JPH05297004A - 固定化担体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 流体試料中の特定成分を正確に、精度及び再
現性良く定量できる技術を提供することである。 【構成】 試料中の特定成分と特異的に結合する物質を
不溶性の担体に固定化する方法であって、固定化に際し
てｐＨ濃度及び／又は塩化ナトリウム濃度を変化させる
固定化担体の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、流体試料中の微量成
分、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を測定する
に際して用いられる固定化担体の製造方法に関するもの
である。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】すなわち、１９５８年にＢｅｒｓｏｎとＹ
ａｌｌｏｗが、放射性同位元素Ｉで標識した牛インシュ
リンと糖尿病患者血清中の抗インシュリン抗体を用い
て、血清中のインシュリンを測定することに成功して以
来、ラジオアイソトープを用いた免疫測定法が広く用い
られて来た。そして、これ以後、標識物質として放射性
同位元素以外のものも種々開発されて来た。例えば、酵
素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオファ
ージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠
分子族、化学発光性反応体及び螢光性分子等が挙げられ
る。

【０００４】ところで、免疫測定が行われるに際して
は、抗体などが固定化された担体が用いられる。この固
定化担体は、特定のｐＨ及び特定の塩化ナトリウム濃度
に設定された抗体溶液中に担体を入れることによって製
造されている。そして、このような手法を用いてのポリ
クローナル抗体が固定化されてなる担体を用いての免疫
測定においては、感度の点で問題が残されており、改善
が求められている。

【０００５】

【発明の開示】本発明の目的は、流体試料中の特定成分
を正確に、精度及び再現性良く定量できる技術を提供す
ることである。この本発明の目的は、試料中の特定成分
と特異的に結合する物質を不溶性の担体に固定化する方
法であって、固定化に際してｐＨ濃度及び／又は塩化ナ
トリウム濃度を変化させることを特徴とする固定化担体
の製造方法によって達成される。

【０００６】以下、本発明をさらに詳しく説明する。免
疫反応に際して用いられる流体試料中の特定成分と特異
的に結合する物質（測定対象により抗体、抗原、レクチ
ン、プロテインＡなどが挙げられるが、特にポリクロー
ナル抗体）が固定化される不溶性の担体としては粒状
体、プレート状といったものが有り、如何なるタイプの
ものでも良い。不溶性担体の材料としては、アガロー
ス、セルロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミ
ド、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、
架橋ポリアクリルアミド、ガラス、シリカゲル、ケイ藻
土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、
ケイ砂、ポリスチレン等の各種の合成樹脂のほか、多孔
質な素材、さらには磁性微粒子などが利用できる。好ま
しくはアガロース、架橋アガロース、架橋デキストラ
ン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ガ
ラス、シリカゲル、ポリスチレン、セルロース、微結晶
セルロース等であり、更に好ましくはポリアクリルアミ
ド、架橋ポリアクリルアミド、ポリスチレン、微結晶セ
ルロース等である。これらの不溶性担体は数種を混合し
て用いても良い。

【０００７】ポリクローナル抗体は、これら不溶性担体
に、当業者に公知の方法で化学的及び／又は物理的に直
接、あるいは間接的に結合させることができる。結合法
については１９７６年、講談社発行、千畑一郎ほか２名
編「実験と応用 アフィニティクロマトグラフィー」
（第１刷）、１９７５年、講談社発行、山崎 誠ほか２
名編「アフィニティクロマトグラフィー」（第１版）を
参考にできる。ここで、特に、大事なことは、結合に際
してｐＨ濃度及び／又は塩化ナトリウム濃度を変化させ
ることである。すなわち、ポリクローナル抗体は何種類
かの抗体が混在したものであるが為、ｐＨや塩化ナトリ
ウム濃度を特定の最適条件下に保持して固定化処理をし
たとしても、全ての抗体にとって最適条件であることは
なく、すなわち総合的には最適条件であったとしても、
個々の抗体にとってはむしろ最適条件から外れたもので
あることが多く、従って個々の抗体にとっては結合が充
分には行われていないことになる。そこで、結合につい
てのこれまでの発想のコペルニクス的な転換を図り、こ
れらｐＨや塩化ナトリウム濃度を一つの条件下に固定す
るのではなく、抗体の結合に際して条件を変動（例え
ば、最初はｐＨをＡ₁ 、塩化ナトリウム濃度をＢ₁ （Ｘ
抗体の固定化の最適条件）として結合させた後、ｐＨを
Ａ₂ 、塩化ナトリウム濃度をＢ₂ （Ｙ抗体の固定化の最
適条件）として結合）させてやれば、いずれの抗体Ｘ，
Ｙも最適条件下での結合処理が行われることになり、固
定化が充分になされることになり、免疫測定の感度の向
上が期待できることになる。例えば、ｐＨを６〜１０の
範囲内で変動させ、又、塩化ナトリウム濃度を０〜１Ｍ
の範囲内で変動させることにより、ポリクローナル抗体
の固定化が効果的に行われた。

【０００８】尚、結合反応後、非特異反応を排除する目
的で、測定すべき特異的反応に関与しない蛋白質を担持
させることができる。それらの代表的な例としては、哺
乳動物及び鳥類の正常血清蛋白質、アルブミン、スキム
ミルク、乳酸醗酵物、コラーゲン及びそれらの分解物質
等が挙げられる。尚、非特異吸着抑制蛋白質は、固定化
担体に担持させるだけでなく、免疫反応時に、その一定
量を免疫反応溶液中に添加することにより、非特異吸着
の抑制効果が一層上がる。

【０００９】測定に用いられる流体試料としてはあらゆ
る形態の溶液、コロイド溶液などが使用しうるが、好ま
しくは生物由来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、
脳脊髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられ
る。測定しうる流体試料中での特定成分は、その特定成
分に特異的に結合する物質が存在しうる物質（物質群）
である。具体的には、特開昭６２−９０５３９号公報や
特開昭６３−１３１０６２号公報に記載の物質（物質
群）を挙げることができるが、これらに限定されるもの
ではない。

【００１０】そして、上記したようなポリクローナル抗
体が固定化された固定化担体、標識抗体及び試料中の抗
原との間で免疫反応が行われ、その後標識物質を測定す
ることにより定量が行われる。免疫反応に用いられる抗
体の標識物質としては、通常の免疫測定法で一般に使用
されるものを用いることが出来、例えば酵素、放射性物
質、発光物質、蛍光物質などが挙げられ、又、酵素基
質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオファージ、循環
反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠分子族、化
学発光性反応体及び螢光性分子等も使用できるが、好ま
しくはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グ
ルタメートデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ等の酵素であ
る。これらの酵素を標識物質とする場合、酵素反応系、
発色系は公知のものを使用できる。具体的には、特開昭
６１−２９２０６０号公報、特開昭６２−９０５３９号
公報、特開昭６３−１３１０６２号公報、特開昭６３−
４５５６２号公報、特願昭６３−２１９８９３号明細書
に記載の物質（物質群）が挙げられるが、これらに限定
されるものではない。そして、これら標識物質の抗体へ
の結合は、当業者間で知られている公知の試薬と方法で
行うことができ、例えば石川 栄治、河合忠、宮井 潔
編「酵素免疫測定法（第３版）、医学書院、１９８７
年」や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時増刊特集第
５３号「臨床検査の為のイムノアッセイ−技術と応用
−、臨床病理刊行会、１９８３年」などに記載された方
法を参考にすることができる。

【００１１】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４〜８
８参照）で精製して用いることができる。又、これらの
抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画
を用いることができ、或いはこれらの抗体を酵素処理し
てＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）₂ といった活性抗
体フラグメントにして使用しても良い。

【００１２】本発明の免疫反応型式としては、競合法、
２抗体法、サンドイッチ法などが挙げられるが、特に限
定はされない。免疫反応後の標識物質に起因した信号の
測定方法は標識の種類により異なるが、例えば標識物質
が螢光物質であれば、螢光強度を測定すれば良く、標識
物質が酵素であれば適当な基質、必要ならば酵素や発色
系を含む溶液を添加し、一定時間インキュベートした後
に、該発色系に適合した波長の光の吸光度または反射濃
度（基質の種類によっては螢光強度、発光強度）を測定
することにより信号強度を測定できる。このような目的
で用いられる基質、発色系は標識酵素の種類にしたがっ
て適宜なものを選択できる。標識酵素に起因した信号
は、吸光度法（比色法) 、螢光法、発光法、放射活性測
定法で検出することができ、測定法としては信号の経時
的変化を測定するレート測定法または一定時間後の信号
を測定するエンドポイント測定法で測定することができ
る。好ましくは吸光度法であり、吸光度法（比色法) で
は紫外線、可視光、近赤外光を利用することができる。

【００１３】

【実施例】以下、実施例により具体的に説明するが、本
発明は実施例によって限定されるものではない。 〔実施例１〕市販の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するポ
リクローナル抗体（フナコシ製）を１Ｍの塩化ナトリウ
ムを溶解した０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ６．
０、ｐＨ７．０）、トリスバッファー（ｐＨ８．０）、
炭酸バッファー（ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０）に１０μ
ｇ／ｍｌになるように溶解し、これら５種類の抗体溶液
に順に４時間ずつ直径６．３５ｍｍのポリスチレンビー
ズ（積水化学工業社、♯８０）を浸漬し、固定化した。

【００１４】又、比較の為に、市販の癌胎児性抗原（Ｃ
ＥＡ）に対するポリクローナル抗体（フナコシ製）を１
Ｍの塩化ナトリウムを溶解した０．１Ｍの炭酸バッファ
ー（ｐＨ９．０）に直径６．３５ｍｍのポリスチレンビ
ーズ（積水化学工業社、♯８０）を２０時間浸漬し、固
定化した。この後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で
洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳ溶
液に３７℃で２４時間浸漬し、その後４℃で保存した。

【００１５】上記のようにして得られたポリスチレンビ
ーズを、０、５ｎｇ、１０ｎｇ、３０ｎｇ、５０ｎｇの
ヒトＣＥＡ標準液５０μｌとＰＢＳ２００μｌとを混合
した液の中に入れ、３７℃で２時間反応させた。ＰＢＳ
で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡ抗体の１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳ溶液を２５０μｌ加え、３７℃で１時間反
応させた。ＰＢＳで洗浄後、３ｎｇ／ｍｌのｏ−フェニ
レンジアミンを溶解したクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ
５．０、０．０２％過酸化水素含有）０．３ｍｌを加
え、室温下で３０分間の発色を行わせた。そして、１Ｎ
の硫酸１ｍｌで発色反応を停止させ、４９２ｎｍでの吸
光度を測定したので、その結果を図１に示す。

【００１６】これによれば、固定化に際してｐＨ濃度を
変化させる本発明の固定化担体の製造方法で得た固定化
担体が用いられた免疫測定は、感度が高いことが判る。 〔実施例２〕ＣＥＡに対するポリクローナル抗体を０、
０．３Ｍ、０．５Ｍ、０．８Ｍ、１．０Ｍの塩化ナトリ
ウムを溶解した０．１Ｍの炭酸バッファー（ｐＨ９．
０）に１０μｇ／ｍｌになるように溶解し、これら５種
類の抗体溶液に順に４時間ずつ直径６．３５ｍｍのポリ
スチレンビーズを浸漬し、固定化した。

【００１７】又、比較の為に、ＣＥＡに対するポリクロ
ーナル抗体を０．１Ｍの炭酸バッファー（ｐＨ９．０、
１．０Ｍの塩化ナトリウム含有）に１０μｇ／ｍｌにな
るように溶解し、直径６．３５ｍｍのポリスチレンビー
ズを２０時間浸漬し、固定化した。この後、実施例１と
同様に行い、４９２ｎｍでの吸光度を測定したので、そ
の結果を図２に示す。

【００１８】これによれば、固定化に際して塩化ナトリ
ウム濃度を変化させる本発明の固定化担体の製造方法で
得た固定化担体が用いられた免疫測定は、感度が高いこ
とが判る。

【００１９】

【効果】本発明の固定化担体が用いられると、高感度な
測定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＥＡの吸光度を示すグラフである。

【図２】ＣＥＡの吸光度を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の特定成分と特異的に結合する物
   質を不溶性の担体に固定化する方法であって、固定化に
   際してｐＨ濃度及び／又は塩化ナトリウム濃度を変化さ
   せることを特徴とする固定化担体の製造方法。