JPS60214260A - ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 - Google Patents
ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬Info
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- JPS60214260A JPS60214260A JP7242884A JP7242884A JPS60214260A JP S60214260 A JPS60214260 A JP S60214260A JP 7242884 A JP7242884 A JP 7242884A JP 7242884 A JP7242884 A JP 7242884A JP S60214260 A JPS60214260 A JP S60214260A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヒト癌胎児性抗原（以下、ＣＥＡと略称する
こともある。）のサンドイツチ法による免疫化学的測定
法およびその試薬に関する。
こともある。）のサンドイツチ法による免疫化学的測定
法およびその試薬に関する。
従来の技術
ＣＥＡは１９６５年Ｇｏｌｄらによって、ヒト大腸癌組
織の過塩素酸抽出物中に見い出され、しかも胎児期の消
化管上皮にも存在することから癌胎児性抗原（ｃａｒｃ
ｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ）と名付
けられた。ＣＥＡは分子量約１８万、約５０％の糖を含
む蛋白である。ＣＥＡは胃癌、大腸癌、膵癌、肺癌など
の種々の癌患者で、癌組織や体液中に比較的高レベルで
栓用される場合か多く、癌の診断ならびに予後管理用と
して繁用されている。
織の過塩素酸抽出物中に見い出され、しかも胎児期の消
化管上皮にも存在することから癌胎児性抗原（ｃａｒｃ
ｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ）と名付
けられた。ＣＥＡは分子量約１８万、約５０％の糖を含
む蛋白である。ＣＥＡは胃癌、大腸癌、膵癌、肺癌など
の種々の癌患者で、癌組織や体液中に比較的高レベルで
栓用される場合か多く、癌の診断ならびに予後管理用と
して繁用されている。
従来より、ＣＥＡの酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡと略
称することもある。）については、サンドインチ法が繁
用されてきた。サンドイツチ法は一般に次のように行な
われる。未知量のＣＥＡを含む被検液に担体上に保持さ
れた過剰量の抗体を加えて反応させ（第１反応）、次に
酵素で標識した過剰量の抗体の一定量を加えて反応させ
る（第２反応）。担体上に保持された酵素もしくは担体
上に保持されなかった酵素の活性を測定する。第１反応
、第２反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行
なってもよい。
称することもある。）については、サンドインチ法が繁
用されてきた。サンドイツチ法は一般に次のように行な
われる。未知量のＣＥＡを含む被検液に担体上に保持さ
れた過剰量の抗体を加えて反応させ（第１反応）、次に
酵素で標識した過剰量の抗体の一定量を加えて反応させ
る（第２反応）。担体上に保持された酵素もしくは担体
上に保持されなかった酵素の活性を測定する。第１反応
、第２反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行
なってもよい。
第１反応および第２反応で用いられている抗体は同一の
免疫動物で得られた抗血清、あるいは異なる免疫動物か
ら得られた抗血清、さらにこれらの抗体の１種類と細胞
融合法で得られた１種類のモノクローナル抗体、あるい
は２種類のモノクローナル抗体などが用いられている。
免疫動物で得られた抗血清、あるいは異なる免疫動物か
ら得られた抗血清、さらにこれらの抗体の１種類と細胞
融合法で得られた１種類のモノクローナル抗体、あるい
は２種類のモノクローナル抗体などが用いられている。
発明が解決しようとする問題点
ＥＩＡで用いられる標識用酵素としては、安定で高感度
測定が可能であり、標識化反応時に損傷を受けないこと
が望捷しい。これまでにペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ。
測定が可能であり、標識化反応時に損傷を受けないこと
が望捷しい。これまでにペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ。
アルカリフオスファクーゼ、グルコースオキシダーゼな
どが用いられているが、上記の酵素のうち、ペルオキシ
ダーゼは分子量約４万の極めて安定な酵素で、酵素活性
も高いため最も繁用されている。
どが用いられているが、上記の酵素のうち、ペルオキシ
ダーゼは分子量約４万の極めて安定な酵素で、酵素活性
も高いため最も繁用されている。
ペルオキシダーゼをＥＩＡＫ利用するにあたって、ペル
オキシダーゼと免疫化学的活性物質とを予め結合させる
必要があるが、通常行なわれている方法では、それぞれ
欠点を有し、改善が切望されていた。
オキシダーゼと免疫化学的活性物質とを予め結合させる
必要があるが、通常行なわれている方法では、それぞれ
欠点を有し、改善が切望されていた。
一方、ＣＥＡは一般Ｋ Ｋｒｕｐｅｙらの方法〔イムノ
ケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） 、
第９巻（１９７２年）、第６１７頁〕に準じてヒト大腸
癌組織の過塩素酸抽出物を、ゲルクロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィーもしくは電気泳動法の
各手法を組み合せて精製されていた。しかし、これらの
方法で得られたＣＥＡは、操作中に強い酸性溶媒にさら
されているため、変性している恐れがあるという欠点を
有する。このだめに緩和な条件でＣＥＡを抽出精製する
方法が報告されているが〔キャンプ−０リサーチ（Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ） 、第３５巻（１９７
５年）、第２９２８頁〕、繁雑であり、またその有用性
も明らかでない。更に抽出のために用いられるヒト癌化
組織としては通常、大腸癌の転移肝癌が用いられるが原
発部組縁と完全に一致する性質を有するものかどうかに
ついては解明されているとは言えない。更にＣＥＡと共
通の抗原決定基を有するＣＥＡ関連抗原が正常組織や新
生児胎便中から発見されておりＮＣＡ ＣＮｏｎ５ｐｅ
ｃｉｆｉｃ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｎｌ、
ｉｇｅｎ ； Ｐｒｏｃｅｅｄ−ｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉ
ｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅｔｊ、ｓ、Ａ、第６９巻（１
９７２年）、第２４９２頁〕やＮＣＡ−２ＣＮｏｎ５−
ｐｅｃｉｆｉｃ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｎ
ｔｉｇｅｎ−２； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ、第１１１巻（１９７３年）、第１９２６頁〕
などと名付られている。これらのＣＥＡ関連抗原と交差
反応する抗ＣＥＡ抗体を利用すると、その交差反応性の
ためにＣＥＡ測定値に影響を与え、正確な測定値が得ら
れない。
ケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） 、
第９巻（１９７２年）、第６１７頁〕に準じてヒト大腸
癌組織の過塩素酸抽出物を、ゲルクロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィーもしくは電気泳動法の
各手法を組み合せて精製されていた。しかし、これらの
方法で得られたＣＥＡは、操作中に強い酸性溶媒にさら
されているため、変性している恐れがあるという欠点を
有する。このだめに緩和な条件でＣＥＡを抽出精製する
方法が報告されているが〔キャンプ−０リサーチ（Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ） 、第３５巻（１９７
５年）、第２９２８頁〕、繁雑であり、またその有用性
も明らかでない。更に抽出のために用いられるヒト癌化
組織としては通常、大腸癌の転移肝癌が用いられるが原
発部組縁と完全に一致する性質を有するものかどうかに
ついては解明されているとは言えない。更にＣＥＡと共
通の抗原決定基を有するＣＥＡ関連抗原が正常組織や新
生児胎便中から発見されておりＮＣＡ ＣＮｏｎ５ｐｅ
ｃｉｆｉｃ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｎｌ、
ｉｇｅｎ ； Ｐｒｏｃｅｅｄ−ｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉ
ｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅｔｊ、ｓ、Ａ、第６９巻（１
９７２年）、第２４９２頁〕やＮＣＡ−２ＣＮｏｎ５−
ｐｅｃｉｆｉｃ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｎ
ｔｉｇｅｎ−２； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ、第１１１巻（１９７３年）、第１９２６頁〕
などと名付られている。これらのＣＥＡ関連抗原と交差
反応する抗ＣＥＡ抗体を利用すると、その交差反応性の
ためにＣＥＡ測定値に影響を与え、正確な測定値が得ら
れない。
問題点を解決するだめの手段
本発明者らは、上記の事情に鑑み更に検討を重ねたとこ
ろ、サンドイツチ法によるＥＩＡにおいて、担体上に保
持される抗体と標識剤を結合させる抗体とが互いに抗原
決定部位を重複しない２種の抗体であり、標識剤として
あらかじめチオール基を導入したペルオキシダーゼを用
いこれと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いると、ＣＥＡを高
感度、高精度でしかも微量のＣＥＡを測定できることを
見い出し、また、ＣＥＡを含有する癌化組織から非イオ
ン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出することにより
ＣＥＡを変性させるこ七なく精製でき、またこのように
して精製されたＣＥＡを用いて製造されたＣＥＡ反応性
モノクローナル抗体を上記サンドインチ法によるＥＩＡ
に用いると、さらに高精度でＣＥＡｉ測定することがで
きることを見い出し、これらの知見に基づいてさらに研
究した結果、本発明を完成した。
ろ、サンドイツチ法によるＥＩＡにおいて、担体上に保
持される抗体と標識剤を結合させる抗体とが互いに抗原
決定部位を重複しない２種の抗体であり、標識剤として
あらかじめチオール基を導入したペルオキシダーゼを用
いこれと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いると、ＣＥＡを高
感度、高精度でしかも微量のＣＥＡを測定できることを
見い出し、また、ＣＥＡを含有する癌化組織から非イオ
ン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出することにより
ＣＥＡを変性させるこ七なく精製でき、またこのように
して精製されたＣＥＡを用いて製造されたＣＥＡ反応性
モノクローナル抗体を上記サンドインチ法によるＥＩＡ
に用いると、さらに高精度でＣＥＡｉ測定することがで
きることを見い出し、これらの知見に基づいてさらに研
究した結果、本発明を完成した。
本発明は、（１）担体上に保持された抗体、抗原および
標識剤を結合させた抗体を用いるヒト癌胎児性抗原の免
疫化学的測定法において、担体上に保持される抗体と標
識剤を結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複し
ない２種の抗体であり、標識剤としてあらかじめチオー
ル基を導入したペルオキシダーゼを用い、これと抗体と
を一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合寸たは
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。」で表わ
される化合物で結合させたものを用いるとさを特徴とす
るヒト癌胎児性抗原の／、（４疫化学的測定法、および （２）、■チオール基を導入したペルオキシダーゼと抗
体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒ１−Ｊ化学結合ま
たは２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で
表わされる化合物で結合させたもの、および■ペルオキ
シダーゼに結合させる抗体と互いに抗原決定部位を重複
せずヒト癌胎児性抗原に反応する抗体を担体」二に保持
したものを含有するヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定
用試薬である。
標識剤を結合させた抗体を用いるヒト癌胎児性抗原の免
疫化学的測定法において、担体上に保持される抗体と標
識剤を結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複し
ない２種の抗体であり、標識剤としてあらかじめチオー
ル基を導入したペルオキシダーゼを用い、これと抗体と
を一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合寸たは
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。」で表わ
される化合物で結合させたものを用いるとさを特徴とす
るヒト癌胎児性抗原の／、（４疫化学的測定法、および （２）、■チオール基を導入したペルオキシダーゼと抗
体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒ１−Ｊ化学結合ま
たは２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で
表わされる化合物で結合させたもの、および■ペルオキ
シダーゼに結合させる抗体と互いに抗原決定部位を重複
せずヒト癌胎児性抗原に反応する抗体を担体」二に保持
したものを含有するヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定
用試薬である。
まだ、上記本発明において、２種の抗体のうち少なくと
も一方かモノクローナル抗体であること、さらに該モノ
クローナル抗体は、ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組
織から、非イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出
し、精製されたヒト癌胎児性抗原で免疫されだ哺乳動物
のリンパ球とミエローマ細胞との融合細胞から得られた
ヒト癌胎児性抗原反応性モノクローナル抗体であること
が好都合である。
も一方かモノクローナル抗体であること、さらに該モノ
クローナル抗体は、ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組
織から、非イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出
し、精製されたヒト癌胎児性抗原で免疫されだ哺乳動物
のリンパ球とミエローマ細胞との融合細胞から得られた
ヒト癌胎児性抗原反応性モノクローナル抗体であること
が好都合である。
本発明において用いられる担体上に保持された抗体にお
ける担体としては、たとえば、ケル粒子（例、アガロー
スゲル〔例、セファロース４Ｂ。
ける担体としては、たとえば、ケル粒子（例、アガロー
スゲル〔例、セファロース４Ｂ。
セファロース６Ｂ（ファルマ“シア・ファインケミカル
社（スエーテン）製〕、テキストラノゲル〔例、セファ
テックスＧ−７５．セファテックスＧ−１００，セファ
テックスｃ；−２００（ファルマシア・ファインケミカ
ル社製）〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、バイオケル
Ｐ−８０，バイオケルＰ−６０，バイオケルＰ−１００
（バイオラッド・ラホラトリーズ社（米国））］、セル
ロース粒子〔例、アヒセル（脂化成製）、イオン交換セ
ルローフ、、（例、 ジエチルアミノエチルセルロース
、カルボキシメチルセルロース）〕、物理的吸着剤〔例
、ガラス（例、ガラス球、ガラスロッド。
社（スエーテン）製〕、テキストラノゲル〔例、セファ
テックスＧ−７５．セファテックスＧ−１００，セファ
テックスｃ；−２００（ファルマシア・ファインケミカ
ル社製）〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、バイオケル
Ｐ−８０，バイオケルＰ−６０，バイオケルＰ−１００
（バイオラッド・ラホラトリーズ社（米国））］、セル
ロース粒子〔例、アヒセル（脂化成製）、イオン交換セ
ルローフ、、（例、 ジエチルアミノエチルセルロース
、カルボキシメチルセルロース）〕、物理的吸着剤〔例
、ガラス（例、ガラス球、ガラスロッド。
アミノアルキルカラス球、アミノアルキルカラスロッド
）、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球
、ホリスチレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例
、ヌンク社（テンマーク）製）〕、イオン交換樹脂（例
、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲＣ
−５０（ローム・アンド・ハース社（米国）！ｔｉｌｌ
）、セオカーブ２２６（パームチット社（西ドイツ）製
）〕９９弱塩基性陰イオン交換樹脂例、アンバーライト
ＩＲ−４Ｂ。
）、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球
、ホリスチレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例
、ヌンク社（テンマーク）製）〕、イオン交換樹脂（例
、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲＣ
−５０（ローム・アンド・ハース社（米国）！ｔｉｌｌ
）、セオカーブ２２６（パームチット社（西ドイツ）製
）〕９９弱塩基性陰イオン交換樹脂例、アンバーライト
ＩＲ−４Ｂ。
ダウエックス３（タウケミカル社（１）製）））などが
挙げられる。
挙げられる。
担体に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し
得るが、たとえば゛代謝″、第８巻（１９７１年）、第
６９６頁に記載されているグロムンアン法、グルタルア
ルテヒド法などが挙げられる。また、より簡易な方法と
して物理的に担体表面に吸着させてもよい。
得るが、たとえば゛代謝″、第８巻（１９７１年）、第
６９６頁に記載されているグロムンアン法、グルタルア
ルテヒド法などが挙げられる。また、より簡易な方法と
して物理的に担体表面に吸着させてもよい。
本発明で用いられる抗体としてはモノクローナル抗ＣＥ
Ａ抗体もしくはポリクローナル抗ＣＥＡ抗体が用いられ
る。抗体の製造における免疫に用いる抗原としては、自
体公知の方法ＣＫｒｕｐｅｙら。
Ａ抗体もしくはポリクローナル抗ＣＥＡ抗体が用いられ
る。抗体の製造における免疫に用いる抗原としては、自
体公知の方法ＣＫｒｕｐｅｙら。
イムノケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
） 、第９巻（１９７２年）、第６１７頁〕で精製し
たＣＥＡ、更に望ましくは、ヒト癌組織から非イオン性
界面活性剤を含む中性塩溶液により抽出、精製されたＣ
ＥＡ画分が用いられる。
） 、第９巻（１９７２年）、第６１７頁〕で精製し
たＣＥＡ、更に望ましくは、ヒト癌組織から非イオン性
界面活性剤を含む中性塩溶液により抽出、精製されたＣ
ＥＡ画分が用いられる。
ヒト癌化組織としてはＣＥＡを含有するヒト癌化組織な
らいずれでも用いることができるが、特にヒト大腸癌組
織が望ましい。ヒト大腸癌組織としては、あらゆる段階
の大腸癌組織を用いることができるが、テユークス（Ｄ
ｕｋｅｓ ）ＣもしくはＤの段階のものが望ましい。
らいずれでも用いることができるが、特にヒト大腸癌組
織が望ましい。ヒト大腸癌組織としては、あらゆる段階
の大腸癌組織を用いることができるが、テユークス（Ｄ
ｕｋｅｓ ）ＣもしくはＤの段階のものが望ましい。
非イオン性界面活性剤としては、細胞成分を可溶化でき
るものならばいずれでも良いが、とりわけエチレンオキ
シド系非イオン界面活性剤〔例、Ｔｗｅｅｎ ２０．
Ｔｗｅｅｎ ４０． Ｔｗｅｅｎ ８０． Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｎ−１０１、ＴｒｉｔｏｎＸ −１００、Ｌｏｂｒ
ｏｌ ＷＸ、 Ｂｒ１ｊｉ９６など、シグマ社（米国）
製〕が用いられる。
るものならばいずれでも良いが、とりわけエチレンオキ
シド系非イオン界面活性剤〔例、Ｔｗｅｅｎ ２０．
Ｔｗｅｅｎ ４０． Ｔｗｅｅｎ ８０． Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｎ−１０１、ＴｒｉｔｏｎＸ −１００、Ｌｏｂｒ
ｏｌ ＷＸ、 Ｂｒ１ｊｉ９６など、シグマ社（米国）
製〕が用いられる。
中性塩としてはたとえば塩化ナトリウム、塩化カリウム
、硫酸ナトリウムなどが良好に用いられる。ヒト癌化組
織あたり、約１ないし１０倍量の約０．１ないし４％エ
チレンオキシド系非イオン界面活性剤を含む約０．０５
Ｍないし３Ｍ塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムを抽
出用溶媒として用いることが好ましい。
、硫酸ナトリウムなどが良好に用いられる。ヒト癌化組
織あたり、約１ないし１０倍量の約０．１ないし４％エ
チレンオキシド系非イオン界面活性剤を含む約０．０５
Ｍないし３Ｍ塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムを抽
出用溶媒として用いることが好ましい。
更にＣＥＡの抽出に際しては、抽出効率を向上させるた
め、攪拌、振盪、超音波処理などを行なってもよい。
め、攪拌、振盪、超音波処理などを行なってもよい。
上記の方法で得られたＣＥＡ抽出液は自体公知の精製手
段（例、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティ・クロ
マトグラフィー、ケル電気泳動法）で更に精製すること
ができる［ ＩｍｒｎｕｎｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ、第９
巻（１９７２年）、第６１７頁。ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅ
ａｒｃｈ 、第３５巻（１９７５年）、第２９２８頁参
照〕。
段（例、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティ・クロ
マトグラフィー、ケル電気泳動法）で更に精製すること
ができる［ ＩｍｒｎｕｎｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ、第９
巻（１９７２年）、第６１７頁。ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅ
ａｒｃｈ 、第３５巻（１９７５年）、第２９２８頁参
照〕。
これらの精製手段によりＣＥＡの純度を蛋白量あたり約
数パーセントから数１０パーセントまでに濃縮すること
ができる。
数パーセントから数１０パーセントまでに濃縮すること
ができる。
モノクローナル抗ＣＥＡ抗体はＭｉｌｓＬｅｉｎらの方
法〔ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ ） ＋第２５６巻（１
９７５年）、第４９５頁〕と同様の方法で作製すること
ができる。例えば、上記精製ＣＥＡを抗原として免疫し
て得られたマウス牌細胞とマウスのミエローマ細胞とを
融合させることにより、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体を
分泌する融合細胞（ハイブリドーマ）を作製することが
できる。
法〔ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ ） ＋第２５６巻（１
９７５年）、第４９５頁〕と同様の方法で作製すること
ができる。例えば、上記精製ＣＥＡを抗原として免疫し
て得られたマウス牌細胞とマウスのミエローマ細胞とを
融合させることにより、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体を
分泌する融合細胞（ハイブリドーマ）を作製することが
できる。
すなわち、ハイブリドーマは精製ＣＥＡであらかじめ免
疫しておいたマウス（たとえばＢ Ａ Ｉ、 Ｂ／Ｃ系
）から得られた牌細胞と、同系マウスのミエローマ細胞
（たとえばＭＳ−１，ＰＳ−Ｕｌなど）とを細胞融合剤
（たとえばポリエチレングリコール、センダイウィルス
など）の存在下で混合し、融合、培養することによって
得られる。牌細胞とミエローマ細胞との混合比は１：１
ないし１０：１種度が有利に用いられる。
疫しておいたマウス（たとえばＢ Ａ Ｉ、 Ｂ／Ｃ系
）から得られた牌細胞と、同系マウスのミエローマ細胞
（たとえばＭＳ−１，ＰＳ−Ｕｌなど）とを細胞融合剤
（たとえばポリエチレングリコール、センダイウィルス
など）の存在下で混合し、融合、培養することによって
得られる。牌細胞とミエローマ細胞との混合比は１：１
ないし１０：１種度が有利に用いられる。
ハイブリドーマはヒポキサンチン−アミノブチリン−チ
ミジン培地（ＨＡＴ培地：ネイチュアー。
ミジン培地（ＨＡＴ培地：ネイチュアー。
第２５６巻（１９７５年）、第４９５頁〕等を用いて選
択的に増殖させることができる。
択的に増殖させることができる。
細胞培養液中に目的とする抗体が含まれているかどうか
については自体公知の酵素免疫測定法を用いて検定する
ことができる。ＣＥＡに特異性の高い抗体を産生ずるハ
イブリドーマはさらに通常の限界希釈法によりモノクロ
ーン化される。得られた目的とするハイブリドーマは通
常の液体培地または哺乳動物の腹腔内で増殖させること
ができる。ハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗
体は公知の方法（たとえば硫酸アンモニウムによル塩析
、Ｄ Ｅ Ａ Ｅセルロースカラムクロマトグラフィー
など）により濃縮精製される。
については自体公知の酵素免疫測定法を用いて検定する
ことができる。ＣＥＡに特異性の高い抗体を産生ずるハ
イブリドーマはさらに通常の限界希釈法によりモノクロ
ーン化される。得られた目的とするハイブリドーマは通
常の液体培地または哺乳動物の腹腔内で増殖させること
ができる。ハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗
体は公知の方法（たとえば硫酸アンモニウムによル塩析
、Ｄ Ｅ Ａ Ｅセルロースカラムクロマトグラフィー
など）により濃縮精製される。
モノクローナル抗体はＣＥＡに対して反応性が高く、正
常組織や非担癌患者由来の試料に対（２ては反応性がは
るかに小さい性質を有する抗体が選ばれる。サンドイツ
チ法によるＥＩＡ用として２種類のモノクローナル抗体
が用いられる場合、それぞれの抗体の抗原決定部位が異
なっているものが選ばれる。
常組織や非担癌患者由来の試料に対（２ては反応性がは
るかに小さい性質を有する抗体が選ばれる。サンドイツ
チ法によるＥＩＡ用として２種類のモノクローナル抗体
が用いられる場合、それぞれの抗体の抗原決定部位が異
なっているものが選ばれる。
ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体は通常の方法で調製するこ
とができる。即ち、精製ＣＥＡがヒト以外の温血動物に
接種される。ヒト以外の温血動物としては、たとえば哺
乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モ
ルモット、ウシ、ウマ、フタ）、鳥類（例、ニワ］・す
、ハト、アヒル。
とができる。即ち、精製ＣＥＡがヒト以外の温血動物に
接種される。ヒト以外の温血動物としては、たとえば哺
乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モ
ルモット、ウシ、ウマ、フタ）、鳥類（例、ニワ］・す
、ハト、アヒル。
ガチョウ、ウズラ）などが挙げられる。該抗原をヒト以
外の温血動物に接種する方法としては、動物に接種する
抗原は抗体を産生ずるに有効な量でよく、たとえばウサ
ギに１回約０．１〜ＬＯｍｇを等容量（１ｍｌ ）の生
理食塩水およびフロイントの完全アジュバントで乳化し
て、背部ならびに後肢掌皮下に４週問おきに５回接種す
ると抗体を産生させ得る場合が多い。
外の温血動物に接種する方法としては、動物に接種する
抗原は抗体を産生ずるに有効な量でよく、たとえばウサ
ギに１回約０．１〜ＬＯｍｇを等容量（１ｍｌ ）の生
理食塩水およびフロイントの完全アジュバントで乳化し
て、背部ならびに後肢掌皮下に４週問おきに５回接種す
ると抗体を産生させ得る場合が多い。
このようにして、温血動物中に形成された抗体を採取す
る方法としては、たとえばウサギでは、通常最終接種後
７日から１２日の間に耳静脈から採血し、遠心分離して
血清として得られる。得られた抗血清は、公知の方法に
従って塩析し、通常、ＣＥＡを保持させた担体を用いる
アフィニティクロマトグラフィーで吸着した両分を回収
することによりポリクローナル抗ＣＥＡ抗体を精製する
ことができる。
る方法としては、たとえばウサギでは、通常最終接種後
７日から１２日の間に耳静脈から採血し、遠心分離して
血清として得られる。得られた抗血清は、公知の方法に
従って塩析し、通常、ＣＥＡを保持させた担体を用いる
アフィニティクロマトグラフィーで吸着した両分を回収
することによりポリクローナル抗ＣＥＡ抗体を精製する
ことができる。
本発明で用いられる２種の抗体は、モノクローナル抗Ｃ
ＥＡ抗体でもポリクローナル抗ＣＥＡ抗体であってもよ
いが、少なくとも一方がモノクローナル抗体であるのが
好ましい。また、抗体分子はＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２も
しくはＦａｂ’であってもよい。
ＥＡ抗体でもポリクローナル抗ＣＥＡ抗体であってもよ
いが、少なくとも一方がモノクローナル抗体であるのが
好ましい。また、抗体分子はＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２も
しくはＦａｂ’であってもよい。
このようにして得られた抗ＣＥＡモノクローナル抗体は
、ＣＥＡのサンドイツチ法によるＥＩＡにおける試薬と
して用いることができる。
、ＣＥＡのサンドイツチ法によるＥＩＡにおける試薬と
して用いることができる。
標識剤であるベルオキシダーセとしては、種々の起源の
ものを用いることができるが、その例としてはたとえば
西洋わさび、パイナツプル、イチジク、せ諸、ソラマメ
、トウモロコシなどから得られるベルオキシダーセが挙
げられ、特に西洋わさびから抽出されたホースラディツ
シュ・ベルオキシダーセ゛（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）が好寸しい。
ものを用いることができるが、その例としてはたとえば
西洋わさび、パイナツプル、イチジク、せ諸、ソラマメ
、トウモロコシなどから得られるベルオキシダーセが挙
げられ、特に西洋わさびから抽出されたホースラディツ
シュ・ベルオキシダーセ゛（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）が好寸しい。
ベルオキシターセと抗体とを化合物〔Ｉ〕で結合するに
あたり、あらかじめベルオキシターセにチオール基を導
入したものを用い〜ると好都合である。
あたり、あらかじめベルオキシターセにチオール基を導
入したものを用い〜ると好都合である。
チオール基をベルオキシターセに導入する方法としては
、ベルオキシターセのアミン基を介してチオール基を導
入することができる。たとえば、Ｓ−アセチルメルカプ
トサクシニックアノハイトライド（ＡＭＳＡと略称する
こともある；５−ａｃｅＬｙｌ ｍｅｒｃａｐもｏｓｕ
ｃｃｉｎｉｃ ａｎｌ＋ｙｄｒｉｄｅ） 、Ｎ−サクン
ニミジル３−（２−ビリジルノチオ）プロピオネ−）（
ＳＰＤＰと略称することもある； Ｎ −ｓｕｃｃｉｎ
ｉｍｉｄｙｌ ：３− （２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉＬｈ
ｉｏ ） ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ）など通常のチオー
ル基導入試薬が有利に用いられる。
、ベルオキシターセのアミン基を介してチオール基を導
入することができる。たとえば、Ｓ−アセチルメルカプ
トサクシニックアノハイトライド（ＡＭＳＡと略称する
こともある；５−ａｃｅＬｙｌ ｍｅｒｃａｐもｏｓｕ
ｃｃｉｎｉｃ ａｎｌ＋ｙｄｒｉｄｅ） 、Ｎ−サクン
ニミジル３−（２−ビリジルノチオ）プロピオネ−）（
ＳＰＤＰと略称することもある； Ｎ −ｓｕｃｃｉｎ
ｉｍｉｄｙｌ ：３− （２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉＬｈ
ｉｏ ） ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ）など通常のチオー
ル基導入試薬が有利に用いられる。
したかって、チオール基をベルオキシター十との間に一
定の基か入っていることとなってもよい。
定の基か入っていることとなってもよい。
ＡＭＳＡを用いる場合、ベルオキシターセ約０１ないし
１０ｍｇを中性の緩衝液（たとえば０．１Ｍリン酸緩衝
液）約０．２ないし２ ｍｌに溶解し、約０１ないし４
ｍｇのＡＭＳＡを約０．０１ないし０１ｍ、ＬかＮ、
Ｎ−ツメチルホルムアミドに溶解して加え、約１０〜１
２０分間、約４〜３５°Ｃで反応させる。次に約０．２
〜２Ｍヒドロキシルアミンを加えて約４〜３５８Ｃで約
１〜６０分間反応させ、ゲルクロマトグラフィーで精製
してチオール化ベルオキシターセを得ることができる。
１０ｍｇを中性の緩衝液（たとえば０．１Ｍリン酸緩衝
液）約０．２ないし２ ｍｌに溶解し、約０１ないし４
ｍｇのＡＭＳＡを約０．０１ないし０１ｍ、ＬかＮ、
Ｎ−ツメチルホルムアミドに溶解して加え、約１０〜１
２０分間、約４〜３５°Ｃで反応させる。次に約０．２
〜２Ｍヒドロキシルアミンを加えて約４〜３５８Ｃで約
１〜６０分間反応させ、ゲルクロマトグラフィーで精製
してチオール化ベルオキシターセを得ることができる。
５ＰＤＰを用いる場合、ベルオキシターセ約０゜１ない
し１０ｍｇを中性の緩衝液（たとえば０．１Ｍリン酸緩
衝液）約０．１〜１１Ｚｌに溶解し、約０．１〜８ ｍ
ｇの５ＰＤＰのエタノール溶液を加えて約４〜３５°Ｃ
で約１０〜１２０分間反応させる。ゲルクロマトグラフ
ィーで過剰の試薬を除去したのち、ジチオスレイトール
（ｄｉＬｈｉｏむｈｒｅｉｔｏｌ ） などの還元用試
薬を加えて還元し、更にケルクロマＩ・グラフィーで精
製してチオール化ベルオキシターセを得ることができる
。
し１０ｍｇを中性の緩衝液（たとえば０．１Ｍリン酸緩
衝液）約０．１〜１１Ｚｌに溶解し、約０．１〜８ ｍ
ｇの５ＰＤＰのエタノール溶液を加えて約４〜３５°Ｃ
で約１０〜１２０分間反応させる。ゲルクロマトグラフ
ィーで過剰の試薬を除去したのち、ジチオスレイトール
（ｄｉＬｈｉｏむｈｒｅｉｔｏｌ ） などの還元用試
薬を加えて還元し、更にケルクロマＩ・グラフィーで精
製してチオール化ベルオキシターセを得ることができる
。
ベルオキシターセと抗体とを結合させる化合物として、
一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物を用いるが、上記式中、Ｒで表わされる２
価の６員環状炭化水素残基としては、飽和のもの、不飽
和のもののいずれてもよい。飽和の２価の６員環状炭化
水素の例としては、たとえば１．２−．１．３−＋ １
．４−シクロヘキシレンが挙げられ、不飽和の２価の６
員環状炭化水素残基の例としては、たとえば１．２−＋
１．３−．１．４−フェニレンなどが挙げられる。
一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物を用いるが、上記式中、Ｒで表わされる２
価の６員環状炭化水素残基としては、飽和のもの、不飽
和のもののいずれてもよい。飽和の２価の６員環状炭化
水素の例としては、たとえば１．２−．１．３−＋ １
．４−シクロヘキシレンが挙げられ、不飽和の２価の６
員環状炭化水素残基の例としては、たとえば１．２−＋
１．３−．１．４−フェニレンなどが挙げられる。
該化合物〔■〕において、ｎとしては工ないし５の整数
が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとしては２価の６員
環状炭化水素残基が好ましく、特に１，４−シクロヘキ
シレンが好ましい。
が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとしては２価の６員
環状炭化水素残基が好ましく、特に１，４−シクロヘキ
シレンが好ましい。
本発明の方法において用いられる化合物〔Ｉ〕は、たと
えばす・ンヤーナル・オフ・バイオケミス ト リー（
ＴＩ＋ｅ山＋＋＋ｒｎａｌ ｏｌ’ Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ
ｉｓＬｒｙ ） 第７９巻２３３頁（１９７６年）、ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オフ・バイオケミストリー（
ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ）第１０１巻３９５頁（１９７９年）、
特開昭５２−８５１６３号公報、特開昭５２−８５１６
４号公報等に記載の方法あるいはこれらの方法に準じて
製造することができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｘは水酸基またはハロケン原子を示す。
えばす・ンヤーナル・オフ・バイオケミス ト リー（
ＴＩ＋ｅ山＋＋＋ｒｎａｌ ｏｌ’ Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ
ｉｓＬｒｙ ） 第７９巻２３３頁（１９７６年）、ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オフ・バイオケミストリー（
ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ）第１０１巻３９５頁（１９７９年）、
特開昭５２−８５１６３号公報、特開昭５２−８５１６
４号公報等に記載の方法あるいはこれらの方法に準じて
製造することができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｘは水酸基またはハロケン原子を示す。
ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わされるマ
レイミド化合物［１）と一般式 〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子を示す。
レイミド化合物［１）と一般式 〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子を示す。
〕で表わされるサクシンイミド化合物〔■〕とを脱水剤
あるいは脱酸剤の存在下で反応させることにより製造す
ることができる。上記一般式において、ハロケン原子と
しては塩素、臭素などが挙げられ、アルカリ金属原子と
してはたとえばナトリウム、カリウムなとか挙げられる
。また反応に用いられる脱水剤としてはたとえば、硫駿
。
あるいは脱酸剤の存在下で反応させることにより製造す
ることができる。上記一般式において、ハロケン原子と
しては塩素、臭素などが挙げられ、アルカリ金属原子と
してはたとえばナトリウム、カリウムなとか挙げられる
。また反応に用いられる脱水剤としてはたとえば、硫駿
。
シンクロへキシルカルホシイミドなどが、脱酸剤として
はたとえばピリジン、トリエチルアミンなどが挙げられ
る。
はたとえばピリジン、トリエチルアミンなどが挙げられ
る。
前記化合物１１’ｌＩ］は、たとえば特開昭５２−８５
１６４号公報に記載の方法あるいはこれに準じて製造す
ることができる。たとえば一般式％式％ 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物ＣＩＶ ］を脱水閉環せしめることにより
得られる。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無水
酢酸又は無水酢酸と酢酸ナトリウム（無水物）を用い、
温和に加熱することにより反応させることができる。
１６４号公報に記載の方法あるいはこれに準じて製造す
ることができる。たとえば一般式％式％ 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物ＣＩＶ ］を脱水閉環せしめることにより
得られる。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無水
酢酸又は無水酢酸と酢酸ナトリウム（無水物）を用い、
温和に加熱することにより反応させることができる。
さらに別法として、ヘルベティカ・キミカ・アクタ（Ｈ
ｅ１ｖｅむｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ ＡｃＬａ ）第５
８巻（１９７５年）５３１頁に記載されている方法ある
いはこれに準じて製造するこ乏ができる。たとえば、一
般式 〔式中、２はアルキル基を示す〕で表わされるＮ−アル
コキシカルボニルマレイミド〔Ｖ〕と、一般式 ％式％ 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるアミノ酸ＣＶＩＩとを反応させて、一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるマレイミド化合物〔■〕を得る。次に一般式〔■
〕で表わされるサクシンイミド化合物ＣＩＩＩ）を加え
先に述べたと同様の脱水剤もしくは脱酸剤の存在下で反
応させることにより製造することができる。
ｅ１ｖｅむｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ ＡｃＬａ ）第５
８巻（１９７５年）５３１頁に記載されている方法ある
いはこれに準じて製造するこ乏ができる。たとえば、一
般式 〔式中、２はアルキル基を示す〕で表わされるＮ−アル
コキシカルボニルマレイミド〔Ｖ〕と、一般式 ％式％ 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるアミノ酸ＣＶＩＩとを反応させて、一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるマレイミド化合物〔■〕を得る。次に一般式〔■
〕で表わされるサクシンイミド化合物ＣＩＩＩ）を加え
先に述べたと同様の脱水剤もしくは脱酸剤の存在下で反
応させることにより製造することができる。
上記一般式〔■〕で表わされる化合物において２で表わ
されるアルキルとしては、たとえばメチル、エチルか挙
げられる。
されるアルキルとしては、たとえばメチル、エチルか挙
げられる。
ベルオキシダーセに化合物〔■〕を反応させるには、両
者をｐＨ約６ないし８の緩衝液中で約１０ないし５０°
Ｃの温度で約１０分ないし２４時間反応させることによ
って行なわれる。該緩衝液としては、たとえばｐＨ７，
０の０．１ Ｍリン酸緩衝液。
者をｐＨ約６ないし８の緩衝液中で約１０ないし５０°
Ｃの温度で約１０分ないし２４時間反応させることによ
って行なわれる。該緩衝液としては、たとえばｐＨ７，
０の０．１ Ｍリン酸緩衝液。
ｐＨ６３の０．０５Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。
このようにして得られたマレイミド化ベルオキシターゼ
の精製は、たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより
行なうことができる。該ゲルクロマトグラフィーを行な
う際に用いられる担体としてはたとえばセファテックス
Ｇ−２５（ファルマンア・ファインケミカル社（スエー
テン）製ｌ）。
の精製は、たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより
行なうことができる。該ゲルクロマトグラフィーを行な
う際に用いられる担体としてはたとえばセファテックス
Ｇ−２５（ファルマンア・ファインケミカル社（スエー
テン）製ｌ）。
バイオゲルＰ−２〔バイオ・ラット・ラホラトリース社
（米国）製〕などが挙げられる。
（米国）製〕などが挙げられる。
マレイミド化ベルオキシターセを抗ＣＥＡ抗体と反応さ
せる場合、抗ＣＥＡ抗体■ｇＧあるいはペプシン分解し
て得られたＦ（ａｂ’）２画分を、メルカプトエチルア
ミノ類の存在下で還元し、ケルクロマＩ・グラフィーに
よって精製された抗ＣＥＡ抗体１ｇＧもしくはＦａｂ’
とマレイミド化ベルオキシターセとを反応させる。
せる場合、抗ＣＥＡ抗体■ｇＧあるいはペプシン分解し
て得られたＦ（ａｂ’）２画分を、メルカプトエチルア
ミノ類の存在下で還元し、ケルクロマＩ・グラフィーに
よって精製された抗ＣＥＡ抗体１ｇＧもしくはＦａｂ’
とマレイミド化ベルオキシターセとを反応させる。
該反応は、両者を緩衝液中で約０°Ｃないし４０℃の温
度で、約１ないし４８時間反応させることにより行なう
ことかできる。該緩衝液としては、たとえばｐ Ｈ６，
０の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む
０，１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。
度で、約１ないし４８時間反応させることにより行なう
ことかできる。該緩衝液としては、たとえばｐ Ｈ６，
０の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む
０，１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。
このようにして得られたベルオキシダーセ標識抗体は、
たとえばケルクロマトクラフィーなどにより精製するこ
とができる。該ゲルクロマトグラフィーに用いられる担
体としては、たとえばウルトロゲルＡｃＡ ４４ ［Ｌ
ＫＢ社（フランス）製〕、セファクリルＳ−２００［：
ファルマシア・ファインケミカル（スエーテン）製〕な
どが挙げられる。
たとえばケルクロマトクラフィーなどにより精製するこ
とができる。該ゲルクロマトグラフィーに用いられる担
体としては、たとえばウルトロゲルＡｃＡ ４４ ［Ｌ
ＫＢ社（フランス）製〕、セファクリルＳ−２００［：
ファルマシア・ファインケミカル（スエーテン）製〕な
どが挙げられる。
旦
本発明の測定方法を以下に具体釣船こ説明する。
まず、■：担体に保持された抗体に、ホ１１定すべきＣ
ＥＡ含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後
これに前記で得られたベルオキシターセと抗ＣＥＡ抗体
との結合物を加えて反応させる。
ＥＡ含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後
これに前記で得られたベルオキシターセと抗ＣＥＡ抗体
との結合物を加えて反応させる。
本発明の酵素免疫測定法において測定対象となるＣＥＡ
を含む被検試料としては、堕、血清、血漿、髄液あるい
は各種臓器抽出物等が挙げられ、とりわけ尿、血清およ
び血漿が繁用される。
を含む被検試料としては、堕、血清、血漿、髄液あるい
は各種臓器抽出物等が挙げられ、とりわけ尿、血清およ
び血漿が繁用される。
■：■で得られた反応生成物にベルオキシターセの基質
を加え、生した物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。
を加え、生した物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。
■：上記■−■の操作を既知量のＣＥＡの標準溶液に対
し予め行ない、ＣＥＡと吸光度もしくは蛍光強度との関
係を標準曲線として作成しておく。
し予め行ない、ＣＥＡと吸光度もしくは蛍光強度との関
係を標準曲線として作成しておく。
■：未知量のＣＥＡを含む分析対象物について得られた
吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析対
象物中のＣＥＡ含量を測定する。
吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析対
象物中のＣＥＡ含量を測定する。
本発明のサンドインチ法によるＣＥＡの免疫化学的測定
法に用いられる定量用キットとしては、〔Ａ〕主として
、 （１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体（２）本発明方
法により得られたペルオキシクー士で標識化された抗Ｃ
ＥＡ抗体（化合物〔■〕を用イて結合されている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
一方はモノクローナル抗体である。
法に用いられる定量用キットとしては、〔Ａ〕主として
、 （１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体（２）本発明方
法により得られたペルオキシクー士で標識化された抗Ｃ
ＥＡ抗体（化合物〔■〕を用イて結合されている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
一方はモノクローナル抗体である。
（３）標準ＣＥＡ
（４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％牛血清および約１％牛血清アルブミン（以下、Ｂ
ＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ないし９
のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。）
。
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％牛血清および約１％牛血清アルブミン（以下、Ｂ
ＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ないし９
のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。）
。
（５）ベルオキシターゼ活性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロキ
シフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、ｏ−フェ
ニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。
例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロキ
シフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、ｏ−フェ
ニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。
が挙げられる。
［Ｂ）主として、
（１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体。
（２）本発明方法により得られたペルオキシクー士で標
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたペルオキシ
クー士と抗ＣＥＡ抗体とか化合物ＣＩ）を用いて結合さ
れている。）。
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたペルオキシ
クー士と抗ＣＥＡ抗体とか化合物ＣＩ）を用いて結合さ
れている。）。
（３）標準ＣＥＡ。
（４）上記（２）〜（８）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる
。）。
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる
。）。
（５）ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質としてＰ−ハイドロキ
シフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、ｏ−フェ
ニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。
例として蛍光法の場合、酵素基質としてＰ−ハイドロキ
シフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、ｏ−フェ
ニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。
が挙げられる。
さらに〔Ｃ〕主として、
（１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体。
（２）本発明方法により得られたペルオキシクー士で標
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたペルオキシ
クー士と抗ＣＥＡ抗体とが化合物〔■〕を用いて結合さ
れている。） 上記（１）おまび（２）の２種の抗体のうち少なくとも
一方はモノクローナル抗体である。
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたペルオキシ
クー士と抗ＣＥＡ抗体とが化合物〔■〕を用いて結合さ
れている。） 上記（１）おまび（２）の２種の抗体のうち少なくとも
一方はモノクローナル抗体である。
（３）標準ＣＥＡ。
（４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる
。） （５）ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質としてＰ−ハイドロキ
シフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フェ
ニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる
。） （５）ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質としてＰ−ハイドロキ
シフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フェ
ニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。
か挙げられる。
上記のキットは例えば下記の方法により使用することが
できる。
できる。
標準ＣＥＡもしくは被検液的１０ないし２００μｅに試
薬（４）を加えて希釈し、一定量の試薬（１）を加えて
約０ないし４０°Ｃで約１ないし４８時間反応させる。
薬（４）を加えて希釈し、一定量の試薬（１）を加えて
約０ないし４０°Ｃで約１ないし４８時間反応させる。
担体を水洗後、試薬（２）の約１０ないし３００μｌを
加えたのち、約Ｏないし４０６Ｃで反応させる。約１な
いし４８時間反応後、担体を洗浄し担体上に結合してい
るベルオキシダーセ活性を測定する。即ちペルオキシク
ー士の基質液約１０〜１０００μｌを加えて約２０〜４
０°Ｃで約０．２〜２４時間反応させたのち、酵素反応
を伴出さ才、反応液中の吸光度もしくは蛍光強度を測定
する。
加えたのち、約Ｏないし４０６Ｃで反応させる。約１な
いし４８時間反応後、担体を洗浄し担体上に結合してい
るベルオキシダーセ活性を測定する。即ちペルオキシク
ー士の基質液約１０〜１０００μｌを加えて約２０〜４
０°Ｃで約０．２〜２４時間反応させたのち、酵素反応
を伴出さ才、反応液中の吸光度もしくは蛍光強度を測定
する。
本発明の免疫化学的分析法用試薬を用いれば、通常の臨
床検査室において簡単な操作でＣＥＡの高感度測定が可
能となる。
床検査室において簡単な操作でＣＥＡの高感度測定が可
能となる。
実施例
参考例１ 過塩素酸抽出法による精製およびモノクロー
ナル抗体の作製 （１）抗原の精製 Ｋｒｕｐｅｙらの方法〔イムフケ６ストリー（Ｉｎｕｎ
ｕｎｏ−ＣｈｅｍｉｓＬｒｙ ）、第９巻（１９７２年
）、第６１７頁〕に準じてＣＥＡを精製した。すなわち
大腸癌組織１００ｇを細断し、これに４００ ｍＬの蒸
留水を加えてホモジナイザーで水冷下１時間破砕して懸
濁液を調製した。次に、等容量の２Ｍ過塩素酸を加えて
室温で３０分間攪拌して抽出した。次に遠心分離し、そ
の上清について蒸留水に対して透析したのち凍結乾燥し
た。次に０．１５ Ｍ ＮａＣｌ を含む０．０５ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液を用いてセファロース４Ｂ［ファルマ
シア製（スエーデン）］のカラム（２，８ｃｍＸ １０
０ｃｍ ）にかけてゲルクロマトグラフィーを行なった
。ＣＥＡを含むフラクションを透析し、凍結乾燥後、更
にセファデックスＧ−２００のカラム（２，８ｃ＋ｎ
Ｘ １００ ｃｍ ）でゲルクロマトグラフィーを行な
い、ＣＥＡ溶出画分を透析、凍結乾燥してＣＥＡの精製
抗原を得た（ ３ ｍｙ ）。
ナル抗体の作製 （１）抗原の精製 Ｋｒｕｐｅｙらの方法〔イムフケ６ストリー（Ｉｎｕｎ
ｕｎｏ−ＣｈｅｍｉｓＬｒｙ ）、第９巻（１９７２年
）、第６１７頁〕に準じてＣＥＡを精製した。すなわち
大腸癌組織１００ｇを細断し、これに４００ ｍＬの蒸
留水を加えてホモジナイザーで水冷下１時間破砕して懸
濁液を調製した。次に、等容量の２Ｍ過塩素酸を加えて
室温で３０分間攪拌して抽出した。次に遠心分離し、そ
の上清について蒸留水に対して透析したのち凍結乾燥し
た。次に０．１５ Ｍ ＮａＣｌ を含む０．０５ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液を用いてセファロース４Ｂ［ファルマ
シア製（スエーデン）］のカラム（２，８ｃｍＸ １０
０ｃｍ ）にかけてゲルクロマトグラフィーを行なった
。ＣＥＡを含むフラクションを透析し、凍結乾燥後、更
にセファデックスＧ−２００のカラム（２，８ｃ＋ｎ
Ｘ １００ ｃｍ ）でゲルクロマトグラフィーを行な
い、ＣＥＡ溶出画分を透析、凍結乾燥してＣＥＡの精製
抗原を得た（ ３ ｍｙ ）。
（２）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製前項（１）で
得た精製抗原７０μｇを生理食塩水１５０ＩＬｌに溶解
し、これにフロイントの完全アジュバント〔Ｆｒｅｕｎ
ｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎむ、″免疫
の生化学“、橘ら著、第２６頁、共立出版株式会社（１
９６７年）：］２５０μｅを加えてよく混和して乳剤を
作り、これをＢＡＬＢ／Ｃマウス皮下に投与した。更に
、２週毎に２回、フロイントの不完全アジュバントを用
いて免疫し、最終免疫として精製抗原１８０μｐを生理
食塩水に溶解して得た４００μβを静脈投与し、３日後
牌臓を取り出した。次に、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ Ｍ Ｅ Ｍ 培地でよく洗浄したのち、
当該肺細胞１×１０８個とマウスミエローマ細胞（Ｐ３
ＵＪ）２×１０７個とを混合し、７００ ｒｐｍで１５
分間遠心してペレットをつくった。次にポリエチレング
リコール６０００をＲＰＭｌ−１６４０に４５％に溶解
した液０．４ ｍｌを加えて、更にＲＰＭＩ−１６４０
，１５ｍＬを徐々に加えて希釈したのち、７００ ｒｐ
ｍで１５分間遠心分離し、細胞を２０％牛脂児血清を含
むＲＰＭＩ−１６４０培地１００ ｒｎＬに分散させた
。次に２４ウエルの培養プレート〔フロー社製（米国）
〕に上記細胞分散液２． ＯｒｎＬずつ注入し、更に２
日目。
得た精製抗原７０μｇを生理食塩水１５０ＩＬｌに溶解
し、これにフロイントの完全アジュバント〔Ｆｒｅｕｎ
ｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎむ、″免疫
の生化学“、橘ら著、第２６頁、共立出版株式会社（１
９６７年）：］２５０μｅを加えてよく混和して乳剤を
作り、これをＢＡＬＢ／Ｃマウス皮下に投与した。更に
、２週毎に２回、フロイントの不完全アジュバントを用
いて免疫し、最終免疫として精製抗原１８０μｐを生理
食塩水に溶解して得た４００μβを静脈投与し、３日後
牌臓を取り出した。次に、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ Ｍ Ｅ Ｍ 培地でよく洗浄したのち、
当該肺細胞１×１０８個とマウスミエローマ細胞（Ｐ３
ＵＪ）２×１０７個とを混合し、７００ ｒｐｍで１５
分間遠心してペレットをつくった。次にポリエチレング
リコール６０００をＲＰＭｌ−１６４０に４５％に溶解
した液０．４ ｍｌを加えて、更にＲＰＭＩ−１６４０
，１５ｍＬを徐々に加えて希釈したのち、７００ ｒｐ
ｍで１５分間遠心分離し、細胞を２０％牛脂児血清を含
むＲＰＭＩ−１６４０培地１００ ｒｎＬに分散させた
。次に２４ウエルの培養プレート〔フロー社製（米国）
〕に上記細胞分散液２． ＯｒｎＬずつ注入し、更に２
日目。
５白目、および８日目に培養上清の半量をＨＡＴ培地に
おきかえた。１４日後における培養上清について抗体価
を測定したところ、計１２０ウェル中１２ウェルに陽性
を認めた。
おきかえた。１４日後における培養上清について抗体価
を測定したところ、計１２０ウェル中１２ウェルに陽性
を認めた。
次に、これら陽性ハイブリドーマのクローニングを牛胎
児血清２０％およびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ーター（ｆｅｅｄｅｒ ）として加えた。
児血清２０％およびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ーター（ｆｅｅｄｅｒ ）として加えた。
ＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、限界希釈（ｌｉｍ−
ｉＬｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ）法を繰り返して行な
い最終的にはモノクローナル抗ＣＥＡ抗体を産生ずる１
２種類のハイブリドーマが得られた。これらを鉱油で処
理されたＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注入し、２〜８
週間後に腹水を採取することにより、モノクローナル抗
ＣＥＡ抗体を得た。これらのモノクローナル抗体を硫酸
アンモニウム法で塩析し、それぞれグロブリン画分を得
た（ＭＱ〜に１〜ＭＯ〜に１２）。
ｉＬｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ）法を繰り返して行な
い最終的にはモノクローナル抗ＣＥＡ抗体を産生ずる１
２種類のハイブリドーマが得られた。これらを鉱油で処
理されたＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注入し、２〜８
週間後に腹水を採取することにより、モノクローナル抗
ＣＥＡ抗体を得た。これらのモノクローナル抗体を硫酸
アンモニウム法で塩析し、それぞれグロブリン画分を得
た（ＭＱ〜に１〜ＭＯ〜に１２）。
参考例２ 過ヨウ素酸架橋法
伸根らの方法〔す・ジャーナル・オブ・ヒストケミスト
リー・アンド・サイトゲミストリー（Ｔｂｅ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ ＨｉｓＬｏｃｌ＋ｅｍｉｓ 電−ｒｙ
ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅ−ｍｉｓＬｒｙ ）第２２巻（
１９７４年）第１０８４頁〕に従って行なった。７ ｍ
ｇの西洋わさびベルオキシターセを１ ｍｌの０．３Ｍ
重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８１）にとかし、０．１
ｍｌの１％１−フルオロ−２，４−ジニトロベン士ンを
加えて室温で１時間反応させた。次にＱ、 ０６ Ｍ
Ｎａ ＩＯ２１ｍｌを加えて室温で３０分間攪拌したの
ち、０．１６Ｍエチレングリコール水溶液１ ｍｌを加
えて室温で１時間放置した。００１Ｍ炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９，５）に対して１夜透析した。
リー・アンド・サイトゲミストリー（Ｔｂｅ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ ＨｉｓＬｏｃｌ＋ｅｍｉｓ 電−ｒｙ
ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅ−ｍｉｓＬｒｙ ）第２２巻（
１９７４年）第１０８４頁〕に従って行なった。７ ｍ
ｇの西洋わさびベルオキシターセを１ ｍｌの０．３Ｍ
重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８１）にとかし、０．１
ｍｌの１％１−フルオロ−２，４−ジニトロベン士ンを
加えて室温で１時間反応させた。次にＱ、 ０６ Ｍ
Ｎａ ＩＯ２１ｍｌを加えて室温で３０分間攪拌したの
ち、０．１６Ｍエチレングリコール水溶液１ ｍｌを加
えて室温で１時間放置した。００１Ｍ炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９，５）に対して１夜透析した。
後述の実施例１−（２）で得られたモノクローナル抗Ｃ
ＥＡ抗体ガンマ・グロブリンフラクション（Ｍｏ−Ｔ３
）５ｍｇを００１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５
） １ ｍｌにとかし、先に調製したアルデヒドペルオ
キシターセと混合して室温で３時間反応させてから、５
ｍｇの水素化硼素ナトリウムに加えて４℃で１夜反応
させた。Ｑ、 １５ Ｍ ＮａＣ１を含む０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，１）に対して４°Ｃで１夜透析し
た後、ウルトロゲルＡｃＡ４４を充てんしたカラム（１
５印×４５ｃｍ）を用いるゲルクロマトグラフィーにか
け、０．１Ｍリン酸緩衝液 （ｐＨ４６，５）で溶出さ
せた。後述の実施例１−（５）と同様に溶出液の２８０
および４０３ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定して
目的フラクションを分取した。得られたモノクローナル
抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体はＢＳＡとして０．１％、
マーチオレートとして０．００５％になるようにして４
℃で保存した。
ＥＡ抗体ガンマ・グロブリンフラクション（Ｍｏ−Ｔ３
）５ｍｇを００１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５
） １ ｍｌにとかし、先に調製したアルデヒドペルオ
キシターセと混合して室温で３時間反応させてから、５
ｍｇの水素化硼素ナトリウムに加えて４℃で１夜反応
させた。Ｑ、 １５ Ｍ ＮａＣ１を含む０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，１）に対して４°Ｃで１夜透析し
た後、ウルトロゲルＡｃＡ４４を充てんしたカラム（１
５印×４５ｃｍ）を用いるゲルクロマトグラフィーにか
け、０．１Ｍリン酸緩衝液 （ｐＨ４６，５）で溶出さ
せた。後述の実施例１−（５）と同様に溶出液の２８０
および４０３ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定して
目的フラクションを分取した。得られたモノクローナル
抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体はＢＳＡとして０．１％、
マーチオレートとして０．００５％になるようにして４
℃で保存した。
実施例 １
（１）抗原の精製
大腸癌組織２００ｇを細断し、これに６００ ｒｎｌの
１％Ｔｗｅｅｎ ２０ Ｃシグマ社（米国）製〕を含む
０、１５ Ｍ ＮａＣ４溶液を加えてホモジナイザーで
氷冷下１０分間破砕して懸濁液を調製した。さらに超音
波発生機で水冷下１時間処理したのち、１２゜０００ｒ
ｐｍ２０分間遠心分離した。上清を蒸留水に対して透析
したのち凍結乾燥した。次に０，２Ｍクエン酸緩衝液（
ｐＨ６，５）に溶解し、同じ緩衝液を用いて調製したコ
ンカナバリンＡ結合セファロース４Ｂ〔ファルマシア製
（スエーテン）〕のカラム（２，２ｃｍ Ｘ ２６ ｃ
ｍ）にかけた。カラムに保持された物質をα−メチル−
Ｄ−マンノサイドを含む緩衝液を用いて溶出した。蒸留
水に対して透析したのち凍結乾燥した。次に０．２ Ｍ
クエン酸緩衝液（ｐＨ６，５）を用いてウルトロゲルＡ
ｃＡ−８４ＣＬＫＢ社製（フランス）〕のカラム（２３
印×１００ ｃｍ ）にかけてゲルクロマトグラフィー
を行ない、２８０〜３５０ ｒｎＬの画分を蒸留水に対
して透析し、凍結乾燥してＣＥＡの精製抗原を得たく５
ｍｇ ）。
１％Ｔｗｅｅｎ ２０ Ｃシグマ社（米国）製〕を含む
０、１５ Ｍ ＮａＣ４溶液を加えてホモジナイザーで
氷冷下１０分間破砕して懸濁液を調製した。さらに超音
波発生機で水冷下１時間処理したのち、１２゜０００ｒ
ｐｍ２０分間遠心分離した。上清を蒸留水に対して透析
したのち凍結乾燥した。次に０，２Ｍクエン酸緩衝液（
ｐＨ６，５）に溶解し、同じ緩衝液を用いて調製したコ
ンカナバリンＡ結合セファロース４Ｂ〔ファルマシア製
（スエーテン）〕のカラム（２，２ｃｍ Ｘ ２６ ｃ
ｍ）にかけた。カラムに保持された物質をα−メチル−
Ｄ−マンノサイドを含む緩衝液を用いて溶出した。蒸留
水に対して透析したのち凍結乾燥した。次に０．２ Ｍ
クエン酸緩衝液（ｐＨ６，５）を用いてウルトロゲルＡ
ｃＡ−８４ＣＬＫＢ社製（フランス）〕のカラム（２３
印×１００ ｃｍ ）にかけてゲルクロマトグラフィー
を行ない、２８０〜３５０ ｒｎＬの画分を蒸留水に対
して透析し、凍結乾燥してＣＥＡの精製抗原を得たく５
ｍｇ ）。
（２）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製前項（１）で
得た精製抗原７０μｇを生理食塩水１５０μｌに溶解し
、これにフロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ
’ｓ ｃｏｍｐｌｅもｅ ａｄｊｕｖａｎも、″免疫の
生化学“、橘ら著、第２６頁、共立出版株式会社（１９
６７年））２５０μ４を加えてよく混和して乳剤を作り
、これをＥＡＬＢ／Ｃマウス皮下に投与した。更に、２
週毎に２回、フロイツトの不完全アシユバノドを用いて
免疫し、最終免疫として精製抗原１８０ ＩＬｇ を生
理食塩水に溶解して得た４００μＬに静脈投与し、３日
後牌臓を取り出した。
得た精製抗原７０μｇを生理食塩水１５０μｌに溶解し
、これにフロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ
’ｓ ｃｏｍｐｌｅもｅ ａｄｊｕｖａｎも、″免疫の
生化学“、橘ら著、第２６頁、共立出版株式会社（１９
６７年））２５０μ４を加えてよく混和して乳剤を作り
、これをＥＡＬＢ／Ｃマウス皮下に投与した。更に、２
週毎に２回、フロイツトの不完全アシユバノドを用いて
免疫し、最終免疫として精製抗原１８０ ＩＬｇ を生
理食塩水に溶解して得た４００μＬに静脈投与し、３日
後牌臓を取り出した。
次に、Ｄｕｌｂｅｃｃ＃ｓ ｍｏｄｉｌ’ｉｅｄ Ｍ
Ｅ Ｍ培地でよく洗浄したのち、当該牌細胞１×１０個
とマウスミエローマ細胞（Ｐ３ Ｕｌ） ２ Ｘ １０
７個とを混合し、７００ｒｐｍで１５分間遠心してペレ
ットをつくった。次にポリエチレングリコール６０００
をＲＰＭ Ｉ −１６４０に４５％に溶解した液０．４
ａｔを加えて、更にＲＰＭＩ−１６４０１５ｍ１を徐
々に加えて希釈したのち、７００ ｒｐｍで１５分間遠
心分離し、細胞を２０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１
６４０培地１００ ｍｌに分散させた。次に２４ウエル
の培養プレート〔フロー社製（米国）〕に上記細胞分散
液２． Ｏｍｌずつ注入し、更に２白目、５日目、およ
び８日日に培養上清の半量をＨＡＴ培地におきえた。１
４日後における培養上清について抗体価を測定したとこ
ろ、計７２ウェル中９ウェルに陽性を認めた。
Ｅ Ｍ培地でよく洗浄したのち、当該牌細胞１×１０個
とマウスミエローマ細胞（Ｐ３ Ｕｌ） ２ Ｘ １０
７個とを混合し、７００ｒｐｍで１５分間遠心してペレ
ットをつくった。次にポリエチレングリコール６０００
をＲＰＭ Ｉ −１６４０に４５％に溶解した液０．４
ａｔを加えて、更にＲＰＭＩ−１６４０１５ｍ１を徐
々に加えて希釈したのち、７００ ｒｐｍで１５分間遠
心分離し、細胞を２０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１
６４０培地１００ ｍｌに分散させた。次に２４ウエル
の培養プレート〔フロー社製（米国）〕に上記細胞分散
液２． Ｏｍｌずつ注入し、更に２白目、５日目、およ
び８日日に培養上清の半量をＨＡＴ培地におきえた。１
４日後における培養上清について抗体価を測定したとこ
ろ、計７２ウェル中９ウェルに陽性を認めた。
次に、これら陽性ハイブリトーマのクローニングを牛胎
児血清２０％おＪびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ーター（ｆｅｅｄｅｒ ）として加えたＲＰＭＩ−１６
４０培地で希釈し、限界希釈（！ｉ１−ｍ１ｔｉｎ ｄ
ｉｌｕｔｉｏｎ ）法を繰り返して行ない最終的にはモ
ノクローナル抗ＣＥＡ抗体を産生ずる５種類のハイブリ
トーマか得られた。これらを鉱油で処理されたＢＡＬＢ
／Ｃマウスの腹腔内に注入し、２〜３週間後に腹水を採
取することにより、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体を得た
。これらのモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム法で
塩析し、それぞれグロフリン画分を得た（ＭＯ−Ｔ＋〜
ＭＯ−Ｔ６）。
児血清２０％おＪびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ーター（ｆｅｅｄｅｒ ）として加えたＲＰＭＩ−１６
４０培地で希釈し、限界希釈（！ｉ１−ｍ１ｔｉｎ ｄ
ｉｌｕｔｉｏｎ ）法を繰り返して行ない最終的にはモ
ノクローナル抗ＣＥＡ抗体を産生ずる５種類のハイブリ
トーマか得られた。これらを鉱油で処理されたＢＡＬＢ
／Ｃマウスの腹腔内に注入し、２〜３週間後に腹水を採
取することにより、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体を得た
。これらのモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム法で
塩析し、それぞれグロフリン画分を得た（ＭＯ−Ｔ＋〜
ＭＯ−Ｔ６）。
（８）ポリクローナル抗ＣＦ’Ａ抗体の作製前項（１）
で得た精製抗原２ ｍｇを生理食塩水１ ｍｌに溶解し
、これにフロイントの完全アジュバント１ｍＬを加えて
よく混和して乳剤を作り、これをウサキの両大朝部筋肉
内および背部皮下数箇所に注射した。以上の操作を３週
毎に５回行ない最終免疫後１週間で採血して抗血清を得
た。硫酸アンモニウム法で塩析してグロブリノ画分を調
製したのち、ＣＥＡ結合セファロース４Ｂのカラムを用
いるアフィニティ・クロマトクラフィーに供した。カラ
ムに保持された抗体画分を０１７Ｍグリノン−塩酸緩衝
液（ｐＨ２，８）で溶出することにより、 ＣＥＡに強
い親和性を有するポリクローナル抗体を得た。
で得た精製抗原２ ｍｇを生理食塩水１ ｍｌに溶解し
、これにフロイントの完全アジュバント１ｍＬを加えて
よく混和して乳剤を作り、これをウサキの両大朝部筋肉
内および背部皮下数箇所に注射した。以上の操作を３週
毎に５回行ない最終免疫後１週間で採血して抗血清を得
た。硫酸アンモニウム法で塩析してグロブリノ画分を調
製したのち、ＣＥＡ結合セファロース４Ｂのカラムを用
いるアフィニティ・クロマトクラフィーに供した。カラ
ムに保持された抗体画分を０１７Ｍグリノン−塩酸緩衝
液（ｐＨ２，８）で溶出することにより、 ＣＥＡに強
い親和性を有するポリクローナル抗体を得た。
（４） モノクローナル抗体の反応性の比較前項（２）
および参考例１セ得られた各種モノクローナル抗体のＣ
ＥＡおよび関連抗原に対する反応性を調べた。
および参考例１セ得られた各種モノクローナル抗体のＣ
ＥＡおよび関連抗原に対する反応性を調べた。
試薬：
■ 前項（２）および参考例１で得られたモノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート■ 西洋わさびベ
ルオキシターセ （以下ＨＲＰと略称する）標識抗ＣＥ
Ａ抗体複合体［ＤＡＫＯＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（
テンマーク）製〕■ ＣＥＡおよびＣＥＡ関連抗原 ■ 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、０．１５Ｍ ＮａＣ１
を含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液）、緩衝Ａ
（０，１５ＭＮａＣｌを含むｐＨ７，０の００２Ｍ
リン酸緩衝液） ■ ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬００２％過
酸化水素と０１５％０−フェニレンジアミノを含むｐ
Ｈ４，８の０．１Ｍクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝
液および反応停止液（２Ｎ−硫酸）。
ル抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート■ 西洋わさびベ
ルオキシターセ （以下ＨＲＰと略称する）標識抗ＣＥ
Ａ抗体複合体［ＤＡＫＯＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（
テンマーク）製〕■ ＣＥＡおよびＣＥＡ関連抗原 ■ 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、０．１５Ｍ ＮａＣ１
を含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液）、緩衝Ａ
（０，１５ＭＮａＣｌを含むｐＨ７，０の００２Ｍ
リン酸緩衝液） ■ ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬００２％過
酸化水素と０１５％０−フェニレンジアミノを含むｐ
Ｈ４，８の０．１Ｍクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝
液および反応停止液（２Ｎ−硫酸）。
抗体感作マイクロプレートの調製：
ＥＩＡ用イムノプレートＩ〔ヌンク社（テンマーク）製
〕の各ウェルに０゜１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９６）で希釈
して調製した前項（２）あるいは参考例１のモノクロー
ナル抗ＣＥＡ抗体溶液（５０μｇ／ｍｌ ）を１００μ
βずつ注入して４℃で一夜放置して感作さぜた。０１％
ＢＳＡを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
洗浄したのち、用時まで冷所保存した。
〕の各ウェルに０゜１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９６）で希釈
して調製した前項（２）あるいは参考例１のモノクロー
ナル抗ＣＥＡ抗体溶液（５０μｇ／ｍｌ ）を１００μ
βずつ注入して４℃で一夜放置して感作さぜた。０１％
ＢＳＡを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
洗浄したのち、用時まで冷所保存した。
測定：
緩衝液Ｂに溶解させたＣＥＡ標準溶液１００μｌを各ウ
ェルに注入し、３７°Ｃで３時間反応させた。
ェルに注入し、３７°Ｃで３時間反応させた。
各ウェルを緩衝液Ａで洗浄後、ＨＲＰ標識抗ＣＥＡ複合
体溶液（ＨＲＰとして８０ｎｙ／ウエル）１００ ＬＬ
ｎを加えて２５°Ｃで３５時間さらに反応させた。緩衝
液Ａで洗浄し、これに００２％過酸（ｔＪ［と０．１５
％０−フェニレンジアミノを含む０．１Ｍクエン酸−リ
ン酸二すトリウム緩ｆｆｉＭ（ｐＨ４，８）１００μβ
を加えて３０°Ｃで３０分間反応させ、２Ｎ−硫酸１０
０μｅずつ加えて反応を停止させてから、マイクロプレ
ート用自動比色計〔タイターチック・マルチスキャン；
フロー社（米国＞製〕を用い、ブランクを対照にして４
９０ ｎｍにおける吸光度を測定した。
体溶液（ＨＲＰとして８０ｎｙ／ウエル）１００ ＬＬ
ｎを加えて２５°Ｃで３５時間さらに反応させた。緩衝
液Ａで洗浄し、これに００２％過酸（ｔＪ［と０．１５
％０−フェニレンジアミノを含む０．１Ｍクエン酸−リ
ン酸二すトリウム緩ｆｆｉＭ（ｐＨ４，８）１００μβ
を加えて３０°Ｃで３０分間反応させ、２Ｎ−硫酸１０
０μｅずつ加えて反応を停止させてから、マイクロプレ
ート用自動比色計〔タイターチック・マルチスキャン；
フロー社（米国＞製〕を用い、ブランクを対照にして４
９０ ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果を第１表に示したが、前記（２）で得られたモノク
ローナル抗ＣＥＡ抗体は、６抗体中４抗体でＣＥＡ関連
抗原であるＮ ＣＡ （ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｒ
ｏｓ８−ｒｅａｃＬｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ） やＮ
ＣＡ −２（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏｓｓｒｅ
ａｃＬｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ −２） と反応せず、
したがって高い確率でＣＥＡに特異的なモノクローナル
抗ＣＥＡ抗体の得られることが分った。一方、参考例１
で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は１２抗体中１
抗体（Ｍ（１−に５）だけがＮＣＡならびにＮＣＡ−２
とは反応せず残りの１１抗体はこれらのＣＥＡ関連抗原
と反応した。
ローナル抗ＣＥＡ抗体は、６抗体中４抗体でＣＥＡ関連
抗原であるＮ ＣＡ （ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｒ
ｏｓ８−ｒｅａｃＬｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ） やＮ
ＣＡ −２（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏｓｓｒｅ
ａｃＬｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ −２） と反応せず、
したがって高い確率でＣＥＡに特異的なモノクローナル
抗ＣＥＡ抗体の得られることが分った。一方、参考例１
で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は１２抗体中１
抗体（Ｍ（１−に５）だけがＮＣＡならびにＮＣＡ−２
とは反応せず残りの１１抗体はこれらのＣＥＡ関連抗原
と反応した。
＜ｇＸｒ＃−臼）
第１表
ＭＯ−に１− 十 ＋
に２ −− 、＋ ＋
に３ ＋ ＋ ＋
に４ − −− ＋
に５ −＋ ＋
に６ − − −−
に７ ＋ ＋ ＋
Ｋ ８ →−＋ ←
に９ ＋ ＋ ＋
ＫＩＯ−−＋
Ｋｌｌ −＋ ＋
に１２− ＋ 十
ＭＯ−ＴＩ ＋ ＋＋
Ｔ２ − − −
Ｔ８ − − −
Ｔ ４ − 〜 −
Ｔ５ ＋ ＋ ＋
Ｔ６ −− − −
＋２反応性あり −：反応性なし
く５）ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’） −Ｈ
ＲＰ複合体の製造 （ａ） マレイミド基の導入 ６ ｍｇの西洋わさびベルオキシターセ〔ベーリンガー
マンハイム社（西ドイツ）製〕を１ ｍｌの０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、５０μ４のＮ、Ｎ−
ジメチルホルムアミドにとかした結合試薬ＭＭＣ−（一
般式ＣＩ）において、ｎ−１，Ｒ＝シクロへキンレノで
ある化合物） ４．８ ｍｇを加えてｓｏ”ｃで６０分
間攪拌しながら反応させた。
ＲＰ複合体の製造 （ａ） マレイミド基の導入 ６ ｍｇの西洋わさびベルオキシターセ〔ベーリンガー
マンハイム社（西ドイツ）製〕を１ ｍｌの０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、５０μ４のＮ、Ｎ−
ジメチルホルムアミドにとかした結合試薬ＭＭＣ−（一
般式ＣＩ）において、ｎ−１，Ｒ＝シクロへキンレノで
ある化合物） ４．８ ｍｇを加えてｓｏ”ｃで６０分
間攪拌しながら反応させた。
生成した沈殿を遠心分離して除去し、上清をセファテッ
クスＧ−２５のカラム（１，０Ｘ４５Ｃ＋＋＋）に通し
、０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液で溶出させた。タンパク
を含む両分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮した。
クスＧ−２５のカラム（１，０Ｘ４５Ｃ＋＋＋）に通し
、０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液で溶出させた。タンパク
を含む両分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮した。
このようにして調製したマレイミド化ベルオキシダーセ
においてベルオキシクーセ１分子あたり導入されたマレ
イミド基の数は１，０〜１．２個であった（ベルオキシ
ターセの分子量を４０，０００、Ｅ２８０ｎＸ１″−２
２，７５として計算）。
においてベルオキシクーセ１分子あたり導入されたマレ
イミド基の数は１，０〜１．２個であった（ベルオキシ
ターセの分子量を４０，０００、Ｅ２８０ｎＸ１″−２
２，７５として計算）。
１％
（ｂ） マレイミド化ベルオキシターゼと抗ＣＥＡ前項
（３）で得られたポリクローナル抗ＣＥＡ抗体５ ｍｇ
に０．１ ｍｇのペプシンを加え３０℃で一夜反応後、
セファデックスＧ−１５０カラム（ｉｌ［２，５Ｇ、長
さ５５ ｃｍ ）で精製した。得られた抗体Ｆ（ａｂ’
）２ 画分を２−メルカプトエチルアミンで還元シ、セ
ファテックスＧ−２５のカラムによるケルクロマトグラ
フィーで精製してウサギ抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’フラグ
メノト）を得た。
（３）で得られたポリクローナル抗ＣＥＡ抗体５ ｍｇ
に０．１ ｍｇのペプシンを加え３０℃で一夜反応後、
セファデックスＧ−１５０カラム（ｉｌ［２，５Ｇ、長
さ５５ ｃｍ ）で精製した。得られた抗体Ｆ（ａｂ’
）２ 画分を２−メルカプトエチルアミンで還元シ、セ
ファテックスＧ−２５のカラムによるケルクロマトグラ
フィーで精製してウサギ抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’フラグ
メノト）を得た。
上記（ａ）で調製したマレイミド化ベルオキシターゼ１
．５ ｍｇをＯ，ｌ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）
０．１５ｍｌに溶解し、先に得た抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ
’ フラグメント）１．８ｍｇをとかした５ ｍ Ｍエ
チレンジアミノ四酢酸すトリウム塩を含む０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐｔ（６，Ｑ ） ０．１５ ｍＬを加えて
４６Ｃで２０時間反応させｔコ。反応後、ウルトロケル
ＡｃＡ ４４を充てんしたカラム（１，５Ｘ４５ｃｍ）
を用いるゲルクロマ（・グラフィーにかけ、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ＰＨ６５）で溶出させた。溶出液の２８０
ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定した。ベルオキ
シターセとウサギ抗ＣＥＡ抗体（Ｆｉｂ’ フラグメン
ト）との複合体が生成していることを、以下の方法で確
認した。
．５ ｍｇをＯ，ｌ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）
０．１５ｍｌに溶解し、先に得た抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ
’ フラグメント）１．８ｍｇをとかした５ ｍ Ｍエ
チレンジアミノ四酢酸すトリウム塩を含む０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐｔ（６，Ｑ ） ０．１５ ｍＬを加えて
４６Ｃで２０時間反応させｔコ。反応後、ウルトロケル
ＡｃＡ ４４を充てんしたカラム（１，５Ｘ４５ｃｍ）
を用いるゲルクロマ（・グラフィーにかけ、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ＰＨ６５）で溶出させた。溶出液の２８０
ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定した。ベルオキ
シターセとウサギ抗ＣＥＡ抗体（Ｆｉｂ’ フラグメン
ト）との複合体が生成していることを、以下の方法で確
認した。
まず、酵素活性の測定はキルバルトらの方法〔アナリテ
ィカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＣＩ＋
ｅ−ｒｎ＋５ｔｒｙ ） ＋第４０巻（１９６８年）、
１２５６頁〕で行なった。即ち、溶出液の各フラクショ
ンを０１％ウシ血清アルブミンを含む０． Ｉ Ｍリン
酸緩衝液（ＰＨ７，０）で１８００倍に希釈した。この
１０μｌに０．１％ウシ血清アルブミンを含む０，０５
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）に溶解した０５
％ｐ−ハイドロキシフェニル酢酸０．２５ ｍｌを加え
て混合し３０℃で５分間インキュベートした。
ィカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＣＩ＋
ｅ−ｒｎ＋５ｔｒｙ ） ＋第４０巻（１９６８年）、
１２５６頁〕で行なった。即ち、溶出液の各フラクショ
ンを０１％ウシ血清アルブミンを含む０． Ｉ Ｍリン
酸緩衝液（ＰＨ７，０）で１８００倍に希釈した。この
１０μｌに０．１％ウシ血清アルブミンを含む０，０５
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）に溶解した０５
％ｐ−ハイドロキシフェニル酢酸０．２５ ｍｌを加え
て混合し３０℃で５分間インキュベートした。
次に０．０１％過酸化水素０．０５ ａｔを加えて３０
℃で２０分反応させた。０．１ Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ１０，８） ２．５ｍｌを加えて酵素反応を停止させ
、１μｇ ／ｍｌのキニンの蛍光強度を１００とし励起
光３２０ ｎｍにおける４０５ｎｍの蛍光強度を測定し
た。
℃で２０分反応させた。０．１ Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ１０，８） ２．５ｍｌを加えて酵素反応を停止させ
、１μｇ ／ｍｌのキニンの蛍光強度を１００とし励起
光３２０ ｎｍにおける４０５ｎｍの蛍光強度を測定し
た。
結果を第１図に示す。第１図において、−トは２８０
ｎｍにおける吸光度を、−一はペルオキシターセ活性（
蛍光強度として）をそれぞれ示す。
ｎｍにおける吸光度を、−一はペルオキシターセ活性（
蛍光強度として）をそれぞれ示す。
フラクション３８付近においてベルオキシターセと抗Ｃ
ＥＡ抗体（Ｆ ａ ｂ’ フラグメ、ント）との複合体
の生成が極めて良好であることか分かった。
ＥＡ抗体（Ｆ ａ ｂ’ フラグメ、ント）との複合体
の生成が極めて良好であることか分かった。
（６）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆ ａ ｂ’ ）
−ＨＲＰ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体γ−
グロブリンフラクション（Ｍｏ−Ｔ８）５ｍｇを０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，２） １ ｍｌに溶解し０２５
ｍｇのペブンンを加え３７°Ｃで一夜反応させる。
−ＨＲＰ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体γ−
グロブリンフラクション（Ｍｏ−Ｔ８）５ｍｇを０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，２） １ ｍｌに溶解し０２５
ｍｇのペブンンを加え３７°Ｃで一夜反応させる。
中和後セファデックスＧ−１５０カラム（直径２５印、
長さ５５ ｃｍ ）で精製した。得られたＦ （ａ ｌ
）’）２画分を２−メルカプトエチルアミンで還元し、
セファテックスＧ−２５のカラムによるケルクロマトグ
ラフィーで精製してモノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａ
ｂ’フラグメノト）を得た。
長さ５５ ｃｍ ）で精製した。得られたＦ （ａ ｌ
）’）２画分を２−メルカプトエチルアミンで還元し、
セファテックスＧ−２５のカラムによるケルクロマトグ
ラフィーで精製してモノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａ
ｂ’フラグメノト）を得た。
次に前項（５） −（ａ）で調製したマレイミド化ベル
オキシターセ１．５ ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（Ｓ
６．０ ）０、１５ Ｔｎｔに溶解し、先に得たモノ
クローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’フラグメノト） １
．８ ｍｇをとかした５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナ
トリウム塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）
０．１５ ＋＋ｌｔを加えて４６Ｃで一夜反応させた
。反応後、ウルトロゲルＡｃＡ ４４を充てんしたカラ
ム（１，５Ｘ４５ＣＩＩ＋）を用いるゲルクロマトグラ
フィーにかけ、００５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，５）で
溶出させた。前項（５）と同様に溶出液の２８０ ｎｍ
の吸光度ならびに酵素活性を測定して目的フラクション
を分取した。得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆ
ａ ｂ’ ）−ＨＲＰ複合体はＢＳＡとして０１％、
マーチオレートとして０００５％になるように調整して
４°Ｃで保存しｔこ。
オキシターセ１．５ ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（Ｓ
６．０ ）０、１５ Ｔｎｔに溶解し、先に得たモノ
クローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’フラグメノト） １
．８ ｍｇをとかした５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナ
トリウム塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）
０．１５ ＋＋ｌｔを加えて４６Ｃで一夜反応させた
。反応後、ウルトロゲルＡｃＡ ４４を充てんしたカラ
ム（１，５Ｘ４５ＣＩＩ＋）を用いるゲルクロマトグラ
フィーにかけ、００５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，５）で
溶出させた。前項（５）と同様に溶出液の２８０ ｎｍ
の吸光度ならびに酵素活性を測定して目的フラクション
を分取した。得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆ
ａ ｂ’ ）−ＨＲＰ複合体はＢＳＡとして０１％、
マーチオレートとして０００５％になるように調整して
４°Ｃで保存しｔこ。
（７） モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲ
Ｐ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体カッ
マグロプリンフラクション（ＭＯ−Ｔ２）５ｍｇを０，
１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１６．５ ） １ ｍｌに溶解
し４０μｌのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドにとかした
結合試薬ＭＭ’Ｃ（一般式〔Ｉ〕において、ｎ−１、Ｒ
−シクロヘキシレンである化合物）０２２ｍｇを加えて
２５℃で４５分間攪拌しなから反応させた。生成した沈
殿を遠心分離して除去し、上清をセファテックスＧ−２
５のカラム（１，０Ｘ４５個）に通し、０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，８）で溶出させた。タンパクを含む両
分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮した。このよう
にして調製したマレイミド化ＩｇＧにおいてＩｇＧ １
分子あたり導入されたマレイミド基の数は５９個であっ
た。
Ｐ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体カッ
マグロプリンフラクション（ＭＯ−Ｔ２）５ｍｇを０，
１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１６．５ ） １ ｍｌに溶解
し４０μｌのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドにとかした
結合試薬ＭＭ’Ｃ（一般式〔Ｉ〕において、ｎ−１、Ｒ
−シクロヘキシレンである化合物）０２２ｍｇを加えて
２５℃で４５分間攪拌しなから反応させた。生成した沈
殿を遠心分離して除去し、上清をセファテックスＧ−２
５のカラム（１，０Ｘ４５個）に通し、０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，８）で溶出させた。タンパクを含む両
分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮した。このよう
にして調製したマレイミド化ＩｇＧにおいてＩｇＧ １
分子あたり導入されたマレイミド基の数は５９個であっ
た。
別に、１０ｍｇのＨＲＰを１．’４ｍｌの０．１ Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，５）ニ溶解し、１００ａ（１０）
：ｒ−タノールにとかした結合試薬５ＰＤＰＣＮ−サ’
） シー’ｉ。
ン酸緩衝液（ｐＨ６，５）ニ溶解し、１００ａ（１０）
：ｒ−タノールにとかした結合試薬５ＰＤＰＣＮ−サ’
） シー’ｉ。
ジル−８−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネ−ト
； Ｎ −ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙ
ｒｉｄｙｌｄｉ も＋＋１ｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａＬｅ
ｌ １．２５ ｍ９を加えて２５°Ｃで３０分間攪拌し
ながら反応させた。反応液はセファテックスＧ−２５の
カラム（１，０Ｘ４５ＣＩＩ＋）に通し０．１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ５，０）で溶出させて５ＰＤＰを除去した。
； Ｎ −ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙ
ｒｉｄｙｌｄｉ も＋＋１ｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａＬｅ
ｌ １．２５ ｍ９を加えて２５°Ｃで３０分間攪拌し
ながら反応させた。反応液はセファテックスＧ−２５の
カラム（１，０Ｘ４５ＣＩＩ＋）に通し０．１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ５，０）で溶出させて５ＰＤＰを除去した。
次にジチオスレイトール（ｄｉｊｌｌｉｏＬｈｒｅ−ｉ
ｔｏｌ） Ｉ ＴｍＱを加えて還元し、再びセファテッ
クスＧ−２５のカラム（１，Ｏｃｍ Ｘ ４５ ｃｍ
）を用いるゲルクロマトグラフィーで精製してチオール
化ＨＲＰを得た。
ｔｏｌ） Ｉ ＴｍＱを加えて還元し、再びセファテッ
クスＧ−２５のカラム（１，Ｏｃｍ Ｘ ４５ ｃｍ
）を用いるゲルクロマトグラフィーで精製してチオール
化ＨＲＰを得た。
次に先に調製し０．２ ａｔに濃縮したマレイミド化Ｉ
ｇＧ３ｍｇと、０．２ ｍｌに濃縮したチオール化ＨＲ
Ｐ６ ｍｇとを４°Ｃで１６時間反応させた。反応後、
ウルトロケ＃ＡｃＡ４４（ＬＫＢ社製（フランス）〕を
充てんしたカラム（１，５ｃｍＸ ４５ｃｍ ）を用い
るケルクロマトグラフィーにかけ、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６，５）で溶出させた。前項（５）と同様に溶
出液の２８０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定し
て目的フラクションを分取した。得られたモノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲＰ複合体はＢＳＡとし
て０．１％、マーチオレートとして０．００５％になる
ように調整して４８Ｃで保存した。
ｇＧ３ｍｇと、０．２ ｍｌに濃縮したチオール化ＨＲ
Ｐ６ ｍｇとを４°Ｃで１６時間反応させた。反応後、
ウルトロケ＃ＡｃＡ４４（ＬＫＢ社製（フランス）〕を
充てんしたカラム（１，５ｃｍＸ ４５ｃｍ ）を用い
るケルクロマトグラフィーにかけ、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６，５）で溶出させた。前項（５）と同様に溶
出液の２８０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定し
て目的フラクションを分取した。得られたモノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲＰ複合体はＢＳＡとし
て０．１％、マーチオレートとして０．００５％になる
ように調整して４８Ｃで保存した。
（８）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲＰ
複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＦ、Ａ抗体カ
ンマグロフリンフラクショノ（ＭＯ−Ｔ２）５ｍｇを０
．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，５） ｔ ｒｎｔに溶解
し、０、６ ｍｇのＳ−アセチルメルカブトサクシニノ
クアンハイドライド（Ｓ −ａｃｅｔｙｌｍｅｒｃａｐ
ｔｏ ５ｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙ−ｄｒｉｄｅ）を４
０ｄのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して加え３
０分間２５°Ｃで反応させた。
複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＦ、Ａ抗体カ
ンマグロフリンフラクショノ（ＭＯ−Ｔ２）５ｍｇを０
．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，５） ｔ ｒｎｔに溶解
し、０、６ ｍｇのＳ−アセチルメルカブトサクシニノ
クアンハイドライド（Ｓ −ａｃｅｔｙｌｍｅｒｃａｐ
ｔｏ ５ｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙ−ｄｒｉｄｅ）を４
０ｄのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して加え３
０分間２５°Ｃで反応させた。
０、ＩＭ）リス緩衝液（ｐＨ７，０） ０．２ ｍｌお
よび１Ｍヒドロキシルアミン０．２ ｍｌを加えて、さ
らに５分間３０℃で反応させたのち、セファデックスＧ
−２５のカラム（１，ＯＸ４５ｃｍ）を用いるケルク
ロマトグラフィーで精製してチオール化モノクローナル
抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）を得た。
よび１Ｍヒドロキシルアミン０．２ ｍｌを加えて、さ
らに５分間３０℃で反応させたのち、セファデックスＧ
−２５のカラム（１，ＯＸ４５ｃｍ）を用いるケルク
ロマトグラフィーで精製してチオール化モノクローナル
抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）を得た。
次に前項（５） −（ａ）で調製したマレイミド化ベル
オキシターセ１．５ ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
ｉ（６，０）０、２ ｍｌに溶解し、先に得たチオール
化モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）８ｍｇと５
ｍ Ｍ ｘチＬ／ ノ’）アミン四酢酸ナトリウム塩と
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，０）０２ｍｔを
加えて４℃で一夜反応させた。反応後、ウルトロケルＡ
ｃＡ ３４を充てんシｔ、：’ｊラム（１，５’Ｘ ４
５ｃｍ ）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０
．１ Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６５）で溶出させた。前
項り５）と同様に溶出液の２８０ ｎｍの吸光度ならび
に酵素活性を測定して目的フラクションを分取した。得
られたモノクローナル抗ＣＥ Ａ （Ｉ ｇＧ ）−Ｈ
ＲＰ複合体ハＢ Ｓ Ａとしテ０．１％、Ｖ−チオレー
ｈトシＴＯ，ｏ Ｏ５％ニなるように調整して４°Ｃで
保存した。
オキシターセ１．５ ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
ｉ（６，０）０、２ ｍｌに溶解し、先に得たチオール
化モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）８ｍｇと５
ｍ Ｍ ｘチＬ／ ノ’）アミン四酢酸ナトリウム塩と
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，０）０２ｍｔを
加えて４℃で一夜反応させた。反応後、ウルトロケルＡ
ｃＡ ３４を充てんシｔ、：’ｊラム（１，５’Ｘ ４
５ｃｍ ）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０
．１ Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６５）で溶出させた。前
項り５）と同様に溶出液の２８０ ｎｍの吸光度ならび
に酵素活性を測定して目的フラクションを分取した。得
られたモノクローナル抗ＣＥ Ａ （Ｉ ｇＧ ）−Ｈ
ＲＰ複合体ハＢ Ｓ Ａとしテ０．１％、Ｖ−チオレー
ｈトシＴＯ，ｏ Ｏ５％ニなるように調整して４°Ｃで
保存した。
実施例２
（ａ） 各種ＨＲＰ複合体の比較（感度、非特異的吸着
） 実施例１て得られた各種ＨＲＰ複合体の性能について調
べるためＥＩＡを行なった。ＥＩＡ用の試薬として、次
のものを用いた。
） 実施例１て得られた各種ＨＲＰ複合体の性能について調
べるためＥＩＡを行なった。ＥＩＡ用の試薬として、次
のものを用いた。
試薬：
■ 抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート■ 実施例１、
参考例２て得られたＨＲＰ複合体、あるいはＤＡＫＯイ
ムノグロフリノ社製（テンマーク）抗ＣＥＡ抗体ＨＲＰ
複合体■ 標準ＣＥＡ ■ 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、０．１５ Ｍ ＮａＣ
１を含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液）。
参考例２て得られたＨＲＰ複合体、あるいはＤＡＫＯイ
ムノグロフリノ社製（テンマーク）抗ＣＥＡ抗体ＨＲＰ
複合体■ 標準ＣＥＡ ■ 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、０．１５ Ｍ ＮａＣ
１を含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液）。
緩衝液Ａ （０，１５Ｍ ＮａＣｌを含むｐＨ７，０の
００２Ｍリン酸緩衝液） ■ ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬０．０２％
過酸化水素と０．１５％０−フェニレンジアミンを含む
ｐＨ４，８の０．１Ｍクエン酸−リン酸二ナトリウム緩
衝液および反応停止液（２Ｎ−硫酸） 抗体感作マイクロプレートの調製： Ｅ Ｉ Ａ用イムノプレートＩ〔ヌノク社（テンマーク
）製〕の各ウェルにポリクローナル抗ＣＥＡ抗体〔タコ
・イムノグロフリン社（テンマーク）製〕を０，１Ｍ炭
酸緩衝液（ｐＨ９，６）で希釈して調製した抗体溶Ｈ（
５０ａｇ／ｍｌ）を１００μｍずつ注入して４°Ｃで一
夜放置して感作させた。Ｏ１％ＢＳＡを含む００１Ｍリ
ン酸緩衝液（ＰＨ７，０）で洗浄したのら、用時まで冷
所保存しｔコ。
００２Ｍリン酸緩衝液） ■ ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬０．０２％
過酸化水素と０．１５％０−フェニレンジアミンを含む
ｐＨ４，８の０．１Ｍクエン酸−リン酸二ナトリウム緩
衝液および反応停止液（２Ｎ−硫酸） 抗体感作マイクロプレートの調製： Ｅ Ｉ Ａ用イムノプレートＩ〔ヌノク社（テンマーク
）製〕の各ウェルにポリクローナル抗ＣＥＡ抗体〔タコ
・イムノグロフリン社（テンマーク）製〕を０，１Ｍ炭
酸緩衝液（ｐＨ９，６）で希釈して調製した抗体溶Ｈ（
５０ａｇ／ｍｌ）を１００μｍずつ注入して４°Ｃで一
夜放置して感作させた。Ｏ１％ＢＳＡを含む００１Ｍリ
ン酸緩衝液（ＰＨ７，０）で洗浄したのら、用時まで冷
所保存しｔコ。
測定：
緩衝液Ｂに溶解させたＣＥＡ標準溶液１００μ６を各ウ
ェルに注入し、３７°Ｃで３時間反応させた。
ェルに注入し、３７°Ｃで３時間反応させた。
各ウェルを緩衝液Ａで洗浄後、実施例１で得られたＨＲ
Ｐ複合体あるいはタコ・イムノグロフリン（Ｄ Ａ Ｋ
ＯＩｎｕｎｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ）社製ポリク
ローナル抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体溶液（それぞれ酵
素活性一定、ＨＲＰとして３ｏｎｇ／ウェル）１００μ
４ を加えて２５℃で３５時間さらに反応させた緩衝液
Ａで洗浄し、これに０．０２％過酸化水素と０１５％０
−フェニレンジアミンヲ含ｔｒ Ｏ，１Ｍ クエン酸−
リン酸二ナトリウム緩衝液（ＰＨ４，８）１ｏｏＬＬｒ
） を加えて３０６Ｃで３０分間反応させ、２Ｎ−硫Ｑ
１００Ｊずつ加えて反応を停止させてから、マイクロプ
レート用自動比色計〔タイターチック・マルチスキャン
・フロー社（米国＞ｆｆ）を用い、フランクを対照にし
て４９０ｎｍにおける吸光度を測定しｔコ。結果を第２
表に示しｊコが、参考例２で得られｆコＨＲＰ複合体お
よびタコ・イムノグロブリン社製ＨＲＰ複合体〔２ステ
ツプ グルタルアルテヒド法；イムノケミストリー（Ｉ
ｒｎ＋ｎｕｎｏ−ｃｈｅｍｉ ５Ｌｒｙ ）、第８巻（
１９７１年）、第１１７５頁〕と比へて実施例１て得ら
れた本発明のＨＲＰ複合体はそれぞれウェルへの非特異
的吸着は極めて小さく、また高感度を与えた。
Ｐ複合体あるいはタコ・イムノグロフリン（Ｄ Ａ Ｋ
ＯＩｎｕｎｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ）社製ポリク
ローナル抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体溶液（それぞれ酵
素活性一定、ＨＲＰとして３ｏｎｇ／ウェル）１００μ
４ を加えて２５℃で３５時間さらに反応させた緩衝液
Ａで洗浄し、これに０．０２％過酸化水素と０１５％０
−フェニレンジアミンヲ含ｔｒ Ｏ，１Ｍ クエン酸−
リン酸二ナトリウム緩衝液（ＰＨ４，８）１ｏｏＬＬｒ
） を加えて３０６Ｃで３０分間反応させ、２Ｎ−硫Ｑ
１００Ｊずつ加えて反応を停止させてから、マイクロプ
レート用自動比色計〔タイターチック・マルチスキャン
・フロー社（米国＞ｆｆ）を用い、フランクを対照にし
て４９０ｎｍにおける吸光度を測定しｔコ。結果を第２
表に示しｊコが、参考例２で得られｆコＨＲＰ複合体お
よびタコ・イムノグロブリン社製ＨＲＰ複合体〔２ステ
ツプ グルタルアルテヒド法；イムノケミストリー（Ｉ
ｒｎ＋ｎｕｎｏ−ｃｈｅｍｉ ５Ｌｒｙ ）、第８巻（
１９７１年）、第１１７５頁〕と比へて実施例１て得ら
れた本発明のＨＲＰ複合体はそれぞれウェルへの非特異
的吸着は極めて小さく、また高感度を与えた。
第２表
（ｂ）ＣＥＡの免疫化学的測定キットおよびＣＥＡの測
定 下記のＣＥＡ免疫化学的測定キットを用い、下記の操作
法に従って正常人および担癌患者血清中のｈ ＣＧ濃度
を測定した。
定 下記のＣＥＡ免疫化学的測定キットを用い、下記の操作
法に従って正常人および担癌患者血清中のｈ ＣＧ濃度
を測定した。
ＣＥＡの免疫化学的測定キット：
（１） 実ｍ 例１． （２）で得られたモノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体ガンマグロブリンフラクション（ＭＯ−
Ｔ４）の１５ｕｙ／ ｍｌ ０．０１ Ｍ ＮａＣｌ−
０，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０） １００ ｍＬ
中にポリスチレン球（直径４８馴、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｂａ１ｌ Ｃｏ、、 Ｃｈｉｃａ
ｇｏ。
ル抗ＣＥＡ抗体ガンマグロブリンフラクション（ＭＯ−
Ｔ４）の１５ｕｙ／ ｍｌ ０．０１ Ｍ ＮａＣｌ−
０，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０） １００ ｍＬ
中にポリスチレン球（直径４８馴、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｂａ１ｌ Ｃｏ、、 Ｃｈｉｃａ
ｇｏ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、） １５００個を浸し、５℃で１夜インキ
ュベートし、更に０１％ＢＳＡを含む０．０５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄してなる抗体感作ポリスチ
レン球 （２）実施例１（７）で得られるベルオキシダーセ標識
抗ＣＥＡ抗体複合体 （３） ０〜２００ｎｇの標準ＣＥＡ （４）上記（３）の試薬および被検試料の希釈上用いる
緩衝液Ｂおよび緩衝液Ａ（前項（ａ）参照）（５）０−
フェニレンジアミン （６）上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液ＣｉＯ，
１％ウシ血清アルブミン、、０．００２％メルチオレー
トを含むｐＨ７，５の０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（７
）上記（５）の溶解に用いる緩衝液Ｉ）；Ｑ、ｏ２％過
酸化水素０．００２％メルチオレートを含むｐＨ４，８
の０．’１Ｍクエン酸緩衝液 （８）停止液ｉ２Ｎ硫酸 操作方法 標準ＣＥＡ溶液あるいは被検試料５０ａｌｌに試薬（４
）緩衝液Ｂ２５０μｌおよび試薬（１）１個を添加し、
室温で１日間反応させた。ポリスチレン球を緩衝液Ａで
水洗後、試薬（６）で希釈した試薬（２） ８００μｅ
（複合体として約８０ ｎｇ）を添加し、４°Ｃで１日
間反応させた。ポリスチレン球を緩衝液Ａで水洗し、試
薬（７）で溶解した０、１５％の試薬（５） ５００μ
ｌを加えて室温で４０分間反応させたのら、２Ｎ硫酸１
．５ ｍＬを添加して反応を停止させ、４９２ ｎｍの
吸光度を測定した。
ュベートし、更に０１％ＢＳＡを含む０．０５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄してなる抗体感作ポリスチ
レン球 （２）実施例１（７）で得られるベルオキシダーセ標識
抗ＣＥＡ抗体複合体 （３） ０〜２００ｎｇの標準ＣＥＡ （４）上記（３）の試薬および被検試料の希釈上用いる
緩衝液Ｂおよび緩衝液Ａ（前項（ａ）参照）（５）０−
フェニレンジアミン （６）上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液ＣｉＯ，
１％ウシ血清アルブミン、、０．００２％メルチオレー
トを含むｐＨ７，５の０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（７
）上記（５）の溶解に用いる緩衝液Ｉ）；Ｑ、ｏ２％過
酸化水素０．００２％メルチオレートを含むｐＨ４，８
の０．’１Ｍクエン酸緩衝液 （８）停止液ｉ２Ｎ硫酸 操作方法 標準ＣＥＡ溶液あるいは被検試料５０ａｌｌに試薬（４
）緩衝液Ｂ２５０μｌおよび試薬（１）１個を添加し、
室温で１日間反応させた。ポリスチレン球を緩衝液Ａで
水洗後、試薬（６）で希釈した試薬（２） ８００μｅ
（複合体として約８０ ｎｇ）を添加し、４°Ｃで１日
間反応させた。ポリスチレン球を緩衝液Ａで水洗し、試
薬（７）で溶解した０、１５％の試薬（５） ５００μ
ｌを加えて室温で４０分間反応させたのら、２Ｎ硫酸１
．５ ｍＬを添加して反応を停止させ、４９２ ｎｍの
吸光度を測定した。
上記の方法により、正常人および担癌患者血清中のＣＥ
ＡＩ度を測定した。結果は第３表に示される。
ＡＩ度を測定した。結果は第３表に示される。
第３表
被検試料 ＣＥＡ濃度（ｎ ｇ ／ｍｌ）正常人血清
１０５ 正常人血清 ２１．０ 正常人血清 ３０７ 正常人血清 ４１．６ 正常人血清 ５１．２ 胆のう癌患者 血 清 １ ８７ 血 ＠ ２ １０．８ 肝 癌 患 者 血 清 １ ６４ 血 清 ２ ２０．８ 胃癌患者 血 清 １ １．４ 血 ＠ ２ ９６ 血 清 ３ ５０ 結腸癌患者 血 清 １ ５６５ 血 清 ２ ３８５ 血 漬 ３ １１３ 牌臓癌患者 血 清 １ ５７ 測定の結果、正常人血清のＣＥＡ値は０．５〜１゜２
ｎｙ／ ｍｌ （平均１． Ｏｎｙ／、ｍＬ ）であっ
たが各種癌患者血清のＣＥＡ値は高値を与え最大５６５
ｎｇ／ ｒｎＬとなった。
１０５ 正常人血清 ２１．０ 正常人血清 ３０７ 正常人血清 ４１．６ 正常人血清 ５１．２ 胆のう癌患者 血 清 １ ８７ 血 ＠ ２ １０．８ 肝 癌 患 者 血 清 １ ６４ 血 清 ２ ２０．８ 胃癌患者 血 清 １ １．４ 血 ＠ ２ ９６ 血 清 ３ ５０ 結腸癌患者 血 清 １ ５６５ 血 清 ２ ３８５ 血 漬 ３ １１３ 牌臓癌患者 血 清 １ ５７ 測定の結果、正常人血清のＣＥＡ値は０．５〜１゜２
ｎｙ／ ｍｌ （平均１． Ｏｎｙ／、ｍＬ ）であっ
たが各種癌患者血清のＣＥＡ値は高値を与え最大５６５
ｎｇ／ ｒｎＬとなった。
発明の効果
本発明の試薬を用いると、高感度かつ正確にＣＥＡが測
定され、大腸癌などの消化器癌や他の癌などの診断、予
後管理などに対して極めて有用である。すなオつち、本
発明におけるチオール基を導入したベルオキシターセで
標識された抗体を用いた場合は、同相に対する非特異的
な吸着か小さいのでＣＥＡの測定の盲検値か小さくした
かって測定の信頼性が増大する。また、本発明で得られ
たモノクローナル抗体はＣＥＡに対して親和性が強く、
他のＣＥＡ関連抗原に対する交差反応性がはるかに小さ
いので被検液に同時に存在するＣＥＡ関連抗原からの影
響を受け難い。更に、モノクローナル抗体を試薬の構成
成分としているので製品の供給が容易であり、測定の再
現性が高い。
定され、大腸癌などの消化器癌や他の癌などの診断、予
後管理などに対して極めて有用である。すなオつち、本
発明におけるチオール基を導入したベルオキシターセで
標識された抗体を用いた場合は、同相に対する非特異的
な吸着か小さいのでＣＥＡの測定の盲検値か小さくした
かって測定の信頼性が増大する。また、本発明で得られ
たモノクローナル抗体はＣＥＡに対して親和性が強く、
他のＣＥＡ関連抗原に対する交差反応性がはるかに小さ
いので被検液に同時に存在するＣＥＡ関連抗原からの影
響を受け難い。更に、モノクローナル抗体を試薬の構成
成分としているので製品の供給が容易であり、測定の再
現性が高い。
また、本発明の方法で得られたＣＥＡを免疫原として作
製されたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は、ＣＥＡに対す
る反応性が高くしかもＣＥＡ関連抗原ＮＣＡ、ＮＣＡ−
２との交差反応を有しないモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
である頻度が高く、従ってモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
作製方法として有用である。
製されたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は、ＣＥＡに対す
る反応性が高くしかもＣＥＡ関連抗原ＮＣＡ、ＮＣＡ−
２との交差反応を有しないモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
である頻度が高く、従ってモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
作製方法として有用である。
これらの選択されたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は免疫
化学的診断剤を構成する成分として利用することができ
る。例えばサンドインチ法による酵素免疫試験法におい
ては担体上に保持された抗体および（もしくは）酵素で
標識された抗体におけるモノクローナル抗ＣＥＡ抗体と
して用いることができる。これらの診断剤は大腸癌など
の消化器癌や他の癌の診断、予後管理などに利用できる
。
化学的診断剤を構成する成分として利用することができ
る。例えばサンドインチ法による酵素免疫試験法におい
ては担体上に保持された抗体および（もしくは）酵素で
標識された抗体におけるモノクローナル抗ＣＥＡ抗体と
して用いることができる。これらの診断剤は大腸癌など
の消化器癌や他の癌の診断、予後管理などに利用できる
。
更にこれらの抗体は治療目的にも利用することができる
。
。
第１図は、実施例１−（５）で得られたベルオキシター
ゼとポリクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’ フラグメ
ント）との反応生成物のゲルクロマトグラフィーにおけ
る溶出パターンを表わす。 フヲクシコン４く
ゼとポリクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’ フラグメ
ント）との反応生成物のゲルクロマトグラフィーにおけ
る溶出パターンを表わす。 フヲクシコン４く
Claims (6)
- （１）担体上に保持された抗体、抗原および標識剤を結
合させた抗体を用いるヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測
定法において、担体上に保持される抗体上標識剤を結合
させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない２種の
抗体であり、標識剤としてあらかしめチオール基を導入
したペルオキシダーゼを用いこれと抗体とを一般式〔式
中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合捷たは２価
の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わされ
る化合物で結合させたものを用いることを特徴とするヒ
ト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法。 - （２）２種の抗体のうち少なくとも一方がモノクローナ
ル抗体である特許請求の範囲第１項記載のヒト癌胎児性
抗原の免疫化学的測定法。 - （３）モノクローナル抗体が、ヒト癌胎児性抗原を含有
する癌化組織から、非イオン性界面活性剤を含む中性塩
溶液で抽出し、精製されたヒト癌胎児性抗原で免疫され
だ哺乳動物のリンパ球とミエローマ細胞さの融合細胞か
ら得られたヒト癌胎児性抗原反応性モノクローナル抗体
である特許請求の範囲第２項記載のヒト癌胎児性抗原の
免疫化学的測定法。 - （４）■あらかじめチオール基ヲ導入したペルオキシダ
ーゼと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたもの、および■ペルオキシダ
ーゼに結合させる抗体と互いに抗原決定部位を重複せず
ヒト癌胎児性抗原に反応テる抗体を担体上に保持したも
のを含有するヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定用試薬
。 - （５）２種の抗体のうち少なくとも一方がモノクローナ
ル抗体である特許請求の範囲第４項記載のヒト癌胎児性
抗原の免疫化学的測定用試薬。 - （６） 七ツクローナル抗体が、ヒト癌胎児性抗原を含
有する癌化組織から、非イオン性界面活性剤を含む中性
塩ｔ８液で抽出し、精製されたヒト癌胎児性抗原で免疫
された哺乳動物のリンパ球とミエローマ細胞との融合細
胞から得られたヒト癌胎児性抗原反応柱上ツクローナル
抗体である特許請求の範囲第５項記載のヒト癌胎児性抗
原の免疫化学的測定用試薬。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59072428A JPH0677020B2 (ja) | 1984-04-10 | 1984-04-10 | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
| EP85104133A EP0158291A3 (en) | 1984-04-10 | 1985-04-04 | A method for purifying carcinoembryonic antigen and a method for producing a carcinoembryonic antigen-reactive monoclonal antibody |
| CA000478552A CA1306427C (en) | 1984-04-10 | 1985-04-09 | Immunochemical assay of carcinoembryonic antigen and reagent therefor |
| US06/721,901 US4816390A (en) | 1984-04-10 | 1985-04-10 | Immunochemical assay of carcinoembryonic antigen and reagent therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59072428A JPH0677020B2 (ja) | 1984-04-10 | 1984-04-10 | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60214260A true JPS60214260A (ja) | 1985-10-26 |
| JPH0677020B2 JPH0677020B2 (ja) | 1994-09-28 |
Family
ID=13489006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59072428A Expired - Lifetime JPH0677020B2 (ja) | 1984-04-10 | 1984-04-10 | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0677020B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5845560A (ja) * | 1981-08-21 | 1983-03-16 | エフ・ホフマン−ラ・ロシユ・ウント・コンパニ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 癌胚杭原の固相サンドウイツチ法による定量方法 |
-
1984
- 1984-04-10 JP JP59072428A patent/JPH0677020B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5845560A (ja) * | 1981-08-21 | 1983-03-16 | エフ・ホフマン−ラ・ロシユ・ウント・コンパニ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 癌胚杭原の固相サンドウイツチ法による定量方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0677020B2 (ja) | 1994-09-28 |
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