DE69227655T2

DE69227655T2 - Testeinheiten und verfahren, die polymerischen oberflächen-verstärkungsagenzien verwenden

Info

Publication number: DE69227655T2
Application number: DE69227655T
Authority: DE
Inventors: Greg Fort Collins Co 80524 Bogart; Jeffrey Boulder Co 80302 Etter; Diana Thornton Co 80221 Maul; Tammy Broomfield Co 80020 Peterson; Loretta Boulder Co 80303 Zapp
Original assignee: Biostar Inc USA
Current assignee: Inverness Medical Biostar Inc
Priority date: 1991-02-11
Filing date: 1992-02-11
Publication date: 1999-04-22
Anticipated expiration: 2012-02-12
Also published as: HK1001890A1; AU652234B2; EP0525178B1; ES2125260T3; WO1992014147A1; EP0525178A1; DE69227655D1; EP0525178A4; JPH05506511A; ATE173826T1; AU1436992A

Description

FACHBEREICH DER ERFINDUNG

Dünnschichtfilm-Nachweisverfahren, die die direkte Bestimmung wechselwirkender Spezies ermöglichen, werden seit langem signifikante Vorteile gegenüber radioaktiven oder enzymatischen, gleich ob fluoreszierenden, lumineszierenden, kolorimetrischen oder anderen markierungsabhängigen Nachweismethoden zugesprochen. Diese markierungsabhängigen Nachweissysteme erfordern die umfassende Optimierung einer großen Zahl von Parametern. Für enzymatische Systeme zählen zu diesen Parametern: spezifische Enzymaktivität, Grad der Bindung von Enzym an sekundäres rezeptives Material, Menge des Sekundärreagenz in der Testprobe und Menge des/der erforderlichen Substrats/e.
Dünnschichtfilmsysteme zeigten bisher den Nachteil einer geringeren Anwendbarkeit beim Nachweis kleiner Moleküle. Solche Analyte sind hinsichtlich der Dicke oder optischen Dichte für den visuellen oder instrumentellen Nachweis unzureichend. Dünnschichtfilm-Nachweissysteme erzielen eine optimale Leistung, solange die Unversehrtheit des Films erhalten bleibt. Jegliches, auf die Amplifikation solcher Systeme ausgelegtes Verfahren sollte eine Dicken oder Dichtenerhöhung bei gleichzeitiger Unversehrtheit des Films anstreben als auch sämtliche Beschränkungen der Nachweissysteme erfüllen, und sollte außerdem von einfachstmöglicher Konstruktion sein.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Beschreibung des Stands der Technik

Die Zahl der Berichte über Amplifikationen bei Dünnschichtfilm-Nachweissystemen nach dem Wissensstand ist begrenzt. Bei einem Amplifikationsverfahren ist die Verwendung kleiner Silicium-Partikel beschrieben, die mit Concanavalin A oder einen Anti-IgG-Antikörper zur Verwendung bei einem ellipsometrischen Assay beschichtet sind (C. Fredrik Mandenires und K. Mosbachm Anal. Biochem., 170, 68- 72, 1988). Silicium-Partikel verfügen über einen Brechungsindex, der den biologischen Schichten im beschriebenen System ausreichend nahekommt, so daß die zugefügte Schicht zur Erhöhung der scheinbaren Dicke der biologischen Schichten in einer Konzentrations-abhängigen Weise dient. Da diese Partikel von Natur aus hart sind, ist die Unversehrtheit des Films allerdings nicht gewährleistet.
In US-Patentschrift 4.647.544 ist ein Immunoassay-Nachweissystem beschrieben, das auf Bragg-Streuung beruht. Die Bragg-Streuung wird durch Verwenden eines gekerbten festen Substrats oder durch Aufbringung des Antikörpers in Mustern erzielt. Auch wird ein Verfahren zur Erhöhung der Streuung durch Einführung eines Sekundärreagenz, zusammengesetzt aus einem Antikörper und einem chemisch inerten Träger, beschrieben. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird ein Metall verwendet, zum Beispiel 6old von 5-100 nm Dicke. Metalle bieten beträchtliche Vorteile beim Streuungsverfahren. Weitere vorgeschlagene Sekundärträger bestanden in Zellen und hochgradig quervernetztem, hartem Polystyrol-Latex von 20-500 nm Dicke. Die Anforderung an dieses System besteht darin, daß der Träger diskontinuierliche, diskrete Punktquellen für die Streuung bieten muß.
In US-Patentschrift 4.480.042 ist ein Agglutinationsimmunoassay beschrieben, der auf der Anlagerung von Antikörpern an Partikel mit hohem Brechungsindex beruht. Die Partikel sind aus einem Schalen- oder Kernlatex-Polymer mit einem hohen Brechungsindex von 1,54 oder mehr hergestellt. Die Außenschale bietet ein Material, das zur kovalenten Bindung des Biomoleküls geeignet ist. In diesem speziellen Fall wird ein 0,03 bis 0,1 Mikrometer dicker Partikel verwendet. Auch hier sollten zur Bewertung einer Agglutinationsreaktion die Partikel diskrete Punktquellen für die Streuung aufweisen. In US-Patentschrift 4.181.636 ist ein ähnlicher Agglutinationsimmunoassay beschrieben, der allerdings den hohen Brechungsindex nicht erfordert. Bei der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Styrol-Butadien- Copolymerlatex mit einer spezifischen Schwerkraft nahe der von Wasser beschrieben, der an der Oberfläche -COOH-Gruppen für die kovalente Bindung von Antikörpern unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids enthält. Auch hier ist die Anforderung an derartige Latexpartikel die Beibehaltung ihres teilchenartigen Charakters.
Eine breite Vielfalt von Styrol-Butadien-Copolymeren hat in Agglutinationsassays, Immunoassays und chromatographischen Anwendungen Einsatz gefunden. Bei den verwendeten Latexen handelt es sich um hochgradig quervernetzte, harte Copolyere. Die gebräuchlichste Verwendung der Latexpartikel bei diesen Anwendungen ist die als fester Träger zum Einfangen und Trennen des gewünschten Analyts.
Styrol-Butadien-Copolymere mit geringer Quervernetzung werden häufig als Oberflächenaktivatoren oder filmerzeugende Partikel bezeichnet. Diese Präparate verhalten sich als Partikel in Lösung, doch trocknen in Kontakt mit einer Oberfläche zu einem konturgetreuen Film aus. Diese filmerzeugenden Styrol-Butadien- Copolymere können eine breite Vielfalt funktioneller Bindungsgruppen enthalten. Auch Gruppen, die die Hydrophilie einer Oberfläche kontrollieren, wurden beschrieben (US-Patentschrift 4.835.211). Über Styrol-Butadien hinaus können diese Copolymere auch Isopren, Vinyl, Acryl, Methacryl, Vinylidenchlorid usw. enthalten. Diese Stoffe fanden in Mitteln zur Erhöhung der Härtungsgeschwindigkeit von Klebstoffen (US-Patentschrift 3.836.377), als ein Bindemittel-Polymer in Farbformulierungen (US-Patentschrift 4.683.269; US-Patentschrift 4.391.928), als Schutzbeschichtungen (US-Patentschrift 4.902.733; US-Patentschrift 4.925.893; US-Patentschrift 4.683.260; US-Patentschrift 3.962.167; US-Patentschrift 4.781.948; US-Patentschrift 4.636.437; US-Patentschrift 4.537.926; US-Patentschrift 4.510.204) und bei der Herstellung von Tönungsfilmen (US-Patentschrift 4.806.451) Anwendung.
Harte Polystyrol-Partikel wurden durch Aufnahme in einen Farbstoff für die Signalerzeugung verwendet. Bei diesen Partikeln handelt es sich einfach um ein alternatives Verfahren zur Einführung einer Markierung oder eines Markers für die Signalerzeugung. Farbige oder gefärbte Latexe für Agglutinationsassays und für auf Membranen basierende Assays finden umfassende Anwendung (zur Übersicht siehe L. B. Bangs, American Clinical Laboratory News, Mai 1990). Wie in früheren Fällen ist die Primäranforderung an diese Partikel die, daß sie ihre Struktur zur Sichtbarmachung bei Agglutinationsassays beibehalten und nicht durch Deformierung die Poren der auf Membranen basierenden Tests verstopfen.
Ein breiter Bereich chemischer Stoffe kann in die Polystyrol-Butadien-Copolymere eingeführt werden, wobei eine ausgezeichnete Übersicht über die Arten von funktionellen Gruppen, die in Latexe eingeführt wurden, wiedergegeben ist in L. B. Bangs, American Clinical Laboratory News, Mai 1990. Gruppen, wie z. B. Carboxylsäure, primäre oder aliphatische Amine, aromatische Amine, Anilin, Chlormethyl, Amid, Aldehyd, Thiol, Hydroxyl, Nitril oder Epoxy wurden zur covalenten Bindung von rezeptivem Material oder einem Mitglied wechselwirkender Spezies an die Oberfläche des Polymers verwendet. Diese Bindung kann durch direkte Reaktion der funktionellen Gruppe mit dem rezeptiven Material erfolgen oder kann auf einer Modifikation der funktionellen Gruppe zu einer neuen reaktiven Gruppe mit einer spezifisch gewünschten chemischen Struktur beruhen. Ein Beispiel für letzteres ist die Modifikation eines Amid-haltigen Latex mit Hydrazid vor der Bindung eines Antikörpers an das Latex-Präparat (US-Patentschrift 4.421.896). Zwar bietet die kovalente Bindung spezifische Vorteile bei bestimmten wechselwirkenden Spezies, doch reicht die passive Adsorption des rezeptiven Materials an den Latex häufig aus.
Während Latex-Partikel oder Styrol-Butadien-Copolymere als feste Träger für Immunoassays und bei einigen affinitätschromatographischen Anwendungen ebenso wie als Verfahren zur Einführung einer Markierung oder eines Markers verwendet wurden, so fanden sie doch keinen breiten Einsatz bei der direkten Signalerzeugung in einem System über Agglutinationsassays hinaus. Dieses Assays erfordern harte, wohldefinierte Latex-Partikel oder -Körnchen. Die vorliegende Erfindung beschreibt die Nutzbarmachung filmerzeugender Latex- oder anderer filmerzeugender Partikel- Präparate, bekannt als Oberflächenaktivatoren, für die Erzeugung eines Signals bei Dünnschichtfilm-Nachweismethoden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Bei dieser Erfindung ist ein einzigartiges Verfahren zur Amplifikation von Signalen in Assay-Systemen beschrieben, die auf einem Dünnschichtfilm-Verfahren beruhen. Zu solchen Verfahren zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Ellipsometrie, Interferenzeffekte, Profiltastschnittmessung, Raster-Tunnelmikroskopie, Atomkraftmikroskopie, Interferenzmessung, Lichtstreuungs-, Totalreflexions- und reflektometrische Methoden. Die zur Verwendung bei diesen Systemarten gewählten Materialien müssen einen bestimmten Grad an teilchenartigem Charakter in Lösung beibehalten und müssen bei Kontakt mit einer Oberfläche oder einem Träger einen stabilen Film bilden. Der Film sollte konturgetreu zur Testoberfläche sein, um die erwünschte Glätte oder Struktur des Substrats aufrechtzuerhalten. Die charakteristische Struktur der Oberfläche hängt vom verwendeten Nachweisverfahren ab. Das gewählte Material muß auch zum Festhalten, durch kovalente oder passive Wechselwirkung, eines rezeptiven Materials oder eines Mitglieds eines wecheselwirkenden Spezies- Sets fähig sein. Das rezeptive Material muß an das Signal-verstärkende Material oder Partikel in einer Weise angelagert werden, die die Reaktivität und Stabilität der rezeptiven Spezies bewahrt. Das auf die Partikel aufgebrachte rezeptive Material kann der auf dem Substrat der Testoberfläche immobilisierten rezeptiven Spezies identisch oder angepaßt sein.
Es wurde nun festgestellt, daß ein amplifizierendes Verfahren durch Verwendung von Oberflächenaktivator-Komponenten bereitgestellt werden kann, wobei das Signal durch Binden eines Analyts von Interesse an das rezeptive Material in einem geeigneten Medium erzeugt wird. Das Verfahren umfaßt die Schritte des (1) Bereitstellens einer Nachweisvorrichtung mit einem optischen Substrat, das mindestens eine Haftschicht trägt, wobei diese Schicht zum Tragen mindestens einer weiteren wechselwirkenden Schicht fähig ist, dann das Kombinieren damit eines zweiten wechselwirkenden, eine rezeptive Schicht erzeugenden Reagenz, umfassend ein Analyt von Interesse und einen an das Analyt durch diese zweite wechselwirkende rezeptive Schicht in einem Medium gebundenen filmerzeugenden Oberflächenaktivator, dann Beobachten und Messen des visuell verstärkten und unterscheidbaren Signals auf dem optischen Substrat. Beim Verfahren handelt es sich beim Oberflächenaktivator um einen filmerzeugendes Latex mit nahezu derselben spezifischen Schwerkraft wie Wasser, der ein gering quervernetztes Copolymer von Styrol-Butadien, vorzugsweise mit wasserlöslichen -COOH- Komponenten ist. Es gibt zahlreiche Verfahren, mittels derer der Nachweis der derart verstärkten Signale vorgenommen werden kann, einschließlich ellipsometrischer Verfahren.
Dieses Verfahren kann unter Verwendung eines Elements der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden, das verstärkte optische Oberflächensignale erbringt, das heißt von Oberflächenaktivatoren, die aus der Wechselwirkung zwischen einem Analyt von Interesse und mindestens einer ersten und zweiten Materialannehmenden Schicht entsteht. Dieses Element umfaßt ein Substrat, wie im folgenden umfassender beschrieben werden wird, das eine Schicht aus einem ersten annehmenden Material trägt, dessen Oberfläche mit einem Gemisch zusammengebracht ist, umfassend eine Kombination von Substanzen, die in einem Analyt von Interesse und einem oberflächenaktivierenden, filmerzeugenden Styrol- Butadien-Copolymer-Latex bestehen.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Zur Verwendung bei dieser Erfindung ist eine ganze Reihe verschiedener Ausgangssubstrate, also optischer Substrate, geeignet. Dazu zählen, doch darauf beschränkt zu sein, monokristalline Silicium-polierte oder -geschliffene Wafer, optische Gläser, Dunkelgläser, Metall, Kunststoff, Borsilikatgläser etc. Diese Substrate können molekular planar oder strukturiert sein, um die gewünschte Eigenschaft für das verwendete Nachweisverfahren bereitzustellen. Das Ausgangssubstrat kann mit weiteren Materialien beschichtet sein, um eine gewünschte physikalische Eigenschaft zu erzielen, wie z. B. bei der Verwendung von Anti-Reflexinns-Beschichtungen auf Silicium-Wafern zur Schaffung eines Interferenzfilms zur Verwendung bei der direkten Sichtbarmachung der Wechselwirkung reaktiver Spezies.
Über das Ausgangssubstrat und die zur Leistungserhöhung des Nachweissystems aufgebrachten Filme hinaus können weitere Materialschichten zum Verankern der reaktiven Spezies oder des rezeptiven Materials auf der Substratoberfläche erforderlich sein. Ist das Substrat einmal aktiviert oder zur Annahme der reaktiven Spezies behandelt, so kann das rezeptive Material mittels passiver oder kovalenter Bindung aufgebracht werden.
Eine Amplifikation ist dann erwünscht, wenn die Größe des Analyts an sich unzureichend ist, um ein Signal zu erzeugen, das mit einem der Dünnschichtfilm- Nachweisverfahren direkt beobachtbar ist, oder dann, wenn extrem geringe Konzentrationsgrade nachgewiesen werden müssen. Das angewandte Amplifikationsverfahren muß die für die Nachweismethode erforderlichen Dünnschichtfilm- Eigenschaften erhalten. Zur Erhaltung der Eigenschaften des Dünnschichtfilms bieten die Oberflächenaktivator-Partikel oder die filmerzeugenden Latex-Formulierungen die Eigenschaften, die ausgenutzt werden können. Die Formulierungen wurden zwar zur Verwendung bei Farben oder als Schutzbeschichtungen entwickelt, doch teilen sie die Eigenschaften der üblicherweise bei Nachweismethoden für verschiedene biologische Stoffe verwendeten Latexe.
Im allgemeinen besteht ein Dünnschichtfilm-Assay, der einer Amplifikation bedarf, aus einem Substrat, dessen Eigenschaften und Merkmale durch die Art der verwendeten Nachweismethode bestimmt werden, wahlweise einem sekundären optischen Material, wahlweise einer Aktivierungs- oder Haftschicht, einer Schicht aus rezeptivem Material, einer für das Analyt von Interesse geeigneten Matrixprobe, mit reaktiver Spezies beschichtete filmerzeugende Partikel aus reaktiver Spezies und jeglichen eventuell erforderlichen Proben-präparativen Reagentien. Ein allgemeines Assay-Protokoll erfordert, daß die vermutetermaßen das Analyt enthaltende Probe mittels jeglicher erforderlichen Behandlung bearbeitet wird, wie z. B. der Extraktion eines zellulären Antigens und dann mit dem Sekundär- oder Amplifikationsreagenz gemischt wird. Eine Teilmenge dieses Gemischs wird auf das mit rezeptivem Material beschichtete Substrat aufgetragen. Nach einer angemessenen Inkubationszeit wird das ungebundene Material vom umgesetzten Film entweder mittels eines physikalischen Spül/Trocknungs-Protokolls oder mit einem Gerät für Spül/Trocknungsschritte abgetrennt. Das Signal wird dann visuell oder instrumentell interpretiert. Die Einführung der filmerzeugenden Sekundär- oder Amplifikations- Partikel kann durch Zugabe eines Reagenz zur Probe, zum Beispiel eines lyophilisierten Materials in der Probenauffang- oder Aufbringungsvorrichtung, oder eingebettet in eine Assay-Vorrichtung, erfolgen.
Die Herstellung der verstärkenden filmerzeugenden Partikel erfordert die Auswahl eines filmerzeugenden Partikel- oder Oberflächenaktivators, der eine ausreichende Partikeldichte bietet, mit der sekundären reaktiven Spezies kompatibel und von ausreichender Größe (in Lösung) ist, um die scheinbare Dicke oder Dichte des eingefangenen Analyts zu erhöhen. Das auf den Oberflächenaktivator aufgeschichtete sekundäre rezeptive Material kann dem am Substrat immobilisierten rezeptiven Material identisch sein oder kann dem rezeptiven Material komplementär sein. Zu geeigneten rezeptiven Materialien zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Antikörper, monoklonal oder polyklonal; Enzyme, deren Substrate oder Inhibitoren; bakterielle, virale oder hormonelle Rezeptoren; DNA eines synthetischen oder natürlichen Ursprungs; RNA eines synthetischen oder natürlichen Ursprungs; oder eine beliebige reaktive Spezies, für die entsprechende/s reaktive(s) Material(ien) existiert/en. Die sekundäre reaktive Spezies umfaßt jegliche zusätzliche reaktive Spezies, die mit dem Analyt ohne Beeinträchtigung der Wechselwirkung von Analyt und immobilisiertem rezeptivem Material reagiert.
Die sekundäre reaktive Spezies kann auf den Oberflächenaktivator-Partikeln durch Inkubation bei einer geeigneten Temperatur über einen bestimmten Zeitraum hinweg immobilisiert werden. Die Temperaturwahl wird durch das angewandte chemische Verfahren zur Bindung der sekundären reaktiven Spezies an die Partikel, die Beschaffenheit der reaktiven Spezies und die Zusammensetzung der Partikel beeinflußt. Zusätzlich zur Temperatur müssen auch Länge der Inkubation, chemisches Verfahren der Immobilisierung, Puffer-Zusammensetzung (pH-Wert und Ionenstärke) und Menge des sekundären reaktiven Materials für die spezielle Anwendung optimiert werden.
Die angegebenen spezifischen Beispiele sollen die Art(en) von Verfahren, die zur Herstellung des filmerzeugenden Amplifikationsreagenz angewandt werden, veranschaulichen. Die beschriebenen Bedingungen sind nicht als Einschränkung für die Herstellung solcher Amplifikationsreagentien zu verstehen.

BEISPIEL 1

Die Oberflächenaktivator-Partikel wurden bezogen von Bangs Laborstories, Carmel, In.; Amid-Partikel: Partie-Nummer L910108A (SA7-015/758) oder L901015 J (B7- 015FF/181); oder Carboxylat-Partikel: Partie-Nummer L9004108 (SA1-015/787). Bei TC3, TC3X, TC7 und TC7X handelt es sich um ähnliche filmerzeugende Partikel, die von Seradyn, Inc., Indianapolis, IN, bezogen wurden. Bei all den mit TC bezeichneten Präparaten handelte es sich um Carboxylsäure-haltige Styrol-Butadien- Copolymere. Von diesen Präparaten wurden lediglich die TC7-Partikel umfangreich untersucht. Die TC3-Präparate führen zu einem sehr schillernden Film und wurden deshalb nicht für diese Nachweis-Anwendung eingesetzt. Bei den untersuchten Seradyn-Partikeln handelte es sich um TC-7A, Produktnummer CML, Partie- Nummer 1K30; TC-7X Partie-Nummer 1 M92, TC-7 Partie-Nummer 1V18 (F040690), TC-3X Partie-Nummer 1R35 und TC-3 Partie-Nummer 1J44. Die Oberflächenaktivator-Präparate bieten mehr Flexibilität bei den chemischen Immobilisationsverfahren, da sowohl Carboxylat- als auch Amid-Partikel verfügbar sind. Die Amid- Partikel lassen sich leicht zu Hydrazid-Partikeln umwandeln, wie in US-Patentschrift 4.421.896 beschrieben. Bei dieser Untersuchung wurden monokristalline Silicium- Testwafer aus Neumaterial, bezogen von Addison Engineering, Inc., Sunnyvale, CA. Diese Wafer wurden mit einem T-Polymer-Siloxan (Petrarch Systems, Bristol, PA, Katalognummer PS401, Partie-Nummer) durch Auftrag von 300 Mikrolitern einer 1 : 300-(VoINoI)-Verdünnung in 2-Methyl-2-butanol des Vorratssiloxans unter Verwendung eines Düsenbeschichters überzogen, einer Methode, die den Fachleuten des Halbleiterbereichs wohlbekannt ist. Das T-Polymer wurde auf der Oberfläche des Wafers durch Wärmebehandlung bei 120ºC über 120 Minuten hinweg ausgehärtet. Die aktivierten Substrate wurden in eine Lösung eingebracht, enthaltend 20 ug/ml eines Kaninchen-polyklonalen Antikörpers für das Gruppe-A- Streptokokken-Antigen (Medix Biotech, Inc., Foster City, CA, Katalognummer V-872- 01R, Partie-Nummer M-11206), in 0,1 M HEPES-Puffer, pH = 6,0. Die Wafer wurden über 60 Minuten hinweg bei 25ºC in die Antikörper-Lösung eingetaucht, daraus entnommen, mit entionisiertem Wasser gespült und unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Die Dicken- und optische Dichten-Veränderung wird durch Untersuchung eines umgesetzten Wafers mit dem Sagax Comparison Ellipsometer oder einer anderen ellipsometrischen Methode und durch Vergleich mit einer vor der Umsetzung am gleichen Wafer vorgenommenen Messung direkt beobachtet.
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse zusammengefaßt, die mit verschiedenen aufgeschichteten filmerzeugenden Partikeln erhalten wurden. In dieser Tabelle 1 sind die Pufferkonzentration, die Antikörper-Konzentration, die Partikel-Konzentration und die Zugabe irgendeines Blockers, sofern erforderlich, gezeigt. Der zur Beschichtung der filmerzeugenden Partikel verwendete Antikörper war derselbe, der als rezeptives Material auf dem ellipsometrischen Wafer verwendet wurde. Der Antikörper wurde auf die Oberfläche der Partikel durch Inkubieren des Gemischs bei 25ºC über 26 Stunden hinweg aufgebracht. Die TC7-Präparate wurden als Verdünnungen der Vorratslösungen untersucht, vor der Antikörper-Behandlung gegen Wasser dialysiert und vor Umsetzen mit dem Antikörper mit einem Mischbettharz behandelt. Die kovalente Bindung des Antikörpers mit den Carboxylat-Partikeln wurde durch Zugabe einer 1%igen Endkonzentration (Gew/Vol) eines Carbodiimids (1-Cyclohexyl- 3-(2-morpholinoethylcarbodiimid-metho-p-toluolsulfonat; Aldrich Chemical, Co., Milwaukee, WI, Katalognummer C10,640-2, Partie-Nummer 09915PW) untersucht. Das Carbodiimid wurde vor Zugabe des Antikörpers zugegeben. Die mit Hydrazid behandelten Amid-Partikel wurden bei einer Endkonzentration von 0,05% Glutaraldehyd sofort vor Zugabe des Antikörpers behandelt, um die kovalente Bindung des Antikörpers an die Oberfläche der Partikel herbeizuführen. Die Partikel wurden mit Antikörper in einer 0,01 M Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung bei pH = 7,2 beschichtet, wenn nicht anders angegeben.
Ein zur Herstellung der positiven Kontrolle verwendetes Strep-A-Antigen-Präparat wurde von Medix Biotech bezogen. Dieses Antigen wurde in einem Gemisch aus einem Teil 2M NaNO&sub2;, einem Teil 2M Essigsäure und einem Teil 0,66 N NaOH bei einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 600 verdünnt. Dasselbe Präparat abzüglich des Antigens wurde als negative Kontrolle verwendet. Das sekundäre Amplifikationsreagenz wurde in verschiedenen Verhältnissen, wie in Tabelle 1 gezeigt, mit den positiven und negativen Kontrollen gemischt; davon wurden fünf Mikroliter auf die Oberfläche des mit Antikörper-beschichteten Wafers aufgebracht. Die Proben wurden 2 Minuten lang bei 25ºC inkubiert, gespült und dann unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Die umgesetzten Wafer wurden mit dem Sagax Ellipsometer untersucht und die Dicke als Veränderung der in Millivolt gemessenen Intensität aufgezeichnet. TABELLE 1 TABELLE 1 (Forts.)
* Verhältnis von Amplifikator zu Probe.
a Die Endkonzentration des Hydrazids bei diesem Partikel-Präparat betrug 3 M, und der Antikörper wurde auf die Partikel in 50 mM MES, pH = 6,0 und bei 56ºC über 30 Minuten aufgebracht.
Diese Daten zeigen, daß eine extrem hohe Partikeldichte im Amplifikationsreagenz eine nicht-spezifische Verbindung dieses Reagenz mit der Testoberfläche einleitet. Die Zugabe ergänzender Proteine oder oberflächenaktiver Mittel verbessert die Leistung der Antikörper-beschichteten Partikel nicht. Da die TC-7-Partikel etwas härter als die Oberflächenaktivatoren sind, ist ihre Leistung bei dieser speziellen Anwendung nicht so gut, doch zeigen die TC-7-Partikel im Vergleich zu herkömmlicheren Latex-Präparaten eine beträchtliche Reaktivität. Eine erhöhte Temperatur scheint den Grad der Antikörper-Aufnahme in die Partikel zu erhöhen, wodurch die Menge an freiem Antikörper vermindert wird. Zwar wurde freier Antikörper nicht von diesen Partikeln entfernt, doch kann es vorteilhaft sein, nicht-gebundenen Antikörper mittels einer Methode wie etwa der Ultrafiltration zu entfernen. Die mit Hydrazid derivatisierten Amid-Partikel scheinen die beste Gesamtreaktivität zu bieten, obschon auch die Amid-Partikel eine gute Leistung zeigen. Die Oberflächenaktivator- Carboxylat-Partikel erweisen sich als weniger leistungsfähig als die Amid-Partikel.

BEISPIEL 2

Bei dieser Untersuchung wurden die amplifizierenden filmerzeugenden Partikel wie in Beispiel 1 präpariert und der Assay wie oben beschrieben durchgeführt. Bei diesen Experimenten wurde allerdings ein visuell interpretierbares Substrat mit dem Antikörper zum Gruppe-A-Strep-Antigen beschichtet. Beim verwendeten Substrat handelte es sich um einen monokristallinen Silicium-Wafer, der mit Aluminiumoxid- Partikeln von 12-20 Mikrometern, mittlere Partikelgröße 15 Mikrometer, geschliffen wurde, um eine Oberfläche mit rauher Struktur unter Verwendung eines den Fachleuten der Halbleiterindustrie wohlbekannten Verfahrens zu schaffen. Dieses Substrat wurde mit einem Dünnschichtfilm aus Siliciumnitrid mittels einer beliebigen Anzahl verschiedener Ablagerungsmethoden, die den Fachleuten des Bereichs bekannt sind, beschichtet. Die optischen Beschichtungsanforderungen waren, daß ein Film des optischen Materials sehr gleichmäßig bis zu einer viel höheren Grenze aufgetragen werden muß, als herkömmlicherweise für Halbleiter-Verfahren erforderlich. Ein Siliciumnitridfilm von 350 bis 550 Å stellt den Standard für diese Anwendung dar, doch kann jede beliebige Filmdicke verwendet werden. Siliciumnitrid ist nicht das einzige für diese Anwendung geeignete Material. Die T-Polymer- Behandlung des optischen Träger erfolgte wie oben beschrieben. Diese Ergebnisse stützen die beim ellipsometrischen System gemachten Beobachtungen. Eine sehr hohe Partikeldichte schafft eine reine Negativ-Kontrolle, doch erzeugt kein starkes visuelles Signal. Eine höherer Grad der Antikörper-Aufnahme ergibt ein stärkeres Signal als eine geringere Antikörpermenge. Diese Untersuchung läßt annehmen, daß eine unzureichende Antikörper-Abdeckung der Partikel auch eine nicht- spezifische Bindung der Partikel mit der Testoberfläche zuläßt. Eine Verdünnung der positiven Kontrolle von 1 : 64 schafft eine eindeutige Trennung von der negativen Kontrolle. TABELLE 2
* Verhältnis von Amplifikator zu Probe.
a Die Hydrazied-Endkonzentration beträgt 3 M, und der Antikörper wurde den Partikel in 50 mM MES, pH = 6,0 und bei 56ºC über 30 Minuten zugegeben. Ein 2,5 M MOPS wurde als das Neutralisationsmittel bei diesen Experimenten zum Erhalt eines pH-Endwerts von 8,0 verwendet.

BEISPIEL 3

Bei dieser Untersuchung waren die ellipsometrischen Oberflächen wie in Beispiel 1 beschrieben. Das untersuchte System war zum Nachweis des Thrombin/Anti- Trhombin-III-(AT-III)-Komplex in menschlichen Plasmen ausgelegt. Es wurden ein polyklonaler Anti-Thrombin und ein polyklonaler Anti-ATIII (Dako Corporation, Santa Barbara, CA) zur Herstellung der Testoberflächen bzw. als Amplifikationsreagenz verwendet. Die ellipsometrische T-Polymer-Oberfläche wurde mit 20 ug/ml des Anti- Thrombin-Antikörpers in einem 0,1 M Na&sub2;HPO&sub4;-Puffer bei pH = 3,0 beschichtet.

Herstellung des Sekundär- oder Amplifikationsreagenz

Dieses Sekundär-Antikörper-Reagenz wurde unter Verwendung einer Modifikation des in Beispielen 1 und 2 beschriebenen Bindungsprotokolls für die mit Hydrazid derivatisierten Oberflächenaktivatoren hergestellt, was die Inkubation der Partikel bei einer Enddichte in Wasser von 0,8% Partikel mit 70 ug/ml Anti-AT-III-Antikörper erfordert.

Assay-Ablaufprotokoll

Die Standards wurden durch Wiederherstellung des gereinigten Thrombin-Anti- Thrombin-III-Komplexes in normalem humanen Plasma und anschließender Verdünnung mit diesem Plasma in vierfachen Verdünnungen zum Erhalt der Standards für den untersuchten Bereich hergestellt. Diese Standards wurden dann 1 : 10 mit normaler Kochsalzlösung verdünnt. Diese Lösungen wurden 1 : 1 mit dem Sekundärreagenz gemischt, wovon 10 Mikroliter auf die Anti-Thrombin-beschichtete Oberfläche aufgebracht wurden. Die Flecken wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (25ºC) inkubiert, dann mit entionisiertem Wasser gespült und unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Diese umgesetzten Träger wurden mit einer Modifikation des Sagax Comparison Ellipsometers ausgewertet, der die Erfassung der Daten mit einem Compaq 386-Computer ermöglichte. Die Probenwerten wurden aus den Standardkurven in Tabelle 3 extrapoliert. TABELLE 3 TAT-Plasma-Standardkurve
* Beim normalen Plasma wurde ein Wert von 3,3 ng/ml, bezogen auf einen handelsüblichen ELISA-Kit, nachgewiesen. Diese TAT-Restkonzentration wurde zu den Standardmengen addiert, um exakte Standardkonzentrationen zu erhalten.
Zum Vergleich mit dem bevorzugten Amplifikationsreagenz wurde eine Verdünnung von 70 ug/ml des Anti-ATIII-Antikörpers in einem handelsüblichen konjugierten Verdünnungsmittel hergestellt und mit den oben beschriebenen Plasmakontrollen untersucht. Der verdünnte Antikörper wurde mit der Probe 1 : 1 gemischt, wie zuvor beschrieben. Die Assay-Bedingungen und -Verfahrensweisen waren konstant. Die Plasmen wurden ohne Verdünnung verwendet. TABELLE 4
Durch Verwenden des Sekundär-Antikörpers bei derselben Konzentration wie im Amplifikationsreagenz aufgenommen wurde eine sehr geringe Trennung oder Dynamikbereich erzielt. Die Leistung des Amplifikationsreagenz erzielt eine gleichmäßigere Trennung der Standards. Für jede Konzentration wurde eine Sättigung über die in Tabelle 4 angegebene Endkonzentration hinaus erreicht.
Verdünnungen von 24 ug/ml und 48 ug/ml einer Anti-ATIII-Antikörper-konjugierten Meerrettich-Peroxidase (HRP) wurden in konjugiertem Verdünnungsmittel vorgenommen. Die Plasma-Standards wurden mit den verdünnten Konjugat- Präparaten 1 : 1 gemischt und das oben beschriebene Assay-Protokoll angewandt. Tabelle 5 zeigt die repräsentative Assay-Leistung für das 24 ug/ml-Konjugat bzw. Tabelle 6 für das 48 ug/ml-Konjugat. Es wird zwar eine leicht verbesserte Trennung mit den Konjugat-Präparaten erzielt, doch wird der Dynamikbereich nicht erreicht und die Sättigung des Systems erfolgt bei höheren als den in den Tabellen angegebenen Konzentrationen. TABELLE 5 TABELLE 6

BEISPIEL 4

Sekundärreagentien wurden durch Koppeln von entweder Weinbergschnecken- Hämocyanin (KLH) oder Ferritin an einen polyklonalen Anti-Strep-A-Antikörper präpariert. Die Verfahren zur Konjugation eines Antikörpers an KLH oder Ferritin oder eines anderen Proteins sind den Fachleuten des Bereichs bekannt. KLH erhöht das Signal aufgrund seiner großen Größe (MG = 1.000.000 Dalton). Bei Ferritin handelt es sich um ein großes Molekül, doch weist es einen relativ hohen Brechungsindex aufgrund der 10 Eisenmoleküle auf, die jedes Ferritin-Molekül enthalten kann. Ein Partikel mit hohem Brechungsindex könnte das in Beispiel 2 beschriebene visuelle Nachweissystem stark beeinflussen. Anti-Strep-A-Antikörper wurde auf die Interferenzträger wie in Beispiel 2 beschrieben aufgeschichtet. Das in Beispiel 2 beschriebene Assay-Protokoll wurde befolgt, doch wurden beim Extraktions-Protokoll 2,5 M Trizma als Neutralisationsmittel verwendet, wobei das Antigen-Präparat aus einer unterschiedlichen Handelsquelle stammte. Die Probe wurde 1 : 1 mit Sekundärreagenz gemischt. Die bei allen getesteten Verhältnissen von Probe zu getestetem Sekundärreagenz erzeugten visuellen Signale waren extrem schwach und schwer interpretierbar. Das restliche Hintergrundsignal machte es unmöglich, die Interpretation einer Verdünnung der reinen positiven Kontrolle von der negativen Kontrolle zu trennen. TABELLE 7

BEISPIEL 5

Die wie in Beispiel 2 mit Hydrazid behandelten Oberflächenaktivator-Amidpartikel wurden mit einem Farbstoff behandelt, der den Partikeln eine blaue Farbe verlieh.
Überschüssiger Farbstoff wurde von den Partikeln durch Dialyse entfernt. Das schließlich erhaltene 0,8%ige Feststoff-Präparat wurde mit dem Medix-Anti-Strep-A- Antikörper über 30 Minuten hinweg bei 56ºC bei einer Antikörper-Endkonzentration von 75,0 ug/ml umgesetzt. Die bei dieser Untersuchung verwendeten Standards waren wie in Beispiel 4 beschrieben. Das bei dieser Untersuchung beschriebene Neutralisationsmittel bestand in 2,5 M MOPS zur Erreichung eines pH-Endwerts von 8,0. Der visuelle Eindruck der reinen positiven Standards ist dem mit dem Ausgangs- Oberflächenaktivator-Hydrazidpartikel erhaltenen vergleichbar. Ein geringer Grad an nicht-spezifischer Bindung wurde mit dem angefärbten SA/Hydrazid-Partikel beobachtet.
Es wurden verschiedene Ausführungsformen und Modifikationen der Erfindung beschrieben, doch wird ersichtlich sein, daß die Erfindung nicht darauf beschränkt ist, sondern alle Hilfsmittel und Variationen umfaßt, die in den Rahmen der Ansprüche fallen.

Claims

1. Verfahren zum Nachweisen eines Analyts von Interesse, umfassend die folgenden Schritte: Bereitstellen einer Nachweisvorrichtung, enthaltend ein optisches Substrat, das eine oder mehrere Schichten trägt, zu denen eine Haftschicht zählt, an die ein rezeptives Material angeheftet ist, welches spezifisch mit diesem Analyt von Interesse wechselwirkt,

wobei die Haftschicht zwischen dem rezeptiven Material und dem Substrat liegt,

Umsetzen dieser Vorrichtung mit einer Probe, die dieses Analyt potentiell enthält, unter Bedingungen, bei denen dieses Analyt an das rezeptive Material bindet, und

Umsetzen des gebundenen Analyts mit einem Reagenz, umfassend einen filmerzeugenden Styrol-Butadien-Copolymerlatex, welche Reaktion eine Veränderung bei der Dicke oder optischen Dichte auf der Oberfläche der Vorrichtung bewirkt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Umsetzen dieses gebundenen Analyts mit diesem Reagenz eine Dickenveränderung auf der Oberfläche der Vorrichtung bewirkt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Umsetzen dieses gebundenen Analyts mit diesem Reagenz eine Veränderung der optischen Dichte auf der Oberfläche der Vorrichtung bewirkt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung ein Substrat aus planarem reflektivem Material umfaßt, das eine anhaftende Schicht aus immunologisch aktivem Material trägt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat und die anhaftende Schicht die Strahlung nach Reflexion ellipsometrisch polarisieren.

6. . Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat und die anhaftende Schicht ein Signal erzeugen, welches durch vergleichende Ellipsometrie analysiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat und die anhaftende Schicht ein Signal erzeugen und dieses Signal durch ein Instrument analysiert wird, das gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Profiltastschnittgeräten, Reflexionsmessern, Raster-Tunnelmikroskopen, Atomkraftmikroskopen oder Interferometern.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei dieser Latex an ein zweites rezeptives Material, das für das Analyt von Interesse spezifisch ist, kovalent gebunden wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei dieser Latex an ein zweites rezeptives Material, das für das Analyt von Interesse spezifisch ist, passiv gebunden wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei dieses Analyt von Interesse zwischen ein rezeptives Material und eine zweite reaktive Spezies eingebracht wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei dieses rezeptive Material einen spezifischen Bindungspartner für dieses Analyt umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei dieses rezeptive Material aus der Gruppe gebildet wird, bestehend aus Antikörpern, Oligonukleotiden, Enzymen, Enzymsubstraten, Enzyminhibitoren, Bakterien, Nukleinsäuren, Viren, Hormonen und Rezeptoren für diese Materialien.

13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Analyt von Interesse ein Gruppe-A- Streptokokken-Antigen ist.

14. Analysensatz für einen optischen Assay für ein Analyt von Interesse, umfassend:

eine Nachweisvorrichtung, enthaltend ein optisches Substrat, das eine oder mehrere Schichten trägt, zu denen eine Haftschicht zählt, an die ein rezeptives Material angeheftet ist, welches spezifisch mit diesem Analyt wechselwirkt, und

ein Reagenz, umfassend einen filmerzeugenden Styrol-Butadien- Copolymerlatex, welches geeignet ist zum Reagieren mit diesem an dieses Substrat gebundenen Analyt, um die Dicke oder optische Dichte auf der Oberfläche zu verändern.