FR2703788A1 - Dispositif et procédé anti-idiotype de détection immunologique. - Google Patents

Abstract

Il s'agit d'une invention permettant indifferemment la detection d'antigenes ou d'anticorps avec exactement le même dispositif et procédé. Ceci est rendu possible grâce à la technologie des immunoglobulines anti-idiotypes immobilisées sur un support et permettant de faire avec une très grande specificité et sensibilité, la difference entre un anticorps dont l'idiotype est complexé à son antigène, et un anticorps libre. L'échantillon est d'abord mis en contact avec des a anticorps marqués, puis avec un ruban (B) fin, transparent, supportant à sa face superieure les immunoglobulines anti-idiotype et à sa face inferieure un moyen de revelation de la traversée de B par les anticorps marqués provenant de (A) - s'ils sont complexés à leur antigène (dosage d'antigènes positif - figure 8 - planche VII) - si leurs sites de fixation en B ont été saturés par des anticorps sériques (dosage d'anticorps positif - figure 9 - planche VIII) Ces moyens de revelation restent incolores si les dosages sont negatifs, les anticorps marqués etant piegés dans ce cas à la surface superieure de B. (figure 7 - planche VI)

Description

DISPOSITIF ET PROCÉDÉ ANTI-IDIOTYPE DE DETECTION IMMUN:
La presente invention a pour but la determination qualitative et quantitative rapide d'un ligand dans un fluide.Elle est relative à un dispositif et un procédé basé sur la technologie des idiotypes et caracterisé,entre autres, par la possibilité de detecter des antigènes ou des anticorps concernant la même affection, avec exactement le même dispositif.Par exemple,un même dispositif de detection HIV va emettre un signal positif si l'echantillon contient des antigènes de virus HIV ou des anticorps anti-HIV.Il va aussi emettre un signal si llechantillon contient à la fois des antigènes et des anticorps.

Mais ceci n'empêche pas bien sûr de realiser des dispositifs qui ne detectent uniquement que des antigènes ou uniquement que des anticorps,grâce à l'addition de certains reactifs ou d'un element supplementaire au dispositif.

Le procédé est parallèlement basé sur des techniques de marquage des anticorps utilisés,originales et extrêmement performantes quand elles sont associées (en cas de signal colorimetrique) à des substrats hypersensibles,ce qui permet une detection fine par une grande sensibilité.

Le procédé objet de cette invention consiste en une immunofiltration en une seule etape et sans rinçages,d'une goutte (associant l'echantillon à tester et un (ou des) anticorps marqué(s) specifique de l'antigene recherché dans cet echantillon) à travers un support-ruban souple (qui sera decrit plus loin) ou tout autre support rigide (du type Porex par exemple),specialement traité par des immunoglobulines anti-idiotypes pour pieger les anticorps marqués par leur site immunologique specifique (appelé idiotype) uniquement lorsque ce site est libre de tout antigène,c'est à dire lorsque l'echantillon est dit
negatif,et laissant ces anticorps marqués traverser le ruban ou le support pour donner un signal ultra-rapide (chromogène ou autre) en quelques secondes sous ce ruban (au contact de moyens de revelation), lorsque l'echantillon est dit positif : les antigenes saturant alors les sites idiotypiques de ces anticorps marqués.

La detection d'anticorps dans l'echantillon est possible avec exactement le même ruban : une grande partie des anticorps recherchés (c'est à dire ayant le même idiotype que les anticorps marqués) contenus dans l'echantillon positif,entrent en competition (inegale car infiniment plus nombreux) avec les anticorps marqués au niveau des immunoglobulines anti-idiotype immobilisées sur le ruban : les sites idiotypiques d'une grande partie des anticorps recherchés dans l'echantillon,saturent rapidement les immunoglobulines anti-idiotype immobilisées qui ne peuvent plus pieger les anticorps marqués : ces derniers traversent alors le ruban et signalent en quelques secondes la seropositivé de 1' echantillon.

Ce procédé se differencie des precedents (qui vont être cités plus loin) par le fait que des immunoglobulines anti-idiotype,specialement preparées et immobilisées sur un ruban ou tout autre support,vont pieger TOUT anticorps (que ce soit humain ou de souris) se presentant à cette membrane ou à ce support,en se fixant aux idiotypes (du dit anticorps) qui se presentent libres de tout antigène.Par contre,si cet anticorps est saturé en antigène,ses sites idiotypes ne sont pas libres et les immunoglobulines anti-idiotypes ne le piegeront pas.De la même façon,si des anticorps seriques saturent les immunoglobulines anti-idiotype,l'anticorps marqué ne sera pas piégé et ira delivrer un signal de seropositivité.

Dans ce procédé,à l'inverse des procédés anterieurs,unC
double selection s'opère au niveau du ruban selectif - - saturation du ruban par les idiotypes de l'anticorps marqué libre de tout antigène (test antigène negatif) ou non-saturation par ces idiotypes fixés deja à leur antigène (test antigène positif)
2 - saturation du ruban par les idiotypes des anticorps humains recherchés (test positif) ou par les idiotypes des anticorps marqués associés à l'echantillon (test anticorps negatif).

En bref,trois hypotheses surviennent dans le fonctionnement de ce procédé
1 - negatif universel : l'absence d'antigène ou d'anticorps dans l'echantillon,aboutit exactement à la même reaction immunologique : pieger les anticorps marqués
2 - positivité en antigène : saturation DES IDIOTYPES
DES ANTICORPS MARQUÉS qui ne sont plus reconnus pas le ruban selectif dont les moyens sont pourtant intacts.

3 - positivité en anticorps : saturation DES
IMMUNOGLOBULINES DU RUBAN SELECTIF (par les anticorps seriques) qui n'a plus les moyens de pieger les anticorps marqués pourtant libres de tout antigène
Ce procédé se differencie donc bien du brevet français 90-12661 (PCT/FR91/00891) publié sous le numero 2667943 et concernant un procédé immunologique different : des immunoglobulines anti-enzyme ou anti-Fab, immobilisées sur un support,piegent des anticorps marqués lorsque leur enzyme n'est pas occulté par un antigène ou lorsque leur
site Fab n'est pas saturé par un antigène,mais laissant traverser ces anticorps marqués lorsqu'ils sont saturés en antigènes.Ces immunoglobulines ne fixent que les anticorps uitilisés pour le test et non les anticorps seriques.Par exemple : des immunoglobulines de chèvre,anti Fab de souris,vont pieger uniquement les anticorps de souris marqués utilisés pour le test,et non les anticorps seriques de l'echantillon à tester.

La première difference fondamentale est que chaque immunoglobuline anti-idiotype est hautement specifique (par definition) de chaque anticorps qui arrive sur la membrane : par exemple un anticorps monoclonal anti
Interleukine 2 arrivant sur la membrane,possède des sites idiotypiques hautement specifiques de l'Interleukine 2;ce sont ces sites idiotypiques anti-Interleukine 2 que les immunoglobulines immobilisées sur la membrane,elles mêmes hautement specifiques des sites idiotypes anti
Interleukine 2, vont pieger s'ils sont libres de toute
Interleukine 2.Chaque membrane va donc être preparée pour un diagnostic precis,comme par exemple ici,le dosage de l'interleukine 2. - Par contre,les immunoglobulines anti
Fab ou anti-enzymes decrites dans le brevet français 9012661 signalé plus haut,n'ont aucune specifité de diagnostic : quelquesoit l'antigène recherché,l'anticorps marqué non saturé en antigène, est piegé par les immunoglobulines anti-Fab : ces immunoglobulines anti-Fab ou anti enzymes etaient en fait un serum obligatoirement polyclonal puisqu'elles piegent tous les anticorps libres d'antigènes;par exemple : le produit Sigma referencé A4185 est un serum polyclonal de Chèvre reconnaissant tous les Fab de souris;ce serum piegera donc tous les anticorps de souris dont les sites Fab seront libres de tout antigène.L'avantage de ce procédé etait donc le caractère universel du dispositif de detection d'antigène
le même pouvait servir pour tout diagnostic;seul
l'anticorps marqué associé à l'echantillon etait specifique du diagnostic recherché.

Or,le site Fab d'un anticorps (de souris par exemple)est très vaste et comprend plusieurs sites (dont le site idiotype qui lie l'antigène):le serum (de chèvre par exemple) polyclonal anti-Fab (de souris par exemple) va donc contenir une forte majorité d'immunoglobulines,chacune specifique d'un site different sur la branche Fab des anticorps de souris,site auquel elle se liera qu'il y ait ou non antigène;autrement dit,une faible partie seulement de ces immunoglobulines anti-Fab va reconnaître sur la branche Fab les sites idiotypes specifiques de l'antigène recherché, alors que le reste de ces immunoglobulines anti-Fab vont se lier à tous leurs sites respectifs sur la branche Fab de souris,qu'il y ait ou non,un antigène fixé au site idiotypique de l'anticorps marqué.D'où un très mauvais rendement : seuls de très rares anticorps de souris,marqués,saturés en antigènes, vont echapper à la membrane supportant les immunoglobulines anti-Fab ; d'où un signal très faible et peu sensible de presence d'antigène recherché.Alors que si la totalité de la membrane est traitée avec des immunoglobulines antiidiotypes,le moindre anticorps marqué dont le site idiotype sera saturé en antigène,traversera cette membrane pour delivrer un signal,d'où une sensibilité infiniment plus elevée que dans le procédé cité plus haut.Certes,le dispositif n'est plus universel;;chacun sera specialement preparé pour un diagnostic precis.Mais avec la technique de marquage qui va être decrite plus loin et qui fait aussi l'objet de la presente invention, il suffira d'une quantité infinitesimale d'anticorps marqués pour fournir un signal interpretable (grâce notemment à des substrats ultrasensibles et à la presence de très nombreuses molecules de marquage
ultraperformant,greffées sur des anticorps monomères et non plus sur les inevitables polymères et agregats créés par les techniques precedentes au glutaraldehyde ou au periodate responsables d'un rendement-signal extrêment bas,qui etait plus ou moins voulu pour lutter contre le bruit de fond,phenomène inexistant dans le procédé objet de l'invention))
Seconde difference fondamentale : le brevet français 90/12661 cité plus haut,ne decrit que des dosages d'antigenes,et non d'anticorps.Ce qui est logique : les immunoglobulines anti-Fab de souris ne piegeront que les anticorps de souris et ne reagiront pas,comme les anti idiotypes,à la presence d'anticorps seriques.

Troisième diference fondamentale : la specificité du procédé objet de la presente invention est infiniment plus importante : il vient de s'averer qu'un serum polyclonal (de chevre par exemple) anti-Fab de souris reconnaissait un pourcentage non negligeable d' anticorps humains;or,dans un echantillon humain (sang ou plasma ou serum) à tester, il y a de très grandes quantités d'anticorps;;et ils vont entrer au niveau de la membrane,en concurrence avec les anticorps marqués de souris destinés à se complexer à l'antigène recherché c'est à dire que les immunoglobulines (de chevre) immobilisées sur la membrane,vont être completement saturées par les branches Fab d'anticorps humains et laisseront filer les anticorps marqués de souris,pourtant libres de tout antigène,ce qui va aboutir à un faux signal positif sous la membrane,alors qu'il n'y a pas d'antigènes dans l'echantillon.

Quatrième difference fondamentale : les immunoglobulines anti-idiotype ne reconnaissent que le site idiotype d'un anticorps qui arrive à leur contact quelque soit l'origine de cet anticorps : que ce soit un anticorps marqué monoclonal (de souris par exemple) utilisé pour être associé à l'echantillon,ou tous les
anticorps polyclonaux (seriques humains par exemple) possedant le même idiotype.Exemple : une immunoglobuline specifique d'un des idiotypes des anticorps anti-GP120
HIV,va reconnaître et pieger aussi bien le dit site idiotype d'un anticorps marqué monoclonal de souris anti
GP120,que le dit site idiotype d'un anticorps circulant serique humain anti-GP120.

Or, le même antigène possède plusieurs epitopes differents et provoque donc chez l'hôte,l'apparition d'un anticorps (possedant un site idiotype specifique de cet epitope) contre chaque epitope : ceci explique pourquoi le procédé objet de la presente invention peut utiliser plusieurs immunoglobulines anti-idiotype differentes,immobilisées sur le même support membranaire,et plusieurs anticorps monoclonaux marqués specifiques chacun d'un epitope de la proteine,pour le même diagnostic.

Exemple 1: un dispositif de detection d'anticorps anti
GP120 va utiliser, immobilisées sur le support membranaire,toute une serie d'immunoglobulines antiidiotype reconnaissant,chacune,un anticorps anti-epitope precis : ainsi les très nombreux anticorps seriques anti
GP120 (des microgrammes),bien que possedant chacun un idiotype different, vont tous être piégés sur le support membranaire qui va être totalement saturé : l'anticorps marqué de souris anti-GP120 associé à l'echantillon,ne sera pas piégé par les anti-idiotype (totalement saturéss) du ruban qu'il traverse pour signaler donc la seropositivité.

Exemple 2: l'antigène p24-HIV ne circule chez les patients seropositifs au debut,qu'en quantités infinitesimales (parfois inferieures à 50 picogrammes/ml) indosables par les techniques actuelles,ce qui constitue l'enorme danger des donneurs de sang seropositifs au debut.Cet antigène p24 possède de nombreux epitopes et il existe de nombreux anticorps monoclonaux de souris anti
p24 (chacun etant specifique d'un epitope du p24).En utilisant,non plus un,mais plusieurs anticorps monoclonaux de souris,marqués, anti p-24 (chacun etant dirigé contre un epitope different),il est possible de
detecter des quantités infinitesimales de p24 car chaque molecule d'antigène sera cernée par plusieurs anticorps monoclonaux hypermarqués rendant le signal visible.Sur le ruban, seront immobilisées des immunoglobulines anti-idiotype correspondant chacune à l'idiotype de chacun des anticorps monoclonaux marqués utilisés : en absence de p24,ces derniers seront tous piégés : pas de signal;alors qu'une quantité de 10 picogrammes/ml de p24 dans l'echantillon,masquera un nombre suffisant de leurs sites idiotype pour leur permettre de traverser le support membranaire et provoquer un signal.Ce qui explique l'extrême sensibilité du procédé.

Mais ceci explique egalement l'extrême specificité de cette technique : le signal ne sera visible que si chacun de tous les anticorps monoclonaux marqués anti-p24 a été saturé par son epitope correspondant de la p24.Ce problème de specifité est la cause de nombreux faux resultats car les techniques habituelles utilisent un seul anticorps monoclonal specifique d'un seul epitope de la p24 par exemple.Or,il arrive que cet epitope existe sur une autre proteine non concernée par le SIDA et le resultat est alors un faux positif.

Le procédé objet de la presente invention est donc un procédé immunologique original qui s'avère très performant en sensibilité et en specificité.

REVUE DE L'ART ANTERIEUR
Les precedentes methodes de determination de la presence ou de la concentration de substances antigeniques dans des fluides biologiques,par voie immunologique,sont à present bien connues;elles sont basées sur la formation d'un complexe entre la substance antigenique à determiner et un ou plusieurs anticorps,l'un des composants du complexe pouvant être marqué par un element radioactif(tel que l'Iode 125,par exemple),pour permettre sa detection et/ou son analyse quantitative après separation de l'antigène ou de l'anticorps marqué complexé,de l'antigène ou de l'anticorps marqué non complexé.

Dans les methodes de determination immunologique par competition,la substance antigenique contenue dans l'echantillon de liquide à analyser,entre en competition avec une quantité connue d'antigène marqué pour une quantité limitée de sites de fixation de l'anticorps : la quantité d'antigène marqué liée à l'anticorps est inversement proportionnelle à la quantité d'antigène contenue dans l'echantillon.

Des tests immunometriques particulièrement adaptés à la detection d'antigènes polyvalents,c'est à dire de substances antigeniques capables de se complexer avec au moins deux anticorps en même temps,consistent à utiliser une quantité d'anticorps non marqué lié à un support solide insoluble dans le liquide à analyser,et une quantité d'anticorps soluble portant un indicateur,tel qu'un isotope radioactif,qui permet la detection ou la determination quantitative du complexe ternaire formé entre l'anticorps en phase solide,l'antigène et l'anticorps marqé.Ces methodes consisitent à mettre tout d'abord en contact l'anticorps lié à la phase solide avec l'echantillon à analyser,pour extraire l'antigène de l'echantillon,par formation d'un complexe binaire entre
l'anticorps en phase solide et l'antigène.Après une periode d'incubation,le support solide est lavé pour en eliminer le residu d'echantillon liquide,y compris l'antigène eventuel n'ayant pas reagi,puis mis en contat avec une solution contenant une quantité connue d'anticorps marqué.Après une seconde periode d'incubation pour permettre à l'anticorps marqué de se complexer avec l'antigène lié au support solide par l'intermediaire de l'anticorps non marqué,le support solide est lavé une seconde fois pour enlever l'anticorps marqué n'ayant pas reagi;puis la presence d'anticorps marqué sur le support solide lavé est detectée (par exemple par mesure du rayonnement emis,si l'indicateur est un rayonnement
radioactif) et eventuellement soumise à un processus de determination quantitative.

Ces methodes sont connues sous le nom de methodes "sandwich" ou "bi-site",du fait que l'antigène porte deux anticorps liés à sa surface en deux sites differents.Elles sont decrites par WIDE dans "Radioimmunoassay Methods" (Kirkham et Hunter,E et S.

Livingstone,Ed. Edimbourg,1970,p 199-206).

Des applications specifiques (test de detection de l'antigène de l'hepatite) sont decrites dans le Brevet des Etats Unis d'Amerique NO 3 867 517 ; des variantes de ces methodes ("simultanées" ou "inverses") sont decrites par JEONG et al.dans "Comparison of RIA with a single incubation two-site immunoradiometric assy (IRMA) as applied to the determination of human thyroïd stimulating hormone (HTSH)",Bio-Rad Laboratories, 1979; dans le Brevet des Etats Unis d'Amerique NO 4 174 384 (marquage de deux anticorps par un chromophore fluorescent (fluoresceïne) et par un chromophore qui absorbe la lumière emise par la fluoresceïne); dans le
Brevet des Etats Unis d'Amerique NO 4 098 876.Ces methodes utilisaient initialement des anticorps polyclonaux,dont la sensibilité est insuffisante en
raison de l'existence d'une reactivité croisée avec d'autres antigènes.Le Brevet français Hybridtech NO 81 15030 publié sous le NO 2 487 983,a proposé de remplacer dans ces tests immunometriques,les anticorps polyclonaux par des anticorps monoclonaux,pour augmenter de façon importante la sensibilité de ces methodes.

Le Brevet français LIOTTA NO 82 16973,publié sous le NO 2 514 511,decrit un dispositif et un procédé pour determiner la presence d'antigènes dans des fluides biologiques,par la methode ELISA,tout en eliminant les operations de lavage et de dilution qu'elle necessite et en reduisant la durée dtincubation.Le dispositif proposé comprend une matrice formée d'un ruban en papier de nitrocellulose ou de diazobenzyloxymethyle (DBM),en gel poreux tel le polyacrylamide,agarose ou collagène,dans les pores duquel l'antigène peut être piégé ou bien il peut être reticulé avec le gel par l'intermediaire des groupes amines du ligand et des groupes carboxyles portés par la matrice,ou bien d'un ruban de cellulose ou de fibres de matière plastique à l'interieur duquel sont piégées des particules ou des billes qui contiennent le ligand.Conformément à ce brevet LIOTTA,le dispositif comprend
- une première zone qui contient des antigènes et des anticorps liés à une enzyme,ces anticorps etant situés dans la dite première zone de telle manière qu'ils soient eliminés de cette première zone quand ils ont reagi avec des antigènes non liés contenus dans l'echantillon à tester, traversant cette première zone,mais qu'ils n'en soient pas eliminés en l'absence de tels antigènes,
- et une seconde zone contenant une substance capable de reagir avec les dits anticorps liés à une enzyme,pour produire une reaction colorée revelant la presence des dits anticorps.

De façon specifique,le dispositif de dosage immunologique decrit par le brevet Liotta,comprend un
stratifié à trois couches de matrice poreuse dont la première est impregnée d'un anticorps specifique lié à une enzyme,la seconde couche poreuse contient un antigène de reference immobilisé (lié), et la troisième couche contient un substrat produisant une couleur,qui reagit avec l'enzyme liée à l'anticorps.L'antigène libre à doser present dans l'echantillon à analyser,mis en contact avec la première couche,diffuse dans la seconde,puis dans la troisième couche.L'antigène libre present dans l'echantillon entre en competition avec l'antigène de reference lié,immobilisé dans la seconde couche,pour se combiner à l'anticorps lié à une enzyme.Si l'anticorps lié à une enzyme se combine à l'antigène libre, il diffuse librement vers la troisième couche et produit une reaction colorée.Par contre,si l'echantillon à analyser ne contient pas d'antigène,tous les anticorps liés à une enzyme possèdent des sites de liaison libres et se combinent avec l'antigène immobilisé present dans la seconde couche;l'anticorps lié à une enzyme, qui se combine à l'antigène immobilisé dans la seconde couche,ne diffuse pas dans la troisième couche et aucune reaction coloré ne se produit.Le bervet français LIOTTA 87 08007,publié sous le NO 2 599 845 decrit une variante de ce dispositif,qui ne comprend que deux couches,dont la couche superieure porte l'antigène avec les deux anticorps reactifs et dont la couche inferieure contient un substrat chromogène,les deux zones (zone de piegeage et zone de substrat) pouvant egalement être juxtaposées.

Le Brevet americain HYBRIDTECH NO 4 632 901 ( et la demande internationale PCT correspondante NO 85/05451) decrit un procédé et un dispositif de realisations d'immunoassays qui ne necessitent pas le recours à des etapes d'incubation de longue durée associées à plusieurs lavages,et permettent par leur simplicité,la mise en oeuvre par un medecin,à sa consultation,et même par le patient chez lui.Ce dispositif comprend un premier
element poreux constitué par une membrane ou un filtre auquel est lié un anticorps,monoclonal ou polyclonal,qui reconnait l'antigène que l'on cherche à identifier,et un deuxième element,qui est absorbant et comporte des passages capillaires perpendiculaires à ses surfaces superieure et inferieure;;ce second element est en communication capillaire avec la membrane,ou analogue,poreuse,qui forme le premier element du dispositif,et presente une dimension de pores telle qu'il induise la traversée de liquide à travers le premier element sans application de moyens externes.La membrane filtrante peut être du Nylon portant des groupes NH2 auxquels les anticorps sont liés par covalence ,par couplage à l'aide de glutaraldehyde et l'element absorbant peut être en matière filtrante fibreuse telle que fibres d'acetate de cellulose,de polyester,de polyolefine,etc.Ces deux elements peuvent être separés l'un de l'autre par un autre element poreux ( en polyethylène par exemple ) qui ne fixe pas d'anticorps de façon non-specifique et empêche que de l'anticorps marqué ne se fixe de façon non-specifique sur la surface superieure de l'element absorbant.

De même la demande de Brevet Europeen ABBOTT
Laboratories NO 186 100 decrit un dispositif qui vise à determiner la presence ou la quantité d'une substance dans un echantillon à tester, et qui comprend une matrice fibreuse poreuse non-absorbante,telle que de verre,impregnée d'un polymère hydrophobe qui forme un revêtement de surface sur au moins une partie de la matrice et auquel est fixé un reactif,par exemple un anticorps ou un antiène,capable de reagir avec la substance recherchée dans 1' echantillon, ce dispositif pouvant être associé à une couche de matière absorbante sous-jacente et/ou à une couche de matière fibreuse telle que fibres de verre ou papier-filtre,qui recouvre la matrice fibreuse et peut jouer le rôle de pré-filtre.

La demande de Brevet europeen MUREX Corp. NO 206 561 fait egalement connaître un dispositif de diagnostic qui comprend un element filtrant comportant au moins une zone de reaction associée à au moins une zone peripherique,un element absorbant associé à uniquement à la zone peripherique du premier element et un element de maintien du filtre en position appropriée.La "reaction" qui se produit dans la zone de reaction peut aussi bien être une separation par filtration qu'un couplage immunologique et c'est dans la même zone, qu'apparaissent les signaux de lecture de la reaction.L'echantillon liquide parvient sur le filtre par un entonnoir dont l'orifice de decharge est calculé de telle manière que son diamètre soit suffisant,en combinaison avec la pression du liquide dans l'entonnoir,pour que le liquide se decharge sur la surface superieure du filtre mais ne traverse pas ce dernier,la pression hydrostatique etant,par la suite,ajustée de telle manière que le liquide penètre dans le filtre par gravité et est diffusé à travers ce dernier par action capillaire,sans le traverser perpendiculairement de part en part.

Le Brevet Unilever PLC No EP-A-274198 est une colonne de type chromatographique à travers laquelle s'ecoule le fluide de l'echantillon.Elle est constituée de support immobilisant des anticorps anti-enzymes associés à l'antigène identique à celui recherché de façon à pieger un anticorps specifique de cet antigène.Ce dernier anticorps est en fait un quadrome : un site Fab reconnait l'antigène tandis que le site Fab restant reconnait une enzyme.C'est en fait un moyen de marquage original mais le procédé est en fait identique aux brevets cités plus haut : un antigène immobilisé dans la colonne piège l'anticorps marqué qui n'a pas rencontré d'antigène dans 1' echantillon.

Le Brevet KONICA Corp. No EP-A-328106 est egalement une superposition de trois compartiments qui ont la même
fonction que dans le brevet objet de la presente invention mais il s'agit encore ici d'un piegeage des anticorps marqués libres par un antigène correspondant immobilisé dans le compartiment median.

Le brevet europeen Boehringer Biochemica Robin (0 303 110) concerne plutôt une filtration horizontale sur des bandelettes avec encore ici des antigenes immobilisés sur la zone selective,pour pieger les anticorps marqués en cas d'absence d'antigenes dans l'echantillon.

Tous ces procédés ont en commun un element filtrant,à travers lequel s'ecoule l'echantillon liquide à tester.La filtration est rendue selective par la presence à ce niveau,immobilisé,d'un antigène identique à celui recherché alors que dans le dispositif objet de la presente invention,la filtration est rendue hyperselective par la presence au niveau de l'element filtrant, d' immunoglobulines anti-idiotypes;de plus, tout cet art anterieur s'adresse exclusivement au dosage d'antigènes et non d'anticorps.

Mattiasson,Danielson,Hermansson et Mosbach (FEBS
Letters. 85 : p 203,1978) ont mis en evidence les changements qui interviennent dans les structures des proteines (antigenes par exemple) quand ces dernières ne se trouvent plus dans leurs conditions physiologiques,et proposent toute une serie de solutions interessantes.

A 1 'inverse,la litterature est abondante sur les hautes qualités de resistance,de conservation et de stabilité des immunoglobulines.

La presente invention s'est en consequence donné pour but de pourvoir à un dispositif et un procédé pour la determination qualitative et quantitative rapide de la presence d'un ligand reactif,dans un fluide,repondant mieux aux necessités de la pratique que les dispositifs
et procédés visant aux mêmes buts proposés dans l'art anterieur.

La presente invention a d'abord pour objet un dispositif pour la determination qualitative et quantitative rapides de la presence d'un ligand reactif, dans un fluide,du type comprenant (figure 1 - Planche I) deux elements separés
- un recipient (A) (poire de prelevement,tube ou tout autre) contenant une solution d'anticorps marqué et destiné à recevoir et diluer,une goutte de l'echantillon à tester (sang total ou plasma ou serum ou salive ou urines ou larmes ou liquide cephalo-rachidien ou tout autre liquide biologique).L'anticorps marqué peut être à l'etat lyophilisé si l'echantillon n'a pas besoin d'être dilué.

- Un ruban (B) sur lequel on depose une goutte provenant de A.

Ce ruban (fig 2 - planche I) supporte en certains endroits (voir plus loin, les exemples de montages) de sa face superieure les immunoglobulines anti-idiotype (IgAI),et à sa face inferieure des moyens de revelation R (par exemple chromogènes) signalant que les anticorps marqués provenant de A ont echappé aux immunoglobulines de la face superieure et traversé ce ruban.

Ce ruban est constitué de tout materiau poreux (papier,nylon, verre, supports Porex,etc..) transparent, de telle sorte qu'il n'est pas necessaire de retourner le ruban pour lire la coloration de B : le depôt de la goutte,puis quelques secondes après,la lecture se font donc à la face superieure du ruban qui peut être simplement collé sur n'importe quel support opaque de preference,ou simplement inséré dans un dossier medical ou epinglé à une fiche.

Pour realiser un dosage semi-quantitatif(fig.3 -
Planche II),l'echantillon est d'abord mis en contact avec un premier recipient (Al) contenant des anticorps NON
MARQUÉS (Y) cette fois,en quantité uniquement suffisante pour se lier à une certaine quantité seulement d'antigène;dans une seconde etape,le contenu du recipient Al est transféré au recipient (A2) contenant des anticorps marqués (*y*) cette fois : s'il y a excès d'antigène (fig.3+ Planche II),les antigenes encore libres après l'etape Aî,vont se lier en A2 aux anticorps (marqués cette fois ci) et les complexes traverseront la membrane selective B pour delivrer un signal d'excès d'antigenes.S'il n'y a pas d'exces d'antigenes (Fig 3
Planche II),ces derniers auront tous été liés en Al aux anticorps non marqués de la première etape,ce qui fait que les anticorps marqués de A2 ne seront pas saturés en antigene et seront piégés en B.

Selon une autre variante de realisation d'un dosage semi-quantitatif,une solution d'anticorps marqué est ajoutée au recipient Al dans un second temps,après incubation de l'echantillon avec le contenu de Al (anticorps marqué);ce qui evite d'utiliser un recipient
A2.

Conformément à la presente invention,il est possible de realiser des dosages quantitatifs,en associant la membrane de revelation B à un appareillage de quantification connu en lui même,tel que RIA (si le marquage est radio-actif),spectrophotomètre,etc.

Le contrôle de fonctionnement (fig 3) consiste à deposer la première goutte de A (echantillon+conjugué) dans un espace sur le ruban,bien signalé (en imprimant "CTRL" par exemple) et qui se colore de toutes façons (bonne conservation des reactifs),et une seconde goutte de A dans un second espace lui aussi bien signalé ("TEST" par exemple) dans lequel le signal n'apparait qu'en cas de test positif.Seul l'espace "test" ayant été preparé avec des immunoglobulines anti-idiotype.

Le dispositif objet de la presente invention se differencie bien des dispositifs suivants retrouvés dans l'art anterieur
- le brevet W0-A-8903039 (SARL CIS-TEST) decrit un dispositif fait de deux plaques perforées formant des reservoirs separés dans lesquels se font des reactions entre l'echantillon et des microbilles recouvertes de l'antigène identique à celui recherché.

- le brevet W0-A-8910564 (compagnie ORIS Industrie SA) decrit une double carte perforée enserrant des membranes dont la première supporte les anticorps marqués,et la seconde les antigenes identiques à celui recherché
- le brevet français 90/12661 (Carte rigide et technique anti-Fab)
Ces brevets decrivent tous des superpositions de membranes,chacune jouant un rôle different,mais ne possedent pas l'etape A de contact de l'anticorps marqué avec l'echantillon,avant le depôt de la goutte.

Ils ont en commun la lecture du resultat par retournement du dispositif alors que le dispositif objet de la presente invention offre une lecture du resultat vue de dessus par transparence.

De plus,ce sont des instruments obligatoirement rigides et opaques,des cartes soudées,etc.;alors qu'ici il s'agit d'un petit ruban.(facilement inséré dans un dossier medical par exemple).

Aucun d'eux n'integre le moindre contrôle de fonctionnement.

Aucun d'eux ne permet le dosage d'anticorps.

Enfin, ils integrent tous,à sec,des anticorps conjugués au niveau de leur membrane superieure afin de proceder directement au dosage par depôt de l'echantillon;alors
qu'ici il y a d'abord le passage de l'echantillon par un recipient (A) d'une part pour la dilution obligée des echantillons (qui seraient trop visqueux autrement) et surtout pour mettre en contact (par agitation mecanique intense ou vortex,notemment) l'echantillon avec les anticorps conjugués pendant un temps suffisant pour que l'eventuelle reaction antigène-anticorps marqué soit la plus complète possible;ce qui n'est pas le cas lorsque l'on depose intempestivement l'echantillon directement sur les anticorps marqués : les reactions ne se font que très partiellement (si elles se font).

Par ailleurs,la declinaison de cette première etape A permet de faire plusieurs tests differents : en utilisant non plus un recipient A mais un recipient Al contenant un anticorps marqué specifique d'un antigène 1,un second recipient,A2,contenant un anticorps marqué specifique d'un antigène 2,etc..Le ruban possedera alors un espace "TEST 1" traité par des immunoglobulines anti-idiotype 1,un espace "TEST 2" traité par des immunoglobulines anti-idiotype 2,etc..et un seul espace "CTRL".

Cet exemple peut très bien s'appliquer aux marqueurs tumoraux : la detection d'un cancer digestif debutant est plus efficace si trois ou plusieurs marqueurs differents sont en excès,alors que pris separément,ils sont peu specifiques : exemple : cancer du colon : le CEA (antigène carcino-embryonnaire) n'est augmenté que dans 55% des cas,le CA 19-9 que dans 60% des cas,le CA 15-5 que dans 45% des cas et l'AFP (alpha foeto proteibne) que dans 50% des cas.Par contre,lorsque au moins trois marqueurs sont en excès,ils signent 99% des cancers du colon.Ainsi un dispositif à trois rubans (ACE,CA 19-9,CA 15-5) où seulement un des marqueurs est en excès,ne doit pas inquieter,alors que si les trois tests delivrent un signal d'excès,il y a une très forte probabilité de cancer et des explorations poussées doivent être effectuées,ciblées sur la sphère digestive.

Mais il est egalement possible de reduire ces trois recipients (Al A2 A3) à un seul recipient en y associant les trois anticorps marqués specifiques des trois marqueurs : s'il y a signal,c'est qu'au moins un des trois est en excès : à ce moment là, il faut proceder à un test avec les trois recipients differents pour savoir lequel des marqueurs est en excès et surtout si c'est un ou tous les marqueurs qui sont en excès.Cet exmple est aussi valable pour les differents antigenes HIV ou pour toute affection impliquant plusieurs parametres.

La presente invention a egalement pour objet un procédé de determination qualitative et quantitative rapide de la presence d'un ligand reactif dans un fluide,qui est caractérisé en ce qu'au cours d'une première etape,un echantillon de fluide à analyser est mis en contact dans un recipient (A),avec un anticorps marqué,en ce qu'au cours d'une seconde etape,le produit de cette première reaction entre en contact avec des immunoglobulines (specifiques de l'idiotype de l'anticorps marqué de A) immobilisées sur un support B et aptes
- soit à pieger très rapidement l'anticorps marqué provenant de A s'il n'est pas saturé en antigènes (dosage d'antigenes negatif)
- soit à le laisser traverser B (pour provoquer un signal à la face inferieure de B) s'il est saturé en antigenes (dosage antigenes positif)
- soit aptes à être saturées par les anticorps seriques recherchés (possedant donc les idiotypes identiques à ceux des anticorps marqués de A,et donc reconnus par les dites immunoglobulines anti-idiotypes immobilisées en B) et donc laisser traverser B pour un signal de seropositivité (dosage anticorps positif).

Si le ligand recherché est un antigène,l'anticorps marqué (en A) forme avec lui un complexe qui va traverser la membrane selective B,tandis que l'anticorps marqué est
piégé en B en absence d'antigene dans l'echantillon.

Si le ligand recherché est un anticorps,il va y avoir competition au niveau de B entre les anticorps seriques (dont l'idiotype est identique à celui de l'anticorps marqué) et les anticorps marqués (de A) qui ont été associés à l'echantillon : les immunoglobulines antiidiotype de la membrane selective B sont rapidement submergées et saturées par l'idiotype des anticorps seriques arrivant en quantités enormes (un sang seropositif en HIV contient des quantités enormes d'anticorps anti-HIV).Les anticorps marqués ne rencontrent plus d'immunoglobuline anti-idiotype encore disponible sur la membrane B et la traversent pour delivrer plus bas,un signal de seropositivité.Ce signal n'est donc pas dû au passage d'un complexe antigeneanticorps marqué à travers B mais plutôt au "nonpiegeage" par B,des anticorps marqués;;ce "non-piegeage" etant dû à la saturation rapide et importante de la membrane selective B par les idiotypes des anticorps seriques.

Ce "non-piegeage d'anticorps marqués,pourtant libres" constitue une des originalités de cette invention et la grande difference avec l'art anterieur.

Ainsi donc,ce procédé retrouve un certain aspect universel,en ce que le même dispositif detecte indifferemment la presence d'antigenes ou d'anticorps.

Se pose alors le problème de la coexistence serique chez certains patients, d'anticorps et d'antigènes.

Dans ce cas,le procédé de detection des anticorps (associés à des antigenes parasites) consistera à associer dans le recipient A,une certaine quantité seulement d'anticorps non marqués pour neutraliser les antigenes parasites circulants.Ces anticorps non-marqués ne seront d'aucune gêne pour la membrane selective B car ils ne portent pas le même idiotype que les anticorps
marqués (ils reconnaissent d'autres epitopes de l'antigène,et n'ont donc pas le même idiotype que les anticorps marqués);or la membrane selective B ne piège que les idiotypes des anticorps marqués ou les anticorps seriques possedant le même idiotype que celui des anticorps marqués.Ces anticorps non marqués ajoutés en A aux anticorps marqués,vont donc traverser B qu'ils soient ou non saturés en antigènes.Donc la presence d'antigènes parasites lors de la recherche d'anticorps seriques,ne posera plus de problemes.

Tandis que le dispositif de detection d'antigenes seriques (avec des anticorps parasites dont certains vont obligatoirement posseder l'idiotype rconnu par B) consistera à immobiliser en A (par des microbilles ou sur les parois ou sur un pré-filtre en fibre de verre) des antigenes qui piegeront les anticorps parasites,laissant ainsi la membrane selective B (libre de tout idiotype parasite) pieger les anticorps marqués non saturés en antigenes.

Ce procédé se revèle être infiniment plus precis,sensible et specifique que les procédés cités plus haut et qui consistaient à pieger les anticorps marqués (non saturés en antigenes) par des antigenes ou par des immunoglobulines anti-Fab ou anti-enzymes.Il obeit à une logique simple : cibler sur l'anticorps marqué,le site exact de reaction immunologique (le site idiotype),seul lieu de fixation de l'antigène quand il existe.Et non plus cibler toute la zone Fab de l'anticorps marqué,très peu specifique de la presence ou de l'absence d'antigene.

EXEMPLES DE PREPARATION DE DIVERS DISPOSITIFS
EXEMPLE 1
PREPARATION D'UN DISPOSITIF DE DOSAGE ANTIGENE HBs
1 - Preparation des anticorps monoclonaux marqués : JS1 et JS2
2 - Preparation des immunoglobulines anti-idiotype
AJS1 et AJS2
3 - Preparation du support membranaire B
4 - Mode operatoire du dosage
1 - Les anticorps monoclonaux anti-HBs sont obtenus à partir d'immunisation de souris par l'antigene HBs puis selectionnés parmi tous les anticorps obtenus,pour leur haute affinité et specificité.

Marquage retenu : Fe(CN)6 Hexaferricyanure
Nombre : 2 numerotés JS1 et JS2 reconnaissant chacun un epitope different de l'antigène HBs.

2 - Les immunoglobulines anti-idiotype (dirigées contre le site idiotype de JS1 et de JS2) sont obtenues par immunisation de chèvre par des fragments selectionnés après digestion de JS1 et JS2.Après plusieurs etapes de purification sur colonne,sont retenus deux clones (AJS1 et AJS2) très specifiques du site de liaison de JS1 et de
JS2 à leur epitope respectif de HBs
3 - Le support membranaire : Un ruban de nylon (Pall) de 2 cm2,divisé au crayon en deux carrés sur lesquels on imprime à gauche "TEST" et à droite "CTRL" (contrôle).Au
centre du carré "test"on depose 10 microlitres d'une solution contenant les immunoglobulines anti-idiotype
AJS1 et AJS2 à raison de 10 microgrammes de chaque par ml de PBS+BSA (Bovine serum Albumine).Tandis que sur le carré "ctrl" on depose une solution de PBS+BSA uniquement.Au bout de trois heures on rince et seche.

Puis on retourne la membrane et on depose sous chaque carré,3 ul d'une solution alcoolique de benzidine à 1mg/ml.

Les carrés "CTRL" vont se colorer de toutes façons au contact de l'echantillon contenant les conjugués car ces derniers,avec ou sans antigènes recherchés,ne seront pas retenus à la face superieure de la case "ctrl" et iront colorer le substrat.

Les carrés "TEST",supportant les immunoglobulines antiidiotype,piegeront à la surface superieure de B,les anticorps marqués non saturés en antigènes,qui ne pourront donc pas entrer en contact avec le substrat de la face inferieure.Par contre si les anticorps marqués sont saturés en antigenes,ils traversent B et entrent au contact du substrat pour produire un signal.De même,si des anticorps seriques saturent la surface de B par leurs idiotypes,l'anticorps marqué traversera B pour emettre le signal de seropositivité.

5 - Mode operatoire
- on prelève une goutte de sang total ou de plasma ou de serum de 10 microlitres que l'on verse dans le recipient A contenant 90 microlitres d'une soultion d'anticorps conjugués concentrés à 10 microgrammes/ml dans une solution contenant TRIS 0,1 M,BSA 1%,PEG 1%,Antibiotiques (Gentalline et Mycostatine),serum de veau foetal 1%,Antitrypsine,Aprotinine.

Vortex 30 secondes au moins.

- on prelève de A 50 microlitres que l'on depose en
B sur le carré "ctrl" : un spot bleu apparait immediatement par transparence : les reactifs sont bien conserves.

- on prelève les 50 microlitres restants que l'on depose sur le carré "test" et on obtient les resultats suivants notés 0 à +++ en fonction de la concentration d'antigène HBs dans le serum
(1 UI = 1 nanogramme/ml)
Taux HBs en UI/ml
0 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 100
Intensité du spot 0 +/- + ++ ++ +++ f++ +++
Limite de sensibilité : 0.001 UI/ml = 1 picogramme/ml
EXEMPLE 2
DOSAGE ANTICORPS ANTI-HBs
Même montage, même dispositif. Même prelevement.Même depose
On prelève 50 microlitres d'un serum connu seronegatif en anticorps anti-HBs : le test fonctionne comme un dosage d'antigène negatif : pas de coloration.

Si on prelève 50 microlitres d'un serum seropositif connu en anticorps anti-HBs,on obtient les intensités de coloration suivantes en fonction des dilutions opérées sur le serum
Taux de dilution : 1/100.000 1/10.000 1/1000 1/100
Signal obtenu : +/- + ++
EXEMPLE 3:
DOSAGE SIMULTANÉ DE p24-GP40-GP120 (virus HIV)
1 - Les anticorps et les peptides p24-GP40 et GP120 sont aimablement offerts par Innogenics : deux monoclonaux pour chaque proteine,issus d'immunisation de souris par ces peptides.

2 - le marquage choisi est triple,pour amplifier le signal
- ferritine pour le fer
- haptoglobine pour exalter la ferritine
- nitrate d'argent pour amplifier le spot de substrat
3 - Neutralisation des eventuels anticorps seriques
Des microbilles à très grand pouvoir de fixation des proteines (Lab.IBF France) sont traitées avec des peptides issus de virus HIV et placées en solution dans un recipient A0 qui va recevoir en premier l'echantillon à tester.Les anticorps seriques parasites vont s'y fixer immediatement.Le surnageant est alors versé dans les differents recipients suivants (voir plus loin) pour être au contact des anticorps marqués.

4 - Les immunoglobulines de B sont preparées à partir des anticorps monoclonaux fournis et sont specifiques des idiotypes de ces derniers, puis fixées sur une membrane de 4 cm de long et de 1 cm de large,divisée donc en quatre carrés : 1er carré imprimé:"p24" - 2ème carré "GP40" - 3ème carré "GP120" - 4ème carré "CTRL"
Après le rinçage et sechage,on retourne la membrane et on depose un spot de 3 ul de benzidine à 1 mg/ml au centre de chaque carré.

MODE OPERATOIRE
On prepare un recipient marqué au feutre :"A-p24" avec 90 microlitres de la solution contenant cette fois les deux anticorps monoclonaux marqués anti p-24.

Puis un second recipient "A-GP40" avec 90 microlitres de la solution d'anticorps marqués anti GP40,puis un troisième recipient "A-GP120" avec aussi ses anticorps marqués anti-GP120.

On verse 10 microlitres de serum à tester provenant du premier recipient A0 (donc debarassé d'anticorps parasites) dans chacun des recipients.

Agitation au vortex 30 secondes.

On preleve 50 microlitres de n'importe quel recipient et que l'on depose sur le carré "contrôle",on attend la coloration avant de proceder aux 3 tests.

Puis on depose 50 microlitres de "A-p24" sur le carré noté p-24,50 microlitres de "A-GP40" sur le carré noté
GP40 et 50 microlitres du recipient "A-GP120" sur le carré noté GP120.

En fonction de la presence ou de l'absence de ces antigenes,on obtient les resultats schematisés dans la figure 4 - planche III et dans la figure 8 - planche VII
Les limites de sensibilité obtenues sont de 10 picogrammes/ml.

EXEMPLE 4:
DOSAGE SEMI-QUANTITATIF DU D-DIMERE DANS LE PLASMA
Figure 5 - Planche IV
Le dosage du D-Dimère et d'autres precurseurs du fibrinogène sont d'actualité et très prometteurs pour detecter la formation de caillot avant que l'embolie ne se produise.Il est possible de faire un diagnostic de pré-infarctus ou de pré-embolie pulmonaire ou de pré-ACV (accident vasculaire cerebral) ou de pré-phlebite.Il est
bien sûr plus interessant d'intervenir sur un patient avant qu'il ne fasse son infarctus : les traitements et les consequences sont bien moins graves.

Le D-Dimère circule dans le sang chez tous les etres humains à un taux inferieur à 0,4 microgrammes/ml de plasma.Au delà,le pronostic d'embolie est très elevé mais n'est pas de 100% : toutes les personnes avec un D-Dimère elevé ne font pas d'embolie.Par contre,100% des personnes ayant moins de 0,4 microgrammes de D-Dimère ne font pas d'embolie.Il s'agit donc d'un diagnostic d'exclusion,très utile en urgences,en cardiologie,ou en suivi de reanimation après une intervention chirurgicale ou devant toute suspicion d'accident imminent : il permet de diriger le diagnostic et le traitement et permet surtout d'eviter ce taux élevé d'embolies pulmonaires postoperatoires ou dans les troubles du rythme cardiaque très generateurs d'embolies.Tout comme il evite des contraintes et soins inutiles à des patients chez lesquels il y a certitude qu'il n'y aura pas d'accident embolique.

Les anticorps anti-D-Dimère sont le 2F7 et le 9C3.

Les immunoglobulines dirigées contre leurs idiotypes sont A2F7 ET A9C3
Le D-Dimère est fourni lyophilisé en flacons de 1mg à reconstituer avec 1 ml d'eau distillée sterile.Le poids moleculaire du D-Dimere est identique au PM de ses anticorps.Donc parité de poids.

Tous ces produits ont été aimablement offerts par la société Stago-Diagnostica (Asnières-France).

Le principe du dosage semi-quantitatif retenu,va consister à neutraliser 0,4 microgrammes/ml de D-Dimere dans un echantillon par des anticorps NON-MARQUÉS.Pour cela on opere de la façon suivante
1 - Dans un recipient Al contenant une solution à 0,4 microgrammes/ml d'anticorps 2F7 NON-MARQUÉ et 0,4 mg/ml d'anticorps 9C3 NON-MARQUÉ (Parité de poids moleculaire),on verse un egal volume de plasma à tester et on vortexe fort pendant 30 secondes.

L'equivalent de 0,4 microgrammes/ml de D-Dimère est pris en sandwich entre le 9C3 non marqué et le 2F7 non marqué.Ce complexe va traverser la membrane selective B sans donner la moindre coloration.

2 - Puis on verse le contenu de Al dans un recipient A2 contenant les anticorps 2F7 ET 9C3 MARQUÉS aux sels de mercure (marquage faible) cette fois et on vortex 30 secondes.Si le taux de D-Dimere est superieur à 0,4 ug/ml,des complexes D-dimere et anticorps marqués se forment pour delivrer un signal d'excès à travers B.

3 - On depose 50 microlitres sur le carré de contrôle avant de deposer 50 microlitres sur le carré de test.Resultats
Taux de D-Dimère dans l'echantillon (;Lg/ml):
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,45 1 5
Signal obtenu
0 0 0 O +/- ++ +++ +++
EXEMPLE 4:
DOSAGE SEMI-QUANTITATIF DE L'ANTIGENE SPECIFIQUE
PROSTATIQUE (PSA)
Cet exemple est interessant car c'est en fait un dosage semi-semi-quantitatif,c'est à dire qu'à l'interieur même du dosage semi-quantitatif,se trouve une limite entre
adenome et carcinome.

Le PSA n'existe pas chez les sujets jeunes et est produit entre 0 et 4 nanogrammes/ml de serum en cas d'adenome benin.Il depasse beaucoup ce taux dans l'adenocarcinome de la prostate pour s'elever jusqu'à par fois 100 nanogrammes /ml.

30% des adenomes benins de la prostate peuvent devenir cancereux.

Il serait donc très interessant de pratiquer un suivi regulier des hommes atteints d'adenome pour signaler très tôt l'apparition d'un adeno-carcinome qui peut être bien traité par les nouvelles molecules à action hormonale antagoniste,sans avoir recours à une chirurgie lourde et eviter les metastases vertebrales,fatales.

Le dispositif (fig 6 - planche V) sera donc un ruban de 3 cm de long (3 carrés) sur 1 cm de large et va comprendre un carré imprimé "PSA" pour le dosage qualitatif : le PSA existe ou non,un second carré imprimé " > 4ng/ml"pour le dosage semi-quantitatif avec 4 nanogr/ml comme limite : la coloration se produit si le taux est superieur,et enfin le carré de contrôle.

Mode operatoire
1 - Dans un recipient A contenant un anticorps MARQUÉ anti-PSA,on verse 50 microlitres de serum à tester selon les modalités des exemples precedents.Vortex.

2 - Dans un autre recipient A1,contenant 4 nanogrammes/ml (parité de poids moleculaire) d'un anticorps NON-MARQUÉ anti-PSA,on verse 50 autres microlitres du même serum à tester et on vortexe 30 secondes.Si le taux de PSA est inferieur à 4 ng/ml,il n'y a plus de PSA libre.Les anticorps non marqués anti
Psa,restés libre ne se fixent pas sur la membrane selective car ils ont des idiotypes autres que ceux
reconnus par la membrane selective.

3 - Dans un recipient A2 contenant un anticorps MARQUÉ cette fois,on verse le contenu de A1.Si le taux de PSA est superieur à 4 ng/ml,des complexes se forment avec l'anticorps marqué pour delivrer le signal d'excès.

La membrane B sera preparée avec des immunoglobulines dirigées contre l'idiotype des anticorps marqués anti-PSA
On depose d'abord 50 microlitres de A sur le carré "CTRL".Si coloration, on poursuit les operations.

On depose 50 microlitres de A sur le carré "PSA" pour uniquement detecter la presence ou l'absence de PSA.

Puis on depose 50 microlitres de A2 sur le carré " > 4ng/ml" pour detecter l'excès de PSA.Les resultats obtenus sont illustrés figure 6 - planche V

Claims (7)

REVENDICATIONS

1 - Procédé detectant indifferemment des antigènes ou des anticorps avec le même dispositif,caracterisé en ce qu'au cours d'une première etape,un echantillon est mis en contact dans un recipient A avec un (ou des) anticorps marqué(s) specifique(s) de l'antigène de l'affection recherchée,puis en ce qu'au cours d'une seconde etape,le produit de cette première reaction est mis en contact avec un element poreux B supportant,immobilisées,des immunoglobulines anti-idiotypes specifiques de l'idiotype du (ou des) anticorps marqué(s).

2 - Procédé selon la revendication l,caracterisé en ce qu'il permet de realiser des dosages semi-quantitatifs d'antigène par neutralisation au cours d'une première etape dans un recipient A1 ,d'une certaine quantité seulement d'antigènes (considérée comme physiologique) par des anticorps non marqués et surtout n'ayant pas le même idiotype que celui reconnu par les immunoglobulines de B,en ce qu'au cours d'une seconde etape,le produit de cette première reaction est mis en contact dans un second recipient A2 avec un (ou des anticorps marqués) avant d'être mis en contact avec B.

3 - Procédé selon la revendication 1,caracterisé en ce qu'il est apte à detecter x antigènes differents en même temps à partir du même echantillon,en ce qu'au cours d'une première etape,l'echantillon,divisé en x parties est placé dans x recipipents differents contenant chacun un anticorps marqué specifique de l'un des x antigènes recherchés; et en ce qu'au cours d'une seconde etape,le

produit de cette première reaction est mis en contact avec x elements poreux supportant à leur face superieure une association d'immunoglobulines anti-idiotype aptes à pieger tous les anticorps marqués utilisés si les sites idiotypes de ces derniers sont libres de tout antigène,et aptes à les laisser traverser cet element poreux B,si leur site idiotype est saturé par l'antigène correspondant, pour entrer en contact avec des moyens de revelation de la presence de cet antigène.

4 - Procédé selon la revendication 1,caracterisé en ce qu'il permet de realiser des dosages semi-semiquantitatifs en revelant au cours d'une première etape la presence pathologique ou l'absence d'un antigène,puis en revelant au cours d'une seconde etape si le taux d'antigène,dejà anormalement present (comme dans plusieurs affections chroniques benignes),est superieur au taux limite generalement admis,impliquant une transformation maligne de cette affection benigne.Le procédé consistera donc en un dosage qualitatif simple comme decrit dans le revendication 1,dans un premier temps,puis en un dosage semi-quantitatif comme decrit dans la revendication 2,dans un second temps.Les deux dosages utilisant exactement le même element B.

5 - Dispositif de determination indifferente de la presence d'antigène ou d'anticorps dans un echantillon,caracterisé en ce qu'il comprend

- un recipient A contenant le ou les anticorps conjugués specifiques de l'affection recherchée,destiné à recevoir et eventuellement diluer un echantillon de fluide biologique,pour mettre en contact au cours de cette première etape du procédé,un eventuel ligand contenu dans l'echantillon,avec le ou les anticorps conjugués specifique(s) du ligand recherché,

- un ruban B poreux du type papier,nylon,fibre de verre, microbilles, agarose, latex, transparent ou translucide,et supportant

- à la surface superieure DE CERTAINES ZONES seulement appelées zones "TEST",des immunoglobulines anti-idiotype (specifiques de l'idiotype de ou des anticorps conjugué(s)) aptes à pieger tout anticorps marqué dont l'idiotype est libre de tout antigène(dosages antigène et anticorps negatifs),et aptes à laisser cet anticorps marqué traverser ce ruban B en cas de presence d'antigene recherché ou d'anticorps recherché dans l'echantillon à tester.

Les zones restées vides,sans immunoglobulines antiidiotype,appelées zones "CTRL" (contrôle) servent à evaluer la validité de tous les reactifs (avant de proceder au test proprement dit) par coloration du spot de substrat par l'echantillon contenant le conjugué,et ceci quelle que soit la presence ou l'absence de ligand recherché dans l'echantillon,du fait que dans ces zones "CTRL",il n'y a pas d'immunoglobulines anti-idiotype.

B,ces moyens pouvant être,mais pas uniquement,un spot ou des traits de substrats chromogenes.

- et sur TOUTE sa face inferieure des moyens de revelation du passage des anticorps marqués à travers

6 - Dispositif selon la revendication 5,caracterisé en ce qu'il permet de realiser des dosages semi-quantitatifs d'antigènes,et comprenant

- un premier recipient Al dans lequel l'echantillon est mis en contact avec des anticorps non-marqués aptes à neutraliser une certaine quantité seulement,considérée comme physiologique,d'antigènes

- un second recipient A2 recevant après un certain

temps,le contenu de Al et contenant des anticorps marqués cette fois,destinés à se lier aux eventuels antigènes en excès,qui sont restés libres après l'etape Al

- un support poreux B identique à celui precedemment decrit, qui contient à sa face superieure des immunoglobulines anti-idiotype specifiques des idiotypes des anticorps marqués (mais non specifiques des idiotypes des anticorps non marqués de la première etape Ai) et destinées à pieger les anticorps marqués quand le taux d'antigènes est inferieur ou egal à la valeur limite normale,soit à laisser passer ces anticorps marqués (complexés aux antigenes en excès) vers la face inferieure de B pour les mettre en contact avec les moyens de revelation.

7 - Dispositif selon la revendication 5,caracterisé en ce qu'il permet de detecter plusieurs antigenes en même temps, et comprenant

- x recipients contenant chacun un anticorps marqué specifique d'un des x antigenes,ces recipients etant destinés à recueillir chacun, au cours d'une première etape,une partie de l'echantillon à tester.

-- et les moyens de revelation à la face inferieure

-- 1 carré non reactif pour le contrôle de fonctionnement

-- x carrés reactifs (supportant les immunoglobulines anti-idiotype de tous les anticorps marqués utilisés),chacun de ces carrés recevant une goutte du recipient correspondant

- un support poreux B presentant