JP3727952B2 - 自動化イムノアッセイカセット - Google Patents
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Description
本発明は、選択された分析物についての体液試料のアッセイにおける使用、特に自動化多段階アッセイにおける使用のための装置に関する。
引用文献
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Siebel et al.,J.Rheumatol.16:964-970(1989).
発明の背景
体液試料中の種々の分析物の存在またはレベルを検出するためのアッセイは公知である。このようなアッセイは代表的には、作業者が臨床アッセイ手順またはアッセイの結果の解釈についての訓練を十分に受けられ得ないような、医院または他の臨床設備において信頼して使用され得るように、使用の単純化のために設計される。操作者の関与の必要を最小にするために、アッセイは自動化されかつ/または内蔵式の様式で実行され得ることが好ましい。
このような内蔵式のアッセイは、代表的には、単純化のために、1工程手順に限られていた。しかし、多くの有用なアッセイは、現実には多段階であり、1つより多くの反応または結合工程、あるいは基質からの未結合物質を除去するための別の洗浄工程を必要とする。溶液を添加または除去、あるいはテスト小片を一方の溶液から他方の溶液に移すといったさらなる操作を必要とするために、多段階アッセイは容易に自動化されず、そして一般的に使用者からのいっそうの入力を必要とし、従ってエラーの可能性を増加する。
それゆえ多段階のアッセイ、特に、反応または結合工程、続いて洗浄工程を含むアッセイを、操作者の最小の入力で行い得る、自動化された、内蔵式のアッセイ装置を提供することが所望される。
吸収小片上で行われる、フロースルータイプのアッセイで頻繁に遭遇する別の問題は、検出用に設計された領域内における検出可能な種の不均等な展開である。それゆえ、アッセイ小片内で、小片上で展開する検出可能な種の単一な分布を増加させるような機能を提供することもまた、所望される。
発明の要旨
本発明は、1つの局面において、体液試料中の分析物の検出における使用のためのイムノアッセイカセットを提供する。このカセットは、基部、試薬支持体および基部上に支持体を取り付ける手段を含み、これら2つの部材を最初の休止位置から相対移動させて、第1および第2の操作位置をとることを可能にする。1つの実施態様において、取り付け手段は、試薬支持体の反対の末端を支持するのに、効果的な基部上の圧縮可能な支持体である。
基部上には、試料を入れる試料ウェル、試料を試料ウェルから試料移動位置に移動させる試料移動小片、洗浄溶液を含む洗浄液リザーバー、および洗浄液を洗浄液リザーバーから洗浄移動位置に移動させる洗浄液移動小片が含まれる。
試薬支持体には、反応小片および分析物検出ゾーンが含まれる。反応小片は、液体移動を可能にするキャピラリー手段からなる。特に、反応小片は試薬支持体が第1の操作位置に動かされた場合、試料溶液を試料移動位置から検出ゾーンへ移動させるのに効果的である。そして試薬支持体が第2の操作位置に動かされた場合に、洗浄溶液を洗浄移動位置から検出ゾーンまで移動させるのに効果的である。好ましい実施態様において、カセットはさらに、反応小片と検出ゾーンとの間かつ隣接して配置される単一な重合体メッシュの小片を含む。カセットはまた、好ましくは基部上に、試薬支持体が第2の操作位置に移動する場合に、検出ゾーンから洗浄溶液を吸入するのに効果的な取り上げパッドを含む。
試薬支持体ならびに第1および第2の操作位置間の基部の相対的な移動およびは、試料移動位置と反応小片との間の接触を切断し、そして洗浄移動位置と反応小片との間の接触を確立するのに効果的である。1つの実施態様において、試料移動小片は突出領域を有し、これは第1の操作位置中の反応小片と接触するように調整され、そして第2の操作位置中の反応小片と非接触の位置に移動するように調整される試料移動位置を含む。
好ましい実施態様において、試薬支持体はさらにコントロール反応ゾーンを含む。この場合、取り付け手段は、支持体と第3の(またはコントロール)操作位置(そこでは接触が試料移動小片とコントロール反応ゾーンとの間で確立される)に想定された基部との間の相対的な移動を可能にする。
カセットはさらに、試料移動小片、反応小片および検出ゾーンで定義された液体経路に配置されたアッセイ試薬を含む。これらの試薬はまた、試薬手段とも呼ばれ、検出ゾーンにおいて、検出可能な、分析物依存的な反応産物を産生するのに効果的である。試薬手段は例えば、選択的に試料分析物と結合するのに効果的な標識したリガンドを含み得、ここで反応産物は、このような結合によって形成された、検出可能な分析物リガンド複合体である。あるいは、試薬手段は以下を含み得る:(i)試料分析物と選択的に結合するのに効果的な標識したリガンド、および(ii)標識したリガンドと競合的に結合するのに効果的な基質。この場合、反応産物は、このような競合的な結合によって形成された検出可能な基質リガンド複合体である。好ましい実施態様において、試薬手段は検出ゾーンに、逆濃度勾配でアプライされ、その結果濃度は検出ゾーンを横切って下流の方向に増加する。
別の局面において、本発明は体液試料中の分析物を検出するアッセイ装置を提供する。この装置は、上記のようなイムノアッセイカセットおよびカセットリーダーを備える。カセットリーダーは、カセットを受容する開口部、および基部に関連するカセットの試薬支持体を、あらかじめ決められた時間にその休止位置から種々の操作状態へ移動させる手段を含む。この装置は好ましくはさらに、アッセイ反応産物を検出する手段を含む。
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明の1つの実施態様に従って構築された、最初の休止位置、または試料ロード位置にあるカセットを備えるイムノアッセイカセットを示す;
図2は、第1の操作(「反応」)位置にあるカセットを示す;
図3Aは、第2の操作(「洗浄」)位置にあるカセットを示す;
図3Bは、さらにコントロール反応をとりこむ、第3の操作位置にあるカセットを示す;および
図4は、カセットの反応支持体部材の切断面の詳細図を示し、本発明の1つの実施態様においては、反応小片および検出ゾーンを示す。
発明の詳細な説明
I.イムノアッセイカセット
図1は、本発明の1つの実施態様に従って構築されたイムノアッセイカセット10を示す。このカセットは、標準的な成型または機械的方法によって作製され得る、2つの平板様部材、基部部材12および試薬支持体部材14から構成される。試薬支持体は、調整可能なサイド部材16(本明細書中で取り付け手段としても定義される)を介して、基盤に取り付けられる。取り付け手段は、以下に記載するように、基部、および試薬支持体の相対位置を、異なる操作位置を想定して最初の休止位置から調整されることを可能にする。
この取り付け手段は、16に示すように、圧縮可能なブロックであり得、これは試薬支持体の反対の末端を支持する。これらのブロックは、図1〜3に図示するように、カセットが連続的な操作位置を想定するに従って、さらに圧縮される。支持ブロックはまた、バネまたはピストン様作用の手段によっても圧縮され得る。
操作上、カセットは好ましくはカセットリーダー内に含まれる。試薬支持体部材はこのリーダー内の支持表面に接触し、そしてこのリーダー内の機械的手段が基部部材を係合し、そして試薬支持体に向かって漸増的に移動することに効果的である。あるいは、この基部は静止状態にあり得、そして試薬支持体は漸増的に移動し得る。カセットリーダー内の機械的手段は、従来の部材、例えば、クランプ、ピストン、ステッピングモーター、ウオームギヤなどを含み得る。基部および試薬支持体部材は、リーダー内で、16として示したように支持体の使用なしで別個に係合され、そして移動させられ得る。その場合、リーダー内の機械的手段は取り付け手段を備え得る。
基部12内で、分析される体液試料を含むための試料ウェル18が、提供される。隣接する試料ウェルは、それらが液体伝達部に運ばれ得るような、試料移動小片20である。小片20が試料との液体伝達部に置かれた場合、この小片は、キャピラリー作用により、試料を試料輸送位置22へ移動させるのに効果的である。この位置は、下に記載するように、操作の間、カセットの反応小片と接触する試料移動小片20の一部として定義される。
試料移動小片は、キャピラリー流動を介して液体を汲み上げ得る吸収性で繊維質の物質の小片から成る。種々の繊維質の物質、例えばセルロース、セルロースアセテート、およびガラス繊維マトリックスを含む、一般的に繊維マットフィルターに使用される物質は、移動小片に適する物質である。所望される場合には、繊維は、化学的架橋法、熱融合などによって架橋され得る。同様に適する物質は、焼結ガラス、融合したポリマービーズなどのような、多孔質の物質であり、これらの水和性および隙間の大きさは、表面の濡れによる小片中への水性媒体の移動を促進するようなものである。1つの例示的な物質は、充填密度約0.2〜0.5gm/cm3のガラス繊維フィルターである。
小片は、プラスチックまたは他の不活性な支持物質製の裏打ちに取り付けられ得る。この裏打ち物質は、好ましくは可撓性である。小片の突出部分は、図1〜3に示すように、休止位置から可撓性でなくてはならない(下記でさらに議論する)。この小片および裏打ちは、試料ブロック23上で支持され、これは圧縮可能な材質、例えば発泡ラバーからなり得る。
ウィック(wick)はまた、図1の24に示すように、試料ウェルと試料移動小片との間に提供され得る。このウィックは代表的には試料移動小片よりも低密度の物質であり、より急速な試料の移動を可能にする。1つの適切な物質は、高分子量ポリスチレン繊維のパッドであり、例えば、下記のように、反応小片としても使用され得る。
フィルター(図には示していない)は試料ウェルまたはウィック中に取り込まれ、アッセイに先立ち、試料から粒子および妨害物質を除去し得る。適切なフィルター物質の選択は、例えば、PCT出願WO 94/03814(Cerelli)に記載される。基部12に提供されるのはまた、洗浄液を含有するための洗浄リザーバー26である。吸収性(bibulous)物質で作られる洗浄移動小片28はまた、リザーバー26から洗浄移動位置30までの洗浄液の移動のために提供される。この位置は、洗浄移動小片28の一部として定義され、これは、操作の間、下記のように、カセットの反応小片と接触するようになる。洗浄移動小片30は、代表的には試料移動小片20に使用されるものと同様の不活性な裏打ち物質に取り付けられ、そして示されるように支持ブロック31上に支持され、これは好ましくは発泡ラバーのような圧縮可能な物質からなる。
示される実施態様において、基部部材はまた、吸収洗浄取り上げパッド32を含む、液体取り上げステーションを含む。このパッドは、検出ゾーンと接触した場合、下記のように、カセットの検出ゾーンからの洗浄溶液を吸収し得る。この吸収パッドは好ましくは圧縮可能な物質で形成されるか、または圧縮可能な支持ブロック上に取り付けられ得る。
試薬支持部材は、分析物検出ゾーン34を含み、液体がキャピラリー作用によって流れ得、そして試薬手段が、下記のように固定化され得る吸収性の物質で作られる。好ましい物質は、例えば、ポリスルフォン、ポリプロピレン、ナイロン、ニトロセルロース、テフロンTM、またはポリビニルクロライド微孔性膜のような、多孔性の、融合したポリマーまたは微孔性ポリマー膜を含む。本発明の場合、例えばMilliporeから入手できるようなclear MylarTMのシート上にキャスト(cast)するニトロセルロース、または同様の物質が特に好まれる。35に示されるような、1つ以上の窓が、好ましくは試薬支持部材14内に提供され、検出ゾーン内に形成された光学的に検出可能な反応産物の便利な検出を可能にする。
検出ゾーンに隣接するのは反応小片36であり、これは本明細書中ではキャピラリー手段とも呼ぶ。この反応小片もまた、上記のような吸収性の物質からなり、キャピラリー作用によって液体の輸送を可能にする。これは好ましくはPorexによって提供されるような、高分子量ポリエチレン繊維のフィルターである。適切な物質には、0.028μ(約700μm)の厚さおよび平均孔径70μmを有するPorex4588、ならびに0.022μ(約550μm)の厚さおよび平均孔径7μmを有するPorexT3が挙げられる。この反応小片はまた、図4の37に示すように、固体の不活性な裏打ちに取り付けられる。
フィルター、試料移動小片および検出ゾーンは、代表的には3つの構成要素がそれぞれ1〜5cmのおよそ同じ幅を有し、好ましくは長さが1〜2cm、および幅が1〜10mmである。移動小片および検出ゾーンは、代表的には厚さ約100〜150μである。反応小片を構成するフィルターは、一般的により厚く、上記のように、約150〜1000μm、そして好ましくは約500〜750μmの厚みを有する。
試料移動小片、反応小片および検出ゾーンを含む、記載したいずれの領域も、定義された容量の試料溶液(代表的には約3〜25μl、そして好ましくは約15〜25μlの間)を吸収するために、寸法を合わせられ得、従って試料容量の制御が可能である。代表的なアッセイにおいては、下記のように、反応小片は試料の20μlアリコートを吸収する。
試料移動小片によって定義された液体経路内に配置されて、反応小片および検出ゾーンは、以下でさらに記載されるように、検出ゾーンで検出される、検出可能な、分析物依存的な反応産物を産生するのに効果的な試薬である。それゆえ下記のように、種々のアッセイがこのカセットを用いて行われ得る。
示される実施態様において、試薬支持体はまたコントロール反応ゾーン38を含む。このコントロールゾーンは、体液サンプルの実体の一部とコントロール反応を行うのに、効果的な試薬を含む、濡れ可能な、吸収性の試験パッドまたは膜を含む。39に示した窓は、好ましくは、コントロールゾーン内に形成した光学的に検出可能な反応産物の検出を便利にするために提供される。
好ましい実施態様において、ポリマーメッシュの細い小片が、図4の40に示すように、反応小片36と検出ゾーン34との間かつ隣接して配置される。小片は本質的に反応小片および検出ゾーンと同じ幅であるが、示すように、長さはこれらの構成要素よりも有意に短く、例えば、約0.5〜5mm長、好ましくは1〜3mm長である。メッシュ材料は、組成において反応小片に使用される物質(代表的にはガラス繊維)より均質であり、その結果、反応小片からメッシュに入っていく任意の不均一な溶液が、メッシュ内でより均一に混合される。1つの適切な材料は、ポリエステルメッシュ、例えば、Tetko 7-7/1(Tetko Inc.,Briarcliff Manor,NYより入手可能)である。この小片の封入は、それが検出ゾーンに入り、そして検出ゾーン内で検出可能な種のより均一な展開を供給するので、任意の溶解した試薬を用い、試料溶液の線条を減少させる。
別の好ましい実施態様において、検出ゾーン内の試薬または種は、逆勾配にアプライされる;すなわち、検出ゾーンの誘導エッジでは試薬が最も低濃度で、その結果下流方向において濃度が増加する。この改変は、ゾーンの誘導エッジにおける過剰展開を減少させ、そこで流入する試料が最初に接触し、検出可能な種のより均一な展開を生じる。このような勾配は、生物学的溶液に適応したインクジェット噴霧器を使用して、試薬をアプライすることによって産生され得る。このような噴霧器は、Ivek Corporation,North Springfield,VTから、およびSynergy Research,West Lebanon,NHにより入手可能である。Synergy Researchからの好ましい噴霧器、PicoJetTM810は、正確な数の微滴を種々の基質物質上に分配し得、そして、滴の数および配置の正確な制御を提供する。
上で述べたように、カセットは好ましくは、カセットを受容する開口部、ならびに基部および試薬支持体の相対的な位置を、例えば、これらの要素を別々に係合する内部の要素の手段によって調整するための手段を含む、カセットリーダー内の操作の間に含まれる。上記のように、好ましい設計においては、カセットの試薬支持体部材は、このカセットがリーダーの中に挿入され、そして基部部材が試薬支持体に向かって増加的に動く場合に、支持体表面を係合する。このような調整は、下記の操作位置を想定するために、操作の間のあらかじめ定めた時間になされる。
カセットリーダーは、好ましくはカセットの検出ゾーン内のアッセイ反応産物を検出する手段を取り込む。この検出ゾーンへの光学的接近は、窓35および/または39を通して提供される。この目的のために、光学整列ピン(図には示していない)が、試薬支持体と接触するリーダー内の表面による係合のために、試薬支持体の上部表面上に含まれ得る。
好ましい方法である反射率分光法が、検出に使用される場合、検出器は光源および反射光検出器を含む。測定位置において焦点を合わせた、選択された波長の光ビームを方向付ける光源は、低出力レーザーで単色の非干渉光源であり得、そのビームはLEDなどの適切なレンズ配置によって焦点を合わせられる。検出器は代表的には、例えば光強度シグナル値を出力する、光起電性センサーのような従来の光センサーである。検出器からのシグナル値は、デジタルプロセッサーに供給される。これは、当該分野で公知の手順に従い、標準試料の反射率との比較によって、反射率%を分析物のレベルに転換する。
II.カセットの操作位置
上記のように、基部および試薬支持体部材は連続して、休止位置ならびに第1および第2の操作位置を含む、異なる相対的位置を想定し得る。本発明の重要な特徴に従って、選択された要素は、下記のように、異なる操作位置が想定されるので、お互いに移動してそして、接触からはずれる。
休止位置では、図1に示すように、試料移動小片20(これは試料移動位置22を含む)、反応小片36、および検出ゾーン34の間で接触が起こらない。この位置はまた、試料ロード位置であり、ここで小片(または存在する場合ウィック24)が、試料ウェル中の試料溶液と接触するように配置される場合、試料移動小片を通る試料の流動が開始される。
最初の操作位置において、図2に示すように、試料移動位置22としての試料移動小片と、反応小片36との間の接触が確立され、試料溶液の試料移動小片から反応小片まで、そしてそれによって検出ゾーン34まで移動を可能にする。この位置もまた、反応位置として参照する。
カセットが第1の操作位置から第2の操作位置に移動する場合、図3A〜3Bに示すように、試料移動位置22および反応小片36との間の接触は中断され、そして洗浄移動位置30と反応小片との間で接触が確立される。従って、洗浄リザーバー26からの洗浄液は、洗浄移動小片28および洗浄移動位置30を介して反応小片へ、そしてそれによって検出ゾーン34および洗浄取り上げパッド32に移動する。
図3Bは第3の操作位置を例示し、そこではコントロールゾーン38が試料移動小片20との接触を形成し、従ってコントロール反応を開始する。示される実施態様において、支持ブロック31およびパッド32は、そのような接触が形成されるために、圧縮された位置を想定するが、洗浄リザーバーから洗浄取り上げパッド32までの洗浄液の流れは影響されない。従って、コントロールゾーン38における反応は、それ自身のアッセイ反応と逐次的に起こるのではなく、同時に起こり得る。コントロールゾーンと試料移動小片との間の簡単な接触のみが試料の移動には一般的に必要とされるので、カセットは代表的には図3Bに示される位置に短時間のみとどまり、次いで図3Aに示される位置に移動され得る。
第1の操作位置から第2の操作位置に移動するときに、カセットは効果的に、ここで、試料が試薬支持体の領域に移動され、そして分析物依存的な反応を受ける反応相から、未結合試薬または他の種が反応小片および検出ゾーンから除去される洗浄相へ移行する。このような工程は、種々のアッセイに含まれ、そして本発明のカセットを使用して、自動化された効果的な様式で、実行され得る。
第2の操作位置は一般的に洗浄位置と呼ばれ、そしてその中に運ばれた溶液が洗浄溶液と呼ばれてきたが、カセットの第2の操作位置は、図3Aまたは図3Bに示すように、洗浄溶液以外のさらなる試薬溶液を取り込み得、従って洗浄相以外の第2の反応相を提供し得ることもまた、理解されるべきである。
試料移動位置22と反応小片36との間の接触を破壊するために使用され得る種々の設計の中で、好ましい設計は図3A〜3Bに示される。ここで、非吸収性のバリヤー42は、試料移動位置と接触するポイントの付近に、反応小片に隣接して配置される。移動位置22を含む試料移動小片の突出部分は、上記のように可撓性である。第1の操作位置においてこの部分は、図2に示すように、反応小片と接触する。第2および第3の操作位置において、図3A〜3Bに示されるように、それは反応小片との非接触位置に、すなわち、バリヤー42と衝突することによって、移動する。示されるように、バリヤーは、反応小片と試薬支持体14との間のギャップを架橋するか、または満たし得る。あるいは、バリヤー42が存在せず、そして第2の操作位置において試料移動位置20が反応小片36をバイパスし得、そしてこのギャップに存在する。
図3A〜3Bに見られ得るように、試料移動小片と反応小片との間の接触を破壊することは、洗浄移動小片28と反応小片の間の接触を確立することと同時に起こる。従って、本発明によって提供される利点に従って、カセットは、自動的、内蔵的な様式で、溶液の添加または他の操作者の入力の必要性なしで第1のアッセイの反応相から、洗浄相のような第2の相へ切り換える。接触を破壊する他の手段もまた、想像し得る。例えば、試料移動小片と洗浄小片の間の横方向(すなわち、図の平面に垂直)の移動により、この場合横方向の支距(offset)である。
III.アッセイおよびアッセイ試薬
A.アッセイのタイプ
イムノアッセイカセットは、種々の免疫化学アッセイの自動および内蔵型の遂行に適する。この目的のために、本明細書中ではまた試薬手段とも呼ぶ免疫化学試薬は、試料移動小片20、反応小片36および検出ゾーン34より定義される、液体経路中に含まれる。
競合的結合タイプアッセイの例において、検出ゾーンは、固定された形態である分析物種のアナログで含浸される。分析物を含む液体試料は、選択的に分析物と結合して分析物-抗体複合体を形成する、既知量の標識リガンドと接触させられる。このリガンドは可溶性の形態で、試料移動小片上に、または好ましくは、反応小片上にロードされ得、その結果所定の領域を横切る試料液体が、試料液体内の分析物に結合するリガンドを溶解する。生じた液体は、検出ゾーンに到達すると、試料中の分析物の量に反比例する未結合の抗体を含む。この未結合の標識抗体は、次いで検出ゾーン内で固定化されたアナログに結合する。
上記の工程は、本発明のカセットが、その第1の操作位置、または反応相にあるときに行われる。適切なインキュベーション時間の後、必要に応じて、カセット内の基部および試薬支持体が、第2操作位置に移動し、その結果、例えば図3Aに示すように、液体経路が、洗浄リザーバー、反応小片、検出ゾーンおよび洗浄取り込みステーションの間に確立される。洗浄液はそれによって反応小片および検出ゾーンを横切り得、そして、この場合、残存している未結合の抗体および分析物-抗体複合体を含む、未結合性種を除去し得る。固定化されたアナログ-抗体複合体は、体液サンプル中の分析物の量に反比例する量で、検出ゾーンに留まる。次いで、この複合体は、検出可能な種のために使用される標識のタイプに依存して、従来の方法によって検出される。
第2のリガンドを標識する多くの方法が、当該分野で公知であり、これは放射標識、蛍光標識、または基質を検出可能な種に転換する、連結された酵素を含む。種々のレポーター標識した抗体(例えば酵素ラベルした抗体)は市販されているか、または公知の方法(例えば、Harlow,319〜358頁を参照のこと)に従って容易に調製し得る。光学的に検出可能な標識方法は、本発明のイムノアッセイカセットでの使用のために好ましい。基質と反応して可視の反応産物を産生する酵素は、この目的のために広範に用いられる。1つの好ましい酵素は、アルカリ性ホスファターゼであり、これはp-ニトロフェニルホスフェート基質と反応し、405nmに強い吸収ピークを有する、着色した産物を産生する。
特に好ましい標識されたリガンドは、可視の粒子(例えば、着色したラテックスビーズまたはコロイド状の金)と結合した分析物特異的抗体である。このような結合物は、米国特許第4,313,734号(Leuvering)に記載され、そしてまた、例えばBB International(Cardiff,U.K.)およびNanoProbes(Stony Brook,NY)のような製造者から入手し得る。
上記の競合的結合アッセイの具体的な例は、以下の第B節に記載する。当業者は、異なるアッセイ試薬を使用して、本発明の精神から逸脱することなく記載したカセットを使用して種々のアッセイを行い得ることが理解される。例えば、試料移動小片は、試料分析物に結合するのに効果的な可溶性の抗体を含み得、一方反応小片は未結合の抗体を固定化するのに効果的な結合試薬を含み、従って、可溶性の分析物-抗体複合体のみが検出ゾーンに拡散することを可能にする。抗体はここで、結合された標識を介して、上記のように検出され得る。あるいは、この検出ゾーンは、非標識抗体分析物を含む検出可能な反応産物を産生するのに効果的な試薬を含み得る。例えば、検出ゾーンは、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、および色素のような検出可能な種に酸化可能な化合物を含み得る。分析物-抗体複合体がオキシダーゼについての基質を含む場合、生じる反応によって生成した過酸化水素が、ペルオキシダーゼによって触媒されて酸化可能な化合物と反応し、検出可能な色素を生成する。このようなアッセイは、例えば、Hewettらにおいて記載される。
カセットはまた、サンドウィッチタイプのアッセイを行うのに適しており、ここで分子は、「捕獲」部分および「検出」部分に同時に結合する。これらのアッセイは、分析物が固定化されたリガンドを含む基質に選択的に結合し、未結合試料成分が洗浄によって除去され、検出可能な選択的な結合リガンドが添加され、そして未結合リガンドが洗い流される、従来のアッセイを含む。1つのバリエーションにおいて、分析物種を選択的に結合するリガンドは検出ゾーン内に固定され、そしてこの分析物は、上で定義した液体経路中に(例えば試料移動小片、または反応小片内に存在する)検出可能な第2のリガンドへの選択的結合によって検出される。
上の記載より、本発明の種々の対象および利点がどのように満たされるかが明らかである。記載したカセットは、カセットの種々のゾーンおよびリザーバー内に異なる試薬を含む、種々の多段階アッセイを、自動的な様式で、操作の間に外部からの入力がほとんどないか、または全くないように行うために使用され得る。カセットは特に、試薬および/または洗浄溶液が固定された支持体を横切って輸送される、連続的な工程を含むアッセイを行うために有用である。必要に応じて、複数のリザーバーおよび/または複数の反応/洗浄の順序が使用され得る。本発明の重要な特色は、上記のように、本明細書中で、単一の流路配置に固定された表面を横切って、異なる溶液の連続的な移動に効果的な、反応位置および洗浄位置として記載した、操作位置の間の自動化された移動である。
好ましくは、カセットは、あらかじめロードされた溶液および試薬と共に供給され、従って完全に内蔵型で、操作者による溶液のロードを必要としない。カセットを含むリーダーは、指定された時間に異なる操作位置にカセットを調整するようにプログラムされ得る。従って、多段階アッセイは、カセットリーダー内に含まれるカセットを用いて、外部の操作者の入力を必要とせずに、行われ得る。
B.代表的なアッセイ:尿中におけるピリジニウム架橋レベルの決定
本発明のデバイスの特定の応用において、尿サンプルをピリジノリン(Pyd)またはデオキシピリジノリン(Dpd)のレベルについて分析する。ピリジウム架橋として知られる、尿中で見い出される化合物のクラスのメンバーである、これらの化合物の変化したレベルは、例えば骨粗鬆症(Robins、Macek、Black)のような、骨形成と骨吸収との間の異常なバランスによって特徴付けられる障害の診断であると示されてきた。クレアチニンレベルは、分析物レベルを尿濃度および骨質量に規準化するために、コントロールとして測定される。
試料を、例えば1%ウシ血清アルブミン(BSA)、1% Tween 20(TWEENは商標である)、および0.9% NaClを含む約3容量の緩衝液(PBS、リン酸緩衝食塩水)のような、適切な培地中で希釈して調製する。次いでこの試料を、PCT公開第94/03814(Cerelli)に記載されているように、アッセイを妨害し得る物質を除去するのに効果的な物質を通して濾過する。適切なフィルター媒体はニトロセルロースベースの物質、疎水性/高タンパク質結合物質、および荷電した親水性物質を含む。フィルターを好ましくは、試料リザーバー18および/またはウィック24に挿入する。
可溶性のリガンドはDpd-またはPyd-特異的な抗体であり、それらの調製はCerelliに記載される。抗体はコロイド状の金、または別の着色した粒子に結合することによって標識される。このような結合は市販の製品から得られ得るか、または上で述べたLeuveringの方法によって調製され得る。コロイド状金-抗体結合物を使用する場合、一般的に、数重量%の、例えばショ糖、トレハロースもしくはBSAといった安定化剤および/または0.1〜1重量%の、例えばTween20(TWEENは商標である)といった界面活性剤の存在下で、反応小片物質にアプライする。
また効果的な抗体に結合する分析物のアナログを、検出ゾーン内で固定化する。適切なアナログは、遊離の分析物特異的抗体に結合するのに効果的な、ピリジノリン(Pyd)またはデオキシピリジノリン(Dpd)化合物である。Dpd、Pydおよび誘導体を、例えば、Black、SiebelおよびCerelliに記載されるプロトコールを用いて、尿の分画によって単離し得る。
アナログ分子を、好ましくは、Cerelliに記載されるような手順に従って、ストレプトアビジン-ブタ血清アルブミン(PSA)-ビオチン複合体を介して、支持体にアプライする。代表的な手順において、ストレプトアビジンに結合したDpdまたはPydを、PSA-ビオチン複合体と共に混合し、そしてこの混合液をインクジェット噴霧器を用いてニトロセルロースにアプライする。上記のように、より均一な産物展開のために試薬を逆勾配中にアプライし得る。次いで、コートされたニトロセルロースを50℃で乾燥させて、成分を結合させる。
イムノアッセイカセットのコントロール位置を、上に示したように、試料のアリコートをコントロールゾーン38に移動させることにより、試料中のクレアチンのレベルを決定するために使用する。クレアチニンを測定する1つの方法は、分析物特異的オキシダーゼ試薬を使用する。クレアチニンアミドヒドロラーゼは、クレアチニンをクレアチンに転換し、クレアチンはクレアチンアミドヒドロラーゼによって尿素およびサルコシンに転換される。サルコシンオキシダーゼは、順に、H2O2の産生を伴って、サルコシンをグリシンおよびホルムアルデヒドに転換する(Hewett)。そのレベルが試料中のクレアチニンのレベルに相当する、展開されたH2O2は、ペルオキシダーゼの存在下で供与体分子と反応し、検出可能な着色した色素を形成する。尿クレアチン濃度はまた、他の公知の方法、例えばアルカリ性ピクリン酸塩(Cook)を用いる反応に基づく方法によって決定され得る。
アッセイを、上記の競合的結合形式で行う。カセットがカセットリーダーに挿入される場合、代表的な操作順序は、以下の通りである。この手順において、コントロール反応は、連続的にではなく、アッセイが行われる(フェーズ3)と同時に開始される。
フェーズ1:
試料ウェルおよび洗浄リザーバーをロードする。
反応小片およびコントロールゾーンを試料移動小片から分離する(休止位置)。
試料移動小片を試料ウィック/フィルターと接触して配置する;試料をロードする。
フェーズ2:
カセットをリーダーに引く。
乾燥膜反射率のための光学的スキャンを検出ゾーンで行う。
反応小片と試料移動小片との間の接触が確立される(第1の操作位置)。
反応小片を試料で満たす;容量を反応小片寸法により制御する(持続時間約3分)
フェーズ3:
試料移動小片と反応小片の間の接続が破壊される。
洗浄リザーバー、反応小片および洗浄取り上げパッド間の接触が形成され、洗浄および取り上げ支持体ブロックを圧縮する(第2の操作位置)。
取り上げパッドを洗浄するために、洗浄液流動を洗浄リザーバーから反応小片を通して開始する。
コントロールゾーンと試料移動小片との間に接触が確立される(第3の操作位置)。
試料が試料移動小片からコントロールゾーンへ移動し、クレアチニン末端反応を開始する。
(約4秒後:)試料移動小片とコントロールゾーンの間の接触が破壊される。
洗浄リザーバー、反応小片および洗浄取り上げパッドの間の接触が残存する。
洗浄液は反応小片を横切って流れ続ける(持続時間約4分間)。
光学的読み取りが行われ、試験が完了する。
次いで標識化抗体のレベルを検出ゾーンで検出する。着色した反応産物、例えば、色素またはコロイド状金結合物のレベルを定量する便利な方法は、当該分野で公知の技術に従う、反射率分光学法による。コロイド状金を540nmにおける吸収ピークにおいて検出する。標準試料の反射率との比較により、反射率%を分析物(DpdまたはPyd)のレベルに転換する。
本発明は、特定の方法および実施態様の参照を用いて記載したが、本発明から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解される。
Claims (12)
- 体液試料中の分析物を検出するために使用するイムノアッセイカセットであって、以下、
(a)基部;
(b)試薬支持体;
(c)最初の休止位置から第1および第2の操作位置への移動に関する、相対的な移動のための、該基部に該支持体を取り付ける手段であって、
該基部は、(i)該試料を入れるサンプルウェル、(ii)サンプルウェル中の試料を試料移動位置に移動させるための試料移動小片、(iii)洗浄溶液を含む洗浄リザーバー、および(iv)洗浄リザーバー中の洗浄液を洗浄移動位置まで移動させるための洗浄移動小片を有し;
該試薬支持体は、(i)分析物検出ゾーンおよび(ii)反応小片を備え、該試薬支持体が第1の操作位置に移動させられる場合、試料溶液を該試料移動位置から該検出ゾーンへ移動させるため、および、該試薬支持体がその第2の操作位置に移動する場合、該洗浄溶液を該洗浄移動位置から該検出ゾーンへ移動させるためのキャピラリー手段を含む、手段。
(d)試薬支持体が第2の操作位置に移動する場合、該検出ゾーンから洗浄溶液を吸収するのに効果的な取り上げパッド;ならびに
(e)該検出ゾーンにおける検出可能な分析物依存的な反応産物試薬手段を産生するための試薬手段であって、該試薬手段は、該試料移動小片、反応小片および検出ゾーンにより定義された流体経路中に配置される手段、
を備える、カセット。 - 請求項1に記載のカセットであって、前記取り付け手段は前記試薬支持体の反対側の末端を支持するのに効果的な前記基部上に圧縮可能な支持体を含む、カセット。
- 請求項1に記載のカセットであって、ここで前記第1の操作位置から前記第2の操作位置への前記相対的移動は、前記試料移動位置と前記反応小片との間の接触を中断するのに効果的であり、ならびに前記洗浄移動位置と前記反応小片との間の接触を確立するのに効果的である、カセット。
- 請求項1に記載のカセットであって、ここで前記試料移動小片は、前記試料移動位置を含む突出領域を有し、該突出領域が前記第1の操作位置において前記反応小片と接触するように調整され、および前記第2の操作位置において該反応小片と非接触の位置に移動するように調整される、カセット。
- 請求項1に記載のカセットであって、ここで前記試薬支持体はさらにコントロール反応ゾーンを含み、そして前記取り付け手段が、前記支持体と、第3の操作位置とみなされるのに効果的な、前記基部との間の相対的移動に効果的であり、ここで接触が該試料移動小片と該コントロール反応ゾーンとの間に確立される、カセット。
- 請求項1に記載のカセットであって、ここで前記試薬手段は、前記分析物と選択的に結合するのに効果的な標識されたリガンドを備え、そして前記反応産物は、そのような結合によって形成された、検出可能な分析物リガンド複合体である、カセット。
- 請求項1に記載のカセットであって、ここで前記試薬手段は、(i)前記分析物と選択的に結合するのに効果的な標識されたリガンド、および(ii)該標識されたリガンドと競合的に結合するのに効果的な基質を含み、そして前記反応産物が、このような競合的な結合によって形成された検出可能な基質リガンド複合体である、カセット。
- 請求項1に記載のカセットであって、ここで前記体液試料は尿試料であり、そして前記分析物がピリジノリンまたはデオキシピリジノリンである、カセット。
- 請求項1に記載のカセットであって、前記反応小片と前記検出ゾーンとの間かつ隣接して配置される、単一の重合体メッシュの小片をさらに備える、カセット。
- 請求項1に記載のカセットであって、ここで前記試薬手段は、逆の濃度勾配で前記検出ゾーンにアプライされ、その結果前記試薬手段の濃度は、検出ゾーンを横切って下流の方向で増加する、カセット。
- 体液試料中の分析物の検出のためのアッセイ装置であって、請求項1から10のいずれかに記載したカセット、および
カセットリーダーであって、該リーダーは該カセットを受け取る開口部、および該カセットの休止位置からの前記試薬支持体に関連する前記基部を、あらかじめ決められた時間に、該カセットの異なる操作位置へ移動させる手段を有するカセットリーダー、
を備える、アッセイ装置。 - 請求項11に記載のアッセイ装置であって、検出ゾーン内において、アッセイ反応産物を検出するための検出手段をさらに備える、装置。
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