JPH06347462A - 免疫測定に使用される固定化担体の保存液、及びこの保存液で保存された担体を用いる免疫学的測定方法 - Google Patents

免疫測定に使用される固定化担体の保存液、及びこの保存液で保存された担体を用いる免疫学的測定方法

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JPH06347462A
JPH06347462A JP13474693A JP13474693A JPH06347462A JP H06347462 A JPH06347462 A JP H06347462A JP 13474693 A JP13474693 A JP 13474693A JP 13474693 A JP13474693 A JP 13474693A JP H06347462 A JPH06347462 A JP H06347462A
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JP13474693A
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Takashi Sakaguchi
孝 阪口
Shinya Yoshida
伸也 吉田
Seiji Hidaka
誠司 日高
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Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 免疫反応物質が固定化された担体を長期間保
存しても、正確な免疫測定を行うことができる手段の提
供。 【構成】 被測定物質と免疫学的に反応する物質を固定
化した担体を保存する溶液にタンパク質分解酵素阻害剤
を少なくとも1種以上含有する固定化担体の保存液及び
該溶液で保存した固定化担体を用いる免疫学的測定方
法。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫測定に使用される
固定化担体の保存液及び該保存液で保存された担体を用
いる免疫学的測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】従来より、疾病の診断や食品検査等にお
いて、微量の物質を測定する方法として免疫学的測定方
法が広く行われている。免疫学的測定方法には、種々の
方法が提案されているが、特に簡便で、精度の高い方法
として、免疫反応物質が固定化された担体を用いる方法
がある。この固定化担体は、一般に免疫反応物質を担体
に固定化した後、免疫測定時まで保存液中に保存され
る。しかし、固定化担体は保存中に、微量存在するタン
パク質分解酵素により、担体表面に保持されている免疫
反応物質が分解され、しばしば測定値に異常を生ずるこ
とがあった。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、免疫
反応物質が固定化された担体を長期間保存しても、正確
な免疫測定を行うことができる手段を提供することであ
る。
【0004】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、上記目的を、被測定物質と免疫学的に反応す
る物質を固定化した担体を保存する溶液にタンパク質分
解酵素阻害剤を少なくとも1種以上含有する固定化担体
の保存液及び該溶液で保存した固定化担体を用いる免疫
学的測定方法により達成した。
【0005】本発明で用いられる、タンパク質分解酵素
阻害剤の好ましい例としては、N−エチルマレイミド
(以下、「NEM」ということがある)、エチレンジア
ミン四酢酸(以下、「EDTA」ということがある)及
びその塩並びにフェニルメタンスルホニルフルオリドを
挙げることができる。EDTAの塩としてはナトリウム
塩のようなアルカリ金属塩が好ましい。なお、タンパク
質分解酵素阻害剤は2種以上のものを組合せて用いるこ
ともできる。
【0006】これらの液中のタンパク質分解酵素阻害剤
の濃度は、タンパク質分解酵素による抗原や抗体の分解
を実質的に低減又は阻止することができ、かつ、本来の
免疫測定に支障のない範囲であれば特に限定されるもの
ではない。通常、1mMないし50mMが好ましく、さ
らに好ましくは2mMないし20mMである。
【0007】本発明で、免疫反応に際して用いられる流
体試料中の特定成分と特異的に結合する物質が固定化さ
れる不溶性の担体としては粒状体、プレート状といった
ものが有り、如何なるタイプのものでも良い。不溶性担
体の材料としては、アガロース、セルロース、架橋デキ
ストラン、ポリアクリルアミド、セルロース、微結晶セ
ルロース、架橋アガロース、架橋ポリアクリルアミド、
ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二酸化チタン、硫酸バ
リウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ砂、ポリスチレン等の
各種の合成樹脂のほか、多孔質な素材、さらには磁性微
粒子などが利用できる。好ましくはアガロース、架橋ア
ガロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架
橋ポリアクリルアミド、ガラス、シリカゲル、ポリスチ
レン、セルロース、微結晶セルロース等であり、更に好
ましくはポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミ
ド、ポリスチレン、微結晶セルロース等である。これら
の不溶性担体は数種を混合して用いても良い。
【0008】本発明に用いられる免疫反応物質は、これ
ら不溶性担体に、当業者に公知の方法で化学的及び/又
は物理的に直接、あるいは間接的に結合させることがで
きる。結合法については1976年、講談社発行、千畑
一郎ほか2名編「実験と応用アフィニティクロマトグラ
フィー」(第1刷)、1975年、講談社発行、山崎
誠ほか2名編「アフィニティクロマトグラフィー」(第
1版)を参考にできる。
【0009】測定に用いられる流体試料としてはあらゆ
る形態の溶液、コロイド溶液などが使用しうるが、好ま
しくは生物由来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、
脳脊髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられ
る。測定しうる流体試料中での特定成分は、その特定成
分に特異的に結合する物質が存在しうる物質(物質群)
である。具体的には、特開昭62−90539号公報や
特開昭63−131062号公報に記載の物質(物質
群)を挙げることができるが、これらに限定されるもの
ではない。
【0010】そして、例えばモノクローナル抗体が固定
化された固定化担体は、標識抗体及び試料中の抗原との
間で免疫反応が行われ、その後標識物質を測定すること
により定量が行われる。
【0011】免疫反応に用いられる抗体の標識物質とし
ては、通常の免疫測定法で一般に使用されるものを用い
ることが出来、例えば酵素、放射性物質、発光物質、蛍
光物質などが挙げられ、又、酵素基質、補酵素、酵素阻
害物質、バクテリオファージ、循環反応体、金属及び有
機金属の錯体、有機補欠分子族、化学発光性反応体及び
螢光性分子等も使用できるが、好ましくはβ−D−ガラ
クトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタメートデヒドロ
ゲナーゼ、アミラーゼ等の酵素である。これらの酵素を
標識物質とする場合、酵素反応系、発色系は公知のもの
を使用できる。具体的には、特開昭61−292060
号公報、特開昭62−90539号公報、特開昭63−
131062号公報、特開昭63−45562号公報、
特願昭63−219893号明細書に記載の物質(物質
群)が挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。そして、これら標識物質の抗体への結合は、当業者
間で知られている公知の試薬と方法で行うことができ、
例えば石川 栄治、河合忠、宮井 潔 編「酵素免疫測
定法(第3版)、医学書院、1987年」や日本臨床病
理学会編「臨床病理」臨時増刊特集第53号「臨床検査
の為のイムノアッセイ−技術と応用−、臨床病理刊行
会、1983年」などに記載された方法を参考にするこ
とができる。
【0012】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等(右田俊介偏「免疫化学」中山書店pp74〜8
8参照)で精製して用いることができる。又、これらの
抗体はIgG、IgM、IgA、IgD、IgE各分画
を用いることができ、或いはこれらの抗体を酵素処理し
てFab、Fab’又はF(ab’)2 といった活性抗
体フラグメントにして使用しても良い。本発明の免疫反
応型式としては、競合法、2抗体法、サンドイッチ法な
どが挙げられるが、特に限定はされない。
【0013】免疫反応後の標識物質に起因した信号の測
定方法は標識物質の種類により異なるが、例えば標識物
質が螢光物質であれば、螢光強度を測定すれば良く、標
識物質が酵素であれば適当な基質、必要ならば酵素や発
色系を含む溶液を添加し、一定時間インキュベートした
後に、該発色系に適合した波長の光の吸光度または反射
濃度(基質の種類によっては螢光強度、発光強度)を測
定することにより信号強度を測定できる。このような目
的で用いられる基質、発色系は標識酵素の種類にしたが
って適宜なものを選択できる。標識物質に起因した信号
は、吸光度法(比色法) 、螢光法、発光法、放射活性測
定法で検出することができ、測定法としては信号の経時
的変化を測定するレート測定法または一定時間後の信号
を測定するエンドポイント測定法で測定することができ
る。好ましくは吸光度法であり、吸光度法(比色法) で
は紫外線、可視光、近赤外光を利用することができる。
【0014】
【実施例】以下、実施例により具体的に説明するが、本
発明は実施例によって限定されるものではない。
【0015】実施例1 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素(以下、「GA
T」ということがある)の測定を以下の通り行った 1) 抗GAT抗体固定化ビーズの作製 特開平3−259093号に記載の方法で得られたGA
Tに対するマウスモノクローナル抗体MAb8513を
1Mの塩化ナトリウムを溶解した0.1M炭酸塩緩衝液
(pH9.15)に10μg/mlになるように溶解
し、この中にポリスチレンビーズ(積水化学製 #8
0)を浸漬して、4℃下で24時間かけて抗体を固定化
した。りん酸緩衝生理食塩水(以下PBSとする)で洗
浄した後、1%牛血清アルブミン(以下BSAとする)
−PBS溶液に37℃、10時間浸漬し、抗GAT抗体
固定化ビーズを作製した。
【0016】2) GAT標準液の作成 ヒト初乳乳清を正常ヒト血清に1/100量添加し、G
AT標準液を作成した。
【0017】3) 緩衝液の作製 1Mの塩化ナトリウムと0.01%Tween20を、
0.02Mりん酸緩衝液(pH6.5)に溶解し、緩衝液
を作製した。
【0018】4) 酵素標識抗体液の作製 固定化抗体とは違う部位を認識する抗GATマウスモノ
クローナル抗体MAb8628(特開平3ー25909
3に記載)を石川栄治、河合忠、宮井潔 編「酵素免疫
測定法(第3版)医学書院 1987年」 P108記
載の方法でペルオキシダーゼ標識した。1Mの塩化ナト
リウム、1%BSA、0.05%p-ヒドロキシ安息香酸
及びこのペルオキシダーゼ標識抗GAT抗体を、0.0
2Mりん酸緩衝液(pH7.2)に溶解し、酵素標識抗
体液を作製した。
【0019】5) GATの測定 抗GAT抗体固定化ビーズを液から取り出し、GAT標
準液50μlとインキュベーション用溶液200μlと
を混合した液の中に入れ、45℃で2時間インキュベー
トした。PBSで洗浄後、酵素標識抗体液を250μl
加え、室温で1時間インキュベートした。PBSで洗浄
後、0.02%の過酸化水素と3mg/mlのoーフェニ
レンジアミンを含むくえん酸−りん酸緩衝液(pH5.
0)0.3mlを加え、常温で30分間発色させた。こ
の後1Nの硫酸1mlで発色反応を停止し、492nm
の吸光度を測定した。
【0020】6) 抗GAT抗体固定化ビーズに対するタ
ンパク質分解酵素阻害剤の効果 1)の浸漬液に表1に示した一定量のタンパク質分解酵素
阻害剤を加え、1)と同様に抗GAT抗体固定化ビーズを
作成した。
【0021】それぞれを4℃及び42℃に7日間保存
後、ビーズを代えた以外は5)と同様にGATを測定し
た。比較例としてタンパク質分解酵素阻害剤を加えない
ものを用いた。5回同時測定した結果を表2に示す。
【0022】
【表1】
【0023】
【表2】
【0024】表2から、タンパク質分解酵素阻害剤を加
えることにより、抗GAT抗体固定化ビーズの活性低下
による吸光度の減少が抑制され、保存安定性が向上した
ことが分かる。
【0025】
【発明の効果】免疫反応物質が固定化された担体を長期
間保存しても、正確な免疫測定を行うことができる手段
が得られた。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 被測定物質と免疫学的に反応する物質を
    固定化した担体を保存する溶液に、タンパク質分解酵素
    阻害剤を少なくとも1種以上含有することを特徴とする
    固定化担体の保存液。
  2. 【請求項2】 タンパク質分解酵素阻害剤を少なくとも
    1種以上含有する溶液に保存された、被測定物質と免疫
    学的に反応する物質を固定化した担体を用いることを特
    徴とする免疫学的測定方法。
  3. 【請求項3】 タンパク質分解酵素阻害剤が、N−エチ
    ルマレイミド、エチレンジアミン四酢酸及びその塩並び
    にフェニルメタンスルホニルフルオリドから選択される
    少なくとも1種である請求項1記載の保存液。
  4. 【請求項4】 タンパク質分解酵素阻害剤が、N−エチ
    ルマレイミド、エチレンジアミン四酢酸及びその塩並び
    にフェニルメタンスルホニルフルオリドから選択される
    少なくとも1種である請求項2記載の免疫学的測定方
    法。
JP13474693A 1993-06-04 1993-06-04 免疫測定に使用される固定化担体の保存液、及びこの保存液で保存された担体を用いる免疫学的測定方法 Pending JPH06347462A (ja)

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