JP2510932B2 - 試料中における生物学的物質の存在を決定する方法及び装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生物学的物質、特に抗
原又は抗体を免疫学的に定量又は検出する方法、並びに
この方法を実施するための装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】定量すべき物質と１つもしくは複数の既
知の物質との間の免疫学的結合の形成によって生物学的
媒質中の抗原又は抗体の存在を検出する、比較的感度の
高い特異的な方法は多く知られている。

【０００３】その一部は、特にＡｍｅｒ．Ｊ．ｏｆ Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８２（６）−７
１９−７２１（１９８４）に記述されている免疫粘着
（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）現象を利用する。
この種の方法では、定量すべき物質に対して特異的な親
和性を有する分子又は細胞を、通常は微量滴定プレート
のウェルである容器の壁に固定し、この容器に検査すべ
き試料を入れる。感作粒子（ｐａｒｔｉｃｕｌｅｓ ｓ
ｅｎｓｉｂｉｌｉｓｅｅｓ）、即ち定量すべき物質に親
和性を介して結合し得る物質を担持している粒子の懸濁
液も導入し、動的沈降段階の後でこれら粒子の分布を調
べる。所期の物質が存在していれば、壁に固定された物
質と定量すべき物質と粒子上に存在する物質との間に生
じる免疫学的結合を介して粒子が壁に結合され、これら
の壁をむらなく覆う。従って、ウェルの底にむらのない
被覆が観察される。所期の物質が存在していなければ、
粒子は底部で、より不透明な中央点を形成する壁の収束
点の周りに集まる。粒子に作用する外力が存在しない場
合には粒子の沈降が遅くなり過ぎるため、この方法をル
ーチンの高速生物学的分析に使用することはできない。
また、周知のように、この種の沈降は適当な遠心によっ
て促進されるが、このような遠心には、精密で調整の難
しい大きな特別の装置を使用しなければならないという
問題がある。実際、遠心力を容器の対称軸と厳密に平行
に加えなければならないため、分布プロフィルが回転軸
に対する容器の位置に応じて異なることになる。また、
遠心時間及び遠心力が定量すべき反応性物質の種類に依
存するため、感度を良好にし且つ結果の誤りを回避する
ためには、定量すべき反応性物質の種類毎に遠心条件を
決定しなければならない。更に、遠心を使用するこれら
の方法はルーチン分析には使用されても、コンパクトで
簡単で低コストの自動化には適していない。

【０００４】最近になって、特許出願ＷＯ ９０／０９
５９０号で、磁性核（ｎｏｙａｕｍａｇｎｅｔｉｑｕ
ｅ）を含む感作粒子を用いて、遠心力ではなく磁力の作
用で感作粒子の沈降を促進する方法が提案された。この
方法は、遠心分離器の使用に起因する問題を解決する。

【０００５】しかしながら本出願人は後述のように、特
にＷＯ ９０／０９５９０号に記載されている前述の方
法では弱い陽性反応を陰性反応から明確に弁別すること
ができず、従ってこの方法は、不均一な抗赤血球抗体及
び輸血前検査における抗原、又は組織移植前のリンパ球
抗原の検出には感度が不十分であることを確認した。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、先行技術の
方法より明らかに感度が高く、特異的であり、高速であ
り、且つ、容器が透明であれ不透明であれ、その底部の
粒子をホトメーターで観察できると共に反応容器の充填
作業、インキュベーション及び洗浄を当業者に公知の一
般的装置で実施し得るという理由で、部分的に又は完全
に自動化できる方法を提供する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、生物学
的物質に特異的に結合する部分が固定化されている壁を
有する容器に試料を導入し、生物学的物質を結合する物
質が固定されている磁性粒子を容器に導入し、前記粒子
が壁を被覆するように前記粒子に静止磁界を作用させ、
生物学的物質に結合していない粒子が壁から離脱される
と共に容器の底に収集されるように、方向が変化する磁
界が前記粒子に作用するように、容器の磁界に関する位
置を水平方向に変え、容器中の磁性粒子の分布を観察す
るステップとを有する試料中における生物学的物質の存
在を決定する方法が提供される。

【０００８】本発明の方法は、第１の実施態様では、 ａ）検出すべき物質に対して特異的な免疫学的親和性を
示すエレメントを壁面に担持している容器に前記試料を
導入し、 ｂ）検出すべき物質に対して特異的な免疫学的親和性を
示す物質を担持している磁性粒子を加え、 ｃ）前記粒子を静止磁界の作用にかけて容器の壁に張り
付け、それによって免疫学的反応を生起させ、 ｄ）次いで、前記粒子を方向が変化する磁界の作用にか
けて、所期の物質と壁に固定されている親和性のあるエ
レメントとを介しての特異的結合により壁に固定されて
いるのではない粒子を離脱させて底に集め、 ｅ）堆積した粒子を観察する ことからなる。

【０００９】この第１の実施態様の変形例では、最終的
観察の前に粒子を更に静止磁界にかけて、免疫学的結合
により壁に付着しているのではない粒子を容器から除去
する。実際の操作では、適当に磁化したロッドを容器内
に導入し、容器の壁に特異的に付着しない粒子だけがこ
のロッドに付着するようにする。

【００１０】本発明の方法は、第２の実施態様では、 ａ）検出すべき物質に対して特異的な免疫学的親和性を
示すエレメントを壁面に担持している容器に前記試料を
導入し、 ｂ）検出すべき物質に対して免疫学的親和性を示す物質
を担持している磁性粒子を加え、 ｃ）前記粒子を静止磁界の作用にかけて容器の壁に張り
付け、それによって特有の免疫学的反応を生起させ、 ｄ）次いで、特に適当に磁化したロッドを用いて容器を
静止磁界の作用にかけることにより、免疫学的結合によ
って容器の壁に付着しているのではない粒子を容器から
除去し、 ｅ）最後に堆積粒子を観察する ことからなる。

【００１１】通常は公知のように、磁性粒子を加える前
に、検査すべき試料を感作容器内で例えば３０分以下の
時間にわたり２０℃〜４５℃の温度でインキュベートす
る。通常は更に、本発明の方法のこれら２つの最初のス
テップの合間に洗浄ステップも含まれる。これは特に、
検出すべき物質だけに対して親和性を示すのではないと
思われる物質で粒子を感作した場合に実施される。

【００１２】ルーチンの免疫学的定量は通常、時には約
百個にも及ぶ容量約３５０マイクロリットルの小カップ
状ウェルを数列に分けて平行に配置したものを含む微量
滴定プレートか、又は支持バー上に並べられた小カップ
状容器内で平行して実施されるが、適当な大きさの他の
任意の容器を使用することもできる。

【００１３】本発明は、本発明の方法を実施するための
装置にも関する。

【００１４】ここでは微量滴定プレートを使用した場合
の本発明の装置を説明するが、本発明は勿論このタイプ
の容器には限定されず、また装置のプレート数も１つと
は限らない。これらのプレートのウェルの底は、平形、
円錐形、円錐台形又は半球形であり得る。

【００１５】本発明の方法を第１の実施態様に従って実
施するのに適した本発明の装置は、 − 微量滴定プレートを水平に支持し、ウェルの寸法に
応じて半径１ｍｍ〜１５ｍｍの振幅を有する水平円形並
進運動を該プレート全体に与え得る支持体と、 − 前記プレートの下に配置された磁石集合体 とを含む。この磁石集合体の上方磁極は前記プレートと
平行であり、ウェルの下で、場合によっては正極と負極
が交互に並ぶように各ウェル毎に配置されるか、又は有
利には各ウェル列毎に帯状に配置される。２つの隣接し
た帯の上方磁極は交互に正極及び負極からなり、２つの
帯の間の間隔は極めて小さく約１／１０ｍｍ以下であ
る。これらの帯は互いに接触してもよい。

【００１６】円形並進運動（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
ｃｉｒｃｕｌａｉｒｅ）とは、その間に容器の中心が円
形軌道を描くが、容器の軸を中心とした回転は全く行わ
れないような運動を意味する。

【００１７】変形例として、この装置は、固定したプレ
ート支持体と水平円形並進運動を行い得る磁石集合体と
を含んでいてもよい。

【００１８】本発明の方法を第１の実施態様の変形又は
第２の実施態様に従って実施するのに適した本発明の装
置は、ウェルの直径より小さい直径を有する一連の円筒
形磁化ロッドと、これらのロッドを総てのウェル内に同
時に挿入し且つ取り出す手段とをも含む。ロッドの挿入
は、ウェルの軸線に沿って、ウェルの底から僅かに上の
地点、例えば０．１〜１．５ｍｍの地点に到達するまで
行う。

【００１９】前記ロッドは軟鉄又は鋼で形成し得、反応
媒質によって腐食されないように処理し得る。これらの
ロッドは使用中は永久磁石と磁気的に接触し、これらの
磁石によって磁化される。磁石は、総てのロッドに対し
て単一の磁石を使用するか、又は各ロッド毎に１つの小
形磁石を使用し得る。各ロッドを永久磁石で形成しもよ
い。ロッドの下端部の形状はこれらのロッドを受け入れ
る容器の形状に合わせて半球形、円錐形又は平形等にす
るのが好ましいが、容器の形状に合わせずに、特に半球
形ウェルと円錐形端部のような組合わせを使用すること
もできる。

【００２０】ウェルの深さより大きい長さを有し得且つ
上部の方が大きい幅を有し得る前記ロッドはグリッド又
はプレートで支持し、場合によっては永久磁石も同様に
支持する。

【００２１】本発明の方法を第２の実施態様に従って実
施するためには、磁極が交互になるように配置した第１
の装置の磁石集合体に代えて、粒子を壁方向に誘引する
磁界を容器が存在するゾーンに発生させる任意の手段、
例えば均一に磁化されたプレートを使用し得る。また、
この場合は微量滴定プレートの支持体と磁石とを互いに
固定する。

【００２２】容器の充填及び洗浄は、適当な装置で、手
動で又は公知の機械的手段を用いて実施し得、本発明の
磁気処理手段に従来の微量滴定プレート充填及び洗浄手
段を組合わせることもできる。

【００２３】また、粒子の分布プロフィルの観察は肉眼
で、好ましくは双眼解剖顕微鏡のような拡大装置を用い
て実施し得、極めて大きい感度を有するものとしては記
録システムに接続した適当なホトメータを使用し得る。
ホトメータを用いる場合は、公知のように、透明な微量
滴定プレートを使用する。

【００２４】本発明の方法では、検出すべき物質が遊離
抗原であるか、ウイルス、リンパ球、血小板、赤血球の
ような細胞の表面に結合した抗原であるか、又は血清中
もしくは別の生物学的媒質中に存在する細胞性抗原、組
織性抗原もしくはアレルゲンに対する抗体であり得る。

【００２５】従って、検出すべき物質に対して親和性を
示す物質、即ち検出すべき物質との間に免疫学的結合を
形成し得る物質は、それぞれ抗体又は抗原である。滴定
容器の壁に固定する捕捉エレメント（ｅｌｅｍｅｎｔ
ｄｅ ｃａｐｔｕｒｅ）は定量すべき物質を特異的に固
定させるようなものでなければならないが、磁性粒子に
担持される顕示物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｒｅｖｅｌ
ａｔｒｉｃｅ）は特異的なものでなくてもよい。免疫学
的分析で一般的に使用されている親和性のある適当な物
質は多数知られており、例えばポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体、抗グロブリン、レクチン、赤血球、
ウイルスタンパク質等がある。当業者は所望の測定に適
した物質を容易に選択し得るであろう。

【００２６】壁に固定するエレメントは、遊離状の抗体
もしくは抗原か、完全細胞の膜もしくはストロマの膜に
合体した抗体もしくは抗原か、又は細胞溶解物に由来す
る抗体もしくは抗原であり得る。

【００２７】捕捉エレメントは当業者に公知の方法、例
えばウェルがポリスチレン製、ポリ塩化ビニル製もしく
はポリメタクリレート製の場合の吸着、プレートの材料
に混入するかあるいは粘着フィルム中でウェルの壁に付
着させた化合物との化学的共有結合、又はイオン系染料
を介して赤血球を結合させるＥＰ−Ａ−０３５０２３３
号に記載の方法のような当業者に公知の他の任意の手法
を用いてウェルの壁に固定する。

【００２８】ウェルが捕捉エレメントを担持しているか
又は公知の方法で感作できる状態にある感作微量滴定プ
レートは幾つか市販されている。当業者には公知のよう
に、総てのプレートが免疫粘着による本発明タイプの定
量に適しているわけではない。言うまでもなく、偽陽性
又は偽陰性を回避するためには、結合部位の密度が均一
であって、好ましくは実質的に連続した単一層として顕
示粒子が壁に付着するような密度が望ましい。

【００２９】磁性粒子は、粒径が約０．５〜５マイクロ
メートル、好ましくは０．８〜１．７マイクロメートル
と小さく、粒度が十分に均一であり、通常は、容器の材
料に自然のままで強く付着することのない天然もしくは
合成ポリマーで形成する。このポリマーは、ポリマー塊
中に分散された鉄、フェライト及び合金のような磁性核
又は磁性エレメントを被覆し得る。適当な粒子は何種類
か市販されており、例えばＤｙｎａｌ社のＤｙｎａｂｅ
ａｄｓ（登録商標）又はＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ社
のＥｓｔａｐｏｒ（登録商標）が挙げられる。これらの
商品は、添加フェライトを４０重量％含み得るポリスチ
レンラテックスからなる。着色粒子を使用してもよい。

【００３０】磁性粒子に担持される物質は、定量すべき
物質に対して親和性を示すものでなければならない。例
えば、抗体の定量では種に共通の抗イムノグロブリンを
使用し、又は抗原の定量ではポリクローナルもしくはモ
ノクローナル抗体を使用するとよい。これらの物質は、
容器内への固定に使用される方法と類似の当業者に公知
の方法の１つで粒子に固定する。通常は複数の分子を同
一の粒子に同時に固定する。このようにすると、壁に固
定した定量すべき物質の分布密度が適当であれば、粒子
が極めて良く付着する。

【００３１】磁気処理の第１の段階では、総てのウェル
に対して同一の分布及び強さを有し、粒子を底部に向け
て移動させ且つ壁の表面にむらなく付着させるような方
向で作用する静止磁界内に滴定ウェルを配置する。磁力
は、沈降が高速で生起するように十分に強くなければな
らないが、既に壁に付着していた総ての粒子が壁から離
脱して最下地点に集結するという事態を防止するため
に、強すぎてはならない。

【００３２】この段階では、粒子が感作壁面の近傍に到
達した時点で、粒子に担持されている顕示物質と、特異
的捕捉エレメントを介して壁に固定された定量すべき物
質との間に親和結合が生起し得る。

【００３３】粒子を方向が変化する磁界の作用にかける
操作を含む方法の実施態様では、その段階で、結合が弱
いか又は全く結合していない粒子が離脱し、壁に沿って
滑り落ち、ウェルの最下ゾーンに集まる。

【００３４】本発明では、前記方向を変化させるための
好ましい手法が、前述のように、微量滴定プレートを磁
石集合体の上方で直径の小さい円形並進運動にかけて、
あるウェルの軸線を、その隣りのウェル、即ち当該ウェ
ルの下の磁石と反対の方向を有する磁石の上に位置する
ウェルの軸線に当該ウェルの軸線をつなぐ線と、これら
２つの磁石のエアギャップ線との交点を中心とする円に
沿って移動させるようにすることからなる。前記円の半
径は磁石の幅の半分以下、好ましくは磁石の幅の１０〜
４０％とする。

【００３５】このような条件では、ある時点で各容器の
底部の総ての点が、最強か又はそれに近い磁界が存在す
るエアギャップ線の上方に位置することになり、そのた
め結合の弱い粒子の総てが５分以下、通常は約２分とい
う極めて短い時間で壁から離脱する。

【００３６】作用させる磁界の強さは特に、粒子の大き
さ、密度及び濃度、並びに反応媒質の粘度、親和結合力
の強さ、ウェルの幾何学的条件に依存し、当業者は、妥
当な処理時間で最適感度を得ると共に偽陽性及び偽陰性
を回避すべく、予備試験によって、磁界の強さとこの強
さに依存する種々の磁気処理段階の適当な所要時間とを
決定する。

【００３７】好ましくは、ウェルの底が磁石集合体の上
方に僅かな距離をおいて位置するようにする。このよう
にすると力の弱い磁石、特に磁化粒子の添加によって磁
化したポリマーの帯からなる市販の磁石を使用すること
ができる。前記距離は通常１ｍｍのオーダーであり、
０．５テスラ以下の磁気誘導の場合は０．１〜５ｍｍで
ある。

【００３８】１２×８列で平行に配置した９６個のウェ
ルを有する１２．８ｃｍ×８．６ｃｍの一般的な微量滴
定プレートで、直径０．５〜５マイクロメートル、密度
約２以下の磁性粒子を用いて抗原又は抗体を検出する場
合は、ウェルの底の下の磁気誘導手段の強さを０．２〜
０．４テスラとし、挿入するロッドの直径を３ｍｍ、長
さを１０ｍｍ以上とし、これらのロッドによって磁極片
の近傍に０．１０〜０．２０テスラの磁気誘導を発生さ
せる。固定磁界内で粒子を堆積させる第１の段階の所要
時間は数秒〜５分であり、磁界内の移動時間は５分未
満、通常は０．５〜４ｒｐｓの回転速度で約２分であ
る。また、磁化ロッド作用時間は通常５秒〜数分であ
り、場合によっては挿入を何回か続けて繰り返す。

【００３９】本発明の方法は種々の変形例で簡単な磁気
処理装置を用いて手動で実施することができるが、免疫
学的定量を行うこの種の装置が一般的に備えているエレ
メントの他に、本発明の磁気処理装置を少なくとも１つ
備えた生物学的分析用自動装置で実施することもでき
る。

【００４０】例えば、本発明の免疫粘着法によって抗原
又は抗体を検出し得る自動装置の１つは、試料交換装
置、微量滴定プレートのウェルに懸濁磁性粒子を含む反
応体とを充填する装置、インキュベーション装置、ウェ
ル洗浄装置、本発明の磁気処理を実施するための装置、
並びに容器内に付着した粒子の定量的又は非定量的観察
を行うためのホトメータ読み取り装置を含む。これらの
種々の装置は、定量の種々のステップと解釈とを制御す
るマイクロコンピュータによって制御される。

【００４１】

【実施例】以下、添付図面に基づき特定実施例を挙げて
本発明をより詳細に説明する。

【００４２】図１〜図３は、第１の実施態様に従って本
発明の方法を実施するための装置を示している。この装
置は、微量滴定プレートを用いて免疫粘着による定量を
行うための磁気処理手段を備えている。

【００４３】図１〜図３に示した装置は、一群のウェル
２を有する微量滴定プレート１を含んでいる。このプレ
ートは支持体３の２つの部分に水平に固定されており、
前記支持体は、後で図３を参照しながら詳述する水平に
配置されたプレート４に固定されている。

【００４４】図２に示すように、微量滴定プレート１の
下には、該プレートから僅かな距離をおいて該プレート
と平行に帯状磁石６の集合体５が配置されている。これ
らの磁石はウェル２の各列の下に配置されており、上方
の磁極が交互に正極６ａ及び負極６ｂであり、２つの帯
の間には極めて小さい間隙７（エアギャップ）が設けら
れている。

【００４５】磁石６の上方に存在する静止磁界は符号８
で示した。

【００４６】磁石６の集合体５は、下にモータ１１が固
定されている平行六面体形状の枠９に固定されている。

【００４７】モータ１１は軸１３を介して中央歯車１２
を駆動する。この可動歯車は側方歯車１４、１５とかみ
合い、これらの側方歯車は、ボールベアリング１８、１
９の軸（ｍｏｙｅｕ）として機能する偏心小軸１６、１
７を各々が担持している。

【００４８】前記ボールベアリングはプレート４に嵌め
込まれており、従ってこのプレートは偏心小軸１６、１
７を担持している前記歯車の回転時に円形並進運動で駆
動されることになる。

【００４９】歯車１２、１４、１５は枠９の下方プレー
ト２１に取り付けられている。

【００５０】静止磁界を作用させるためには、図２に示
すような磁石の配置を使用する。静止磁界は、ウェル２
内に導入した粒子を壁に張り付ける機能を果たす。

【００５１】方向が変化する磁界を作用させる場合は、
モータ１１を回転させて、プレート４に固定されている
滴定プレート１を円形並進移動させる。

【００５２】このように磁界の上方でウェル２が円形並
進移動すると、方向が変化する磁界がウェル２内に発生
するだけでなく、ウェル２の中味が軽く撹拌されるた
め、結合していない粒子又は結合の弱い粒子の離脱が促
進される。

【００５３】好ましくは、円形並進運動を実施する前
に、プレートを、磁極６ａ及び６ｂが交互に変わる方向
に従ってウェルの軸間距離の約半分にほぼ等しい長さに
わたり、磁石システムに対してウェル列と平行に移動さ
せる。このようにすると、回転中に、最強の磁界が存在
するエアギャップ７の領域に各ウェルの軸線がより接近
することになる。そこで支持体には、前述の短い並進移
動を実施するための手段を具備する。

【００５４】特に好ましい実施態様では、各ウェルの軸
線がエアギャップ７の上に難なく配置される。

【００５５】図４には、本発明の方法を第１の実施態様
の変形例又は第２の実施態様に従って実施するのに適し
ている装置を示した。

【００５６】図４の装置は、ウェル２と同じ配列に従っ
て配置された一連の磁化ロッド２２を備えている。各ロ
ッド２２は軟鉄又は鋼で形成されている。その形状は円
筒形である。このロッドは、半球形の下端部２３と、永
久磁石２５に接触している上端部２４とを有する。

【００５７】この装置は、微量滴定プレートを静止及び
／又は回転磁界にかけた後で、且つ各ウェル２がまだ反
応液で満たされている間に、これらのウェル内に導入す
る。磁化ロッド２２は適当な手段（図示せず）によって
下降させ、その下端部２３がウェル２の底から僅かな距
離をおいた地点に到達するまでウェル内に沈める。前記
距離の調整及びロッド２２の調心は一般的な手段（図示
せず）によって行う。これらの磁化ロッドは、第１の磁
界（静止）の方向とほぼ反対の方向で付着粒子を誘引力
を加えるが、これによって離脱するのは、免疫学的結合
によって固定されているのではない粒子、又はこの結合
が弱い粒子だけである。

【００５８】ここで、前述の微量滴定プレート用磁気処
理装置を用いて血清中の抗赤血球抗体を検出する場合の
本発明の方法の実施例を、前出の特許出願ＷＯ９０／０
９５９０号に記載のような一定磁界の作用下での磁気沈
降によって得られた結果、又はＩｍｍｕｃｏｒ Ｉｎｃ
−Ｎｏｒｃｒｏｓｓ−Ｕ．Ｓ．Ａ．社から市販されてい
るテストＣａｐｔｕｒｅ Ｒ（登録商標）、即ち遠心分
離を行うテストの結果と比較しながら説明する。

【００５９】不均一な抗体を検出する前記テストは、検
出すべき抗体に対応する抗原を含む「テスト」赤血球を
固定したプレートで、免疫粘着法を用いて行う。この方
法は、 − 検査すべき試料と対照とを感作ウェル内に分配し、 − 約２０分という十分に長い時間にわたってインキュ
ベートし、 − 望ましくない物質を完全に除去するために等張溶液
で６回連続的に洗浄し、 − 顕示赤血球、即ちヒト抗イムノグロブリン抗体を固
定した赤血球を加え、 − ウェル付きプレート用の遠心分離器で、１０００ｇ
で１分間遠心し、 − 次いで、ウェルの底の赤血球の分布プロフィルを観
察する ことからなる。これらの操作全体を１つのプレート全体
について手動で実施するのに必要な時間は約１時間であ
る。

【００６０】本発明の方法は公知の方法より明らかに感
度が高い。

【００６１】実施例１ 不均一な抗赤血球抗体の定量 ａ）ヒト抗グロブリンで被覆した磁性粒子の製造。

【００６２】Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ社から市販さ
れている褐色ラテックス磁性粒子Ｅｓｔａｐｏｒ（登録
商標）（粒度０．８マイクロメートル）をＫＯＨ水溶液
（ｐＨ９〜１０）で洗浄し、次いで０．１Ｍのグリシン
と０．１４ＭのＮａＣｌとで製造し且つＮａＯＨの添加
によってｐＨ８．２に調整したＧＢＳ緩衝液に濃度１．
２％（ｐ／Ｖ）で懸濁させる。

【００６３】その一方で、同じ緩衝液を用いて、ヒト抗
ＩｇＧ抗体の溶液を濃度０．２ｍｇ／ｍｌで調製する。

【００６４】前記溶液及び懸濁液を同量ずつ混合し、３
７℃で４５分間撹拌する。

【００６５】感作した粒子を分離し、０．１％のウシ血
清アルブミンを加えたＧＢＳ緩衝液で十分に洗浄する。

【００６６】ｂ）検査すべき抗体の溶液の調製。

【００６７】１％（ｐ／Ｖ）の抗Ｄ抗体を含む母溶液の
希釈物を、ウシ血清アルブミン（６％ｐ／Ｖ）を加えた
ＮａＣｌ水溶液（０．９％ｐ／Ｖ）により２の割合の等
比数列で希釈しながら調製する。

【００６８】ｃ）抗体の滴定。

【００６９】下記の試験では、赤血球を固定するために
予処理したＵ形のウェルを９６個有する１２．８×８．
６ｃｍのポリスチレン製微量滴定プレートを使用する。
このプレートは、Ｉｍｍｕｃｏｒ Ｉｎｃ．から商品名
Ｃａｐｔｕｒｅ（登録商標）で市販されている。

【００７０】定量すべき抗体に対応する抗原を担持して
いる洗浄した赤血球の濃度０．５％（ｐ／Ｖ）の懸濁液
をウェル内に分配する。プレートを遠心にかけ、ウェル
を生理的食塩水で洗浄し、これに抗体溶液の各希釈物５
０マイクロリットルと、適当な低イオン力の水溶液１０
０マイクロリットルとを加える。幾つかのウェルには血
液型ＡＢの不活性ヒト血清からなる陰性対照を導入す
る。

【００７１】プレートを３７℃で２０分間インキュベー
トし、次いでウェルをＮａＣｌ水溶液（０．９％ｐ／
Ｖ）で数回洗浄する。これに、先に調製した磁性粒子懸
濁液を０．１％のウシ血清アルブミンを加えたｐＨ８．
２のＧＢＳ緩衝液で濃度０．０２％にしたものを５０マ
イクロリットル導入する。

【００７２】次いでプレートを、図１〜図３に示した磁
気処理装置上に配置する。この装置は次の特徴を有す
る。磁石集合体が、ＤＩＣ社（フランス）のＦｅｒｒｉ
ｆｌｅｘ（登録商標）（磁性粒子を添加したゴム）で形
成した厚さ５ｍｍ、幅９ｍｍ、長さ７０ｍｍの帯からな
り、ウェルの底の下方に０．８ｍｍ以下の距離をおいて
配置されており、ウェルが平行に、且つウェルの軸線が
前記帯の中央、又はより好ましくはエアギャップと一直
線になるように配置されている。

【００７３】プレートを支持体上に２秒間放置し、次い
でこのプレート支持体を約５０ｒｐｍの速度で２分間、
半径３ｍｍの円を描くように回転駆動する。

【００７４】次いで、ウェルの底の粒子の分布を肉眼で
観察する。陰性反応の場合には、ウェルの底の中央に大
きな褐色の点が見えるが、陽性反応の場合には底全体に
わたる褐色の被覆が観察される。

【００７５】陰性対照は更に、１％母溶液から予め調製
した希釈度１／１２８の抗Ｄを入れたウェルから明確に
区別される。

【００７６】比較のために、同様にして感作したマイク
ロプレートを用いて同じ希釈度で、但し感作磁性粒子の
代わりにＩｍｍｕｃｏｒ社から同社のテストＣａｐｔｕ
ｒｅ−Ｒ（登録商標）のために市販されている感作赤血
球を用いて試験を行った。Ｉｍｍｕｃｏｒ社の指示に従
い、プレートを磁気処理する代わりに１０００ｇで１分
間遠心した。この場合は、肉眼による陽性ウェル及び陰
性ウェルの判別が母溶液の１／３２の希釈度までしかで
きなかった。

【００７７】更に、前述の方法で感作プレートを調製す
ると共に、特許出願ＷＯ ９０／０９５９０号の実施例
１に記載の方法を適用してＤｙｎａｌ社の４．５マイク
ロメートルの磁性粒子Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）
Ｍ ４５０をヒト抗イムノグロブリンで被覆し、抗Ｄ希
釈物が入っているウェルに前記粒子を２５マイクロリッ
トル導入した。次いで、前記先行特許出願の実施例１に
記載のようにプレートを処理した（マイクロ撹拌機で均
質化し、次いで静止磁界の作用にかける）。この場合
は、肉眼による陽性分布の観察が困難になる最終希釈度
が１／１６であるが、同じ磁性粒子を本実施例の磁気処
理にかけた場合には希釈度１／１３２まで明確な分布が
観察され、完璧に弁別できるため、判定が極めて容易で
ある。

【００７８】最後に、０．８マイクロメートルの感作し
た磁性粒子Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）を使用し、ＷＯ
９０／０９５９０号に記載の磁気処理にかけた。その
結果得られる様相は判定不可能なものである。なぜな
ら、磁界作用時間を３０分まで延長しても陰性対照がウ
ェルの底に所期の点を形成しないからである。これに対
し、同じ粒子を本発明の磁気処理にかけた場合には、希
釈度１／１２８でも完全に弁別することができる。

【００７９】実施例２ 実施例１と同様に、但し磁気処理を３つの段階に分けて
実施しながらマイクロプレートを調製する。３つの磁気
処理段階のうち最初の２つは実施例１と同じであるが、
３つ目は、前述のような直径３ｍｍの磁化ロッドを各ウ
ェルに２分間挿入することからなる。ロッドを取出した
後、１％希釈母液の希釈度１／１０２４までの陽性分布
を双眼解剖顕微鏡で弁別する。

【００８０】実施例３ 実施例１と同様に調製したプレートの磁気処理を改変し
て、実施例２に記載した処理の最初の段階及び３つ目の
段階だけを含むようにする。

【００８１】適当なホトメータで観察すると、１％希釈
母液の希釈度１／２５６まで陽性分布の存在を確認する
ことができる。

【００８２】実施例４ Ｓｉｍｏｎｉｎ検査と称する血
液型ＡＢＯ判定 ヒト抗グロブリンで被覆した０．８マイクロメートルの
磁性粒子Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）の０．０２％（ｐ
／Ｖ）懸濁液を調製し、実施例１と同様の、但し血液型
Ａ１、Ａ２及びＢの捕捉赤血球で微量滴定プレートを被
覆する。検査すべき血漿５０マイクロリットルと、低イ
オン力溶液１００マイクロリットルとを各ウェル内に導
入し、３７℃で２０分間インキュベートする。次いでウ
ェルを洗浄し、これに５０マイクロリットルの磁性粒子
懸濁液を加えた後、プレートを実施例２と同様に２つの
段階からなる磁気処理にかける。得られた分布の観察に
よって、検査した血漿の血液型Ａ、Ｂ、ＡＢ又はＯを間
違いなく判定することができた。

【００８３】実施例５ Ｂｅｔｈ Ｖｉｎｃｅｎｔ血球
検査と称する血液型ＡＢＯ判定 この検査では、赤血球を固定できるようにＭｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ ｅｎｙｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ．７３−
Ｃ．Ｈ．Ｈｅｕｓｓｅｒ；Ｊ．Ｗ．Ｓｔｏｃｋｅｒ，
Ｒ．Ｈ．Ｇｉｓｌｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
Ｉｎｃ．−１９８１）に記載の方法でＵ形ウェルを予
め処理したポリスチレン製微量滴定プレートを使用す
る。

【００８４】実施例１と同様に、但しマウス抗グロブリ
ンで被覆した直径０．８マイクロメートルの磁性粒子Ｅ
ｓｔａｐｏｒ（登録商標）の０．０２％（ｐ／Ｖ）懸濁
液を調製する。

【００８５】予め洗浄した検査すべき赤血球の１％（ｐ
／Ｖ）懸濁液５０マイクロリットルを試料当たり３つの
ウェルに分配し、プレートを５分間室温で放置した後、
ウェルを生理的食塩水で洗浄する。ある試料に関する３
つのウェルのうち第１のウェルには５０マイクロリット
ルの抗Ａマウステスト血清を１００マイクロリットルの
低イオン力溶液と共に導入し、第２のウェルには５０マ
イクロリットルの抗Ｂマウステスト血清を同量の低イオ
ン力溶液と共に導入し、第３のウェルには抗Ａ＋Ｂテス
ト血清と低イオン力溶液とを導入する。３７℃で２０分
間インキュベートした後ウェルを洗浄し、各ウェルに５
０マイクロリットルの磁性粒子懸濁液を加え、その後プ
レートを実施例２と同様に３つの段階を含む磁気処理に
かける。磁性粒子の分布の観察により、７０の試料の各
々について血液型Ａ、Ｂ、ＡＢ又はＯを間違いなく判定
することができた。これらの試料のうちあるものは弱い
抗原性を有し、血液型Ａ₃、Ａ₃Ｂ、Ａｘ、Ｂ₃又はＢｈ
であった。

【００８６】実施例６ ＩｇＧ型イムノグロブリンの定
量 実施例１と同様にヒト抗ＩｇＧ抗体で感作した磁性粒子
の懸濁液を調製する。一方、Ｐｏｌｙｌａｂｏ社（フラ
ンス）から市販されている剛性ポリスチレン製微量滴定
プレートＭ ２４ Ａの９６個のウェルを、次のように
ヒト抗ＩｇＧヤギ抗体で被覆する。まず、２．２ｍｇ／
ｍｌの抗ＩｇＧ水溶液を１００マイクロリットル導入
し、３７℃で１時間、次いで４℃で一晩インキュベート
する。液体を除去した後、０．１％のウシ血清アルブミ
ンを含むＧＢＳ緩衝液をウェルに充填し、４℃で一晩接
触させ、次いで０．９％（ｐ／Ｖ）のＮａＣｌ水溶液で
十分に洗浄する。２％の血清アルブミンを含むＮａＣｌ
水溶液（０．９％）にＳｉｇｍａ社から市販されている
イムノグロブリンＩｇＧ Ｉ ４５０６を溶解させて濃
度１マイクログラム／ｍｌの検査すべき試料を調製す
る。陰性対照試料には希釈剤しか含ませない。プレート
の各ウェルに試料１００マイクロリットルを導入し、３
７℃で４５分間インキュベートした後、生理的食塩水で
洗浄する。

【００８７】次いで、０．１％のウシ血清アルブミンを
加えたｐＨ８．２のＧＢＳ緩衝液で濃度０．０２％にし
た磁性粒子懸濁液５０マイクロリットルを各ウェルに入
れ、プレートを実施例２と同様の磁気処理にかける。陽
性ウェルは肉眼で完璧に陰性ウェルから弁別できる。

【００８８】実施例７ 不均一な抗赤血球抗体の検出 磁性粒子溶液と不均一抗体を含む検査すべき血清又は血
漿の溶液（希釈度１／２０４８まで）とを実施例１と同
様に調製する。

【００８９】特異性Ｃ、ｃ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｋｐｂ、Ｆｙ
ａ、Ｆｙｂ、Ｊｋａ、Ｊｋｂ、Ｓ又はＬｕｂの不均一ア
ロ抗体を含む２６の血清又は血漿を検査する一方で、不
均一抗体を全く含んでいないことがわかっている１７０
の陰性血漿を検査する。

【００９０】ウェルを実施例５と同様に予処理し、次い
で、所期の抗体に対する特異性がわかっているテスト赤
血球の１％（ｐ／Ｖ）懸濁液をウェルに５０マイクロリ
ットル入れる。室温で５分間静置した後、これらのウェ
ルを洗浄する。

【００９１】不均一抗体を含む血漿を検査するために、
各試料について、所期の抗体に対応する抗原を担持して
いるテスト赤血球を１つのウェルに導入し、前記抗原を
含まないテスト赤血球を１つのウェルに導入する。

【００９２】希釈していない陰性血漿を検査するため
に、総ての血液型抗原を担持しているテスト赤血球を１
つのウェルに入れる。

【００９３】洗浄したウェルに５０マイクロリットルの
検査すべき溶液と１００マイクロリットルの低イオン力
水溶液とを入れ、３７℃で２０分間インキュベートす
る。次いでウェルを洗浄してから５０マイクロリットル
の磁性粒子懸濁液を入れ、プレートを実施例２と同様に
３つの段階からなる磁気処理にかけ、その後粒子の分布
を目又はホトメータで観察する。

【００９４】陰性血漿では偽陽性反応は全く観察されな
かった。これは、この方法の特異性が高いことを示すも
のである。

【００９５】力価、即ち検査した抗体試料について陽性
反応が観察された最終希釈度を、表Ｉに示す。

【００９６】幾つかの場合には、抗Ｄ抗体を含む血清に
関する力価の測定を１０回繰り返したが、希釈度１／１
２８での力価の有意な差は観察されなかった。

【００９７】比較のために、Ｉｍｍｕｃｏｒ社のＣａｐ
ｔｕｒｅ（登録商標）で２６の不均一抗体試料の定量を
行った。その結果、試料の５６％について、本発明の方
法の方が感度が高く、１〜３の力価差に対応する明らか
な増加を示すことが判明した。

【００９８】

【表１】

【００９９】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の装置を、その一部を露出させて示す平
面図である。

【図２】微量滴定プレート及び磁石を含む前記装置の一
部分の最初の静止磁気処理時の状態を拡大して示す線２
−２に沿った断面図である。

【図３】図１の装置の線３−３に沿った断面図である。

【図４】本発明の方法をある実施態様に従って実施する
ための装置の一部分を拡大して示す断面図である。

【符号の説明】

１ 微量滴定プレート ２ ウェル ６ 磁石 ２２ 磁化ロッド

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）生物学的物質に特異的に結合する部
   分が固定化されている壁を有する容器に試料を導入し、 ｂ） 生物学的物質を結合する物質が固定されている磁
   性粒子を容器に導入し、 ｃ） 前記粒子が壁を被覆するように前記粒子に静止磁
   界を作用させ、 ｄ） 生物学的物質に結合していない粒子が壁から離脱
   されると共に容器の底に収集されるように、方向が変化
   する磁界が前記粒子に作用するように、容器の磁界に関
   する位置を水平方向に変え、 ｅ） 容器中の磁性粒子の分布を観察するステップとを
   有する試料中における生物学的物質の存在を決定する方
   法。
2. 【請求項２】 ステップｄ）の後に、壁上の生物学的物
   質に結合していない粒子を離脱させるために前記粒子に
   静止磁界を作用させるステップを更に含んでいる請求項
   １に記載の方法。
3. 【請求項３】 容器が微量滴定プレートのウェルである
   請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 容器が微量滴定プレートのウェルである
   請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 磁性粒子が０．５から５ミクロンの直径
   を有する請求項３に記載の方法。
6. 【請求項６】 磁性粒子上に固定化されており、試料中
   で検定されるべき生物学的物質を特定的に結合する成分
   が、特定的に生物学的物質を結合する物質で被覆されて
   いる微量滴定プレートのウェル中の試料と反応し、生物
   学的物質の存在又は不在の表示として粒子の分布が観察
   される免疫学的検定用装置であって、前記装置は、 −水平微量滴定プレートを水平方向に並進移動させる手
   段を有する前記プレートの支持手段と、 −前記プレートの各ウェルの下に位置し、前記プレート
   と平行な上方磁極を有し、交互の磁極がチェック模様又
   は帯状に配置されている小さい磁石の一組とを有する免
   疫学的検定用装置。
7. 【請求項７】 磁性粒子上に固定化されており、試料中
   で検定されるべき生物学的物質を特定的に結合する成分
   が、特定的に生物学的物質を結合する物質で被覆されて
   いる微量滴定プレートのウェル中の試料と反応し、生物
   学的物質の存在又は不在の表示として粒子の分布が観察
   される免疫学的検定用装置であって、 −水平微量滴定プレートの固定支持手段と、 −前記プレートの各ウェルの下に位置し、前記プレート
   と平行な上方磁極を有し、交互の電極がチェック模様又
   は帯状に配置されている小さい磁石の一組と、 −プレート及び磁石に相対的円形並進運動を水平方向に
   行わせる手段とを有する免疫学的検定用装置。
8. 【請求項８】 磁石が磁化ポリマから成る請求項６に記
   載の装置。
9. 【請求項９】 磁石が磁化ポリマから成る請求項７に記
   載の装置。