ
って転換されるか、または検出可能な化合物がそれから
放出されるか、または次の反応において検出可能にする
ことができる量の化合物を生じる。酵素がヒドロラーゼ
である場合、例えば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０１５６
３４７に開示されているように、色素産生およびフッ素
産生げ１ ｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）基質を使用することが
できる。酵素基質を、例えば、非孔質成形品中で液相に
添加することができる。しかしながら、該基質は、好ま
しくは、多孔性物質から試料液体を追い出す液体中に含
有される。この場合、使用される置換液体の量は、該液
体の少なくとも一部分が非孔質成形品中に溢れる程度で
ある。該成形品は、例えば、キュベツトのような容器の
内部または２つの壁の間の狭い空間であり得る。非孔質
成形品の使用の長所は、感受性が明らかに増大すること
である。これは、反射測光法および透過測光法の場合に
適用される。 ［００１５］ 結合した酵素が検出可能な物質を実際に絶えず放出する
ことができ、これを成形品中に拡散させることができる
ので、非孔質成形品と液体接触する固相に結合した酵素
標識がこの成形品中での測定を妨害しないことは非常に
驚くことである［００１６］ この測定法は非孔質成形品中で行われるので、測定は、
透過測光法によって行うことができる。従来技術の試験
ストリップと比較して、非孔質成形品中での測定は非常
によりよい感受性であり得るという長所を有している。 ［００１７］ 本発明の方法は、図１に示されるようなキュベツトまた
は図２（縦断面図）に示されるような試、験ストリップ
における分析物の検出に特に適している。図３は、図２
の試験ストリップの製造工程を示す。 ［００１８］ 図１の助けをかりて、好ましい具体例を説明する。装置
１は、上部領域２ａと多孔性物質３（マトリックス）が
固定されている下部２ｂを有するキュベツト２とからな
る。キュベツトにマトリックスを接着することによって
固定することができるか、またはマトリックスをキュベ
ツト中に嵌め込むことができる。少なくともキュベツト
の一部分２ａは、電磁波に対して透過性であり、特に、
標識を測定するのに必要とされる波長の光に対して透過
性である。試料および、所望により、補助試薬を多孔性
物質３上にピペットで移す。ピペットで移される液体の
量は、好ましくは、多孔性物質の飽和量を越えるべきで
ない。 ［００１９］ 酵素標識化合物を孔質マトリックスと液相との間で分配
するインキュベーション期間の後、該装置は、例えばマ
トリックスの上に降ろした針５の助けをかりてマトリッ
クスを介して充填される。この方法において、マトリッ
クスの孔中に含まれる液相は、溶液によってマトリック
スから実質的に完全に追い出される。 該置換溶液は、酵素標識に関する基質を含有する。 ［００２０］ 第２のインキュベーション期間の後、色素展開を上澄み
液４（領域２ａ中）中で測定する。しかしながら、上澄
み液中における色素展開は、動力学的測定によって第２
のインキュベーション期間なしで直接測定することもで
きる。 ［００２１］ 多孔性物質を介して、基質を含有しない緩衝液で装置を
部分的に満たし、次に上澄み液に基質溶液を添加するこ
とも可能である。 ［００２２］ さらなる具体例によって、本発明の方法は、図２の試験
ストリップ中で行われる。試験ストリップ１０は、ベー
スホイル１１上に、少なくとも部分的にホイル１３によ
って覆われている多孔性マトリックス１２を有する。多
孔性マトリックス１２と接するホイル１３およびベース
ホイル１１は、非孔質空間１５を形成する。この空間は
、好ましくは、通気口１４を含む。該ホイルとしては、
試験ストリップに関する公知の不活性プラスチックホイ
ルが好適である。 ［００２３］ 試験ストリップ１０によって本発明の方法を行うために
、試料液および、所望により酵素免疫検査法に必要な他
の試薬を多孔性マトリックス１２に適用する。 これは、例えば、試料適用装置１６を介して行うことが
できる。インキュベーション期間の後、容器１５は、置
換液でマトリックス１２を介して満たされる。これに関
して、置換液は、充填口１７を介して充填されることが
できる。置換液は、既に酵素基質を含んでいることがで
きる。置換液は、マトリックスから液相を追い出す。酵
素標識の量は、キュベツト様空間１５中における色素展
開の測定によって決定される。レミッション（ｒｅｍ
ｉ ｓｓ ｉ ｏｎ ）測光法による測定に関して、ホ
イル１３および１１のうちの一方は透明であり、他方は
光を反射させる。両ホイルは、好ましくは、透過測光法
による測定のために透明である。図面の平面に対して垂
直方向の測定も可能である。 ［００２４］ 図２の試験ストリップは、図３に従って３つのホイルと
固体マトリックス１２を一緒に接着させることによって
製造され得る。 ［００２５］ この場合、ベースホイル１１は、反射されるかまたは透
明であり、ホイル１８の一部は穴があけられており、好
ましくはホイル１１および１３よりも厚く、好ましくは
固体担体１２と同じくらい厚い。ホイル１３は試料適用
装置１６、充填口１７および通気口１４を有する。
【００２６】
試料および置換液の移動は、加圧下で（傾けるがまたは
ピペットで移す）、または毛管現象によって生じること
ができる。後者の場合、キュベツトは、１１と１３との
間に１ ｍｍ以下の厚さの層を有するべきである。試験
ストリップにおける本発明方法の具体例は、簡単にピペ
ットで移すことによって（手動的にも）反応を開始する
ことができ、可視的に評価することができるという長所
を有する。 ［００２７］ 上記酵素−免疫測定法は、以下のとおり、本発明の方法
を行うのに適し得る。
ピペットで移す）、または毛管現象によって生じること
ができる。後者の場合、キュベツトは、１１と１３との
間に１ ｍｍ以下の厚さの層を有するべきである。試験
ストリップにおける本発明方法の具体例は、簡単にピペ
ットで移すことによって（手動的にも）反応を開始する
ことができ、可視的に評価することができるという長所
を有する。 ［００２７］ 上記酵素−免疫測定法は、以下のとおり、本発明の方法
を行うのに適し得る。
【Ｏ○２８】
１、置換試験
酵素と分析物の免疫学的相手とのコンジュゲート体を、
多孔性物質上に固定された分析物または分析物類似体と
の免疫複合体を介して多孔性物質に結合させる。試料と
一緒に多孔性マトリックスをインキュベートすることに
よって、該コンジュゲート体が多孔性物質から液相中に
部分的に分離され、自由に動く分析物と結合する。この
ように固定された分析物または分析物類似体は該分析物
によって置換される。多孔性物質から液相への置換の後
、コンジュゲート体−分析物複合体の量を液相中で測定
する。 ［００２９］ ２、ＩＥＭＡ 分析物を含む試料および分析物に向かって指向する酵素
コンジュゲート体を、必要であれば予備インキュベーシ
ョンの後、多孔性マトリックス上にピペットで移す。該
マトリックスは、遊離コンジュゲート体に関する結合部
位を含む。液相置換の後、分析物とコンジュゲート体と
の複合体を液相中で測定する。 ［００３０］ ３、競合試験 限定量の分析物の免疫学的相手を多孔性物質に固定する
。分析物を含有する試料および既知の濃度の分析物また
は分析物類似体と酵素とのコンジュゲート体を多孔性物
質上にピペットする。分析物とコンジュゲート体は多孔
性物質の結合部位に関して競合する。置換の後、コンジ
ュゲート体の量を液相中で測定する。 ［００３１］ 競合試験のさらなる具体例において、ポリハプテンのタ
ンパク部分に対する抗体を多孔性物質に固定する。ポリ
ハプテンは、例えば、Ｔ４およびＩｇＧのコンジュゲー
ト体である。ポリハプテン（結合試料を有し、かつ既知
の濃度である）、試料および抗体（Ａ Ｂ ）と酵素（
既知の濃度）とのコンジュゲート体を多孔性物質上にピ
ペットで移す。ポリハプテンと試料はコンジュゲート体
に関して競合する。 ポリハプテンとポリハプテンコンジュゲート体複合体を
多孔性物質に結合させる。液相中の複合試料／コンジュ
ゲート体を置換の後に測定する。 ［００３２］ ４、サンドウィッチ試験 分析物に対する抗体（ＡＢ １）を多孔性物質に結合
させる。分析物を含有する試料および酵素と分析物に対
する抗体とのコンジュゲート体（既知の濃度）を多孔性
物質上にピペットで移す。インキュベーション期間およ
び置換の後、非結合コンジュゲート体を液相中で測定す
る。抗体ＡＢ １に対する抗体ＡＢ ２も多孔性物
質に結合させることができる。その時、インキュベーシ
ョンは、試料、コンジュゲート体およびＡＢ １と一
緒である。 ［００３３］ 酵素免疫測定法を行うために必要な試薬は公知であり、
本発明方法において同様に使用することができる。 ［００３４］ 特に、上記試験ストリップのうちの１つにおいて免疫測
定法を行う場合、酵素標識は、いわゆる直接標識によっ
て置換されることもできる。直接標識としては、例えば
、色素、蛍光色素、固体粒子、特に金の金属ゾルまたは
セレンもしくはテルルのような非金属もしくはその酸化
物が挙げられる。このような直接標識およびそれらを用
いる標識化合物の製造は、当業者には公知である。かり
に、これらを用いる場合、面相から液相を完全に分離す
ることが必要ではなく、直接標識を用いる試験がパッド
における測定よりもより高い感受性を有するとしても、
この試験における酵素標識の使用には、−様に高い感受
性の可能性がある。 ［００３５］ 図１は、本発明のキュベツトの中央部を通る断面図であ
る。 ［００３６］ 図２は、本発明の試験ストリップの中央部を通る縦断面
図である。 ［００３７］ 図３は、図２の本発明の試験ストリップの個々の構成素
子を説明する図である［００３８］ 以下の実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する
。 ［００３９］
多孔性物質上に固定された分析物または分析物類似体と
の免疫複合体を介して多孔性物質に結合させる。試料と
一緒に多孔性マトリックスをインキュベートすることに
よって、該コンジュゲート体が多孔性物質から液相中に
部分的に分離され、自由に動く分析物と結合する。この
ように固定された分析物または分析物類似体は該分析物
によって置換される。多孔性物質から液相への置換の後
、コンジュゲート体−分析物複合体の量を液相中で測定
する。 ［００２９］ ２、ＩＥＭＡ 分析物を含む試料および分析物に向かって指向する酵素
コンジュゲート体を、必要であれば予備インキュベーシ
ョンの後、多孔性マトリックス上にピペットで移す。該
マトリックスは、遊離コンジュゲート体に関する結合部
位を含む。液相置換の後、分析物とコンジュゲート体と
の複合体を液相中で測定する。 ［００３０］ ３、競合試験 限定量の分析物の免疫学的相手を多孔性物質に固定する
。分析物を含有する試料および既知の濃度の分析物また
は分析物類似体と酵素とのコンジュゲート体を多孔性物
質上にピペットする。分析物とコンジュゲート体は多孔
性物質の結合部位に関して競合する。置換の後、コンジ
ュゲート体の量を液相中で測定する。 ［００３１］ 競合試験のさらなる具体例において、ポリハプテンのタ
ンパク部分に対する抗体を多孔性物質に固定する。ポリ
ハプテンは、例えば、Ｔ４およびＩｇＧのコンジュゲー
ト体である。ポリハプテン（結合試料を有し、かつ既知
の濃度である）、試料および抗体（Ａ Ｂ ）と酵素（
既知の濃度）とのコンジュゲート体を多孔性物質上にピ
ペットで移す。ポリハプテンと試料はコンジュゲート体
に関して競合する。 ポリハプテンとポリハプテンコンジュゲート体複合体を
多孔性物質に結合させる。液相中の複合試料／コンジュ
ゲート体を置換の後に測定する。 ［００３２］ ４、サンドウィッチ試験 分析物に対する抗体（ＡＢ １）を多孔性物質に結合
させる。分析物を含有する試料および酵素と分析物に対
する抗体とのコンジュゲート体（既知の濃度）を多孔性
物質上にピペットで移す。インキュベーション期間およ
び置換の後、非結合コンジュゲート体を液相中で測定す
る。抗体ＡＢ １に対する抗体ＡＢ ２も多孔性物
質に結合させることができる。その時、インキュベーシ
ョンは、試料、コンジュゲート体およびＡＢ １と一
緒である。 ［００３３］ 酵素免疫測定法を行うために必要な試薬は公知であり、
本発明方法において同様に使用することができる。 ［００３４］ 特に、上記試験ストリップのうちの１つにおいて免疫測
定法を行う場合、酵素標識は、いわゆる直接標識によっ
て置換されることもできる。直接標識としては、例えば
、色素、蛍光色素、固体粒子、特に金の金属ゾルまたは
セレンもしくはテルルのような非金属もしくはその酸化
物が挙げられる。このような直接標識およびそれらを用
いる標識化合物の製造は、当業者には公知である。かり
に、これらを用いる場合、面相から液相を完全に分離す
ることが必要ではなく、直接標識を用いる試験がパッド
における測定よりもより高い感受性を有するとしても、
この試験における酵素標識の使用には、−様に高い感受
性の可能性がある。 ［００３５］ 図１は、本発明のキュベツトの中央部を通る断面図であ
る。 ［００３６］ 図２は、本発明の試験ストリップの中央部を通る縦断面
図である。 ［００３７］ 図３は、図２の本発明の試験ストリップの個々の構成素
子を説明する図である［００３８］ 以下の実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する
。 ［００３９］
実施例１
アルブミン試験
図１の装置を用いて、この試験を行った。キュベツト２
は容量１ｍｌを有した。 ドイツ特許出願ＤＥ−Ａ−３８４２７００に従って、ア
ルブミンを固定したパッド（８０％ポリエステル、２０
％スルファイトパルプ、高さ＝０．８ｍｍ、長さ×輻＝
１ｃｍＸ０．５ｃｍ）を多孔性マトリックスとして用い
た。この固定されたアルブミンに、免疫学的複合体を介
して、アルブミンに対する抗体とβ−ガラクトシダーゼ
とのコンジュゲート体２００ｍＵを結合させる。該パッ
ド物質の上にアルブミン含有試料液体２０μｍをピペッ
トで移す。５分後、該装置に、パッド物質を介して、ク
ロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトシドの溶液（
濃度３ミリモルへペス（Ｈｅｐｅｓ） ５０ミリモル、
ｐＨ７，５、量１ｍ１）を充填する。さらに５分後、慣
用の光度計で、５７０ｎｍでの上澄み液の吸光度を測定
する。 ［００４０］ 尿中のアルブミンの定量測定に関して、既知のアルブミ
ン含有量の試料液体による目盛り曲線を確立する。結果
を表１に示す。 ［００４１］
は容量１ｍｌを有した。 ドイツ特許出願ＤＥ−Ａ−３８４２７００に従って、ア
ルブミンを固定したパッド（８０％ポリエステル、２０
％スルファイトパルプ、高さ＝０．８ｍｍ、長さ×輻＝
１ｃｍＸ０．５ｃｍ）を多孔性マトリックスとして用い
た。この固定されたアルブミンに、免疫学的複合体を介
して、アルブミンに対する抗体とβ−ガラクトシダーゼ
とのコンジュゲート体２００ｍＵを結合させる。該パッ
ド物質の上にアルブミン含有試料液体２０μｍをピペッ
トで移す。５分後、該装置に、パッド物質を介して、ク
ロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトシドの溶液（
濃度３ミリモルへペス（Ｈｅｐｅｓ） ５０ミリモル、
ｐＨ７，５、量１ｍ１）を充填する。さらに５分後、慣
用の光度計で、５７０ｎｍでの上澄み液の吸光度を測定
する。 ［００４０］ 尿中のアルブミンの定量測定に関して、既知のアルブミ
ン含有量の試料液体による目盛り曲線を確立する。結果
を表１に示す。 ［００４１］
【表１】
響
分析物の濃度
信号
Ｏｍｇアルブミン／ｄ１
０３ｍＡ
１ｍｇアルブミン／ｄ１
５２ｍＡ
１０ｍｇアルブアルブミン
含有量ｍＡ”
［００４２］
この目盛り曲線を用いて未知のアルブミン含有量の尿試
料中のアルブミン濃度を測定する。 ［００４３］ 実施例２ Ｔ４−試験 図１の装置を用いて、この試験を行う。欧州特許出願Ｅ
Ｐ−Ａ−０１８５３７２に従って、パッド物質（エタジ
ュリン（ｅｔａｄｕｒｉｎｅ）で増強した、８０％ポリ
エステル、２０％スルファイトパルプ）にＴ４を結合さ
せる。少なくとも５分の予備インキュベーションの後、
試料５μｌを、Ｔ４に対するＡＢとβ−ガラクトシダー
ゼとのコンジュゲート体の溶液（３Ｕ／ｍ１）１５μｌ
を有するパッド上にピペットで移す。５分後、装置に、
パッドの上に降ろした針を用いて、該パッドを通して、
クロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガクトシド（３ｍＭ
、５０ミリモルのへペス、ｐＨ７，５）の溶液を充填す
る。目盛り曲線を確立するために、５分後、様々なＴ４
濃度で上澄み液の吸光度を測定する。結果を表２に示す
。 ［００４４］
料中のアルブミン濃度を測定する。 ［００４３］ 実施例２ Ｔ４−試験 図１の装置を用いて、この試験を行う。欧州特許出願Ｅ
Ｐ−Ａ−０１８５３７２に従って、パッド物質（エタジ
ュリン（ｅｔａｄｕｒｉｎｅ）で増強した、８０％ポリ
エステル、２０％スルファイトパルプ）にＴ４を結合さ
せる。少なくとも５分の予備インキュベーションの後、
試料５μｌを、Ｔ４に対するＡＢとβ−ガラクトシダー
ゼとのコンジュゲート体の溶液（３Ｕ／ｍ１）１５μｌ
を有するパッド上にピペットで移す。５分後、装置に、
パッドの上に降ろした針を用いて、該パッドを通して、
クロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガクトシド（３ｍＭ
、５０ミリモルのへペス、ｐＨ７，５）の溶液を充填す
る。目盛り曲線を確立するために、５分後、様々なＴ４
濃度で上澄み液の吸光度を測定する。結果を表２に示す
。 ［００４４］
【表２】
Ｔ４濃度
信号
０．８μｇ／ｄ１
３４ｍＡ
３．５μｇ／ｄ１
５８５ｍ、Ａ
２５．１μｇ／ｄ１
７０ｍＡ
［００４５］
この目盛り曲線を用いて血清または血漿中のＴ４含有量
を測定することができる。 ［００４６］ 実施例３ ＴＳＨ試験 図１の装置において本試験を行った。米国特許ＵＳ−Ａ
−４８０３１７１に類似のマウスＦｃに対する抗体をパ
ッド物質（８０％ポリエステル、２０％スルファイトパ
ルプ、エタジュリン）に固定する。標準（表３のＴＳＨ
濃度に類似の組成物）または試料４２５μｍ、ＴＳＨに
対する抗体（マウス）（ＡＢ １．１５０μｇ／ｍｌ
） ８０μｌおよびＴＳＨに対するヒツジ抗体とβ−ガ
ラクトシダーゼ（７５ｍＵ／ｍｌ）のコンジュゲート体
８０μｍを、容器中で１２０分間、予備インキュベート
する。この溶液の２０μｌをパッド物質上にピペットで
移す。５分後、装置に、パッド物質の上に降ろした針を
用いて、パッドを通して、クロロフェノールレッド−β
−Ｄ−ガクトシド（濃度３ｍＭ、５ｍＭのヘペス、ｐＨ
７，５）を充填する。５分後、様々な濃度で、領域２ａ
における上澄み液の吸光度を測定する。これによって、
表３の目盛り曲線が得られた。 ［００４７］
を測定することができる。 ［００４６］ 実施例３ ＴＳＨ試験 図１の装置において本試験を行った。米国特許ＵＳ−Ａ
−４８０３１７１に類似のマウスＦｃに対する抗体をパ
ッド物質（８０％ポリエステル、２０％スルファイトパ
ルプ、エタジュリン）に固定する。標準（表３のＴＳＨ
濃度に類似の組成物）または試料４２５μｍ、ＴＳＨに
対する抗体（マウス）（ＡＢ １．１５０μｇ／ｍｌ
） ８０μｌおよびＴＳＨに対するヒツジ抗体とβ−ガ
ラクトシダーゼ（７５ｍＵ／ｍｌ）のコンジュゲート体
８０μｍを、容器中で１２０分間、予備インキュベート
する。この溶液の２０μｌをパッド物質上にピペットで
移す。５分後、装置に、パッド物質の上に降ろした針を
用いて、パッドを通して、クロロフェノールレッド−β
−Ｄ−ガクトシド（濃度３ｍＭ、５ｍＭのヘペス、ｐＨ
７，５）を充填する。５分後、様々な濃度で、領域２ａ
における上澄み液の吸光度を測定する。これによって、
表３の目盛り曲線が得られた。 ［００４７］
【表３】
ＴＳＨ濃度
０μＵ／ｍ１
３１μＵ／ｍ１
４７μＵ／ｍｌ
信号
６０ｍＡ
４３５ ｍＡ
３０ｍＡ
［００４８］
この目盛り曲線を用いて血清および血漿中のＴＳＨの未
知の濃度を測定することができる。
知の濃度を測定することができる。
【図１】 本発明のキュベツトの中央部を通る断面図で
ある。
ある。
【図２】 本発明の試験ストリップの中央部を通る縦断
面図である。
面図である。
【図３】 図２の本発明の試験ストリップの個々の構成
素子を説明する図である。
素子を説明する図である。
１・・・装置、
２・・・キュベツト、
３．１２・・・多孔性マトリックス、
４・・・上澄み液、
５・・・針、
１０・・・試験ストリップ、
１１・・・ベースホイル、
１３・・・ホイル、
１４・・・通気口、
１５・・・非孔質空間、
１６・・・試料適用装置、
１７・・・充填口、
１８・・・ホイル。
【図１】
図面
【図３】
【図２】
第１頁の続き
０発 明 者 ハンス ・ ランデ ドイツ連邦共
和国６８４０ランパートハイム、ダンツイゲルストラー
セ３番
和国６８４０ランパートハイム、ダンツイゲルストラー
セ３番
Claims (10)
- 【請求項１】酵素標識化合物を固相と液相の間で分配し
、固相以外の液相中の酵素標識の量を分析物の濃度に関
する尺度として測定する酵素−免疫測定法による試料液
中の分析物の検出方法であって、該測定が非孔質成形品
中で行われ、その中に含まれる液相が固相と接している
ことを特徴とする検出方法。 - 【請求項２】固相が大きい表面積を有する物質である請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】固相が多孔性である請求項１または２のい
ずれか１つに記載の方法。 - 【請求項４】固相を介して試料液を流通させる請求項１
〜３のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項５】酵素に対する適切な基質を含む液によって
試料液を置換する請求項４記載の方法。 - 【請求項６】固相が小さい粒子からなる請求項１または
２のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項７】固相に直接接するキュベット中の酵素によ
って転換された酵素基質の量によって酵素標識の量を測
定する請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項８】測定が透過測光法によって行われる請求項
７記載の方法。 - 【請求項９】底部に多孔性マトリックスを有し、それを
介して液を流通させることができることを特徴とする請
求項１〜８のいずれか１つに記載の方法を行うためのキ
ユベツト。 - 【請求項１０】液を流通させることができる多孔性マト
リックス、液を該マトリックスに適用し得る少なくとも
１つのストリップ部および空間が該マトリックスと接し
ている非孔質成形品をベースホイル上に含有する試験ス
トリップであって、ストリップ部、マトリックスおよび
非孔質成形品が、この順序でこれらを介して、まず試料
、次に置換液を流通させ得るような方法でベースホイル
上に配列されることを特徴とする試験ストリップ。
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| DE3941150A DE3941150A1 (de) | 1989-12-13 | 1989-12-13 | Verfahren zur bestimmung eines analyten |
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