JPH05506511A - ポリマー性表面増幅剤を用いた構成要素および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリマー性表面増幅剤を用いた構成要素および方法発明の分野 相互作用性化学種を直接的に測定する薄膜検出方法は、長い間、放射性、または 蛍光的、発色的、比色定量的または他の標識依存性の酵素的検出体制に対して常 に著しい利益をもたらしてきた。これらの標識依存性検出システムは、多数のパ ラメーターの充分な最適化を必要とする。これらのパラメーターには、酵素シス テムの場合、酵素比活性、二次受容物質における酵素取り込みのレベル、試験試 料中の二次試薬の量および必要とされる基質（複数も可）のレベルがある。

薄膜システムの欠点は小分子の検出における適用性が低いことであった。それら の分析質は、視覚的または器械的検出に充分な厚さまたは光学密度を生じ得ない 。膜の完全さくｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が維持されたとき、薄膜検出システムは最 適に機能する。上記システムにおいて増幅を目的として設計された方法は、厚さ または密度を増加させ、膜の完全さを維持し、検出システムの限定条件を満たす べきであり、できるだけ単純な構造を有するべきである。

発明の背景 先行技術の記載 先行技術における薄膜検出システムの増幅に関する報告は限定されている。−増 幅方法では、偏光解析検定用のコンカナバリンＡまたは抗−１ｇＧ抗体で被覆さ れた小さなシリカ粒子の使用が記載されている（Ｃ，フレデリック・マンデニレ スおよびに、モスバッハ、「アナリティカル・バイオケミストリーＪ、１７０． ６８−７２．１９８８）。シリカ粒子は、加えられた層が濃度依存的に生物層の 見かけ上の濃度を高めるのに役立つ記載されたシステムにおいて生物層に充分に 近い屈折率を与える。しかしながら、本来剛性であるこれらの粒子は、薄膜の完 全さを維持しない。

アメリカ合衆国特許第４６４７５４４号は、ブラッグ散乱に基づくイムノアッセ イ検出システムについて記載している。ブラッグ散乱は、溝つき固体基質の使用 またはパターンでの抗体の適用により発生する。また、抗体および化学的不活性 担体から成る二次試薬の導入による散乱増強方法も記載されている。好ましい態 様では、５　１１００ｎの金属、例えば金を使用する。金属は、散乱方法におい て顕著な利益を提供する。提案された追加的二次担体は、細胞および２０−５０ ００■の高度架橋性硬直ポリスチレンラテックスであった。このシステムに関す る必要条件は、担体が、散乱させるための不連続の離散した点供給源を提供する ことである。

アメリカ合衆国特許第４４８００４２号は、高屈折率粒子への抗体の結合に基づ く凝集イムノアッセイを記載している。粒子は、高屈折重設または屈折率が１゜ ５４またはそれより大きいコアラテックスポリマーから構築される。外殻は、生 物分子の共有結合に適した物質を提供する。この場合、具体的には０．０３〜０ ゜１ミクロン粒子が使用される。また、凝集反応を評価するためには、粒子は、 散乱させるための離散した点供給源を提供するべきである。アメリカ合衆国特許 ４１８１６３６号は、類似した凝集イムノアッセイを記載しているが、高い屈折 率を必要とはしない。本発明は、水に近い比重を有し、水溶性カルボジイミドを 用いて抗体を共有結合させる表面−ＣＯＯＨ基を含むスチレン−ブタジェン・コ ポリマー・ラテックスの使用について記載している。また、それらのラテックス 粒子に関する必要条件は、それらがそれらの粒子特性を維持することである。

広範囲のスチレン−ブタジェンコポリマーが、凝集検定、イムノアッセイおよび クロマトグラフィー適用に有用であることが見出された。使用されるラテックス は、高度架橋性剛性コポリマーである。これらの適用におけるラテックス粒子は 、目的とする分析質の固体支持体捕獲および分離に最も常用されている。

低架橋性スチレン−ブタジェンコポリマーは、表面活性物質または膜形成粒子と 呼ばれることが多い。これらの製品は、溶液中では粒子として動くが、表面と接 触すると乾燥して順応性膜となる。これらの膜形成スチレンーブタンニンコポリ マーは、広い範囲の官能性結合基を含み得る。表面の親水性を制御する基もまた 記載されている（アメリカ合衆国特許４８３５２１１号）。スチレン−ブタジェ ンに加えて、これらのコポリマーはまた、イソプレン、ビニル、アクリル樹脂、 メタクリル樹脂、ビニルジエンクロリド等を含み得る。これらの物質は、接着剤 の硬化速度を高める薬剤（アメリカ合衆国特許３８３６３７７号）、塗料製剤に おける結合剤ポリマー（アメリカ合衆国特許４６８３２６９号、アメリカ合衆国 特許４３９１９２８号）として、保護性コーティング（アメリカ合衆国特許４９ ０２７３３号、アメリカ合衆国特許４９２５８９３号、アメリカ合衆国特許４６ ８３２６０号、アメリカ合衆国特許３９６２１６７号、アメリカ合衆国特許４７ ８１９４８号、アメリカ合衆国特許４６３６４３７号、アメリカ合衆国特許４５ ３７９２６号、アメリカ合衆国特許４５１０２０４号）として、およびトーニン グフィルムの製造（アメリカ合衆国特許４８０６４５１号）において有用である ことが見出された。

剛性ポリスチレン粒子は、色素取り込みによるシグナル発生に使用されている。

これらの粒子は、標識またはラベルを導入してシグナルを発生させる代替的方法 にすぎない。凝集検定および膜に基づく検定用に着色または染色されたラテック スの用途は、広範に利用されている（概説としては、Ｌ、　Ｂ、パンゲス、アメ リカン・クリニカル・ラボラトリ−・ニュース、１９９０年５月号参照）。先の 場合と同様、これらの粒子に関する一次必要条件は、それらが凝集検定で視覚化 されるべくそれらの構造を維持していること、および歪曲することにより膜に基 づく試験の孔を遮断しないことである。

広範囲の化学作用がポリスチレン−ブタジェンコポリマーに導入され得、ラテッ クス中へ導入されている官能基のタイプの優れた概説は、Ｌ、Ｂ、パンゲス、ア メリカン・クリニカル・ラボラトリ−・ニュース、１９９０年５月号に提示され ている。例えばカルボン酸、第１級または脂肪族アミン類、芳香族アミン類、ア ニリン、クロロメチル、アミド、アルデヒド、千オール、ヒドロキシル、ニトリ ルまたはエポキシといった基は、ポリマー表面に対する受容物質または相互作用 性化学種の一員の共有結合に使用されている。この結合は、受容物質と官能基の 直接反応を通して達成され得るか、または官能基を特定の目的化学作用を有する 新規反応性基に変える修飾に基づき得る。後者の一例は、ラテックス製品への抗 体結合前におけるヒドラジドによるアミド含有ラテックスの修飾である、アメリ カ合衆国特許第４４２１８９６号。共有結合は相互作用性化学種の場合には特異 的な利益を与えるが、ラテックスへの受容物質の受動的吸着が適切なことが多い 。

ラテックス粒子またはスチレン−ブタンエンコポリマーは、免疫検定用および幾 つかのアフィニティー・クロマトグラフィー適用における固体支持体および標識 またはラベルの導入方法として使用されてきたが、それらは凝集検定の範囲を越 えたシステムにおいてシグナルの直接発生で広範に使用されてきたわけではない 。これらの検定は、硬直で明確なラテックス粒子またはビーズを必要とする。

本発明は、薄膜検出方法でのシグナル発生における表面活性剤として知られてい る膜形成ラテックスまたは他の膜形成粒子製品の使用について記載している。

発明の要旨 この発明は、薄膜方法に基づく検定システムにおけるシグナルの独特な増幅方法 について記載している。それらの方法には偏光解析法、干渉作用、側面分析法（ プロフィリメトリー）、走査型狭視（トンネリング）顕微鏡法、原子力顕微鏡法 、インターフェロメトリー、光散乱式全体内部反射または反射計技術があるが、 これらに限定されるわけではない。これらのタイプのシステムでの使用に選ばれ る物質は、溶液中である程度の粒子特性を維持しなければならず、表面または支 持体との接触時に安定した膜を形成しなければならない。膜は試験表面に順応す ることにより、基質の所望の平滑さまたはきめを維持するべきである。表面の特 徴的なきめは、使用される検出方法により異なる。また、選択される物質は、共 有結合的または受動的相互作用により受容物質または相互作用性化学種のセット の一員に付着し得るものでなければならない。受容物質は、受容性化学種の反応 性および安定性を保存する形でシグナル増幅性物質または粒子に付着しなければ ならない。粒子に適用される受容物質は、試験表面の基質に固定された受容性化 学種と同一であるかまたはマツチするものであり得る。

適当な媒質中その反応性物質を通して検出された興味の対象である分析質により 発生されたシグナルの増幅方法であって、（１）少なくとも１種の相互作用性受 容層を支持する基質を有する検出構成要素（ｅｌｅ＋＊ｅｎｔ）を提供し、前記 層は少なくとも１種の他の相互作用性層を支持し得るものであり、次いでそれと 興味の対象である分析質および前記分析質に結合した膜形成性表面活性剤を含む 二次相互作用性受容層形成性基質とを組み合わせ、媒質中でポリマー性ラテック スを形成させ、次いで受容層において視覚的に高められた認識可能なシグナルを 観察および測定するという段階を含む方法は、表面活性構成要素の使用により提 供され得ることが見出された。好ましい方法では、表面活性剤は、水とほとんど 等しい比重を有する膜形成性ラテックスであり、好ましくは水溶性−ＣＯＯＨ部 分を有するスチレン−ブタジェンの高度架橋コポリマーである。偏光解析法を含 めこうして増幅されたシグナルの検出を可能にする多様な方法が存在する。

この方法は、本発明を具体化する構成要素であって、興味の対象である分析質お よび物質の少なくとも１つの一次および二次受容層間の交差から生じる高い表面 光学シグナル、すなわち表面活性化を呈する成分を用いて実施され得る。この構 成要素は、後でさらに詳述されている通り、表面が興味の対象である分析質およ び表面活性剤膜形成性ラテックスを含む物質の組み合わせを含む混合物と接触す る時に一次受容物質の層を支持する基質を含む。

好ましい態様の詳細な記載 若干の相異なる開始基質、光学基質がこの発明による使用に適している。これら の基質には、単結晶の珪素で艶だしまたはラップしたウェハー、光学ガラス、暗 色ガラス、金属、プラスチック、ホウ珪酸塩ガラス等があるが、これらに限定さ れるわけではない。これらの基質は、分子的に平面であり得るか、または特定の きめを出すことにより使用されている検出方法にとって望ましい特性が与えられ 得る。開始基質を追加的物質で被覆することにより、所望の物理特性が提供され 得、例えば珪素ウェハー上に抗反射コーティングを用いることにより、反応性物 質の相互作用の直接視覚化で使用される干渉膜が作成され得る。

開始基質および検出システムの性能を高めるのに適用される膜以外に、基質表面 へ反応性化字種または受容性物質を固定させるために物質の追加層が要求され得 る。一旦基質が反応性化学種を受け入れるべく活性化または処理されると、受容 物質は受動的または共有的結合により適用され得る。

分析質のサイズが、薄膜検出方法のいずれかにより直接観察可能なシグナルを発 生させるのに本質的および自然では不充分な場合、または非常に低い濃度レベル を検出しなければならない場合に増幅が要求される。使用される増幅方法は、検 出技術に必要とされる薄膜特性を維持しなければならない。薄膜の特性を維持す るため、表面活性化粒子または膜形成性ラテックス製剤は活用され得る特性を呈 する。これらの製剤は塗料での使用または保護コーティングとして設計されたが 、それらは様々な生物材料に関する検出体制でより一般的に使用されるラテック スの属性を共有する。

一般に、増幅を必要とする薄膜検定は、その特性および特徴が使用されている方 法のタイプにより決定される基質、所望による二次光学物質、所望による活性化 または付着層、受容物質の層、興味の対象である分析質に適したマトリックスの 試料、反応性化学種で被覆された膜形成性粒子、および必要とされ得る試料プレ パラティブ試薬により構成される。総括的検定プロトコールは、分析質を含む疑 いのある試料が、必要とされる何らかの処理、例えば細胞性抗原の抽出により加 工処理されることを必要とし、次いで二次または増幅試薬と混合される。この混 合物のアリコートは、受容性材料で被覆した基質に適用される。適当なインキュ ベーション期間後、非結合物質は、物理的洗浄／乾燥プロトコールまたは装置内 包洗浄／乾燥段階により反応膜から分離される。次いで、シグナルは視覚的また は器械的に解釈される。二次または増幅膜形成性粒子の導入は、試料収集または 適用装置中凍結乾燥物質として試料へ試薬を加えるかまたは検定装置中に埋封す ることにより行なわれ得る。

増幅性膜形成性粒子の製造は、充分な粒子密度を与え、二次反応性化学種と融和 性であり、捕獲された分析質の見かけ上の厚さまたは密度を高めるのに充分なサ イズ（溶液中）を有する膜形成性粒子または表面の選択を必要とする。表面活性 剤に被覆された二次光学物質は、基質に固定された受容性物質と同一であり得る か、または受容性物質に相補的であり得る。適当な受容性物質には、モノクロー ナルまたはポリクローナル抗体、酵素、それらの基質または阻害物質、細菌性、 ウィルス性またはホルモン性受容体、合成または天然性ＤＮＡ、合成または天然 性ＲＮＡ、または対応する反応性成分（複数も可）が存在する反応性化学種があ るが、これらに限定されるわけではない。二次反応性化学種は、固定された受容 性物質との分析質の相互作用に影響することなく分析質と反応する種類の追加的 反応性物質があればそれを含む。

二次反応性化字種は、ある一定期間適温でのインキュベーションにより表面活性 化粒子に固定化され得る。選択される温度は、粒子への二次反応性化学種の結合 に利用される化学作用、反応性化学種の性質および粒子の組成により影響される 。温度に加えて、インキュベーションの長さ、固定化の化学作用、緩衝液組成（ ｐＨおよびイオン強度およびｐＨ）および二次反応性物質の量は、特定の適用に 対して最適化されなければならない。

与えられた具体例は、膜形成性増幅試薬の製造に使用される方法（複数もあり得 る）のタイプの代表であるものとする。記載された条件は、それらの増幅試薬の 製造における限定を意図したものではない。

実施例１ 表面活性化粒子は、インジアナ、カーメルのパンゲス・ラボラトリーズから購入 された、アミド粒子：ロット番号Ｌ９１０１０８Ａ（ＳＡＴ−０１５／７５８） またはＬ９０１０１５Ｊ（Ｂ７−０１５ＦＦ／１８１）、またはカルボキンレー ト粒子・ロット番号Ｌ９００４１０８（ＳＡＩ−０１５／７８７）。ＴＣ３、Ｔ Ｃ３Ｘ、ＴＣ７およびＴＣ７Ｘは、インジアナ、インジアナポリスのセラディン ・インコーホレイテッドから購入された類似膜形成性粒子である。ＴＣと命名さ れた製品は全て、カルボン酸含有スチレン−ブタンエンコポリマーであった。こ れらの製品のうち、ＴＣ７粒子は充分に検査された。ＴＣ３！ｌ！品は、全くオ パールのような光彩を放つ膜を生じるため、この検出適用では使用されなかった 。検査されたセラディン粒子は、ＴＣ−７Ａ製品番号ＣＭＬ、ロット番号ＩＫ３ ０、ＴＣ−７Ｘロット番号ＩＭ９２、ＴＣ−７０ソト番号ＩＶ１８（ＦＯ４０６ ９０）、ＴＣ−３Ｘロット番号ｌＲ３５およびＴＣ−３０ット番号ＩＪ４４であ った。カルボキンレートおよびアミド粒子は両方とも利用可能であるため、表面 活性化製品は固定化の化学作用においてさらに高い可撓性を与える。アメリカ合 衆国特許第４４２１、８９６号に記載されている通り、アミド粒子はヒドラジド 粒子に容易に変換される。この試験では、単結晶珪素、処女試験ウエノ１−を、 カリフォルニア、サニーベールのアディソン・エンジニアリング、インコーホレ イテッドから購入された。これらのウェハーは、半導体業界の熟練者によく知ら れた技術である、回転被覆装置を用いたストック・シロキサンの２−メチル−２ −ブタノール中３００マイクロリットルの１　：　３００　（Ｖ／Ｖ）希釈物の 適用によりＴ−ポリマーシロキサン（ペンシルベニア、ブリストルのペトラーチ ・システムズ、カタログ番号ＰＳ４０１、ロフト番号）により被覆した。Ｔ−ポ リマーを、１２０℃で１２０分間加熱処理によりウェハーの表面へ硬化させた。

活性化基質を、０．１モルのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ＝６．０中、２０マイクロ グラム／社の割合でストレプトコッカスＡ群抗原に対するうさぎポリクローナル 抗体（カリフォルニア、フォスター・ノティーのメディノクス・バイオチク、イ ンコーホレイテッド、カタログ番号Ｖ−８７２−０１Ｒ１ロＺト番号Ｍ−１１２ ０６）を含有する溶液中に入れた。ウェハーを２５℃で６０分間抗体溶液に浸し 、除去し、脱イオン水で洗浄し、窒素気流下で乾燥した。厚さまたは光学密度の 変化は、サガツクス・コンバリズン・エリプソメーターまたは他の偏光解析技術 を用いて反応したウニ／ｈ−を検査することにより直接観察され、行なわれた測 定との比較は反応前の同じウニ／Ｘ−である。

表１は、様々な方法で被覆された膜形成性粒子により得られた結果を要約したも のである。表１は、緩衝条件、抗体濃度、粒子濃度および必要に応じた遮断物質 の追加を示す。膜形成性粒子の被覆に使用される抗体は、偏光解析用ウェハーに 関して受容性物質として使用されたものと同じであった。２５℃で２６時間混合 物のインキュベーションにより粒子表面に対して抗体を被覆した。ＴＣ７製品を 貯蔵溶液の希釈物として検査し、抗体処理前に水に対して透析し、抗体との反応 前に混合床樹脂で処理した。１％最終濃度（Ｗ／Ｖ）のカルボジイミド（１−シ クロへキシル−３−（２−モルホリノエチル−カルボジイミド）メト−ｐ−トル エンスルホネート、アルドリック・ケミカル・カンパニー、ミルウオーキー、ウ イスコンンン、カタログ番号Ｃ１０，６４０−２、ロット番号０９９１５ＰＷ） を加えることにより、カルボキンレート粒子で抗体の共有結合を検査した。抗体 を加える前にカルボジイミドを加えた。抗体を加えることにより粒子表面への抗 体の共有結合が得られる直前にヒドラジ「処理したアミド粒子を最終濃度０，０ ５％のグルタルアルデヒドで処理した。特記しない場合、０．０１モル燐酸緩衝 食塩水ｐＨ＝７．２中抗体により粒子を被覆した。

陽性対照の製造に使用されるストレップＡ抗原製品は、メデイックス・バイオチ クから購入された。この抗原を、１部２モルのＮａＮ０ｔ、１部２モル９酢酸お よび１部０．６６ＮのＮａＯＨから成る混合物中へ１：６００希釈レベルに希釈 した。同じ製品から抗原を除いたものを陰性対照として使用した。二次増幅性試 薬を、表１で示された通り、陽性および陰性対照と様々な比率で混合し、５マイ クロリツトルを抗体被覆ウェハーの表面に適用した。試料を２５℃で２分間イン キュベーションし、洗浄し、次いで窒素気流下で乾燥した。反応したウェハーを サガックス・エリプソメーターで検査し、ミリボルトで測定された強度の変化と して濃度を記録した。

壇 咥び＝＝器冗黛 塔 ★　増幅物質対試料比。

ａ　この粒子製品中におけるヒドラノドの最終濃度は３モルであり、５０ミリモ ルのＭＥＳＳｐ）（＝５．０および５６℃で３０分間粒子に抗体を被覆した。

これらのデータは、増幅性試薬において粒子密度が非常に高いと、その試薬と試 験表面との非特異的会合が導入されることを立証している。補助的蛋白質または 界面活性剤を加えても、抗体被覆粒子の性能は改善されない。表面活性剤よりも 僅かに硬直であるＴＣ−７粒子でも、この特定適用については同じく機能しない が、より伝統的なラテックス製品と比較すると、ＴＣ−７粒子は顕著な反応性を 示す。温度を増すと、粒子への抗体導入レベルが改善されると思われるため、遊 離抗体のレベルが低減化される。遊離抗体はこれらの粒子からは除去されなかっ たが、例えば限外ろ過といった技術により非会合抗体を除去するのが有利であり 得る。アミド粒子もまた充分に機能するが、ヒドラジド誘導体化アミド粒子は最 善の全体的反応性を与えると思われる。表面活性剤カルボキシレート粒子はアミ ド粒子と同様に機能しない。

実施例２ この試験では、増幅性膜形成性粒子を実施例１と同じ要領で製造し、上記に従っ て検定を行った。しかしながら、これらの実験では、視覚的に解釈可能な基質を 、ストレップＡ群抗原に対する抗体により被覆した。使用される基質は、半導体 産業の熟練者によく知られたプロセスを用いて１２−２０ミクロンの酸化アルミ ニウム粒子（平均粒子サイズ１５ミクロン）でラップされることにより、粗いき めの表面が作成された単結晶珪素ウェハーであった。この基質を、当業界の熟練 者に周知のかなり多数の相異なる析出技術により窒化珪素の薄膜で被覆する。光 学コーティングの必要条件は、光学物質の膜が、半導体プロセスに関して伝統的 に要求される場合よりもかなり高い許容限界へ非常に均一に適用されることであ る。

３５０−５５０オングストロームの窒化珪素膜がこの適用の場合には標準的であ るが、いかなる膜の厚さでも使用され得る。窒化珪素が、この適用に適した唯一 の材料というわけではない。光学スライドのＴ−ポリマー処理は上記と同様であ つた。これらの結果は、偏光解析システムで為された観測結果を立証している。

非常に高い粒子密度により明確な陰性が与えられるが、強い視覚的シグナルは発 生されない。粒子への抗体導入のレベルが高いと、低いレベルの抗体の場合より も強いシグナルが発生される。この試験は、粒子の抗体カバレッジが不充分であ る場合も、粒子と試験表面との非特異的会合が行なわれることを示唆している。

陽性対照を１・６４に希釈すると、陰性対照とは明確に分離される。

表２ 増幅物質　固体％　抗体濃度　Ａ・Ｓ比★　視覚的応答陰性　陽性 ＳＡ＋Ｎ＝Ｎ！Ｔ　Ｈ２Ｏ１０１５０１：１　＋ＳＡ：Ｎ＝ＮＨ１＋２０　１０ 　１５０　１：１　−　＋ＳＡ：Ｎ＝聞　１（２０１０１５０１・２　−　＋Ｓ Ａ：Ｎ＝Ｎｔｌ　ＬＯ１０１５０１：３　−　＋Ｓ＾・Ｎ＝ＮＨＨ２Ｏ１０１５ ０１：４　−　＋＋ＳＡ：Ｎ＝Ｎｌｌ　Ｈ２Ｏ１０１５０１：５　−　＋／−５ Ａ：Ｎ＝ｍｌＨｔ０　３　１５０　１：１　＋／−＋＋ＳＡ：Ｎ＝ＮＨＨ２Ｏ３ １５０１・５＋／−＋Ｓ＾：Ｎ＝ＮＩｌａ　３　３００　１：２　−　＋十＋Ｓ ＾：Ｃ０ＮＨ２ａ　３　３００　１：２　＋＋★　増幅物質対試料比。

ａ　最終ヒドラジド濃度は３モルであり、抗体は、ｐＨ＝６．０．５６℃で３０ 分間５０ミリモルのＭＥＳ中で粒子に加えられる。これらの実験では２．５モル のＭＯＰＳを中和剤として用いることにより、８．０の最終ｐＨが得られた。

実施例３ この試験では、使用される偏光解析表面は実施例１記載のものであった。検査さ れたシステムは、ヒト血しょうにおけるトロンビン／抗トロンビンＩＩＩ（Ａ　 Ｔ　−Ｉｌｌ）複合体を検出すべく設計された。ポリクローナル抗トロンビンお よびポリクローナル抗ＡＴ−丁ＩＩ（ダコ・コーポレイション、サンタ・バーバ ラ、カリフォルニア）は、各々試験表面および増幅性試薬の製造に使用された。

ｔ−ポリマー偏光解析表面を、ｐＨ＝３．０の０．１モルＮａ２ＨＰＯ４緩衝液 中２０　μｇ／ｍ１（７）抗ト。

ンビン抗体で被覆した。

二次または増幅性試薬の製造 この二次抗体試薬は、ヒドラジド誘導体化表面活性剤に関する実施例１および２ 記載の結合プロトコールの修正法を用いて製造されたものであり、水中０．８％ 粒子の最終密度の粒子と７０μｇ／ｍｌの抗−Ａ　Ｔ　ＩＩＩ抗体とのインキュ ベーションを必要とする。

検定実施プロトコール 正零ヒト血しょう中で精製トロンビン抗トロンビンＩＩＩ複合体を再構成し、次 いで４倍希釈率でその血しょうにより希釈して、検査範囲に関する標準物質を作 成することにより標準物質を製造した。次いで、標準物質を規定食塩水で１・１ ０に希釈した。これらの溶液を二次試薬と１．１混合し、１０マイクロリツトル を抗トロンビン被覆表面に適用した。スポットを、室温（２５℃）で５分間イン キュベーションし、次に脱イオン水で洗浄し、窒素気流下で乾燥した。これらの 反応したスライドを、コンパツク３８６コンピユーターによるデータの獲得を可 能にするサガックス・コンバリズン・エリプソメーターの修正法で評価した。試 料値を標準曲線から補作した。

表３ ＴＡＴ血しょう標準曲線 濃度★（ｎｇ、／ｍｌ）　偏光解析値（ｍＶ）　平均ｔｇＶ値　ＣＶ（％）３． ３　０．０．　０．０．　０．２　０．１＋／−０，１４，４６２５，６，２５ ，４，２５，５２５，５＋／−０，１＜０．１％７．９３　２６．９．２７．ｌ 、２８，６　３０．９＋／−６，７２１，７％２１．８　７０．４．６２４．７ ０，９　６７．９＋／−４，８７，０％７７．３　９１．０．９９．０．８１， ３　９０．４＋／−９，８５，２％★　正常面しょうは、市販されているＥＬＩ 　ＳＡキットに基づき３　、３　ｎｇ／ｍｌＯ値を有することが立証された。こ の残留ＴＡＴ濃度を標準レベルに加えると、正確な標準濃度が得られた。

好ましい増幅性試薬と比較するため、抗ＡＴＩＩＩ抗体の７０μｇ／ｍｌ希釈物 を、市販されているコンジュゲート希釈物中で製造し、上記血しょう対照により 検査した。希釈した抗体を前記と同様に試料と１：１混合した。検定条件および 方法は一定であった。血しょうは希釈せずに使用した。

表４ ４０．３　５８．０ 分解または動的範囲は、増幅性試薬へ混入されたのと同じ濃度で二次抗体を使用 しても非常に僅かしか得られなかった。増幅性試薬の効果により、標準物質はよ り一貫して分解される。表４で与えられた最終濃度を越える濃度であれば全て飽 和状態に到達した。

抗ＡＴＩＩＩ抗体コンジュゲート西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の２４ μｇ／１１および４８μｇ／＊ｌの希釈物を、フンシュゲート希釈剤中で製造し た。血しょう標準物質を、希釈したコンジュゲート製品と１：１混合し、上記検 定プロトコールを使用した。表５は、２４μｇ／ｍｌコンジュゲートに関する代 表的検定結果を示し、表６は４８μｇ／ｍｌの場合を示す。コンジュゲート製剤 の場合分解状況は僅かに改善されるが、動的範囲は得られず、システムは表で与 えられた濃度を越える濃度で飽和する。

表５ ３、９　８．７ ４、５　９．０ 表６ 実施例４ ポリクローナル抗ストレップＡ抗体にキー・ホール・リンペット・ヘモシナフン （ＫＬＨ）またはフェリチンを結合させることにより、二次試薬を製造した。Ｋ ＬＨまたはフェリチンまたは他の蛋白質があればそれに抗体をコンジュゲーンヨ ンする方法は、当業界の熟練者には周知である。ＫＬＨは、サイズが大きいため （ＭＷ＝　１００００００ダルトン）当然シグナルを増強させる。フェリチンは 大きな分子ではあるが、フェリチンの各分子は１０分子の鉄を携え得るため、当 然比較的高い屈折率を有する。高屈折率粒子は、当然実施例２記載の視覚的検出 システムと有利に衝突する。実施例２の記載に従い、インターフェレンス（干渉 ）スライドを抗ストレップＡ抗体により被覆した。実施例２記載の検定プロトコ ールに従ったが、抽出プロトコールでは中和試薬として２．５モルのトリズマを 使用し、抗原製品は異なる重版供給源から入手した。試料を二次試薬と１・１混 合した。

試料対試験される二次試薬のあらゆる比率で発生した視覚的シグナルは非常に弱 いため、解釈が困難であった。残留基底値シグナルにより、正味（ｎｅａｔ）陽 性対照の希釈物の解釈を陰性対照と分離するのが不可能となった。

表７ 実施例５ 表面活性剤アミド粒子、実施例２と同様に処理したヒドラジドを、粒子に青色を 付与する染料で処理した。過剰の染料を粒子から透析により除去し、領８％最終 固体製品を、メディックス抗ストレップＡ抗体と５６℃で３０分間７５．０μｇ ／ａ＋１の最終抗体濃度で反応させた。この試験で使用される標準物質は実施例 ４と同様であった。この試験で使用される中和剤は２．５モルＭＯＰＳであり、 最終ｐＨは８．０に達した。正味陽性標準物質の視覚的印象は、最初の表面活性 剤ヒドラジド粒子により得られたものと同等である。染色されたＳＡ／ヒドラジ ド粒子により、僅かのレベルの非特異的結合も観察された。

本発明の様々な形態および修正法を開示したが、本発明はそれらに限定されるわ けではなく、請求の範囲内に含まれる全ての手段および変形も包含するものとす る。

要約書 この発明は、薄膜検出システムに基づいた検定で使用される二次または増幅性試 薬の製造方法について記載している。視覚的に解釈され、器械的に分析される雨 検出システムにおいて最適の性能を与える粒子の特徴が記載されている。これら の薄膜システムにおける増幅は、受容性物質および分析質の反応で生成された薄 膜の厚さまたは光学密度を増加させ得る物質の使用により達成され得る。これら の検定システムは、様々な相互作用性化学種間の反応の検出に有用である。

国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）薄膜検出システムにおいて、媒質から検出された興味の対象である反応性 物質の分析質により発生したシグナルを増幅する方法であって、少なくとも１つ の相互作用性受容層を支持する基質を有する検出構成要素を提供し、前記層が少 なくとも１つの他の相互作用性層を支持し得るものであり、それに興味の対象で ある分析質および前記分析質に結合した膜形成性表面活性剤を含み、媒質中でポ リマー性ラテックスを形成する第二相互作用性受容層形成性物質を合わせ、前記 層から視覚的に増強された認識可能なシグナルを観察および測定することを含む 方法。
2. （２）表面活性剤が膜形成性ラテックスである、請求項１記載の方法。
3. （３）ラテックスが高度架橋スチレン−ブタジエンコポリマーである、請求項２ 記載の方法。
4. （４）ラテックスが、水溶性部分を用いて興味の対象である分析質に共有結合し ている、請求項３記載の方法。
5. （５）測定が偏光解析法により行なわれる、請求項１記載の方法。
6. （６）興味の対象である分析質および少なくとも１つの第一および第二受容性物 質間の相互作用から発する増強された表面光学シグナルを呈する構成要素であっ て、表面とさらに興味の対象である分析質および表面活性剤膜形成性ラテックス を含む組み合わせを含む第二受容性物質を含む混合物とが接触するときに第一受 容性物質の層を支持する基質を含む構成要素。
7. （７）表面活性剤が高度架橋スチレン−ブタジエンコポリマーである、請求項６ 記載の構成要素。
8. （８）表面活性剤が、水溶性部分を用いて興味の対象である分析質に共有結合し ている、請求項７記載の構成要素。