JPH09136900A - ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＣＥＡ抗原ペプチドを提供する。 【解決手段】 下記の塩基配列： 【表１】 を有する単離された核酸又は緊縮条件下に該塩基配列に
ハイブリダイズする単離された核酸によってコードされ
た連続状のアミノ酸配列に対応する少なくとも５個のア
ミノ酸からなるペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、癌胎児性抗原のペプチド配列を
コードする核酸配列に関する。

【０００２】癌胎児性抗原（carcinoembryonic antige
n）（「ＣＥＡ」）は、最初にゴールド（Gold）および
フリードマン（Freedman），ジャーナル・オブ・イクス
ペリメンタル・メディシン（J. Exp. Med.），１２１，
４３９−４６２（１９６５）に記載された。ＣＥＡは、
５０〜６０の重量％の炭水化物をもつ分子量ほぼ２０
０,０００の糖蛋白質として特徴づけられる。ＣＥＡは
正常のヒト胎児の発育間に存在するが、正常の大人の腸
管中の濃度は非常に低い。それはある数の異なる腫瘍に
よって生成されかつ分泌される。

【０００３】ＣＥＡは結腸直腸の癌患者の監視のため
の、臨床的に有用な腫瘍マーカーである。ＣＥＡは感受
性のイムノアッセイ法を用いて測定できる。ＣＥＡの手
術前の血清レベルが高くなったとき、血清ＣＥＡの手術
後の正常範囲への低下は、典型的には、腫瘍の切除に成
功したことを示す。正常に戻らない手術後のＣＥＡレベ
ルは、しばしば、腫瘍の切除が不完全であること、ある
いは患者中に追加の腫瘍部位が存在することを示す。正
常レベルへ戻った後、血清ＣＥＡレベルの引続く急速な
上昇は通常準段階（metastage）の存在を示す。通常レ
ベルからのより遅い手術後の上昇は、最も頻繁に、前に
検出されない新しい一次腫瘍の存在を示すと解釈され
る。こうして、結腸の患者の手術後の管理はＣＥＡの測
定によって促進される。

【０００４】ＣＥＡは抗原族の１員である。このため
に、現在利用可能な方法によるＣＥＡのイムノアッセイ
は、ＣＥＡがいくつかの潜在的に反応性の抗原の１つだ
けであるという事実によって複雑である。少なくとも１
６のＣＥＡ様抗体が文献に記載されてきた。これらのい
くつかは異なる研究者らによって記載された同一の抗体
と思われるので、異なる抗原の実際の数は多少この数よ
りも少ない。それにもかかわらず、腫瘍が放出するＣＥ
Ａのイムノアッセイを潜在的に妨害しうる交差反応性抗
原の複雑な列が存在する。ＣＥＡ様抗原の血清レベル
は、多くの腫瘍以外の状態、例えば、炎症性肝臓の病気
およびまた喫煙者において増大することが知られてい
る。癌患者の状態の監視のために使用するイムノアッセ
イは、これらの他のＣＥＡ様抗原によって妨害されない
ことが重要である。逆に、異なる型の腫瘍が異なる型の
ＣＥＡを優先的に発現する可能性があるので、抗原類を
イムノアッセイによって区別できることが重要である。
そうである場合、異なる型のＣＥＡを信頼性をもって測
定できることは、異なる型の癌を診断し、あるいはより
首尾よく処置する手段を提供する。

【０００５】「放射性ヨウ素を使用する癌胎児性抗原お
よび診断法」と題する米国特許第３,６６３,６８４号
は、ＲＩＡにおいて使用するためのＣＥＡの精製および
放射性ヨウ素化に関する。

【０００６】米国特許第３,６９７,６３８号は、ＣＥＡ
が抗原類（この場合成分ＡおよびＢ）の混合物であるこ
とを記載している。米国特許第３,６９７,６３８号は、
各成分を分離しかつ放射性ヨウ素化する方法および特定
のＲＩＡにおけるそれらの使用を述べている。

【０００７】「癌胎児性抗原の決定における血漿抽出物
のための代替物として、ラジオイムノアッセイにおいて
使用する組成物」と題する米国特許第３,８５２,４１５
号は、ＣＥＡのＲＩＡのための希釈剤の代替物として、
ＥＤＴＡおよびウシ血清アルブミンを含有する緩衝液の
使用に関する。

【０００８】「癌胎児性抗原」と題する米国特許第３,
８６７,３６３号は、ＣＥＡの成分ＡおよびＢの分離、
それらの標識つけおよびＲＩＡにおける使用に関する。

【０００９】「放射線標識した抗体による腫瘍の局在
化」と題する米国特許第３,９２７,１９３号は、全身の
腫瘍の映像化における放射線標識抗ＣＥＡの使用に関す
る。

【００１０】「癌胎児性抗原」と題する米国特許第３,
９５６,２８５号は、ＣＥＡの成分ＡおよびＢの分離に
関する。

【００１１】「癌胎児性抗原」と題する米国特許第４,
０８６,２１７号は、ＣＥＡの成分ＡおよびＢの分離に
関する。

【００１２】「診断法および試薬」と題する米国特許第
４,１４０,７５３号は、ＣＥＡ−Ｓ１と呼ばれるＣＥＡ
異性体の精製およびＲＩＡにおけるその使用に関する。

【００１３】「癌胎児性抗原の異性体」と題する米国特
許第４,１４５,３３６号は、抗原ＣＥＡ−Ｓ１に関す
る。

【００１４】「癌胎児性抗原」と題する米国特許第４,
１８０,４９９号は、ＣＥＡの成分Ａの生成法を記載し
ている。

【００１５】「癌胎児性抗原を生成する方法」と題する
米国特許第４,２２８,２３６号は、確立された細胞系Ｌ
Ｓ−１７４ＴおよびＬＳ−１８０またはそのクローンま
たは誘導体をＣＥＡの生成において使用することに関す
る。

【００１６】「癌胎児性抗原のアッセイのための抗体吸
着支持体法」と題する米国特許第４,２７２,５０４号
は、ＣＥＡのラジオイムノアッセイのための２つの概念
に関する。第１に、米国特許第４,２７２,５０４号は、
試料をｐＨ５において６５−８５℃に加熱して予備処理
して、異質蛋白質を沈殿しかつ排除することに関する。
第２に、それは分析物および放射線標識ＣＥＡトレーサ
ーを捕捉する手段として、固体の抗体（ビーズまたは管
上）を使用することを記載している。

【００１７】「癌胎児性抗原の決定」と題する米国特許
第４,２９９,８１５号は、ＣＥＡ試料を水で希釈し、そ
して蛋白質の沈殿が起こる温度より低い温度に加熱する
ことによって予備処理することに関する。次いで、予備
処理した試料を、ＲＩＡ、ＥＩＡ、ＦＩＡまたは化学ル
ミネセンスイムノアッセイを使用してイムノアッセイす
る。

【００１８】「高分子量の癌胎児性抗原に対して特異的
なモノクローナルハイブリドーマの抗体」と題する米国
特許第４,３４９,５２８号は、１８０ｋＤのＣＥＡと反
応性であるが、他の分子量の形態と反応性ではないモノ
クローナル抗体に関する。

【００１９】「癌胎児性抗原のための酵素−イムノアッ
セイ」と題する米国特許第４,４６７,０３１号は、２つ
の高ＣＥＡモノクローナル抗体の第１が固相に取付けら
れており、そして第２のモノクローナル抗体がペルオキ
シドと接合している、ＣＥＡのためのサンドイッチ酵素
イムノアッセイに関する。

【００２０】「癌の検出のための方法および組成物」と
題する米国特許第４,４８９,１６７号は、ＣＥＡがヒト
血清の正常な成分であるα−酸性糖蛋白質（ＡＧ）と抗
原決定基を共有することを記載している。そこに記載さ
れている方法は、１つの抗体として、ＡＧを認識する抗
体および、ＣＥＡを認識するが、ＡＧを認識しない他の
抗体を使用する、固相サンドイッチ酵素イムノアッセイ
に関する。

【００２１】「癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のためのイムノ
アッセイ」と題する米国特許第４,５７８,３４９号は、
ＣＥＡのイムノアッセイにおいて希釈剤として高い塩を
含有する緩衝液を使用することに関する。

【００２２】「癌胎児性抗原のための血液試料のアッセ
イ − シリカゲルとのインキュベーションによる妨害物
質の除去後」と題する欧州特許（ＥＰ）１１３０７２−
Ａ号は、シリカゲルで予備処理することによって血漿試
料の血清から妨害物質を除去することに関する。次い
で、予備清浄化試料をイムノアッセイにかける。

【００２３】「癌診断の癌胎児性抗原 − 電気泳動なし
に過塩素酸抽出物から生成された」と題する欧州特許
（ＥＰ）９２２２３−Ａ号は、血清または血漿中ではな
く、腫瘍組織自体の細胞質ゾル分画中におけるＣＥＡの
イムノアッセイに関する。

【００２４】「癌、とくに乳癌における予測試験として
細胞質ゾル−ＣＥＡ−測定」と題する欧州特許（ＥＰ）
８３１０３７５９.６号は、欧州特許（ＥＰ）９２２２
３−Ａ号に類似する。

【００２５】「癌胎児性抗原に対して特異的なモノクロ
ーナル抗体類」と題する欧州特許（ＥＰ）８３３０３７
５９号は、「ＣＥＡ特異的」モノクローナル抗体類およ
びイムノアッセイにおけるそれらの使用に関する。

【００２６】「特異的ＣＥＡ−族抗原類、それらに対し
て特異的な抗体類およびそれらの使用法」と題するＷＯ
８４／０２９８３号は、ＣＥＡ−メコニウム（ＭＡ）−
およびＮＣＡ−特異的エピトープに対するモノクローナ
ル抗体類を、試料中のこれらの個々の成分の各々を選択
的に測定するように案出されたイムノアッセイにおいて
使用することに関する。

【００２７】従来のＣＥＡのアッセイのすべては、選択
した無傷の抗原で動物を免疫化することによって発生し
たモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいず
れかを利用している。それらのいずれも、種々の抗原の
独特の一次配列を検出するために、配列特異的抗体をつ
くるという考えを述べていない。それらは、合成ペプチ
ドまたは天然の産物の断片に対して抗体を生成するため
に一次アミノ酸配列を使用することを包含していない。
それらは、ＣＥＡの族の構成員を区別するために一次ア
ミノ酸配列を使用するという概念を含まない。それらの
いずれも、一次配列の決定に使用する遺伝子を分離する
ために、ＤＮＡまたはＲＮＡのクローンを使用すること
を包含していない。

【００２８】 定義 例えば、図１および図５〜７に出現するような核酸の略号 Ａ アデニン Ｇ グアニン Ｃ シトシン Ｔ チミジン Ｕ ウラシル 例えば、図１および図５〜７に出現するようなアミノ酸の略号 Ａｓｐ アスパラギン酸 Ａｓｎ アスパラギン Ｔｈｒ スレオニン Ｓｅｒ セリン Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｇｌｎ グルタミン Ｐｒｏ プロリン Ｇｌｙ グリシン Ａｌａ アラニン Ｃｙｓ システイン Ｖａｌ バリン Ｍｅｔ メチオニン Ｉｌｅ イソロイシン Ｌｅｕ ロイシン Ｔｙｒ チロシン Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｔｒｐ トリプトファン Ｌｙｓ リジン Ｈｉｓ ヒスチジン Ａｒｇ アルギニン ヌクレオチド − 糖部分（ペントース）、ホスフェー
ト、および窒素の複素環塩基を含有するＤＮＡまたはＲ
ＮＡのモノマーの単位、塩基は糖部分にグリコシドの炭
素（ペントースの１′炭素）を介して結合しており、そ
して塩基と糖との組合せはヌクレオチドと呼ばれる。塩
基はヌクレオチドを特徴づける。４つのＤＮＡ塩基はア
デニン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン
（「Ｃ」）およびチミジン（「Ｔ」）である。４つのＲ
ＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）であ
る。

【００２９】ＤＮＡ配列 − 隣接ペントース類の３′
および５′炭素の間のホスホジエステル結合によって互
いに結合するヌクレオチドの直線の列。

【００３０】機能的同等体 − ＤＮＡ配列において、
あるヌクレオチドが発現生成物の配列を妨害しないで置
換されうることは、この分野においてよく知られてい
る。ペプチドに関すると、この用語は、特定の使用にお
いて機能をもたない１または２以上のアミノ酸が欠失さ
れるか、あるいは他のものと置換されうることを意味す
る。

【００３１】コドン − ｍＲＮＡを通してアミノ酸、
翻訳開始シグナルまたは翻訳停止シグナルをコードする
（encode）３つのヌクレオチド（トリプレット）のＤＮ
Ａ配列。例えば、ヌクレオチドのトリプレットＴＴＡ、
ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ
酸のロイシン（「Ｌｅｕ」）についてコードし、そして
ＴＧＡは翻訳停止シグナルであり、そしてＡＴＧは翻訳
開始シグナルである。リーディングフレーム − アミ
ノ酸配列へのｍＲＮＡの翻訳の間のコドンのグループ。
翻訳の間、適切なリーディングフレームが維持されなく
てはならない。例えば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧ
は３つのリーディングフレームまたは相において翻訳さ
れることができ、それらの各々は異なるアミノ酸配列 ＧＴＣ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ − Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ − Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ ＧＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ − Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−（停止） を与える。

【００３２】ポリペプチド − 隣接アミノ酸類のα−
アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって
互い結合したアミノ酸の直線の列。

【００３３】ゲノム − 細胞またはウイルスの全ＤＮ
Ａ。それは、なかでも、細胞またはウイルスのポリペプ
チドをコードする構造遺伝子、ならびにそのオペレータ
−、プロモーターおよびリボソーム結合および相互作用
配列、例えば、ＳＤ配列（Shine-Dalgarno 配列）のよ
うな配列、を包含する。

【００３４】構造遺伝子 − その鋳型またはメッセン
ジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）を通して特定のポリペプ
チドの特徴あるアミノ酸の配列をコードするＤＮＡを配
列。

【００３５】転写 − 構造遺伝子からｍＲＮＡを生成
するプロセス。

【００３６】翻訳 − ｍＲＮＡからポリペプチドを生
成するプロセス。

【００３７】発現 − ポリペプチドを生成するために
構造遺伝子によってなされるプロセス。それは転写と翻
訳との組み合わせである。

【００３８】プラスミド − プラスミドが宿主細胞中
で複製されるように、無傷の「レプリコン」からなる非
染色体二本鎖ＤＮＡ配列。プラスミドが単細胞の有機体
内に配置されると、その有機体の特性はプラスミドのＤ
ＮＡの結果として変化または形質転換されうる。例え
ば、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔ^R）のための遺伝子
を有するプラスミドは、テトラサイクリンに対して以前
感受性であった細胞をそれに対して抵抗性の細胞に形質
転換する。プラスミドによって形質転換された細胞を
「形質転換体」と呼ぶ。

【００３９】ファージまたはバクテリオファージ −
バクテリアのウイルス、それらの多くは蛋白質のエンベ
ロープまたはコート）（「カプシド蛋白質」）中に包膜
されたＤＮＡ配列から成る。

【００４０】クローニングビヒクル（cloning vehicl
e） − 宿主細胞中で複製することができるプラスミ
ド、ファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列、これはＤＮ
Ａの本質的生物学的機能、例えば、複製、コート蛋白質
の生成を付随して損失しないで、あるいはプロモーター
または結合部位を損失しないで、決定可能な方法でこの
ようなＤＮＡ配列を切断できる、エンドヌクレアーゼ認
識部位の１つまたは小さい数によって特徴づけられ、そ
して形質転換した細胞の同定において使用するために適
するマーカー、例えば、テトラサイクリン耐性またはア
ンピシリン体制を包含する。クローニングビヒクルはし
ばしばベクターと呼ばれる。

【００４１】クローニング − 無性生殖によって１つ
のこのような有機体または配列から誘導された有機体ま
たはＤＮＡ配列の集団を得るプロセス。

【００４２】組換え体ＤＮＡ分子またはハイブリッドＤ
ＮＡ − 生きている細胞の外部で端対端で接合し、そ
してある宿主細胞を感染することができかつその中で維
持されうる異なるゲノムからのＤＮＡのセグメントから
成る分子。

【００４３】発現制御配列 − 構造遺伝子へ操作的に
結合されたとき、構造遺伝子の発現を制御しかつ調節す
るヌクレオチドの配列、それらは、ｌａｃ系、Ｔｒｐ
系、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモータ
ーの領域、ｆｄコート蛋白質の制御領域およびそれらの
ウイルスの原核または真核細胞の遺伝子の発現を制御す
ることが知られている他の配列を包含する。

【００４４】形質転換／トランスフェクション − Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡを細胞中に導入して遺伝子を発現させ
ることができる。ここにおいて使用する「感染した（in
fected）」は、ウイルスのベクターによってＲＮＡまた
はＤＮＡが宿主中に導入されることに関する。ここで使
用する「注入された（injected）」は、細胞中へのＤＮ
Ａのマイクロインジェクション（細い注射器の使用）に
関する。

【００４５】以後述べるＣＥＡ−Ａ、ＣＥＡ−Ｂ、ＣＥ
Ａ−Ｃ、ＣＥＡ−Ｄは、下の実施例において記載するＣ
ＥＡ族の構成員である。

【００４６】本発明は、新規な核酸配列、例えば、ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ配列に関し、この核酸配列はＣＥＡ配列
またはそれとハイブリダイゼーション可能な塩基配列
（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を有する核酸をコードする塩基
配列からなる。このような核酸は、完全なＣＥＡ遺伝子
またはその一部、例えば、イントロン配列、ならびにエ
クソン配列からなるゲノムＤＮＡであることができる
か、あるいはＣＥＡ蛋白質をコードするメッセンジャー
ＲＮＡに対して相補的であるように構成されたＤＮＡ、
すなわち、ｃＤＮＡであることができる。本発明の核酸
は、下に記載するＤＮＡ配列またはその断片、ならびに
それとハイブリダイゼーション可能な配列からなる：

【００４７】

【表１５】

【００４８】配列は位置１から端（位置８６２）を表示
する。配列は位置１から番号を付してある。

【００４９】完全なＣＥＡ蛋白質をコードしかつ前述の
配列からなる本発明の核酸は、合計約５０００以下、よ
り通常約３６００の塩基を有するであろう。上の配列の
ｃＤＮＡの断片は、少なくとも１０、ある場合において
少なくとも５０の塩基を有するであろう。

【００５０】８５９塩基の上のＤＮＡ配列は、発現され
うるＣＥＡの免疫反応性断片、例えば、ラムダｇｔｌ１
をコードする。この配列は、長さがほぼ３００塩基であ
る内部の反復を有し、そして長さが２８５アミノ酸の理
論的蛋白質をコードする。このｃＤＮＡは他のヒト遺伝
子中に見出される配列をコードし、そして遺伝子のこの
全族はＣＥＡ族の蛋白質をコードすることができる。

【００５１】本発明は、また、下に記載する塩基配列ま
たはその断片、ならびにそれとハイブリダイゼーション
可能な配列からなる、２８３９塩基対を有するＤＮＡ配
列に関する；

【００５２】

【表１６】

【００５３】

【表１７】

【００５４】

【表１８】

【００５５】

【表１９】

【００５６】同様にＣＥＡ族の構成員である蛋白質をコ
ードするそれ以上の配列は、以後に実施例中に示されて
いる。

【００５７】本発明は、また、核酸、例えば、ＤＮＡか
らなるインサートを有する複製可能な組換えクローニン
グビヒクル（「ベクター」）に関し、この核酸はＣＥＡ
ペプチドをコードする塩基配列またはそれとハイブリダ
イゼーション可能な塩基配列からなる。

【００５８】本発明は、また、複製可能な組換えクロー
ニングビヒクルまたは前述のｃＤＮＡとハイブリダイゼ
ーション可能な核酸で形質転換／トランスフェクショ
ン、感染または注入した細胞に関する。こうして、本発
明は、また、クローニングビヒクルを使用しないで、遊
離の核酸を使用する細胞のトランスフェクションに関す
る。

【００５９】なおさらに、本発明は、前述のトランスフ
ェクション、感染または注入した細胞によって発現され
たポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＣＥＡ、な
らびに前記ポリペプチドの標識された形態と免疫学的交
差反応性を示す。本発明は、また、前述の複製可能な組
換えクローニングビヒクルでトランスフェクション、感
染または注入した細胞の発現生成物のアミノ酸配列、す
なわち、合成ペプチドを有するポリペプチド、ならびに
標識された形態のポリペプチドに関する。換言すると、
本発明は、前述の発現生成物の全アミノ酸配列またはそ
の５以上のアミノ酸を有するその一部に相当するアミノ
酸配列を有する合成ペプチドに関する。本発明は、さら
に、前述のポリペプチドに対して特異的な抗体調製物に
関する。

【００６０】本発明の他の面は、工程（ａ） 試験試料
を前述の抗体調製物と接触させ、そして（ｂ） 試料中
のＣＥＡへ結合する前記抗体調製物を決定すること、を
含んでなる試験試料中のＣＥＡまたは機能的同等体を検
出するイムノアッセイ法に関する。

【００６１】本発明は、また、工程（ａ） 試験試料を
核酸プローブと接触させ、前記プローブは、ＣＥＡペプ
チド配列またはそれとハイブリダイゼーション可能な塩
基配列をコードする塩基配列からなる核酸からなり、そ
して（ｂ） 得られないハイブリダイゼーションしたプ
ローブの形成を決定すること、を含んでなる試験試料中
のＣＥＡまたは関連する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を
検出する核酸ハイブリダイゼーション法に関する。

【００６２】本発明は、また、工程 ａ） 動物またはヒトの患者に、本発明による標識され
た（例えば、Ｘ線、放射線標識、あるいはＮＭＲで検出
可能な常磁性物質で標識した）抗体調製物を導入し、そ
して ｂ） 患者におけるこのような抗体調製の存在を標識の
検出により検出すること、を含んでなる生体内で患者に
おける癌胎児性抗原またはその機能的同等体の存在を検
出する方法に関する。

【００６３】他の面において、本発明は、本発明による
抗体調製物を治療的目的に使用すること、すなわち、抗
体調製物を放射線核種または毒素に取付けて複合体を形
成し、そしてこのような複合体の有効量を動物またはヒ
トの患者に、例えば、注射により、導入すること、に関
する。標識した複合体は患者中のＣＥＡに結合し、そし
て放射線核種または毒素はＣＥＡを発現する細胞を破壊
する役目をするであろう。

【００６４】いくつかのＣＥＡエピトープは独特であ
る。これらは、種々のＣＥＡ様抗原を免疫学的に区別す
るために有用であったエピトープである。ペプチドのエ
ピトープは、抗原の直線のアミノ酸配列および／または
蛋白質のフォルディング（folding）から生ずる面によ
って定義される。蛋白質のフォルディングに要求される
情報は、一次アミノ酸配列中にコードされる。したがっ
て、抗原の差は、究極的には、異なるＣＥＡ分子の一次
構造における差から生ずる。こうして、ＣＥＡ種におけ
るＣＥＡ蛋白質中に存在する差は、一次アミノ酸配列の
決定によって決定することができる。これはＣＥＡの遺
伝子の各々をクローニングしかつ配列決定することによ
って最も容易に達成される。癌の診断にどの遺伝子生成
物が最も有用であるかを決定するために、独特プローブ
を各遺伝子のために選択することができ、そして各遺伝
子の発現を異なる腫瘍の型において核酸ハイブリダイゼ
ーション技術によって決定することができる。本発明
は、ＣＥＡ族の異なる構成員をコードする潜在的遺伝子
を同定し、そしてそれらのための理論的一次アミノ酸配
列を決定するための道具を提供する。自動化されたペプ
チド合成法を使用すると、これらの抗原における独特配
列の対応するペプチドを合成できる。これらのペプチド
を使用して、これらの配列に対する抗体を生成せしめる
ことができ、これらの抗体は、無傷のＣＥＡ分子におい
て、免疫化された動物によって認識されることができな
い。これが達成されると、各抗原を測定するための特別
のイムノアッセイを発生するために、これらの抗原の差
を利用することができる。

【００６５】広範な種類の宿主／クローニングビヒクル
の組み合わせを、本発明に従い調製された二本鎖核酸の
クローニングに使用できる。例えば、有用なクローニン
グビヒクルは、次のものから成ることができる：染色
体、非染色体および合成のＤＮＡ配列のセグメント、例
えば、ＳＶ４０の種々の既知の誘導体および既知のバク
テリアのプラスミド、例えば、E. coli からのプラスミ
ド、例えば、ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、
ｐＭＢ８９およびそれらの誘導体、より広い宿主範囲の
プラスミド、例えば、ＲＰ４、およびファージのＤＮ
Ａ、例えば、ファージの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９
８９、および他のデータファージ、例えば、Ｍ１３およ
びフィラメンテアス（Filamenteous）一本鎖ＤＮＡファ
ージおよびプラスミドとファージのＤＮＡとの組み合わ
せから誘導されるベクター、例えば、ファージＤＮＡを
使用するように修飾されたプラスミドまたは他の発現制
御配列または酵母菌プラスミド、例えば、２μプラスミ
ドまたはその誘導体。有用な宿主は、次のものを包含す
ることができる：バクテリアの宿主、例えば、E. col
i、例えば、E. coli ＨＢ １０１、E. coli Ｘ１７
７６、E. coli Ｘ２２８２、E. coli ＭＲＣ１および
シュードモナス（Pseudomonas）、バシルス スブチルス
（Bacillus subtillus）、バシルス ステアロテルモフ
ィルス（Bacillusstearothermophilus）および他の E.
coli、バシルス、酵母菌および他の菌・カビ類、動物ま
たは植物の雑種、例えば、培養における動物（ヒトを含
む）または植物の細胞または他の宿主。もちろん、すべ
ての宿主／ベクターの組み合わせが同等に有効であると
いうわけではない。宿主／ベクターの組み合わせの特定
の選択は、本発明の範囲を逸脱しないで、記載する原理
を正当に考慮した後、この当業者によってなされること
ができる。

【００６６】さらに、各特定のクローニングビヒクルの
範囲内で、本発明による核酸の挿入のために種々の部位
を選択することができる。これらの部位は、通常、それ
らを切断する制限エンドヌクレアーゼによって表示され
る。例えば、ｐＢＲ３２２において、Ｐｓｔ１部位はベ
ーターラクタマーゼのための遺伝子中に、その蛋白質の
アミノ酸１８１および１８２をコードするヌクレオチド
のトリプレットの間に位置する。ｐＢＲ３２２におい
て、２つのＨｉｎｄＩＩエンドヌクレアーゼ認識部位の
１つはアミノ酸１０１および１０２をコードするトリプ
レットの間に存在して、そしていくつかのＴａｇ部位の
１つはベーターラクタマーゼのアミノ酸４５をコードす
るトリプレットに存在する。同様な方法において、この
プラスミドにおけるＥｃｏＲＩ部位およびＰＶＵＩＩ部
位は解読領域の外観に存在し、そしてＥｃｏＲＩ部位
は、それぞれ、テトラサイクリンおよびアンピシリンに
対する耐性をコードする遺伝子の間に位置する。これら
の部位はこの分野においてよく認識されている。もちろ
ん、本発明において有用なクローニングビヒクルは、選
択したＤＮＡ断片の挿入のための制限エンドヌクレアー
ゼ部位を有する必要はないことを理解すべきである。そ
の代わり、ビヒクルを切断し、そして別の手段により断
片に接合することができる。

【００６７】組換え核酸分子を形成するために選択した
核酸断片を取付けるための、ここにおいて選択したベク
ターまたはクローニングビヒクル、とくに部位は、種々
の因子によって決定され、それらの因子の例は、特定の
制限酵素に対して感受性の部位の数、発現すべき蛋白質
の大きさ、宿主細胞の酵素による蛋白質分解的減成に対
する所望蛋白質の感受性、精製の間の除去が困難な宿主
細胞蛋白質により発現される蛋白質の汚染、発現の特
性、例えば、ベクター配列に関する出発コドンおよび停
止コドンの位置、およびこの分野において認識されてい
る他の因子である。特定の遺伝子のためのベクターの挿
入部位の選択は、これらの因子のバランスによって決定
され、すべての区画（section）が所定の場合に同等に
有効であるというわけではない。

【００６８】核酸配列をクローニングビヒクル中に挿入
して組換え核酸分子を形成する方法は、例えば、ｄＡ〜
ｄＴテイリング（tailing）、直接結合、合成リンカ
ー、エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ連結修復反
応および引続く結合、あるいは適当なポリメラーゼおよ
び適当な一本鎖鋳型を使用する核酸の伸張および引続く
結合を包含する。

【００６９】また、クローニングビヒクルの選択した部
位に挿入された核酸配列または核酸断片は、所望ポリペ
プチドまたは成熟蛋白質のための実際の構造遺伝子の一
部ではないヌクレオチドを含むことができるか、あるい
は所望ポリペプチドまたは成熟蛋白質のための完全な構
造遺伝子の断片のみを含むことができる。

【００７０】異質遺伝子を含有するクローニングビヒク
ルまたはベクターを使用して適当な宿主を形質転換し
て、その宿主がその異質遺伝子を複製できるようにしか
つその異質遺伝子またはその一部によって解読された蛋
白質を発現することができる。適当な宿主の選択は、ま
た、ある数のこの分野で認識されている因子によって制
御される。これらは、例えば、選択したベクターとの適
合性、ハイブリッドプラスミドによってコードされた蛋
白質の毒性、所望蛋白質の回収の容易さ、発現特性、生
物安全性およびコストを包含する。特定の組換えＤＮＡ
分子の発現のためにすべての宿主が同等に有効でないで
あろうことを理解して、これらの因子はバランスされな
くてはならない。

【００７１】蛋白質の生成レベルは、２つの主要な因子
によって支配される：細胞内のその遺伝子のコピーの数
およびそれらの遺伝子のコピーが転写および翻訳される
効率。次に、転写および翻訳（それらは一緒になって発
現を構成する）の効率は、通常所望解読配列より前に位
置する、ヌクレオチド配列に依存する。これらのヌクレ
オチド配列または発現制御配列は、なかでも、ＲＮＡポ
リメラーゼが相互作用して転写を開始し（プロモーター
配列）およびリボソームがｍＲＮＡ（転写の生成物）と
結合しかつ相互作用して翻訳を開始する位置を定める。
このような発現制御配列のすべてが同等の効率で機能す
るわけではない。こうして、所望蛋白質のための特異的
解読配列をそれらの隣接ヌクレオチド配列から分離し、
そしてそれらを他の既知の発現制御配列の代わりに融合
して発現のレベルをより高くすることは有利である。こ
れが達成されると、新しく操作された核酸、例えば、Ｄ
ＮＡ、の断片は、マルチコピーのプラスミドまたはバク
テリオファージの誘導体の中に挿入して、細胞内の遺伝
子のコピーの数を増加し、これによって発現された蛋白
質の収率を改良することができる。

【００７２】いくつかの発現制御配列を前述のようにし
て使用できる。これらは、次のものを包含する：E. col
i のラクトースオペロン（「ｌａｃ配列」）のオペレー
ター、プロモーターおよびリボソームの結合および相互
作用の配列（例えば、ＳＤ配列のような配列を包含す
る）、E. coli のトリプトファンシンターゼ系の対応す
る配列（「ｔｒｐ系」）、ファージλの主要なオペレー
ターおよびプロモーター領域（Ｏ_LＰ_LおよびＯ
_RＲ′_R）、フィラメンテアス（Filamenteous）一本鎖Ｄ
ＮＡファージの制御領域、あるいは原核細胞または真核
細胞およびそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御する
他の配列。したがって、適当な宿主における特定のポリ
ペプチドの生成を改良するためには、そのポリペプチド
をコードする遺伝子を選択し、そしてそれを含有する組
換え核酸分子から除去し、そして組換え核酸分子の中
に、その前者の発現制御配列の近くにあるいはそれと一
層適当な相関関係で、あるいは前述の発現制御配列に１
つの制御の下に、再挿入することができる。このような
方法はこの分野において知られている。

【００７３】ここにおいて使用するとき、「相関関係」
は、多くの因子、例えば、次のものを包含する：組換え
核酸分子の発現増大および促進領域および挿入された核
酸配列を分離する距離、ベクター自体における挿入され
た核酸配列または他の配列の転写および翻訳の特性、ベ
クターの挿入された核酸配列または他の配列の特定のヌ
クレオチド配列、およびベクターの発現増大および促進
領域の特定の特性。

【００７４】さらに、所望生成物の細胞の収率の増加
は、細胞中で利用できる遺伝子の数の増加に依存する。
例示すると、これは次のようにして達成される。操作し
た組換え核酸分子を鋳型のバクテリオファージλ（ＮＭ
９８９）の中に挿入して、最も簡単にはプラスミドを制
限酵素で消化して、線状分子を生成し、次いでこれを制
限されたファージλクローニングビヒクル［例えば、次
の文献に記載されている型のもの、Ｎ．Ｍ．ムレイ（Mu
rray）ら、「生体外組換え体の回収を簡素化するラムド
イドファージ（Lambdoid Phage That Simplify the Rec
overy of In Vitro Recombinants）」、モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジェニティックス（Molec. Gen.
Genet.）、１５０、５３−６１ページ（１９７７）およ
びＮ．Ｅ．ムレイ（Murray）ら、「バクテリオファージ
Ｔ４からのＤＮＡリガーゼ遺伝子の分子クローニング
（Molecular Cloning of the ＤＮＡ Ligaze Gene From
Bacteriophage Ｔ４）、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、１３２、４９
３−５０５ページ（１９７９）」と混合し、そして組換
え体ＤＮＡ分子をＤＮＡリガーゼとのインキュベーショ
ンにより再環状化する。次いで、所望の組換えファージ
を前のように選択し、そして E. coli の宿主菌株を溶
原化するために使用する。

【００７５】とくに有用なλクローニングビヒクルは、
抑制遺伝子中に温度感受性突然変異体および遺伝子Ｓ中
に抑制突然変異体、その生成物は宿主細胞の溶解のため
に必要である、および遺伝子Ｅ、その生成物はウイルス
の主要なカプシド蛋白質である、を含有する。この系を
用いると、溶原性細胞を３２℃で生長させ、次いで４５
℃に加熱してプロファージの切除を誘発する。３７℃に
おいて延長して生長させると、細胞内に保持される蛋白
質の生産レベルが高くなり、これらは通常の方法でファ
ージ遺伝子生成物によって溶解されないので、およびフ
ァージ遺伝子のインサートは包膜されないので、それは
それ以上の転写のために利用可能にとどまる。次いで、
細胞の人工的溶解は高い収率で所望生成物を解放する。

【００７６】さらに、本発明に従って調製されるポリペ
プチドの収率は、また、存在するＤＮＡ配列のコドンの
一部または全部を異なるコドンで置換することによって
改良することができ、これらの置換されたコドンは置き
代えられたコドンによってコードされるものと同一のア
ミノ酸をコードする。 最後に、本発明の組換え核酸分
子によって生成されたポリペプチドの活性は、本発明の
範囲から逸脱しないで、よく知られた手段によって、本
発明の核酸配列またはポリペプチドを断片化、修飾また
は誘導体化することによって改良することができる。

【００７７】本発明のポリペプチドは、次のものを包含
する： （１） 前述の細胞によって発現されたポリペプチド、
（２） 合成手段によって調製されたポリペプチド、
（３） 上の（１）または（２）のポリペプチドの断
片、このような断片はアミノ酸の合成により、あるいは
消化または切断によって生成される。

【００７８】本発明による合成ペプチドに関すると、ペ
プチドの化学的合成は次の刊行物に記載されている：
Ｓ．Ｂ．Ｈ．ケント（Kent）、バイオメディカル・ポリ
マー（Biomedical Polymers）、ゴールドバーグ（Goldb
erg）、Ｅ．Ｐ．およびナカジマ、Ａ．編（アカデミッ
ク・プレス、ニューヨーク）、２１３−２４２（１９８
０）；Ａ．Ｒ．ミッチェル（Mitchell）、Ｓ．Ｂ．Ｈ．
ケント（Kent）、Ｍ．エンゲルハード（Engelhard）お
よびＲ．Ｂ．メリフィールド（Merrifield）、ジャーナ
ル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Org. Che
m.）４３、２８４５−２８５２（１９７８）；Ｊ．Ｐ．
タム（Tam）、Ｔ．−Ｗ．ウォング（Wong）、Ｍ．リー
マン（Rieman）、Ｆ．−Ｓ．ジョング（Tjoeng）および
Ｒ．Ｂ．メリフィールド（Merrifield）、テトラヘドロ
ン・レターズ（Tet. Let.）、４０３３−４０３６、
（１９７９）；Ｓ．モジソブ（Mjsov）、Ａ．Ｒ．ミッ
チェル（Mitchell）およびＲ．Ｂ．メリフィールド（Me
rrifield）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミス
トリー（J. Org. Chem.）、４５、５５０−５６０（１
９８０）；Ｊ．Ｐ．タム（Tam）、Ｒ．Ｄ．ジマーチ（D
iMarchi）およびＲ．Ｂ．メリフィールド（Merrifiel
d）、テトラヘドロン・レターズ（Tet. Let.）、２８５
１−２８５４、（１９８１）；およびＳ．Ｂ．Ｈ．ケン
ト（Kent）、Ｍ．リーメン（Riemen）、Ｍ．デ・ドウク
ス（De Doux）およびＲ．Ｂ．メリフィールド（Merrifi
eld）、蛋白質配列の分析法についての第ＩＶ回国際シ
ンポジウムの会議録（Proceedings of the IV Internat
ional Symposium on Methods of Protein Sequence Ana
lysis）、（ブルックヘブン・プレス、ブルックヘブ
ン、ニューヨーク）、イン・プレス、１９８１。

【００７９】メリーフィールド（Merifield）の固相手
順において、Ｌ−アミノ酸の適当な配列はカルボキシ末
端アミノ酸からアミノ末端アミノ酸に構成される。樹脂
のクロロメチル基、ベンズヒドリルアミン基または他の
基への化学結合を介してポリスチレン（または他の適当
な）樹脂へ取付けられた適当なカルボキシル末端アミノ
酸を使用して出発して、アミノ酸を次の手順に従い順番
に付加する。ペプチド−樹脂を、（ａ） 塩化メチレン
で洗浄し、（ｂ） 塩化メチレン中の５％（ｖ／ｖ）ジ
イソプロピルエチルアミン（または他のヒンダード塩
基）で室温において１０分間中和し、（ｃ） 塩化メチ
レンで洗浄し、（ｄ） 生長するペプチド鎖のモル量の
６倍に等しい量のアミノ酸を、モル数の１／２倍の量の
カーボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカーボジイ
ミド、またはジイソピルカーボジイミド）と１０分間０
℃において組み合わせることによって活性化して、アミ
ノ酸の対称無水物を形成する。使用するアミノ酸は、本
来、Ｎ−アルファ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
誘導体として提供されるべきであり、側鎖は、ペプチド
合成において普通に使用される、ベンジルエステル（例
えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、ベンジル
エーテル（例えば、セリン、スレオニン、システインま
たはチロシン）、ベンジルオキシカルボニル基（例え
ば、リジン）または他の保護基で保護されており、
（ｃ） 活性化アミノ酸をペプチド−樹脂と２時間室温
において反応させ、新しいアミノ酸を生長するペプチド
鎖の末端に付加させ、（ｆ） ペプチド−樹脂を塩化メ
チレンで洗浄し、（ｇ） Ｎ−アルファ−（ｔｅｒｔ−
ブチルオキシカルボニル）基を、最も最近付加されたア
ミノ酸から、塩化メチレン中の３０〜６５％（ｖ／
ｖ）、好ましくは５０％（ｖ／ｖ）のトルフルオロ酢酸
と室温において１０〜３０分間反応させることによって
除去し、（ｈ） ペプチド−樹脂を塩化メチレンで洗浄
し、（ｉ） 要求するペプチド配列が構成されてしまう
まで、工程（ａ）〜（ｈ）を反復する。

【００８０】次いでペプチドを樹脂から除去し、そして
同時に、１０％ｖ／ｖのアニソールまたは他の適当な
（芳香族）スキャベンジャーを含有する無水フッ化水素
酸との反応によって、側鎖の保護基を除去する。引続い
て、ペプチドをゲル濾過、イオン交換、高圧液体クロマ
トグラフィー、または他の適当な手段によって精製す
る。ある場合において、化学的合成は固相樹脂を用いな
いで実施することができ、この場合において、合成反応
は完全に溶液中で実施される。反応はこの分野において
同様でありかつよく知られており、そして最終生成物は
本質的に同一である。

【００８１】ポリペプチドの消化は、蛋白質分解酵素、
ことにその基質の特異性がアミノ酸の所望配列にすぐに
隣接する部位においてポリペプチドを切断する酵素を使
用することによって達成できる。

【００８２】ポリペプチドの切断（cleavage）は化学的
手段によって達成できる。アミノ酸間の特定の結合は、
特異的試薬との反応によって切断できる。実施例は次の
ものを包含する：メチオニンを含む結合は臭化シアンに
よって切断される；アスパラギニル−グリシン結合はヒ
ドロキシルアミンによって切断される。

【００８３】合成ペプチド類およびそれらに対する抗体
をつくる目的に対して重要であると信じられる配列の非
制限的列挙は、次の通りである。各抗原は３つのレベル
にカテゴリー化される：１）内部に潜在的に有用な部位
を含有する大きい領域；２）１のサブ領域および；３）
合成ペプチド抗原としての使用するためのプライムター
ゲットであると考えられる個々の部位。

【００８４】 大きさのカテゴリー 抗原 （上を参照） 残基からのアミノ酸 残基へのアミノ酸 ＣＥＡ 1 135 386 （図５〜７参照） 2 174 220 285 386 3 174 200 208 216 285 290 292 308 312 321 360 372 380 386 ＦＬ−５（ＦＬ− 1 135 386 ５についての配列 411 492 は下に与えられて いる) 2 174 220 285 389 3 174 200 208 222 285 292 295 311 315 328 331 345 348 360 363 377 383 390 ＢＴ ２０ 1 135 285 （ＦＬ−５に についての配列 2 168 220 は下に与えられ ている） 3 168 196 210 220 264 283 本発明は次の利点を有する： （１） 本発明によるＣＥＡをコードする核酸は、その
一部分である完全な遺伝子を分離するためにプローブと
して使用できる。

【００８５】（２） それはＣＥＡ遺伝子族の他の構成
員を分離するためのプローブとして使用できる。

【００８６】（３） それは種々の腫瘍の型におけるこ
の遺伝子の発現を決定するためにオリゴヌクレオチドプ
ローブとして使用できる。

【００８７】（４） このヌクレオチド配列は、合成ペ
プチドの生成のための蛋白質の一次アミノ酸配列を予測
するために使用することができ、そしてＣＥＡ族の構成
員を区別するために使用できる。

【００８８】（５） 上の配列から誘導された合成ペプ
チドは、配列特異的抗体を生成するために使用できる。

【００８９】（６） ＣＥＡ族の各構成員についてのイ
ムノアッセイは、これらの配列特異的抗体および合成特
異的ペプチドを用いて生成することができる。

【００９０】（７） ＣＥＡ族の異なる構成員が異なる
型の癌のための臨床的に有用なマーカーであることが決
定された場合、これらのイムノアッセイは異なる型の癌
のための診断に使用できる。

【００９１】本発明によるポリペプチドは、慣用の手段
により、放射線部分、例えば、Ｉ¹²⁵、酵素、色素およ
び蛍光性化合物を使用して標識することができ、これら
の標識は単なる例である。

【００９２】本発明によるイムノアッセイのためにいく
つかの可能な立体的配置を使用できる。これらのアッセ
イにおいて使用できる読出し系は多数存在し、そしてこ
のような系の非制限的例は、蛍光性および比色の酵素
系、ラジオアイソトープ標識および誘導体および化学ル
ミネセンス系を包含する。イムノアッセイ法の２つの例
は、次の通りである： （１） 本発明による抗体調製物（それらから誘導され
たＦａｂまたはＦ（ａｂ）′断片を含む）を使用する酵
素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、固相（例えば、
マイクロタイター板またはラテックスのビーズ）に、酵
素に接合するもの以外の特異的をもつ精製された抗ＣＥ
Ａ抗体を取付ける。この固相抗体をＣＥＡを含有する試
料と接触させる。洗浄後、固相抗体−ＣＥＡ複合体を、
接合した抗ペプチド抗体（または接合した断片）と接触
させる。結合しない接合体を洗浄除去した後、酵素のた
めの発色性または蛍光発生性の基質を添加することによ
って、色または蛍光を発生させる。発生した色または蛍
光は、試料中のＣＥＡの量に比例する。

【００９３】（２） 蛍光的に標識されたペプチドまた
はｃＬＶ７によって特定化された配列の合成ペプチドを
使用する競合蛍光測定イムノアッセイ。この実施例にお
いて、細胞によって発現された精製されたペプチドまた
はその合成ペプチドを蛍光的に標識する。固相に、精製
された抗ＣＥＡ抗体を取付ける。次いで、蛍光性ペプチ
ドプローブが添加されているＣＥＡ含有試料とこの固相
を接触させる。結合後、過剰のプローブを洗浄除去し、
結合したプローブの量を定量する。結合した蛍光性プロ
ーブの量は、試料中のＣＥＡの量に対して反比例する。

【００９４】本発明による核酸ハイブリダイゼーション
法において、核酸プローブを標識、例えば、酵素、蛍光
団、ラジオアイソトープ、化学ルミネセント化合物など
と接合する。最も一般的場合において、プローブを試料
と接触させ、そしてハイブリダイゼーション可能な核酸
配列の存在は、発色性酵素基質の存在下に発色させ、蛍
光をエピフルオレセンス（epifluorescence）により検
出することにより、ラジオアイソトープで標識されたプ
ローブのオートラジオグラフィーにより、または化学ル
ミネセンスにより検出することができる。ハイブリダイ
ゼーション可能なＲＮＡ配列の検出は、（１）ドットブ
ロット法または（２）正常部位（in situ）ハイブリダ
イゼーション法によって達成することができる。これら
の最後の２つの技術についての方法は、それぞれ、次の
文献に記載されている：Ｄ．ギレスピー（Gillespie）
およびＪ．ブレッサー（Bresser）、「ＮａＩ中のｍＲ
ＮＡの固定化（ｍＲＮＡ Immobilization in NaI）：
クイック・ブロッツ（Quick Blots）」、バイオテクニ
ークス（Biotechniques）、１８４−１９２、１１月／
１２月、１９８３およびＪ．ロウレンス（Lawrence）お
よびＲ．シンガー（Singer）、「サイトスケタル蛋白質
についてのメッセンジャーＲＮＡ類の細胞内局在化（In
tracellurar Localization of Messenger ＲＮＡｓ for
Cytosketal Proteins）」、細胞（Cell）、４５、４０
７−４１５、５月９日、１９８６。読出し系は前述のも
のと同一であり、例えば、酵素標識、放射線標識などで
ある。

【００９５】前述のように、本発明は、また、本発明の
前述の複合体の薬物中の使用に関する。

【００９６】本発明は、活性成分として、本発明の複合
体を固体、液体または液化ガスの希釈剤と混合して含有
する製薬学的組成物を提供する。

【００９７】本発明は、さらに、活性成分として、本発
明の複合体を含有する。無菌および／または薬理学的に
等張の水溶液の形態の製薬学的組成物を提供する。

【００９８】本発明は、また、本発明の複合体を含んで
なる投与単位の形態の薬物を提供する。

【００９９】本発明は、また、本発明の複合体を含んで
なる錠剤（ロゼンジおよび顆粒を包含する）、糖剤、カ
プセル剤、カプレット、ピル、アンプルおよび坐薬の形
態の薬物を提供する。

【０１００】「薬物」は、ここで使用するとき、医学的
投与に適する物理的に離散した凝集性の部分を意味す
る。「投与単位形態の薬物」は、ここで使用するとき、
各々が本発明の化合物の１日量または１日量の多数倍ま
たは約量を担体と一緒におよび／またはエンベロープ内
に包装して含有する、医学的投与に適する物理的に離散
した凝集性の部分を意味する。

【０１０１】本発明による製薬学的組成物は、例えば、
水性または非水性の希釈剤中の懸濁液、溶液または乳濁
液、シロップ、顆粒または粉末の形態を取ることができ
る。錠剤、糖剤、カプセル剤、カプレットおよびピルに
形成するために適合する製薬学的組成物（例えば、顆
粒）中に使用する希釈剤は、次のものを包含する：
（ａ）充填剤および増量剤、（ｂ）結合剤、（ｃ）湿潤
剤、（ｄ）崩壊剤、（ｅ）溶解遅延剤、（ｆ）吸着促進
剤、（ｇ）表面活性剤、（ｈ）吸着性担体、（ｉ）潤滑
剤。

【０１０２】本発明の製薬学的組成物から形成される錠
剤、糖剤、カプセル剤、カプレットおよびピルは、慣用
の被膜、エンベロープおよび保護マトリックスを有する
ことができ、これらは不透明化剤を含有することができ
る。それらは、活性成分を腸管のみに、あるいは、好ま
しくはその特定の部分に、可能ならばある期間にわたっ
て、放出するように構成することができる。

【０１０３】活性成分は、また、前述の希釈剤の１種ま
たは数種と一緒にマイクロカプセルの形態に構成するこ
とができる。

【０１０４】非経口的投与のために、溶液および乳濁液
は無菌であり、そして、適当ならば、血液等張性である
べきである。

【０１０５】本発明の複合体に加えて、本発明による製
薬学的組成物および薬物は、また、他の製薬学的に活性
な化合物を含有することができる。

【０１０６】本発明の薬物を構成する離散した凝集性の
部分は、一般に、それらの形状または包装のおかげで、
医学的投与に適合し、そして、例えば、次のいずれであ
ることもできる：錠剤（ロゼンジおよび顆粒を包含す
る）、ピル、糖剤、カプセル剤、カプレット、坐薬およ
びアンプル。これらの形態のあるものは、活性成分の遅
延した放出のために構成することができる。ある、この
ようなカプセル剤は、薬物の一部分を物理的に離散しか
つ凝集性とする保護的エンベロープを含むことができ
る。

【０１０７】前述の製薬学的組成物および薬物の調製
は、この分野において知られた任意の方法により、例え
ば、活性成分が希釈剤と混合して製薬学的組成物（例え
ば、顆粒）を形成し、次いでこの組成物を薬物（例え
ば、錠剤）に形成することによって実施される。

【０１０８】活性複合体は、経口的に、非経口的に（例
えば、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、あるいは静脈内
に）、経直腸的にまたは局所的に投与することが考えら
れる。

【０１０９】

【実施例】実施例１〜８ ＣＥＡ−ＡをコードするＬＶ７の調製 実施例１ ＲＮＡの調製 腫瘍メッセンジャーＲＮＡを、Ｊ．ファボラロ（Favola
ro）、Ｅ．トレイスマン（Treisman）およびＲ．ケイメ
ン（Kamen）、メソッズ・イン・エンジモロジー（Metho
ds in Enzymology）、６５、７１８、アカデミック・プ
レス・インコーポレーテッド（１９８０）のプロイテナ
ーゼＫ−フェノール抽出法によって調製し、次いでオリ
ゴｄＴセルロースクロマトグラフィーによってポリＡ＋
ＲＮＡ（ポリペプチドに翻訳できるほとんどのｍＲＮＡ
を含有する３′−ポリアデニル化真核生物ＲＮＡ）を生
成した。ほぼ１.２ｍｇのポリＡ＋ＲＮＡを得るため
に、後期の対数生長後、ほぼ５×１０⁹のロボ（Lovo）
細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２２９）を１００×８５０ｃｍ
³のローラーびんから収穫した。細胞を１４０ミリモル
のＮａＣｌ、１.５ミリモルのＭｇＣｌ₂、１０ミリモル
のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、０.５％のＮＰ４０、４ミ
リモルのジチオスレイトールおよび２０単位／ｍｌの胎
盤リボヌクレアーゼ阻害剤の氷冷溶液中の均質化によっ
て溶解した。次いで、ナトリウムデオキシコレートを
０.２％に添加した。細胞質および核は、ホモジネート
を１２,０００×ｇにおいて２０分間遠心することによ
って分離した。細胞質の分画を等体積の０.２モルのト
リス−ＨＣｌ、２５ミリモルのＥＤＴＡ、０.３ミリモ
ルのＮａＣｌ、２％のドデシル硫酸ナトリウムおよび４
００μｌ／ｍｌのプロイテナーゼＫと混合し、１時間３
７℃でインキュベーションし、次いで等体積のエタノー
ル／クロロホルム（１：１／ｖ：ｖ）溶液で１回抽出し
た。核酸は分離した水相のエタノール沈殿により得た。
合計のＲＮＡは、ポリＡ＋ＲＮＡについて、０.５モル
のＮａＣｌ、１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.
８、０.１％のサルコシル中でオリゴｄＴ（１２−１
８）セルロースカラムに通過させることによって濃縮し
た。洗浄後、結合したＲＮＡを、塩化ナトリウムの不存
在下に同一溶液で溶離した。

【０１１０】実施例２ ｍＲＮＡの逆転写 ５μｇのポリＡ＋Ｌｏｖｏ ＲＮＡを、オリゴｄＴ（１
２−１８）で逆転写についてプライミングした。５０μ
ｌの反応を９０分間４２℃において７５単位のＡＭＶ逆
トランスクリプターゼ（ライフ・サイエンシズ・インコ
ーポレーテッド、米国フロリダ州、セントペテルスバー
グ）を使用して実施した。ＲＮＡをアルカリ性加水分解
により除去し、そして一本鎖ｃＤＮＡを、それぞれ、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼの大
きい断片（クレノー）とともにインキュベーションする
ことによって一本鎖および平滑末端（blunt end）とし
た。

【０１１１】実施例３ ｐＬＶ７（プラスミドＬＶ７）のクローニグ 合成ＥｃｏＲＩ ＤＮＡリンカー（５′ｐＧＧ ＡＡＴ
ＴＣＣ ３′）を実施例２に記載するようにして調製し
たｃＤＮＡの末端に、過剰のＴ４ＤＮＡリガーゼ［２０
ウェイス（Weiss）単位］との平滑末端結合によって取
付けた。過剰のリンカーを「セファデックス（ＳＥＰＨ
ＡＤＥＸ）」Ｇ−５０のゲル透過クロマトグラフィーに
よって除去し、ＥｃｏＲＩ制限酵素による切断およびＡ
１５ｍ（バイオラド、ラボラトリーズ、米国カリフォル
ニア州リッチモンド）のアガロース排除クロマトグラフ
ィーによる分画によって、ＥｃｏＲＩ接着末端（stiky
end）を発生させた。５００ｂｐより大きいＤＮＡ断片
を、アガロースゲルの大きさ分類後に、選択し、９５％
のエタノールで沈殿させた。ＤＮＡを小さい体積の１０
ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.８、１ミリモルの
ＥＤＴＡ中に再懸濁し、そして等モル量のラムダｇｔｌ
１の５′ホスファターゼ化ＥｃｏＲＩ末端アーム（プロ
メガ・バイオテク、米国ウィスコンシン州マディソン）
に添加した。このファージは有利な性質をもち、ラムダ
ｇｔｌ１のＥｃｏＲＩ部位に挿入された異質ＤＮＡはベ
ーターガラクトシダーゼ融合蛋白質の一部として翻訳さ
れ、これはＣＥＡに対する抗体との免疫反応性について
スクリーニングすることができる。ＤＮＡをＴ４ＤＮＡ
リガーゼの存在下に１００〜２００μｌ／ｍｌの濃度に
おいて２４時間結合した。３μｌの結合したＤＮＡを生
体外ラムダパケージング混合物（packaging mix）スト
ラタジーン、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に添
加し、そしてパーケージングされた粒子を E. coli 宿
主ｙ１０８８（ＡＴＣＣ ２７１９５）の感染によって
アッセイした。４００万のファージのうちで、１２０万
はｃＤＮＡインサートを有することがベーターガラクト
シダーゼの相補性によって決定した。

【０１１２】実施例４ 免疫プロッティングによる融合ポリペプチドのスクリー
ニング ５万のファージを、E. coli Ｙ１０９０（ＡＴＣＣ ３
７１９７）上で、１０ミリモルのＭｇＳＯ₄および１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−ブロスを含有
する１２枚の１５０ｍｍの皿の各々においてスクリーニ
ングのために配置した。ある場合において、ファージの
ストック（stock）は、スクリーニング前に、増幅およ
び力価決定（titering）によって調製した。ファージを
４２℃で４時間溶解的に生長させ、次いで１０ミリモル
のＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）で含浸し
たニトロセルロースの円形体を皿の上に配置し、そして
３７℃でさらに２時間インキュベーションした。この期
間の間、融合蛋白質の合成は誘発され、そしてニトロセ
ルロースのマトリックスへ吸収された蛋白質を変性ＥＬ
ＩＳＡフォーマットにおいてスクリーニングした。出願
人のライブラリーにおいて、あるＬｏｖｏ蛋白質はＣＥ
ＡまたはＣＥＡ関連エピトープの一部分を発現すること
ができ、この部分は適当な抗体によって認識することが
できる。出願人は、自然のＣＥＡ（１８０ｋｄ）に対し
て向けられた商業的に入手可能な抗血清および還元しか
つアルキル化されたＣＥＡに対して会社内で調製された
抗血清を利用して、フィルター上で抗原を検出した。こ
れらのウサギのポリクローナル抗血清をＰＢＳ／Ｔ
（０.０５％の「ツイーン−２０」および０.０１％のチ
メロサルを含有するリン酸塩緩衝化食塩水（５０ミリモ
ルのＮａリン酸塩、ｐＨ７.３、１５０ミリモルのＮａ
Ｃｌ））中で希釈し、そして２時間インキュベーション
してニトロセルロースの円形体へ付着する蛋白質を認識
できるようにした。過剰の抗体を除去し、そして融合蛋
白質へ結合したウサギＩｇＧ分子を、アルカリ性ホスフ
ァターゼと接合したマウス抗ウサギＩｇＧ抗体によって
検出した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホ
スフェートおよびニトロブル−テトラゾリウムの存在下
に、色を検出した。暗色に着色するプラークの像をマー
クし、そして潜在的な陽性の区域の回復についてマスタ
ーファージ平板で検索（key）した。反復した希釈、免
疫プロッティングによるスクリーニングおよびアッセイ
の増幅後に、抗ＣＥＡ反応性ペプチドを発現しつづける
ファージを使用してＤＮＡを調製した。

【０１１３】実施例５ ＤＮＡの操作 Ｔ．マニアチス（Maniatis）、Ｅ．Ｆ．フイツリトシ
（Fritsch）およびＪ．サムブルック（Sambrook）、モ
レキュラークローニング、ア・ラボラトリー・マニュア
ル（Molecular Cloning, A Laboratory Mannual）、コ
ールド・スプリング・ハーバー、（１９８２）に従い、
ファージＤＮＡを調製した。ＤＮＡのセグメントを低融
点のアガロースゲルから分離し、そしてブルースクライ
ブ（Bluescribe）プラスミドベクター（ストラトギー
ン、米国カリフォルニア州サンディエゴ）中のサブクロ
ーニグのために挿入した。ＤＮＡの配列決定は、Ｆ．サ
ンガー（Sanger）、Ｓ．ニックレン（Nicklen）および
Ａ．Ｒ．クールソン（Coulson）、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ、７４、５４６３−
５４６７、（１９７７）のジデオキシ停止法によって実
施した。

【０１１４】実施例６ 酵素イムノアッセイによるラムダｃＬＶ７（ｃＤＮＡ
ＬＶ７）におけるＣＥＡ反応性の検出 ラムダｃＬＶ７を E. coli Ｙ１０８９中において２０
分間イソプロピルチオガラクトシドで誘発し、そして３
７℃において１時間生長させた。細胞を５分間ベックマ
ン・マイクロフージ（Beckman Microfuge）中で室温に
おいて遠心した。細胞をもとの体積の１％で、１０μｇ
／ｍｌのロイペプチンおよびペプスタチン、１０ミリモ
ルのＥＤＴＡ、１ミリモルのフェニルメチルスルホニル
フルオリドおよび０.０１％のチメロサルを含有する５
０モルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、中に懸濁させ
た。細胞を−８０℃で凍結し、融解し、そして０℃で６
分間超音波処理した。超音波処理した懸濁液を遠心し、
そして上澄みの流体を酵素結合イムノアッセイによりＣ
ＥＡ免疫反応性についてアッセイした。リンブロ（Linb
ro）９６ウェルのマイクロタイタープレートを、４００
ｎｇのマウスをモノクローナル抗ベータガラクトシダー
ゼ抗体で４℃において一夜被覆した。結合しない抗体を
洗浄除去し、そしてプレートをＰＢＳ／Ｔ（０.０５％
の「ツイーン−２０」および０.０１％のチメロサルを
含有するリン酸塩緩衝化食塩水（５０ミリモルのＮａリ
ン酸塩、ｐＨ７.３、１５０ミリモルのＮａＣｌ））で
室温において３時間ブロッキングした。超音波処理した
細胞からの上澄みをＰＢＳ／Ｔ中で希釈し、そして１０
０μｌの希釈した抗原を抗体被覆ウェルに添加した。室
温において２時間インキュベーションした後、結合しな
い抗原を洗浄除去し、そして希釈したウサギ抗ＣＥＡ抗
体を１００μｌのＰＢＳ／Ｔ中において添加した。次い
で、プレートを２時間室温においてインキュベーション
した。洗浄後、各ウェルにＰＢＳ／Ｔ中のヤギ抗ウサギ
ＩｇＧからの１００μｌのセイヨウワサビペルオキシダ
ーゼ接合Ｉｇを添加した。室温において２時間インキュ
ベーションした後、ウェルを洗浄し、そしてペルオキシ
ダーゼの基質（３,３,５,５′−テトラメチルベンジジ
ンおよび過酸化水素）５分間添加した。５０μｌの８モ
ルの硫酸の添加により、発色反応を停止した。４５０ｎ
ｍの吸収を各ウェルについて決定した。図２の四角形
（open square）は、前述のような融合蛋白質抗原を加
えたウェルを表わす、＋のデータ点は、上のように処理
したが、希釈した融合蛋白質抗原の代わりに１００μｌ
のＰＢＳ／Ｔを加えたウェルを表わす。

【０１１５】実施例７ ラムダムＬＶ７融合蛋白質の免疫化学的同定 融合蛋白質を含有する E. coli Ｙ１０８９リゼイト
を、Ｕ．Ｋ．ラエムリ（Laemmli）、ネイチャー（Natur
e）、２２７、６８０−６８５（１９７０）の方法に従
いＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に展開した。１０％のアクリルア
ミドゲル上の電気泳動後、蛋白質は電気泳動的にニトロ
セルロースへ移行した。移行後、フィターをＰＢＳ／Ｔ
中でブロッキングした。免疫プロットを、ウサギ抗ＣＥ
Ａおよび、ヤギ抗ウサギＩｇＧからのセイヨウワサビペ
ルオキシダーゼ接合ＩｇＧを使用する順次のインキュベ
ーションによって展開した。洗浄後、移行体を４−クロ
ロ−１−ナフトールとともにインキュベーションして帯
を可視化した。図３におけるレーン１は対照、すなわ
ち、ファージを含まない E. coli リゼイドである。図
３におけるレーン２はラムダｃＬＶ７融合蛋白質を含有
するリゼイトである。図３の左側の番号は、蛋白質の標
準の移動度および分子量（キロダルトン）を示す。図３
の右側の番号は、ラムダＬＶ７融合蛋白質（上のしる
し）および E. coliベーターガラクトシダーゼサブユニ
ット（下のしるし）の計算した分子量および移動度を示
す。

【０１１６】実施例８ ｃＬＶ７特異的ポリＡ＋ＲＮＡの検出 細胞質のポリＡ＋ＲＮＡを、Ｌｏｖｏ腫瘍細胞からおよ
びリンパ芽球様系統ＧＭ１９８９（対照の細胞系）から
調製した。５μｇの各ＲＮＡを変性し、そして１％のア
ガロース−２.２モルのホルムアルデヒドのゲル中で電
気泳動させ、次いでニトロセルロース紙に移した。次い
で、移したブロットを２×ＳＳＰＥ、５×デンハルト、
５０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中において６８℃
で１８時間にわたって、³²Ｐ放射線ｃＬＶ７ＤＮＡと対
抗させた。ブロットを０.２×ＳＳＰＥ、０.２５％のＳ
ＤＳ中で６８℃において２時間洗浄し、次いで「ＫＯＤ
ＡＫ」Ｘ−ＡＲフィルム上で２枚の増強スクリーンを使
用してオートラジオグラフィ−にかけた。ＲＮＡの大き
さマーカー（ＢＲＬインコーポレーテッド、米国マリイ
ランド州ガイサースバーグ）をアガロースゲルの隣接ウ
ェル中で同時に電気泳動し、そして０.０４％のメチレ
ンブルーで着色することによって可視化した。

【０１１７】結果 Ｌｏｖｏ ｃＤＮＡ分子から独立に誘導し、ラムダ ｇｔ
ｌ１発現ベクター系中に挿入されかつ抗ＣＥＡ免疫反応
性についてポリペプチドしてスクリーニングしたほぼ１
００万のうちで、２つの陽性のクローンを分離した。イ
ンサートをブルースクライブ（＋）プラスミドクローニ
グベクターのＥｃｏＲＩ部位中にサブクローニグし、そ
してこれらの１つ、ｐｃＬＶ７と表示する、をさらに分
析した。ｐｃＬＶ７を含有する Escherichia coli 中の
プラスミド、ＡＴＣＣ Ｎｏ．６７１６９は、１９８６
年７月３０日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（American Type Culture Collection）（「Ａ
ＴＣＣ」）に受託された。ＤＮＡ配列の分析により、こ
のクローンのインサートの大きさは８５９ｂｐであり、
そしてその配列は図１に示されている。上の線はｐｃＬ
Ｖ７のオープンリーデイングフレームのヌクレオチド配
列を表わす。その下は、それをコードするペプチド配列
である。ここにおけるｃＤＮＡクローンを表示するため
に使用する一般用語はｃＬＶ７またはＬＶ７である。こ
の用語に付加するとき、接頭文字ラムダ−またはｐ−
は、このクローンが、それぞれ、ラムダファージまたは
プラスミドの中に挿入されたことを意味する。

【０１１８】実施例９〜１３ ＣＥＡ−Ｂをコードする１ＬＶ７ ｃＤＮＡ７の調製 実施例９ ＲＮＡの調製 ＬＶ７ ｃＤＮＡについての実施例１の手順と同一の手
順を、１ＬＶ７ ｃＤＮＡについて従う。

【０１１９】実施例１０ ｍＲＮＡの逆転写 ５０μｇのポリＡ＋ＲＮＡを、逆転写のために、オリゴ
ｄｔ（１２−１８）およびランダムデオキシヘキサマー
でプライミングした。３５０μｌの反応を、９００単位
のＡＭＶ逆トランスクリプターゼ（ライフ・サイエンシ
ズ・インコーポレーテッド、米国フロリダ州、セントペ
テルスバーク）とともに、４２℃で２.５時間インキュ
ベーションした。次いで、ｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッ
ドのＲＮＡ成分を、ＲＮアーゼＨ、E．coli ＤＮＡポリ
メラーゼＩおよび E. coli ＤＮＡリガーゼで、１２℃
および２２℃において各々１.５時間処理することによ
って、ｃＤＮＡ相補性鎖で置換した。分子の末端をＴ４
ＤＮＡポリメラーゼでポリッシングした（polished）。

【０１２０】実施例１１ ｐＬＶ７のクローニグ 引続く消化工程からの新しく合成されたｃＤＮＡに対し
て内部のＥｃｏＲＩ部位を保護するために、合計のｃＤ
ＮＡを８０μモルのＳ−アデノシルメチオニンの存在下
に３７℃において１時間処理した。２〜５ｋｂの大きさ
の範囲のｃＤＮＡセグメントを切除し、ゲルのスライス
から抽出し、そして１００倍モル過剰量の合成ＥｃｏＲ
Ｉリンカー（５’ｐｄＧＧＡＡＴＴＣＣ３’）の存在下
にＴ４ＤＮＡリガーゼとともにインキュベーションし
た。過剰のリンカーをセファデックスＧ−２５（中程
度）のゲル透過クロマトグラフィーにより除去し、そし
てＥｃｏＲＩ接着末端をＥｃｏＲＩ制限酵素の切断によ
って発生させた。ＥｃｏＲＩ末端ｃＤＮＡセグメント
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下に５℃において一夜、
バクテリオファージのベクターのラムダｇｔｌ１のＥｃ
ｏＲＩ切断およびホスファターゼのアームとともにイン
キュベーションした。次いで、結合混合物のアリコート
を生体外パッケージング抽出物（ストラタジーン、米国
カリフォルニア州サンディエゴ）と混合し、そしてファ
ージの粒子を E. coli Ｙ１０８９細胞上で滴定した。

【０１２１】実施例１２ ハイブリダイゼーションによる組換え体のスクリーニン
グ 生体外パッケイジングしたライブラリーからの５万のフ
ァージ（pfu）を、１.４％の寒天、１０ミリモルのＭｇ
ＳＯ₄および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る４枚の１５０ｍｍのＬＢプレートの各々の上に配置し
た。ファージの大きさが直径０.２〜０.５ｍｍとなるま
で、ファージに宿主細胞を溶解させた。次いで、プレー
トを冷却し、そしてＷ．Ｄ．ベントン（Benton）および
Ｒ．Ｗ．デイビス（Davis）、「単一プラークへの正常
部位のハイブリダイゼーションによるラムダＧＴ組換え
体クローンのスクリーニング（Screening Lambda GT Re
combinant Clones by Hybridization to Single Plaque
s In Situ）Ｊ．サイエンス（Science）、１９６、１８
０−１８２、（１９７７）の方法により、ニトロセルロ
ースのフィルターのレプリカを、調製した。フィルター
を２×ＳＳＰＥ、５×デンハルト、０.１％のＳＤＳ、
１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中で予備ハイブ
リダイゼーションし、そしてハイブリダイゼーション
し、ハイブリダイゼーションのため、２ｎｇ／ｍｌの³²
Ｐ標識ｃＬＶ７インサートＤＮＡを使用した。非特異的
ＤＮＡハイブリダイゼーションを０.５×ＳＳＰＥ、０.
２５％のＳＤＳ中のフィルターの洗浄により除去した。
陽性のプラークをオートラジオグラフィーにより検出
し、取り上げ、そして放射線標識プローブを使用して２
回の追加の連続のハイブリダイゼーションについてスク
リーニングした。

【０１２２】実施例１３ ＤＮＡの操作 実施例１２からの陽性のプラークのインサートをバクテ
リアのプラスミドのベクター中に導入し、そしてエンド
ヌクレアーゼＩＩＩ発生二本鎖セグメントをジデオキシ
末端法によって配列決定した。ＤＮＡ配列をプステル
（Pustell）ＤＮＡ配列分析プログラム（ＩＢＩインタ
ナショナル、米国コネチカット州ニューヘブン）を使用
してコンピューターによって分析した。

【０１２３】結果 Ｌｏｖｏ ｃＤＮＡ分子から独立に誘導し、ラムダｇｔ
ｌ１ベクター系中に挿入されかつ放射線標識したＬＶ７
プローブとの反応性についてスクリーニングしたほぼ２
０万のうちで、４０の陽性のクローンを分離した。これ
らのうちの最大（ほぼ３Ｋｂ）を配列決定し、その核酸
および蛋白質の配列を図５〜７に記載する。

【０１２４】Ｐｅ１ＬＶ７を含有する Escherichia col
i 中のプラスミド、ＡＴＣＣ Ｎｏ．６７３１２は、１
９８７年２月６日にアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（American Type Culture Collection）
（「ＡＴＣＣ」）に受託された。

【０１２５】ＤＮＡ配列の分析により、このクローンの
インサートの大きさは２８３９ｂｐであり、そしてその
配列は図５〜７に示されている。上の線はｐ１ＬＶ７の
オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を表
わす。その下は、それをコードするペプチド配列であ
る。ここにおけるｃＤＮＡクローンを表示するために使
用する一般用語はｃ１ＬＶ７または１ＬＶ７である。こ
の用語に付加するとき、接頭文字ラムダーまたはｐ−
は、このクローンが、それぞれ、ラムダファージまたは
プラスミドの中に挿入されたことを意味する。

【０１２６】実施例１４ ＣＥＡ−Ｃの遺伝情報を指定するｃＦＬ−ＣＥＡのクロ
ーニグおよび配列決定 バクテリオファージのベクターのラムダｇｔｌ１中の胎
児肝臓ｃＤＮＡの２×１０⁵の独立のインサートを含有
する組換え体ライブラリー（クロンテク、米国カリフォ
ルニア州パロアルト）を、Ｗ．Ｄ．ベントン（Benton）
およびＲ．Ｗ．デイビス（Davis）、サイエンス（Scien
ce）、１９６、１８０−１８２、（１９７７）に従い放
射線レベルＬＶ７でスクリーニングした。単一の陽性ク
ローンを選択し、そしてＥｃｏＲＩインサートをプラス
ミドのベクターのブルースクリプトＫＳ＋（ストラタジ
ーン、米国カリフォルニア州サンディエゴ）中にサブク
ローニグした。検出クローンを両方向において調製し、
そしてＦ．サンガー（Sanger）、Ｓ．ニックレン（Nick
len）およびＡ．Ｒ．クールソン（Coulson）、プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ（Proc.Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ、７４、
５４６３−５４６７、（１９７７）のジデオキシ停止法
により配列決定した。このクローン、ＦＬ５と表示す
る、は翻訳停止シグナルの欠如によって判断して不完全
であった。Ｆ＋５の３’末端から誘導される単一のコピ
ーのプローブを使用して、前述の商用胎児肝臓ライブラ
リーを再スクリーニングした。５つの陽性のクローンが
得られ、インサートをブルースクリプトＫＳ＋ベクター
中にクローニグし、そして最大のＦＬ４と表示するもの
を配列決定した。これらの２つのｃＤＮＡプラスミド、
ＦＬ５およびＦＬ４は重複し、そして一緒に、ＦＬ−Ｃ
ＥＡとここで表示するポリペプチドの全オープンリーデ
ィングフレームを含有する。ＦＬ−ＣＥＡの翻訳した配
列は、次の通りである：

【０１２７】

【表２０】

【０１２８】

【表２１】

【０１２９】

【表２２】

【０１３０】

【表２３】

【０１３１】

【表２４】

【０１３２】残留配列の目的のため、第１アミノ酸はＧ
ｌｎであり、これは核酸１９０の下に存在する。その
後、アミノ酸には連続番号が付されている。

【０１３３】実施例１５〜１９ ＣＥＡ−ＤをコードするｃＢＴ−２０のクローニグおよ
び配列決定 実施例１５ ＲＮＡの調製 腫瘍メッセンジャーＲＮＡを、Ｊ．ファボラロ（Favola
ro）、Ｅ．トレイスマン（Treisman）およびＲ．ケイメ
ン（Kamen）、メソッズ・イン・エンジモロジー（Metho
ds in Enzymology）、６５、７１８、アカデミック・プ
レス・インコーポレーテッド（１９８０）のプロイテナ
ーゼＫ−フェノール抽出法によって調製し、次いでオリ
ゴｄＴセルロースクロマトグラフィーによってポリＡ＋
ＲＮＡを生成した。ほぼ１００μｇのポリＡ＋ＲＮＡを
得るために、１ｇ（湿潤重量）のＢＴ−２０細胞（ＡＴ
ＣＣ ＨＴＢ １９）を２０ｍｌの氷冷ＲＮＡ溶解緩衝
液（１４０ミリモルのＮａＣｌ、１.５ミリモルのＭｇ
Ｃｌ₂、１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.８、
０.５％のＮＰ−４０、４ミリモルのジチオスレイトー
ルおよび２０単位／ｍｌの胎盤リボヌクレアーゼ阻害
剤）中に再懸濁しかつ溶解した。ナトリウムデオキシコ
レートを０.２％に添加した。細胞質および核は、ホモ
ジネートを１２,０００×ｇにおいて２０分間遠心する
ことによって分離した。細胞質の分画を等体積のＰＫ緩
衝液（０.２モルのトリス−ＨＣｌ、２５ミリモルのＥ
ＤＴＡ、０.３ミリモルのＮａＣｌ、２％のドデシル硫
酸ナトリウムおよび４００μｇ／ｍｌのプロイテナーゼ
Ｋ）と混合し、２時間３７℃でインキュベーションし、
次いで等体積のフェノール／クロロホルム（１：１／
ｖ：ｖ）溶液で１回抽出した。核酸は分離した水相のエ
タノール沈殿により得た。合計のＲＮＡは、ポリＡ＋Ｒ
ＮＡについて、０.５モルのＮａＣｌ、１０ミリモルの
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.８、０.１％のサルコシル中で
オリゴｄＴ（１２−１８）セルロースカラムに通過させ
ることによって濃縮した。洗浄後、結合したＲＮＡを、
塩化ナトリウムの不存在下に同一溶液で溶離した。

【０１３４】実施例１６ ｍＲＮＡの逆転写 １０μｇのポリＡ＋ＢＴ−２０ ＲＮＡを、オリゴｄＴ
（１２−１８）およびｐｄＮ₆で逆転写のためにプライ
ミングした。１００μｌの反応を４時間４２℃において
２００単位のＡＭＶ逆トランスクリプターゼ（ライフ・
サイエンシズ・インコーポレーテッド、米国フロリダ
州、セントペテルスバーグ）を使用して実施した。ｃＤ
ＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ成分を、１２℃お
よび２２℃において各々１.５時間ＲＮアーゼ、E．coli
ＤＮＡポリメラーゼＩおよび E．coli ＤＮＡリガー
ゼで処理することによって、第２相補性鎖で置換した。
分子の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼの処理によって平
滑にした。ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出
し、エタノール沈殿し、そして１０ミリモルのトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ７.８、１ミリモルのＥＤＴＡ（ＴＥ）中
で調製した「セファデックス Ｇ−２０」スパン（spn
u）カラムで精製した。

【０１３５】実施例１７ ｃＢＴ２０のクローニグ 合成ＤＮＡリンカー ５′ｐＣＣＣＧＧＧ ３′ ３′ＧＧＧＣＣＣＴＴＡＡ５′ を、ｃＤＮＡの末端に、過剰のＴ４ＤＮＡリガーゼとの
平滑末端結合によって取付けた。過剰のリンカーをＴＥ
中において「セファデックス Ｇ−５０」（中程度）の
クロマトグラフィーおよび０.８％の低融点のアガロー
スゲルの分画によって除去した。ＢＴ−２０細胞系のポ
リＡ＋ＲＮＡのノザンブロットに基づいて、ＣＥＡ関連
ｍＲＮＡの大きさは３.０ｋｂと推定された。したがっ
て、２〜４ｋｂの間のｃＤＮＡ断片を、ゲルのスライス
から回収し、そしてエタノール沈殿した。ＴＥ中のｃＤ
ＮＡの再懸濁後、ＥｃｏＲＩ切断ラムダｇｔ１０アーム
を１：１の推定モル比においてｃＤＮＡへ付加した。結
合をＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下に７℃において２日間
進行させた。標識反応のアリコートを商業的に得られる
パッケージング混合物（ストラタジーン、米国カリフォ
ルニア州サンディエゴ）にラムダ粒子の調製のために添
加した。生体外のパッケージングおよび E．coli 宿主
ＮＭ５１４の感染後、５００万のファージ粒子が得られ
た。

【０１３６】実施例１８ 組換え体のライブラリーのスクリーニング ５０万のパッーケージングされたラムダ粒子を E．coli
ＮＭ５１４の菌叢上に配置し、複製のパターンを、
Ｗ．Ｄ．ベントン（Benton）およびＲ．Ｗ．デイビス
（Davis）、サイエンス（Science）、１９６、１８０−
１８２、（１９７７）に記載されているようにニトロセ
ルロースのシート上に持上げた。種々のＣＥＡ族の構成
員の間の反復領域を含有する。

【０１３７】³²Ｐ標識ＬＶ７ ｃＤＮＡインサートのプ
ローブとのハイブリダイゼーションにより、陽性のファ
ージを選択した。この選択法によって、多数回の連続的
スクリーニング後に、１２の陽性のファージが得られ
た。個々のプラークからのファージを増幅し、力価決定
し、そしてこれらを使用して少量の組換え体ファージＤ
ＮＡを調製した。

【０１３８】実施例１９ ＤＮＡの操作 Ｔ．マニアチス（Maniatis）、Ｅ．Ｆ．フリトシ（Frit
sch）およびＪ．サムブルック（Sambrook）、モレキュ
ラー・クローニグ、ラボラトリー・マニュアル（Molecu
lar Cloning，A Laboratory Mannual）、コールド・ス
プリング・ハーバー、（１９８２）に従い、ファージＤ
ＮＡを調製した。ＤＮＡのセグメントを低融点のアガロ
ースゲルから分離し、そしてブルースクリプト（Bluesc
ript）プラスミドベクター（ストラトジーン、米国カリ
フォルニア州サンディエゴ）中のサブクローニグのため
に挿入した。ＤＮＡの配列決定は、Ｆ．サンガー（Sang
er）、Ｓ．ニックレン（Nicklen）およびＡ．Ｒ．クー
ルソン（Coulson）、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc．Nat
l．Acad．Sci.）ＵＳＡ、７４、５４６３−５４６７、
（１９７７）のジデオキシ停止法によって実施した。Ｂ
Ｔ２０についての翻訳された配列は次の通りである：

【０１３９】

【表２５】

【０１４０】

【表２６】

【０１４１】

【表２７】

【０１４２】注：位置１３８０−１２８１における［ｎ
ｎ］および位置１５８９−１５９１における［ｎｎｎ］
は、ｃＢＴ−２０の、まだ、配列決定されない３′−翻
訳領域を表わす。

【０１４３】残留配列の目的のため、第１アミノ酸は第
４列のＬｙｓであり、左から１１アミノ酸である。その
後、アミノ酸には連続番号が付されている。

【０１４４】この明細書および特許請求の範囲は例示を
目的とし、限定を意味するものではなく、そして種々の
変更および変化は本発明の精神および範囲を逸脱しない
で可能であることは、理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるｃＤＮＡ配列のアミノ酸および核
酸配列（８５９塩基）である。

【図２】抗原（「Ａｇ」）の存在下または不存在下にお
ける、本発明によるＣＥＡ融合蛋白質の酵素イムノアッ
セイを描写するグラフである。

【図３】本発明によるＣＥＡ融合蛋白質の免疫ブロット
を示す写真である。

【図４】本発明によるポリＡ＋ＲＮＡの検出のためのオ
ートラジオグラフの写真である。

【図５】本発明によるｃＤＮＡ配列のアミノ酸および核
酸配列（２８３９塩基）の一部である。

【図６】本発明によるｃＤＮＡ配列のアミノ酸および核
酸配列（２８３９塩基）の図５からのつづきである。図
５〜７において、残基配列の目的のための第１アミノ酸
は右から第２列第３アミノ酸中のＬｙｓである。

【図７】本発明によるｃＤＮＡ配列のアミノ酸および核
酸配列（２８３９塩基）の図６からのつづきである。図
５〜７において、残基配列の目的のための第１アミノ酸
は右から第２列第３アミノ酸中のＬｙｓである。その
後、残りのアミノ酸は連続番号が付されている。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ // Ａ６１Ｋ 39/00 39/395 ＡＤＵ 39/395 ＡＤＵ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 マイケル・イー・カマーク アメリカ合衆国コネチカツト州06437ギル フオード・ウオーウイネトトレイル46

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の塩基配列： 【表１】 を有する単離された核酸又は緊縮条件下に該塩基配列に
   ハイブリダイズする単離された核酸によってコードされ
   た連続状のアミノ酸配列に対応する少なくとも５個のア
   ミノ酸からなるペプチド。
2. 【請求項２】 単離された核酸が（ａ） 【表２】 【表３】 【表４】 【表５】 【表６】 （ｂ） 【表７】 【表８】 【表９】 【表１０】 【表１１】 及び（ｃ） 【表１２】 【表１３】 【表１４】 よりなる群から選ばれる塩基配列を有する請求項１記載
   のペプチド。
3. 【請求項３】 請求項２の（ａ）に記載の配列から誘導
   されるアミノ酸配列を有し、かつ （ｉ） アミノ酸残基１３５〜３８６、 （ii） アミノ酸残基１７４〜２２０、 （iii) アミノ酸残基２８５〜３８６、 （iv） アミノ酸残基１７４〜２００、 （ｖ） アミノ酸残基２０８〜２１６、 （vi） アミノ酸残基２８５〜２９０、 （vii) アミノ酸残基２９２〜３０８、 （viii) アミノ酸残基３１２〜３２１、 （ix） アミノ酸残基３６０〜３７２、及び （ｘ） アミノ酸残基３８０〜３８６、よりなる群から
   選ばれるペプチド；請求項２の（ｂ）に記載の配列から
   誘導されるアミノ酸配列を有し、かつ （ｉ） アミノ酸残基１３５〜３８６、 （ii） アミノ酸残基４１１〜４９２、 （iii) アミノ酸残基１７４〜２２０、 （iv） アミノ酸残基１７４〜２００、 （ｖ） アミノ酸残基２８５〜３８９、 （vi） アミノ酸残基２０８〜２２２、 （vii) アミノ酸残基２８５〜２９２、 （viii) アミノ酸残基２９５〜３１１、 （ix） アミノ酸残基３１５〜３２８、 （ｘ） アミノ酸残基３３１〜３４５、 （xi） アミノ酸残基３４８〜３６０、 （xii) アミノ酸残基３６３〜３７７、及び （xiii) アミノ酸残基３８３〜３９０、よりなる群から
   選ばれるペプチド；請求項２の（ｄ）に記載の配列から
   誘導されるアミノ酸配列を有し、かつ （ｉ） アミノ酸残基１３５〜２８５、 （ii） アミノ酸残基１６８〜２２０、 （iii) アミノ酸残基１６８〜１９６、 （iv） アミノ酸残基２１０〜２２０、及び （ｖ） アミノ酸残基２６４〜３８３、よりなる群から
   選ばれるペプチドである請求項２記載のペプチド。