JPH11118804A - Ｐｓａ−ａｃｔの測定 - Google Patents
Ｐｓａ−ａｃｔの測定Info
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- JPH11118804A JPH11118804A JP10230105A JP23010598A JPH11118804A JP H11118804 A JPH11118804 A JP H11118804A JP 10230105 A JP10230105 A JP 10230105A JP 23010598 A JP23010598 A JP 23010598A JP H11118804 A JPH11118804 A JP H11118804A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ２部位免疫測定アッセイによる血液サンプル
中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびα-1- 抗キモト
リプシン（ＡＣＴ）の複合体の正確かつ特異的な測定方
法を提供する。 【解決手段】 標識抗体試薬および微小粒子に固定され
ているか固定され得る捕捉抗体試薬を使用する２部位免
疫測定アッセイによって、血液サンプル中のＰＳＡ−Ａ
ＣＴを測定する。生成した固定化免疫複合体を好ましく
は複数回、そして好ましくは自動化分析装置によって洗
浄し、そして洗浄された微小粒子中の標識抗体試薬を測
定する。 【効果】 ＰＳＡ−ＡＣＴの測定は診断の促進および前
立腺ガンの監視のための高感度で特異的な方法を提供
し、また相当数の患者の不必要な前立腺生検の実施の必
要性を除去する。
中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびα-1- 抗キモト
リプシン（ＡＣＴ）の複合体の正確かつ特異的な測定方
法を提供する。 【解決手段】 標識抗体試薬および微小粒子に固定され
ているか固定され得る捕捉抗体試薬を使用する２部位免
疫測定アッセイによって、血液サンプル中のＰＳＡ−Ａ
ＣＴを測定する。生成した固定化免疫複合体を好ましく
は複数回、そして好ましくは自動化分析装置によって洗
浄し、そして洗浄された微小粒子中の標識抗体試薬を測
定する。 【効果】 ＰＳＡ−ＡＣＴの測定は診断の促進および前
立腺ガンの監視のための高感度で特異的な方法を提供
し、また相当数の患者の不必要な前立腺生検の実施の必
要性を除去する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、２部位免疫測定ア
ッセイによる血液サンプル中の前立腺特異的抗原（ＰＳ
Ａ）およびα-1- 抗キモトリプシン（ＡＣＴ）の複合体
の正確かつ特異的な測定に関する。
ッセイによる血液サンプル中の前立腺特異的抗原（ＰＳ
Ａ）およびα-1- 抗キモトリプシン（ＡＣＴ）の複合体
の正確かつ特異的な測定に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）はヒト
カリクレインファミリーに高度にアミノ酸相同性を有す
る約33,000ダルトンの糖タンパク質であり（１，２）、
トリプシンおよびキモトリプシン様活性を有するセリン
プロテアーゼであることが示されている（３，４，
５）。ＰＳＡは前立腺の上皮細胞から分泌され、精液中
に見出だされる主要なタンパク質の１つである（６）。
前立腺ガンの患者の血清中でＰＳＡの濃度が上昇すると
いう発見に続いて、多数の報告がこのタンパク質を前立
腺ガン患者の管理のための重要で臨床上有用なバイオマ
ーカーとして立証した（７，８，９，10）。最近の努力
は無症状者の前立腺ガンの早期検出のための血清ＰＳＡ
試験の利用に焦点を当ててきた。実際、アメリカガン学
会（American CancerSociety ）およびアメリカ泌尿器
学会（American Urological Society ）は最近、50才を
超えたすべての男性は毎年直腸指診（ＤＲＥ）とともに
血清ＰＳＡを使用してスクリーニングを受けるべきであ
ると勧告した（11）。
カリクレインファミリーに高度にアミノ酸相同性を有す
る約33,000ダルトンの糖タンパク質であり（１，２）、
トリプシンおよびキモトリプシン様活性を有するセリン
プロテアーゼであることが示されている（３，４，
５）。ＰＳＡは前立腺の上皮細胞から分泌され、精液中
に見出だされる主要なタンパク質の１つである（６）。
前立腺ガンの患者の血清中でＰＳＡの濃度が上昇すると
いう発見に続いて、多数の報告がこのタンパク質を前立
腺ガン患者の管理のための重要で臨床上有用なバイオマ
ーカーとして立証した（７，８，９，10）。最近の努力
は無症状者の前立腺ガンの早期検出のための血清ＰＳＡ
試験の利用に焦点を当ててきた。実際、アメリカガン学
会（American CancerSociety ）およびアメリカ泌尿器
学会（American Urological Society ）は最近、50才を
超えたすべての男性は毎年直腸指診（ＤＲＥ）とともに
血清ＰＳＡを使用してスクリーニングを受けるべきであ
ると勧告した（11）。
【０００３】前立腺ガンの早期検出の臨床的価値はいく
つかの理由によって論争の的となったままである。第１
に、早期段階での前立腺ガンの治療が発症集団における
生存率を改善するかどうかが明白でない。この論点を目
的として計画された臨床試験は現在実施中である。第２
に、最近、50才を超えた男性における前立腺ガンの早期
検出のために、血清ＰＳＡ測定の有効性について、直腸
指診（ＤＲＥ）と連携させて臨床試験で測定した（1
2）。異常ＤＲＥまたは上昇したＰＳＡ試験値のいずれ
かを有した1060人の患者の内、22％のみが前立腺ガンで
あった。これらのデータは全前立腺生検の70−80％がガ
ンでない男性に実施されることを示している。50才を超
えた男性の30−50％が剖検上前立腺ガンの徴候を示すか
ら、上昇ＰＳＡアッセイによって標的とされる不必要な
前立腺生検の数は非常に高いということができる。この
ことは、医療コストの増大および生検操作に関連した罹
病率の増大の両方の結果を招く。
つかの理由によって論争の的となったままである。第１
に、早期段階での前立腺ガンの治療が発症集団における
生存率を改善するかどうかが明白でない。この論点を目
的として計画された臨床試験は現在実施中である。第２
に、最近、50才を超えた男性における前立腺ガンの早期
検出のために、血清ＰＳＡ測定の有効性について、直腸
指診（ＤＲＥ）と連携させて臨床試験で測定した（1
2）。異常ＤＲＥまたは上昇したＰＳＡ試験値のいずれ
かを有した1060人の患者の内、22％のみが前立腺ガンで
あった。これらのデータは全前立腺生検の70−80％がガ
ンでない男性に実施されることを示している。50才を超
えた男性の30−50％が剖検上前立腺ガンの徴候を示すか
ら、上昇ＰＳＡアッセイによって標的とされる不必要な
前立腺生検の数は非常に高いということができる。この
ことは、医療コストの増大および生検操作に関連した罹
病率の増大の両方の結果を招く。
【０００４】ＰＳＡがα1-抗キモトリプシン（ＡＣ
Ｔ）、α2-マクログロブリンおよびα1-抗トリプシンな
どのプロテアーゼインヒビターとの複合体を形成するこ
とを、いくつかの研究室が別々に示した（13−19）。Ａ
ＣＴまたはα1-抗トリプシンとの複合体、若しくは遊離
の非複合体形態のＰＳＡはイムノアッセイ技術によって
血清中で検出可能である。実際、血清中の免疫反応性Ｐ
ＳＡの大部分はＡＣＴと複合体化し、ＡＣＴに結合した
ＰＳＡおよび総血清ＰＳＡ濃度間には有意な相関性が証
明されている（13）。しかし、α2-マクログロブリンに
結合したＰＳＡは、このプロテアーゼとの複合体化にと
もなう抗体のＰＳＡへの結合の立体障害によって、血清
中で測定することができない。初期の研究において、Ｐ
ＳＡ−ＡＣＴ数値および総ＰＳＡに対するＰＳＡ−ＡＣ
Ｔの割合は前立腺ガン診断において有用であることが示
唆された（13，15，16，17）が、種々の理由（その中の
いくつかについて以下に論述する）によって、ＰＳＡ−
ＡＣＴの血清測定の臨床上の有用性の結論を下すことは
困難だった。
Ｔ）、α2-マクログロブリンおよびα1-抗トリプシンな
どのプロテアーゼインヒビターとの複合体を形成するこ
とを、いくつかの研究室が別々に示した（13−19）。Ａ
ＣＴまたはα1-抗トリプシンとの複合体、若しくは遊離
の非複合体形態のＰＳＡはイムノアッセイ技術によって
血清中で検出可能である。実際、血清中の免疫反応性Ｐ
ＳＡの大部分はＡＣＴと複合体化し、ＡＣＴに結合した
ＰＳＡおよび総血清ＰＳＡ濃度間には有意な相関性が証
明されている（13）。しかし、α2-マクログロブリンに
結合したＰＳＡは、このプロテアーゼとの複合体化にと
もなう抗体のＰＳＡへの結合の立体障害によって、血清
中で測定することができない。初期の研究において、Ｐ
ＳＡ−ＡＣＴ数値および総ＰＳＡに対するＰＳＡ−ＡＣ
Ｔの割合は前立腺ガン診断において有用であることが示
唆された（13，15，16，17）が、種々の理由（その中の
いくつかについて以下に論述する）によって、ＰＳＡ−
ＡＣＴの血清測定の臨床上の有用性の結論を下すことは
困難だった。
【０００５】Lilja，Stenmanおよび共同研究者たちは19
91年に、血清ＰＳＡが遊離形態ならびにＡＣＴおよびα
1-抗トリプシンとの複合体で存在することを発表した
（13，18）。その後の研究において、Stenman らは、遊
離プラス複合体化ＰＳＡ（通常のＰＳＡアッセイではα
2-マクログロブリンとの複合体化ＰＳＡは測定されない
が、これを総ＰＳＡと称する）と関連させたＰＳＡ−Ａ
ＣＴの測定が、前立腺ガンの男性と良性前立腺肥大症
（ＢＰＨ）などの良性の前立腺疾患の男性との鑑別を改
善するらしいことを表明した。しかし、ＰＳＡ−ＡＣＴ
複合体の正確な測定は、この複合体の正確な測定におけ
る技術的問題のため、達成されていない。Stenman ら
は、ＰＳＡ−ＡＣＴ数値と総ＰＳＡの測定との相関関係
は低濃度末端では良好でなく、ｙ軸交点が上昇して、複
合体化ＰＳＡの過剰再現を示すことを発見した（13およ
び米国特許第5,501,983 号）。実際に、彼らは、試験し
た大部分の患者について、ＰＳＡ−ＡＣＴの濃度が総Ｐ
ＳＡよりも高いことを発見した（米国特許第5,501,983
号）。その後の複合体化および遊離ＰＳＡの相関関係の
分析は、勾配1.12を示し、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の過剰
再現を示した（16）。Petterssonらは、メスの血清中で
上昇したＰＳＡ−ＡＣＴ数値を発見した時、この過剰再
現に注目した（20）。ヘパリンの添加はメス血清におけ
る偽陽性値の率を減少させたが、前立腺ガンおよびＢＰ
Ｈ患者におけるＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の測定の最近の試
みでは、複合体の有意な過剰再現が示され続けている
（21）。
91年に、血清ＰＳＡが遊離形態ならびにＡＣＴおよびα
1-抗トリプシンとの複合体で存在することを発表した
（13，18）。その後の研究において、Stenman らは、遊
離プラス複合体化ＰＳＡ（通常のＰＳＡアッセイではα
2-マクログロブリンとの複合体化ＰＳＡは測定されない
が、これを総ＰＳＡと称する）と関連させたＰＳＡ−Ａ
ＣＴの測定が、前立腺ガンの男性と良性前立腺肥大症
（ＢＰＨ）などの良性の前立腺疾患の男性との鑑別を改
善するらしいことを表明した。しかし、ＰＳＡ−ＡＣＴ
複合体の正確な測定は、この複合体の正確な測定におけ
る技術的問題のため、達成されていない。Stenman ら
は、ＰＳＡ−ＡＣＴ数値と総ＰＳＡの測定との相関関係
は低濃度末端では良好でなく、ｙ軸交点が上昇して、複
合体化ＰＳＡの過剰再現を示すことを発見した（13およ
び米国特許第5,501,983 号）。実際に、彼らは、試験し
た大部分の患者について、ＰＳＡ−ＡＣＴの濃度が総Ｐ
ＳＡよりも高いことを発見した（米国特許第5,501,983
号）。その後の複合体化および遊離ＰＳＡの相関関係の
分析は、勾配1.12を示し、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の過剰
再現を示した（16）。Petterssonらは、メスの血清中で
上昇したＰＳＡ−ＡＣＴ数値を発見した時、この過剰再
現に注目した（20）。ヘパリンの添加はメス血清におけ
る偽陽性値の率を減少させたが、前立腺ガンおよびＢＰ
Ｈ患者におけるＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の測定の最近の試
みでは、複合体の有意な過剰再現が示され続けている
（21）。
【０００６】ＰＳＡ−ＡＣＴ測定において遭遇するこの
問題点のため、文献中の関心は総ＰＳＡの測定とともに
複合体化していない遊離のＰＳＡの測定に移った。総Ｐ
ＳＡ値の範囲が約4−10 ng/mL の場合に改善された特異
性が要求されることは、現在明白である。血清総ＰＳＡ
が＜4.0 ng/mL の場合、前立腺ガンのリスクは低い；同
様に、総ＰＳＡが＞10 ng/mLの場合、前立腺ガンのリス
クは＞50％であり、前立腺生検が必要となる。診断のグ
レイゾーン内（一般的に2−20 ng/mL 、普通は4−10 ng
/mL ）において、ガンのリスクは高いが偽陽性の割合も
また高い。遊離ＰＳＡ／総ＰＳＡ比の遡及適用によっ
て、4−10 ng/mL グレイゾーンにおける総ＰＳＡの特異
性をおよそ50−60％から70−80％に改善することができ
ることが示された（22−26）。この改善された特異性の
結果、不必要な生検を20−30％減少させることができ
る。PCT 国際公開公報第96-26441号および国際公開公
報第97-12245号には総ＰＳＡ数値が2.5 から20 ng/mLの
間の患者におけるＢＰＨおよびガンのそれぞれの鑑別を
改善するための、遊離ＰＳＡ／総ＰＳＡ比の使用につい
て同様に記載されている。
問題点のため、文献中の関心は総ＰＳＡの測定とともに
複合体化していない遊離のＰＳＡの測定に移った。総Ｐ
ＳＡ値の範囲が約4−10 ng/mL の場合に改善された特異
性が要求されることは、現在明白である。血清総ＰＳＡ
が＜4.0 ng/mL の場合、前立腺ガンのリスクは低い；同
様に、総ＰＳＡが＞10 ng/mLの場合、前立腺ガンのリス
クは＞50％であり、前立腺生検が必要となる。診断のグ
レイゾーン内（一般的に2−20 ng/mL 、普通は4−10 ng
/mL ）において、ガンのリスクは高いが偽陽性の割合も
また高い。遊離ＰＳＡ／総ＰＳＡ比の遡及適用によっ
て、4−10 ng/mL グレイゾーンにおける総ＰＳＡの特異
性をおよそ50−60％から70−80％に改善することができ
ることが示された（22−26）。この改善された特異性の
結果、不必要な生検を20−30％減少させることができ
る。PCT 国際公開公報第96-26441号および国際公開公
報第97-12245号には総ＰＳＡ数値が2.5 から20 ng/mLの
間の患者におけるＢＰＨおよびガンのそれぞれの鑑別を
改善するための、遊離ＰＳＡ／総ＰＳＡ比の使用につい
て同様に記載されている。
【０００７】しかし、遊離ＰＳＡの測定にはそれ自体に
技術上の困難がある。第１に、診断のグレイゾーン内に
おいて、遊離ＰＳＡは典型的にはかなり低く、5−30％
の範囲である。したがって完成された遊離ＰＳＡアッセ
イは0.2−3.0 ng/mLの範囲内を正確に測定しなければな
らない。また、遊離ＰＳＡの割合はＢＰＨおよびガン患
者においてあまり差異がなく、遊離ＰＳＡ／総ＰＳＡ比
はＡＣＴと複合体化したＰＳＡの割合の増加によって減
少する。その上、遊離ＰＳＡは血清中で安定ではなく、
遊離ＰＳＡ数値は時間が経つと、おそらくα2-マクログ
ロブリンとの複合体化によって、減少することが知られ
てきた。
技術上の困難がある。第１に、診断のグレイゾーン内に
おいて、遊離ＰＳＡは典型的にはかなり低く、5−30％
の範囲である。したがって完成された遊離ＰＳＡアッセ
イは0.2−3.0 ng/mLの範囲内を正確に測定しなければな
らない。また、遊離ＰＳＡの割合はＢＰＨおよびガン患
者においてあまり差異がなく、遊離ＰＳＡ／総ＰＳＡ比
はＡＣＴと複合体化したＰＳＡの割合の増加によって減
少する。その上、遊離ＰＳＡは血清中で安定ではなく、
遊離ＰＳＡ数値は時間が経つと、おそらくα2-マクログ
ロブリンとの複合体化によって、減少することが知られ
てきた。
【０００８】この間に、こうした問題を克服するための
試みにともなって、血液中のＰＳＡ−ＡＣＴの正確な測
定に関連する問題のさらに別の認識が得られた。1994
年、Hybritech の研究者は抗ＰＳＡおよび抗ＡＣＴを使
用したＰＳＡ−ＡＣＴのためのサンドイッチイムノアッ
セイの開発を報告した。彼らは、測定したＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ値が前立腺ガンの診断における改善された臨床上の特
異性を証明することができないと結論づけた（27）。後
に、このグループはJohns Hopkins Medical Institutio
nsの研究者と共同して、抗ＰＳＡ／抗ＡＣＴサンドイッ
チイムノアッセイ法は有意の非特異的結合およびＰＳＡ
−ＡＣＴの過剰再現の難点があるという知見を報告し
た。彼らは、解決することなく、これらの問題がＰＳＡ
−ＡＣＴの測定を臨床的に無意味なものとしていると結
論づけた（28）。続いて、この共同グループは、ＰＳＡ
−ＡＣＴ複合体に特異的なモノクローナル抗体に基づく
ＰＳＡ−ＡＣＴのサンドイッチイムノアッセイの開発を
通してこの非特異的結合の問題を克服したと報告した
（29，30）。しかし、彼らの臨床研究では、総ＰＳＡの
測定または総ＰＳＡに対するＰＳＡ−ＡＣＴの計算上の
比に比較してＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のみの測定による前
立腺ガンに対する特異性の何らかの改善を示すことがで
きなかった（29）。ブロック試薬の使用を含む、ＰＳＡ
−ＡＣＴ測定に関連する問題を克服するその他の研究方
法が提案されてきた（31）。
試みにともなって、血液中のＰＳＡ−ＡＣＴの正確な測
定に関連する問題のさらに別の認識が得られた。1994
年、Hybritech の研究者は抗ＰＳＡおよび抗ＡＣＴを使
用したＰＳＡ−ＡＣＴのためのサンドイッチイムノアッ
セイの開発を報告した。彼らは、測定したＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ値が前立腺ガンの診断における改善された臨床上の特
異性を証明することができないと結論づけた（27）。後
に、このグループはJohns Hopkins Medical Institutio
nsの研究者と共同して、抗ＰＳＡ／抗ＡＣＴサンドイッ
チイムノアッセイ法は有意の非特異的結合およびＰＳＡ
−ＡＣＴの過剰再現の難点があるという知見を報告し
た。彼らは、解決することなく、これらの問題がＰＳＡ
−ＡＣＴの測定を臨床的に無意味なものとしていると結
論づけた（28）。続いて、この共同グループは、ＰＳＡ
−ＡＣＴ複合体に特異的なモノクローナル抗体に基づく
ＰＳＡ−ＡＣＴのサンドイッチイムノアッセイの開発を
通してこの非特異的結合の問題を克服したと報告した
（29，30）。しかし、彼らの臨床研究では、総ＰＳＡの
測定または総ＰＳＡに対するＰＳＡ−ＡＣＴの計算上の
比に比較してＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のみの測定による前
立腺ガンに対する特異性の何らかの改善を示すことがで
きなかった（29）。ブロック試薬の使用を含む、ＰＳＡ
−ＡＣＴ測定に関連する問題を克服するその他の研究方
法が提案されてきた（31）。
【０００９】前立腺ガンの患者においてなぜＡＣＴと複
合体化したＰＳＡの割合が増大するかは不明のままであ
るが、ＡＣＴに対する抗体がＢＰＨ患者からの前立腺上
皮を染色(stain) しないこと、およびこの組織において
ｍＲＮＡの転写が見られないことの観察に関係がありそ
うである。反対に、前立腺ガンの患者からの前立腺上皮
において抗ＡＣＴの免疫反応性およびｍＲＮＡ合成が検
出される（32）。これらは、前立腺腫瘍中で、ＰＳＡは
血清中に放出される前にそのままＡＣＴと複合体化する
らしいことを示唆している。活性ＰＳＡの血流への移行
には別の機構が関与するようである。健康な男性からの
血清中に見られる遊離ＰＳＡはタンパク質分解によって
切断され、酵素的に不活性である。しかし、腫瘍は血管
原性因子を合成し、これが腫瘍組織の血管新生の増加を
導く。腫瘍中では、より大きな割合の酵素的に活性なＰ
ＳＡが血流への移行を獲得するようである。この活性Ｐ
ＳＡはＡＣＴなどのプロテアーゼインヒビターと複合体
化するものと予想され、これによって前立腺ガン患者か
らの血清中でのＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のより高い割合が
もたらされると考えられる。
合体化したＰＳＡの割合が増大するかは不明のままであ
るが、ＡＣＴに対する抗体がＢＰＨ患者からの前立腺上
皮を染色(stain) しないこと、およびこの組織において
ｍＲＮＡの転写が見られないことの観察に関係がありそ
うである。反対に、前立腺ガンの患者からの前立腺上皮
において抗ＡＣＴの免疫反応性およびｍＲＮＡ合成が検
出される（32）。これらは、前立腺腫瘍中で、ＰＳＡは
血清中に放出される前にそのままＡＣＴと複合体化する
らしいことを示唆している。活性ＰＳＡの血流への移行
には別の機構が関与するようである。健康な男性からの
血清中に見られる遊離ＰＳＡはタンパク質分解によって
切断され、酵素的に不活性である。しかし、腫瘍は血管
原性因子を合成し、これが腫瘍組織の血管新生の増加を
導く。腫瘍中では、より大きな割合の酵素的に活性なＰ
ＳＡが血流への移行を獲得するようである。この活性Ｐ
ＳＡはＡＣＴなどのプロテアーゼインヒビターと複合体
化するものと予想され、これによって前立腺ガン患者か
らの血清中でのＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のより高い割合が
もたらされると考えられる。
【００１０】したがって、前立腺ガンに関する男性患者
のスクリーニングに関連して、複合体化ＰＳＡの正確な
測定方法および複合体化ＰＳＡの血中値の臨床上の意義
を評価する必要がある。
のスクリーニングに関連して、複合体化ＰＳＡの正確な
測定方法および複合体化ＰＳＡの血中値の臨床上の意義
を評価する必要がある。
【００１１】欧州特許第635,575 号には、遊離ＰＳＡに
は結合するがＰＳＡ−ＡＣＴには結合しないモノクロー
ナル抗体の調製について記載されている。PCT 国際公開
公報第95/18381号は、遊離ＰＳＡには結合するが複合体
化ＰＳＡには結合しない抗体の添加によって、遊離およ
び複合体化ＰＳＡに対して等モルの応答性を提供するこ
とができるようにした、ＰＳＡ測定のためのモノクロー
ナル／ポリクローナルイムノアッセイ法に関係してい
る。
は結合するがＰＳＡ−ＡＣＴには結合しないモノクロー
ナル抗体の調製について記載されている。PCT 国際公開
公報第95/18381号は、遊離ＰＳＡには結合するが複合体
化ＰＳＡには結合しない抗体の添加によって、遊離およ
び複合体化ＰＳＡに対して等モルの応答性を提供するこ
とができるようにした、ＰＳＡ測定のためのモノクロー
ナル／ポリクローナルイムノアッセイ法に関係してい
る。
【００１２】米国特許出願番号第08/595,155号およびZh
ou Z,NgPC,Very DL,Allard WJ,Yeung KK,J.Clin.Lab.An
al.(1996),10:155-159, には、モノクローナル／ポリク
ローナルイムノアッセイにおいて遊離および複合体化Ｐ
ＳＡに対して等モルの応答性を提供するモノクローナル
抗体の調製方法が記載されている。記載されているモノ
クローナル抗体は、ＰＳＡに結合して、遊離ＰＳＡには
結合するが複合体化ＰＳＡには結合しない抗体にＰＳＡ
が結合するのを実質的に不可能にするという、独特の特
性を有している。
ou Z,NgPC,Very DL,Allard WJ,Yeung KK,J.Clin.Lab.An
al.(1996),10:155-159, には、モノクローナル／ポリク
ローナルイムノアッセイにおいて遊離および複合体化Ｐ
ＳＡに対して等モルの応答性を提供するモノクローナル
抗体の調製方法が記載されている。記載されているモノ
クローナル抗体は、ＰＳＡに結合して、遊離ＰＳＡには
結合するが複合体化ＰＳＡには結合しない抗体にＰＳＡ
が結合するのを実質的に不可能にするという、独特の特
性を有している。
【００１３】日本特許公告公報第62-46263号にはプロテ
アーゼインヒビターとの複合体化ＰＳＡの測定のための
サンドイッチイムノアッセイが記載されている。
アーゼインヒビターとの複合体化ＰＳＡの測定のための
サンドイッチイムノアッセイが記載されている。
【００１４】ドイツ特許出願公開公報第4,322,342 号に
は、総ＰＳＡに対するＰＳＡ−ＡＣＴの比率を計算する
ための数値を提供する目的で、単一のアッセイにおいて
総ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴの両方を測定する方法が
記載されている。
は、総ＰＳＡに対するＰＳＡ−ＡＣＴの比率を計算する
ための数値を提供する目的で、単一のアッセイにおいて
総ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴの両方を測定する方法が
記載されている。
【００１５】Chichibuらは、Journal of Medicine and
Pharmaceutical Science(Japan,1996)36(3):477-483,に
おいて、ビーズに結合させた抗ＰＳＡおよび酵素標識抗
ＡＣＴを使用したＰＳＡ−ＡＣＴのためのサンドイッチ
イムノアッセイを記述している。血液サンプル中のＰＳ
Ａ−ＡＣＴを正確に測定する能力を確定するデータは含
まれていない。
Pharmaceutical Science(Japan,1996)36(3):477-483,に
おいて、ビーズに結合させた抗ＰＳＡおよび酵素標識抗
ＡＣＴを使用したＰＳＡ−ＡＣＴのためのサンドイッチ
イムノアッセイを記述している。血液サンプル中のＰＳ
Ａ−ＡＣＴを正確に測定する能力を確定するデータは含
まれていない。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、２部位免疫
測定アッセイによる血液サンプル中の前立腺特異的抗原
（ＰＳＡ）およびα-1- 抗キモトリプシン（ＡＣＴ）の
複合体の正確かつ特異的な測定方法を提供することを目
的とする。
測定アッセイによる血液サンプル中の前立腺特異的抗原
（ＰＳＡ）およびα-1- 抗キモトリプシン（ＡＣＴ）の
複合体の正確かつ特異的な測定方法を提供することを目
的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】捕捉抗体を微小粒子（例
えば磁気応答性微小粒子）に固定する２部位免疫測定ア
ッセイによって、血液サンプル中のＰＳＡ−ＡＣＴの正
確かつ特異的な測定が得られることが本発明において見
いだされた。一般的には、本発明の方法は、（ａ）ＰＳ
Ａへの結合について特異的な第１抗体試薬およびＡＣＴ
への結合について特異的な第２抗体試薬であって、この
第１および第２の抗体試薬の１つが微小粒子に固定され
（「捕捉抗体」）、これらの抗体試薬の他方が標識され
ている（「検出抗体」）２つの抗体試薬に結合した血液
サンプルからのＰＳＡ−ＡＣＴの固定されかつ標識され
た免疫複合体を含有する反応混合物を形成させ、（ｂ）
該固定された免疫複合体を含む微小粒子をその他の反応
混合物から分離し、（ｃ）分離した微小粒子を好ましく
は２回以上洗浄し、（ｄ）洗浄した微小粒子の標識抗体
試薬を測定する、段階を含む。好ましくは、分離および
洗浄段階を自動分析装置によって実施する。また、好ま
しくは、第１および第２抗体試薬はモノクローナル抗体
を含む。ＰＳＡ−ＡＣＴの固定化および標識免疫複合体
を含有する反応混合物は、通常、血液サンプルを、該第
１および第２抗体試薬であって、該第１および第２の試
薬の１つが該微小粒子に固定され、または固定されるこ
とができるものであり（「捕捉抗体」）、該抗体試薬の
他方が例えば酵素または化学発光化合物で標識または標
識されることができるものである（「検出抗体」）抗体
試薬と混合することによって形成させる。特に好ましい
方法において、捕捉抗体をリガンドで修飾し、該微小粒
子に固着させたリガンドの結合相手と接触させることに
よって固定する。
えば磁気応答性微小粒子）に固定する２部位免疫測定ア
ッセイによって、血液サンプル中のＰＳＡ−ＡＣＴの正
確かつ特異的な測定が得られることが本発明において見
いだされた。一般的には、本発明の方法は、（ａ）ＰＳ
Ａへの結合について特異的な第１抗体試薬およびＡＣＴ
への結合について特異的な第２抗体試薬であって、この
第１および第２の抗体試薬の１つが微小粒子に固定され
（「捕捉抗体」）、これらの抗体試薬の他方が標識され
ている（「検出抗体」）２つの抗体試薬に結合した血液
サンプルからのＰＳＡ−ＡＣＴの固定されかつ標識され
た免疫複合体を含有する反応混合物を形成させ、（ｂ）
該固定された免疫複合体を含む微小粒子をその他の反応
混合物から分離し、（ｃ）分離した微小粒子を好ましく
は２回以上洗浄し、（ｄ）洗浄した微小粒子の標識抗体
試薬を測定する、段階を含む。好ましくは、分離および
洗浄段階を自動分析装置によって実施する。また、好ま
しくは、第１および第２抗体試薬はモノクローナル抗体
を含む。ＰＳＡ−ＡＣＴの固定化および標識免疫複合体
を含有する反応混合物は、通常、血液サンプルを、該第
１および第２抗体試薬であって、該第１および第２の試
薬の１つが該微小粒子に固定され、または固定されるこ
とができるものであり（「捕捉抗体」）、該抗体試薬の
他方が例えば酵素または化学発光化合物で標識または標
識されることができるものである（「検出抗体」）抗体
試薬と混合することによって形成させる。特に好ましい
方法において、捕捉抗体をリガンドで修飾し、該微小粒
子に固着させたリガンドの結合相手と接触させることに
よって固定する。
【００１８】本発明の方法はＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の特
異的かつ正確な検出法を提供する。以下の実施例におい
て証明するように、遊離ＰＳＡプラスＰＳＡ−ＡＣＴの
測定値の合計が総ＰＳＡの測定値に等しいので、ＰＳＡ
−ＡＣＴの定量は正確であることが示された。文献に報
告されている、通常はマイクロタイタープレート分離に
基づく手動形式を使用してＰＳＡ−ＡＣＴを測定する際
の難点は、好ましくは複数回の洗浄を含み、好ましくは
自動分析装置上で実施する、微小粒子に基づく分離の使
用によって克服される。本発明の方法はスパイク（spik
e)再現試験によって、緩衝液中および血清中の両方にお
いてＰＳＡ−ＡＣＴを正確に測定することも示された。
その上、50才以上の健康者、BPH 患者および前立腺患者
からの血清サンプルの試験は、本発明の方法が前立腺ガ
ンがある人とない人の判別における臨床利用性があるこ
とを示した。先行技術の総ＰＳＡアッセイの感度に等し
い感度を提供するＰＳＡ−ＡＣＴアッセイの正常の上限
値が確定された。
異的かつ正確な検出法を提供する。以下の実施例におい
て証明するように、遊離ＰＳＡプラスＰＳＡ−ＡＣＴの
測定値の合計が総ＰＳＡの測定値に等しいので、ＰＳＡ
−ＡＣＴの定量は正確であることが示された。文献に報
告されている、通常はマイクロタイタープレート分離に
基づく手動形式を使用してＰＳＡ−ＡＣＴを測定する際
の難点は、好ましくは複数回の洗浄を含み、好ましくは
自動分析装置上で実施する、微小粒子に基づく分離の使
用によって克服される。本発明の方法はスパイク（spik
e)再現試験によって、緩衝液中および血清中の両方にお
いてＰＳＡ−ＡＣＴを正確に測定することも示された。
その上、50才以上の健康者、BPH 患者および前立腺患者
からの血清サンプルの試験は、本発明の方法が前立腺ガ
ンがある人とない人の判別における臨床利用性があるこ
とを示した。先行技術の総ＰＳＡアッセイの感度に等し
い感度を提供するＰＳＡ−ＡＣＴアッセイの正常の上限
値が確定された。
【００１９】この正常の上限値（3.75 ng/mL）を使用し
た場合、総ＰＳＡ値が従来認識されてきた診断のグレイ
ゾーン（例えば約4-10 ng/mLの間）以内にある雄のCaP
の検出に関するＰＳＡ−ＡＣＴアッセイの特異性はｆ
ＰＳＡ／ｔＰＳＡ比の算出を基礎とする最近開発された
方法の特異性に匹敵することが発見された。
た場合、総ＰＳＡ値が従来認識されてきた診断のグレイ
ゾーン（例えば約4-10 ng/mLの間）以内にある雄のCaP
の検出に関するＰＳＡ−ＡＣＴアッセイの特異性はｆ
ＰＳＡ／ｔＰＳＡ比の算出を基礎とする最近開発された
方法の特異性に匹敵することが発見された。
【００２０】したがって、本発明の方法は男性患者にお
けるCaP の検出における特に有用な手段を提供する。顕
著なことは、本発明の方法は、費用がかかり、しかも不
快な前立腺の生検を男性に薦めるかどうかを判定するの
に役立つことである。これらの点において、本発明の方
法は、ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比を算出するために必要とさ
れる二重のアッセイよりも、１回のアッセイの実施のみ
を必要とするという明白な利点を有する。
けるCaP の検出における特に有用な手段を提供する。顕
著なことは、本発明の方法は、費用がかかり、しかも不
快な前立腺の生検を男性に薦めるかどうかを判定するの
に役立つことである。これらの点において、本発明の方
法は、ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比を算出するために必要とさ
れる二重のアッセイよりも、１回のアッセイの実施のみ
を必要とするという明白な利点を有する。
【００２１】
【発明の実施の形態】ここで使用する場合、以下の用語
は指定された意味を持つものとする。
は指定された意味を持つものとする。
【００２２】ＰＳＡは前立腺特異的抗原を意味するもの
とする。
とする。
【００２３】ｔＰＳＡまたは総ＰＳＡとは、血液サンプ
ル中の免疫学的に測定可能なＰＳＡ、すなわち、通常の
イムノアッセイによる測定に応答することができる複合
体化または遊離形態のＰＳＡの総量を意味するものとす
る。現状の知見を基準として、（ＡＣＴ、α1-抗トリプ
シン、およびインター−αトリプシンインヒビターを含
む）ある種のプロテアーゼインヒビターと複合体化した
血液ＰＳＡは免疫学的に測定可能であるが、α2-マクロ
グロブリンなどの別のプロテアーゼインヒビターと複合
体化したときには、ＰＳＡは測定不可能であると理解さ
れる。
ル中の免疫学的に測定可能なＰＳＡ、すなわち、通常の
イムノアッセイによる測定に応答することができる複合
体化または遊離形態のＰＳＡの総量を意味するものとす
る。現状の知見を基準として、（ＡＣＴ、α1-抗トリプ
シン、およびインター−αトリプシンインヒビターを含
む）ある種のプロテアーゼインヒビターと複合体化した
血液ＰＳＡは免疫学的に測定可能であるが、α2-マクロ
グロブリンなどの別のプロテアーゼインヒビターと複合
体化したときには、ＰＳＡは測定不可能であると理解さ
れる。
【００２４】ｆＰＳＡまたは遊離ＰＳＡとは、複合体化
していない遊離のＰＳＡを意味するものとする。
していない遊離のＰＳＡを意味するものとする。
【００２５】ＰＳＡ−ＡＣＴとは、ＡＣＴと複合体化し
たＰＳＡを意味するものとする。
たＰＳＡを意味するものとする。
【００２６】抗体とは、完全イムノグロブリン、例えば
IgG 若しくはIgM 、または抗体結合部位を含んでいるイ
ムノグロブリン断片、例えばFab，Fab' ，およびF(ab')
2 断片、あるいはこれらの凝集体を意味するものとす
る。
IgG 若しくはIgM 、または抗体結合部位を含んでいるイ
ムノグロブリン断片、例えばFab，Fab' ，およびF(ab')
2 断片、あるいはこれらの凝集体を意味するものとす
る。
【００２７】本発明は微小粒子に基づく２部位免疫測定
アッセイによって、血液サンプル中のＰＳＡ−ＡＣＴを
測定する方法を提供する。ＰＳＡ−ＡＣＴを測定するた
めに、各種の２部位免疫測定フォーマットおよび微小粒
子を使用することができることは当業者にとって明らか
なことであろう。一般的には２部位免疫測定アッセイ法
において、２つの抗体が使用される（ときには「サンド
イッチ」法と称される）。抗体の１つは標識されている
かまたは標識可能であり（ときには「検出抗体」と称さ
れる）、他方は固定されるかまたは固定され得るもので
ある（ときには「捕捉抗体」と称される）。当業界で知
られているように、捕捉および検出抗体は試験サンプル
に同時にまたは順次接触させることができる。順次法
は、捕捉抗体をサンプルとともにインキュベートし、そ
の後あらかじめ定めた時間に標識抗体を添加することに
よって実施される（ときには「前進(forward)」 法と称
される）か、または最初に検出抗体をサンプルとともに
インキュベートし、その後標識抗体を添加することもで
きる（ときには「逆行(reverse)」 法と称される）。１
回以上の必要なインキュベーションを行なった後、アッ
セイを完了させるために、捕捉抗体を液体試験混合物か
ら分離し、少なくとも１つの分離した捕捉抗体相の少な
くとも一部について、または液体試験混合物に残存する
ものについて標識を測定する。通常は前者である。その
理由は前者が捕捉および検出抗体によって（その間に
「サンドイッチ」されて）結合されたＰＳＡを含むから
である。
アッセイによって、血液サンプル中のＰＳＡ−ＡＣＴを
測定する方法を提供する。ＰＳＡ−ＡＣＴを測定するた
めに、各種の２部位免疫測定フォーマットおよび微小粒
子を使用することができることは当業者にとって明らか
なことであろう。一般的には２部位免疫測定アッセイ法
において、２つの抗体が使用される（ときには「サンド
イッチ」法と称される）。抗体の１つは標識されている
かまたは標識可能であり（ときには「検出抗体」と称さ
れる）、他方は固定されるかまたは固定され得るもので
ある（ときには「捕捉抗体」と称される）。当業界で知
られているように、捕捉および検出抗体は試験サンプル
に同時にまたは順次接触させることができる。順次法
は、捕捉抗体をサンプルとともにインキュベートし、そ
の後あらかじめ定めた時間に標識抗体を添加することに
よって実施される（ときには「前進(forward)」 法と称
される）か、または最初に検出抗体をサンプルとともに
インキュベートし、その後標識抗体を添加することもで
きる（ときには「逆行(reverse)」 法と称される）。１
回以上の必要なインキュベーションを行なった後、アッ
セイを完了させるために、捕捉抗体を液体試験混合物か
ら分離し、少なくとも１つの分離した捕捉抗体相の少な
くとも一部について、または液体試験混合物に残存する
ものについて標識を測定する。通常は前者である。その
理由は前者が捕捉および検出抗体によって（その間に
「サンドイッチ」されて）結合されたＰＳＡを含むから
である。
【００２８】ＰＳＡのための典型的な２部位免疫測定ア
ッセイにおいて、捕捉および検出抗体の１つまたは両方
がモノクローナル抗体である。検出抗体に使用する標識
は当業界で通常既知のどれでも選択することができる。
普通は、標識は酵素または化学発光部分分子であるが、
放射性同位元素、発蛍光団、検出可能なリガンド（例え
ば、そのリガンドに対する標識結合相手に二次的に結合
することによって検出可能なもの）などでもよい。捕捉
抗体の重要な特性は、試験混合物のその他のものから分
離される方法を提供することである。したがって、当業
界で理解されているように、捕捉抗体はあらかじめ固定
化または不溶化された形態でアッセイ中に導入すること
もできるし、または固定化し得る形態、すなわち、アッ
セイへの捕捉抗体の導入の後に固定化を達成することが
できるような形態でもよい。固定化し得る捕捉抗体の例
は、リガンド部分分子、例えばハプテン、ビオチンなど
で化学的に修飾された抗体であって、そのためにその
後、固定化形態のそのリガンドの結合相手、例えば抗
体、アビジンなどと接触させることによって固定化する
ことができる抗体である。
ッセイにおいて、捕捉および検出抗体の１つまたは両方
がモノクローナル抗体である。検出抗体に使用する標識
は当業界で通常既知のどれでも選択することができる。
普通は、標識は酵素または化学発光部分分子であるが、
放射性同位元素、発蛍光団、検出可能なリガンド（例え
ば、そのリガンドに対する標識結合相手に二次的に結合
することによって検出可能なもの）などでもよい。捕捉
抗体の重要な特性は、試験混合物のその他のものから分
離される方法を提供することである。したがって、当業
界で理解されているように、捕捉抗体はあらかじめ固定
化または不溶化された形態でアッセイ中に導入すること
もできるし、または固定化し得る形態、すなわち、アッ
セイへの捕捉抗体の導入の後に固定化を達成することが
できるような形態でもよい。固定化し得る捕捉抗体の例
は、リガンド部分分子、例えばハプテン、ビオチンなど
で化学的に修飾された抗体であって、そのためにその
後、固定化形態のそのリガンドの結合相手、例えば抗
体、アビジンなどと接触させることによって固定化する
ことができる抗体である。
【００２９】本発明に従うことによって、（微小粒子へ
の捕捉抗体の直接の固定化または微小粒子に支持された
結合相手の添加をともなうリガンド修飾抗体の使用を介
した間接の固定化のいずれかによる）捕捉抗体の固定化
の方法として、微小粒子を使用することにより、ＰＳＡ
−ＡＣＴの測定のための従来方法の不正確さが克服され
ることがわかった。当業界で周知のように、固定化は共
有または非共有結合性付着など、各種の方法によって達
成することができる。さらに、バックグラウンド値の干
渉の除去を確実にするために、固定された捕捉および検
出抗体に結合したＰＳＡ−ＡＣＴの免疫複合体を保有す
る微小粒子を例えば２回以上などの多数回洗浄するのが
好ましい。微小粒子をその他の反応混合物から分離した
後、第１の洗浄液、例えば緩衝液と混合し、第１の洗浄
液から分離し、第２の洗浄液、例えば再び緩衝液で洗浄
し、このように所望の洗浄回数まで実施する。洗浄の一
貫性を得るためには、洗浄および分離段階を自動分析装
置によって実施するのが最も好ましい。
の捕捉抗体の直接の固定化または微小粒子に支持された
結合相手の添加をともなうリガンド修飾抗体の使用を介
した間接の固定化のいずれかによる）捕捉抗体の固定化
の方法として、微小粒子を使用することにより、ＰＳＡ
−ＡＣＴの測定のための従来方法の不正確さが克服され
ることがわかった。当業界で周知のように、固定化は共
有または非共有結合性付着など、各種の方法によって達
成することができる。さらに、バックグラウンド値の干
渉の除去を確実にするために、固定された捕捉および検
出抗体に結合したＰＳＡ−ＡＣＴの免疫複合体を保有す
る微小粒子を例えば２回以上などの多数回洗浄するのが
好ましい。微小粒子をその他の反応混合物から分離した
後、第１の洗浄液、例えば緩衝液と混合し、第１の洗浄
液から分離し、第２の洗浄液、例えば再び緩衝液で洗浄
し、このように所望の洗浄回数まで実施する。洗浄の一
貫性を得るためには、洗浄および分離段階を自動分析装
置によって実施するのが最も好ましい。
【００３０】本発明においてはどんな２部位微小粒子に
基づくイムノアッセイ方法またはフォーマットをも使用
し得るものと一般的に理解されるベきであるから、上記
のイムノアッセイ法およびフォーマットは好例として意
図するものであってこれに限定するものではない。
基づくイムノアッセイ方法またはフォーマットをも使用
し得るものと一般的に理解されるベきであるから、上記
のイムノアッセイ法およびフォーマットは好例として意
図するものであってこれに限定するものではない。
【００３１】本発明においては広範な種類の微小粒子を
使用することができる。一般的に、非常に効果的な洗浄
をすることによって、血液サンプルからの干渉の可能性
がある量の非特異的に結合したＡＣＴの除去を促進する
ためには、微小粒子はある限度までのサイズとなるであ
ろう。典型的には、微小粒子は平均直径が約0.01ミクロ
ンと約100 ミクロンの間、さらに普通は約1 ミクロンと
約50ミクロンの間である。微小粒子は広範な種類の天然
および／または合成材料で構成することができ、また多
岐にわたる方法によって調製することができる。これら
はどんな特異な形状でもよいが、基本的には球状の微小
粒子が典型的に知られており、イムノアッセイへの適用
において使用される。普通は、微小粒子はラテックス、
コロイド、水和性ゲル粒子などである。例えば、広範な
種類のラテックス微小粒子がBangs Laboratories,Carme
l,Indiana,USA またはDow Chemical Company,Midland,M
ichigan,USA などから市販されている。こうしたラテッ
クス微小粒子は典型的には、ポリスチレン、ブタジエ
ン、スチレン類、ポリエチルメタクリレート、ポリビニ
ルアセテート、ポリビニルピリジン、ポリブチレンテレ
フタレート、および所望の抗体試薬と化学的にカップリ
ングする部位を提供する、例えばアルデヒト、カルボキ
シ、アミノ、ヒドロキシルまたはヒドラジドを有する、
これらの機能的誘導体、などのポリマーで構成される。
使用することができる。一般的に、非常に効果的な洗浄
をすることによって、血液サンプルからの干渉の可能性
がある量の非特異的に結合したＡＣＴの除去を促進する
ためには、微小粒子はある限度までのサイズとなるであ
ろう。典型的には、微小粒子は平均直径が約0.01ミクロ
ンと約100 ミクロンの間、さらに普通は約1 ミクロンと
約50ミクロンの間である。微小粒子は広範な種類の天然
および／または合成材料で構成することができ、また多
岐にわたる方法によって調製することができる。これら
はどんな特異な形状でもよいが、基本的には球状の微小
粒子が典型的に知られており、イムノアッセイへの適用
において使用される。普通は、微小粒子はラテックス、
コロイド、水和性ゲル粒子などである。例えば、広範な
種類のラテックス微小粒子がBangs Laboratories,Carme
l,Indiana,USA またはDow Chemical Company,Midland,M
ichigan,USA などから市販されている。こうしたラテッ
クス微小粒子は典型的には、ポリスチレン、ブタジエ
ン、スチレン類、ポリエチルメタクリレート、ポリビニ
ルアセテート、ポリビニルピリジン、ポリブチレンテレ
フタレート、および所望の抗体試薬と化学的にカップリ
ングする部位を提供する、例えばアルデヒト、カルボキ
シ、アミノ、ヒドロキシルまたはヒドラジドを有する、
これらの機能的誘導体、などのポリマーで構成される。
【００３２】例えば強磁性または常磁性微小粒子などの
磁気応答性の微小粒子の使用によって、特に利点を得る
ことができる。磁気応答性微小粒子には金属（鉄、ニッ
ケルまたはコバルトなど）、金属合金（アルミニウム、
ニッケルまたはコバルトの金属合金など）、および／ま
たは金属酸化物（Fe3Ｏ4またはFe2Ｏ3など）が含まれ
る。好ましい形態において、こうした磁気応答性微小粒
子は非磁性ポリマーマトリックスまたはコーティングを
も含む。有用な磁気応答性微小粒子の例が米国特許第4,
177,253 号；4,661,408 号；5,206,159 号；5,320,944
号；5,541,072 号；および5,567,326 号に記載されてい
る。米国特許第5,206,159 号に記載された酸化鉄顆粒を
含有するポリマー粒子が特に好ましい。
磁気応答性の微小粒子の使用によって、特に利点を得る
ことができる。磁気応答性微小粒子には金属（鉄、ニッ
ケルまたはコバルトなど）、金属合金（アルミニウム、
ニッケルまたはコバルトの金属合金など）、および／ま
たは金属酸化物（Fe3Ｏ4またはFe2Ｏ3など）が含まれ
る。好ましい形態において、こうした磁気応答性微小粒
子は非磁性ポリマーマトリックスまたはコーティングを
も含む。有用な磁気応答性微小粒子の例が米国特許第4,
177,253 号；4,661,408 号；5,206,159 号；5,320,944
号；5,541,072 号；および5,567,326 号に記載されてい
る。米国特許第5,206,159 号に記載された酸化鉄顆粒を
含有するポリマー粒子が特に好ましい。
【００３３】本発明の方法において使用する抗ＰＳＡお
よび抗ＡＣＴ抗体は適当に免疫した宿主動物から抗血清
を収穫することによって得られるポリクローナル抗体お
よび体細胞ハイブリダイゼーションによって得られるモ
ノクローナル抗体の両者を含む、任意の通常の方法によ
って得ることができるが、後者が好ましい。体細胞ハイ
ブリダイゼーションは現在周知の方法論であり、好適
な、そして所望のすべての変更を含めて、本発明に適用
することができる。一般に、骨髄腫細胞とアナライトに
対して免疫感作させた動物から取ったリンパ球との融合
によってハイブリドーマの集団を製造する。ここで使用
する宿主動物の免疫感作とは、対象とするアナライト上
の１以上のエピトープに結合する抗体を産生するよう
に、その動物の免疫系をチャレンジしたことを意味す
る。これらの結果が、限定するわけではないが、天然の
アナライト、合成ペプチド免疫原、表面にアナライトの
エピトープを発現するトランスフェクトされた細胞など
の宿主動物の血流中への投与を含む、多数の方法のどれ
によっても得られることは、当業者にとって明らかであ
ろう。同様に、クローン化されたハイブリドーマ細胞系
からのモノクローナル抗体の製造および収穫は当業界の
通常の技術範囲であり、一般的に本発明を実用化する時
に、既知のどの方法をも使用することができる。
よび抗ＡＣＴ抗体は適当に免疫した宿主動物から抗血清
を収穫することによって得られるポリクローナル抗体お
よび体細胞ハイブリダイゼーションによって得られるモ
ノクローナル抗体の両者を含む、任意の通常の方法によ
って得ることができるが、後者が好ましい。体細胞ハイ
ブリダイゼーションは現在周知の方法論であり、好適
な、そして所望のすべての変更を含めて、本発明に適用
することができる。一般に、骨髄腫細胞とアナライトに
対して免疫感作させた動物から取ったリンパ球との融合
によってハイブリドーマの集団を製造する。ここで使用
する宿主動物の免疫感作とは、対象とするアナライト上
の１以上のエピトープに結合する抗体を産生するよう
に、その動物の免疫系をチャレンジしたことを意味す
る。これらの結果が、限定するわけではないが、天然の
アナライト、合成ペプチド免疫原、表面にアナライトの
エピトープを発現するトランスフェクトされた細胞など
の宿主動物の血流中への投与を含む、多数の方法のどれ
によっても得られることは、当業者にとって明らかであ
ろう。同様に、クローン化されたハイブリドーマ細胞系
からのモノクローナル抗体の製造および収穫は当業界の
通常の技術範囲であり、一般的に本発明を実用化する時
に、既知のどの方法をも使用することができる。
【００３４】ＰＳＡ−ＡＣＴを測定するための上記の特
に好ましい方法の実用化に必要な試薬およびその他のア
ッセイ用成分は試験キット、すなわち使用者の需要に適
合する包装集合体または配合体の形態で、および分析操
作法をも含めて好都合に供給される。最小限、この試験
キットは前記の第１および第２抗体を含むものとなる。
に好ましい方法の実用化に必要な試薬およびその他のア
ッセイ用成分は試験キット、すなわち使用者の需要に適
合する包装集合体または配合体の形態で、および分析操
作法をも含めて好都合に供給される。最小限、この試験
キットは前記の第１および第２抗体を含むものとなる。
【００３５】男性患者のＰＳＡ−ＡＣＴ血中値は、先行
技術のｔＰＳＡ値およびｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比数値に比
較して実質的な臨床上の意義を提供する。特定すると、
50才を超える、CaP の患者53名、ＢＰＨの患者75名お
よび健康な男性対照者88名を含む226 名の患者からの血
清サンプルを使用して研究を実施した。この研究におい
て、ＰＳＡ−ＡＣＴの測定はｔＰＳＡの測定に比較して
CaP の検出について同等の感度を提供することが発見さ
れた（それぞれ88％に対して85％）。試験した全患者に
ついて、正常およびＢＰＨ集団における特異性もまた、
ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比に比較してＰＳＡ−ＡＣＴについ
ても遜色なかった。ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比と関連させて
使用するｔＰＳＡアッセイの感度および特異性がＰＳＡ
−ＡＣＴのみの場合と同等であるという発見は、患者集
団が診断のグレイゾーンに属する場合にも正当だった。
診断のグレイゾーンの正確な範囲は確定されていない
が、この研究において比較したすべての範囲において、
ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイの感度および特異性は総および
遊離ＰＳＡアッセイの両方を使用して得られたものに匹
敵した。これらのデータは単独試験、ＰＳＡ−ＡＣＴ、
が総ＰＳＡと同等の有効性で前立腺ガンを検出すること
ができ、しかも、２つのアッセイ、ｆＰＳＡおよびｔＰ
ＳＡを使用して得られることが示されている、改善され
た特異性を有することを証明している。
技術のｔＰＳＡ値およびｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比数値に比
較して実質的な臨床上の意義を提供する。特定すると、
50才を超える、CaP の患者53名、ＢＰＨの患者75名お
よび健康な男性対照者88名を含む226 名の患者からの血
清サンプルを使用して研究を実施した。この研究におい
て、ＰＳＡ−ＡＣＴの測定はｔＰＳＡの測定に比較して
CaP の検出について同等の感度を提供することが発見さ
れた（それぞれ88％に対して85％）。試験した全患者に
ついて、正常およびＢＰＨ集団における特異性もまた、
ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比に比較してＰＳＡ−ＡＣＴについ
ても遜色なかった。ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡ比と関連させて
使用するｔＰＳＡアッセイの感度および特異性がＰＳＡ
−ＡＣＴのみの場合と同等であるという発見は、患者集
団が診断のグレイゾーンに属する場合にも正当だった。
診断のグレイゾーンの正確な範囲は確定されていない
が、この研究において比較したすべての範囲において、
ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイの感度および特異性は総および
遊離ＰＳＡアッセイの両方を使用して得られたものに匹
敵した。これらのデータは単独試験、ＰＳＡ−ＡＣＴ、
が総ＰＳＡと同等の有効性で前立腺ガンを検出すること
ができ、しかも、２つのアッセイ、ｆＰＳＡおよびｔＰ
ＳＡを使用して得られることが示されている、改善され
た特異性を有することを証明している。
【００３６】上に述べた前立腺ガンの検出における使用
の他に、ＰＳＡ−ＡＣＴの測定は、前立腺ガンと診断さ
れた患者、特に前立腺ガンの第一次治療を受けた後にお
ける病気の経過を監視するのに有用となる。こうした患
者のｔＰＳＡ測定による縦断的監視は再発性前立腺ガン
の早期検出に有用であることが証明された。ＰＳＡ−Ａ
ＣＴはＰＳＡのガン特異的形態であると理解され、そし
て潜在的ガン細胞が遠隔転移部位を確立して増殖するに
つれて血清中で増加するものと予想される形態である。
したがって、ＰＳＡ−ＡＣＴ血中数値の経時変化は病状
の変化と相関性があり、そして特に治療後のＰＳＡ−Ａ
ＣＴ血中値の上昇は病気の再発を示すことになる。
の他に、ＰＳＡ−ＡＣＴの測定は、前立腺ガンと診断さ
れた患者、特に前立腺ガンの第一次治療を受けた後にお
ける病気の経過を監視するのに有用となる。こうした患
者のｔＰＳＡ測定による縦断的監視は再発性前立腺ガン
の早期検出に有用であることが証明された。ＰＳＡ−Ａ
ＣＴはＰＳＡのガン特異的形態であると理解され、そし
て潜在的ガン細胞が遠隔転移部位を確立して増殖するに
つれて血清中で増加するものと予想される形態である。
したがって、ＰＳＡ−ＡＣＴ血中数値の経時変化は病状
の変化と相関性があり、そして特に治療後のＰＳＡ−Ａ
ＣＴ血中値の上昇は病気の再発を示すことになる。
【００３７】
【実施例】本発明を以下の実施例によって説明するが、
これによって限定するつもりではない。
これによって限定するつもりではない。
【００３８】材料および方法 抗体および抗原 これらの研究で使用する抗体としては、以下のものが挙
げられる：ＭＭ１，遊離および複合体化したＰＳＡの両
者を認識するＰＳＡに特異的なモノクローナル抗体（19
97年4 月10日、American Type Culture Collection,Roc
kville,Maryland,USA に寄託され、それぞれ受託番号HB
-12338および12337 号を得ている、ハイブリドーマ細胞
系 346.7.4および346.7.26によって製造されるものと実
質的に同一の抗体である）；ならびにＭＰ２，ヤギから
誘導され、アフィニティークロマトグラフィーによって
精製したＰＳＡに対するポリクローナル抗体。遊離ＰＳ
Ａ特異的モノクローナル抗体、ＰＳＡ19、ならびに２つ
のＡＣＴ特異的モノクローナル抗体、ＡＣＴ53（Lot#63
06）およびＡＣＴ68（Lot#6268）は CanAg Diagnostics
AB (Gothenburg,Sweden)から購入した。これらの抗体
をプロテイン−Ａアフィニティークロマトグラフィーを
使用して精製し、0.9％ 塩化ナトリウムを含有するTRIS
- ＨCl 緩衝液（pH 7.8）中で保存した。
げられる：ＭＭ１，遊離および複合体化したＰＳＡの両
者を認識するＰＳＡに特異的なモノクローナル抗体（19
97年4 月10日、American Type Culture Collection,Roc
kville,Maryland,USA に寄託され、それぞれ受託番号HB
-12338および12337 号を得ている、ハイブリドーマ細胞
系 346.7.4および346.7.26によって製造されるものと実
質的に同一の抗体である）；ならびにＭＰ２，ヤギから
誘導され、アフィニティークロマトグラフィーによって
精製したＰＳＡに対するポリクローナル抗体。遊離ＰＳ
Ａ特異的モノクローナル抗体、ＰＳＡ19、ならびに２つ
のＡＣＴ特異的モノクローナル抗体、ＡＣＴ53（Lot#63
06）およびＡＣＴ68（Lot#6268）は CanAg Diagnostics
AB (Gothenburg,Sweden)から購入した。これらの抗体
をプロテイン−Ａアフィニティークロマトグラフィーを
使用して精製し、0.9％ 塩化ナトリウムを含有するTRIS
- ＨCl 緩衝液（pH 7.8）中で保存した。
【００３９】これらの研究において使用する抗原として
は、Scripps Laboratories(San Diego,California,USA)
から購入した遊離ＰＳＡ（Lot#,751464 ）およびＰＳＡ
−ＡＣＴ複合体（Lot#,145564 ）が挙げられる。遊離Ｐ
ＳＡはヒト精液からSDS-PAGEおよび酵素イムノアッセイ
によつて測定して98％の純度まで精製し、0.1％ アジ化
ナトリウムを含有する10 mM TRIS緩衝液（ｐＨ8.0 ）中
で保存した。ＡＣＴはヒト血漿から約96％の純度まで精
製した。ＰＳＡ−ＡＣＴは150 mM塩化ナトリウムおよび
0.1％ アジ化ナトリウムを含有する10 mM 酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ5.6 ）中で保存した。遊離ＰＳＡおよび
ＰＳＡ−ＡＣＴ抗原をｔＰＳＡ，ｆＰＳＡ，およびＰＳ
Ａ−ＡＣＴの検量剤の調製のために使用した。
は、Scripps Laboratories(San Diego,California,USA)
から購入した遊離ＰＳＡ（Lot#,751464 ）およびＰＳＡ
−ＡＣＴ複合体（Lot#,145564 ）が挙げられる。遊離Ｐ
ＳＡはヒト精液からSDS-PAGEおよび酵素イムノアッセイ
によつて測定して98％の純度まで精製し、0.1％ アジ化
ナトリウムを含有する10 mM TRIS緩衝液（ｐＨ8.0 ）中
で保存した。ＡＣＴはヒト血漿から約96％の純度まで精
製した。ＰＳＡ−ＡＣＴは150 mM塩化ナトリウムおよび
0.1％ アジ化ナトリウムを含有する10 mM 酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ5.6 ）中で保存した。遊離ＰＳＡおよび
ＰＳＡ−ＡＣＴ抗原をｔＰＳＡ，ｆＰＳＡ，およびＰＳ
Ａ−ＡＣＴの検量剤の調製のために使用した。
【００４０】緩衝液および溶液 5％ 熱失活正常ヤギ血清（Biocell Laboratories,Carso
n,California,USA）を有する100 mM TRIS-ＨCl（pH 7.
4）を使用して、抗体コンジュゲートとともに使用する
緩衝液を調製した。Bayer Immuno 1TM総ＰＳＡおよび遊
離ＰＳＡアッセイ（Bayer Corporation,Business Group
Diagnostics,Tarrytown,New York,USA ）のための検量
剤を調製するために、111 mM塩化ナトリウムおよび 6％
BSA を含有する 25mM TRIS-ＨCl緩衝液（pH 7.4）を使
用した。ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイのための検量剤を調製
するために、111 mM塩化ナトリウムおよび 6％BSA を含
有する MES緩衝液（50 mM）（pH 5.8） を使用した。
n,California,USA）を有する100 mM TRIS-ＨCl（pH 7.
4）を使用して、抗体コンジュゲートとともに使用する
緩衝液を調製した。Bayer Immuno 1TM総ＰＳＡおよび遊
離ＰＳＡアッセイ（Bayer Corporation,Business Group
Diagnostics,Tarrytown,New York,USA ）のための検量
剤を調製するために、111 mM塩化ナトリウムおよび 6％
BSA を含有する 25mM TRIS-ＨCl緩衝液（pH 7.4）を使
用した。ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイのための検量剤を調製
するために、111 mM塩化ナトリウムおよび 6％BSA を含
有する MES緩衝液（50 mM）（pH 5.8） を使用した。
【００４１】検量剤および対照 この50 mM MES 緩衝液を使用して、0，2，10，25，50お
よび100 ng/mL の6 種の濃度のＰＳＡ−ＡＣＴ検量剤を
調製した。これらの検量剤を Bayer Immuno 1ＰＳＡ−
ＡＣＴアッセイおよび手動ＰＳＡ−ＡＣＴ ELISAアッセ
イ（両者とも下記）の両方において使用した。総および
遊離ＰＳＡアッセイ用に、ヒト精液からの精製遊離ＰＳ
Ａを上記のTRIS緩衝液中に同一の６種の濃度で懸濁させ
た。
よび100 ng/mL の6 種の濃度のＰＳＡ−ＡＣＴ検量剤を
調製した。これらの検量剤を Bayer Immuno 1ＰＳＡ−
ＡＣＴアッセイおよび手動ＰＳＡ−ＡＣＴ ELISAアッセ
イ（両者とも下記）の両方において使用した。総および
遊離ＰＳＡアッセイ用に、ヒト精液からの精製遊離ＰＳ
Ａを上記のTRIS緩衝液中に同一の６種の濃度で懸濁させ
た。
【００４２】２組のＰＳＡ−ＡＣＴ対照を調製した。１
組には希釈剤としてTRIS-ＨCl 緩衝液を使用し、90％Ｐ
ＳＡ−ＡＣＴおよび10％遊離ＰＳＡを使用した 4 ng/mL
および25 ng/mLの２つの濃度のＰＳＡを含ませた。対照
の第２の組は 50 mM MES緩衝液を使用し、3.5，15 およ
び75 ng/mLの３つの濃度のＰＳＡ−ＡＣＴを使用して調
製した。これらの２つの対照調製物をBayer Immuno 1Ｐ
ＳＡ−ＡＣＴアッセイおよび手動ＰＳＡ−ＡＣＴ ELISA
において使用した。BioRad Laboratories,California,U
SAより、市販の３レベル対照製品を入手した。Bayer Co
rporation で、最終濃度 4 ng/mlまでの遊離ＰＳＡをス
パイクしたヒト血清を使用して、対照製品を調製した。
後者の２つの物質はBayer Immuno 1ｔＰＳＡおよびｆＰ
ＳＡアッセイのための対照として使用した。
組には希釈剤としてTRIS-ＨCl 緩衝液を使用し、90％Ｐ
ＳＡ−ＡＣＴおよび10％遊離ＰＳＡを使用した 4 ng/mL
および25 ng/mLの２つの濃度のＰＳＡを含ませた。対照
の第２の組は 50 mM MES緩衝液を使用し、3.5，15 およ
び75 ng/mLの３つの濃度のＰＳＡ−ＡＣＴを使用して調
製した。これらの２つの対照調製物をBayer Immuno 1Ｐ
ＳＡ−ＡＣＴアッセイおよび手動ＰＳＡ−ＡＣＴ ELISA
において使用した。BioRad Laboratories,California,U
SAより、市販の３レベル対照製品を入手した。Bayer Co
rporation で、最終濃度 4 ng/mlまでの遊離ＰＳＡをス
パイクしたヒト血清を使用して、対照製品を調製した。
後者の２つの物質はBayer Immuno 1ｔＰＳＡおよびｆＰ
ＳＡアッセイのための対照として使用した。
【００４３】血清サンプル BioClinical Partners(Franklin,Massachusetts,USA)か
ら、50才以上の前立腺ガン患者53名、ＢＰＨの患者およ
び健康な男性163 名からの総数216 の血清サンプルを入
手した。前立腺ガンおよびＢＰＨは組織学的試験によっ
て確認し、普通の直腸指診に基づいて、男性を前立腺の
疾病の点について正常とみなした。
ら、50才以上の前立腺ガン患者53名、ＢＰＨの患者およ
び健康な男性163 名からの総数216 の血清サンプルを入
手した。前立腺ガンおよびＢＰＨは組織学的試験によっ
て確認し、普通の直腸指診に基づいて、男性を前立腺の
疾病の点について正常とみなした。
【００４４】Bayer Immuno １TM ＰＳＡアッセイ Bayer Immuno １ ＰＳＡアッセイはＰＳＡの捕捉用のモ
ノクローナル抗体および検出用ポリクローナル抗体を使
用する市販のサンドイッチアッセイである。モノクロー
ナル抗ＰＳＡ抗体はフルオレセインとコンジュゲート化
（Ｒ１，1.5 mg/mL ）し、アフィニティー精製したポリ
クローナル抗血清はアルカリホスファターゼとコンジュ
ゲート化（Ｒ２，6.5 mg/mL ）している。65 ml/試験の
２つの抗体溶液を検体とともにインキュベートし、免疫
複合体（Ｒ１−ＰＳＡ−Ｒ２）を生成させ、次にこれを
抗フルオレセインモノクローナル抗体でコーティングし
た磁性粒子（10 ml/試験）によって捕捉する。免疫複合
体が結合した粒子を洗浄し、その後、23 mM p-ニトロフ
ェニルホスフェート 300 ml/試験を添加し、結合したア
ルカリホスファターゼによるp-ニトロフェノレートへの
変換の程度を測定する。濃度 0,2,10,25,50 および 100
ng/mLの遊離ＰＳＡで調製したBayer Immuno1 SET poin
t（登録商標）ＰＳＡ検量剤を使用して、Bayer Immuno
1分析機の検量化を実施する。標準検量線を作成するた
めに、０点を通る三次式(cubic-through-zero)に適合さ
せるアルゴリズムを使用する。Bayer Immuno 1分析機の
操作は製造元の指示書（Bayer Corporation,Tarrytown,
New York,USA）にしたがって実施する。
ノクローナル抗体および検出用ポリクローナル抗体を使
用する市販のサンドイッチアッセイである。モノクロー
ナル抗ＰＳＡ抗体はフルオレセインとコンジュゲート化
（Ｒ１，1.5 mg/mL ）し、アフィニティー精製したポリ
クローナル抗血清はアルカリホスファターゼとコンジュ
ゲート化（Ｒ２，6.5 mg/mL ）している。65 ml/試験の
２つの抗体溶液を検体とともにインキュベートし、免疫
複合体（Ｒ１−ＰＳＡ−Ｒ２）を生成させ、次にこれを
抗フルオレセインモノクローナル抗体でコーティングし
た磁性粒子（10 ml/試験）によって捕捉する。免疫複合
体が結合した粒子を洗浄し、その後、23 mM p-ニトロフ
ェニルホスフェート 300 ml/試験を添加し、結合したア
ルカリホスファターゼによるp-ニトロフェノレートへの
変換の程度を測定する。濃度 0,2,10,25,50 および 100
ng/mLの遊離ＰＳＡで調製したBayer Immuno1 SET poin
t（登録商標）ＰＳＡ検量剤を使用して、Bayer Immuno
1分析機の検量化を実施する。標準検量線を作成するた
めに、０点を通る三次式(cubic-through-zero)に適合さ
せるアルゴリズムを使用する。Bayer Immuno 1分析機の
操作は製造元の指示書（Bayer Corporation,Tarrytown,
New York,USA）にしたがって実施する。
【００４５】ＰＳＡ−ＡＣＴのための微小粒子に基づく
アッセイ Bayer Immuno 1ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイフォーマットは
以下の変更を除いて Bayer Immuno 1 ｔＰＳＡアッセイ
のものと同一である：（１）検出用に 2μg/mLのＡＣＴ
に特異的なモノクローナル抗体、ＡＣＴ53を使用する；
（２）検量剤および対照抗原として、基剤として50 mM
MES 緩衝液（pH 5.8）中のＰＳＡ−ＡＣＴを使用する；
および（３）抗原を最初に捕捉抗体とともにインキュベ
ートし、生成した複合体を洗浄して結合していない抗原
およびその他の血清成分を除去し、その後検出抗体を添
加するようにする、２回洗浄プロトコルを使用する。こ
れは 、抗原を捕捉および検出抗体とともに同時にイン
キュベートするBayer Immuno 1 ｔＰＳＡアッセイにお
いて使用するフォーマットと対照的である。
アッセイ Bayer Immuno 1ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイフォーマットは
以下の変更を除いて Bayer Immuno 1 ｔＰＳＡアッセイ
のものと同一である：（１）検出用に 2μg/mLのＡＣＴ
に特異的なモノクローナル抗体、ＡＣＴ53を使用する；
（２）検量剤および対照抗原として、基剤として50 mM
MES 緩衝液（pH 5.8）中のＰＳＡ−ＡＣＴを使用する；
および（３）抗原を最初に捕捉抗体とともにインキュベ
ートし、生成した複合体を洗浄して結合していない抗原
およびその他の血清成分を除去し、その後検出抗体を添
加するようにする、２回洗浄プロトコルを使用する。こ
れは 、抗原を捕捉および検出抗体とともに同時にイン
キュベートするBayer Immuno 1 ｔＰＳＡアッセイにお
いて使用するフォーマットと対照的である。
【００４６】遊離ＰＳＡのための自動化アッセイ Bayer Immuno 1ｆＰＳＡアッセイのために使用するプロ
トコルは以下の変更を除いて Bayer Immuno 1 ｔＰＳＡ
アッセイについての上記のものと同一である： （１）捕捉用にｆＰＳＡに特異的なモノクローナル抗
体、ＰＳＡ19をフルオレセインとコンジュゲート化させ
る；（２）使用するＲ１およびＲ２の濃度をそれぞれ
2.5μg/mLおよび 6.15μg/mLとする；および（３） サ
ンプル容積を１試験当たり 20μlから 35μlとする。
トコルは以下の変更を除いて Bayer Immuno 1 ｔＰＳＡ
アッセイについての上記のものと同一である： （１）捕捉用にｆＰＳＡに特異的なモノクローナル抗
体、ＰＳＡ19をフルオレセインとコンジュゲート化させ
る；（２）使用するＲ１およびＲ２の濃度をそれぞれ
2.5μg/mLおよび 6.15μg/mLとする；および（３） サ
ンプル容積を１試験当たり 20μlから 35μlとする。
【００４７】ＰＳＡ−ＡＣＴのための手動マイクロプレ
ートELISA 法 100 mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.6）中 1.5μg/mLの
ＭＭ１捕捉抗体を100μl/ウェル使用して、Immulon 1
（登録商標）マイクロタイタープレート（Dynatech Lab
oratories,Chantilly,Virginia,USA）をコーティングし
た。プレートを室温で1.5 時間インキュベートした。6
％ BSA を含有するTRIS（pH 7.4）300μl／ウェルで未
反応の部位をクエンチングし、4℃ で一晩インキュベー
トした。ＰＳＡ−ＡＣＴ検量剤、対照または患者サンプ
ルのいずれかを 100μl 容量添加し、室温で1.5 時間イ
ンキュベートした。Ultrawash II Microplate Washer
（Dynatech Laboratories,Chantilly,Virginia USA）を
使用し、TRIS緩衝化生理食塩水で５回洗浄した後、GS5
緩衝液中のＡＬＰ−ＡＣＴ #53検出抗体（100μl／ウェ
ル）を添加し、室温(RT)で1.5 時間インキュベートし
た。さらに５回の洗浄の後、ジエタノールアミン中のp-
ニトロフェニルホスフェート基質溶液（Pierce Chemica
ls,Rockford,Illinois,USA）（1 mg/mL ）100μlを添加
して、室温でインキュベートした。1 N 水酸化ナトリウ
ム 100μl/ウェルの添加によって免疫反応を停止させ
た。Thermo-Max Microplate Reader（Molecular Device
s,Menlo Park,California,USA） 上 405-490 nm で各ウ
ェルの吸光度を読み取った。ＰＳＡ−ＡＣＴの正確な定
量を確実にするため、各マイクロプレートにおいて、検
量線を作製した。０点を通る三次式に適合させるアルゴ
リズムを使用して、吸光度をアナライト濃度に変換し
た。すべてのサンプルについて２回ずつ実施した。
ートELISA 法 100 mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.6）中 1.5μg/mLの
ＭＭ１捕捉抗体を100μl/ウェル使用して、Immulon 1
（登録商標）マイクロタイタープレート（Dynatech Lab
oratories,Chantilly,Virginia,USA）をコーティングし
た。プレートを室温で1.5 時間インキュベートした。6
％ BSA を含有するTRIS（pH 7.4）300μl／ウェルで未
反応の部位をクエンチングし、4℃ で一晩インキュベー
トした。ＰＳＡ−ＡＣＴ検量剤、対照または患者サンプ
ルのいずれかを 100μl 容量添加し、室温で1.5 時間イ
ンキュベートした。Ultrawash II Microplate Washer
（Dynatech Laboratories,Chantilly,Virginia USA）を
使用し、TRIS緩衝化生理食塩水で５回洗浄した後、GS5
緩衝液中のＡＬＰ−ＡＣＴ #53検出抗体（100μl／ウェ
ル）を添加し、室温(RT)で1.5 時間インキュベートし
た。さらに５回の洗浄の後、ジエタノールアミン中のp-
ニトロフェニルホスフェート基質溶液（Pierce Chemica
ls,Rockford,Illinois,USA）（1 mg/mL ）100μlを添加
して、室温でインキュベートした。1 N 水酸化ナトリウ
ム 100μl/ウェルの添加によって免疫反応を停止させ
た。Thermo-Max Microplate Reader（Molecular Device
s,Menlo Park,California,USA） 上 405-490 nm で各ウ
ェルの吸光度を読み取った。ＰＳＡ−ＡＣＴの正確な定
量を確実にするため、各マイクロプレートにおいて、検
量線を作製した。０点を通る三次式に適合させるアルゴ
リズムを使用して、吸光度をアナライト濃度に変換し
た。すべてのサンプルについて２回ずつ実施した。
【００４８】結果および考察 ＰＳＡ−ＡＣＴ測定のための抗体の選択 分析のため、検出抗体として、ＡＣＴに特異的な２つの
モノクローナル抗体、ＡＣＴ53およびＡＣＴ68を選択し
た。捕捉抗体ＭＭ１と組み合わせて、ＡＣＴ53を2μg/m
L 使用し、ＡＣＴ68は4μg/mL 使用して、ＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ測定のためのサンドイッチアッセイを形成させた。２
つの抗ＡＣＴ抗体を使用して、ＰＳＡ−ＡＣＴ検量剤の
反応率と15名の前立腺ガン患者の血清サンプルのアナラ
イト濃度を比較した。結果によると、ＡＣＴ53はＡＣＴ
68の場合よりも≧52％高い反応率を与えることが示され
た。さらに、ＡＣＴ68を使用した場合のバックグラウン
ドシグナルは抗体ＡＣＴ53で見られるよりも有意に高か
った。抗体ＡＣＴ53はノイズに対するシグナル率がより
高いことが証明されたので、これ以後の分析のためにこ
れを選択した。
モノクローナル抗体、ＡＣＴ53およびＡＣＴ68を選択し
た。捕捉抗体ＭＭ１と組み合わせて、ＡＣＴ53を2μg/m
L 使用し、ＡＣＴ68は4μg/mL 使用して、ＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ測定のためのサンドイッチアッセイを形成させた。２
つの抗ＡＣＴ抗体を使用して、ＰＳＡ−ＡＣＴ検量剤の
反応率と15名の前立腺ガン患者の血清サンプルのアナラ
イト濃度を比較した。結果によると、ＡＣＴ53はＡＣＴ
68の場合よりも≧52％高い反応率を与えることが示され
た。さらに、ＡＣＴ68を使用した場合のバックグラウン
ドシグナルは抗体ＡＣＴ53で見られるよりも有意に高か
った。抗体ＡＣＴ53はノイズに対するシグナル率がより
高いことが証明されたので、これ以後の分析のためにこ
れを選択した。
【００４９】Bayer Immuno 1ＰＳＡ−ＡＣＴおよびELIS
A ＰＳＡ−ＡＣＴ両アッセイの標準曲線 自動化Bayer Immuno 1ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイで６種の
レベルのＰＳＡ−ＡＣＴ検量剤を使用して標準曲線を誘
導した。その結果を図１のＡに示す。手動マイクロプレ
ートＰＳＡ−ＡＣＴアッセイでも６種のレベルのＰＳＡ
−ＡＣＴ検量剤を使用して標準曲線を誘導した。その結
果を図１のＢに示す。どちらの場合も、シグナルはＰＳ
Ａ−ＡＣＴ濃度に比例した。
A ＰＳＡ−ＡＣＴ両アッセイの標準曲線 自動化Bayer Immuno 1ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイで６種の
レベルのＰＳＡ−ＡＣＴ検量剤を使用して標準曲線を誘
導した。その結果を図１のＡに示す。手動マイクロプレ
ートＰＳＡ−ＡＣＴアッセイでも６種のレベルのＰＳＡ
−ＡＣＴ検量剤を使用して標準曲線を誘導した。その結
果を図１のＢに示す。どちらの場合も、シグナルはＰＳ
Ａ−ＡＣＴ濃度に比例した。
【００５０】遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴを含有す
る混合物からのＰＳＡ−ＡＣＴの回収 遊離ＰＳＡ：ＰＳＡ−ＡＣＴ比が100:0，80:20，50:5
0，20:80および0:100 の各種割合の遊離およびＡＣＴと
複合体化したＰＳＡの混合物５種をＰＳＡ−ＡＣＴ検量
剤を調製するために使用したものと同一のTRIS緩衝液を
使用して総ＰＳＡ濃度約 10 ng/mL に希釈した。これら
のサンプルをBayer Immuno 1分析機で３つのアッセイ：
総ＰＳＡ、遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴのそれぞれ
を実施した。総および遊離ＰＳＡを測定するため、遊離
ＰＳＡを使用して調製した検量剤でBayer Immuno 1シス
テムを検量化した。ＰＳＡ−ＡＣＴを測定するため、Ｐ
ＳＡ−ＡＣＴを使用して調製した検量剤でBayer Immuno
1システムを検量化した。自動化Bayer Immuno 1ＰＳＡ
−ＡＣＴアッセイでは上記のようにＡＣＴ53検出抗体を
使用した。図２のＡの結果は、Bayer Immuno 1ＰＳＡ−
ＡＣＴアッセイが、ＰＳＡ−ＡＣＴを正確に測定し、遊
離ＰＳＡは検出せず、そしてＰＳＡ−ＡＣＴを測定する
ためにこれまで記載されたアッセイにおいて報告された
ようなＰＳＡ−ＡＣＴの明らかな過剰回収(over-recove
ry)の問題はないことを示している。
る混合物からのＰＳＡ−ＡＣＴの回収 遊離ＰＳＡ：ＰＳＡ−ＡＣＴ比が100:0，80:20，50:5
0，20:80および0:100 の各種割合の遊離およびＡＣＴと
複合体化したＰＳＡの混合物５種をＰＳＡ−ＡＣＴ検量
剤を調製するために使用したものと同一のTRIS緩衝液を
使用して総ＰＳＡ濃度約 10 ng/mL に希釈した。これら
のサンプルをBayer Immuno 1分析機で３つのアッセイ：
総ＰＳＡ、遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴのそれぞれ
を実施した。総および遊離ＰＳＡを測定するため、遊離
ＰＳＡを使用して調製した検量剤でBayer Immuno 1シス
テムを検量化した。ＰＳＡ−ＡＣＴを測定するため、Ｐ
ＳＡ−ＡＣＴを使用して調製した検量剤でBayer Immuno
1システムを検量化した。自動化Bayer Immuno 1ＰＳＡ
−ＡＣＴアッセイでは上記のようにＡＣＴ53検出抗体を
使用した。図２のＡの結果は、Bayer Immuno 1ＰＳＡ−
ＡＣＴアッセイが、ＰＳＡ−ＡＣＴを正確に測定し、遊
離ＰＳＡは検出せず、そしてＰＳＡ−ＡＣＴを測定する
ためにこれまで記載されたアッセイにおいて報告された
ようなＰＳＡ−ＡＣＴの明らかな過剰回収(over-recove
ry)の問題はないことを示している。
【００５１】さらに、Bayer Immuno 1での微小粒子に基
づくＰＳＡ−ＡＣＴアッセイの特異性と比較するため、
固相マイクロプレートに基づくELISA ＰＳＡ−ＡＣＴア
ッセイの特異性を決定した。上記のような各種割合での
遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴからなる総ＰＳＡ約 1
0μg/mL を含むサンプルを固相マイクロプレートに基づ
くELISA ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイで試験した。図２のＢ
に示す結果は、ＰＳＡ−ＡＣＴの回収はＰＳＡ−ＡＣＴ
濃度に対して直線性でないこと、およびこのアッセイで
は特に低濃度のＰＳＡ−ＡＣＴにおいて、ＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ測定が不正確であることを証明している。これは微小
粒子に基づくＰＳＡ−ＡＣＴアッセイにおけるＰＳＡ−
ＡＣＴの回収と顕著な対照をなしている。一例をあげる
と、80:20サンプルは20％ＰＳＡ−ＡＣＴを含んでいる
はずであり、したがってイムノアッセイでの読みは 2 n
g/mLであるべきである。微小粒子に基づくアッセイでの
このサンプルの回収は予測どおりに約 2 ng/mLであっ
た。対照的に、マイクロプレートに基づく ELISAではこ
のサンプル中のＰＳＡ−ＡＣＴ濃度が 4 ng/mLと測定さ
れ、これは予測よりも100％ 高い。マイクロプレートに
基づく ELISAの操作を繰り返したが、この過剰回収の問
題は修正されなかった。
づくＰＳＡ−ＡＣＴアッセイの特異性と比較するため、
固相マイクロプレートに基づくELISA ＰＳＡ−ＡＣＴア
ッセイの特異性を決定した。上記のような各種割合での
遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴからなる総ＰＳＡ約 1
0μg/mL を含むサンプルを固相マイクロプレートに基づ
くELISA ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイで試験した。図２のＢ
に示す結果は、ＰＳＡ−ＡＣＴの回収はＰＳＡ−ＡＣＴ
濃度に対して直線性でないこと、およびこのアッセイで
は特に低濃度のＰＳＡ−ＡＣＴにおいて、ＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ測定が不正確であることを証明している。これは微小
粒子に基づくＰＳＡ−ＡＣＴアッセイにおけるＰＳＡ−
ＡＣＴの回収と顕著な対照をなしている。一例をあげる
と、80:20サンプルは20％ＰＳＡ−ＡＣＴを含んでいる
はずであり、したがってイムノアッセイでの読みは 2 n
g/mLであるべきである。微小粒子に基づくアッセイでの
このサンプルの回収は予測どおりに約 2 ng/mLであっ
た。対照的に、マイクロプレートに基づく ELISAではこ
のサンプル中のＰＳＡ−ＡＣＴ濃度が 4 ng/mLと測定さ
れ、これは予測よりも100％ 高い。マイクロプレートに
基づく ELISAの操作を繰り返したが、この過剰回収の問
題は修正されなかった。
【００５２】Bayer Immuno 1ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイの
特異性 自動化 Bayer Immuno 1 ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイを使用
して、未知のサンプルとしてＰＳＡ濃度が 0，2，10，2
5，50 および100 ng/mL の遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−Ａ
ＣＴの両方について試験した。図３の結果は、 Bayer I
mmuno 1 ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイでは遊離ＰＳＡが検出
されなかったことを示している。しかし、Bayer Immuno
1ｆＰＳＡアッセイで測定したところ、遊離ＰＳＡの回
収は予測値に対して直線性であった。これらの結果は B
ayer Immuno 1 ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイが遊離ＰＳＡと
は検出可能な反応性を持たず、ＰＳＡ−ＡＣＴに対して
特異的であることを証明している。
特異性 自動化 Bayer Immuno 1 ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイを使用
して、未知のサンプルとしてＰＳＡ濃度が 0，2，10，2
5，50 および100 ng/mL の遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−Ａ
ＣＴの両方について試験した。図３の結果は、 Bayer I
mmuno 1 ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイでは遊離ＰＳＡが検出
されなかったことを示している。しかし、Bayer Immuno
1ｆＰＳＡアッセイで測定したところ、遊離ＰＳＡの回
収は予測値に対して直線性であった。これらの結果は B
ayer Immuno 1 ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイが遊離ＰＳＡと
は検出可能な反応性を持たず、ＰＳＡ−ＡＣＴに対して
特異的であることを証明している。
【００５３】患者血清サンプルからのＰＳＡ−ＡＣＴの
スパイク回収(spiked recovery)３つの前立腺ガン患者
の血清サンプル中に 0，18および61 ng/mLの３つの濃度
のＰＳＡ−ＡＣＴをスパイクした。これらの３つの血清
中のＰＳＡ−ＡＣＴ濃度を Bayer Immuno 1 ＰＳＡ−Ａ
ＣＴアッセイを使用して測定し、遊離および複合体化Ｐ
ＳＡの両方を等モル量で正確に測定する Bayer Immuno
1 総ＰＳＡアッセイで得られた数値と比較した。図４に
示されたデータは、ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイにおいて、
３つのサンプルすべてについて、平均して回収したＰＳ
Ａ−ＡＣＴの98％の回収を意味している。遊離ＰＳＡは
総ＰＳＡアッセイにおいて測定可能であるが、ＰＳＡ−
ＡＣＴアッセイでは測定されないから、Bayer Immuno 1
ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイに対する Bayer Immuno 1 総Ｐ
ＳＡアッセイによる定量における 2％の差異はＰＳＡ−
ＡＣＴ複合体からの遊離ＰＳＡの解離によるものと考え
られる。
スパイク回収(spiked recovery)３つの前立腺ガン患者
の血清サンプル中に 0，18および61 ng/mLの３つの濃度
のＰＳＡ−ＡＣＴをスパイクした。これらの３つの血清
中のＰＳＡ−ＡＣＴ濃度を Bayer Immuno 1 ＰＳＡ−Ａ
ＣＴアッセイを使用して測定し、遊離および複合体化Ｐ
ＳＡの両方を等モル量で正確に測定する Bayer Immuno
1 総ＰＳＡアッセイで得られた数値と比較した。図４に
示されたデータは、ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイにおいて、
３つのサンプルすべてについて、平均して回収したＰＳ
Ａ−ＡＣＴの98％の回収を意味している。遊離ＰＳＡは
総ＰＳＡアッセイにおいて測定可能であるが、ＰＳＡ−
ＡＣＴアッセイでは測定されないから、Bayer Immuno 1
ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイに対する Bayer Immuno 1 総Ｐ
ＳＡアッセイによる定量における 2％の差異はＰＳＡ−
ＡＣＴ複合体からの遊離ＰＳＡの解離によるものと考え
られる。
【００５４】ＰＳＡ−ＡＣＴ測定の精度 Bayer Immuno 1ＰＳＡ−ＡＣＴアッセイを使用した（遊
離ＰＳＡ＋ＰＳＡ−ＡＣＴ）／総ＰＳＡの平均値は前立
腺ガン患者血清においては96％、ＢＰＨ患者血清からの
サンプルでは102.7％ および正常な同年令層の血清サン
プルでは103％であった。これは、Bayer Immuno 1ＰＳ
Ａ−ＡＣＴアッセイを使用した場合、血清中のＰＳＡ−
ＡＣＴの過剰回収がなかったことを意味している。対照
的に、マイクロプレートに基づくELISA ＰＳＡ−ＡＣＴ
アッセイを使用した場合の回収は同一の患者血清につい
て約 171％，135％ および164％ であった。これらのデ
ータは、ＰＳＡ−ＡＣＴのマイクロタイタープレート E
LISA測定が予測結果よりも高い結果になったとする他の
研究室による刊行物の結果（13，14，16）を確認するも
のである。
離ＰＳＡ＋ＰＳＡ−ＡＣＴ）／総ＰＳＡの平均値は前立
腺ガン患者血清においては96％、ＢＰＨ患者血清からの
サンプルでは102.7％ および正常な同年令層の血清サン
プルでは103％であった。これは、Bayer Immuno 1ＰＳ
Ａ−ＡＣＴアッセイを使用した場合、血清中のＰＳＡ−
ＡＣＴの過剰回収がなかったことを意味している。対照
的に、マイクロプレートに基づくELISA ＰＳＡ−ＡＣＴ
アッセイを使用した場合の回収は同一の患者血清につい
て約 171％，135％ および164％ であった。これらのデ
ータは、ＰＳＡ−ＡＣＴのマイクロタイタープレート E
LISA測定が予測結果よりも高い結果になったとする他の
研究室による刊行物の結果（13，14，16）を確認するも
のである。
【００５５】文献 １．Wang MC,Valenzuela LA,Murphy GP,Chu TM. ヒト前
立腺特異的抗原の精製.Invest Urol 1979;17:159-63。 ２．Watt WK,Lee PJ,Timkulu TM,Chan WP,Loor R. ヒト
前立腺特異的抗原：構造およびセリンプロテアーゼとの
機能的類似性.Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:3166-7
0。 ３．Akiyama k,Nakamura T,Iwanaga S,Hara M.ヒト前立
腺特異的抗原、γ-セミノプロテインのキモトリプシン
様活性.FEBS Letters 1987;225:168-72。 ４．Christensson A,Laurel CB,Lilja H. 前立腺特異的
抗原の酵素活性および細胞外セリンプロテイナーゼイン
ヒビターとの反応.Eur J Biochem 1990;194:755-763。 ５．Lilja H.前立腺液中のカリクレイン様セリンプロテ
アーゼは主要精嚢タンパク質を切断する.J Clin Invest
1985;76:1899-903。 ６．Lilja H,Abrahamsson PA. ヒト前立腺によって分泌
される３つの主要なタンパク質.Prostate 1980;12:29-3
8。 ７．Papsidero LD,Wang MC,Valenzuela LA,Murphy GP,C
hu TM.前立腺ガン患者の血清中の前立腺抗原.Cancer Re
s 1980;40:2428-2432。 ８．Lange PH. 前立腺ガンの診断および管理における前
立腺特異的抗原.Supplement to Urology 1990;XXXVI:25
-29。 ９．Oesterling JE.前立腺特異的抗原：前立腺ガンのた
めの最も有用な腫瘍マーカーの臨界評価.J Urol 1991;1
45:907-923。 10．Armbruster DA.前立腺特異的抗原：生化学、分析方
法および臨床応用.ClinChem 1993;39:181-195。 11．American Cancer Society:ガンの事例および実像−
1995.American CancerSociety,Inc., Atlanta,GA.Page
11。 12．Catalona WJ,Richie JP,Ahmann FR,Hudson MA,Scar
dino PT,Flanigan RC,deKernion JB,Ratliff TL,Kavous
si LR,Dalkin BL,Waters,WB,MacFarlane MTand Southwi
ck PC. 前立腺ガンの早期検出における直腸指診と血清
前立腺特異的抗原との比較：男性 6,630名の多施設臨床
試験の結果.J Urol 1994;151:1283-1290。 13．Stenman UH,Leinonen J,Alfthan H,Rannikko S,Tuh
kanen K,Alfthan O.前立腺特異的抗原とα121-抗キモト
リプシンとの複合体は前立腺ガン患者の血清中の前立腺
特異的抗原の主要な形態である：この複合体のアッセイ
はガンの臨床上の感度を改善する.Cancer Res 1991;51:
222-226。 14．Zhou AM,Tewari PC,Bluestein BL,Caldwell,GW,Lar
sen FL. 血清中の前立腺特異的抗原の多種の形態：モノ
クローナルおよびポリクローナルアッセイによる免疫認
識の差異.Clin Chem 1993;39:2483-91。 15．Leinonen J,Lovgren T,Vornanen T,Stenman UH. 前
立腺特異的抗原およびそのα1-抗キモトリプシンとの複
合体の二重標識時間分解免疫蛍光測定(double-label ti
me-resolved immunofluorometric).Clin Chem 1993;39:
2098-2103。 16．Christensson A,Bjork T,Nilsson O,Nilsson O,Dah
len U,Matikainen MT,Cockett AT,Abrahamssion PA. 前
立腺ガンのインジケーターとしての、α1-抗キモトリプ
シンと複合体化した血清前立腺ガン特異的抗原.J Urol
1993;150:100-105。 17．Lilja H.血清ＰＳＡの異なる分子形態の意義：α1-
抗キモトリプシンと複合体化したものに対する遊離の非
複合体化形態のＰＳＡ.Urol Clin NorthAm 1993;20(4):
681-686。 18．Lilja H,Christensson A,Dahlen U,Matikainen M-
T,Nilsson O,PetterssonK and Lovgren T:ヒト血清中の
前立腺特異的抗原は主としてアルファ抗キモトリプシン
との複合体として存在する.Clin Chem 1991;37:1618-16
25。 19．Bjork T,Hulkko S,Bjartell A,Santagnese AD,Abra
hamsson P-A,Lilja H.ＰＳＡ産生細胞中のアルファ1-抗
キモトリプシンの生成は前立腺ガンに共通するが良性前
立腺肥大症ではまれである.Urology 1994;43:427-434。 20．Pettersson K,Piironen T,Seppala M,Liukkonen L,
Christensson A,Matikainen M-T,Suonpaa M,Lovgren T,
Lilja H.遊離および複合体前立腺特異的抗原（ＰＳ
Ａ）：遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−α1-抗キモトリプシン
複合体の invitro 安定性、エピトープマップ、ならび
に特異的および好感度検出のための免疫蛍光アッセイの
開発.Clin Chem 1995;41:1480-1488。 21．Wu JT,Wilson L,Zhang P,Meikle AW,Stephenson R.
ＢＰＨおよび前立腺ガン患者からの無作為または系列検
体におけるＰＳＡ−ＡＣＴ複合体と総ＰＳＡの血清中濃
度の相関関係.J Clin Lab Anal 1995 9:15-24。 22．Mitrunen K,Pettersson K,Piironen T,Bjork T,Lil
ja H,Lovgren T.(1995)血清中の遊離および総前立腺特
異的抗原の濃度および比率の同時測定のための二重標識
一段階イムノアッセイ.Clin Chem 1995 41(8):1115-112
0。 23．Catalona WJ,Smith DS,Wolfert RL,Wang TJ,Ritten
house HG,Ratliff TL,Nadler RB:前立腺ガンスクリーニ
ングの特異性を改善するための遊離の血清前立腺特異的
抗原の割合の評価.JAMA 1995 274(15):1214-1220。 24．Prestigiacomo AF,Stamey TA. 遊離および複合体化
ＰＳＡの臨床上の有用性.Scan J Clin Lab Invest 1995
55Supple 221:32-34。 25．Wang TJ,Hill TM,Sokoloff RL,Frankenne F,Ritten
house HG,Wolfert RL.遊離前立腺特異的抗原のための二
重モノクローナル抗体イムノアッセイ. Prostate 1996
28:10-16。 26．Jung K,Stephan C,Lein M,Henkne W,Schnorr D,Bru
x B,Schurenkamper P,Loening SA. ２つの遊離前立腺特
異的抗原アッセイを比較した分析の成績および臨床上の
妥当性.Clin Chem 1996 42(7):1026-1033。 27．Wang TJ,Hill T,Sokoloff R,Frankenne F,Wolfert
R,and Rittenhouse H.良性肥大症および前立腺ガンにお
ける遊離ＰＳＡを定量するためのモノクローナル抗体サ
ンドイッチイムノアッセイ.1994 ISOBM会議における後
期発表(poster presentation)。 28．Chan D,Kelley CA,Partin AW,Linton J,Wang TJ,So
koloff RL,RittenhouseHG,and Wolfert RL.Clin Chem
(1996) 42(6):S255。 29．Wang TJ,Linton J,Payne J,Rittenhouse HG,Wolfer
t RL,Chan DW,Kelley CAand Partin AW. ＰＳＡ−ＡＣ
Ｔに対する特異的モノクローナル抗体による複合体化Ｐ
ＳＡイムノアッセイの臨床的有用性. J Urology (1997)
157(4)Suppl:147。 30．Wang TJ,Linton HJ,Payne J,Liu R-S,Kuus-Reichel
K,Rittenhouse HG,Kelley C,Cox J,Chan DW, and Wolf
ert RL. ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に特異的なモノクローナ
ル抗体の開発およびイムノアッセイへのそれらの組み込
み.ClinChem(1997) 43(6):S225。 31．Zhang P and Wu,JT.非特異的吸着の妨害をともなわ
ない、血清中のＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のためのイムノア
ッセイの開発.Clin Chem (1997)43(6):S236。 32．Bjork T,Bjartell A,Abrahamsson P-A,Hulkko S,Di
Sant'agnese A,LiljaH. ＰＳＡ産生細胞中のアルファ1
-抗キモトリプシンの生成は前立腺ガンに共通するが、
良性前立腺肥大症ではまれである.Urol 1994 43(4):427
-434。
立腺特異的抗原の精製.Invest Urol 1979;17:159-63。 ２．Watt WK,Lee PJ,Timkulu TM,Chan WP,Loor R. ヒト
前立腺特異的抗原：構造およびセリンプロテアーゼとの
機能的類似性.Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:3166-7
0。 ３．Akiyama k,Nakamura T,Iwanaga S,Hara M.ヒト前立
腺特異的抗原、γ-セミノプロテインのキモトリプシン
様活性.FEBS Letters 1987;225:168-72。 ４．Christensson A,Laurel CB,Lilja H. 前立腺特異的
抗原の酵素活性および細胞外セリンプロテイナーゼイン
ヒビターとの反応.Eur J Biochem 1990;194:755-763。 ５．Lilja H.前立腺液中のカリクレイン様セリンプロテ
アーゼは主要精嚢タンパク質を切断する.J Clin Invest
1985;76:1899-903。 ６．Lilja H,Abrahamsson PA. ヒト前立腺によって分泌
される３つの主要なタンパク質.Prostate 1980;12:29-3
8。 ７．Papsidero LD,Wang MC,Valenzuela LA,Murphy GP,C
hu TM.前立腺ガン患者の血清中の前立腺抗原.Cancer Re
s 1980;40:2428-2432。 ８．Lange PH. 前立腺ガンの診断および管理における前
立腺特異的抗原.Supplement to Urology 1990;XXXVI:25
-29。 ９．Oesterling JE.前立腺特異的抗原：前立腺ガンのた
めの最も有用な腫瘍マーカーの臨界評価.J Urol 1991;1
45:907-923。 10．Armbruster DA.前立腺特異的抗原：生化学、分析方
法および臨床応用.ClinChem 1993;39:181-195。 11．American Cancer Society:ガンの事例および実像−
1995.American CancerSociety,Inc., Atlanta,GA.Page
11。 12．Catalona WJ,Richie JP,Ahmann FR,Hudson MA,Scar
dino PT,Flanigan RC,deKernion JB,Ratliff TL,Kavous
si LR,Dalkin BL,Waters,WB,MacFarlane MTand Southwi
ck PC. 前立腺ガンの早期検出における直腸指診と血清
前立腺特異的抗原との比較：男性 6,630名の多施設臨床
試験の結果.J Urol 1994;151:1283-1290。 13．Stenman UH,Leinonen J,Alfthan H,Rannikko S,Tuh
kanen K,Alfthan O.前立腺特異的抗原とα121-抗キモト
リプシンとの複合体は前立腺ガン患者の血清中の前立腺
特異的抗原の主要な形態である：この複合体のアッセイ
はガンの臨床上の感度を改善する.Cancer Res 1991;51:
222-226。 14．Zhou AM,Tewari PC,Bluestein BL,Caldwell,GW,Lar
sen FL. 血清中の前立腺特異的抗原の多種の形態：モノ
クローナルおよびポリクローナルアッセイによる免疫認
識の差異.Clin Chem 1993;39:2483-91。 15．Leinonen J,Lovgren T,Vornanen T,Stenman UH. 前
立腺特異的抗原およびそのα1-抗キモトリプシンとの複
合体の二重標識時間分解免疫蛍光測定(double-label ti
me-resolved immunofluorometric).Clin Chem 1993;39:
2098-2103。 16．Christensson A,Bjork T,Nilsson O,Nilsson O,Dah
len U,Matikainen MT,Cockett AT,Abrahamssion PA. 前
立腺ガンのインジケーターとしての、α1-抗キモトリプ
シンと複合体化した血清前立腺ガン特異的抗原.J Urol
1993;150:100-105。 17．Lilja H.血清ＰＳＡの異なる分子形態の意義：α1-
抗キモトリプシンと複合体化したものに対する遊離の非
複合体化形態のＰＳＡ.Urol Clin NorthAm 1993;20(4):
681-686。 18．Lilja H,Christensson A,Dahlen U,Matikainen M-
T,Nilsson O,PetterssonK and Lovgren T:ヒト血清中の
前立腺特異的抗原は主としてアルファ抗キモトリプシン
との複合体として存在する.Clin Chem 1991;37:1618-16
25。 19．Bjork T,Hulkko S,Bjartell A,Santagnese AD,Abra
hamsson P-A,Lilja H.ＰＳＡ産生細胞中のアルファ1-抗
キモトリプシンの生成は前立腺ガンに共通するが良性前
立腺肥大症ではまれである.Urology 1994;43:427-434。 20．Pettersson K,Piironen T,Seppala M,Liukkonen L,
Christensson A,Matikainen M-T,Suonpaa M,Lovgren T,
Lilja H.遊離および複合体前立腺特異的抗原（ＰＳ
Ａ）：遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−α1-抗キモトリプシン
複合体の invitro 安定性、エピトープマップ、ならび
に特異的および好感度検出のための免疫蛍光アッセイの
開発.Clin Chem 1995;41:1480-1488。 21．Wu JT,Wilson L,Zhang P,Meikle AW,Stephenson R.
ＢＰＨおよび前立腺ガン患者からの無作為または系列検
体におけるＰＳＡ−ＡＣＴ複合体と総ＰＳＡの血清中濃
度の相関関係.J Clin Lab Anal 1995 9:15-24。 22．Mitrunen K,Pettersson K,Piironen T,Bjork T,Lil
ja H,Lovgren T.(1995)血清中の遊離および総前立腺特
異的抗原の濃度および比率の同時測定のための二重標識
一段階イムノアッセイ.Clin Chem 1995 41(8):1115-112
0。 23．Catalona WJ,Smith DS,Wolfert RL,Wang TJ,Ritten
house HG,Ratliff TL,Nadler RB:前立腺ガンスクリーニ
ングの特異性を改善するための遊離の血清前立腺特異的
抗原の割合の評価.JAMA 1995 274(15):1214-1220。 24．Prestigiacomo AF,Stamey TA. 遊離および複合体化
ＰＳＡの臨床上の有用性.Scan J Clin Lab Invest 1995
55Supple 221:32-34。 25．Wang TJ,Hill TM,Sokoloff RL,Frankenne F,Ritten
house HG,Wolfert RL.遊離前立腺特異的抗原のための二
重モノクローナル抗体イムノアッセイ. Prostate 1996
28:10-16。 26．Jung K,Stephan C,Lein M,Henkne W,Schnorr D,Bru
x B,Schurenkamper P,Loening SA. ２つの遊離前立腺特
異的抗原アッセイを比較した分析の成績および臨床上の
妥当性.Clin Chem 1996 42(7):1026-1033。 27．Wang TJ,Hill T,Sokoloff R,Frankenne F,Wolfert
R,and Rittenhouse H.良性肥大症および前立腺ガンにお
ける遊離ＰＳＡを定量するためのモノクローナル抗体サ
ンドイッチイムノアッセイ.1994 ISOBM会議における後
期発表(poster presentation)。 28．Chan D,Kelley CA,Partin AW,Linton J,Wang TJ,So
koloff RL,RittenhouseHG,and Wolfert RL.Clin Chem
(1996) 42(6):S255。 29．Wang TJ,Linton J,Payne J,Rittenhouse HG,Wolfer
t RL,Chan DW,Kelley CAand Partin AW. ＰＳＡ−ＡＣ
Ｔに対する特異的モノクローナル抗体による複合体化Ｐ
ＳＡイムノアッセイの臨床的有用性. J Urology (1997)
157(4)Suppl:147。 30．Wang TJ,Linton HJ,Payne J,Liu R-S,Kuus-Reichel
K,Rittenhouse HG,Kelley C,Cox J,Chan DW, and Wolf
ert RL. ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に特異的なモノクローナ
ル抗体の開発およびイムノアッセイへのそれらの組み込
み.ClinChem(1997) 43(6):S225。 31．Zhang P and Wu,JT.非特異的吸着の妨害をともなわ
ない、血清中のＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のためのイムノア
ッセイの開発.Clin Chem (1997)43(6):S236。 32．Bjork T,Bjartell A,Abrahamsson P-A,Hulkko S,Di
Sant'agnese A,LiljaH. ＰＳＡ産生細胞中のアルファ1
-抗キモトリプシンの生成は前立腺ガンに共通するが、
良性前立腺肥大症ではまれである.Urol 1994 43(4):427
-434。
【図１】ＡおよびＢはそれぞれＰＳＡ−ＡＣＴ微小粒子
イムノアッセイおよびマイクロプレートに基づくELISA
ＰＳＡ−ＡＣＴサンドイッチイムノアッセイを使用する
ＰＳＡ−ＡＣＴのための標準曲線を示すグラフである。
イムノアッセイおよびマイクロプレートに基づくELISA
ＰＳＡ−ＡＣＴサンドイッチイムノアッセイを使用する
ＰＳＡ−ＡＣＴのための標準曲線を示すグラフである。
【図２】ＡおよびＢは各種ＰＳＡイムノアッセイの特異
性を示すグラフである。サンプルに遊離およびＰＳＡ−
ＡＣＴの比率を変更させたＰＳＡを総量で約 10 ng/mL
を含ませた。Ａにおいて、ＰＳＡ−ＡＣＴ微小粒子イム
ノアッセイはＰＳＡ−ＡＣＴを特異的かつ正確に測定す
ることが示される。その上、ｔＰＳＡアッセイはＰＳＡ
およびＰＳＡ−ＡＣＴを等モル応答で測定し、ｆＰＳＡ
アッセイは遊離ＰＳＡを特異的に測定する。Ｂに示すグ
ラフはマイクロプレートに基づくELISA ＰＳＡ−ＡＣＴ
イムノアッセイにおけるＰＳＡ−ＡＣＴの再現を表して
いる。
性を示すグラフである。サンプルに遊離およびＰＳＡ−
ＡＣＴの比率を変更させたＰＳＡを総量で約 10 ng/mL
を含ませた。Ａにおいて、ＰＳＡ−ＡＣＴ微小粒子イム
ノアッセイはＰＳＡ−ＡＣＴを特異的かつ正確に測定す
ることが示される。その上、ｔＰＳＡアッセイはＰＳＡ
およびＰＳＡ−ＡＣＴを等モル応答で測定し、ｆＰＳＡ
アッセイは遊離ＰＳＡを特異的に測定する。Ｂに示すグ
ラフはマイクロプレートに基づくELISA ＰＳＡ−ＡＣＴ
イムノアッセイにおけるＰＳＡ−ＡＣＴの再現を表して
いる。
【図３】実施例に記載するＰＳＡ−ＡＣＴ微小粒子イム
ノアッセイの特異性を示すグラフである。6％ BSA を含
有するMES 緩衝液中 0，2，10，25，50 および100 ng/m
L の濃度のｆＰＳＡを含有するサンプルをｆＰＳＡアッ
セイおよびＰＳＡ−ＡＣＴアッセイによって試験した。
このデータは、ＰＳＡ−ＡＣＴ微小粒子に基づくイムノ
アッセイによっては遊離ＰＳＡはほとんど測定されなか
ったが、ｆＰＳＡアッセイによっては完全に定量された
ことを証明している。
ノアッセイの特異性を示すグラフである。6％ BSA を含
有するMES 緩衝液中 0，2，10，25，50 および100 ng/m
L の濃度のｆＰＳＡを含有するサンプルをｆＰＳＡアッ
セイおよびＰＳＡ−ＡＣＴアッセイによって試験した。
このデータは、ＰＳＡ−ＡＣＴ微小粒子に基づくイムノ
アッセイによっては遊離ＰＳＡはほとんど測定されなか
ったが、ｆＰＳＡアッセイによっては完全に定量された
ことを証明している。
【図４】ＰＳＡ−ＡＣＴ微小粒子に基づくアッセイは血
清中にスパイクしたＰＳＡ−ＡＣＴを正確に測定するこ
とを示すデータの表である。
清中にスパイクしたＰＳＡ−ＡＣＴを正確に測定するこ
とを示すデータの表である。
Claims (17)
- 【請求項１】 （ａ）血液サンプルを、ＰＳＡへの結合
について特異的な第１抗体試薬およびＡＣＴへの結合に
ついて特異的な第２抗体試薬（該第１および第２抗体試
薬の一方が微小粒子に固定され（捕捉抗体）、該抗体試
薬の他方が標識されている（検出抗体））と混合して、
該第１および第２抗体試薬に結合したＰＳＡ−ＡＣＴを
含む免疫複合体である、ＰＳＡ−ＡＣＴの固定化および
標識免疫複合体を含有する混合物を形成させ、（ｂ）該
固定化免疫複合体を含む微小粒子をその他の反応混合物
から分離し、（ｃ）分離した微小粒子を洗浄し、そして
（ｄ）洗浄した微小粒子中の検出抗体試薬を測定して、
該測定値を血液サンプル中のＰＳＡ−ＡＣＴ濃度に連関
させる、段階を含む、血液サンプル中のＰＳＡ−ＡＣＴ
を測定するための方法。 - 【請求項２】 微小粒子の平均直径が約 0.01 ミクロン
および約100 ミクロンの間である、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 微小粒子の平均直径が約1 ミクロンおよ
び約50ミクロンの間である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 洗浄段階（ｃ）が、分離した微小粒子を
第１洗浄液と混合し、微小粒子を第１洗浄液から分離
し、第１洗浄液から分離した微小粒子を第２洗浄液と混
合し、そして微小粒子を第２洗浄液から分離することを
含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 洗浄および分離段階が自動分析装置で実
施される、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 第１および第２抗体試薬がモノクローナ
ル抗体を含む、請求項１−５のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項７】 微小粒子が磁気応答性である、請求項１
−５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 捕捉抗体が微小粒子に固定されているか
または固定されることが可能であり（捕捉抗体）、検出
抗体が標識されているかまたは標識されることが可能で
ある（検出抗体）、捕捉抗体および検出抗体と血液サン
プルとを混合することによって、ＰＳＡ−ＡＣＴの固定
化および標識免疫複合体を含む反応混合物を形成させ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 検出抗体が酵素または化学発光性化合物
で標識されている、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 捕捉抗体がリガンドで修飾され、微小
粒子に固着されたリガンドに対する結合相手と接触させ
ることによって固定される、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 （１）ＰＳＡへの結合について特異的
な第１抗体試薬、および（２）ＡＣＴへの結合について
特異的な第２抗体試薬（該第１および第２抗体試薬の一
方が微小粒子に固定されているかまたは固定されること
が可能であり（捕捉抗体）、該抗体試薬の他方が標識さ
れているかまたは標識されることが可能である（検出抗
体））を含む、血液サンプル中のＰＳＡ−ＡＣＴを測定
するために使用する、試験用キット。 - 【請求項１２】 微小粒子の平均直径が約 0.01 ミクロ
ンおよび約100 ミクロンの間である、請求項11に記載の
試験用キット。 - 【請求項１３】 微小粒子の平均直径が約1 ミクロンお
よび約50ミクロンの間である、請求項11に記載の試験用
キット。 - 【請求項１４】 検出抗体が酵素または化学発光性化合
物で標識されている、請求項11に記載の試験用キット。 - 【請求項１５】 捕捉抗体がリガンドで修飾され、微小
粒子に固定されたリガンドに対する結合相手と接触させ
ることによって固定されることが可能な、請求項11に記
載の試験用キット。 - 【請求項１６】 第１および第２抗体試薬がモノクロー
ナル抗体を含む、請求項11−15のいずれか１項に記載の
試験用キット。 - 【請求項１７】 微小粒子が磁気応答性である、請求項
11−15のいずれか１項に記載の試験用キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US90374997A | 1997-07-31 | 1997-07-31 | |
| US08/903749 | 1997-07-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11118804A true JPH11118804A (ja) | 1999-04-30 |
Family
ID=25418024
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10230105A Withdrawn JPH11118804A (ja) | 1997-07-31 | 1998-07-31 | Ｐｓａ−ａｃｔの測定 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0895085B1 (ja) |
| JP (1) | JPH11118804A (ja) |
| AT (1) | ATE232299T1 (ja) |
| CA (1) | CA2243033A1 (ja) |
| DE (1) | DE69811157T2 (ja) |
| ES (1) | ES2191889T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004510161A (ja) * | 2000-09-25 | 2004-04-02 | アボット・ラボラトリーズ | 高分子ポリカチオンを用いることにより、特異的結合アッセイにおける血清または血漿含有アッセイ試料の干渉を減少させるための方法及びキット |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE322687T1 (de) * | 1999-10-07 | 2006-04-15 | Joken Ltd | Nachweis von prostatakrebs durch bestimmen des verhältnisses von psa zu igf-1 |
| CN106198989B (zh) * | 2016-06-29 | 2018-02-16 | 丹娜（天津）生物科技有限公司 | 检测前列腺特异抗原与α1‑抗糜蛋白酶复合物的试剂盒 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4322342A1 (de) * | 1993-07-05 | 1995-02-09 | Gif Ges Fuer Immunologische Fo | Verfahren für die Differentialdiagnostik des Prostata-Karzinoms |
| US5599677A (en) * | 1993-12-29 | 1997-02-04 | Abbott Laboratories | Immunoassays for prostate specific antigen |
| IL121659A (en) * | 1996-10-25 | 2000-07-16 | Bayer Ag | Method for determining CPSA in a blood sample |
| US5856182A (en) * | 1996-11-18 | 1999-01-05 | Beckman Coulter, Inc. | Monoclonal antibodies specific for the PSA-ACT complex |
-
1998
- 1998-07-10 CA CA002243033A patent/CA2243033A1/en not_active Abandoned
- 1998-07-17 DE DE69811157T patent/DE69811157T2/de not_active Revoked
- 1998-07-17 ES ES98113378T patent/ES2191889T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-17 AT AT98113378T patent/ATE232299T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-07-17 EP EP98113378A patent/EP0895085B1/en not_active Revoked
- 1998-07-31 JP JP10230105A patent/JPH11118804A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004510161A (ja) * | 2000-09-25 | 2004-04-02 | アボット・ラボラトリーズ | 高分子ポリカチオンを用いることにより、特異的結合アッセイにおける血清または血漿含有アッセイ試料の干渉を減少させるための方法及びキット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0895085A1 (en) | 1999-02-03 |
| EP0895085B1 (en) | 2003-02-05 |
| DE69811157D1 (de) | 2003-03-13 |
| DE69811157T2 (de) | 2003-07-24 |
| CA2243033A1 (en) | 1999-01-31 |
| ES2191889T3 (es) | 2003-09-16 |
| ATE232299T1 (de) | 2003-02-15 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050712 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20060919 |