DE69122252T2 - Apparat zum nachweis eines immobilisierten analyten - Google Patents

Apparat zum nachweis eines immobilisierten analyten

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Description

    Apparat zum Nachweis eines immobilisierten Analyten Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betriffi das Fachgebiet von Biochemie und Chemie mit Anwendungen in derartigen Gebieten wie dem Immunoassay, der Nucleinsäure-Sequenzanalyse, der klinischen Chemie, dem Enzymassay und der Untersuchung von Ligand/Antiligand-Bindungspaaren, wie Kombinationen aus Toxin-Rezeptor oder Hormon-Rezeptor, usw. Diese Erfindung verwendet einen neuen Festphasenassay auf Grundlage von optischer Interferenz, ein direktes physikalisches Nachweisverfahren. In diesem Festphasenassay wird das rezeptive bzw aufhahmefähige Material auf einer beschichteten Trägeroberfläche immobilisiert. Das immobilisierte rezeptive Material wird einer Flüssigkeit ausgesetzt, weiche den Analyten enthalten kann, der ein Molekül von Interesse ist, welches fähig ist, an das rezeptive Material zu binden oder damit zu reagieren. Der Analyt kann ein beliebiges Material sein, lür welches ein spezifischer reaktiver Partner vertügbar ist, entweder organisch oder anorganisch. Im allgemeinen können die Rollen des rezeptiven Materials und des Analyten in dem Assay umgekehrt werden.
    • Stand der Technik
  • Auf dem Fachgebiet existieren Assays zur Uberwachung von Rettttionen zwischen homologen Paaren, wie der Antigen-Antikörper-Bindung, Hormon-Rezeptor-Bindung, Enzyrnassays und der Nucleinsäure-Hybridisierung. Der kritische Teil des Assay-Entwurfs in jedem Falle liegt in der Entscheidurig, wie das Signal erzeugt werden wird. Gefärbte Realttionsprodukte, biologische Aktivität auf der zellulären Ebene und radioaktive, fluoreszente oder lumineszente Markierungen, die an eine der reagiernden Spezies kovalent gebunden sind, sind alle verwendet worden. Zwei vertraute Beispiele auf dem Gebiet des Immunoassays sind der Enzme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und der Radioimrnunoassay (RIA). In diesen Verfahren weist der Experimentator nicht tatsächlich die Bindung der zwei Moleküle nach, sondern eine mit der Bindungsreaktion in Beziehung stehende sekundäre Aktivität. Viele dieser Techniken erfordern spezielle Schritte zur Signalerzeugung, was zu zusätzlichen Laborkosten führt und häufig die Verwendung gefährlicher Materialien und kostspieliger Instrumente erfordert.
  • Ein vorteilhafterer Weg zum Nachweis der Bindung oder Reaktion zwischen zwei Spezies von biologischen Molekülen besteht darin, eine Veränderung in einer physikalischen Eigenschaft nachzuweisen, welche ein direktes Ergebnis der Bindung oder Reaktion ist. Wenn zum Beispiel der Ligand als eine auf einem Substrat immobilisierte dünne Schicht vorhanden ist, dann wäre ein beliebiges Verfahren, das eine Veränderung in der Dicke oder optischen Masse der biologischen dünnen Schicht nach der Bindung oder der Reaktion des Analyten mit dem Liganden messen kann, ein Weg für einen direkten physikalischen Nachweis. Diese Erfindung stellt ein derartiges Verfahren zur Vertügung, welches auf den Grundlagen der optischen Interferenz in dünnen Schichten beruht.
  • Optische Nachweistechniken haben in der Biochemie seit der Mitte dieses Jahrhunderts existiert, insbesondere auf dem Gebiet des Immunoassays. Alle diese Techniken verwenden: Einen festen Träger oder ein Substrat; intermediäre Schichten, die zur Erzeugung des Signals nötig sein können; eine dünne Schicht (gewöhnlich monomolekular) eines biologisch aktiven Moleküls, des Liganden; und eine optische Komponente, die eine Strahlungsqueile, ein Mittel zur Einstellung des Einfallswinkels, falls notwendig, und eine Nachweisvorrichtung umfaßt. Die verschiedenen optischen Assays messen verschiedene Eigenschaften des Lichts, verwenden verschiedene Substrate und weisen einen variierenden Verwendb&keitsgrad in verschiedenen Umgebungen auf (Forschungslabor im Gegensatz zum Arztpraxis-Labor im Gegensatz zum Heim- oder Feld-Gebrauch).
  • Der erste Festphasen-Immunoassay, welcher einen direkten optischen Nachweis einsetzte, beruhte auf der Langmuir-Blodgett-Technik. Diese Technik stellt einen Weg zur Herstellung von Monoschichten amphipathischer Moleküle auf der Oberfläche von Wasser zur Vertügung, wobei diese Schichten danach auf ein Glas- oder Metallsubstrat übertührt werden. Mehrfachschichtfilme von Fettsäuren können auf dem Substrat durch mehrere Durchführungen des Substrats durch die Monoschicht aufgebaut werden. Diese Monoschichten konnten danach als Träger für die Adhäsion von Protein-Monoschichten verwendet werden (K. B. Blodgett, JACS 56 495, 1934). In dem veröffentlichten Immunoassay (I. Langinuir und J. J. Schaefer, JACS, 59, 2400, 1937) wurde eine Bariumstearatschicht von etwa fünfrig Monoschichten auf einem verchromten Objektträger hergestellt. Die Bariumstearatschicht wurde dann mit einer Schicht von Diphtherietoxin überzogen, welche 3,6 nm zu der Dicke der Schicht hinztügte. Der mit dem Liganden beschichtete Objektträger wurde dann in eine Lösung, die Anti-Toxin- Antikörper enthielt, eingetaucht. Nach einer Inkubation mit den Antikörpern nahm die Dicke der Schicht um weitere 7,5 nm zu. In diesem Experiment wurden die Dickenveränderungen durch Beleuchtung des Objektträgers mit s-poiarisiertem Licht bei großen Einfallswinkeln und Bestimmung des Mimums des Reflexionsvermögens gemessen. Dieses Nachweissystem ist empfindlich genug, um so kleine Dickenanderungen wie 1 Ångström zu messen. Eine Modifikation dieser Technik ist von Kawaguchi, U.S.-Patent 4 820 649, erörtert worden, worin eine Metallsubstrat mit Lipiden überzogen wurde, um einen spiegelnden Interferenzeffekt hervorzurufen. Das resultierende Produkt ist jedoch sehr schwierig auszuwerten, da die Betrachtung in hohem Maße vom Winkel abhängig ist. Die Erzeugung der spiegelnden Interferenzfarbe ist sehr schwach.
  • Obwohl sehr empfindliche Tests möglich sind, sind Assays auf Grundlage der Langmuir- Blodgett-Technik in der Biochemie wegen mehrerer ernster Einschränkungen nicht länger von praktischer Bedeutung. Die Technik ist sehr schwierig und zeitaufwendig und erfordert Reagenzien, insbesondere Wasser, von sehr hoher Reinheit. Es ist auch sehr schwierig, mit Lipid beschichtete Substrate herzustellen. Jegliche Störung des Wassers führt zu Defekten in den hergestellten Lipid-Monoschichten.
  • Das Prinzip der optischen Interferenz durch die Überlagerung von Lichtwellen mit variierenden Phasen-Beziehungen und Amplituden ist verwendet worden, um biologische Reaktionen zu überwachen. Die ersten optischen Assays, die Interferenzfarben als eine Nachweismethode einsetzten, verwendeten Metallsubstrate oder metallisierte Substrate, wobei das Ligandenmolekül einfach an die Oberfläche absorbiert war. Zum Beispiel verwendeten A. L. Adams, et al., 3. Immunol. Methods, 3, 227, 1973, anodisiertes Tantal mit einer Tantaloxidschicht. Giaever (1974), U.S.-Pat. 4 054 646 verwendete auf Glasobjektträger aulbeschichtetes lndium. Diese Substrate weisen zahlreiche Nachteile auf Insbesondere lassen sich Giaver's Oberflächen schwierig reproduzierbar herstellen. Die Metalloberflächen sind auch vom Standpunkt der Chemie her nachteilhaft. Metallionen können aus der Oberfläche ausbluten und die Chemie der Bindung zwischen dem Liganden und dem Analyten stören. Darüber hinaus sind die Oberflächen derartiger Substrate für organische, kovalente Verknüpfüngen nicht so vielseitig wie eine Silica- oder Glasoberfläche. Giaver's Technik beruht teilweise auf der Erzeugung emes Interferenzeffektes durch einen Brechungs-Streuungs-Effekt und teilweise auf den Absorptionseigenschaften des Metalls.
  • Zwei neuere Erfindungen verwenden Effekte des Reflexionsvermögens oder der optischen Interferenz, um durch Analytenbindung verursachte Veränderungen in dünnen Schichten nachzuweisen. Ein Verfahren verfolgt einen Veränderung der Dicke und das andere mißt die Veränderungen der Polarisierbarkeit von immobilisierten dünnen Schichten. H. Arwin und I. Lundstrom, Anal. Biochem., 145, 106, 1985, verwenden ein Verfahren, welches an die ursprüngliche Arbeit von Langmuir, Blodgett und Schaefer erinnert. Sie verwendeten ein Siliciunssubstrat mit einer thermisch gewachsenen 10 nm dicken Siliciumdioxidschicht. Die Oberfläche wurde durch Einsatz von Dichlordimethylsilan hydrophob gemacht und in dem veröffentlichten Beispiel wurde humanes Serumalbumin auf die hydrophobe Oberfläche adsorbiert, vermutlich als Monoschicht. Die Erfindung nutzt die Remissionseigenschaften bzw. Eigenschaften des Reflexionsvermögens von p-polarisiertem und s-polarisiertem Licht aus. Am Brewster-Winkel, weicher durch die Brechungsindizes an der Grenze zwischen zwei Medien bestimmt wird, wird kein p-polarisiertes Licht reflektiert. Wenn das Substrat ein absorbierendes Material und das Medium transparent ist, wie in diesem Fall, wird das Minimum des Reflexionsvermögens zum sogenannten Pseudo-Brewster-Winkel verschoben. Bei diesem Einfaliswinkel hat p-polarisiertes Licht ein meßbares, aber minimales Reflexions vermögen. Wenn die Dicke der dielektrischen Schicht zunimmt, zum Beispiel aufgrund von Äntikörperbindung in einer immunologischen Reaktion, tritt eine Zunahme des Reflexionsvermögens bei dem Pseudo-Brewster-Winkel auf Das Verfahren ist vom Konzept her einfach, aber erfordert in der Praxis äußerst präzise Instrumente. Zuerst muß ein Polarisator verwendet werden, um die Polarisationskomponente des Lichts zu erhalten und zu isolieren. Für die Verwendung mit einem Siliciumsubstrat muß das einfallende Licht ferner mit einem Filter verarbeitet werden, um rote Wellenlängen zu eliminieren. Andere Substrate können monochromatisches oder nahezu monochromatisches Licht erfordern. Somit ist das Instrument nicht so flexibel oder anpassbar wie andere optische Nachweisinstrumente. Es werden zwei Photodioden benötigt: eine zur Messung der reflektierten Intensität und eine zur Messung der Intensität des einfallenden Lichts. Eine elektronische Verarbeitungseinheit, die einen Verstärker und eine Anzeige enthält, wird ebenfalls benötigt. Am wichtigsten ist, daß der Einfallswinkel sehr genau gemessen werden muß, weshalb alle Bestandsteile und die Probe in einem prazisionsverarbeiteten Gehäuse eingebaut werden müssen. Dieser veröffentlichte Bericht konzentrierte sich spezifisch auf ein Immunoassay-Format.
  • Ein anderes verwandtes Verfahren wird von Nicoli et al., in dem U.S.-Patent 4 647 544 beschrieben. Dieses Patent offenbart ein Verfahren für einen Immunoassay unter Verwendung des Prinzips optischer Interferenz. Der in dieser Erfindung verwendete Interferenzeffekt ist viel mehr eine Veränderung der Lichtintensität an verschiedenen Raumpunkten als eine Veränderung der Interferenzfarbe, und jene ist nicht zur Erzeugung eines visuell interpretierbaren Signals in der Lage. Dieses Verfahren detektiert insbesondere die konstruktive Lichtinterferenz bei Bragg'schen Streuungswinkeln unter Verwendung eines Beugungsgitters zur Erzeugung der Streuung. Ein wesentlicher Teil dieser Erfindung ist die Herstellung der Oberfläche. Der Ligand (z.B. Antikörper) wird in Form einer regelmäßigen Anordnung auf das Substrat aufgebracht. Als Alternative wird der Ligand in einer gleichmäßigen Weise aufgebracht und danach in dem präzisen Muster inaktiviert, das zur Erzeugung eines Beugungsgitters erforderlich ist. Die bevorzugte Auslührungsform besteht darin, den Liganden in Streifen der Breite w und in einem Abstand von Mitte zu Mitte d aufrubringen, wobei d größer ist als w. Sowohl d als auch w sind von miktoskopischen Abmessungen. Die regelmäßige Anordnung wirkt als ein Beugungsgitter, und eine maximale Streuung tritt bei Winkeln θs auf, wobei gilt: d sin θs m λs (m = 1, 2, 3, ...). Die in diesem Schema gemessene bedeutende physikalische Eigenschaft ist eine Veränderung der Polarisierbarkeit im Verhältnis zu dem Medium. Wenn ein Antigen an den immobilisierten Antikörper bindet, besteht eine Zunahme der polarisierbaren Masse bei regelmäßigen Intervallen in der Anordnung, und die Intersität des Lichts bei den Winkeln θs steigt ebenfalls an. Da dieses Nachweisverfahren einen Effekt zweiter Ordnung beobachtet, besteht eine Verminderung in der Empfindlichkeit des Assays im Verhältnis zu anderen Interferenzphänomenen. Die Herstellung von Anordnungen des Liganden bei den für diese Technik erforderten zulässigen Abweichungen steigert in großem Maße die Herstellungskosten und die Ausschußrate von anfanglichen Testoberflächen.
  • In einer anderen Ausführungsform beschichten Nicoli et al. ein tatsächliches Beugungsgitter mit dem Liganden und weisen die Bragg'sche Streuung nach. In beiden Ausführungsformen können die Peaks des gestreuten Lichtes entweder in dem reflektierten oder in dem durchgelassenen Licht in Abhängigkeit von der Natur des Substrats nachgewiesen werden.
  • Wie in dem Verfahren von Arwin und Lundstrom sind spezielle Lichtquellen und optische Ausrüstung notwendig, um die Interferenzeffekte nachzuweisen. Da lediglich Intensitätsveränderungen auf Grund optischer Interferenz nachgewiesen werden, muß eine monochromatische Lichtquelle verwendet werden. In dem offenbarten Beispiel diente ein Heine- Laser als die Lichtquelle. Die Detektion beim Streuwinkel wird mit einer Vorrichtung, wie einem Photomultiplier-Rohr oder einer Festkörper-Photodiode, erreicht. Da das Signal gestreut wird, ist eine große Zahl von Nachweiswinkeln möglich, aber die Empfindlichkeit leidet, da keine Einzelmessung hinreichend ist.
  • Die am nächsten zu der vorliegenden Erfindung verwandte Technologie wurde zuerst von Nygren et al. (1985) in dem U.S.-Patent 4 558 012 offenbart. Dieses Patent deckt ein Verfahren und eine Vorrichtung für optische Interferenzassays ab, welche die direkte Detektion von Ergebnissen unter Verwendung eines Nichtmetall-Substrats und einer dielektrischen Schicht ermöglichen. Die dielektrische Schicht besteht aus einer Schicht Siliciumnitrid oder Siliciumoxid, wobei eine Oberschicht aus SiO&sub2; (1,46) derjenigen für die meisten organischen Moleküle (n = 1,5) sehr nahe kommt, so daß die zwei Substanzen für optische Zwecke als eine einzelne Schicht wirken können. Die Dicken werden so gewählt, daß die gesamte dielektrische Schicht als eine einzelschichtige Anti-Reflexionsbeschichtung wirken kann, welche für eine in dem einfallenden polychromatischen Licht vorhandene Wellenlänge optimiert ist, was dem nicht-reagierten Objektträger eine charakteristische Interferenzfarbe verleiht. Wenn der Analyt mit dem Liganden bindet, verändert sich die optische Weglänge, was ein neues Welleniängenminimum in dem reflektierten Licht und eine neue sichtbare Interferenzfarbe ergibt. Die Verwendung einer polychromatischen Lichtquelle bedeutet, daß eher eine Interferenzfarbe in dem reflektierten Licht gesehen wird als Interferenzringe oder eine Intensitätsveränderung. Diese Technik hängt in starkem Maße von den Spiegelreflexionseigenschaften des Substrats ab.
  • Eine ähnliche Technologie ist in folgenden Teijin-Patentanmeldungen beschrieben: Japanische Patentanmeldung SHO 61-222057 und SHO 61-222058; und die Teijin-Europäische Patentanmeldung 87113842.6 zeigt ein Verfahren zur Steigerung des sichtbaren Interferenzsignals.
  • Die meisten Festphasensysteme verwenden Trägeroberflächen, welche makroskopisch planar und gleichinäßig erscheinen. Bei miktoskopischer Untersuchung jedoch sind diese Oberflächen in hohem Maße gefaltet und unregelmäßig. Im allgemeinen sind die Merkmale der Oberflächen für die Erzeugung des Assaysignals nicht kritisch. Die Oberflächenmerkmale können die Dichte des Liganden in dem Assay beeinflussen. Die obenstehend beschriebenen optischen Nachweissysteme beruhen auf gemusterten, angeordneten oder gitterartigen Substraten zur Erzeugung von Streuung oder eines Signals. Diese optischen Systeme verwenden ebenfalls gemusterte oder geordnete Ligandenbeschichtungen, um das Signal zu beeinflussen.
  • Verfahren zur physikalischen Aufrauhung oder Ätzung der Oberfläche eines Siliciumsubstrats sind in der Elektro- oder Halbleiterindustrie bekannt. Glas- und Silica-Oberflächen können mit Modifikationen dieser Techniken geätzt werden. Das anisotrope bzw. richtungsabhängige Ätzen von Silicium, Galliumarsenid und Germanium stellt Wege zur Einführung von Struktur oder Textur auf die Substratoberfläche zur Verfügung. Kaliumhydroxid oder Natriumhydroxid werden in Ätzverfahren gewöhnlich verwendet. Die Ätz-Rate und -Tiefe kann durch Variiren der Konzentration der alkalischen Lösung und Verwenden ausgewählter Zusatzstoffe gesteuert werden.
  • Zum Beispiel beschreiben I. Stoev und L. Petkanov, Bulg. J. Phys., 9(3), 277, 1982, die Verwendung von n-Propanol und Hydrazin in KOH-Lösungen, um die Ätz-Rate zu senken und Fehler bei der Herstellung von VMOS-Strukturen zu verringern. Erdman et al. (Deutsche Offenlegungsschrift 2 245 809) beschreiben die Verwendung von H&sub2;O&sub2;, K&sub2;CrO&sub4;, K&sub2;CrO&sub4; und Tetrahydrofufurylalkohol als Zusatzstoffe in alkalischen Ätzlösungen. Ein anderes von Petkanov für die Herstellung von VMOS-Strukturen beschriebenes Ätzsystem ist eine Kombination von Ethylendiamin-Pyrocatechol-Wasser. Auch Trockenätzverfahren sind verfügbar. Das japanische Patent JP 81144 541 lehrt die Verwendung eines C&sub2;F&sub5;Cl und CF&sub2; enthaltenden ätzenden Gases, das in einer Plasma-Umgebung erzeugt wird. J. A. Barkanic et al., EP 246514A2, 1987, verwenden Mischungen von NF&sub3; in CF&sub3;Cl, CF&sub2;Cl und CF&sub3;Br in einem Plasmagenerator. In dieser Plasma-Umgebung können Muster durch Maskierung diskreter Abschnitte der Oberfläche mit SiO&sub2;, das gegenüber den ätzenden Gasen nicht anfällig ist, erzeugt werden.
  • Es ist ein Ziel dieser Erfindung, einen Assay zur Verfligung zu stellen, welcher ein optisches Nachweisverfahren, und genauer gesagt die Erzeugung von Interferenzfarben, verwendet, um die Bindung und/oder Reaktion zwischen zwei Molekülspezies - dem Liganden und dem Analyten - zu überwachen.
  • Es ist noch ein anderes Ziel dieser Erfindung, einen einfachen und preisgünstigen Assay zur Verfügung zu stellen, der zu Hause und im Labor verwendet werden kann, welcher fähig zur selektiven Anheftung eines Analyten von Interesse und zur Erzeugung eines entsprechenden Bindungssignals ist, welcher auf einem instrumentellen Nachweis beruht, der eine wahlfreie sichtbare Signalerzeugung vornimmt.
  • Noch ein weiteres Ziel dieser Erfindung schließt eine Verbesserung in optischen Interferenzassays ein, wobei eine Assayvorrichtung mit einer unregelmäßigen Oberfläche verwendet wird, welche eine diffuse Reflexion erzeugt. Wie hier nachstehend ersichdich wird, sind die Oberflächen-Fehlerstellen oder -Unregelmäßigkeiten nicht wie in einem Beugungsgitter regelmäßig angeordnet, und die zufälligen Variationen in der Höhe können in dem Bereich von eitügen hundert Nanometer bis etwa 100 Mikrometer liegen.
  • Die vorliegende Entdeckung zieht Nutzen aus der Tatsache, daß die unregelmäßige Oberfläche drei Funktionen ausübt. Die erste von diesen besteht darin, die für eine Beschichtung mit dem rezeptiven Material zur Verfligung stehende Oberfläche zu vergrößern, was zu einer einhergehenden Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit und/oder Empfindlichkeit des Assays führt. Die zweite Funktion besteht darin, daß die Interferenzfarben in der diffusen anstatt der spiegelnden Reflexion gesehen werden. Dies bedeutet, daß wenn, im Gegensatz zu einer diffusen Reflexion, Interferenzfarben gegen eine spiegelnd reflektierende Oberfläche gesehen werden, auch Bilder von entfernten Objekten in dem reflektierten Licht sichtbar sind. Diese Bilder können den Betrachter verwirren oder sogar Farbflecken überdecken, insbesondere wenn die Farbe schwach ist und der Assay nahe der Nachweisgrenze vorgenommen wird. Der dritte fünktionelle Vorteil besteht darin, daß eine diffuse Reflexion eine sichtbare Farbveränderung über einen breiten Bereich von Winkeln des einfallenden Lichts erlaubt. Spiegelreflexionen hingegen sind vom Winkel des einfallenden Lichts abhängig. Wenn der Artikel bezüglich der Lichtquelle unkorrekt angeordnet ist, wird die Farbveränderung undeutlich.
  • Die Vorrichtung, welche die vorliegende Erfindung auslührt, stellt ebenfalls eine wandlungsfähige Assaytechnologie zur Verfligung. Diese Erfindung kann aus einer breiten Vielzahl von Substraten, anti-reflektierenden (AR) Materialien und rezeptiven Materialien angefertigt werden. Die geeignete Auswahl von Materialbestandteilen ermöglicht es, daß der Test in ein Format gebracht wird, um ein für einen breiten Bereich von Testanforderungen angemessenes Signal zu erzeugen. Wahrend die meisten Assays für den Hausgebrauch lediglich ein qualitatives Ergebnis (positive gegenüber negativen Resultaten) erfordern, fordert der Einsatz in einer Arztpraxis häufig ein quantitativeres Ergebnis, um eine therapeutische Wirksamkeit zu erkennen oder zu überwachen; die verschiedenen Ausfli.hrungsformen dieser Erfindung ermöglichen für diesen Ausfli.hrungstyp eine jenseits eines Immunoassays liegende Vielseitigkeit überhalb, wobei DNA-DNA, DNA-MRNA, DNA-RNA, RNA-RNA, Enzym-Substrat, Enzym- Inhibitoren und dergleichen eingeschlossen sind.
  • Healy et al., U.S.-Patent Nr.4090849, beschreibt ein Assaysystem, worin ein Metallsubstrat auf der Oberfläche aufgerauht wird, chemisch geätzt wird, und die geätzte Oberfläche anodisiert wird, um eine stumpfe Oxidoberfläche herzustellen. Metallsubstrate besitzten den Nachteil, die Reflexion von Licht durch dessen Absorption zu behindern. Die vorliegende Erfindung beruht auf anti-reflektiven Eigenschaften, die Veränderungen der dielektrischen Schicht beinhalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung zum Nachweis der Gegenwart eines Analyten von Interesse zur Verfligung, welche umfaßt:
  • Ein Substrat, das eine Schicht eines Analyten-rezeptiven Materials trägt oder in Anheftung daran aufweist, welches in Kombination mit einem anti-reflektierenden Überzug eine optisch aktive Obertläche bildet, welche eine erste Interferenzfarbe in Antwort auf darauf auftreffendes Licht autzeigt, und eine zweite Interferenzfarbe, welche eine Kombination von Lichtwellenlängen umfaßt, die von der ersten Interferemfarbe verschieden sind, oder eine Intensität mindestens emer der Lichtwellenlängen umfaßt, die von der ersten Interferenzfarbe verschieden ist, in Antwort auf das Licht zeigt, wenn der Analyt auf der optisch aktiven Oberfläche vorhanden ist;
  • worin das Substrat eine nicht-spiegelnde Oberfläche besitzt, oder worin eine transparente Schicht mit einer nicht-spiegelnden Oberfläche zur Betrachtung der optisch aktiven Oberfläche vorgesehen ist.
  • Die vorliegende Erfindung schließt neue Zusammensetzungen und neue Artikel für die direkte selektive Absorption, Adsorption, kovalente Bindung oder Anheftung eines Analyten, weicher für das an die Oberfläche der Vorrichtung gebundene rezeptive Material spezifisch ist, durch einen beliebigen Mechanismus zum Zwecke der Identifikation oder Ouantifizierung des Analyten ein. Die vorliegende Erfindung stellt in ihrem weitesten Sinn ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten ohne Verwendung von Markierungen, wie radioaktivem Enzym, fluoreszenten oder lumineszenten Konjugaten und dergleichen, zur Verfügung, d.h. unter Verwendung nicht-markierter Nachweismaterialien. Dieses Verfahren zum Aufbau der Nachweisvorrichtung umfaßt die Schritte des Auftragens einer oder mehrerer anti-reflektierenden (AR) Beschichtungen auf ein Substratmaterial und der kovalenten Bindung, Anheflung oder Adsorption, eines für den Analyten von Interesse spezifischen rezeptiven Materials auf die obere Schicht des anti-reflektiven Materials. Das mit dem rezeptiven Material überzogene optische Substrat wird dann mit einer den entsprechenden Analyten von Interesse enthaltenden Flüssigkeit in Kontakt gebracht und hinsichtlich einer durch den beschichteten Artikel erzeugten diffusen Reflexion untersucht, um zu ermitteln, ob ein Farbfleck oder ein anderes geeignetes optisches Signal erscheint. In einer Ausführungsform dieser Erfindung besitzt das Substrat eine unregelmaßige Oberfläche, deshalb ist die Reflexion diffus. In einer anderen Ausführungsform jedoch ist die Reflexion anfänglich spiegelnd, aber dann wird die Reflexion mittels eines lichtvermindernden, lichtstreuenden, diffus lichtstreuenden, lichtabschwächenden oder lichtmodifizierenden Materials, wie Mattglas oder Textur-Kunststoff, welches zur Erzeugung einer nicht-spiegelnden Reflexion über dem Artikel angebracht wird, nicht-spiegelnd gemacht.
  • Die Nachteile vieler spiegelnder Assays, die für die Verwendung als nicht-instrumentelle visuelle Tests beabsichtigt werden, schließen ein,, daß die Betrachtung durch Polarisatoren oder Filter vorgenommen werden muß, so daß die Empfindlichkeit des Assays durch die Abhängigkeit von dem Winkel des einfallenden Lichts eingeschränkt wird. Zum Beispiel weist ein Substrat mit einem Brechungsindex von 2,25, welches mit einer anti-reflektierenden Schicht mit einem realen Brechungsindex von 1,50 überzogen ist, einen Mangel an Empfindlichkeit auf wenn das einfallende Licht mit 30 Grad oder stärker von der Senkrechten abweichend einfälit. (T. Sandstroem, M. Stenberg und H. Nygren, Applied Optics Band 24, S.472479 [15.02. 85]). Es ist unerwartet und überraschend, festzustellen, daß ein unregelmaßiges Substrat, oder ein diflus lichtstreuendes Material, das über dem Artikel angebracht ist, eine diffüse Reflexion erzeugt, welche die Abhängigkeit des Artikels vom Einfallslichtwinkel vermindern oder eliminieren würde und dennoch ein deutliches Signal, d.h. eine Veränderung in der Interferenzfarbe, ergibt. Die vorliegende Erfindung verwendet ein Verfahren und einen Artikel, welche eine diflüse oder nicht-spiegelnde Reflexion erzeugen, was eine wesentliche Verbesserung gegenüber den bislang bekannten Assay-Nachweisverfahren ist.
  • Gemaß der bevorzugten Ausübung dieser Erfindung wird ein Substrat dahingehend gewahlt, daß es einige der verschiedenen hier beschriebenen Eigenschalten aufzuweist. Das Substrat kann aus einem reflektiven Material, wie poliertem Silicium, polierten Metallen usw., gebildet sein, oder der Assay kann mit wenig Schwierigkeit an einem durchlässigen Substrat, wie bestimmten Kunststoffen, Glas, Quarz usw. durchgeführt werden. Das Substrat kann ein fester Träger, ein flexibler Träger, ein Häutchen oder ein Gel sein. Beispiele von einigen geeigneten Materialien zur Herstellung eines Substrats sind Metall, Quarz, Kunsstoff, Silicium, Nicht- Metalle oder fünktional äquivalente Materialien, welche dazu fähig sind, anti-reflektive Materialien als Überzug auf der Oberfläche aufruweisen.
  • Ein flexibler Träger ist besonders nützlich für Artikel, die als Heimtest-Kits vermarktet werden. Beim Transport erfordern diese Artikel keine besondere Behandlung oder kostenaufwendige Schutzverpackung. Beispiele von einigen dieser Materialien, weiche zur Bildung flexibler Träger geeignet sind, sind verschiedene Formen von Kunststoffen oder verformbaren Metallen usw. Das Substrat kann auch ein Häutchen sein, welches sowohl leichtgewichtig als auch flexibel ist, oder das Substrat kann aus einer gelartigen Substanz gebildet werden. Darüber hinaus kann das Substrat jegliche Substanz sein, auf welcher eine Schicht eines Materials aufbeschichtet ist, welches fähig zur Aufhahme einer anti-reflektierenden Beschichtung und zur Erfüllung der hier nachstehend beschriebenen Kriterien ist. Das ausschlaggebende Kriterium für die Auswahl des Substratmaterials ist dessen Beschichtbarkeit mit einem anti-reflektiven Material, und daß sein Brechungsindex etwa gleichwertig zum Quadrat des Brechungsindexes des direkt darüber befindlichen Materials ist. Eine breite Vielzahl von Verhältnissen zwischen den Brechungsindizes des Substrats und des Materials direkt überhalb davon kann innerhalb des Umfangs dieser Erfindung verwendet werden. Für die Signalerzeugung ist ebenfalls bedeutsam,, daß die durch den vorgefertigten Artikel erzeugte Interferenzfarbe und die durch den reagierten Artikel erzeugte Interferenzfarbe einen sichtbaren Kontrast auweisen sollten, um ein in hohem Maße sichtbares Signal zu ergeben.
  • Gemäß der bevorzugten Ausübung dieser Erfindung besitzt das Substrat der erfündenen Vorrichtung eine unregelmaßige Oberfläche. Die Oberflächenfehlerstellen sind nicht regelmäßig angeordnet und die durch Profilometrie bestimmten Höhenvariationen liegen in der Größenordnung von 200-300 Nanometern bis zu etwa 100 Mikrometer. Verfahren zur Erzeugung einer unregelmäßigen Oberfläche schließen das anisotrope und das isotrope Ätzen der Oberfläche ein. In einigen Fällen macht die Natur des intrinsischen Substratmaterials die Oberfläche unregelmäßig. Geeignete Oberflächen werden auch unter Verwendung von Aluminiumoxid oder anderen Läppteuchen geeigneten Durchmessers erzeugt, um die diffuse Oberfläche durch Abrieb zu erzeugen. Es sollte jedoch verstanden werden, daß einige der Äusführungsformen dieser Erfindung eine glatte Substratoberfläche als das bevorzugte Substrat verwenden.
  • Nach Auswählen des geeigneten Substrats wird eine anti-reflektive Beschichtung auf dem Substrat angeheftet. Die anti-reflektiven Beschichtungen werden mittels bekannter Beschichtungstechniken auf die Oberfläche des Substrats aufgetragen, zum Beispiel durch Besputtern, Dampfphasenauftrag in einer Vakuumkammer und dergleichen. Als anti-reflektive Beschichtungen verwendbare Materialien besitzen vier Merktnale, Klarheit, wesentliche Farbfreiheit bei der verwendeten Dicke, Stabilität bei Raumtemperatur, ausreichende Stabilität, um die Auftragungstechniken zu überdauern, und die Fähigkeit, bei Beschichtung, reflektiertes Licht bei ausgewählten Wellenlängen zu unterdrücken. Die Funktion des anti-reflektiven Materials umfaßt eine Interferenzfarbe und besteht zweitens darin, eine Schicht vorzusehen, auf weicher das rezeptive Material angeheftet werden kann. Die Fähigkeit des rezeptiven Materials, einen beliebigen Analyten von Interesse, welcher in der mit der Vorrichtung in Kontakt zu bringenden Flüssigkeit vorhanden ist, selektiv zu adsorbieren oder zu binden, darf durch das Immobilisierungsverfahren nicht nachteilig beeinflußt werden.
  • Das anti-reflektive Material in dieser Erfindung erzeugt eine Interferenzfarbe durch destruktive Interferenz bestimmter Wellenlängen des Lichts; eine anti-reflektive Schicht von Siliciummonoxid zum Beispiel, welche bei einer Dicke von 600 Ångström auf einem Siliciumsubstrat aufgeschichtet ist, erzeugt eine bläuliche Interferenzfarbe. Siliciumdioxid auf einem ähnlichen Substrat und bei einer ähnlichen Dicke erzeugt eine goldene Farbe.
  • Die Dicke des aufgeschichteten anti-reflektiven Materials ist davon, ob monochromatisches oder polychromatisches Licht verwendet werden wird, um die Oberfläche der Assayvorrichtung zu bestrahlen, und von dem im Assay gewünschten Empfindlichkeitsgrad abhängig. Die größte Verminderung der Reflexion tritt bei einer anti-reflektiven Beschichtung mit einer Dicke von etwa einem Viertel der Wellenlänge des Lichts im Medium und mit einem Brechungsindex, welcher die Ouadratwurzel des Produkts der Indizes des Mediums direkt darüber und direkt darunter ist, auf
  • Ein mit polychromatischem Licht zu bestrahlender optimierter Artikel sollte eine AR-Beschichtung einer Dicke eines Viertels der zur Unterdrückung ausgewählten Wellenlänge aufweisen. Wenn der Artikel mit monochromatischem Licht bestrahlt werden soll und ein hoher Grad an Empfindlichkeit erwünscht wird, dann sollte die Vorrichtung mit einer oder mehreren anti-reflektiven Schichten mit einer optischen Dicke in der Größenordnung von mehreren Wellenlängen überzogen sein. Dies dient zur weiteren Optimierung der Wellenlängenunterdrückung für eine ausgewählte Wellenlänge. Wenn die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zum Beispiel mit einer dicken anti-reflektiven Schicht (z.B. 1 µm) beschichtet wurde und mit einer festgelegten Wellenlänge (z. B. 6328 Ångström aus einem HeNe-Laser) bestrahlt wurde, wird eine extrem kleine Veranderung in der Dicke der Schichten auf der Testvorrichtung eine signifikante Veränderung in der Wellenlänge des reflektierten oder durchgelassenen Lichtes erzeugen.
  • Ein bei einer optischen Dichte von einer bis mehreren Wellenlängen des anti-reflektiven Materials beschichtetes reflektives Substrat kann dieselben optischen Prinzipien wie ein Fabry- Perot-Interferometer verwenden. Die anti-reflektiven Materialien bilden eine Vertiefüng mit einer reflektierenden oberen und unteren Oberfläche, welche nur bestimmten optischen Wellenlängen erlaubt, darin vorzukommen. Die von diesem Artikel reflektierten Wellenlängen variieren in starkem Maße als eine Funktion der Wellenlänge des einfallenden Lichts. Je dicker die anti-reflektive Schicht oder Schichten, desto höher wird der Q der Aushöhlung, und desto schmaler wird das Band von reflektierten Wellenlängen sein, wodurch die Empfindlichkeit der Vorrichtung erhöht wird. Bei Bestrahlung mit polychromatischem Licht zeigt dieser Artikel wesentliche Veränderungen in der reflektierten Wellenlänge bei Dickenänderungen von lediglich wenigen Ångström.
  • Nach Anbringen der anti-reflektiven Schicht oder Schichten auf dem Substrat wird das rezeptive Material über verschiedene Wege an die oberste anti-reflektive Schicht angeheftet. Die oberste anti-reflektive Schicht kann chemisch aktiviert werden, um die kovalente Bindung des rezeptiven Materials zu ermöglichen, oder eine Adsorption des rezeptiven Materials vorzusehen. Das rezeptive Material kann mittels des Langmuir-Blodgett-Verfahrens auf das anti-reflektive Material aufgeschichtet werden. Die Funktion des rezeptiven Materials besteht darin, über verschiedene Wege einen spezifischen Analyten aus einer den Analyten enthaltenden beliebigen Flüssigkeit selektiv zu adsorbieren, zu binden oder anzuheften.
  • Die vorbeschichtete Vorrichtung oder der Artikel kann dann verwendet werden, um eine beliebige Flüssigkeit zu assayen, welche in Verdacht steht oder von welcher angenommen wird, den Analyten von Interesse zu enthalten. Die fragliche Flüssigkeit wird auf der vorbeschichteten Vorrichtung ausgesetzt und eine vorbestimmte Zeitdauer lang inkubieren gelassen. Als Nächstes wird die Vorrichtung gespült, um ungebundenes Material zu entfernen, und getrocknet. Eine Veränderung der sichtbaren Interferenzfarbe ist ein Beweis eines positiven Ergebnisses, wohingegen negative Ergebnisse keine Veränderung in der Interferenzfarbe zeigen.
  • In den folgenden Beispielen ist die oberste Schicht des anti-reflektiven Materials, auf welches das rezeptive Material aufbeschichtet wird, ein Siliciumoxid; jedoch ist jegliches anti-reflektive Material, das fähig zur Anheftung des rezeptiven Materials ist, ein geeigneter Ersatz. Beispiele von oberen anti-reflektiven Schichten schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, elementaren Kohlenstoff (in graphitartigen oder diamantartigen Gitterstrukturen), Borverbindungen, organische Polymere, TiO&sub2;, Alumiumoxid, Silicidverbindungen oder beliebige andere Verbindungen ein, weiche die Fähigkeit zeigen, aktiviert zu werden, um das rezeptive Material anzuknüpfen, zu adhärieren, anzuheften oder anderweitig zu sichern, welches in der Lage ist, mit dem Änalvten in einer beliebigen Probeflüssigkeit selektiv zu binden oder wechselzuwirken.
  • Der anschließende qualitative oder quantitative Nachweis des Analyten ist einfach vorzunehmen, da die Reflexion diflüs und wenig winkelabhängig ist. Der qualitative Nachweis des Änalyten erfolgt durch das bloße Auge, der quantitative Nachweis wird mit derartigen Instrumenten durchgeführt, wie dem Vergleichsellipsometer von Sagax (eingetragenes Warenzeichen von Biostar Medical Products, Inc., Boulder, Colorado) oder einem Reflektometer oder einem beliebigen anderen Instrument, das zur Messung derartiger physikalischer Parameter, wie der Wellenlänge, der Polarisation, der Intensität, kleiner optischer Dichteveränderungen usw., fähig ist.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Figur 1 stellt einen hergestellten Objektträger mit einer unregelmäßigen Oberfläche, antireflektiven Schichten und einem rezeptiven Material dar;
  • die Figur 2 stellt einen mit einem Analyten reagierten hergestellten Objektträger dar;
  • die Figur 3 stellt die dise oder nicht-spiegelnde Reflexion von Licht von einem unebenen Substrat dar;
  • die Figur 4 stellt die spiegelnde Reflexion von Licht von einem ebenen Substrat und die nichtspiegelnde Reflexion von Licht von einem mit Kunststoff bedeckten ebenen Substrat dar;
  • die Figur 5 stellt einen hergestellten Objektträger dar, welcher mit rezeptivem Material beschichtet und teilweise mit einem nicht-spiegelnden Material bedeckt ist; und
  • die Figur 6 stellt einen hergestellten Objektträger mit einer unregelmäßigen Oberfläche und rezeptivem Material dar.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die nachstehenden hierin verwendeten Begriffsdefinitionen werden mit der Absicht, Aspekte der Erfindung klar zu stellen, angegeben, und es wird nicht beabsichtigt, mit ihnen die Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken, und es wird davon ausgegangen, daß sie im Fachgebiet angenommen sind:
  • Anti-reflektive Schichten: Eine auf ein Substrat aufgeschichtete dünne Materialschicht, um unerwünschte Reflexionen von der Oberfläche zu unterdrücken. Die Schicht ist am wirksamsten, wenn die Reflexionen von der oberen Oberfläche der Schicht und der oberen Oberfläche des Substrats um ungefähr 180 Grad voneinander phasenverschoben sind.
  • Antikörper: Klasse von Serumproteinen, welche spezifisch binden und deren Herstellung durch ein Antigen induziert wurde.
  • Antigen: Moleküle, welche eine Immunreaktion induzieren, wenn sie durch das Immunsystem des Wirts erkannt werden.
  • Interferenzphanomen: Eine destruktive und/oder konstruktive Wechselwirkung zweier oder mehrerer Lichtwellen, welche zu einer Intensität führt, die eine verschiedene resultierende Summe als die Summe der ursprünglichen Wellenkomponenten besitzt.
  • Diffüse Reflexion: Einfallendes Licht, das von einer Oberfläche reflektiert wird, welche Oberflächenstrukturen besitzt, die im Vergleich zu den Wellenlängen des eingestrahlten Lichts groß sind.
  • Spiegelnde Reflexion; Einfallendes Licht, das von einer Oberfläche reflektiert wird, welche Oberflächenstrukturen besitzt, die im Vergleich zu den Wellenlängen des eingestrahlten Lichts klein sind.
  • Brechungsindex: Verhältnis der Geschwindigkeit von sichtbarem Licht in einem Material zu der Geschwindigkeit von Licht in einem Vakuum.
  • Optische Dicke: Die meßbare physikalische Dicke eines Materials multipliziert mit dem Brechungsindex des Materials.
  • Läppen: Verfahren, in welchem Schleifteuchen verwendet werden, um Oberflächenstrukturen mechanisch herzustellen. Die Schleifteilchengröße wird den Charakter, die Größe und die Verteilung von Oberflächenmerkmalen bestimmen.
  • Ätzen: Chemisch gesteuertes Verfahren zur Herstellung von Oberflächenmerkinalen auf einem Substrat.
  • Interferenzfarbe: Phänomen, bei dem eine oder mehrere Wellenlängen des Lichts konstruktiv oder destruktiv miteinander interferieren und somit bestimmte Wellenlängen in einer Region des Spektrums unterdrückt werden und eine Farbe durch ein Interferenzphanomen reflektiert wird.
  • Nachstehend folgt eine Beschreibung der Erfindung einschließlich der Schritte des Beschichtens des Substrats mit anti-reflektivem Material und rezeptivem Material zur Bildung der vorbeschichteten Vorrichtung, des Assayverfahrens für den Analyten in der Flüssigkeitsprobe und des Verfahrens zum Nachweis und zur Bestimmung der Menge des an das Substrat gebundenen Analyten. Die Verwendung von Markern oder Markierungen, wie radioaktiven, Enzym-, fluoreszenten, lumineszenten Konjugaten usw., wird durch diese unmarkierte Vorrichtung umgangen. Um die Beschreibung der Erfindung anzufertigen, wurde ein spezifisches Beispiel ausgewählt. Eine Siliciumwafer diente als das Substrat. Siliciummonoxid und Siliciumdioxid waren die aufbeschichteten anti-reflektiven Schichten, und Silan-Chemie wurde angewandt, um Rinder-Ganima-Globulin, das rezeptive Material, an die Vorrichtung zu binden. Das Herstellungsverfahren der Vorrichtung ist nicht auf die in diesem Beispiel ausgewählten spezifischen Materialien beschränkt. Es können jedwede Verbindungen, welche die für jedes der Elemente des Apparats oder der Vorrichtung aufgezählten spezifischen Kriterien erfüllen, mittels im Fachbereich angenommenen und bekannten Wegen leichter Abänderungen des hier naclsstehend beschriebenen Verfahrens verwendet werden.
    • SCHRITT 1: Auswahl des Substrats
  • Diese Erfindung erlaubt verschiedene Substratformate; das Substrat kann ein Träger sein, welcher in Abhängigkeit von dem Typ des gewählten Analyten und der vom Endbenutzer gewunschten Assaymerkmale fest, flexibel, halbflexibel, ein Häutchen oder ein Gel ist.
  • Bevorzugte Ausfiilirungsformen der vorliegenden Erfindung schließen die Verwendung eines Substrats mit einer unregelmäßigen Oberfläche zur Erzeugung einer diffusen Lichtreflexion, und einer glatten Substratoberfläche mit einem diffis lichtstreuenden oder lichtmodifizierenden Material, wie Mattglas oder strukturierten Kunststoff, ein. Dieses wird über den Objektträger aufgebracht, nachdem die Vortichtung mit dem Analyten reagiert hat. Die erste Ausführungsform wird mit einem Substrat eines geeigneten Materials mit mmdestens einer unregelmäßigen Oberfläche gebildet (nachstehend bezeichnet als das unregelmäßige Substrat). Ein einfaches Verfähren zur Erzeugung einer unregelmäßigen Oberfläche besteht darin, Material mit einer Gitterstruktur zu verwenden, welche bei Spaltung ein unregelmäßiges Muster bildet. Material mit einer Gitterstruktur, welche bei Spaltung eine glatte Oberfläche bildet, kann jedoch in der ersten Ausführungsform (und offensichtlich ohne weitere Veränderung in der zweiten Ausführungsform) dieser Erfindung ebenfalls verwendet werden. Eine glatte Substratoberfläche kann mittels einer Vielzhhl von Verfahren behandelt werden, um ein unregelmäßiges Substrat zu bilden. Diese Verfahren schließen, jedoch ohne darauf eingeschränkt zu sein, ein: anisotropes Ätzen, isotropes Ätzen, Schleifläppen, Behandlung mit HF-Säure und chemisches Ätzetil- Plasma-Ätzen zur Erzeugung der Oberflächenmerkmale, welche ein diffuses Substrat vorsehen.
  • Unter Bezugnahme auf die Fig. 1, wird ein Substrat mit einer im wesentlichen unregelmäßigen Oberfläche gezeigt, welches auf einem beliebigen geeigneten Material angefertigt ist; in dieser Figur ist das gewählte Substrat ein Siliciumwafer. Der Wafer ist von etwa 4 Inch Durchmesser und von 0,02 Inch Dicke; es sollte bemerkt werden, daß diese Abmessungen des Substrats für die vorliegende Erfindung nicht kritisch sind.
  • Das Substrat wird auf einem Siliciumstall gebildet, welcher wachsen gelassen und auf 4 Inch Durchmesser extrudiert und danach diamantgesagt wird, um einen Wafer zu bilden. Die Wafer werden mit chemischen Ätzmitteln behandelt, um die Oberfläche zu glätten und Fehlerstellen zu verringern. Die Wafer werden mit Aluminiumoxid- oder Titanoxidteilchen in einer Talkaufschlämmung geläppt oder abgeschliffen. Die anfängliche Kömchengröße ist groß, und es werden sukzessiv kleinere Teilchengrößen verwendet, um eine zunehmend glattere Oberfläche herzustellen. Beide Seiten des Wafers werden diesem Verfarhren unterzogen. Das abschließende Läppverfahren hinterläßt eine sehr diffus reflektierende Oberfläche. Die Wafer können dann bei dieser Anwendung eingesetzt werden, nach dem die anti-reflektiven Beschichtungen aufgetragen sind. Wafer können mit chemischem Ätzen oder Plasma-Ätzen weiter bearbeitet werden, um die Merkmale der diffusen Reflexion des Substrats zu modifizieren. In der Halbleiterindustrie durchgehen Wafer eine weitere Bearbeitung, um auf einer oder zwei Seiten poliert zu werden, und sind in der zweiten Ausführungsform dieser Erfindung von Nutzen.
  • Sobald die Wafer geläppt sind, werden sie unter Verwendung des folgenden Verfahrens oder einer bekannten Abwandlung davon gesäubert: Die Wafer werden per Schall mit einem kationischen Detergenz gereinigt, gefolgt von einer Spülung in Wasser von 18 Megaohm. Danach werden sie mit anionischem Detergenz gesäubert, gefolgt von einer Spulung in Wasser von 18 Megaohm. Danach werden sie per Ultraschall mit einer wassngen Ammoniaklösung, welche aus 370 ml zu 30 % unstabilisiertem H&sub2;O&sub2;, 250 ml wassngem Ammoniak und 9 Gallonen Wasser hergestellt wurde, gesäubert. Sie werden dann in eine Kaskadenwasserspülvorrichtung eingebracht, wobei die letzte Spülung mit auf 0,1 Mikrometer gefiltertem Wasser erfolgt. Sie werden dann rotationsgetrocknet und sind für eine optische Beschichtung bereit. Eine Alternative zu diesem Verfahren ist der "RCA Clean", wie beschrieben in Polymer Surfaces and Interfaces, herausgegeben von W. J. Feast und H. S. Munro, John Wiley and Sons, N. Y., N. Y., Seite 212, 1987. Dieses Verfahren ist in der gesamten Halbleiterindustrie in breitem Maße modifiziert worden.
  • Für Glas wird das Ausmaß der Oberflächenmerkmale oder der Unregelmäßigkeit bezüglich Glas erörtert. Die Fähigkeit der Oberfläche zur diffusen Reflexion, welche hier beschrieben wird, bezieht sich auf das Ausmaß, zu dem die Reflexion, anstatt der reinen spiegelnden Reflexion, gestreut wird. Diffiisheit ist eine Funktion der Oberflächentopographie, und da die relevante Topographie viel größer als die Interferenzschicht oder die Bioschichten ist, wird nicht erwartet, daß die Unschärfe für verschiedene Schichten signifikant variiert. Die Schicht wird natürlich die Helligkeit oder Farbe des reflektierten Lichts beeinflussen, aber nicht dessen Spiegelungsvermögen bzw. Spekularität.
  • Die Oberflächentopographie, und somit die Unschärfe oder Unregelmäßigkeit, kann mit einem Oberflächen-Profilometer, wie dem Dek-tak (Sloan Technology Corp., Santa Barbara, Califomia), charakterisiert werden. Das Dek-tak sieht Ablesungen der Trennung oder des Abstands zwischen Oberflächenmerkinalen und eines Mittelwerts für die Höhe von Oberflächenmerkmalen über eine definierte Oberflächenregion hinweg vor. Ein nützliches Maß der Oberfläche ist die RMS-Rauhigkeit geteilt durch den mittleren Peak-Abstand, wobei ein Peak als eine Erhebung mit einer Höhe von mindestens 50 % der RMS-Rauhigkeit definiert ist. Da Rauhigkeit eine Funktion des Reflexionsvermögens gegenüber dem Winkel ist, kann sie durch Messen der Winkelabhängigkeit des Reflexionsvermögens quantifiziert werden. Für eine bei 30º von der Normalen einfallende Lichtquelle sollte die Intensität des reflektierten Lichts auf einer Photodiode als eine Funktion des Winkels von 0º bis 90º gemessen werden. Der gewählte Wafer sollte optimalerweise über den betrachteten Winkelbereich ein sanft variierendes Reflexionsvermögen aulzeigen. Unter Verwendung einer HeNe-Laserlichtquelle sollte das von einer aufgerauhten Oberfläche vorhandene Reflexionsvermögen weniger als 5 % betragen, wobei angenommen wird, daß ein polierter Wafer bei 100 % reflektiert.
  • In einer bevorzugten Ausfiihrungsform der vorliegenden Erfindung sind Artikel, welche die nicht-spiegelnden, d.h. unregelmäßigen, Oberflächen umfassen, welche die Schicht oder die Schichten von anti-reflektivem Material tragen, welches fähig ist, aktiviert zu werden, um an ein Analyten-rezeptives Material anzuhatten, dadurch gekennzeichnet, daß die unregelmäßigen oder strukturierten Oberflächen bei Messung mittels eines Profilometers eine Messung oder Werte zwischen etwa 2700 und etwa 3295 ergeben, wobei eine bevorzugte Messung bei etwa 2995 liegt. Dieser Wert repräsentiert die RMS-Rauhigkeit, dividiert durch den Durchschnitts- Peak der Strukturen, und deren Reflexionsvermögen, wie mit einer HeNe-Laserlichtquelle gemessen, beträgt weniger als etwa 5 %.
  • Zusätzlich zum Schleitläppen ist eine breite Auswahl von chemischen oder Plasma-Ätztechniken zur Vorsehung der diflusen Lichteigenschaften des Substrats geeignet. Glas kann unter Verwendung einer HF-Ätzung, wie bei der Herstellung von mattiertem Glas, zu einer diffüs lichtreflektierenden Oberfläche abgewandelt werden.
  • Die dritte Ausführungsform dieser Erfindung wird auf eine ähnliche Weise wie entweder die erste oder die zweite Ausführungsform, mit der Ausnahme der Anheflung der antireflektierenden Schichten, hergestellt. Die dritte Ausführungsform ist entworfen, um durch ein Instrument, wie ein Ellipsometer, Photoreflektometer, Vergleichsellipsometer usw., und nicht notwendigerweise durch das bloße Auge, ablesbar zu sein; deswegen ist die Verwendung von anti-reflektivem Material, welches eine sichtbare Interferenzfarbe erzeugt, in der dritten Ausführungsform wahlfrei.
  • Die instrumentelle Vorrichtung wird mittels derselben Verfahren wie die erste und die zweite Ausfühmngsform gebildet mit der Ausnahme, daß das Substrat nicht notwendigerweise mit anti-reflektivem Material beschichtet wird und daß das Substrat direkt aktiviert werden kann, um die Bindung des rezeptiven Materials zu gestatten.
  • Es war eine in hohem Maße unerwartete Entdeckung, daß die Vorrichtung, wenn sie ohne anti-reflektives Material hergestellt wurde, ein Signal erzeugte, welches mittels einer Vielzahl von optischen Instrumenten leicht nachgewiesen wurde. Es wurde ebenfalls festgestellt, daß wenn die erste und die zweite Ausführungsform unter einem Instrument abgelesen wurden, häufig Filter notwendig waren, um die Ergebnisse zu erzielen, welche durch die Vorrichtung ohne eine Aufschichtung von anti-reflektivem Material auf das Substrat erzeugt wurden (siehe die Figuren 5 und 6).
    • SCHRITT 2: Anheftung der anti-reflektierenden Schichten auf das Substrat
  • Siliciummonoxid ist ein Beispiel einer anti-reflektierenden (AR) dünnen Schicht, die mittels Standard-Dünnschichtbeschichtungstechniken, welche in der Halbleiter- und in der optischen Industrie bekannt sind, auf das Substrat aufgeschichtet werden kann. Die Beschichtung kann durch Elektronenbombardierung oder duch Aufdampfen des Materials auf die Vorrichtung in einer Niedertemperatur-Vakuumkammer, welche fähig zur Erzeugung eines Vakuums von mindestens 10&supmin;&sup5; Torr ist, oder durch ein beliebiges anderes äquivalentes Verfahren durchgeführt werden. Diese Beschichtungen auf Siliciumbasis werden auf die hier nachfolgend erwähnten Spezifikationen in handelsüblicher Weise aufgeschichtet. Siliciumwafer, Glas oder andere diffüs lichtreflektierende Substrate können in diesen Verfahren beschichtet werden.
  • In diesem Beispiel wurde Siliciummonoxid zu einer Dicke zwischen 450 Ångström und 650 Ångström aulbeschichtet, was einer optischen Dicke von geringfügig weniger als einem Viertel einer Wellenlänge des Lichts entspricht. Alternativ dazu kann das anti-reflektive Material bei zwischen 1800 Ångström und 12 500 Ångström aufgeschichtet werden, was ungefahr die Dicke von drei Vierteln bis mehreren Vierteln der Lichtwellenlänge an optischer Dicke ausmacht, um eine empfindlichere Vorrichtung herzustellen. Lambda ist die zur Unterdrückung ausgewählte Wellenlänge. Danach werden die Reflexionen außer Phase sein, und ein Reflexionsminimum für das einfallende Licht wird erreicht. Die optische Dicke wird als die physikalische Dicke der Beschichtung multipliziert mit dem Brechungsindex der AR- Materialien definiert. Dementsprechend werden in der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung die optischen Beschichtungen gewöhnlich bei einer Dicke von 1/4 Wellenlänge des Lichts in optischer Dicke aufgetragen.
  • Um gleiche Intensitäten festzulegen, sollten die Brechungsindizes eine geometrische Folge bilden. Da der Brechungsindex von Luft 1,0 ist, sollte der Brechungsindex der AR- Beschichtung etwa äquivalent zu der Quadratwurzel des Substrats sein. Die größte Verringerung der Reflexion tritt für eine anti-reflektive Beschichtung auf, welche eine Dicke von etwa einem Viertel der Lichtwellenlänge in der optischen Dicke in dem Medium aulweist und einen Brechungsindex aufweist, der die Ouadratrwurzel des Produkts der Indizes der direkt darüber und darunter liegenden Medien ist. Dünne Schichten von Siliciummonoxid auf der Vorrichtung zeigen einen Brechungsindex von 1,8-2,0, was etwa die Quadratwurzel des Brechungsindex des Siliciumwafers ist, welcher 4,1 beträgt. Somit vermindert die Anbringung von anti-reflektiven Schichten den Verlust von einfallendem Licht aufgrund von Reflexion.
  • Die Anzahl von auf das Substrat aufbeschichteten anti-reflektiven Schichten kann eine beliebige ganze Zahl von 1 bis unendlich sein, wobei die bevorzugte Anzahl von Materialschichten zwei beträgt. Die Anzahl von Schichten wird lediglich durch zwei Faktoren eingeschränkt: daß die Brechungsindizes der gewählten Materialien einer geometrischen Reihe gehorchen sollten, und den bei der Herstellung von Mehrfachschichtüberzügen beteiligten Unkosten.
  • Bei Beschichtung mit den anti-reflektiven Schichten aus Silicium unterdrückt die Objelttträger- Vorrichtung bestimmte Wellenlängen in dem sichtbaren Blaulichtbereich und reflektiert deswegen eine goldene Interferenzfarbe. Obwohl bei dieser Kombination von Elementen eine goldene Interferenzfarbe verwendet wird, kann die sichtbare Interferenzfarbe des Objektträgers eine beliebige geeignete Farbe im Spektrum sein, abhängig vom gewählten Material des Substrats, der chemischen Zusammensetzung der gewählten anti-reflektiven Schichten und der Dicke und der Anzahl von aufbeschichteten Schichten.
    • SCHRITT 3 Anheften von rezeptivem Material an die Objektträger-Vorrichtung
  • Vor der Anheftung des rezeptiven Materials an das optisch beschichtete Substrat muß die Oberfläche der Vorrichtung gründlich von Fremdteilchen abgestriffen werden, deren unerwünschte Gegenwart nicht-spezifische Bindung oder Hintergrundasignale verursachen könnte. Um dies zu bewerkstelligen, wird die Vorrichtung mit einem Sauerstoffplasma-Ätzmittel in einer Vakuumkammer behandelt. Die beschichtete Vorrichtung wird in eine Vakuumkammer gebracht, welche auf 0,7 Torr evakuiert ist. Der Sauerstoff wird durch einen Anodenstrom von 175 Milliampere Gleichstrom, 250 Watt Hochfrequenz, angeregt, um ein Sauerstoffplasma zu bilden.
  • Man setzt das Sauerstoffplasma-Ätzverfahren fünf Minuten lang fort, um die Entfernung aller unerwünschten organischen Matenahen zu gewährleisten. Dieses Sauerstoffplasma-Ätzverfahren sollte unmittelbar vor dem Anheften des rezeptiven Materials durchgeführt werden.
  • Die gesäuberte Vorrichtung wird dann chemisch aktiviert, um die kovalente Bindung des rezeptiven Materials auf das oberste anti-reflektive Material, Siliciumdioxid, zu erleichtern. Die Anheflung des rezeptiven Materials kann mittels einer Anahl von Verfahren durchgeführt werden; wie Langmuir-Blodgett-Beschichtungstechniken, mittels Adsorption oder mittels einem beliebigen anderen Mechanismus, welcher das rezeptive Material angemessen an das aktivierte beschichtete Substrat anheftet. Wie vorstehend in der dritten Ausführungsform erörtert, wird das gesäuberte Substrat chemisch aktiviert, um das Anheften des rezeptiven Materials an die Vorrichtung zu erleichtern.
  • Weil dieses Beispiel mit Siliciumdioxid beschichtet wird, wird Silan-Cherme verwendet, um die Oberfläche zu aktivieren und das rezeptive Material kovalent an die Oberfläche zu binden. Fünfundzwanzig Siliciummonoxid-Wafer werden in ein Quarzgestell gebracht, weiches in einen Vakuum-Exsikkator eingeführt wird; innerhalb dieses Exsikkators wird ein kleines Gefäß eingeführt, weiches etwa 5 Mikroliter Bisaminosilan enthält. Im Spezifischeren wird N-(2- Aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilan, Siedepunkt 140 Grad bei 15 Torr, verwendet. Der Siedepunkt der Aminosilanverbindung bestimmt den optimalen Druck und die optimale Temperatur zur Durchführung des Dampfphasenauftragens. Der Vakuumexsikkator wird 30 Minuten lang auf 0,06 Torr evakuiert. Dann wird die Temperatur des Exsikkators über den Verlauf einer Stunde auf 100ºC angehoben, um einen Überzug von Silan von etwa 20-30 Ångström herzustellen. Dieser Uberzug bleibt mindestens 6 Monate lang stabil.
  • Die chemische Aktivierungsbeschichtung kann durch alternative Verfahren, wie in den Beispielen abgebildet, durchgeführt werden, wobei, ohne darauf eingeschränkt zu sein, chemische Aktivierung durch Lösungsauftrag, Schleuderbeschichtung oder ein beliebiger anderer Mechanismus eingeschlossen ist, welcher fähig ist, die Oberfläche für die Anheftung des rezeptiven Materials (der rezeptiven Materialien) auf die Oberfläche der Vorrichtung vorzubereiten.
  • Die Vorrichtung wird nun für die Anheftung des rezeptiven Materials vorbereitet. Das hier verwendete spezifische Beispiel ist ein Test für den Nachweis von Rheumatoid-Faktor, dem Analyten, in einer Körperflüssigkeit. Drei annehmbare rezeptive Materialien oder Liganden,, närlich Rinder-Gemma-Globulin, humanes IgG, oder Rinder-Immunoglobulin G (IgG), sind verwendet worden, um den Analyten zu binden. Für unterschiedliche Analyten müssen verschiedene rezeptive Materialien verwendet werden. Dieses Beispiel verwendet den kostengünstigsten Liganden, Rinder-Gamma-Globulin (hier nachstehend als BGG bezeichnet). Die Silan-beschichtete Vorrichtung wird in einen Kunststoff-Zellkulturbehälter von 8 cm mal 3 cm mal 2 cm Größe gebracht (ein beliebiger geeigneter Behälter kann verwendet werden). Zwanzig ml einer auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellten 10 mM Phosphat-gepufferten 0,9%igen Salzlösung (hier nachstehend als PBS bezeichnet) werden mit 200 Mikrogramm pro ml BGG (das Verhältnis von Gewicht/Volumen ergibt einen Überschuß von Liganden und unterliegt einem breiten Bereich nützlicher Konzentrationen) vereüiigt und in den Kunststoffbehälter gegeben. Zu dieser Lösung wird ein Verhältnis von 1 %, bezogen auf das Volumen, an Glutaraldehyd zugesetzt. Die Lösungen, in welche das rezeptive Material eingemischt wird, werden von den Merkmalen des Aktivierungsschritts und von der Auswahl des rezeptiven Materials abhängen.
  • Der Behälter mit der Vorrichtung, welche von der Lösung des rezeptiven Materials bedeckt ist, wird in einem Schüttelbad bei Raumtemperatur inkubiert. Das Schütteln fördert die gleichmaßige Anheftung des rezeptiven Materials an der beschichteten Vorichtung. Die Bindung des BGG an die Vorrichtung in diesem Beispiel erfolgt durch die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den aktivierten fünktionellen Silangruppen und dem Proteinmolekül. Die Anheftung des gewahlten rezeptiven Materials kann mittels einer Vielzahl bekannter Techniken durchgeführt werden. Die bevorzugte Technik wird eine Funktion des Typs der erforderlichen Bindung und des Typs des verwendeten rezeptiven Materials sein.
  • Anschließend an die Inkubation werden ungebundene Rinder-Gamma-Globulinproteine aus der Vorrichtung mittels gründlichem Spülen der Vorrichtung mit entionisiertem Wasser entfernt. Die Herstellung des vorgefertigten Artikels wird durch Einbringen der Vorrichtung unter einen Strom von N&sub2; oder Druckluft oder durch Lufttrocknen der Vorrichtung vollendet. In der bevorzugten Ausfülrrungsform dieser Erfindung wird jedoch ein wahlfreier Blockierungsschritt vor der Trocknung des Objektträgers eingebunden.
  • Anschließend an das Spülen der Objektträger-Vorrichtung zur Verringerung der Menge von nicht-spezifischer Bindung wird die Vorrichtung in eine Blockierungslösung gebracht und eine Stunde lang in einem Schüttelbad inkubieren gelassen. Die Lösung wurde aus 2 µg/ml säurehydrolysiertem Casein plus 1 % Glycerin, Volumen pro Volumen, und 2 % Sucrose, Gewicht pro Volumen, in genügend PBS hergestellt, um das Gesamtvolumen auf 20 ml zu bringen.
  • Anschließend an die Schüttel-Inkubation wird die Vorrichtung mit entionisiertem Wasser gespült, um allen nicht-gebundenen Blocker zu entfernen,, und der Objektträger wird getrocknet. Verschiedene dem Fachmann bekannte Blockierungsmittel und Blockierungslösungen können verwendet werden, zum Beispiel BSA, Milch, Spermidin, Glycin, Ethylendiamin usw.
    • SCHRITT 4: Assay für an die Vorrichtung angehefteten Analyten
  • Vor dem Kontaktieren der den Analyten enthaltenden Flüssigkeit mit dem vorgefertigten Artikel wird die Flüssigkeit durch Zugeben von Aliquots der Flüssigkeit zu Phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt. Obwohl eine Verdünnung nicht notwendig ist, ist sie der bevorzugte Weg zur Verringerung nicht-spezifischer Bindung. Bei diesem Beispiel beträgt die für diesen Assay optimale bevorzugte Verdünnung 1:1 (Volumen des Serums: Volumen des Verdünnungsmittels), obwohl ein breiter Spielraum der Verdünnung, abhängig von der Natur der zu untersuchenden Flüssigkeit und der verwendeten Assay-Nachweistechnik, eingesetzt werden kann. Mternative Proben-Verdünnungsmittel können verwendet werden, um die zufallige Anheftung unerwunschten Materials an den vorgefertigten Artikel zu verhindern, zum Beispiel 20 mM TRIS bei einem pH-Wert von 8,0.
  • Die verdünnte Probe der Flüssigkeit, von welcher vermutet wird, den Analyten von Interesse zu enthalten, wird danach in Kontakt mit dem vorgefertigten Objektträger gebracht. Der vorgefertigte Artikel kann in die verdünnte Probe eingetaucht werden, oder ein kleiner Tropfen der Flüssigkeit kann auf die Oberfläche des Artikels gestrichen oder damit santt in Kontakt gebracht werden. Die Anheflung des Analyten an den Artikel wird durch drei Minuten lange Inkubation des Objektträgers auf einem Heizblock bei 45ºC verbessert, oder gegebenenfalls kann der vorgefertigte Artikel fünf Minuten lang unter eine Heizlampe gebracht werden, oder alternativ dazu kann die Vorrichtung bei Raumtemperatur inkubiert werden, bis die Feuchtigkeit in der Probe verdampft ist. Es versteht sich, daß die Temperatur, bei welcher die Vorrichtung inkubiert wird, eine Funktion des gewählten rezeptiven Materials und Analyten ist. Im Anschluß an die Inkubation wird der vorgefertigte Artikel vollständig gespült, um jegliches nicht-gebundene Material von seiner Oberfläche zu entfernen. Dann wird die Vorrichtung mit einem Strom von N&sub2; oder Druckluft, oder auf eine beliebige äquivalente Weise zur Entfernung der Spüllösung und zur Verhinderung von Wasserbefleckung auf der Objektträgeroberfläche, getrocknet (siehe Figur 2).
    • SCHRITT 5: Assay-Nachweistechniken
  • Für den Nachweis von gebundenem Analyten werden zwei Assay-Nachweistechniken, visuell und inrumentell, eingesetzt. Ein beliebiges geeignetes instrumentelles Nachweisverfanren kann verwendet werden. Für die hier nachstehend beschriebenen Beispiele wird ein Interferenzfarbenphänomen verwendet, um visuell zu bestätigen, ob die Flüssigkeit den Analyten von Interesse enthält.
  • Der vorgefertigte Artikel kann mit einer polychromatischen oder monochromatischen Lichtquelle bestrahlt werden, um festzustellen, ob Annlyt an die Oberfläche gebunden hat. Der vorgefertigte (oder nicht-reagierte) Artikel reflektiert unter polychromatischem Licht eine goldene Interferenzfarbe mit einem Absorptionsmaximum von etwa 476 Nanometer, wohingegen im Vergleich dazu der reagierte Artikel unter polychromatischem Licht die goldene Farbe reflektiert, wo kein Analyt gebunden ist, und eine purpurfarbene oder eine blaue Interferenzfarbe mit einem Absorptionsmaximum zwischen 550 Nanometer und 650 Nanometer reflektiert, wo der Analyt gebunden ist. Die Farbe des reagierten Flecks hängt von der Konzentration des an die Oberfläche gebundenen Analyten ab. Je höher die Konzentration, desto intensiver erscheint die Farbveränderung
  • Wenn der Analyt mit dem rezeptiven Material reagiert, nimmt die physikalische Dicke des Materials auf der Oberseite des Substrats entweder zu oder ab. Diese Dickenanderung resultiert in einer Veränderung des optischen Weges; der neue optische Weg bedingt, daß sich die Interferenzfarbe ändert. Um in dem bevorzugten Verfahren dieser Erfindung die korrekte Phasenverschiebung für destruktive Interferenz zu erreichen, ist die Dicke des SiO, oder eines beliebigen Überzugs der AR-Schicht, geringfügig kleiner als eine ungerade Anzahl von Vierteiwellenlängen des einfallenden Lichts. Da Luft ein weniger dichtes Medium als die AR- Schichten oder das Substrat ist, besteht eine Phasenverschiebung um pi/2 für Reflexionen an beiden Grenzflächen. Die identische Phasenverschiebung löscht sich gegenseitig aus. Um die Netto-Phasenverschiebung zu bestimmen, ist deshalb der einzige Faktor der optische Gangunterschied, welcher als 2d x nf definiert ist. Die Definition von d ist die tatsächliche Messung der AR-Dicke, und nfist als der Brechungsindex der AR-Schicht definiert. Die tatsächliche Phasenverschiebung ist deshalb 2dn/Lambda multipliziert mit 2pi, falls im Bogenmaß, oder mit 360, falls im Winkelmaß angegeben. Die optische Dicke der AR-Schicht ist irgendeine ungerade Viertelwellenlänge des einfallenden Lichts; in diesem Beispiel ist die tatsächliche optische Dicke etwa äquivalent zu Lambda!4, wobei Lambda die für eine Peak-Leistung ausgewählte Wellenlänge ist. Deshalb beträgt die Phasenverschiebung etwa 180 Grad, und es besteht eine teilweise destruktive Interferenz, welche eine goldene Interferenzfarbe aufzeigt, weil bestimmte der Wellenlängen in der Blauregion des sichtbaren Lichts, bei etwa 465-480 Nanometer, unterdrückt werden.
  • Wenn der Analyt an das rezeptive Material an der Oberseite des Artikels bindet, wird der optische Weg entweder gesteigert oder verringert. In diesem Beispiel ist die tatsächliche Dickenänderung, welche sich durch die Bindungsreaktion zwischen dem Rheumatoid-Faktor und dem Rinder-Gamma-Globulin ereignet, ein Materialzuwachs von etwa 20-500 Ångström. Diese Veränderung im optischen Weg ergibt eine Unterdrückung der Gold-Wellenlängen nahe 450 Nanometer, was zu einer blauen oder purpurfarbenen Interferenzfarbe führt, die den Bereich definiert, wo der Analyt gebunden ist. Die purpurfarbene Farbe auf dem diflüsen Substrat wird teilweise gestreut, teilweise reflektiert (siehe Figur 3). Die Purpurfarbe auf dem Substrat mit glatter Oberfläche wird vor der Zugabe des diffus lichtstreuenden Materials spiegelnd reflektiert (siehe Figur 4).
  • Es ist überraschend, daß das Aufbringen einer anti-reflektierenden Beschichtung deren Fähigkeit beibehält, Interferenzeffekte auf einem diffüsen oder strukturierten Substrat zu erzeugen. Man nimmt an, daß anti-reflektive Schichten nur wirksam sind, wenn das Substrat hochreflektiv ist. Es wird erwartet, daß sie eine Winkelabhängigkeit bei der Erzeugung von Interferenzfarben autzeigen. Für AR-Schichten in der optischen Industrie sind dies die erwünschten Eigenschaften.
  • Für einen visuellen Assay mit diagnostischer Anwendung sind das Reflexionsvermögen und die Winkelabhangigkeit ernsthafte Nachteile. Der mit Substraten nach dem Stand der Technik erhaltene hohe Grad des Reflexionsvermögens (Nygren et al., U. S.-Patent 4 558 012) erzeugt kontrastierende Interferenzfarben, aber die spiegelahnliche Oberfläche ist für den unerfahrenen Betrachter sehr verwirrend. Das Auge neigt dazu, sich auf andere Bilder zu konzentrieren, welche in dem Substrat reflektiert werden und kann von der Betrachtung einer reagierten Zone auf dem Substrat abgelenkt werden. Die größte Einschränkung des spiegelnd reflektierenden Substrats ist die Abhängigkeit der wahrgenommenen Interferenzfarbe vom Betrachtungswinkel. Dies ist eine ernste Einschränkung bei den oder in der Nähe der Nachweisgrenzen des Ässay-Systems. Diese Substrate erfordern einen ziemlich fortgeschrittenen Erfahrungsstand, um eine schwache positive Antwort korrekt zu interpretieren. Das diffuse Substrat, wenn geeignet gewählt, behält die deutliche Erzeugung einer Interferenzfarbe, ohhe die mit der Betrachtung der spiegelnden Oberfläche verbundenen Ablenkungen, bei. Darüber hinaus verursachen diese Substrate keine Winkelabhängigkeit der Interferenzfarben für die Betrachtung. Dies ermöglicht, daß die visuelle Interpretation sehr schwacher positiver Fälle von unerfahrenen Personen in klarer Weise vorgenommen werden kann. Somit wird die Gesamtempfindlichkeit eines qualitativen, visuellen Assays mit diesen Substraten in großem Maße verbessert.
  • Um die Notwendigkeit für Techniken zur Signalverstärkung zu vermeiden, sollte die Interferenzfarbenveränderung optimiert werden, um bei Reaktion eine kontrastierende Interferenzfarbe zu ergeben. Dies ermöglicht einen Farbkontrast, für welchen das menschliche Auge hochempfindlich ist. Es sollte verstanden werden, daß jegliche Farbveränderung, ob für das menschliche Auge sichtbar oder nicht, als ein Nachweissignal verwendet werden kann, weil das instrumentelle Nachweisverfahren hochempfindlich gegenüber nicht-sichtbaren Veränderungen der Dicke ist. Das zur quantitativen Analyse der Menge von gebundenem Material häufig verwendete Instrument ist das Ellipsometer, obwohl verschiedene andere Instrumente eine ähnliche Analyse durchführen können. Obwohl alle drei Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mittels eines Instruments abgelesen werden können, ist die dritte Ausführungsform spezifisch für die instrumentelle Detektion entworfen. Der instrumentelle Nachweis erlaubt, daß der Assay unter Vergleichsergebnissen auf einer spiegelnden oder nicht-spiegelnden reflektierenden Oberfläche durchgeführt wird.
  • Ellipsometrie ist ein optisches Verfahren zur Bestimmung der Dicke und des Brechungsindex von extrem dünnen Schichten. Die Technik nutzt Veränderungen von der planaren zur elliptischen Polarisation, welche auftreten, wenn der Lichtstrahl reflektiert wird. Die Form und die Orientierung der Ellipse werden vom Einfallswinkel und den Eigenschaften der reflektierenden Oberfläche beeinflußt. Die elliptische Orientierung ist somit ein sehr empfindliches Maß der Dicke einer Schicht, welche die reflektive Oberfläche bedeckt. Der geeignete Einfallswinkel für ein Vergleichsellipsometer ergibt einen optimalen Nachweis der Schichtdicke bis zu etwa 3 Ångström. Dies entspricht einer Empfindlichkeit von etwa 1/1000 der Wellenlänge des die Oberfläche bestrahlenden Lichts.
  • Das Sagax -Vergleichsellipsometer vergleicht die Dicke des reagierten Objektträgers mit einer Referenzschicht, welche eine zu dem nicht-reagierten Objektträger nahezu äquivalente Dicke aufweist. Das polarisierte Licht wird von beiden Oberflächen abreflektiert und in ein digitalisiertes Bild umgewandelt. Das Bild wird entsprechend der Lichtintensität in Graustufenwerte umgewandelt. Diese Graustufenwerte sind eine zuverlässige Wiedergabe der tatsächlichen Schichtdicke.
  • Bekannte Konzentrationen von auf einem Artikel reagierten Analyten wurden auf dem Ellipso meter abgelesen, und die resultierenden Daten wurden verwendet, um eine Standardkurve aufzustellen. Die Konzentration des Analyten, Rheumatoid-Faktor, in dieser Probe wird unter Bezugnme auf die zuvor aufgestellte Standardkurve berechnet. Es sollte offensichtlich sein, daß andere Verfahren der Messung der Analytkonzentration innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung angewandt werden können, wie Reflektometrie, Colorimetrie, Profilometrie und dergleichen.
  • In der zweiten Ausführungsform dieser Erfindung wurde das Substrat mit einer regelnmßigen Oberfläche verwendet. Um die weniger winkelabhängige diffuse Reflexion zu erzeugen, wird der Artikel vor dem visuellen oder instrumentellen Nachweis des Analyten mit einem diffus lichtstreuenden Material bedeckt. Dieses Material kann dauerhaft aufbeschichtet oder auf dem Artikel angebracht werden, oder es kann, alternativ dazu, entfernbar sein. Ein undurchsichtiges nicht-blendendes Glasstück von etwa 4 Inch Durchmesser und 1/16 Inch Dicke wurde über die zweite Ausführungsform gebracht, um eine diffüse Reflexion oder eine abgeschwächte Reflexion hervorzurufen. Materialien, wie undurchsichtige Kunststoffe, Mattglas (smoked glas) oder ein beliebiges anderes funktioneil äquivalentes Material, können eingesetzt werden, um eine diffuse Reflexion oder eine abgeschwächte Reflexion, oder einen Lichtstreuungseffekt zu erzeugen.
    • BEISPIEL 1 Nachweis von Rheumatoid-Faktor unter Verwendung von dicken anti-reflektiven Beschichtungen
  • Ein Siliciumwafer von etwa 4 Inch Durchmesser und 0,02 Inch Dicke, der auf einer Seite eine hochpolierte Oberfläche und auf der anderen eine diflus reflektierende Oberfläche aufwies, wurde mit einer Kombination von Siliciummonoxid und Siliciumdioxid zu einer Dicke von 11.893 Ångström des anti-reflektiven Materials beschichtet, so daß beide Seiten eine AR-Beschichtung erhielten. Dieser Wafer wurde in Hälften geschnitten und ein Proben-Assay wurde auf der diffüs reflektierenden Oberfläche durchgeführt, und der zweite Proben-Assay wurde auf der glatten Oberfläche durchgeführt. Dieser beschichtete Wafer wurde durch Anwendung von N-(2-Aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilan mittels des folgenden Verfahrens aktiviert:
  • 1. Der beschichtete Wafer wurde fünf Minuten lang in einem Vakuum bei 0,7 Torr, bei einer Sauerstoffatmosphäre und einem Anodenstrom von 175 Milliampere Gleichstrom und 250 Watt Hochtrequenz, Sauerstoffplasma-geätzt.
  • 2. Unmittelbar nach der Entfernung wurden die beschichteten Wafer in ein Quarzgestell gebracht und in einen Vakuumexsikkator mit einem Gefäß, enthaltend 5 Mikroliter N-(2- Aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilan, eingeführt. Das Vakuum wurde 30 Minuten lang bei 0,06 Torr aufrechterhalten. Danach wurde die Temperatur des Exsikkators über den Verlauf einer Stunde auf 100 Grad erhöht, um den Dampfrhasenauftrag von Aminosilan zu vervollständigen.
  • 3.200 Mikrogramm/pro mi BGG und 20 ml PBS (vorstehend beschrieben) und 1 Vol.-% Glutaraldehyd wurden vereüügt, um die Lösung des rezeptiven Materials zu bilden. Die Wafer wurden in eine Petrischale gebracht, und die Lösung des rezeptiven Materials wurde zugegeben.
  • 4. Um die Anheftung des rezeptiven Materials zu verbessern, wurden die Wafer 15 Stunden lang bei Raumtemperatur in einem Schüttelbad inkubiert.
  • 5. Im Anschluß an die Inkubation wurden die nicht-gebundenen Rinder-Gamma-Globulinproteine durch Spülen mit entionisiertem Wasser von den Wafern entfernt.
  • 6. Anschließend an den Spülschritt wurden die Wafer in die vorstehend beschriebene Casein- Blockierungslösung gebracht, um nicht-spezifische Bindung zu verringern. Die Petrischale mit den Wafern und der Blockierungslösung wurde eine Stunden lang bei Raumtemperatur in einem Schüttelbad inkubiert.
  • 7. Im Anschluß an das Blockierungsverfahren wurde alles überschüßige Blockierungsmittel durch Spülen mit entionisiertem Wasser entfernt. Dann wurde der Objektträger unter einem Strom von Stickstoff getrocknet. Die vorgefertigten Wafer wurden danach verwendet, um die Gegenwart von Rheumatoid-Faktor in zwei positiven Serumproben zu bestimmen. Ein Assay mit einer glatten Oberfläche und ein Assay mit einer unregelmäßigen Oberfläche, wie hier nachstehend beschrieben, unter Verwendung der wie vorstehend beschrieben hergestellten beschichteten Wafer, erzeugte die Daten in der Tabelle 1 durch die folgenden Verfahren:
  • a. Jede Serumprobe wurde durch Zugabe von PBS (vorstehend beschrieben) auf ein Verhältnis von 1:1 (Volumen des Serums : Volumen des Verdünnungsmittels) verdünnt.
  • b. 5 Mikroliter jeder verdünnten Probe wurden auf jeden Wafer gebracht, und die Wafer wurden drei Minuten lang auf einem Heizblock bei 45ºC inkubiert, um die Analyten-Anheftung zu verbessern.
  • c. Die Wafer wurden danach mit entionisiertem Wasser gespült, um alles nicht-gebundene Material zu entfernen, und dann mit einem Strom von Druckluft getrocknet.
  • Bei visueller Inspektion des nicht-reagierten Abschnitts des diffusen Wafers unter polychromatischem Licht, reflektierte der Wafer eine diffuse grüne Farbe bei den meisten Betrachtungswinkeln. Dennoch erschien bei schrägeren Winkeln eine diffuse Rosafarbe. Die zwei positiven Serumproben reflektierten einen diffusen rosafarbenen Fleck, welcher bei den meisten Betrachtungswinkeln sichtbar war, aber gingen bei schrägeren Winkeln zu einem grün gefarbten Fleck über. Wenn der diffus reflektierende Wafer unter ein grünes monochromatisches Licht mit einer Wellenlänge von 546 Nanometern gebracht wurde, reflektierte die nicht-reagierte Oberfläche diffus eine grüne Farbe und der reagierte Abschnitt reflektierte bei den meisten Betrachtungswinkeln einen schwarzen Fleck. Eine ähnliche Betrachtung des nichtreagierten, spiegelnd reflektierenden Wafers unter polychromatischem Licht zeigte eine grüne spiegelnde Reflexion bei Betrachtungswinkeln von der Normalen bis zu 30 Grad abweichend von der Normalen, und bei Winkeln, welche größer als 30 Grad waren, erschien der Wafer rosafarben. In Abhängigkeit vom Winkel des einfallenden Lichts war der reagierte Fleck sichtbar, obwohl die Sichtbarmachung eines schwach positiven Falls sehr schwierig war. Der glatte Wafer wurde dann mit einer lichtstreuenden Kunststoffscheibe von etwa 0,01 Inch Dicke bedeckt, was den reagierten Fleck von der Hintergrundfarbe leichter unterscheidbar machte. Der Kunststoff ermöglichte ebenfalls, daß die Flecken bei Winkeln des einfallenden Lichts, welche größer als 30 Grad von der Normalen waren, sichtbar waren. TABELLE 1 Dickenveränderung von reagierten Wafern aufgrund der Bindung von Rheumatoid-Faktor
    • BEISPIEL 2 Nachweis von für Birkenpollen spezifischen IgE-Antikörpern
  • Ein Siliciumwafer von 4 Inch Durchmesser und 0,02 Inch Dicke mit einer glatten Oberfläche und einer diffus reflektierenden Oberfläche wurde auf beiden Seiten mit zwei anti-reflektiven Schichten überzogen, eine aus Siliciummonoxid mit etwa 500 Ångström Dicke und eine zweite aus Siliciumdioxid mit einer Dicke von 50 Ångström. Vor dem Aktivierungsschritt wies die diffus reflektierend beschichtete Oberfläche des Wafers bei Messung 531 Ångström auf. Der Wafer wurde durch Aufbringen von verdünnter gereinigter Nitrozellulose mittels des nachstehenden Verfahrens aktiviert:
  • 1. Der Wafer wurde auf einen Photoresist-Schleuderbeschichter gebracht und mit 3 ml Aceton gewaschen, um Fremdteilchen zu entfernen.
  • 2. 300 Mkroliter der hier nachstehend beschriebenen Lösung wurden dann auf den rotierenden Wafer aufgesprüht Die Lösung bestand aus 0,0829 Gramm gereinigter Nitrozellulose (erhältlich von Balzer's Union), welche in vier Millilitern Pentylacetat gelöst war.
  • 3. Der aktivierte Wafer wurde danach aus dem Schleuderbeschichter entnommen und eine Stunde lang in einem Ofen bei 120ºC erwärmt. Der Erwärmungsvorgang unterstützte die Eliminierung jeglichen überschüßigen Pentylacetats und unterstützte die Adsorption der Nitrozellulose an das anti-reflektive Material. Auf einem Ellipsometer wurde gemessen, daß das aktivierte Substrat sich auf 552 Ångström belief
  • 4. Das rezeptive Material, Birkenpollenextrakt, wurde durch Lösen von 1/2 Gramm Birkenpollen (im Handel erhältlich) in 5 ml eines 1 0%igen isotonischen Phosphatpuffers angefertigt, der aus 2,2 Gramm zweiwertigem Kaliumphosphat mit 0,1 Vol.-% Tween in 1000 ml entionisiertem Wasser bestand und auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt war.
  • 5. Die Pufferlösung mit dem Birkenpollen wurde 3 Stunden lang gerührt, um die Oberflächenallergene zu extrahieren. Nach dem Rühren wurde die Lösung 20 Minuten lang bei 1500 Upm zentrifligiert. Nach der Zentrifügation wurde die den Birkenpollenextrakt enthaltende überstehende Flüssigkeit abdekantiert und aufbewahrt.
  • 6. Der 1/2 ml Birrkenpollenextrakt wurde in 20 ml PBS verdünnt, und der Wafer wurde in diese Lösung eingetaucht. Die Schale wurde dann bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt, um die Adsorption des rezeptiven Materials an das Nitrozellulose-Aktivierungsmaterial zu erleichtern. An dem blau gefärbten Wafer wurde eine Messung vorgenommen, und es wurde ein Zuwachs von 39 Ångström aufgezeichnet.
  • Danach wurde der vorgefertigte Wafer verwendet zur Feststellung der Gegenwart von IgE- Antikörpern in vier Serumproben aus Individuen mit:
  • 1. Akuter allergischer Antwort (Akut)
  • 2. Starker allergischer Antwort (Stark)
  • 3. Milder allergischer Antwort (Mild)
  • 4. Keiner offensichtlichen Antwort (Normal)
  • Ein Assay, wie hier nachstehend beschrieben, unter Verwendung des beschichteten, wie vorstehend beschrieben hergestellten, Wafers erzeugte durch die folgenden Verfahren die Daten in der Tabelle 2:
  • 1. 5 Mikroliter jeder Serumprobe wurden auf die Obertläche des Wafers gebracht. Der Wafer wurde dann 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, um alle Feuchtigkeit aus der Probe zu verdampfen und die Anheftung der für Birkenpollen spezifischen IgE-Antikörper zu erleichtern.
  • 2. Der Wafer wurde kurz in entionisiertem Wasser gespült, um alles nicht-gebundene Material zu entfernen. Danach wurde der Wafer unter einen Strom von N&sub2; gebracht, um die Obertläche zu trocknen. Nach visueller Inspektion des Wafers unter polychromatischem Licht zeigten drei der Serumproben diffüs reflektierende weiße Flecken gegen den hellblauen Hintergrund, die normale Probe zeigte keine sichtbare Farbveränderung Die Intensität des weißen Flecks stand in guter Ubereinstimmung mit dem Ausmaß der allergischen Antwort. Die "akute" Probe war ein extrem heller Fleck, die "hohe" Probe war etwas weniger deutlich, und der "milde" Fleck war leicht sichtbar, aber weniger deutlich als die anderen zwei Proben.
  • 3. Die Dickenveränderung des reagierten Abschnitts des Wafers wurde auf einem Ellipsometer in Ångström gemessen.
    • TABELLE 2 Dickenveränderung aufgrund der Anheftung von IgE-Antikörpern BEISPIEL 3 Nachweis von karzinoembryonischem Antigen (CEA)
  • Ein Siliciumwafer mit einer hochpolierten Seite und einer diflüs reflektierenden Seite wurde auf beiden Seiten mit einem anti-reflektiven Material, Siliciumoxynitrid, zu einer Dicke von 500 -650 Ångström des Materials von Meadowlark Optics beschichtet. Die Seite mit der unregeimäßigen Obertläche wurde durch Aufbringen von N-(2-Aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilan mittels des folgenden Verfahrens chemisch aktiviert:
  • 1. Der beschichtete Wafer wurde 5 Minuten lang in einer Sauerstoffatmosphäre von 0,71 Torr bei einem Anodenstrom von 175 Milliampere Gleichstrom und 250 Watt Hochftequenz Sauerstoffplasma-geätzt.
  • 2. Unmittelbar nach der Entfernung aus dem Sauerstoffplasma-Ätzer wurde der Wafer in ein Quarzgestell gebracht, das in einen Vakuumexsikkator mit einem angebrachten Gefaß, in welches 5 Mikroliter des Aminosilans eingebracht waren, eingeführt wurde.
  • 3. Der Vakklimexsikkator wurde 30 Minuten lang bei 0,06 Torr betrieben. Danach wurde die Temperatur des Exsikkators über den Verlauf einer Stunde auf 100ºC erhöht. Dieses Verfahren aktivierte den Wafer durch den Dampfauftrag des Aminosilans auf die Oberfläche des Wafers.
  • 4. Der Wafer wurde nun für die Anheftung des rezeptiven Materials vorbereitet. Zuerst wurde eine Lösung, bestehend aus 20 ml PBS, 0,1 Vol.-% Glutaraldehyd und 150 µl IGAP, das ein synthetisches Polypeptid ist, welches die aktive Region von Protein A überspannt, hergestellt. (Andere Experimente setzten Protein A oder Protein G anstatt des IGAP ein, und ähnliche Ergebnisse wurde erzielt.)
  • 5. 200 Mikroliter von für karzinoembryonisches Antigen spezifischem monoklonalen Antikörper (polyklonaler kann anstelle davon eingesetzt werden) wurden bei 10 µg/ml in die IGAP-Lösung pipettiert.
  • 6. Die vereinigte Lösung wurde auf die Oberseite des Wafers in einer Petrischale gegeben und wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einem Schüttelbad inkubiert. Nach der Entnhme wurde die Petrischale in eine Kühleinheit überführt und 48 Stunden lang bei 4ºC inkubieren gelassen, um die Anheftung des rezeptiven Antikörper-Materials fortzuführen. Um alles nicht-gebundene Material zu entfernen, wurde der Wafer mit entionisiertem Wasser gespült und in einem Strom von N&sub2; getrocknet.
  • Der vorgefertigte Wafer, welcher eine bräunliche Farbe diffus reflektierte, wurde dann verwendet, um die Gegenwart von CEA-Antigen in fünf Serumproben mit bekannten CEA- Konzentrationen zu bestimmen.
  • Ein Assay, wie hier nachstehend beschrieben, unter Verwendung des beschichteten Wafers, hergestellt wie eben beschrieben, ergab die Daten in der Tabelle 3 und die Daten in Tafel 1 durch die folgenden Verfahren:
  • 1. 10 Mikroliter von allen fünf Serumproben wurden mit der Oberfläche des Wafers in Kontakt gebracht und sieben Minuten lang bei 37ºC inkubiert.
  • 2. Nach sieben Minuten wurde der Wafer in entionisiertem Wasser gespült, um alles nichtgebunde Material zu entfernen. Danach wurde der Wafer unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Die visuelle Betrachtung des Objekträgers enthüllte kleine rosafarbene Flecken mit Farbintensitäten, welche den zunehmenden Analyt-Konzentrationshöhen entsprachen.
  • 3. Die Dickenveranderung des reagierten Abschnitts des Wafers wurde mittels eines Sagax - Vergleichsellipsometers in Graustufeneinheiten gemessen. TABELLE 3 Messung von gebundenem CEA-Antigen
    • BEISPIEL 4 Nachweis von Gruppe A-Streptococcus
  • In diesem Test wurden drei Siliciumwafer mit hochpolierten Oberflächen und drei Siliciumwafer mit diffis reflektierenden Oberflächen, welche jeweils einen Brechungsindex von etwa 4 bis 4,08 bei einer spezifischen Wellenlänge aufwiesen, verwendet. Die Gruppe A wurde mit etwa 550 Angstöm Siliciummonoxid mit einem Brechungsindex von 1,97 bei einer spezifischen Wellenlänge beschichtet. Die Gruppe B wurde mit etwa 560 Ångström Siliciumoxynitrid mit einem Brechungsindex bei einer spezifischen Wellenlänge von 1,95 beschichtet. Die Gruppe C wurde mit etwa 550 Ångström Boroxid mit einem Brechungsindex bei einer spezifischen Wellenlänge von 1,9 beschichtet. Diese Beschichtungen kommen der Gleichung nahe, welche für die Aufbeschichtung einer optischen Schicht auf die Oberfläche des Substrats verwendet wurde.
  • Das rezeptive Material wurde zu einer Dicke von 25 bis 30 Ångström aufbeschichtet. Es wurden drei Gruppen von Wafern chemisch aktiviert, um die Anheftung des rezeptiven Materials zu ermöglichen. Die Aktivierung erfolgte durch Aufbringen von N-2-(2-Aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilan durch das folgende Verfahren:
  • 1. Die beschichteten Wafern wurden 5 Minuten lang in einer Sauerstoffatmosphare von 0,70 Torr bei einem Anodenstrom von 175 Milliampere Gleichstrom und 250 Watt Hochftequenz Sauerstoffplasma-geätzt.
  • 2. Unmittelbar nach Entfernung aus dem Sauerstoffplasma-Ätzer wurden die Wafer in ein Quarzgestell gegeben, welches, mit einem angebrachten Gefäß, in das 2,5 Mikroliter Aminosilan eingebracht waren, in einen Vakuumexsikkator eingeführt wurde.
  • 3. Der Vakuumexsikkator wurde 30 Minuten lang auf 0,06 Torr evakuiert. Danach wurde die Temperatur des Exsikkators über den Verlauf einer Stunde auf 100ºC angehoben. Dieses Verfahren aktivierte den Wafer durch den Dampfauftrag von Aminosilan auf die Waferoberflächen.
  • 4. Die Wafer wurden nun für die Anheftung der rezeptiven Materialien vorbereitet. Zuerst wurden 250 Mikrogramm pro Milliliter Rinderserumalbumin (BSA) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gelöst. 10 Milliliter dieser Lösung wurden auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und wurden in ein Kunststoff-Zellkulturgefaß pipettiert, welches die sechs Wafer enthielt.
  • 5. 50 Mikroliter einer Lösung von 25 % Glutaraldehyd in Wasser wurden in das Zellkulturgefäß gegeben. 25 Mikroliter einer 50 ml-Mikrogramm-pro-ml-Protein A-Lösung wurden ebenfalls in das Zellkulturgefäß gegeben.
  • 6. Die sechs Wafer in dem Zellkulturgefäß wurden bei Raumtemperatur eineihhalb Stunden lang in einem Schüttelbad inkubiert.
  • 7. 200 Mikroliter eines im Handel (von Ventrex, Inc.) erhältlichen Anti-Strep A (herangezogen in Kaninchen) wurden in das Zellkulturgefäß pipettiert und eine weitere Stunde lang in dem Schüttelbad bei Raumtemperatur inkubiert.
  • 8. Anscl:lließend an die Inkubation wurde das Zellkulturgefäß etwa 48 Stunden lang bei 4ºC abgekühlt, um die Anheftung des rezeptiven Antikörper-Materials an die Vorrichtung fortzuführen. Um alles nicht-gebundene Material zu entfernen, wurden die Wafer mit entionisiertem Wasser gespült und in einem Strom von N&sub2; getrocknet.
  • Die sechs Wafer erschienen in Goldschattierungen, wobei drei der Wafer eine spiegelnde Reflexion abgaben und drei der Wafer eine nicht-spiegelnde diffuse Reflexion autzeigten. Diese Wafer wurden dann verwendet, um die Gegenwart von Strep A in entweder einer intakten bakteriellen Form oder als Bakterienlysat zu bestimmen.
  • Eine Assay-Technik ist hier nachstehend beschrieben:
  • 1. Jeder Wafer wurde abgetrennt und in ein kleines Kunststoff-Testkit eingebracht. Das Testkit war mit zwei Rohgüteklasse-Filterpapierplättchen, angebracht an der Innenseite der oberen Abdeckung, entworfen. Jedes Testkit erhielt sieben Mikroliter einer Positivkontrolle, welche auf ein Plättchen gebracht wurden, und sieben Mikroliter einer Negativkontrolle, welche auf das zweite Plättchen gebracht wurden. Die Positivkontrolle bestand in Hitze-abgetötetem Gruppe A-Streptococcus in einer Pufferlösung mit 0,02 % Natriumazid. Die Negativkontrolle wurde aus einer Lösung von 50 Mikrogramm BSA pro ml PBS genommen.
  • 2. Die Abdeckung der Testkits wurde geschlossen, was die Filterplättchen eine Minuten lang mit dem beschichteten Wafer in Kontakt brachte.
  • 3. Die Abdeckungen wurden geöffiiet, und die Wafer wurden eine Minuten lang an der Luft trocknen gelassen. Dann wurden die Wafer mit destilliertem entionisiertem Wasser gespült und mit Druckluft getrocknet.
  • Die visuelle Betrachtung der Wafer enthüllte in hohem Maße sichtbare purpurfarbene Flecken auf den nicht-spiegelnden Wafern und sichtbare purpurfarbene Flecken auf den spiegelnden Wafern. Die visuelle Betrachtung der nicht-spiegelnden Wafer wies eine geringere Winkelabhängigkeit auf als diejenige der spiegelnden Wafer. Die reagierten Farben wurden bei niedrigeren Konzentrationen weniger zitternd, obwohl alle Flecken deutlich unterscheidbar waren. Es wurde ein Instrument verwendet, um den durch die Bindungsreaktion auf der Oberfläche des Wafers ereeugten Massenzuwachs zu bestätigen. Die Veränderung der Masse oder der Dicke wurde in Graustufeneinheiten mittels eines Sagax -Vergleichsellipsometers gemessen.
  • Die vorstehenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Effizienz und Verwendbarkeit dieser Technologie, um eine Vielzahl von Analyten nachzuweisen, wobei der aus einem Sub strat, anti-reflelttiven Material(ien), einer Aktivierung und rezeptiven Material(ien) bestehende, vorgefertigte Objekträger verwendet wird, um eine Interferenzfarbenveränderung als Signal der Analytenanheftung zu erzeugen.
  • Ohne an die in den vorstehenden Beispielen verwendeten Substratformate oder -materialien gebunden zu sein, ist es möglich, eine Vielzahl von Kombinationen von Substratformaten und Substratmaterialien zu verwenden, welche fünktionell gleichwertige Ersetzungen sind, die fähig sind, ein anti-reflektives Material aufihrer Oberfläche gebunden aufruweisen, oder, wie in der dritten Ausführungsform beschrieben, dazu fähig sind, aktiviert zu werden, um die Anheftung des rezeptiven Materials zu erlauben (siehe Figur 5).
  • Das (Die) anti-reflektive(n) Material(ien) stellt eine Schicht zur Verfügung, welche aktiviert werden kann, um als das rezeptive Material zu wirken oder das rezeptive Material durch einen beliebigen Mechanismus an die Vorrichtung anzuknüpfen oder anzuheften. Darüber hinaus wird das in der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung verwendete anti-reflektive Material so aufbeschichtet, daß es eine Viertelwellenlänge große optische Dicke einer bestimmten Lichtwellenlänge ausmacht, um das höchste Ausmaß der destruktiven Lichtinterferenz zu erzielen. Die AR-Beschichtung kann von einem Viertel der bestimmten Wellenlänge abweichen, weil nämlich die destruktive Interferenz nicht vollständig sein muß, um eine angemessene Interferenzfarbe zu erreichen. Die tatsächliche Menge des auf die Oberfläche aufbeschichteten AR-Materials kann in breitem Maße schwanken, da die bestimmte Wellenlänge nahzu jede Wellenlänge sein kann. BEISPIEL 5 Vergleich von diffusen Oberflächen mit einem Stre-Gnuppe A-Antigen-Nachweisassay
  • Mi variierenden Teilchengrößen abgeläppte Wafer wurden mit Siliciumnitrid zu einer Dicke und einem Brechungsindex von 500 Ångström und n-2,0 beschichtet. Dies erzeugt eine goldene Interferenzärbe. Die Wafer wurden anfänglich hinsichtlich des Ausmaßes des beobachteten Reflexionsvermögens, oder hinsichtlich der verbleibenden Spiegelmerkmale untersucht. Diese Wafer wurden dann mit Aminosilan,, wie in den vorstehenden Beispielen, überzogen und danach mit einem polyklonalen Anti-Strep A-Antikörper antikörperbeschichtet. Die Wafer wurden dann mit Proben zur Reaktion gebracht, die variierende Anteile an Strep- Gruppe A-Antigen und einem sekundären Reagenz in Puffer enthielten, welche auf die Oberfläche dieser Wafer aufgebracht und 2 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die Objekträger wurden mit entionisiertem Wasser gespült und unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Es wurde kein Unterschied in der Menge des eingebauten Silans oder des angehefteten Antikörpers beobachtet. TABELLE 4 TABELLE 5 Visuelle Auswertung eines Strep A-Asaays auf unterschiedlich geläppten Waferoberflächen
  • Die Materialzusammensetzung der AR-Schichten wird auf Grundlage des Brechungsindex der ÄR-Materialien und der gewählten Substratmaterialien ausgewahlt; deshalb kann nahezu jegliches AR-Material verwendet werden, wenn die korrekte Kombination von Materialien gewählt wird.
  • Das oberste AR-Material wird dahingehend gewahlt, daß es dazu in der Lage ist, zur Aufnahme des rezeptiven Materials aktiviert zu werden. Die meisten AR-Materialien können auf irgendeinem Weg aktiviert werden, um die Anknüpfüng des rezeptiven Materials an die Vorrichtung zu gestatten; deshalb ist eine Vielzahl von Materialien dazu fähig, als antirefiektives Material verwendet zu werden. Es können verschiedene Verfahren der chemischen Aktivierung in Abhangigkeit von der Zusammensetzung des AR-Materials und des rezeptiven Materials angewandt werden. Eine Vielzahl von Materialien, fünktionellen Gruppen usw. kann als das Aktivierungsmaterial flingieren oder in dem Aktivierungsverfahren wirken.
  • Die Behandlung des Substrats, welches ein beliebiges unter einer Vielzahl von Formen, d.h. Reagenzgläsern, Wafern, Glas-Objekträgern, Mikrovertieflingen usw., und Formaten, d.h. ein fester Träger, ein flexibler Träger, ein Gel, ein Häutchen, sein kann und aus verschiedenen geeigneten Materialien hergestellt sein kann, d.h. Glas, Silicium, Kunststoff, wie Polystyrol und dergleichen, und/oder eine Beschichtung davon auf einem anderen Trägermaterial usw. umfaßt, mit der vorstehend erwähnten Technologie stellt viele nützliche Vorgehensweisen zum Nachweis des Analyten zur Verfügung. Dieser Nachweis des Analyten muß nicht auf den visuellen Nachweis einer Interferenzfarbenveränderung eingeschränkt sein. Die Farbveranderung kann in den infraroten oder den ultravioletten Bereichen geschehen, wobei der Analytnachweis in Entsprechung zu einer instrumentellen Nachweisvorrichtung erfolgt. Die reagierte Vorrichtung kann qualitativ oder quantitativ mittels eines Ellipsometers oder eines beliebigen anderen Intrruments, das durch einen beliebigen Mechanismus fähig zum Nachweis der Analytenbindung ist, analysiert werden.
  • Die diffus reflektierende Oberfläche kann unter Verwendung eines Substrats mit unregelmäßiger Oberfläche hergestellt werden, oder durch Aufbringen eines geeigneten lichtstreuenden oder Licht-interferierenden Bestandteils oder Materials auf die Oberseite der Vorrichtung in der Art, daß zumindestens etwas von der Schicht, welche zur Aussendung bzw. Herbeiführung einer nicht-spiegelnden Reflexion in der Lage ist, getroffen wird, oder durch Beschichten des Substrats mit einem zur Erzeugung einer diffus reflektierenden Oberfläche fähigen Material oder durch einen beliebigen anderen geeigneten Weg zur Erzeugung einer diffüsen Reflexion, einer abgeschwächten oder geringeren als vollständigen Reflexion oder jeglicher anderen nicht-spezifischen Reflexion hergestellt werden.

Claims (19)

  1. Vorrichtung zum Nachweis der Gegenwart eines Analyten von Interesse, weiches umfaßt: Substrat, das eine Schicht eines Analyt-rezeptiven Materials trägt oder in Anheftung daran aufweist, welches in Kombination mit einem anti-reflektierenden Überzug eine optisch aktive Oberfläche bildet, welche eine erste Interferenzfarbe in Antwort auf darauf auftreffendes Licht zeigt, und eine zweite Interferenzfarbe, welche eine Kombination von Lichtwellenlängen umfaßt, die von der ersten Interferenzfarbe verschieden sind, oder eine Intensität mindestens einer der Lichtweilenlängen umfaßt, die von der ersten Interferenzfarbe verschieden ist, in Antwort auf das Licht zeigt, wenn der Analyt auf der optisch aktiven Oberfläche vorhanden ist;
    worin das Substrat eine nicht-spiegelnde Oberfläche besitzt, oder worin eine transparente Schicht mit einer nicht-spiegelnden Oberfläche zur Betrachtung der optisch aktiven Oberläche vorgesehen ist.
  2. 2. Vorrichtung von Anspruch 1, worin das Substrat einen optischen Film umfaßt.
  3. 3. Vorrichtung von Anspruch 1, worin das Substrat ein Material umfaßt, das aus der aus monokristalinem Sllicium, Glas, Keramik, polykristallinem Silicium, Metall, Kunststoff und Verbundsstoffen dieser Materialien bestehenden Gruppe gewählt ist.
  4. 4. Vorrichtung von Anspruch 1, worin der anti-reflektierende Überzug ein Material umfaßt, das aus der aus folgendem bestehenden Gruppe gewählt ist: Siliciumdioxid, Siliciummonoxid, Diamant und Siliciumcarbid.
  5. 5. Vorrichtung von Anspruch 1 oder 2, worin das Substrat mit einem nicht-spiegeinden Material überzogen ist.
  6. 6. Vorrichtung von Anspruch 1 oder 2, worin der Analyt aus der aus Rheumatoid-Faktor, IgE-Antikörpern, karzinoembryonischem Antigen, einem für eine Autoimmunkrankheit spezifischen Analyten, einem Allergen, einem infektiösen Mikroorganismus oder dem Streptococcus-Gruppe A-Antigen bestehenden Gruppe gewählt ist.
  7. 7. Vorrichtung von Anspruch 1 oder 2, worin die nicht-spiegelnde Oberfläche einen Skalenwert zwischen 2700 und 3295 auf einem Profiltastschnittgerät aufweist, wobei der Wert die RMS-Rauhigkeit geteilt durch den Durchschnittspeak der Strukturen repräsentiert, und deren mittels einer HeNe-Laserlichtquelle gemessene Remission geringer als etwa 5 % ist.
  8. 8. Vorrichtung von Anspruch 1 oder 2, worin die Analyt-rezeptive Schicht einen spezifischen Bindungspartner für den Analyten umfaßt.
  9. 9. Vorrichtung von Anspruch 8, worin die Rezeptorschicht aus einem Material gebildet ist, das aus der aus Antigenen, Antikörpern, Oligonudeotiden, Enzymen, Bakterien und Nudeinsäuren bestehenden Gruppe gewählt ist.
  10. 10. Vorrichtung von Anspruch 1 oder 2, worin der Analyt aus der aus einem Antikörper, Antigen, Enzymen und Nudeinsäuren bestehenden Gruppe gewählt ist.
  11. 11. Vorrichtung von Anspruch 1 oder 2, worin der Analyt von Interesse das Strep-Gruppe A- Antigen ist.
  12. 12. Vorrichtung von Anspruch 1 oder 2, worin das Substrat eine zusätzliche Schicht umfaßt, die für die Anheflung des rezeptiven Materials geeignet ist.
  13. 13. Vorrichtung von Anspruch 1 oder 2, worin das Substrat ein lichtreflektierendes Material ist.
  14. 14. Vorrichtung von Anspruch 1 oder 2, worin das Substrat ein lichtdurchlässiges Material ist.
  15. 15. Vorrichtung von Anspruch 1 oder 2, worin das auftreffende Licht monochromatisches Licht oder polychromatisches Licht ist
  16. 16. Vorrichtung von Anspruch 1 oder 2, ausgelegt für die Verwendung mit einem Reflektometer.
  17. 17. Vorrichtung von Anspruch 1 oder 2, ausgelegt für die Verwendung mit einem Vergleichs- Ellipsometer.
  18. 18. Vorrichtung von Anspruch 1 oder 2, worin das Substrat ein mattiertes Glas ist.
  19. 19. Verfanren zum Nachweis der Gegenwart oder der Menge eines Analyten von Interesse in einer Probe, welches folgende Schritte umfaßt:
    Vorsehen eines Substrats, das eine Schicht eines Analyten-rezeptiven Materials trägt oder in Anheftung daran aufweist, welches in Kombination mit einem anti-reflektierenden Überzug eine optisch äktive Oberfläche bildet, welche eine erste Interferenzfarbe in Antwort auf darauf auftreffendes Licht zeigt, und eine zweite Interferenzfarbe, welche eine Kombination von Lichtweilenlängen umfaßt, die von der ersten Interferenzfarbe verschieden sind, oder eine Intensität mindestens einer der Lichtwellenlängen umfaßt, die von der ersten Interferenzfarbe verschieden ist, in Antwort auf das Licht zeigt, wenn der Analyt auf der optisch äktiven Oberfläche vorhanden ist;
    worin das Substrat eine nicht-spiegelnde Oberfläche besitzt, oder worin eine transparente Schicht mit einer nicht-spiegelnden Oberfläche zur Betrachtung der optisch äktiven Oberfläche vorgesehen ist;
    und Kontaktieren der optisch aktiven Oberfläche mit einer Probe, welche den Analyten von Interesse möglicherweise umfaßt, unter Bedingungen, bei denen der Analyt mit der optisch aktiven Oberfläche wechseiwirken kann, um die optisch aktive Oberfläche dazu zu veranlassen, die zweite Interferenzfarbe zu zeigen, wenn der Analyt vorhanden ist.
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