JPH04249769A - 免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、流体試料中の微量成分
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を測定する方
法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】すなわち、１９５８年にベルソン（Ｂｅｒ
ｓｏｎ）とイアロウ（Ｙａｌｌｏｗ）が、放射性同位元
素Ｉで標識した牛インシュリンと糖尿病患者血清中の抗
インシュリン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測
定することに成功して以来、ラジオアイソトープを用い
た免疫学的測定法が広く用いられて来た。そして、これ
以後、標識物質として放射性同位元素以外のものも種々
開発されて来た。例えば、酵素、酵素基質、補酵素、酵
素阻害物質、バクテリオファージ、循環反応体、金属及
び有機金属の錯体、有機補欠分子族、化学発光性反応体
及び螢光性分子等が挙げられる。

【０００４】免疫学的測定法は、均一免疫測定法と非均
一免疫測定法に大別される。すなわち、抗原抗体反応生
成物（Ｂｏｕｎｄ体）と非反応物（Ｆｒｅｅ体）の分離
（Ｂ／Ｆ分離）が必要な非均一免疫測定法と、Ｂ／Ｆ分
離の必要のない均一免疫測定法とに大別される。このう
ち、測定対象物質が高分子である場合には、Ｂ／Ｆ分離
が必要な非均一免疫測定法が利用されている。

【０００５】ところで、この非均一免疫測定法における
Ｂ／Ｆ分離の操作は、抗原抗体反応を停止させることな
く、吸引、遠心分離、フィルター濾過などの手段により
行われている。しかしながら、このような物理的操作に
よるＢ／Ｆ分離は、操作そのものが煩雑であり、このた
め時間が掛かり、例えば遠心分離時に抗原抗体反応も進
行することから、抗原抗体反応が迅速に進行する場合（
例えば、担体として微粒子が用いられる場合は、抗原抗
体反応は速い）、時間のバラツキがあると測定は不正確
なものとなる。

【０００６】

【発明の開示】抗原抗体反応は、抗原又は抗体の多量の
添加により、瞬時に飽和に達し、実質的に、途中までの
抗原抗体反応は停止することが知られている。そこで、
この手法を応用し、Ｂ／Ｆ分離に際して抗原又は抗体を
多量に添加して抗原抗体反応を停止させればとのことが
考えられるが、サンドイッチアッセイ系への適用は不可
能であった。すなわち、反応型式がサンドイッチ法の場
合に、例えば単なる抗原を多量に添加したのでは、この
添加量も測定値に上乗せされるものとなり、何を測定し
ているのか判らないものとなるからである。

【０００７】このようなことから、更に検討が鋭意押し
進められて行った結果、遊離状態と固定化された二種の
抗体のうち、一方にのみ結合してその活性を消失させる
物質を添加すれば、サンドイッチアッセイ系において特
異的シグナルを変動することなく、抗原抗体反応を停止
できるに至ることに気付いた。すなわち、本発明の目的
は、正確な測定値を得る技術、つまり簡単な技術で、特
異的シグナルを変動させることなく、免疫反応を停止さ
せることができる技術を提供することである。

【０００８】この本発明の目的は、反応型式がサンドイ
ッチ法による免疫学的測定方法が行われるに際して、遊
離状態の抗体と固定化抗体の二種の抗体のうち、一方の
抗体とのみ結合し、その活性を消失する物質が添加され
ることを特徴とする免疫学的測定方法によって達成され
る。尚、一方の抗体とのみ結合し、その活性を消失する
物質は、二つの抗体の抗原決定基のうち一方の抗体のみ
の抗原決定基を有する物質であり、二つの抗体の性質に
より任意に選択できる。例えば、種の異なる抗原物質と
か抗原のうち一方の抗体の抗原活性基を含む部分を化学
的な処理や酵素的な処理により欠如させた抗原類縁体と
か一方の抗体に対する抗イデオタイプ抗体が挙げられる
。このような物質の添加量は結合可能な抗体の量と等モ
ル以上であれば良いが、免疫反応を速やかに停止させる
為に１０倍量以上であることが好ましい。

【０００９】そして、反応型式がサンドイッチ法によっ
て試料中の特定成分を分析するに際して、免疫反応させ
た後、不溶化担体と結合した反応生成物と非反応物とを
分離する操作を行う前に、遊離状態の抗体と固定化抗体
の二種の抗体のうちの一方の抗体とのみ結合し、その活
性を消失する物質を添加して免疫反応を停止させ、そし
てＢ／Ｆ分離の操作を行い、最終的に不溶化担体に結合
した標識を測定することにより、Ｂ／Ｆ分離の操作時間
の違いにかかわらず試料中の抗原が正確に分析されるの
である。

【００１０】本発明において、試料としてはあらゆる形
態の溶液、コロイド溶液などが使用しうるが、好ましく
は生物由来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、脳脊
髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。 本発明により測定しうる流体試料中での特定成分は、そ
の特定成分に特異的に結合する物質（例えば抗体）が存
在しうる物質（物質群）である。すなわち、ポリペプチ
ド、蛋白質、複合蛋白質、多糖類、脂質、複合脂質、核
酸、ホルモン類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等
が挙げられる。具体的には、特開昭６２−９０５３９号
公報や特開昭６３−１３１０６２号公報に記載の物質（
物質群）を挙げることができるが、これらに限定される
ものではない。

【００１１】本発明に用いられる標識物質としては通常
の免疫測定方法で一般に使用できるものを使用でき、例
えば放射性物質、発光物質、螢光物質、酵素などが挙げ
られ、又、酵素基質、酵素及び酵素前駆体の活性を変化
させる物質（酵素阻害物質、補欠分子族、補酵素）、酵
素前駆体、アポ酵素、螢光物質なども使用できる。具体
的な物質としては、特開昭６２−９０５３９号公報など
に記載のものが挙げられるが、好ましくは酵素、又は螢
光物質であり、さらに好ましくはβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペルオキシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ
、アミラーゼなどの酵素である。

【００１２】これらの酵素を標識物質とする場合、酵素
反応系、発色系は公知のものを使用できる。具体的には
、特開昭６１−２９２０６０号公報、特開昭６２−９０
５３９号公報、特開昭６３−１３１０６２号公報、特開
昭６３−４５５６２号公報、特願昭６３−２１９８９３
号明細書に記載の物質（物質群）が挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。

【００１３】そして、これら標識物質の抗体への結合は
、当業者間で知られている公知の試薬と方法で行うこと
ができ、例えば石川　　栄治、河合　　忠、宮井　　潔
編「酵素免疫測定法（第２版）、医学書院、１９７８年
」や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時増刊特集第５
３号「臨床検査の為のイムノアッセイ−技術と応用−、
臨床病理刊行会、１９８３年」などに記載された方法を
参考にすることができる。

【００１４】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４ない
し８８参照）で精製して用いることができる。

【００１５】あるいは、抗原で感染した哺乳動物など（
例えばマウス）の脾臓細胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）
から雑種細胞（ハイブリドーマ）を得てモノクローナル
抗体を作成し、これを特定成分と特異的に結合しうる物
質として使用すると特異性が向上し、好ましい。 又、これらの抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、
ＩｇＥ各分画を用いることができ、或いはこれらの抗体
を酵素処理してＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２　
といった活性抗体フラグメントにして使用しても良い。 さらに、これらの抗体は単一で使用しても、複数の抗体
を組み合わせて使用しても良い。

【００１６】本発明の免疫測定方法による反応型式はサ
ンドイッチ法であり、通常の例えば２ステップあるいは
１ステップいずれの型式のものでも良いが、洗浄操作が
加えられない１ステップのものであることが好ましい。 本発明で使用する抗原は特異抗体と反応するものであり
、ハプテン及びその誘導体を含有する。

【００１７】抗体を結合させる不溶化担体の形態として
は通常のサンドイッチ法に使用されるものが使用でき、
例えばビーズ、プレート、膜、チューブ等が挙げられる
が、粒状体が好ましく、特に微粒子が好ましい。不溶化
担体の材料としては、アガロース、セルロース、架橋デ
キストラン、ポリアクリルアミド、セルロース、微結晶
セルロース、架橋アガロース、架橋ポリアクリルアミド
、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二酸化チタン、硫酸
バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ砂、又はポリスチレ
ンやポリ塩化ビニル等の各種の合成樹脂のほか、多孔質
の素材、さらには磁性微粒子が利用できる。上記不溶化
担体は数種を混合して用いても良い。

【００１８】好ましくはアガロース、架橋アガロース、
架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアク
リルアミド、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、セル
ロース、微結晶セルロース等であり、更に好ましくはポ
リアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリスチ
レン、微結晶セルロース等である。抗体は、これら不溶
化担体に、当業者で公知の方法で化学的及び／又は物理
的に直接、あるいは間接的に結合させることができる。

【００１９】結合法については１９７６年、講談社発行
、千畑一郎ほか２名編「実験と応用アフィニティクロマ
トグラフィー」（第１刷）、１９７５年、講談社発行、
山崎誠ほか２名編「アフィニティクロマトグラフィー」
（第１版）を参考にできる。結合反応後、標識抗体の非
特異反応を排除する目的で、測定すべき特異的反応に関
与しない蛋白質を担持させることができる。それらの代
表的な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常血清蛋白質
、アルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コラーゲン
及びそれらの分解物質等が挙げられる。

【００２０】又、上記の非特異吸着抑制蛋白質は、不溶
化担体に担持させるだけでなく、免疫反応時に、その一
定量を免疫反応溶液中に添加することにより、一層非特
異吸着の抑制効果が上がる。Ｂ／Ｆ分離は、フィルター
を用いての濾過手段、遠心分離手段、吸引手段などで行
え、又、不溶化担体として磁性微粒子が用いられた場合
には磁気的な分離手段を用いることもできる。

【００２１】標識に起因した信号は、吸光度法（比色法
）　、螢光法、発光法あるいは放射活性測定法などで検
出することができ、測定法としては信号の経時的変化を
測定するレート測定法または一定時間後の信号を測定す
るエンドポイント測定法で測定することができる。

【００２２】

〔実施例１〕

〔抗体の調製〕常法にて人血清から精製した人ガラクト
ース転移酵素（以下、Ｈ−ＧＴ）２０μｇを、フロイン
トアジュバントと共にＢａｌｂ／ｃマウスに２週間毎に
３回腹腔内及び皮下に注射した。最終注射の３日後に脾
臓を取り出し、常法にしたがいポリエチレングリコール
を用いてマウスミエローマ×６３．８−６．５．３と細
胞融合を行った。

【００２３】ＨＡＴ培地にて選択後、ＥＬＩＳＡ法にて
スクリーニングを行い、活性の得られたクローンを限界
希釈法にてクローニングした。その結果、Ｈ−ＧＴと反
応し、牛ミルクガラクトース転移酵素（シグマ社製、以
下Ｂ−ＧＴ）と反応しない抗体を産出するクローンＡ−
１とＡ−２とが得られた。又、Ｈ−ＧＴとＢ−ＧＴとの
両方に反応性を有する抗体を産出するクローンＢ−１と
Ｂ−２とが得られた。

【００２４】各ハイブリドーマから得られたモノクロー
ナル抗体のクラスは、Ａ−１，Ａ−２，Ｂ−１がＩｇＧ
１　，Ｂ−２がＩｇＧ２ａであった。次に、単離精製し
たモノクローナル抗体Ａ−１の３０μｇを、フロイント
のアジュバントと共にＢａｌｂ／ｃマウスに２週間毎に
４回皮下注射した。最終注射の３日後に脾臓を取り出し
、同様に細胞融合を行った。スクリーニングは、Ａ−１
のＨ−ＧＴへの結合の阻害反応を検出した。その結果、
Ａ−１に結合し、Ｈ−ＧＴへの結合を阻害する抗体を産
出するクローンＩ−１を得た。モノクローナル抗体Ｉ−
１のクラスはＩｇＧ３　であった。モノクローナル抗体
Ｉ−１は他の抗Ｈ−ＧＴ抗体であるＡ−２，Ｂ−１，Ｂ
−２とは結合しないことが確認された。

【００２５】得られた５種のモノクローナル抗体は、常
法通り、マウス腹水から、プロテイン−Ａアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーにより精製された。そして
、常法に従い、グルタルアルデヒド法によりペルオキシ
ダーゼと結合した後、ゲル濾過を行うことによりペルオ
キシダーゼ標識抗体Ａ−１及びＢ−１が得られた。 〔人血清中Ｈ−ＧＴの測定〕ポリスチレンビーズ（直径
６．３５ｍｍ、積水化学社製）を、精製したモノクロー
ナル抗体Ｂ−２を１０μｇ／ｍｌの濃度に加えたリン酸
緩衝液（以下、ＰＢＳ）に４℃で一晩浸漬し、固定化し
た。この後、１％ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）
ＰＢＳ溶液で４℃において１日かけてブロッキング処理
した後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中にストックした
。

【００２６】人血清５０μｌにＰＢＳ２００μｌを加え
、上記Ｂ−２固定化ビーズ１個を加え、室温で反応させ
、下記の４通りの処理を行った。例−■では、１時間後
にビーズをＰＢＳで洗った。例−■では、１時間後にＢ
−ＧＴ３００μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液５０μｌを加え、そ
の後直ちにビーズをＰＢＳで洗った。

【００２７】例−■では、１時間後にＢ−ＧＴ１０μｇ
／ｍｌＰＢＳ溶液５０μｌを加え、さらに３０分後にビ
ーズをＰＢＳで洗った。例−■では、１時間後にＰＢＳ
５０μｌを加え、さらに３０分後にビーズをＰＢＳで洗
った。各々、ＰＢＳで洗浄後、５μｇ／ｍｌの濃度で１
％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に溶解したペルオキシダーゼ標識
抗体Ａ−１を２５０μｌ加え、室温で１時間反応させた
。ＰＢＳで洗浄後、３ｍｇ／ｍｌの濃度のｏ−フェニレ
ンジアミンと０．０２％の過酸化水素を含む５０ｍＭク
エン酸緩衝液（ｐＨ５．０）３００μｌを加え、室温に
て３０分間発色反応を行った。この後、１Ｎ硫酸１ｍｌ
を加え４９２ｎｍの吸光度を測定した。

【００２８】この測定結果は、例−■のものでは吸光度
が０．３０４、例−■のものでは吸光度が０．３１２、
例−■のものでは吸光度が０．３０９であったのに対し
て、例−■のものでは吸光度が０．４１０であった。こ
のことから、Ｂ−ＧＴの添加により実質的に免疫反応の
停止していることが判る。

【００２９】〔実施例２〕オイパーギットＣ２５０Ｌ（
ローム＆ファーム社製）と精製モノクローナル抗体Ａ−
２のＰＢＳ溶液（３ｍｇ／ｍｌ）を４℃にて一晩混合、
反応させた後、ＰＢＳにて洗浄し、この後１Ｍグリシン
バッファー（ｐＨ８．０）にて一晩静置した。次に、１
％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に４℃で一晩静置し、蒸留水にて洗
浄後凍結乾燥を行い、Ａ−２固定化微粒子担体を調製し
た。

【００３０】５０本の試験管に順次調製した微粒子担体
１０ｍｇ、ペルオキシダーゼ標識抗体Ｂ−１（１μｇ／
ｍｌの濃度の１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）４００μｌ、さ
らに人プール血清３０μｌを添加した。室温にて１０分
間攪拌後、２５本の試験管には２００μｇ／ｍｌの濃度
のＢ−ＧＴのＰＢＳ溶液５０μｌを加え、他の２５本の
試験管には加えることなしに、順次５本ずつ遠心分離（
１０００ｒｐｍ、１分間）し、溶液の吸引を行った。 ＰＢＳ１ｍｌを加えた後、遠心分離、吸引の一連の操作
を３回繰り返した後、実施例１と同様にｏ−フェニレン
ジアミンにより発色反応を行い、４９２ｎｍの吸光度を
測定したので、その結果を下記に示す。 これによれば、Ｂ−ＧＴの添加により免疫反応は実質的
に停止し、測定値のバラツキは小さいことが判る。これ
に対して、Ｂ−ＧＴ無添加の場合は、遠心分離、吸引の
Ｂ／Ｆ分離操作のタイムラグにより免疫反応が進行し、
後で操作したものほど測定値は高い値であり、結果的に
測定値が大きくばらついていることが判る。

【００３１】〔実施例３〕ペルオキシダーゼ標識抗体Ｂ
−１の代わりにペルオキシダーゼ標識抗体Ａ−１を使用
した以外は、実施例２と同様に免疫反応を行った。２５
本の試験管にはＢ−ＧＴの代わりに１００μｇ／ｍｌの
濃度のモノクローナル抗体Ｉ−１のＰＢＳ溶液５０μｌ
を加えた。残りの２５本には加えなかった。そして、実
施例２と同様に、５本ずつ遠心分離（１０００ｒｐｍ、
１分間）吸引操作を行い、発色反応を行、４９２ｎｍの
吸光度を測定した。

【００３２】この測定結果は、Ｉ−１の添加例では吸光
度の平均値が０．５１０２で変動係数が２．６２％であ
るのに対して、Ｉ−１の無添加例では吸光度の平均値が
０．５９０２で変動係数が６．９３％であった。このこ
とより、実施例２の場合と同様に、抗イデオタイプ抗体
添加により免疫反応は停止し、測定値のバラツキは小さ
いことが判る。特許出願人　　コニカ株式会社代　　理
　　人　　宇　　高　　克　　己

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　反応型式がサンドイッチ法による免疫
   学的測定方法が行われるに際して、遊離状態の抗体と固
   定化抗体の二種の抗体のうち、一方の抗体とのみ結合し
   、その活性を消失する物質が添加されることを特徴とす
   る免疫学的測定方法。
2. 【請求項２】　　一方の抗体とのみ結合し、その活性を
   消失する物質が抗原類縁体である請求項１の免疫学的測
   定方法。
3. 【請求項３】　　一方の抗体とのみ結合し、その活性を
   消失する物質が抗イデオタイプ抗体である請求項１の免
   疫学的測定方法。