JPS63271162A - 表面プラズモン共鳴を用いる測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は測定方法、及び該方法を実施するための手段に
関する。この発明は特に、増強された感度及び特異性を
提供する改良された測定方法に関する。

以下余白 〔従来の技術〕 簡単な光学構造体の性質は古くから知られており、そし
て例えば回折格子のごとき構造体は電磁放射の波の性質
を理解しそして分析するための道具としてのみならず、
一層最近では、サンプル中の化学的、生化学的又は生物
学的種を検出するためのセンサーとしても広範に使用さ
れている。

ＥＰ−０１１２７２１は、測定されるべき種（以後、パ
リガント”と称する）と結合することができる物質（以
後、“特異的結合パートナ−”と称する）がコートされ
たあらかじめ形成された起伏状態を有する光学構造体の
調製、及びバイオセンサーとしての使用を記載している
。このような構造体の光学的性質はリガンドと特異的結
合パートナ−との間の複合体の形成の結果として変化し
、その結果この現象は測定系の基礎を構成する。

上記の構造体の光学的性質の変化は、結合したリガンド
の質量又は嵩、それらの誘電特性、並びにそれらの光学
的特性、例えば屈折率及び透明度の関数である。従って
、センサーを構成するために表面プラズモン共鳴（ｓｕ
ｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｖｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；５
ＰＲ）のごとき撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂｅ）された光学的
性質を用いる基本概念は有効であるか、小さな、小分子
量リガンドに対する低い感度のため、この様な方法の実
際的適用は従来から限定されている。この低い感度のな
め、例えば１０，０００ダルトンより小さい分子量を有
する低分子量リガンドの臨床濃度における正確な測定が
実現不能である。

ＥＰ−０１１２７２１に記載されている技法の実際的な
適用において経験される他の困難は低い特異性である。

このことは、アッセイ方法の２つの別個の段階において
起こる。

ｉ）光学構造体の表面へのサンプル成分の非特異的結合
、これは偽陽性結果、及び特異的結合の結果として生ず
る光学的性質の撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）の不
正確な定量をもたらすことがある。

ｉｉ）単一の認識段階の使用、すなわち分析されるべき
リガンドについてのただ１つの特異的結合対の使用が特
異性を低下せしめる場合がある。すなわち、サンプル中
にリガンドが無傷のユニット及び断片の両者として存在
する場合、例えば副甲状腺ホルモンの場合、無傷の、そ
してそれ故に生化学的に活性な分子のみを測定すること
が望ましい際に単一の認識段階は両形態が結合する結果
をもたらすであろう。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者等は今や、従来技術の感度の欠点を克服するこ
とができ、そして幾つかの態様においてはさらに改良さ
れた感受性をもたらす改良された測定技法を考案した。

従って本発明は、サンプル中のリガンドの測定方法であ
って、 ａ）前記サンプル、 ｂ）試薬Ｘ、及び Ｃ）表面プラズモン共鳴を示すことができる光学構造体
の表面上に直接的又は間接的に固定化された試薬Ｙ、 を同時に、又は任意の順序でインキュベートすることを
含んで成り、ここで試薬Ｘ及びＹの１つは前記リガンド
に対する特異的結合パートナ−を含んで成り、そして試
薬Ｘ及びＹの他方はリガンド類似体又は前記リガンドに
対する特異的結合パートナ−を含んで成り、試薬Ｘは、
試薬ＸとＹとの間の直接的又は間接的複合体の形成が、
試薬Ｘの非存在下で支配的である光学表面の光学的厚さ
に比べてかなり増加した光学的厚さを有する光学表面を
もたらすようなものであり、 該方法は、光学構造体により示される表面プラズモン共
鳴が前記複合体形成によって変化するか否か、そして所
望により該変化の程度及び／又は速度を測定する段階を
含んで成る方法を提供する。

試薬Ｘ及びＹの一方はリガンド類似体を含んで成り、そ
してリガンドＸ及びＹの他方はリガンドに対する特異的
結合パートナ−を含んで成り、リガンドＸ及び７間の複
合体の形成が直接生ずるであろう０両試薬Ｘ及びＹがリ
ガンドに対する特異的結合パートナ−を含んで成る場合
、もしサンプル中にリガンドが存在すれば、試薬Ｘ及び
７間の該リガンドを介する間接的な複合体の形成が起こ
るであろう。

試薬Ｙは光学構造体の表面に直接又は間接に固定化され
得ることが理解される０例えば、試薬Ｙが抗体であれば
、光学構造体の表面にそれ自体結合する、試薬Ｙに対す
る抗一種抗体により、間接固定化が行われるであろう。

この明細書において、“表面プラズモン共鳴を示すこと
ができる光学構造体”なる語は、波長の所定のバンドに
わたる放射に関して光学的に活性であり、そして構造体
の表面特性に決定的に依存する表面プラズモン共鳴を示
すすべての構造体を定義する。好ましくは、この構造体
はあらかじめ形成された表面起伏形状を有し、そして金
属性回折格子の使用が特に好ましい、しかしながら、表
面プラズモン共鳴効果を示す他の光学構造体、例えば金
属コートプリズムもまた本発明の方法において使用され
る。

このような光学構造体の表面プラズモン（ＳＰＲ）特性
は、構造体を電磁放射、好ましくは単色放射、さらに好
ましくは偏光へ暴露せしめそして反射され又は透過した
放射をモニターすることにより観察することができる８
回折格子の使用及び該格子の線に対して横断する平面内
で偏光する光の形での照射が特に好ましい。

この明細書において使用する“リガンド類似体”なる語
は、測定されるリガンドのものと同じ特異的結合パート
ナ−の同じ結合部位と複合体を形成することができる種
を意味し、そして特にその範囲内で既知量の測定対象リ
ガンドを包含する。

この明細書で使用する場合、“光学的厚さ”なる語はそ
の物理的厚さとその屈折率の両方の間数である材料の複
合光学特性を定義する。それにリガンド−特異的結合パ
ートナ−複合体が結合する光学構造体例えば回折格子の
ＳＰＲ効果は結合した複合体の光学的厚さに厳密に依存
することが見出された。すなわち、リガンド−特異的結
合パートナ−複合体の形成により導入される光学構造体
のＳＰＲ効果の変化は、リガンド濃度の増加を伴わない
で結合層の光学的厚さを増加することにより増強され得
る。

この明細書において、“光学表面”なる語は、光学構造
体自体の表面のみを当然に意味するのではなく、文脈か
ら適当な場合には光学構造体の表面上に存在するすべて
の材料（例えば固定化された複合体）を包含する。

複合体の形成から生ずる光学表面の光学的厚さの増加は
、結合された複合体の物理的サイズ又は結合した複合体
の屈折率を大きくする試薬を試薬Ｘとして用いることに
より達成される。典型的には、複合体のサイズの増加は
１１００ｎ以上のオーダーであり、あるいは屈折率は１
．５〜２．０に増加するであろう、前記のように、試薬
Ｘはリガンド類似体、又は分析対象リガンドに対して特
異的な結合パートナ−を含んで成る。しかしながら、試
薬Ｘは、試薬Ｘ及び７間のあらゆる複合体形成（直接的
又は間接的）（光学構造体の表面上に結合した複合体を
導く）が前記のように光学表面のかなり増加した光学的
厚さをもたらすようなものでなければならない、リガン
ド類似体又は特異的結合パートナ−が、これを達成する
ためにそれ自体十分に大きくない場合、試薬Ｘは光学的
厚さ増強剤、例えばポリスチレンラテックス、ウィルス
、微生物、フェリチン、又は蛋白買、例えば第二の特異
的結合パートナ−への連結によって°′パラベルれた”
リガンド類似体又は特異的結合パートナ−であろう。

この発明の測定法の感度は、高屈折率（μ）を有する適
当な粒子、例えばガラスピーズμ〉０．２、特にμ〉２
．２を有するリチウムニオブガラスを含有する試薬Ｘの
使用によってさらに増強されよう。

このような試薬は結合した複合体のサイズ及び屈折率の
両者を増加せしめ、そして光学表面の付随する増加がこ
の発明の測定法のなお一層の改良を可能にする。

この発明の測定方法は、 １）試薬Ｙがリガンド類似体であり、そして試薬Ｘがリ
ガンドに対する特異的結合パートナ−であり、場合によ
っては光学的厚さ増強剤に連結されているような方法； ２）試薬Ｙがリガンドに対する特異的結合パートナ−で
あり、そして試薬Ｘが光学的厚さ増強剤に連結されてい
るリガンド類似体であるような方法；あるいは、 ３）試薬Ｙがリガンドに対する特異的結合パートナ−で
あり、そして試薬Ｘがリガンドに対する特異的結合パー
トナ−（試薬Ｙと同一であるか、又は異る）であり、場
合によっては光学的厚さ増強剤に連結されているような
方法； を包含する。

従って、試薬Ｘは任意の適当に太きなリガンド類似体、
又はリガンドに対する特異的結合パートナ−を含んで成
ることができる。すなわち、例えば、リガンドが抗原で
ある場合、Ｘはそれに対する比較的大きな抗体であるこ
とができ、このものは場合によっては試薬Ｘの光学的厚
さ増強性をさらに高める１又は複数の他の成分に結合し
ている。

あるいは、試薬Ｘはその表面にサンプル抗原（リガンド
）に類似する少なくとも１個の抗原決定基を有する成分
であって、固定化された試薬Ｙにより提供される特異的
結合部位に対するサンプル抗原（リガンド）と試薬Ｘと
の間の競争が起こり得るようなものでもよい。

前記のような場合によっては１又は複数の光学的厚さ増
強成分又は粒子に結合している、リガンドに対する第二
の特異的結合パートナ−の試薬Ｘとしての使用は、この
発明の方法の感度を改良するのみならず、前記のように
その特異性をも改良するであろう、すなわち、測定され
るべきリガンドが抗原又は抗体である場合、場合によっ
ては１又は複数の他の成分、例えばガラスピーズに連結
されている抗体又はそれに対して特異的な抗原を光学的
厚さ増強試薬Ｘとして使用することは特に好ましい。

この発明の方法は、ＳＰＲ効果撹乱技法を用いて測定さ
れ得るリガンドの範囲を、２Ｘ１０’ダルトンの分子量
を有するウィルスから、ステロイド、薬剤等のごとき低
分子量、例えば２００〜５００ダルトンを有するリガン
ドに至る広い範囲に拡大する。従って、このタイプの測
定技法はもはやリガンド自体の物理的サイズにより限定
されない。

この発明の変法は゛競争型”測定に適用することができ
る。すなわち、例えば、光学表面の光学的厚さは、ラテ
ックスのごとき比較的大きなパラベル”粒子に連結され
たリガンド類似体を試薬Ｘとして使用して増加せしめる
ことができる。リガンドに対する特異的結合パートナ−
を担持する光学構造体の表面に、測定されるべきリガン
ドを含有するサンプルと一緒に試薬Ｘを導入することに
より、試薬Ｙにより提供される結合部位に対する試薬Ｘ
とリガンドとの競争が許容される。試薬Ｘ及びＹの間の
複合体が、サンプル中のリガンドの濃度に逆比例する量
で形成されるであろう。

あるいは、試薬Ｘは測定されるべきリガンドに対する特
異的結合パートナ−によりコートされた大“ラベル″粒
子から成ることができ、そしてこの試薬Ｘをサンプル、
及び固定化されたリガンド類似体（試薬Ｙ）によりコー
トされた光学構造体と共にインキュベートすることがで
き、この結果試薬Ｘ及びＹの間で形成された複合体の量
はやはりサンプル中のリガンドの濃度に逆比例する。

この発明の他のＲ様においては、大きな゛′ラベル“°
成分をいわゆるサンドイッチアッセイにおいて使用する
ことができる。この場合には、リガンドは、光学構造体
の表面に固定化された特異的結合パートナ−（試薬Ｙ）
、及び光学的厚さ増強成分の表面上に担持された同一の
又は異る第二の特異的結合パートナ−（試薬Ｘ）の両者
と結合することができる。存在すればサンプルリガンド
が試薬Ｘと試薬Ｙとを連結し、三成分すべての間の複合
体分もたらす。

この発明の他の具体例においては、大きな凝集を可能に
して試薬Ｘ及びＹとの間のその後の複合体を形成せしめ
ることにより、結合層の光学的厚さの増強を達成するこ
とができる。

この発明の他の観点に従えば、アッセイを行うためのキ
ットが提供され、このキットは前に定義した試薬Ｘ、及
び前に定義した試薬Ｙがその表面上に固定化されている
光学的構造体を含んで成る。

試薬Ｘ及びＹの間の複合体の形成による光学構造体の光
学的厚さの増強はＳＰＲ効果をモニターすることにより
検出される。光学構造体が金属化回折格子であるこの発
明の好ましい具体例においては、該格子の線に対して横
断的な平面内で偏光された光を格子表面に向け、そして
複合体の形成により変化した表面プラズモン共鳴効果の
変化を検出する。すなわち、反射又は回折された光の強
さの急激な低下が存在する入射角を測定することができ
る。この急激な低下は、光エネルギーが格子の表面にカ
ップリングし、そして格子表面の光学特性、そして特に
光学表面の光学的厚さに依存する特定の角度において表
面プラズモゲン共鳴を惹起することにより生ずる。別の
方法として、入射角が一定に保持されそして放射光の波
長が変化して、表面の変化したＳＰＲ特性が検出される
。

この発明は後で、特にリガンドとして抗体又は抗原に言
及しながら記載される。しかしながら、この発明は抗体
又は抗原の測定に限定されると解してはならない、この
発明の方法により測定され得るリガンドの例を、各場合
に適当な特異的結合パートナ−と共に次の第１表に示す
。

以下余白 第１表 抗　原　　　　　　　　　特異的抗体 抗体　　　　抗原 ホルモン　　　　　　　　ホルモン受容体ホルモン受容
体　　　　　ホルモン ポリヌクレオチド鎖　　　相補的ポリヌクレオチド鎖ア
ビジン　　　　　　　　ビオチン ビオチン　　　　　　　　アビジン プロティンＡ　　　　　　免疫グロブリン免疫グロブリ
ン　　　　　プロティンＡレクチン　　　　　　　　特
異的炭水化物この発明の方法は非常に広範囲の用途を有
するか、特に、ホルモン類、例えばペプチドホルモン、
例えば甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモ
ン（ＬＨ）、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、卵胞
刺激ホルモン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）、インシュリン及びプロラ
クチン、又は非−ペプチドホルモン、例えばステロイド
ホルモン、例えばコルチゾール、エストラジオール、プ
ロゲステロン及びテストステロン、又は甲状腺ホルモン
、例えばチロキシン（Ｔ４）及びトリョードチロニン、
蛋白質類、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びアルファ
ーフェトプロティン（ＡＦＰ）、薬剤、例えばジゴキシ
ン（ｄｉｇｏｘｉｎ）、糖類、毒素類、ビタミン類、ウ
ィルス類、例えばインフルエンザウィルス、パラインフ
ルエンザウィルス、アデノウィルス、肝炎ウィルス、呼
吸器ウィルス及びＡＩＤＳウィルス、あるいは微生物、
の測定のために使用することができる。

この明細書において“抗体”なる語は、その範囲内に次
のものを含む。

（ａ）常用されるすべての動物、例えばヒツジ、ラビッ
ト、ヤギ又はマウスに由来するすべてのりラス又はサブ
クラスの免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩＢＭ。

（ｂ）モノクローナル抗体： （ｃ）抗体、すなわちモノクローナル抗体又はポリクロ
ーナル抗体の完全な分子又は゛断片”。この断片は抗体
の結合領域を含むもの、すなわちＦｃ部分を欠く断片（
例えばＦａｂ、　Ｆａｂ’　　、　Ｆ（ａｂ’）２）、
又は完全な抗体中で重鎮成分を連結するジスルフィド結
合の還元的開裂により得られるいわゆる゛″半分子”断
片である。

抗体の断片の調製方法は当業界においてよく知られてい
る。

この明細書において使用するパ抗原”なる語は、永久的
抗原種（例えば、蛋白質、細菌、細菌断片、細胞、細胞
断片及びウィルス）、及び適当な条件下で抗原性となる
ハプテンを包含すると理解されよう。

下記の一般的測定方式は本発明の特定の具体例を示す。

以下金白 凝集技漱 抗体は典型的には二価であり、そして蛋白質のごとき大
きな抗原はしばしば多価である。従って、１個の抗体が
同一の又は異る２個の抗原に同時に結合することができ
、あるいは複数の抗体が１個の抗原に結合することがで
きる。抗原及び抗体が溶液中で混合された場合、直接的
抗原−抗体反応がまず小複合体の形成を導く。抗体結合
部位の数が抗原結合部位の数に近い場合、抗体と抗原と
の間の大規模な架橋が起こり大きな凝集を発達せしめる
ことができる。

第１図は、測定されるべき種、すなわち抗原１４に対し
て特異的な抗体１２（試薬Ｙ）がその上に固定化されて
いる回折格子１０の表面を模式的に示す０次に、抗原１
４を含有するサンプル、抗原１４に結合することができ
　（そして抗体１２と同一でも同一でなくてもよい）特
異的抗体１６の形の試薬Ｘ、及び前記格子１０を同時に
、又は任意の望ましい順序で接触せしめ、形成された大
きな抗体−抗ｉｎ集体を抗体１２を介して格子の表面に
結合せしめる。格子上に形成された抗体／抗原複合体の
数を表面のＳＲＰ特性の変化により検出することができ
る。

溶液中での凝集体の形成の時間的経過は急速であるか、
しかしポリエチレングリコールのごとき追加の試薬を使
用して免疫沈澱を促進することができる。従って、ＳＰ
Ｒ効果を増強するために適当な回折格子の表面で凝集体
を形成するためにこの方法を使用することは一層長いイ
ンキュベーション時開をもたらさず、又は回折格子を基
礎とする測定に追加の処理段階を加えない８例えば、試
薬Ｘすなわち図中１６（特異的抗体）をサンプルに加撚
し、そして数分間凝集体を形成せしめた後、こうして増
強されたサンプルを、サンプル抗原１４に対して特異的
な鉢１２（試薬Ｙ）をその表面に固定化して担持する試
験回折格子に適用することができる。

別の方法として、凝集体を試験回折格子の表面で直接形
成せしめることができ、そして該表面のＳＰＲ効果の変
化を、凝集の形成が進行するに従って経時的にモニター
することができる。このタイプの測定系の他の変法は常
用のイムノアッセイ系に基礎を置き、この方法において
は、例えば、薬物のごとき小分子により凝集体の形成が
阻害される。

粒ｌシゴ９に 次の例は、規定されたサイズ並びに化学的及び光学的性
質を有する１又は複数の粒子に連結された、リガンドに
対する特異的結合パートナ−又はリガンド類似体を含ん
で成る試薬Ｘを使用する。

サンプルリガンド類似体又はリガンドに対する特異的結
合パートナ−ではなく、粒子自体がＳＰＲ効果により直
接測定される主たる成分である。

適当な粒子ラベルは小粒子、例えば１１００ｎの直径の
粒子の形成のために適当な材料を含んで成り、入射光が
結合した粒子を通過するように比較的透明であり、そし
て好ましくは高屈折率を有し、さらに好ましくは２．０
より大きい屈折率を有し、これによって表面プラズモン
効果が増強される０粒子の表面は、要求されるリガンド
類似体、又は特異的結合パートナ−１例えば抗原もしく
は抗体を、それに対して固定化することを許容する適当
な材料から作られるべきである０合成粒子は、例えばポ
リマー材料、例えばラテックス、ガラス、特にリチウム
ニオブガラス、コロイド状銀又は金、金属酸化物又はフ
ェリチンを含むことができ、そして天然粒子は細胞、例
えば微生物、ウィルス、澱粉粒及び花粉粒を包含する。

この様な粒子状ラベルを使用することができそして当業
界においてよく知られている常用のイムノアッセイ技法
に基礎を置き、それ自体はこの明細書中で検討していな
い幾つかの測定方式が存在する。

ａ）　肌争實順ｕし乞【 薬物やホルモンのごとき小分子は、競争的測定方式を用
いて多数の異る方法で測定することができる。

第２図に関し、反応体Ｘはその表面上に抗原２０（これ
はサンプル抗原２４と同一でもよく、同一でなくてもよ
い）を担持するラベル粒子１８を含んで成る０反応体Ｙ
は回折格子１０の表面上に固定化された特異的抗体２２
を含んで成る。サンプル抗原２４及び試薬Ｘが格子試験
ストリップと共にインキュベートされる場合、抗原２２
への結合についての競争がサンプル抗原２４と、粒子１
８に結合した抗原２０との間で起こる。試験格子１０の
表面に結合した粒子１８の量はサンプル抗原２４の濃度
と逆比例し、サンプル抗原２４の測定が可能であろう。

第３図は、他の競争的測定法を示す、この場合、試薬Ｙ
は固定化された抗原２８（これはサンプル抗原３４と同
一でもよく、又は同一でなくてもよい）を担持する回折
格子１０を構成し、そして試薬Ｘはサンプル抗原３４及
び固定化された抗原２８に特異的な抗体３２を担持する
ラベル粒子３０を含んで成る。サンプル抗原３４及び固
定化された抗原２８は抗体３２上の結合部位について競
争し、試験格子１０の表面に結合した試薬Ｘの量がサン
プル抗原の濃度に逆比例するであろう。

以下金白 ｂ）サンドイツ　・　　式 この方式は、抗体により認識されそして結合され得る１
個より多くの部位をその表面に担持するために十分に大
きな抗原に適用することができる。

これらの抗原は少なくとも２種類の抗体に同時に結合す
ることができ、そしてそれ故に抗体間を架橋することが
できる。

第４図に関し、二価サンプル抗原３４の場合において、
試験格子１０の表面に結合した抗体３６（試薬Ｙ）と試
薬Ｘを構成するラベル粒子４０の表面に結合した他の抗
体３８（これは抗体３６と同一でもよく、又は同一でな
くてもよい）の間で架橋が形成される０次に、結合した
試薬Ｘの量が決定され、従ってサンプル抗原３４の測定
が可能となる。サンプル抗原の濃度の増加が結合した試
薬Ｘの量の増加を生じさせる。

第５図は他のタイプのサンドイッチ測定を示し、この方
法においては多価サンプル抗原が測定される。多価サン
プル抗原６０が試験格子１０の表面に結合した抗体６２
（試薬Ｙ）と抗原６４　（これは抗体６２と同一である
か、又は同一でない）を含んで成る少なくとも１つの試
薬Ｘとの間の価橋を形成する。従って結合したサンプル
抗原６０の有効サイズが増加し、サンプル抗原６０の一
層鋭敏な測定が可能となる。

Ｃ）凝集測定方式 この発明の前記の具体例は、サンドイッチ−型イムノア
ッセイにおける抗体−抗原−抗体複合体の形成がいかに
して測定の感度及び特異性を増強し得るかを説明してい
る。これらの測定の感度をさらに増強するために粒子を
使用することができる。測定は直接凝集又は凝集阻害方
式を用いることができる。後者は、前記のような競争的
測定方式において小分子を測定するなめ使用される。

サンプル抗原又は抗体の存在下で生成する大粒子凝集体
を、特異性結合パートナ−（試薬Ｙ）の手段により回折
格子の表面上に捕捉することが提案される。−例におい
て、ラベルされた粒子の形の試薬Ｘがサンプルに加えら
れ、そしてリガンドが、もしそのサンプル中に存在する
とすれば、凝集を惹起するであろう、試験格子への粒子
で増強されたサンプルの添加が、表面への凝集体の捕捉
を可能にし、この表面でそれらが測定されるであろう。

あるいは、試薬Ｘ、サンプル、及び回折格子に付着され
た試薬Ｙの接触は、逐次的ではなく同時的であることが
でき、そして格子の表面への凝集体の形成の速度を測定
して測定対象リガンドを測定することができよう。

第６図は凝集測定方式を模式的に示す、不活性支持体粒
子３８は抗体４０を担持し、この抗体がサンプル抗原４
２と結合する。生ずる大凝集体４４が、格子１０の表面
上に固定化された抗体４６　（これは抗体４０と同一で
もよく、又は同一でなくてもよい）により回折格子１０
の表面に結合される。抗体４６が大凝集体の抗原４２に
結合し、そして次にサンプル抗原４２の量を測定するこ
とができる。

ム　゛アッセイ アルギン酸塩又はキト−サンのごとき炭水化物ポリマー
は、可溶性ポリマーとして又は不溶性ポリマーとして、
異る形態で存在することができる。

１つの形から他の形への移行はある種のイオンの添加に
より行われ得る。例えば、Ｃａ’　　は不溶性アルギン
酸塩を沈澱せしめる。この明細書中に記載するＳＰＲ測
定を強化するためにこの効果を使用することができるこ
とが提案される。例えば、試薬Ｘはリガンドによりラベ
ルされた長鎖ポリマーであることができる。この試薬は
、格子表面上の特異抗体（試薬Ｙ）への結合についてサ
ンプルリガンドと競争することができる。結合の後、結
合したポリマーを沈澱せしめるための展開溶液を測定の
前の加える。

例えば第７図に関し、長鎖ポリマー５０が抗原５２（サ
ンプル抗原５４と同一でもよく、又は同一でなくてもよ
い）によりラベルされる。このラベルされた抗原は、格
子表面に固定化された抗体５６上の結合部位について、
″遊離″サンプル抗原５４と競争する０次に、展開溶液
を加えて結合したラベルされた抗原（第７図ｂ、５８）
を沈澱せしめる。結合しそして格子１０の表面に沈澱し
たラベル化抗原５８の量はサンプル抗原５４の濃度に逆
比例する。

同様に、この様な沈澱性ポリマーを用いてサンドイッチ
方式のアッセイを開発することができる。

次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明するか、
これによりこの発明の範囲を限定するものではない。

Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＫｏｈｌｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ２
５６，４９５−４９７（１９７５）により報告された方
法により、マウス腹水液からモノクローナル抗体を得た
０個々のハイブリドーマセルラインからの抗体をスクリ
ーニングして、インフルエンザＡウィルスの別々の抗原
決定基に対する抗体を生産するセルラインを同定した。

インフルエンザＡウィルス、Ｘ−３１株に対して最高の
親和性を有する抗体を選択して測定において使用した。

捕捉抗体（抗体Ａ）を、０．１％ウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ）（シグマ・ケミカルス社、イングランド）を含
有するリン酸緩衝化塩（ＰＢＳ）中で５０μｇ／ｍ１で
使用し、そしてラベル抗体（抗体Ｂ）をＰＢＳ中５０μ
ｇ／…ｌで使用した。

２、　インフルエンザＡウィルスＸ−１３株の調！イン
フルエンザＡウィルスＸ−１３株を標準的方法で増殖せ
しめなく例えば、”Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｐｒｏｃｅ
ｄｕｒｅｓ　Ｆｏｒ　Ｖｉｒａｌ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉ
ａｌ　ａｎｄ　ＣｈｌａｍｙｄｉａＩｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｓ、第５版、Ｅ、）１．Ｌｅｎｎｅｔｔｅ及びＮ、Ｊ。

Ｓｃｈｍｉｄｔ、＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈ
ｅａｌｔｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ。

１９７９により発行、５９３〜５９４頁を参照のこと）
。ウィルスを、ポリエチレングリコールによる沈澱の後
、シュークロース密度勾配遠心により精製した。

使用に先立って、ウィルスを０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
中に稀釈した。

３、　　ｉ（Ｏｔ　　Ｏ”ｌ− 回折格子（６３３ｎｍピッチ、３５ｎｍ深さ）を射出成
形によりポリカーボネートで製造した。次に、この格子
を１０ｎｍの厚さのクロム層でコートし、次に１００ｎ
ｒａの厚さの金でコートした０両金属は真空下での熱蒸
発により沈着せしめた。

４１表厘プラズモン共鳴（Ｓ　Ｐ　Ｒ現象の・ＩＩ！−
表面プラズモン共鳴は第８図中に示される装置を用いて
発生せしめた。この装置は、抗体でコートされた回折格
子を照射する平面偏光された白色光の平行ビームを用い
る。次に、この光は鏡を介して前記の抗体コート回折格
子からブレーズ回折格子に向けられ、ここで光はその波
長成分に分けられ、そして２５６ピクセル光ダイオ一ド
列に集中される。この光ダイオード列は特定の波長にお
いて光強度を測定する。

インフルエンザＡウィルスを　　　るための−験祖 清浄な金コート回折格子を装置中に入れ、そしてワード
の異常律ｏｏｄ’ｓ　ａｎｏ糟ａｌｙ）　（回折格子の
表面プラズモン共鳴の発生によりもたらされる反射光強
度の最小）の波長を記録した。抗体Ａ又は０．１％ＢＳ
Ａ含有ＰＢＳの２５０μｌのアリコートをピペットによ
り格子の表面に置き、抗体を固定化した。これらのスト
リップを湿潤雰囲気中で３７℃にて６０分間インキュベ
ー１〜した。ストリップをＰＢＳで洗浄した後、ウィル
スの稀釈物又は稀釈剤の２５０μｌのアリコートをスト
リップに適用し、そして湿潤雰囲気中でわずかに撹拌し
ながら（８５ｒｐｍ）　３７℃にて２時間インキュベー
トした。

ＰＢＳによりさらに洗浄した後、抗体Ｂ又は稀釈前の２
５０μｌのアリコートをストリップに適用し、そして湿
潤雰囲気中でわずかに撹拌しながら（８５ｒｐｍ）　３
７℃にて１時間インキュベートした。

ストリップをＰＢＳで洗浄し、そして次に蒸留水で洗浄
しな。空気乾燥の後、ワードの異常（Ｗｏｏｄ’　ｓａ
ｎｏｅｍａｌｙ）を各ストリップについて読み取った。

第９図は、免疫的に活性な回折格子に結合するインフル
エンザウィルスにより惹起されるワードの異常の変位、
及び抗体がインフルエンザウィルス粒子に結合した場合
に得られる増強されたシグナルを示す。

以下余白 湘　ヒト血清中のインフルエンザウィルスに対ベルとし
てのインフルエン　ウィルスの肛 例１に記載したようにしてインフルエンザＡウィルス（
Ｘ−３０株）を増殖せしめそして精製した。

Ｂｒａｎｃｌ及び５ｋｅｈｅｌ、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ
　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、２３８（１９７２）、　１
４５−１４７頁に記載されているブロスライン法により
ウィルスからヘマグルチニンを抽出した。

２、（Σ折二Ａ仝）」り聾グ勺１１ インフルエンザＡウィルスについての赤血球凝集阻害測
定法において陽性のヒト血清及び陰性のヒト血清を、Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｍｅｃ
ｌｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｉｌｌ　Ｈｉｌｌ、ロ
ンドンから得た。血清を、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中
１　／２０　、１　／１６０及び１／１２８０稀釈物と
して、測定において試験した。

以下余白 ３、インフルエンザウィルスの弘艷 例１に記載したようにしてインフルエンザＡウィルスを
調製した。

４、金・　ａ　　　の・ 金属化回折格子を例１に記載したようにして調製した。

この装置は例１に記載した通りであった。

清浄な、金をコートした回折格子を装置に入れ、そして
ワードの異状（Ｗｏｏｄ’ｓ　ａｎｏｍａｌｙ）　（回
折格子上での表面フラズモン共鳴の発生によりもたらさ
れる反射光強度の最小）の波長を記録した。ヘマグルチ
ニン（Ｐ　Ｂ　Ｓ中５０μｓ／ｍｆｆ１）の２５０μｌ
のアリコートを回折格子上に拡げ、そして湿潤雰囲気中
で３７℃にて１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄
した後、ストリップを湿潤雰囲気中３７℃にて１時間、
ＰＢＳ中１％ＢＳＡと共にインキユベートした。ＰＢＳ
によりさらに洗浄した後、ヒト血清又は稀釈剤の２５０
μ！のアリコートを回折格子に適用し、そして湿潤雰囲
気中でわずかに撹拌（８５ｒｐｍ）　Ｌながら３７℃に
て２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、イ
ンフルエンザウィルス又は稀釈剤の２５０μｌのアリコ
ートを回折格子に適用し、そして湿潤雰囲気中でわずか
に撹拌しながら（８５ｒｐｍ）　３７℃にて２時間イン
キュベートした。次に格子をＰＢＳで洗浄し、次に蒸留
水で洗浄し、次に空気乾燥した後各ストリップについて
ラードの異状の位置を測定した。

第１０図はラードの異状の位置の変位をナノメーターで
示したものであり、ウィルス粒子ラベルの存在下及び非
存在下での回折格子への陽性抗体及び陰性抗体の異る稀
釈物の結合により得られたものである。

以下余白 肚　アビジンを　　　るためのアッセイにおスペーサー
分子ジアミノジプロピルアミン（ＤＡＰＡ）を介して酵
素パーオキシダーゼに接合したたビオチン、アビジン、
及びフェリチンブラベルされたアビジルの接合体はシグ
マ・ケミカル社、ロンドンから得た。

ビオチン−パーオキシダーゼ接合体は０．０５Ｍ炭酸／
炭酸水素緩衝液（ｐＨ９，６）中０．０６８ｍｇ／社に
し、そしてアビジン−フェリチン及びアビジンは０．０
５Ｍリン酸緩衝液＜ｐＨ７，４）に溶解した。

２、金　　口　　　の＝　１ 金属化回折格子は例１に記載したようにして調製した。

３、　　　プラズモン丑鳴（Ｓ　Ｐ　Ｒ）　　象のン　
−この装置は例１に記載したものと同一であった。

以下余白 実１１１友 金コート回折格子の各々に０．４ｒａｌのビオチン溶液
を加え、そして３７℃にて１．５時間インキユベートシ
た。炭酸／炭酸水素ＭＷＩ液で洗浄した後、格子を０．
４ｖａｌの炭酸／炭酸水素Ｍ衝液中０．１％ＢＳＡと共
に３７℃にて２時間インキュベートした。

炭酸／炭酸水素Ｍｆｆｌ液によりさらに洗浄した後、０
．４ｃｔｒｌの段階的に稀釈したアビジン又はアビジン
−フェリチン溶液を格子に添加し、そして３７℃にて２
時間インキュベートした０次に、格子をリン酸ｔｌｄＪ
ｆｌ液で選択し、次に蒸留水で洗浄した後空気乾燥し、
そしてラードの異状の位置を測定した。

第１１図は、ビオチンコート回折格子へのアビジン及び
アビジン−フェリチンの結合に後の、ラードの異状の位
置の変位をナノメーターで示すものである。フェリチン
の存在に基くシグナルの増加が明瞭に観察される。

【図面の簡単な説明】

第１　図〜第７図は本発明の方法の種々の態様を示す模
式図である。 第８図は、本発明の方法において使用する光学系を示す
模式図である。 第９図は、本発明の方法によりインフルエンザウィルス
の濃度を測定する場合のグラフである。 第１０図は、本発明の方法により血清中のインフルエン
ザ抗体を測定する場合のグラフである。 第１１図は、本発明の方法によりアビジン濃度を測定す
る場合のグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サンプル中のリガンドの測定方法であって、この方
   法は、 ａ）前記サンプル、 ｂ）試薬Ｘ、及び ｃ）表面プラズモン共鳴を示すことができる光学構造体
   の表面上に直接的又は間接的に固定化された試薬Ｙ、 を同時に、又は任意の順序でインキュベートすることを
   含んで成り、ここで試薬Ｘ及びＹの１つは前記リガンド
   に対する特異的結合パートナーを含んで成り、そして試
   薬Ｘ及びＹの他方はリガンド類似体又は前記リガンドに
   対する特異的結合パートナーを含んで成り、試薬Ｘは、
   試薬ＸとＹとの間の直接的又は間接的複合体の形成が、
   試薬Ｘの非存在下で支配的である光学表面の光学的厚さ
   に比べてかなり増加した光学的厚さを有する光学表面を
   もたらすようなものであり、 該方法は、光学構造体により示される表面プラズモン共
   鳴が前記複合体形成によって変化するか否か、そして所
   望により該変化の程度及び／又は速度を測定する段階を
   含んで成る方法。 ２、試薬Ｙがリガンド類似体であり、そしてＸが前記リ
   ガンドに対する特異的結合パートナーであり、場合によ
   っては光学的厚さ増強剤に連結されている、請求項１に
   記載の方法。 ３、試薬Ｙがリガンドに対する特異的結合パートナーで
   あり、そして試薬Ｘが光学的厚さ増強剤に連結されたリ
   ガンド類似体である、請求項１に記載の方法。 ４、試薬Ｙがリガンドに対する特異的結合パートナーで
   あり、そしてＸがリガンドに対する特異的結合パートナ
   ー（試薬Ｙと同一であるか又は異る）であり、場合によ
   っては光学的厚さ増強剤に連結されている、請求項１に
   記載の方法。 ５、試薬Ｘが形成された複合体の大きさを少なくとも１
   ００ｎｍ増加せしめる、請求項１に記載の方法。 ６、試薬Ｘが高い屈折率を有する、請求項１又は５に記
   載の方法。 ７、試薬Ｘが２．０以上の屈折率を有する、請求項６に
   記載の方法。 ８、前記光学構造体が回折格子である、請求項１〜７の
   いずれか１項に記載の方法。 ９、請求項１〜８項のいずれか１項に記載の方法を実施
   するためのキットであって、請求項１に定義される試薬
   Ｘ、及び請求項１に定義される試薬Ｙがその表面上に固
   定化される光学構造体を含んで成るキット。