JP3253609B2 - 癌胎児性抗原をコードするｃＤＮＡ - Google Patents
癌胎児性抗原をコードするｃＤＮＡInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、癌胎児性抗原のペプチド配列をコードする
核酸配列に関する。 癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen）（「CE
A」）は、最初にゴールド（Gold）およびフリードマン
（Freedman），ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル
・メディシン（J.Exp.Med.）,121,439−462（1965）に
記載された。CEAは、50〜60重量％の炭水化物をもつ分
子量ほぼ200,000の糖蛋白質として特徴づけられる。CEA
は正常のヒト胎児の発育間に存在するが、正常の大人の
腸管中の濃度は非常に低い。それはある数の異なる腫瘍
によって生成されかつ分泌される。 CEAは結腸直腸の癌患者の監視のための、臨床的に有
用な腫瘍マーカーである。CEAは感受性のイムノアッセ
イ法を用いて測定できる。CEAの手術前の血清レベルが
高くなったとき、血清CEAの手術後の正常範囲への低下
は、典型的には、腫瘍の切除に成功したことを示す。正
常に戻らない手術後のCEAレベルは、しばしば、腫瘍の
切除が不完全であること、あるいは患者中に追加の腫瘍
部位が存在することを示す。正常レベルへ戻った後、血
清CEAレベルの引続く急速な上昇は通常準段階（metasta
ge）の存在を示す。通常レベルからのより遅い手術後の
上昇は、最も頻繁に、前に検出されない新しい一次腫瘍
の存在を示すと解釈される。こうして、結腸の患者の手
術後の管理はCEAの測定によって促進される。 CEAは抗原族の１員である。このために、現在利用可
能な方法によるCEAのイムノアッセイは、CEAがいくつか
の潜在的な反応性の抗原の１つだけであるという事実に
よって複雑である。少なくとも16のCEA様抗体が文献が
記載されてきた。これらのいくつかは異なる研究者らに
よって記載された同一の抗体と思われるので、異なる抗
原の実際の数は多少この数よりも少ない。それにもかか
わらず、腫瘍が放出するCEAのイムノアッセイを潜在的
に妨害しうる交差反応性抗原の複雑な列が存在する。CE
A様抗原の血清レベルは、多くの腫瘍以外の状態、例え
ば、炎症性肝臓の病気およびまた喫煙者において増大す
ることが知られている。癌患者の状態の監視のために使
用するイムノアッセイは、これらの他のCEA様抗原によ
って妨害されないことが重要である。逆に、異なる型の
腫瘍が異なる型のCEAを優先的に発現する可能性がある
ので、抗原類をイムノアッセイによって区別できること
が重要である。そうである場合、異なる型のCEAを信頼
性をもって測定できることは、異なる型の癌を診断し、
あるいはより首尾よく処置する手段を提供する。 「放射性ヨウ素を使用する癌胎児性抗原および診断
法」と題する米国特許第3,663,684号は、RIAにおいて使
用するためのCEAの精製および放射性ヨウ素化に関す
る。 米国特許第3,697,638号は、CEAが抗原類（この場合成
分ＡおよびＢ）の混合物であることを記載している。米
国特許第3,697,638号は、各成分を分離しかつ放射性ヨ
ウ素化する方法および特定のRIAにおけるそれらの使用
を述べている。 「癌胎児性抗原の決定における血漿抽出物のための代
替物として、ラジオイムノアッセイにおいて使用する組
成物」と題する米国特許第3,852,415号は、CEAのRIAの
ための希釈剤の代替物として、EDTAおよびウシ血清アル
ブミンを含有する緩衝液の使用に関する。 「癌胎児性抗原」と題する米国特許第3,867,363号
は、CEAの成分ＡおよびＢの分離、それらの標識つけお
よびRIAにおける使用に関する。 「放射線標識した抗体による腫瘍の局在化」と題する
米国特許第3,927,193号は、全身の腫瘍の映像化におけ
る放射線標識抗CEAの使用に関する。 「癌胎児性抗原」と題する米国特許第3,956,258号
は、CEAの成分ＡおよびＢの分離に関する。 「癌胎児性抗原」と題する米国特許第4,086,217号
は、CEAの成分ＡおよびＢの分離に関する。 「診断法および試薬」と題する米国特許第4,140,753
号は、CEA−S1と呼ばれるCEA異性体の精製およびRIAに
おけるその使用に関する。 「癌胎児性抗原の異性体」と題する米国特許第4,145,
336号は、抗原CEA−S1に関する。 「癌胎児性抗原」と題する米国特許第4,180,499号
は、CEAの成分Ａの生成法を記載している。 「癌胎児性抗原を生成する方法」と題する米国特許第
4,228,236号は、確立された細胞系LS−174TおよびLS−1
80またはそのクローンまたは誘導体をCEAの生成におい
て使用することに関する。 「癌胎児性抗原のアッセイのための抗体吸着支持体
法」と題する米国特許第4,272,504号は、CEAのラジオイ
ムノアッセイのための２つの概念に関する。第１に、米
国特許第4,272,504号は、試料をpH5において65〜85℃に
加熱して予備処理して、異質蛋白質を沈殿しかつ排除す
ることに関する。第２に、それは分析物および放射線標
識CEAトレーサーを捕捉する手段として、固体の抗体
（ビーズまたは管上）を使用することを記載している。 「癌胎児性抗原の決定」と題する米国特許第4,299,81
5号は、CEA試料を水で希釈し、そして蛋白質の沈殿が起
こる温度より低い温度に加熱することによって予備処理
することに関する。次いで、予備処理した試料を、RI
A、EIA、FIAまたは化学ルミネセンスイムノアッセイを
使用してイムノアッセイする。 「高分子量の癌胎児性抗原に対して特異的なモノクロ
ーナルハイブリドーマの抗体」と題する米国特許第4,34
9,528号は、180kDのCEAと反応性であるが、他の分子量
の形態と反応性ではないモノクローナル抗体に関する。 「癌胎児性抗原のための酵素−イムノアッセイ」と題
する米国特許第4,467,031号は、２つの高CEAモノクロー
ナル抗体の第１が固相に取付けられており、そして第２
のモノクローナル抗体がペルオキシドと接合している、
CEAのためのサンドイッチ酵素イムノアッセイに関す
る。 「癌の検出のための方法および組成物」と題する米国
特許第4,489,167号は、CEAがヒト血清の正常な成分であ
るα−酸性糖蛋白質（AG）と抗原決定基を共有すること
を記載している。そこに記載されている方法は、１つの
抗体として、AGを認識する抗体および、CEAを認識する
が、AGを認識しない他の抗体を使用する、固相サンドイ
ッチ酵素イムノアッセイに関する。 「癌胎児性抗原（CEA）のためのイムノアッセイ」と
題する米国特許第4,578,349号は、CEAのイムノアッセイ
において希釈剤として高い塩を含有する緩衝液を使用す
ることに関する。 「癌胎児性抗原のための血液試料のアッセイ−シリカ
ゲルとのインキュベーションによる妨害物質の除去後」
と題する欧州特許（EP）113072−Ａ号は、シリカゲルで
予備処理することによって血漿試料の血清から妨害物質
を除去することに関する。次いで、予備清浄化試料をイ
ムノアッセイにかける。 「癌診断癌胎児性抗原−電気泳動なしに過塩素酸抽出
物から生成された」と題する欧州特許（EP）92223−Ａ
号は、血清または血漿中ではなく、腫瘍組織自体の細胞
質ゾル分画中におけるCEAのイムノアッセイに関する。 「癌、とくに乳癌における予測試験として細胞質ゾル
−CEA−測定」と題する欧州特許（EP）83103759.6号
は、欧州特許（EP）92223−Ａ号に類似する。 「癌胎児性抗原に対して特異的なモノクローナル抗体
類」と題する欧州特許（EP）83303759号は、「CEA特異
的」モノクローナル抗体類およびイムノアッセイにおけ
るそれらの使用に関する。 「特異的CEA−族抗原類、それらに対して特異的な抗
体類およびそれらの使用法」と題するWO84/02983号は、
CEA−メコニウム（MA）−およびNCA−特異的エピトープ
に対するモノクローナル抗体類を、試料中のこれらの個
々の成分の各々を選択的に測定するように案出されたイ
ムノアッセイにおいて使用することに関する。 従来のCEAのアッセイのすべては、選択した無傷の抗
原で動物を免疫化することによって発生したモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを利用し
ている。それらのいずれも、種々の抗原の独特の一次配
列を検出するために、配列特異的抗体をつくるという考
えを述べていない。それらは、合成ペプチドまたは天然
の産物の断片に対して抗体を生成するために一次アミノ
酸配列を使用することを包含していない。それらは、CE
Aの族の構成員を区別するために一次アミノ酸配列を使
用するという概念を含まない。それらのいずれも、一次
配列の決定に使用する遺伝子を分離するために、DNAま
たはRNAのクローンを使用することを包含していない。 定義 例えば、第１図および第５図に出現するような核酸の略
号 Ａ アデニン Ｇ グアニン Ｃ シトシン Ｔ チミジン Ｕ ウラシル 例えば、第１図および第５図に出現するようなアミノ酸
の略号 Asp アスパラギン酸 Asn アスパラギン Thr スレオニン Ser セリン Glu グルタミン酸 Gln グルタミン Pro プロリン Gly グリシン Ala アラニン Cys システイン Val バリン Met メチオニン Ile イソロイシン Leu ロイシン Tyr チロシン Phe フェニルアラニン Trp トリプトファン Lys リジン His ヒスチジン Arg アルギニン ヌクレオチド−糖部分（ペントース）、ホスフェー
ト、および窒素の複素環塩基を含有するDNAまたはRNAの
モノマーの単位。塩基は糖部分にグリコシドの炭素（ペ
ントースの1'炭素）を介して結合しており、そして塩基
と糖との組合せはヌクレオシドと呼ばれる。塩基はヌク
レオチドを特徴づける。４つのDNA塩基はアデニン
（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）
およびチミジン（「Ｔ」）である。４つのRNA塩基は
Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。 DNA配列−隣接ペントース類の3'および5'炭素の間の
ホスホジエステル結合によって互いに結合するヌクレオ
チドの直線の列。 機能的同等体−DNA配列において、あるヌクレオチド
が発現生成物の配列を妨害しないで置換されうること
は、この分野においてよく知られている。ペプチドに関
すると、この用語は、特定の使用において機能をもたな
い１または２以上のアミノ酸が欠失されるか、あるいは
他のものと置換されうることを意味する。 コドン−mRNAを通してアミノ酸、翻訳開始シグナルま
たは翻訳停止シグナルをコードする（encode）３つのヌ
クレオチド（トリプレット）のDNA配列。例えば、ヌク
レオチドのトリプレットTTA、TTG、CTT、CTC、CTAおよ
びCTGはアミノ酸のロイシン（「Leu」）についてコード
し、そしてTGAは翻訳停止シグナルであり、そしてATGは
翻訳開始シグナルである。 リーディングフレーム−アミノ酸配列へのmRNAの翻訳
の間のコドンのグループ。翻訳の間、適切なリーディン
グフレームが維持されなくてはならない。例えば、配列
GCTGGTTGTAAGは３つのリーディングフレームまたは相に
おいて翻訳されることができ、それらの各々は異なるア
ミノ酸配列 を与える。 ポリペプチド−隣接アミノ酸類のα−アミノ基とカル
ボキシ基との間のペプチド結合によって互い結合したア
ミノ酸の直線の列。 ゲノム−細胞またはウイルスの全DNA。それは、なか
でも、細胞またはウイルスのポリペプチドをコードする
構造遺伝子、ならびにそのオペレーター、プロモーター
およびリボソーム結合および相互作用配列、例えば、SD
配列（Shine−Dalgarno配列）のような配列、を包含す
る。 構造遺伝子−その鋳型またはメッセンジャーRNA（「m
RNA」）を通して特定のポリペプチドの特徴あるアミノ
酸の配列をコードするDNA配列。 転写−構造遺伝子からmRNAを生成するプロセス。 翻訳−mRNAからポリペプチドを生成するプロセス。 発現−ポリペプチドを生成するために構造遺伝子によ
ってなされるプロセス。それは転写と翻訳との組み合わ
せである。 プラスミド−プラスミドが宿主細胞中で複製されるよ
うに、無傷の「レプリコン」からなる非染色体二本鎖DN
A配列。プラスミドが単細胞の有機体内に配置される
と、その有機体の特性はプラスミドのDNAの結果として
変化または形質転換されうる。例えば、テトラサイクリ
ン耐性（TetR）のための遺伝子を有するプラスミドは、
テトラサイクリンに対して以前感受性であった細胞をそ
れに対して抵抗性の細胞に形質転換する。プラスミドに
よって形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。 ファージまたはバクテリオファージ−バクテリアのウ
イルス、それらの多くの蛋白質のエンベロープまたはコ
ート）（「カプシド蛋白質」）中に包膜されたDNA配列
から成る。 クローニングビヒクル（cloning vehicle）−宿主細
胞中で複製することができるプラスミド、ファージDNA
または他のDNA配列、これはDNAの本質的生物学的機能、
例えば、複製、コート蛋白質の生成を付随して損失しな
いで、あるいはプロモーターまたは結合部位を損失しな
いで、決定可能な方法でこのようなDNA配列を切断でき
る、エンドヌクレアーゼ認識部位の１つまたは小さい数
によって特徴づけられ、そして形質転換した細胞の同定
において使用するために適するマーカー、例えば、テト
ラサイクリン耐性またはアンピシリン体制を含有する。
クローニングビヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。 クローニング−無性生殖によって１つのこのような有
機体または配列から誘導された有機体またはDNA配列の
集団を得るプロセス。 組換え体DNA分子またはハイブリッドDNA−生きている
細胞の外部で端対端で接合し、そしてある宿主細胞を感
染することができかつその中で維持されうる異なるゲノ
ムからのDNAのセグメントから成る分子。 発現制御配列−構造遺伝子へ操作的に結合されたと
き、構造遺伝子の発現を制御しかつ調節するヌクレオチ
ドの配列。それらは、lac系、Trp系、ファージλの主要
なオペレーターおよびプロモーターの領域、fdコート蛋
白質の制御領域およびそれらのウイルスの原核または真
核細胞の遺伝子の発現を制御することが知られている他
の配列を包含する。 形質転換／トランスフェクション−DNAまたはRNAを細
胞中に導入して遺伝子を発現させることができる。ここ
において使用する「感染した（infected）」は、ウイル
スのベクターによつてRNAまたはDNAが宿主中に導入され
ることに関する。ここで使用する「注入された（inject
ed）」は、細胞中へのDNAのマイクロインジェクション
（細い注射器の使用）に関する。 以後述べるCEA−Ａ、CEA−Ｂ、CEA−Ｃ、CEA−Ｄは、
下の実施例において記載するCEA族の構成員である。 本発明は、新規な核酸配列、例えば、DNAまたはRNA配
列に関し、この核酸配列はCEA配列またはそれとハイブ
リダイゼーション可能な塩基配列（RNAまたはDNA）を有
する核酸をコードする塩基配列からなる。このような核
酸は、完全なCEA遺伝子またはその一部、例えば、イン
トロン配列、ならびにエクソン配列からなるゲノムDNA
であることができるか、あるいはCEA蛋白質をコードす
るメッセンジャーRNAに対して相補的であるように構成
されたDNA、すなわち、cDNAであることができる。本発
明の核酸は、下に記載するDNA配列またはその断片、な
らびにそれとハイブリダイゼーション可能な配列からな
る： 配列は位置１から端（位置862）を表示する。配列は位
置１から番号を付してある。 完全なCEA蛋白質をコードしかつ前述の配列からなる
本発明の核酸は、合計約5000以下、より通常約3600の塩
基を有するであろう。上の配列のcDNAの断片は、少なく
とも10、ある場合において少なくとも50の塩基を有する
であろう。 859塩基の上のDNA配列は、発現されうるCEAの免疫反
応性断片、例えば、ラムダgtl １をコードする。この
配列は、長さがほぼ300塩基である内部の反復を有し、
そして長さが285アミノ酸の理論的蛋白質をコードす
る。このcDNAは他のヒト遺伝子中に見出される配列をコ
ードし、そして遺伝子のこの全族はCEA族の蛋白質をコ
ードすることができる。 本発明は、また、下に記載する塩基配列またはその断
片、ならびにそれとハイブリダイゼーション可能な配列
からなる、2839塩基対を有するDNA配列に関する； 同様にCEA族の構成員である蛋白質をコードするそれ
以上の配列は、以後に実施例中に示されている。 本発明は、また、核酸、例えば、DNAからなるインサ
ートを有する複製可能な組換えクローニングビヒクル
（「ベクター」）に関し、この核酸はCEAペプチドをコ
ードする塩基配列またはそれとハイブリダイゼーション
可能な塩基配列からなる。 本発明は、また、複製可能な組換えクローニングビヒ
クルまたは前述のcDNAとハイブリダイゼーション可能な
核酸で形質転換／トランスフェクション、感染または注
入した細胞に関する。こうして、本発明は、また、クロ
ーニングビヒクルを使用しないで、遊離の核酸を使用す
る細胞のトランスフェクションに関する。 なおさらに、本発明は、前述のトランスフェクショ
ン、感染または注入した細胞によって発現されたポリペ
プチドに関し、前記ポリペプチドはCEA、ならびに前記
ポリペプチドの標識された形態と免疫学的交差反応性を
示す。本発明は、また、前述の複製可能な組換えクロー
ニングビヒクルでトランスフェクション、感染または注
入した細胞の発現生成物のアミノ酸配列、すなわち、合
成ペプチドを有するポリペプチド、ならびに標識された
形態のポリペプチドに関する。換言すると、本発明は、
前述の発現生成物の全アミノ酸配列またはその５以上の
アミノ酸を有するその一部に相当するアミノ酸配列を有
する合成ペプチドに関する。 本発明は、さらに、前述のポリペプチドに対して特異
的な抗体調製物に関する。 本発明の他の面は、工程 （ａ）試験試料を前述の抗体調製物と接触させ、そして （ｂ）試料中のCEAへ結合する前記抗体調製物を決定す
る、 を含んでなる試験試料中のCEAまたは機能的同等体を検
出するイムノアッセイ法に関する。 本発明は、また、工程 （ａ）試験試料を核酸プローブと接触させ、前記プロー
ブは、CEAペプチド配列またはそれとハイブリダイゼー
ション可能な塩基配列をコードする塩基配列からなる核
酸からなり、そして （ｂ）得られたハイブリダイゼーションしたプローブの
形成を決定する、 を含んでなる試験試料中のCEAまたは関連する核酸（DNA
またはRNA）を検出する核酸ハイブリダイゼーション法
に関する。 本発明は、また、工程 ａ）動物またはヒトの患者に、本発明による標識された
（例えば、Ｘ線、放射線標識、あるいはＮΜＲで検出可
能な常磁性物質で標識した）抗体調製物を導入し、そし
て ｂ）患者におけるこのような抗体調製の存在を標識の検
出により検出する、 を含んでなる生体内で患者における癌胎児性抗原または
その機能的同等体の存在を検出する方法に関する。 他の面において、本発明は、本発明による抗体調製物
を治療的目的に使用すること、すなわち、抗体調製物を
放射線核種または毒素に取付けて複合体を形成し、そし
てこのような複合体の有効量を動物またはヒトの患者
に、例えば、注射により、導入すること、に関する。標
識した複合体は患者中のCEAに結合し、そして放射線核
種または毒素はCEAを発現する細胞を破壊する役目をす
るであろう。 いくつかのCEAエピトープは独特である。これらは、
種々のCEA様抗原を免疫学的に区別するために有用であ
ったエピトープである。ペプチドのエピトープは、抗原
の直線のアミノ酸配列および／または蛋白質のフォルデ
ィング（folding）から生ずる面によって定義される。
蛋白質のフォルディングに要求される情報は、一次アミ
ノ酸配列中にコードされる。したがって、抗原の差は、
究極的には、異なるCEA分子の一次構造における差から
生ずる。こうして、CEA種におけるCEA蛋白質中に存在す
る差は、一次アミノ酸配列の決定によって決定すること
ができる。これはCEAの遺伝子の各々をクローニングし
かつ配列決定することによって最も容易に達成される。
癌の診断にどの遺伝子生成物が最も有用であるかを決定
するために、独特プローブを各遺伝子のために選択する
ことができ、そして各遺伝子の発現を異なる腫瘍の型に
おいて核酸ハイブリダイゼーション技術によって決定す
ることができる。本発明は、CEA族の異なる構成員をコ
ードする潜在的遺伝子を同定し、そしてそれらのための
理論的一次アミノ酸配列を決定するために道具を提供す
る。自動化されたペプチド合成法を使用すると、これら
の抗原における独特配列の対応するペプチドを合成でき
る。これらのペプチドを使用して、これらの配列に対す
る抗体を生成することができ、これらの抗体は、無傷の
CEA分子において、免疫化された動物によって認識され
ることができない。これが達成されると、各抗原を測定
するための特異的なイムノアッセイを実施するために、
これらの抗原の差を利用することができる。 広範な種類の宿主／クローニングビヒクルの組み合わ
せを、本発明に従い調製された二本鎖核酸のクローニン
グに使用できる。例えば、有用なクローニングビヒクル
は、次のものから成ることができる：染色体、非染色体
および合成のDNA配列のセグメント、例えば、SV40の種
々の既知の誘導体および既知のバクテリアのプラスミ
ド、例えば、E.coliからのプラスミド、例えば、col E
1、pCR1、pBR322、pMB89およびそれらの誘導体、より広
い宿主範囲のプラスミド、例えば、RP4、およびファー
ジのDNA、例えば、ファージの多数の誘導体、例えば、N
M989、および他のDNAファージ、例えば、M13およびフィ
ラメンテアス（Filamenteous）一本鎖DNAファージおよ
びプラスミドとファージのDNAとの組み合わせから誘導
されるベクター、例えば、ファージDNAを使用するよう
に修飾されたプラスミドまたは他の発現制御配列または
酵母菌プラスミド、例えば、２μプラスミドまたはその
誘導体。有用な宿主は、次のものを包含することができ
る：バクテリアの宿主、例えば、E.coli、例えば、E.co
li HB 101、E.coli X1776、E.coli X2282、E.coli
MRC1およびシュードモナス（Pseudomonas）、バシル
ス スブチルス（Bacillus subtillus）、バシルス
ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophil
us）および他のE.coli、バシルス、酵母菌および他の菌
・カビ類、動物または植物の雑種、例えば、培養におけ
る動物（ヒトを含む）または植物の細胞または他の宿
主。もちろん、すべての宿主／ベクターの組み合わせが
同等に有効であるというわけではない。宿主／ベクター
の組み合わせの特定の選択は、本発明の範囲を逸脱しな
いで、記載する原理を正当に考慮した後、この当業者に
よってなされることができる。 さらに、各特定のクローニングビヒクルの範囲内で、
本発明による核酸の挿入のために種々の部位を選択する
ことができる。これらの部位は、通常、それらを切断す
る制限エンドヌクレアーゼによって表示される。例え
ば、pBR322において、Pst1部位はベーターラクタマーゼ
のための遺伝子中に、その蛋白質のアミノ酸181および1
82をコードするヌクレオチドのトリプレットの間に位置
する。pBR322において、２つのHind IIエンドヌクレア
ーゼ認識部位の１つはアミノ酸101および102をコードす
るトリプレットの間に存在し、そしていくつかのTag部
位の１つはベーターラクタマーゼのアミノ酸45をコード
するトリプレットに存在する。同様な方法において、こ
のプラスミドにおけるEcoR I部位およびPVU II部位は解
読領域の外側に存在し、そしてEcoR I部位は、それぞ
れ、テトラサイクリンおよびアンピシリンに対する耐性
をコードする遺伝子の間に位置する。これらの部位はこ
の分野においてよく認識されている。もちろん、本発明
において有用なクローニングビヒクルは、選択したDNA
断片の挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位を有す
る必要はないことを理解すべきである。その代わり、ビ
ヒクルを切断し、そして別の手段により断片に接合する
ことができる。 組換え核酸分子を形成するために選択した核酸断片を
取付けるための、ここにおいて選択したベクターまたは
クローニングビヒクル、とくに部位は、種々の因子によ
って決定され、それらの因子の例は、特定の制限酵素に
対して感受性の部位の数、発現すべき蛋白質の大きさ、
宿主細胞の酵素による蛋白質分解的減成に対する所望蛋
白質の感受性、精製の間の除去が困難な宿主細胞蛋白質
により発現される蛋白質の汚染、発現の特性、例えば、
ベクター配列に関する開始コドンおよび停止コドンの位
置、およびこの分野において認識されている他の因子で
ある。特定の遺伝子のためのベクターの挿入部位の選択
は、これらの因子のバランスによって決定され、すべて
の区画（section）が所定の場合に同等に有効であると
いうわけではない。 核酸配列をクローニングビヒクル中に挿入して組換え
核酸分子を形成する方法は、例えば、dA−dTテイリング
（tailing）、直接結合、合成リンカー、エキソヌクレ
アーゼおよびポリメラーゼ連結修復反応および引続く結
合、あるいは適当なポリメラーゼおよび適当な一本鎖鋳
型を使用する核酸の伸張および引続く結合を包含する。 また、クローニングビヒクルの選択した部位に挿入さ
れた核酸配列または核酸断片は、所望ポリペプチドまた
は成熟蛋白質のための実際の構造遺伝子の一部ではない
ヌクレオチドを含むことができるか、あるいは所望ポリ
ペプチドまたは成熟蛋白質のための完全な構造遺伝子の
断片のみを含むことができる。 異質遺伝子を含有するクローニングビヒクルまたはベ
クターを使用して適当な宿主を形質転換して、その宿主
がその異質遺伝子を複製できるようにしかつこの異質遺
伝子またはこの一部によって解読された蛋白質を発現す
ることができる。適当な宿主の選択は、また、ある数の
この分野で認識されている因子によって制御される。こ
れらは、例えば、選択したベクターとの適合性、ハイブ
リッドプラスミドによってコードされた蛋白質の毒性、
所望蛋白質の回収の容易さ、発現特性、生物安全性およ
びコストを包含する。特定の組換えDNA分子の発現のた
めにすべての宿主が同等に有効でないであろうことを理
解して、これらの因子はバランスされなくてはならな
い。 蛋白質の生成レベルは、２つの主要な因子によって支
配される：細胞内のその遺伝子のコピーの数およびそれ
らの遺伝子のコピーが転写および翻訳される効率。次
に、転写および翻訳（それらは一緒になって発現を構成
する）の効率は、通常所望解読配列より前に位置する、
ヌクレオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド配
列または発現制御配列は、なかでも、RNAポリメラーゼ
が相互作用して転写を開始し（プロモーター配列）およ
びリボソームがmRNA（転写の生成物）と結合しかつ相互
作用して翻訳を開始する位置を定める。このような発現
制御配列のすべてが同等の効率で機能するわけではな
い。こうして、所望蛋白質のための特異的解読配列をそ
れらの隣接ヌクレオチド配列から分離し、そしてそれら
を他の既知の発現制御配列の代わりに融合して発現のレ
ベルをより高くすることは有利である。これが達成され
ると、新しく操作された核酸、例えば、DNA、の断片
は、マルチコピーのプラスミドまたはバクテリオファー
ジの誘導体の中に挿入して、細胞内の遺伝子のコピーの
数を増加し、これによって発現された蛋白質の収率を改
良することができる。 いくつかの発現制御配列を前述のようにして使用でき
る。これらは、次のものを包含する:E.coliのラクトー
スオペロン（「lac配列」）のオペレーター、プロモー
ターおよびリボソームの結合および相互作用の配列（例
えば、SD配列のような配列を包含する）、E.coliのトリ
プトファンシンターゼ系の対応する配列（「trp
系」）、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモ
ーター領域（OLPLおよびORR'R）、フイラメンテアス（F
ilamenteous）一本鎖DNAファージの制御領域、あるいは
原核細胞または真核細胞およびそれらのウイルスの遺伝
子の発現を制御する他の配列。したがって、適当な宿主
における特定のポリペプチドの生成を改良するために
は、そのポリペプチドをコードする遺伝子を選択し、そ
してそれを含有する組換え核酸分子から除去し、そして
組換え核酸分子の中に、その前者の発現制御配列の近く
にあるいはそれと一層適当な相関関係で、あるいは前述
の発現制御配列に１つの制御の下に、再挿入することが
できる。このような方法はこの分野において知られてい
る。 ここにおいて使用するとき、「相関関係」は、多くの
因子、例えば、次のものを包含する：組換え核酸分子の
発現増大および促進領域および挿入された核酸配列を分
離する距離、ベクター自体における挿入された核酸配列
または他の配列の転写および翻訳の特性、ベクターの挿
入された核酸配列または他の配列の特定のヌクレオチド
配列、およびベクターの発現増大および促進領域の特定
の特性。 さらに、所望生成物の細胞の収率の増加は、細胞中で
利用できる遺伝子の数の増加に依存する。例示すると、
これは次のようにして達成される。操作した組換え核酸
分子を鋳型のバクテリオファージλ（ＮΜ989）の中に
挿入して、最も簡単にはプラスミドを制限酵素で消化し
て、線状分子を生成し、次いでこれを制限されたファー
ジλクローニングビヒクル［例えば、次の文献に記載さ
れている型のもの、N.M.ムレイ（Murray）ら、「生体外
組換え体の回収を簡素化するラムドイドファージ（Lamb
doid Phage That Simplify the Recovery of In
Vitro Ｒ ecombinants）」、モレキュラー・アンド
・ジェネラル・ジェニティックス（Molec.Gen.Gene
t.）、150、53−61ページ（1977）およびN.E.ムレイ（M
urray）ら、「バクテリオファージT4からのDNAリガーゼ
遺伝子の分子クローニング（Molecular Clonig of th
e DNA Ligaze Gene From Bacteriophage T4）、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mo
l.Biol.）、132、493−505ページ（1979）］と混合し、
そして組換え体DNA分子をDNAリガーゼとのインキュベー
ションにより再環状化する。次いで、所望の組換えファ
ージを前のように選択し、そしてE.coliの宿主菌株を溶
原化するために使用する。 とくに有用なλクローニングビヒクルは、抑制遺伝子
中に温度感受性突然変異体および遺伝子Ｓ中に抑制突然
変異体、その生成物は宿主細胞の溶解のために必要であ
る、および遺伝子Ｅ、その生成物はウイルスの主要なカ
プシド蛋白質である、を含有する。この系を用いると、
溶原性細胞を32℃で生長させ、次いで45℃に加熱してプ
ロファージの切除を誘発する。37℃において延長して生
長させると、細胞内に保持される蛋白質の生産レベルが
高くなり、これらは通常の方法でファージ遺伝子生成物
によって溶解されないので、およびファージ遺伝子のイ
ンサートは包膜されないので、それはそれ以上の転写の
ために利用可能にとどまる。次いで、細胞の人工的溶解
は高い収率で所望生成物を解放する。 さらに、本発明に従って調製されるポリペプチドの収
率は、また、存在するDNA配列のコドンの一部または全
部を異なるコドンで置換することによって改良すること
ができ、これらの置換されたコドンは置き代えられたコ
ドンによってコードされるものと同一のアミノ酸をコー
ドする。 最後に、本発明の組換え核酸分子によって生成された
ポリペプチドの活性は、本発明の範囲から逸脱しない
で、よく知られた手段によって、本発明の核酸配列また
はポリペプチドを断片化、修飾または誘導体化すること
によって改良することができる。 本発明のポリペプチドは、次のものを包含する： （１）前述の細胞によって発現されたポリペプチド、 （２）合成手段によって調製されたポリペプチド、 （３）上の（１）または（２）のポリペプチドの断片、
このような断片はアミノ酸の合成により、あるいは消化
または切断によって生成される。 本発明による合成ペプチドに関すると、ペプチドの化
学的合成は次の刊行物に記載されている:S.B.H.ケント
（Kent），バイオメディカル・ポリマー（Biomedical
Polymers），ゴールドバーグ（Goldberg）,E.P.および
ナカジマ、A.編（アカデミック・プレス、ニューヨー
ク）、213−242（1980）;A.R.ミッチェル（Mitchel
l）、S.B.H.ケント（Kent）、M.エンゲルハード（Engel
hard）およびR.B.メリフィールド（Merrifield）、ジャ
ーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J.Org.Ch
em.）、43、2845−2852（1978）;J.P.タム（Tam）、T.
−W.ウォング（Wong）、M.リーマン（Rieman）、F.−S.
ジョング（Tjoeng）およびR.B.メリフィールド（Merrif
ield）、テトラヘドロン・レターズ（Tet.Let.）、4033
−4036、（1979）;S.モジソブ（Mjsov）、A.R.ミッチェ
ル（Mitchell）およびR.B.メリフィールド（Merrifiel
d）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー
（J.Org.Chem.）、45、550−560（1980）;J.P.タム（Ta
m）、R.D.ジマーチ（DiMarchi）およびR.B.メリフィー
レド（Merrifield）、テトラヘドロン・レターズ（Tet.
Let.）、2851−2854、（1981）；およびS.B.H.ケント
（Kent）、M.リーメン（Riemen）、M.デ・ドウクス（De
Doux）およびR.B.メリフィールド（Merrifield）、蛋
白質配列の分析法についての第IV回国際シンポジウムの
会議録（Proceedings of the IV International S
ymposium on Methods of Protein Sequence Anal
ysis）、（ブルックヘブン・プレス、ブルックヘブン、
ニューヨーク）、イン・プレス、1981。 メリーフィールド（Merifield）の固相手順におい
て、Ｌ−アミノ酸の適当な配列はカルボキシ末端アミノ
酸からアミノ末端アミノ酸に構成される。樹脂のクロロ
メチル基、ベンズヒドリルアミン基または他の基への化
学結合を介してポリスチレン（または他の適当な）樹脂
へ取付けられた適当なカルボキシル末端アミノ酸を使用
して出発して、アミノ酸を次の手順に従い順番に付加す
る。ペプチド−樹脂を、 （ａ） 塩化メチレンで洗浄し、 （ｂ） 塩化メチレン中の５％（v/v）ジイソプロピル
エチルアミン（または他のヒンダード塩基）で室温にお
いて10分間中和し、 （ｃ） 塩化メチレンで洗浄し、 （ｄ） 生長するペプチド鎖のモル量の６倍に等しい量
のアミノ酸を、モル数の1/2倍の量のカーボジイミド
（例えば、ジシクロヘキシルカーボジイミド、またはジ
イソピルカーボジイミド）と10分間０℃において組み合
わせることによって活性化して、アミノ酸の対称無水物
を形成する。使用するアミノ酸は、本来、Ｎ−アルファ
−tert−ブチルオキシカルボニル誘導体として提供され
るべきであり、側鎖は、ペプチド合成において普通に使
用される、ベンジルエステル（例えば、アスパラギン酸
またはグルタミン酸）、ベンジルエーテル（例えば、セ
リン、スレオニン、システインまたはチロシン）、ベン
ジルオキシカルボニル基（例えば、リジン）または他の
保護基で保護されており、 （ｅ） 活性化アミノ酸をペプチド−樹脂と２時間室温
において反応させ、新しいアミノ酸を生長するペプチド
鎖の末端に付加させ、 （ｆ） ペプチド−樹脂を塩化メチレンで洗浄し、 （ｇ） Ｎ−アルファ−（tert−ブチルオキシカルボニ
ル）基を、最も最近付加されたアミノ酸から、塩化メチ
レン中の30〜65％（v/v）、好ましくは50％（v/v）のト
リフルオロ酢酸と室温において10〜30分間反応させるこ
とによって除去し、 （ｈ） ペプチド−樹脂を塩化メチレンで洗浄し、 （ｉ） 要求するペプチド配列が構成されてしまうま
で、工程（ａ）〜（ｈ）を反復する。 次いでペプチドを樹脂から除去し、そして同時に、10％
v/vのアニソールまたは他の適当な（芳香族）スキャン
ベンジャーを含有する無水フッ化水素酸との反応によっ
て、側鎖の保護基を除去する。引続いて、ペプチドをゲ
ル過、イオン交換、高圧液体クロマトグラフィー、ま
たは他の適当な手段によって精製する。 ある場合において、化学的合成は固相樹脂を用いない
で実施することができ、この場合において、合成反応は
完全に溶液中で実施される。反応はこの分野において同
様でありかつよく知られており、そして最終生成物は本
質的に同一である。 ポリペプチドの消化は、蛋白質分解酵素、ことにその
基質の特異性がアミノ酸の所望配列にすぐに隣接する部
位においてポリペプチドを切断する酵素を使用すること
によって達成できる。 ポリペプチドの切断（cleavage）は化学的手段によっ
て達成できる。アミノ酸間の特定の結合は、特異的試薬
との反応によって切断できる。実施例は次のものを包含
する：メチオニンを含む結合は臭化シアンによって切断
される；アスパラギニル−グリシン結合はヒドロキシル
アミンによって切断される。 合成ペプチド類およびそれらに対する抗体をつくる目
的に対して重要であることと信じられる配列の非制限的
列挙は、次の通りである。各抗原は３つのレベルにカテ
ゴリー化される:1）内部に潜在的に有用な部位を含有す
る大きい領域;2）１のサブ領域および;3）合成ペプチド
抗原としての使用するためのプライムターゲツトである
と考えられる個々の部位。 本発明は次の利点を有する： （１）本発明によるCEAをコードする核酸は、その一部
分である完全な遺伝子を分離するためのプローブとして
使用できる。 （２）それはCEA遺伝子族の他の構成員を分離するため
のプローブとして使用できる。 （３）それは種々の腫瘍の型におけるこの遺伝子の発現
を決定するためにオリゴヌクレオチドプローブとして使
用できる。 （４）このヌクレオチド配列は、合成ペプチドの生成の
ための蛋白質の一次アミノ酸配列を予測するために使用
することができ、そしてCEA族の構成員を区別するため
に使用できる。 （５）上の配列から誘導された合成ペプチドは、配列特
異的抗体を生成するために使用できる。 （６）CEA族の各構成員についてのイムノアッセイは、
これらの配列特異的抗体および合成特異的ペプチドを用
いて生成することができる。 （７）CEA族の異なる構成員が異なる型の癌のための臨
床的に有用なマーカーであることが決定された場合、こ
れらのイムノアッセイは異なる型の癌のための診断に使
用できる。 本発明によるポリペプチドは、慣用の手段により、放
射線部分、例えば、I125、酵素、色素および蛍光性化合
物を使用して標識することができ、これらの標識は単な
る例である。 本発明によるイムノアッセイのためのいくつかの可能
な立体的配置を使用できる。これらのアッセイにおいて
使用できる読出し系は多数存在し、そしてこのような系
の非制限的例は、蛍光性および比色の酵素系、ラジオア
イソトープ標識および誘導体および化学ルミネセンス系
を包含する。イムノアッセイ法の２つの例は、次の通り
である： （１） 本発明による抗体調製物（それらから誘導され
たFabまたはＦ（ab）’断片を含む）を使用する酵素結
合イムノアッセイ（ELISA）、固相（例えば、マイクロ
タイター板またはラテックスのビーズ）に、酵素に接合
するもの以外の特異的をもつ精製された抗CEA抗体を取
付ける。この固相抗体をCEAを含有する試料と接触させ
る。洗浄後、固相抗体−CEA複合体を、接合した抗ペプ
チド抗体（または接合した断片）と接触させる。結合し
ない接合体を洗浄除去した後、酵素のための発色性また
は蛍光発生性の基質を添加することによって、色または
蛍光を発生させる。発生した色または蛍光は、試料中の
CEAの量に比例する。 （２） 蛍光的に標識されたペプチドまたはcLV7によっ
て特定化された配列の合成ペプチドを使用する競合蛍光
測定イムノアッセイ。この実施例において、細胞によっ
て発現された精製されたペプチドまたはその合成ペプチ
ドを蛍光的に標識する。固相に、精製された抗CEA抗体
を取付ける。次いで、蛍光性ペプチドプローブが添加さ
れているCEA含有試料とこの固相を接触させる。結合
後、過剰のプローブを洗浄除去し、結合したプローブの
量を定量する。結合した蛍光性プローブの量は、試料中
のCEAの量に対して反比例する。 本発明による核酸ハイブリダイゼーション法におい
て、核酸プローブを標識、例えば、酵素、蛍光団、ラジ
オアイソトープ、化学ルミネセント化合物などと接合す
る。最も一般的場合において、プローブを試料と接触さ
せ、そしてハイブリダイゼーション可能な核酸配列の存
在は、発色性酵素基質の存在下に発色させ、蛍光をエピ
フルオレセンス（epifluorescence）により検出するこ
とにより、ラジオアオソトープで標識されたプローブの
オートラジオグラフィーにより、または化学ルミネセン
スにより検出することができる。ハイブリダイゼーショ
ン可能なRNA配列の検出は、（１）ドットブロット法ま
たは（２）インシトウ（in situ）ハイブリダイゼーシ
ョン法によって達成することができる。これらの最後の
２つの技術についての方法は、それぞれ、次の文献に記
載されている:D.ギレスピー（Gillespie）およびJ.ブレ
ッサー（Bresser）、「Na I中のmRNAの固定化（mRNA I
mmobilization in Na I）：クイック・ブロッツ（Qui
ck Blots）」、バイオテクニークス（Biotechnique
s）、184−192、11月/12月、1983およびJ.ロウレンス
（Lawrence）およびR.シンガー（Singer）、「サイトス
ケタル蛋白質についてのメッセンジャーRNA類の細胞内
局在化（Intracellurar Localization of Messenger
RNAs for Cytosketal Proteins）」、細胞（Cel
l）、45、407−415、５月９日、1986。読出し系は前述
のものと同一であり、例えば、酵素標識、放射線標識な
どである。 前述のように、本発明は、また、本発明の前述の複合
体の薬物中の使用に関する。 本発明は、活性成分として、本発明の複合体を固体、
液体または液化ガスの希釈剤と混合して含有する製薬学
的組成物を提供する。 本発明は、さらに、活性成分として、本発明の複合体
を含有する、無菌および／または薬理学的に等張の水溶
液の形態の製薬学的組成物を提供する。 本発明は、また、本発明の複合体を含んでなる投与単
位の形態の薬物を提供する。 本発明は、また、本発明の複合体を含んでなる錠剤
（ロゼンジおよび顆粒を包含する）、糖剤、カプセル
剤、カプレット、ピル、アンプルおよび坐薬の形態の薬
物を提供する。 「薬物」は、ここで使用するとき、医学的投与に適す
る物理的に離散した凝集性の部分を意味する。「投与単
位形態の薬物」は、ここで使用するとき、各々が本発明
の化合物の１日量または１日量の多数倍または約量を担
体と一緒におよび／またはエンベロープ内に包装して含
有する、医学的投与に適する物理的に離散した凝集性の
部分を意味する。 本発明による製薬学的組成物は、例えば、水性または
非水性の希釈剤中の懸濁液、溶液または乳濁液、シロッ
プ、顆粒または粉末の形態を取ることができる。 錠剤、糖剤、カプセル剤、カプレットおよびピルに形
成するために適合する製薬学的組成物（例えば、顆粒）
中に使用する希釈剤は、次のものを包含する：（ａ）充
填剤および増量剤、（ｂ）結合剤、（ｃ）湿潤剤、
（ｄ）崩壊剤、（ｅ）溶解遅延剤、（ｆ）吸着促進剤、
（ｇ）表面活性剤、（ｈ）吸着性担体、（ｉ）潤滑剤。 本発明の製薬学的組成物から形成される錠剤、糖剤、
カプセル剤、カプレットおよびピルは、慣用の被膜、エ
ンベロープおよび保護マトリックスを有することがで
き、これらは不透明化剤を含有することができる。それ
らは、活性成分を腸管のみに、あるいは、好ましくはそ
の特定の部分に、可能ならばある期間にわたって、放出
するように構成することができる。 活性成分は、また、前述の希釈剤の１種または数種と
一緒にマイクロカプセルの形態に構成することができ
る。 非経口的投与のために、溶液および乳濁液は無菌であ
り、そして、適当ならば、血液等張性であるべきであ
る。 本発明の複合体に加えて、本発明による製薬学的組成
物および薬物は、また、他の製薬学的に活性な化合物を
含有することができる。 本発明の薬物を構成する離散した凝集性の部分は、一
般に、それらの形状または包装のおかげで、医学的投与
に適合し、そして、例えば、次のいずれであることもで
きる：錠剤（ロゼンジおよび顆粒を包含する）、ピル、
糖剤、カプセル剤、カプレット、坐薬およびアンプル。
これらの形態のあるものは、活性成分の遅延した放出の
ために構成することができる。ある、このようなカプセ
ル剤は、薬物の一部分を物理的に離散しかつ凝集性とす
る保護的エンベロープを含むことができる。 前述の製薬学的組成物および薬物の調製は、この分野
において知られた任意の方法により、例えば、活性成分
を希釈剤と混合して製薬学的組成物（例えば、顆粒）を
形成し、次いでこの組成物を薬物（例えば、錠剤）に形
成することによって実施される。 活性複合体は、経口的に、非経口的に（例えば、筋肉
内に、腹腔内に、皮下に、あるいは静脈内に）、経直腸
的にまたは局所的に投与することが考えられる。 実施例 実施例１〜８ CEA−ＡをコードするLV7の調製 実施例１ RNAの調製 腫瘍メッセンジャーRNAを、J.ファボラロ（Favolar
o）、E.トレイスマン（Treisman）およびR.ケイメン（K
amen）、メソッズ・イン・エンジモロジー（Methods i
n Enzymology）、65、718、アカデミック・プレス・イ
ンコーポレーテッド（1980）のプロイテナーゼＫ−フェ
ノール抽出法によって調製し、次いでオリゴdTセルロー
スクロマトグラフィーによってポリＡ＋RNA（ポリペプ
チドに翻訳できるほとんどのmRNAを含有する3'−ポリア
デニル化真核生物RNA）を生成した。ほぼ1.2mgのポリＡ
＋RNAを得るために、後期の対数生長後、ほぼ５×109の
ロボ（Lovo）細胞（ATCC CCL 229）を100×850cm3の
ローラーびんから収穫した。細胞を140ミリモルのNaC
l、1.5ミリモルのMgCl2、10ミリモルのトリス−HCl、pH
8、0.5％のNP40、４ミリモルのジチオスレイトールおよ
び20単位/mlの胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤の氷冷溶液
中の均質化によって溶解した。次いで、ナトリウムデオ
キシコレートを0.2％に添加した。細胞質および核は、
ホモジネートを12,000×ｇにおいて20分間遠心すること
によって分離した。細胞質の分画を等体積の0.2モルの
トリス−HCl、25ミリモルのEDTA、0.3ミリモルのNaCl、
２％のドデシル硫酸ナトリウムおよび400μl/mlのプロ
イテナーゼＫと混合し、１時間37℃でインキュベーショ
ンし、次いで等体積のエタノール／クロロホルム（1:1/
v:v）溶液で１回抽出した。核酸は分離した水相のエタ
ノール沈殿により得た。合計のRNAは、ポリＡ＋RNAにつ
いて、0.5モルのNaCl、10ミリモルのトリス−HCl、pH7.
8、0.1％のサルコシル中でオリゴdT（12−18）セルロー
スカラムに通過させることによって濃縮した。洗浄後、
結合したRNAを、塩化ナトリウムの不存在下に同一溶液
で溶離した。 実施例２ mRNAの逆転写 ５μｇのポリＡ＋Lovo RNAを、オリゴdT（12−18）
で逆転写についてプライミングした。50μｌの反応を90
分間42℃において75単位のAMV逆トランスクリプターゼ
（ライフ・サイエンシズ・インコーポレーテッド、米国
フロリダ州、セントペテルスバーグ）を使用して実施し
た。RNAをアルカリ性加水分解により除去し、そして一
本鎖cDNAを、それぞれ、DNAポリメラーゼＩおよびT4DNA
ポリメラーゼの大きい断片（クレノー）とともにインキ
ュベーションすることによって一本鎖および平滑末端
（blunt end）とした。 実施例３ pLV7（プラスミドLV7）のクローニグ 合成EcoR I DNAリンカー（5'pGGAATTCC 3'）を、実
施例２に記載するようにして調製したcDNAの末端に、過
剰のT4DNAリガーゼ［20ウェイス（Weiss）単位］との平
滑末端結合によって取付けた。過剰のリンカーを［セフ
ァデックス（SEPHADEX）」Ｇ−50のゲル透過クロマトグ
ラフィーによって除去し、EcoR I制限酵素による切断お
よびA15m（バイオラド、ラボラトリーズ、米国カリフォ
ルニア州リッチモンド）のアガロース排除クロマトグラ
フィーによる分画によって、EcoR I接着末端（stiky e
nd）を発生させた。500bpより大きいDNA断片を、アガロ
ースゲルの大きさ分類後に、選択し、95％のエタノール
で沈殿させた。DNAを小さい体積の10ミリモルのトリス
−HCl、pH7.8、１ミリモルのEDTA中に再懸濁し、そして
等モル量のラムダgtl1の5'ホスファターゼ化EcoR I末端
アーム（プロメガ・バイオテク、米国ウィスコンシン州
マディソン）に添加した。このファージは有利な性質を
もち、ラムダgtl1のEcoR I部位に挿入された異質DNAは
ベーターガラクトシダーゼ融合蛋白質の一部として翻訳
され、これはCEAに対する抗体との免疫反応性について
スクリーニングすることができる。DNAをT4DNAリガーゼ
の存在下に100〜200μl/mlの濃度において24時間結合し
た。３μｌの結合したDNAを生体外ラムダパケージング
混合物（packaging mix）（ストラタジーン、米国カリ
フォルニア州サンディエゴ）に添加し、そしてパーケー
ジングされた粒子をE.coli宿主y1088（ATCC 27195）の
感染によってアッセイした。400万のファージのうち
で、120万はcDNAインサートを有することがベーターガ
ラクトシダーゼの相補性によって決定された。 実施例４ 免疫ブロッティングによる融合ポリペプチドのスクリー
ニング ５万のファージを、E.coliY1090（ATCC 37197）上
で、10ミリモルのMgSO4および100μg/mlのアンピシリン
を含むLB−ブロスを含有する12枚の150mmの皿の各々に
おいてスクリーニングのために配置した。ある場合にお
いて、ファージのストック（stock）は、スクリーニン
グ前に、増幅および力価決定（titering）によって調製
した。ファージを42℃で４時間溶解的に生長させ、次い
で10ミリモルのIPTG（イソプロピルチオガラクトシド）
で含浸したニトロセルロースの円形体を皿の上に配置
し、そして37℃でさらに２時間インキュベーションし
た。この期間の間、融合蛋白質の合成は誘発され、そし
てニトロセルロースのマトリックスへ吸収された蛋白質
を変性ELISAフォーマットにおいてスクリーニングし
た。出願人のライブラリーにおいて、あるLovo蛋白質は
CEAまたはCEA関連エピトープの一部分を発現することが
でき、この部分は適当な抗体によつて認識することがで
きる。出願人は、自然のCEA（180kd）に対して向けられ
た商業的に入手可能な抗血清および還元しかつアルキル
化されたCEAに対して会社内で調製された抗血清を利用
して、フィルター上で抗原を検出した。これらのウサギ
のポリクローナル抗血清をPBS/T（0.05％の「ツイーン
−20」および0.01％のチメロサルを含有するリン酸塩緩
衝化食塩水（50ミリモルのNaリン酸塩、pH7.3、150ミリ
モルのNaCl））中で希釈し、そして２時間インキュベー
ションしてニトロセルロースの円形体へ付着する蛋白質
を認識できるようにした。過剰の抗体を除去し、そして
融合蛋白質へ結合したウサギIgG分子を、アルカリ性ホ
スファターゼと接合したマウス抗ウサギIgG抗体によっ
て検出した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
ホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムの存在
下に、色を検出した。暗色に着色するプラークの像をマ
ークし、そして潜在的な陽性の区域の回復についてマス
ターファージ平板で検索（key）した。反復した希釈、
免疫ブロッティングによるスクリーニングおよびアッセ
イの増幅後に、抗CEA反応性ペプチドを発現しつづける
ファージを使用してDNAを調製した。 実施例５ DNAの操作 T.マニアチス（Maniatis）、E.F.フイツリトシ（Frit
sch）およびJ.サムブルック（Sambrook）、モレキュラ
ークローニグ、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecu
lar Cloning,A Laboratory Mannual）、コールド・
スプリング・ハーバー、（1982）に従い、ファージDNA
を調製した。DNAのセグメントを低融点のアガロースゲ
ルから分離し、そしてブルースクライブ（Bluescribe）
プラスミドベクター（ストラトギーン、米国カリフォル
ニア州サンディエゴ）中のサブクローニグのために挿入
した。DNAの配列決定は、F.サンガー（Sanger）、S.ニ
ックレン（Nicklen）およびA.R.クールソン（Coulso
n）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）US
A、74、5463−5467、（1977）のジデオキシ停止法によ
って実施した。 実施例６ 酵素イムノアッセイによるラムダcLV7（cDNA LV7）に
おけるCEA反応性の検出 ラムダcLV7をE.coliY1089中において20分間イソプロ
ピルチオガラクトシドで誘発し、そして37℃において１
時間生長させた。細胞を５分間ベックマン・マイクロフ
ージ（Beckman Microfuge）中で室温において遠心し
た。細胞をもとの体積の１％で、10μg/mlのロイペプチ
ンおよびペプスタチン、10ミリモルのEDTA、１ミリモル
のフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび0.01％の
チメロサルを含有する50モルのトリス−HCl、pH7.5、中
に懸濁させた。細胞を−80℃で凍結し、融解し、そして
０℃で６分間超音波処理した。超音波処理した懸濁液を
遠心し、そして上澄みの流体を酵素結合イムノアッセイ
によりCEA免疫反応性についてアッセイした。リンブロ
（Linbro）96ウェルのマイクロタイタープレートを、40
0ngのマウスのモノクローナル抗ベータガラクトシダー
ゼ抗体で４℃において一夜被覆した。結合しない抗体を
洗浄除去し、そしてプレートをPBS/T（0.05％の「ツイ
ーン−20」および0.01％のチメロサルを含有するリン酸
塩緩衝化食塩水（50ミリモルのNaリン酸塩、pH7.3、150
ミリモルのNaCl））で室温において３時間ブロッキング
した。超音波処理した細胞からの上澄みをPBS/T中で希
釈し、そして100μｌの希釈した抗原を抗体被覆ウェル
に添加した。室温において２時間インキュベーションし
た後、結合しない抗原を洗浄除去し、そして希釈したウ
サギ抗CEA抗体を100μｌのPBS/T中において添加した。
次いで、プレートを２時間室温においてインキュベーシ
ョンした。洗浄後、各ウェルにPBS/T中のヤギ抗ウサギI
gGからの100μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ接
合Igを添加した。室温において２時間インキュベーショ
ンした後、ウェルを洗浄し、そしてペルオキシダーゼの
基質（3,3,5,5'−テトラメチルベンジジンおよび過酸化
水素）５分間添加した。50μｌの８モルの硫酸の添加に
より、発色反応を停止した。450nmの吸収を各ウェルに
ついて決定した。第２図の四角形（open square）は、
前述のような融合蛋白質抗原を加えたウェルを表わす。
＋のデータ点は、上のように処理したが、希釈した融合
蛋白質抗原の代わりに100μｌのPBS/Tを加えたウェルを
表わす。 実施例７ ラムダLV7融合蛋白質の免疫化学的同定 融合蛋白質を含有するE.coliY1089リゼイトを、U.K.
ラエムリ（Laemmli）、ネイチャー（Nature）、227、68
0−685（1970）の方法に従いSDS−PAGE上に展開した。1
0％のアクリルアミドゲル上の電気泳動後、蛋白質は電
気泳動的にニトロセルロースへ移行した。移行後、フィ
ターをPBS/T中でブロッキングした。免疫ブロットを、
ウサギ抗CEAおよび、ヤギ抗ウサギIgGからのセイヨウワ
サビペルオキシダーゼ接合IgGを使用する順次のインキ
ュベーションによって展開した。洗浄後、移行体を４−
クロロ−１−ナフトールとともにインキュベーションし
て帯を可視化した。第３図においてレーン１は対照、す
なわち、ファージを含まないE.coliリゼイドである。第
３図におけるレーン２はラムダcLV7融合蛋白質を含有す
るリゼイトである。第３図の左側の番号は、蛋白質の標
準の移動度および分子量（キロダルトン）を示す。第３
図の右側の番号は、ラムダLV7融合蛋白質（上のしる
し）およびE.coliベータ−ガラクトシダーゼサブユニッ
ト（下のしるし）の計算した分子量および移動度を示
す。 実施例８ cLV7特異的ポリＡ＋RNAの検出 細胞質のポリＡ＋RNAを、Lovo腫瘍細胞からおよびリ
ンパ芽球様系統GM1989（対照の細胞系）から調製した。
５μｇの各RNAを変性し、そして１％のアガロース−2.2
モルのホルムアルデヒドのゲル中で電気泳動させ、次い
でニトロセルロース紙に移した。次いで、移したブロッ
トを２×SSPE、５×デンハルト、50μg/mlの変性サケ精
子DNA中において68℃で18時間のわたって、32P放射線cL
V7DNAと対抗させた。ブロットを0.2×SSPE、0.25％のSD
S中で68℃において２時間洗浄し、次いで「KODAK」Ｘ−
ARフィルム上で２枚の増強スクリーンを使用してオート
ラジオグラフィーにかけた。RNAの大きさマーカー（BRL
インコーポレーテッド、米国マリイランド州ガイサース
バーグ）をアガロースゲルの隣接ウェル中で同時に電気
泳動し、そして0.04％のメチレンブルーで着色すること
によって可視化した。 結果 Lovo cDNA分子から独立に誘導し、ラムダgtl1発現ベ
クター系中に挿入されかつ抗CEA免疫反応性についてポ
リペプチドとしてスクリーニングしたほぼ100万のうち
で、２つの陽性のクローンを分離した。インサートをブ
ルースクライブ（＋）プラスミドクローニグベクターの
EcoR I部位中にサブクローニグし、そしてこれらの１
つ、pcLV7と表示する、をさらに分析した。pcLV7を含有
するEscherichia coli中のプラスミド、ATCC No.6716
9は、1986年７月30日にアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（American Type Culture Collect
ion）（「ATCC」）に受託された。DNA配列の分析によ
り、このクローンのインサートの大きさは859bpであ
り、そしてその配列は第１図に示されている。上の線は
pcLV7のオープンリーデイングフレームのヌクレオチド
配列を表わす。その下は、それをコードするペプチド配
列である。ここにおけるcDNAクローンを表示するために
使用する一般用語はcLV7またはLV7である。この用語に
付加するとき、接頭文字ラムダ−またはｐ−は、このク
ローンが、それぞれ、ラムダファージまたはプラスミド
の中に挿入されたことを意味する。 実施例９〜13 CEA−Ｂをコードする1LV7 cDNAの調製 実施例９ RNAの調製 LV7 cDNAについての実施例１の手順と同一の手順
を、1LV7 cDNAについて従う。 実施例10 mRNAの逆転写 50μｇのポリＡ＋RNAを、逆転写のために、オリゴdt
（12−18）およびランダムデオキシヘキサマーでプライ
ミングした。350μｌの反応を、900単位のAMV逆トラン
スクリプターゼ（ライフ・サイエンシズ・インコーポレ
ーテッド、米国フロリダ州、セントペテルスバーグ）と
ともに、42℃で2.5時間インキュベーションした。次い
で、cDNA/RNAハイブリッドのRNA成分を、RNアーゼＨ、
E.coli DNAポリメラーゼＩおよびE.coli DNAリガーゼ
で、12℃および22℃において各々1.5時間処理すること
によって、cDNA相補性鎖で置換した。分子の末端をT4DN
Aポリメラーゼでポリッシングした（polished）。 実施例11 pLV7のクローニグ 引続く消化工程からの新しく合成されたcDNAに対して
内部のEcoR I部位を保護するために、合計のcDNAを80μ
モルのＳ−アデノシルメチオニンの存在下に37℃におい
て１時間処理した。２〜5kbの大きさの範囲のcDNAセグ
メントを切除し、ゲルのスライスから抽出し、そして10
0倍モル過剰量の合成EcoR Iリンカー（5'pdGGAATTCC
3'）の存在下にT4DNAリガーゼとともにインキュベーシ
ョンした。過剰のリンカーをセファデックスＧ−25（中
程度）のゲル透過クロマトグラフィーにより除去し、そ
してEcoR I接着末端をEcoR I制限酵素の切断によって発
生させた。EcoR I末端cDNAセグメントを、T4DNAリガー
ゼの存在下に５℃において一夜、バクテリオファージの
ベクターのラムダgtl1のEcoR I切断およびホスファター
ゼのアームとともにインキュベーションした。次いで、
結合混合物のアリコートを生体外パッケージング抽出物
（ストラタジーン、米国カリフォリニア州サンディエ
ゴ）と混合し、そしてファージの粒子をE.coliY1089細
胞上で滴定した。 実施例12 ハイブリダイゼーションによる組換え体のスクリーニン
グ 生体外パッケイジングしたライブラリーからの５万の
ファージ（pfu）を、1.4％の寒天、10ミリモルのMgSO4
および100μg/mlのアンピシリンを含有する４枚の150mm
のLBプレートの各々の上に配置した。ファージの大きさ
が直径0.2〜0.5mmとなるまで、ファージに宿主細胞を溶
解させた。次いで、プレートを冷却し、そしてW.D.ベン
トン（Benton）およびR.W.デイビス（Davis）、「単一
プラークへのインシトウのハイブリダイゼーションによ
るラムダGT組換え体クローンのスクリーニング（Screen
ing Lambda GT Recombinant Clones by Hybridiz
ation to Single Plaques In Situ）」、サイエン
ス（Science）、196、180−182、（1977）の方法によ
り、ニトロセルロースのフィルターのレプリカを、調製
した。フィルターを２×SSPE、５×デンハルト、0.1％
のSDS、100μg/mlの変性サケ精子DNA中で予備ハイブリ
ダイゼーションし、そしてハイブリダイゼーションし、
ハイブリダイゼーションのため、2ng/mlの32P標識cLV7
インサートDNAを使用した。非特異的DNAハイブリダイゼ
ーションを0.5×SSPE、0.25％のSDS中のフィルターの洗
浄により除去した。陽性のプラークをオートラジオグラ
フィーにより検出し、取り上げ、そして放射線標識プロ
ーブを使用して２回の追加の連続のハイブリダイゼーシ
ョンについてスクリーニングした。 実施例13 DNAの操作 実施例12からの陽性のプラークのインサートをバクテ
リアのプラスミドのベクター中に導入し、そしてエンド
ヌクレアーゼIII発生二本鎖セグメントをジデオキシ末
端法によって配列決定した。DNA配列をプステル（Puste
ll）DNA配列分析プログラム（IBIインタナショナル、米
国コネチカット州ニューヘブン）を使用してコンピュー
ターによって分析した。 結果 Lovo cDNA分子から独立に誘導し、ラムダgtlIベクタ
ー系中に挿入されかつ放射線標識したLV7プローブとの
反応性についてスクリーニングしたほぼ20万のうちで、
40の陽性のクローンを分離した。これらのうちの最大
（ほぼ3Kb）を配列決定し、その核酸および蛋白質の配
列を第５図に記載する。 Pc1LV7を含有するEscherichia coli中のプラスミ
ド、ATCCNo.67312は、1987年２月６日にアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（American Type Cu
lture Collection）（「ATCC」）に受託された。 DNA配列の分析により、このクローンのインサートの
大きさは2839bpであり。そしてその配列は第５図に示さ
れている。上の行はp1LV7のオープンリーディングフレ
ームのヌクレオチド配列を表わす。その下は、それをコ
ードするペプチド配列である。ここにおけるcDNAクロー
ンを表示するために使用する一般用語はc1LV7または1LV
7である。この用語に付加するとき、接頭文字ラムダ−
またはｐ−は、このクローンが、それぞれ、ラムダファ
ージまたはプラスミドの中に挿入されたことを意味す
る。 実施例14 CEA−ＣをコードするcFL−CEAのクローニグおよび配列
決定 バクテリオファージのベクターのラムダgtl1中の胎児
肝臓cDNAの２×105の独立のインサートを含有する組換
え体ライブラリー（クロンテク、米国カリフォルニア州
バロアルト）を、W.D.ベントン（Benton）およびR.W.デ
イビス（Davis）、サイエンス（Science）、196、180−
182、（1977）に従い放射線ラベルLV7でスクリーニング
した。単一の陽性クローンを選択し、そしてEcoR Iイン
サートをプラスミドのベクターのブルースクリプトKS＋
（ストラタジーン、米国カリフォルニア州サンディエ
ゴ）中にサブクローニグした。検出クローンを両方向に
おいて調製し、そしてF.サンガー（Sanger）、S.ニック
レン（Nicklen）およびA.R.クールソン（Coulson）、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、74、54
63−5467、（1977）のジデオキシ停止法により配列決定
した。このクローン、FL5と表示する、は翻訳停止シグ
ナルの欠如によって判断して不完全であった。Ｆ＋５の
3'末端から誘導される単一のコピーのプローブを使用し
て、前述の商用胎児肝臓ライブラリーを再スクリーニン
グした。５つの陽性のクローンが得られ、インサートを
ブルースクリプトKS＋ベクター中にクローニグし、そし
て最大のFL4と表示するものを配列決定した。これらの
２つのcDNAプラスミド、FL5およびFL4は重複し、そして
一緒に、FL−CEAとここで表示するポリペプチドの全オ
ープンリーディングフレームを含有する。FL−CEAの翻
訳した配列は、次の通りである： 残留配列について、第１アミノ酸がGlnであり、これ
は核酸190の下に存在する。その後、アミノ酸には連続
番号が付されている。 実施例15〜19 CEA−ＤをコードするcBT−20のクローニグおよび配列決
定 実施例15 RNAの調製 腫瘍メッセンジャーRNAを、J.ファボラロ（Favolar
o）、E.トレイスマン（Treisman）およびR.ケイメン（K
amen）、メソッズ・イン・エンジモロジー（Methods i
n Enzymology）、65、718、アカデミック・プレス・イ
ンコーポレーテッド（1980）のプロイテナーゼＫ−フェ
ノール抽出法によって調製し、次いでオリゴdTセルロー
スクロマトグラフィーによってポリＡ＋RNAを生成し
た。ほぼ100μｇのポリＡ＋RNAを得るために、1g（湿潤
重量）のBT−20細胞（ATCC HTB 19）を20mlの氷冷RNA
溶解緩衝液（140ミリモルのNaCl、1.5ミリモルのMgC
l2、10ミリモルのトリス−HCl、pH7.8、0.5％のNP−4
0、４ミリモルのジチオスレイトールおよび20単位/mlの
胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤）中に再懸濁しかつ溶解し
た。ナトリウムデオキシコレートを0.2％に添加した。
細胞質および核は、ホモジネートを12,000×ｇにおいて
20分間遠心することによって分離した。細胞質の分画を
等体積のPK緩衝液（0.2モルのトリス−HCl、25ミリモル
のEDTA、0.3ミリモルのNaCl、２％のドデシル硫酸ナト
リウムおよび400μg/mlのプロイテナーゼＫ）と混合
し、２時間37℃でインキュベーションし、次いで等体積
のフェノール／クロロホルム（1:1/v:v）溶液で１回抽
出した。核酸は分離した水相のエタノール沈殿により得
た。合計のRNAは、ポリＡ＋RNAについて、0.5モルのNaC
l、10ミリモルのトリス−HCl、pH7.8、0.1％のサルコシ
ル中でオリゴdT（12−18）セルロースカラムに通過させ
ることによって濃縮した。洗浄後、結合したRNAを、塩
化ナトリウムの不存在下に同一溶液で溶離した。 実施例16 mRNAの逆転写 10μｇのポリＡ＋BT−20 RNAを、オリゴdT（12−1
8）およびpdN6で逆転写のためにプライミングした。100
μｌの反応を４時間42℃において200単位のAMV逆トラン
スクリプターゼ（ライフ・サイエンシズ・インコーポレ
ーテッド、米国フロリダ州、セントペテルスバーグ）を
使用して実施した。cDNA/mRNAハイブリッドのRNA成分
を、12℃および22℃において各々1.5時間RNアーゼ、E.c
oli DNAポリメラーゼＩおよびE.coli DNAリガーゼで
処理することによって、第２相補性鎖で置換した。分子
の末端をT4DNAポリメラーゼの処理によって平滑にし
た。cDNAをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノ
ール沈殿し、そして10ミリモルのトリス−HCl、pH7.8、
１ミリモルのEDTA（TE）中で調製した「セファデックス
Ｇ−20」スパン（spun）カラムで精製した。 実施例17 cBT20のクローニグ 合成DNAリンカー を、cDNAの末端に、過剰のT4DNAリガーゼとの平滑末端
結合によって取付けた。過剰のリンカーをTE中において
「セファデックス Ｇ−50」（中程度）のクロマトグラ
フィーおよび0.8％の低融点のアガロースゲルの分画に
よつて除去した。BT−20細胞系のポリＡ＋RNAのノザン
ブロットに基づいて、CEA関連mRNAの大きさは3.0kbと推
定された。したがって、２〜4kbの間のcDNA断片を、ゲ
ルのスライスから回収し、そしてエタノール沈殿した。
TE中のcDNAの再懸濁後、EcoR I切断ラムダgt10アームを
1:1の推定モル比においてcDNAへ付加した。結合をT4DNA
リガーゼの存在下に７℃において２日間進行させた。標
識反応のアリコートを商業的に得られるパッケージング
混合物（ストラタジーン、米国カリフォルニア州サンデ
ィエゴ）にラムダ粒子の調製のために添加した。生体外
のパッケージングおよびE.coli宿主ＮΜ514の感染後、5
00万のファージ粒子が得られた。 実施例18 組換え体のライブラリーのスクリーニング 50万のパツケージングされたラムダ粒子をE.coli NM
514の菌叢上に配置し、複製のパターンを、W.D.ベント
ン（Benton）およびR.W.デイビス（Davis）、サイエン
ス（Science）、196、180−182、（1977）に記載されて
いるようにニトロセルロースのシート上に持上げた。種
々のCEA族の構成員の間の反復領域を含有する、32 P標識LV7 cDNAインサートのプローブとのハイブリダ
イゼーションにより、陽性のファージを選択した。この
選択法によって、多数回の連続的スクリーニング後に、
12の陽性のファージが得られた。個々のプラークからの
ファージを増幅し、力価決定し、そしてこれらを使用し
て少量の組換え体ファージDNAを調製した。 実施例19 DNAの操作 T.マニアチス（Maniatis）、E.F.フリトシ（Fritsc
h）およびJ.サムブルック（Sambrook）、モレキュラー
・クローニグ、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecu
lar Cloning,A Laboratory Mannual）、コールド・
スプリング・ハーバー、（1982）に従い、ファージDNA
を調製した。DNAのセグメントを低融点のアガロースゲ
ルから分離し、そしてブルースクプト（Bluescript）プ
ラスミドベクター（ストラトジーン、米国カリフォルニ
ア州サンディエゴ）中のサブクローニングのために挿入
した。DNAの配列決定は、F.サンガー（Sanger）、S.ニ
ックレン（Nicklen）およびA.R.クールソン（Coulso
n）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）US
A、74、5463−5467、（1977）のジデオキシ停止法によ
って実施した。BT20についての翻訳された配列は次の通
りである： 注：位置1380−1281における「nn」および位置1589−15
91における「nnn」は、cBT−20の、まだ、配列決定され
ない3'−翻訳領域を表わす。 残留配列について、第１アミノ酸は第４列のLysであ
り、左から11アミノ酸である。その後、アミノ酸には連
続番号が付されている。 この明細書および特許請求の範囲は例示を目的とし、
限定を意味するものではなく、そして種々の変更および
変化は本発明の精神および範囲を逸脱しないで可能であ
ることは、理解されるであろう。
核酸配列に関する。 癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen）（「CE
A」）は、最初にゴールド（Gold）およびフリードマン
（Freedman），ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル
・メディシン（J.Exp.Med.）,121,439−462（1965）に
記載された。CEAは、50〜60重量％の炭水化物をもつ分
子量ほぼ200,000の糖蛋白質として特徴づけられる。CEA
は正常のヒト胎児の発育間に存在するが、正常の大人の
腸管中の濃度は非常に低い。それはある数の異なる腫瘍
によって生成されかつ分泌される。 CEAは結腸直腸の癌患者の監視のための、臨床的に有
用な腫瘍マーカーである。CEAは感受性のイムノアッセ
イ法を用いて測定できる。CEAの手術前の血清レベルが
高くなったとき、血清CEAの手術後の正常範囲への低下
は、典型的には、腫瘍の切除に成功したことを示す。正
常に戻らない手術後のCEAレベルは、しばしば、腫瘍の
切除が不完全であること、あるいは患者中に追加の腫瘍
部位が存在することを示す。正常レベルへ戻った後、血
清CEAレベルの引続く急速な上昇は通常準段階（metasta
ge）の存在を示す。通常レベルからのより遅い手術後の
上昇は、最も頻繁に、前に検出されない新しい一次腫瘍
の存在を示すと解釈される。こうして、結腸の患者の手
術後の管理はCEAの測定によって促進される。 CEAは抗原族の１員である。このために、現在利用可
能な方法によるCEAのイムノアッセイは、CEAがいくつか
の潜在的な反応性の抗原の１つだけであるという事実に
よって複雑である。少なくとも16のCEA様抗体が文献が
記載されてきた。これらのいくつかは異なる研究者らに
よって記載された同一の抗体と思われるので、異なる抗
原の実際の数は多少この数よりも少ない。それにもかか
わらず、腫瘍が放出するCEAのイムノアッセイを潜在的
に妨害しうる交差反応性抗原の複雑な列が存在する。CE
A様抗原の血清レベルは、多くの腫瘍以外の状態、例え
ば、炎症性肝臓の病気およびまた喫煙者において増大す
ることが知られている。癌患者の状態の監視のために使
用するイムノアッセイは、これらの他のCEA様抗原によ
って妨害されないことが重要である。逆に、異なる型の
腫瘍が異なる型のCEAを優先的に発現する可能性がある
ので、抗原類をイムノアッセイによって区別できること
が重要である。そうである場合、異なる型のCEAを信頼
性をもって測定できることは、異なる型の癌を診断し、
あるいはより首尾よく処置する手段を提供する。 「放射性ヨウ素を使用する癌胎児性抗原および診断
法」と題する米国特許第3,663,684号は、RIAにおいて使
用するためのCEAの精製および放射性ヨウ素化に関す
る。 米国特許第3,697,638号は、CEAが抗原類（この場合成
分ＡおよびＢ）の混合物であることを記載している。米
国特許第3,697,638号は、各成分を分離しかつ放射性ヨ
ウ素化する方法および特定のRIAにおけるそれらの使用
を述べている。 「癌胎児性抗原の決定における血漿抽出物のための代
替物として、ラジオイムノアッセイにおいて使用する組
成物」と題する米国特許第3,852,415号は、CEAのRIAの
ための希釈剤の代替物として、EDTAおよびウシ血清アル
ブミンを含有する緩衝液の使用に関する。 「癌胎児性抗原」と題する米国特許第3,867,363号
は、CEAの成分ＡおよびＢの分離、それらの標識つけお
よびRIAにおける使用に関する。 「放射線標識した抗体による腫瘍の局在化」と題する
米国特許第3,927,193号は、全身の腫瘍の映像化におけ
る放射線標識抗CEAの使用に関する。 「癌胎児性抗原」と題する米国特許第3,956,258号
は、CEAの成分ＡおよびＢの分離に関する。 「癌胎児性抗原」と題する米国特許第4,086,217号
は、CEAの成分ＡおよびＢの分離に関する。 「診断法および試薬」と題する米国特許第4,140,753
号は、CEA−S1と呼ばれるCEA異性体の精製およびRIAに
おけるその使用に関する。 「癌胎児性抗原の異性体」と題する米国特許第4,145,
336号は、抗原CEA−S1に関する。 「癌胎児性抗原」と題する米国特許第4,180,499号
は、CEAの成分Ａの生成法を記載している。 「癌胎児性抗原を生成する方法」と題する米国特許第
4,228,236号は、確立された細胞系LS−174TおよびLS−1
80またはそのクローンまたは誘導体をCEAの生成におい
て使用することに関する。 「癌胎児性抗原のアッセイのための抗体吸着支持体
法」と題する米国特許第4,272,504号は、CEAのラジオイ
ムノアッセイのための２つの概念に関する。第１に、米
国特許第4,272,504号は、試料をpH5において65〜85℃に
加熱して予備処理して、異質蛋白質を沈殿しかつ排除す
ることに関する。第２に、それは分析物および放射線標
識CEAトレーサーを捕捉する手段として、固体の抗体
（ビーズまたは管上）を使用することを記載している。 「癌胎児性抗原の決定」と題する米国特許第4,299,81
5号は、CEA試料を水で希釈し、そして蛋白質の沈殿が起
こる温度より低い温度に加熱することによって予備処理
することに関する。次いで、予備処理した試料を、RI
A、EIA、FIAまたは化学ルミネセンスイムノアッセイを
使用してイムノアッセイする。 「高分子量の癌胎児性抗原に対して特異的なモノクロ
ーナルハイブリドーマの抗体」と題する米国特許第4,34
9,528号は、180kDのCEAと反応性であるが、他の分子量
の形態と反応性ではないモノクローナル抗体に関する。 「癌胎児性抗原のための酵素−イムノアッセイ」と題
する米国特許第4,467,031号は、２つの高CEAモノクロー
ナル抗体の第１が固相に取付けられており、そして第２
のモノクローナル抗体がペルオキシドと接合している、
CEAのためのサンドイッチ酵素イムノアッセイに関す
る。 「癌の検出のための方法および組成物」と題する米国
特許第4,489,167号は、CEAがヒト血清の正常な成分であ
るα−酸性糖蛋白質（AG）と抗原決定基を共有すること
を記載している。そこに記載されている方法は、１つの
抗体として、AGを認識する抗体および、CEAを認識する
が、AGを認識しない他の抗体を使用する、固相サンドイ
ッチ酵素イムノアッセイに関する。 「癌胎児性抗原（CEA）のためのイムノアッセイ」と
題する米国特許第4,578,349号は、CEAのイムノアッセイ
において希釈剤として高い塩を含有する緩衝液を使用す
ることに関する。 「癌胎児性抗原のための血液試料のアッセイ−シリカ
ゲルとのインキュベーションによる妨害物質の除去後」
と題する欧州特許（EP）113072−Ａ号は、シリカゲルで
予備処理することによって血漿試料の血清から妨害物質
を除去することに関する。次いで、予備清浄化試料をイ
ムノアッセイにかける。 「癌診断癌胎児性抗原−電気泳動なしに過塩素酸抽出
物から生成された」と題する欧州特許（EP）92223−Ａ
号は、血清または血漿中ではなく、腫瘍組織自体の細胞
質ゾル分画中におけるCEAのイムノアッセイに関する。 「癌、とくに乳癌における予測試験として細胞質ゾル
−CEA−測定」と題する欧州特許（EP）83103759.6号
は、欧州特許（EP）92223−Ａ号に類似する。 「癌胎児性抗原に対して特異的なモノクローナル抗体
類」と題する欧州特許（EP）83303759号は、「CEA特異
的」モノクローナル抗体類およびイムノアッセイにおけ
るそれらの使用に関する。 「特異的CEA−族抗原類、それらに対して特異的な抗
体類およびそれらの使用法」と題するWO84/02983号は、
CEA−メコニウム（MA）−およびNCA−特異的エピトープ
に対するモノクローナル抗体類を、試料中のこれらの個
々の成分の各々を選択的に測定するように案出されたイ
ムノアッセイにおいて使用することに関する。 従来のCEAのアッセイのすべては、選択した無傷の抗
原で動物を免疫化することによって発生したモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを利用し
ている。それらのいずれも、種々の抗原の独特の一次配
列を検出するために、配列特異的抗体をつくるという考
えを述べていない。それらは、合成ペプチドまたは天然
の産物の断片に対して抗体を生成するために一次アミノ
酸配列を使用することを包含していない。それらは、CE
Aの族の構成員を区別するために一次アミノ酸配列を使
用するという概念を含まない。それらのいずれも、一次
配列の決定に使用する遺伝子を分離するために、DNAま
たはRNAのクローンを使用することを包含していない。 定義 例えば、第１図および第５図に出現するような核酸の略
号 Ａ アデニン Ｇ グアニン Ｃ シトシン Ｔ チミジン Ｕ ウラシル 例えば、第１図および第５図に出現するようなアミノ酸
の略号 Asp アスパラギン酸 Asn アスパラギン Thr スレオニン Ser セリン Glu グルタミン酸 Gln グルタミン Pro プロリン Gly グリシン Ala アラニン Cys システイン Val バリン Met メチオニン Ile イソロイシン Leu ロイシン Tyr チロシン Phe フェニルアラニン Trp トリプトファン Lys リジン His ヒスチジン Arg アルギニン ヌクレオチド−糖部分（ペントース）、ホスフェー
ト、および窒素の複素環塩基を含有するDNAまたはRNAの
モノマーの単位。塩基は糖部分にグリコシドの炭素（ペ
ントースの1'炭素）を介して結合しており、そして塩基
と糖との組合せはヌクレオシドと呼ばれる。塩基はヌク
レオチドを特徴づける。４つのDNA塩基はアデニン
（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）
およびチミジン（「Ｔ」）である。４つのRNA塩基は
Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。 DNA配列−隣接ペントース類の3'および5'炭素の間の
ホスホジエステル結合によって互いに結合するヌクレオ
チドの直線の列。 機能的同等体−DNA配列において、あるヌクレオチド
が発現生成物の配列を妨害しないで置換されうること
は、この分野においてよく知られている。ペプチドに関
すると、この用語は、特定の使用において機能をもたな
い１または２以上のアミノ酸が欠失されるか、あるいは
他のものと置換されうることを意味する。 コドン−mRNAを通してアミノ酸、翻訳開始シグナルま
たは翻訳停止シグナルをコードする（encode）３つのヌ
クレオチド（トリプレット）のDNA配列。例えば、ヌク
レオチドのトリプレットTTA、TTG、CTT、CTC、CTAおよ
びCTGはアミノ酸のロイシン（「Leu」）についてコード
し、そしてTGAは翻訳停止シグナルであり、そしてATGは
翻訳開始シグナルである。 リーディングフレーム−アミノ酸配列へのmRNAの翻訳
の間のコドンのグループ。翻訳の間、適切なリーディン
グフレームが維持されなくてはならない。例えば、配列
GCTGGTTGTAAGは３つのリーディングフレームまたは相に
おいて翻訳されることができ、それらの各々は異なるア
ミノ酸配列 を与える。 ポリペプチド−隣接アミノ酸類のα−アミノ基とカル
ボキシ基との間のペプチド結合によって互い結合したア
ミノ酸の直線の列。 ゲノム−細胞またはウイルスの全DNA。それは、なか
でも、細胞またはウイルスのポリペプチドをコードする
構造遺伝子、ならびにそのオペレーター、プロモーター
およびリボソーム結合および相互作用配列、例えば、SD
配列（Shine−Dalgarno配列）のような配列、を包含す
る。 構造遺伝子−その鋳型またはメッセンジャーRNA（「m
RNA」）を通して特定のポリペプチドの特徴あるアミノ
酸の配列をコードするDNA配列。 転写−構造遺伝子からmRNAを生成するプロセス。 翻訳−mRNAからポリペプチドを生成するプロセス。 発現−ポリペプチドを生成するために構造遺伝子によ
ってなされるプロセス。それは転写と翻訳との組み合わ
せである。 プラスミド−プラスミドが宿主細胞中で複製されるよ
うに、無傷の「レプリコン」からなる非染色体二本鎖DN
A配列。プラスミドが単細胞の有機体内に配置される
と、その有機体の特性はプラスミドのDNAの結果として
変化または形質転換されうる。例えば、テトラサイクリ
ン耐性（TetR）のための遺伝子を有するプラスミドは、
テトラサイクリンに対して以前感受性であった細胞をそ
れに対して抵抗性の細胞に形質転換する。プラスミドに
よって形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。 ファージまたはバクテリオファージ−バクテリアのウ
イルス、それらの多くの蛋白質のエンベロープまたはコ
ート）（「カプシド蛋白質」）中に包膜されたDNA配列
から成る。 クローニングビヒクル（cloning vehicle）−宿主細
胞中で複製することができるプラスミド、ファージDNA
または他のDNA配列、これはDNAの本質的生物学的機能、
例えば、複製、コート蛋白質の生成を付随して損失しな
いで、あるいはプロモーターまたは結合部位を損失しな
いで、決定可能な方法でこのようなDNA配列を切断でき
る、エンドヌクレアーゼ認識部位の１つまたは小さい数
によって特徴づけられ、そして形質転換した細胞の同定
において使用するために適するマーカー、例えば、テト
ラサイクリン耐性またはアンピシリン体制を含有する。
クローニングビヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。 クローニング−無性生殖によって１つのこのような有
機体または配列から誘導された有機体またはDNA配列の
集団を得るプロセス。 組換え体DNA分子またはハイブリッドDNA−生きている
細胞の外部で端対端で接合し、そしてある宿主細胞を感
染することができかつその中で維持されうる異なるゲノ
ムからのDNAのセグメントから成る分子。 発現制御配列−構造遺伝子へ操作的に結合されたと
き、構造遺伝子の発現を制御しかつ調節するヌクレオチ
ドの配列。それらは、lac系、Trp系、ファージλの主要
なオペレーターおよびプロモーターの領域、fdコート蛋
白質の制御領域およびそれらのウイルスの原核または真
核細胞の遺伝子の発現を制御することが知られている他
の配列を包含する。 形質転換／トランスフェクション−DNAまたはRNAを細
胞中に導入して遺伝子を発現させることができる。ここ
において使用する「感染した（infected）」は、ウイル
スのベクターによつてRNAまたはDNAが宿主中に導入され
ることに関する。ここで使用する「注入された（inject
ed）」は、細胞中へのDNAのマイクロインジェクション
（細い注射器の使用）に関する。 以後述べるCEA−Ａ、CEA−Ｂ、CEA−Ｃ、CEA−Ｄは、
下の実施例において記載するCEA族の構成員である。 本発明は、新規な核酸配列、例えば、DNAまたはRNA配
列に関し、この核酸配列はCEA配列またはそれとハイブ
リダイゼーション可能な塩基配列（RNAまたはDNA）を有
する核酸をコードする塩基配列からなる。このような核
酸は、完全なCEA遺伝子またはその一部、例えば、イン
トロン配列、ならびにエクソン配列からなるゲノムDNA
であることができるか、あるいはCEA蛋白質をコードす
るメッセンジャーRNAに対して相補的であるように構成
されたDNA、すなわち、cDNAであることができる。本発
明の核酸は、下に記載するDNA配列またはその断片、な
らびにそれとハイブリダイゼーション可能な配列からな
る： 配列は位置１から端（位置862）を表示する。配列は位
置１から番号を付してある。 完全なCEA蛋白質をコードしかつ前述の配列からなる
本発明の核酸は、合計約5000以下、より通常約3600の塩
基を有するであろう。上の配列のcDNAの断片は、少なく
とも10、ある場合において少なくとも50の塩基を有する
であろう。 859塩基の上のDNA配列は、発現されうるCEAの免疫反
応性断片、例えば、ラムダgtl １をコードする。この
配列は、長さがほぼ300塩基である内部の反復を有し、
そして長さが285アミノ酸の理論的蛋白質をコードす
る。このcDNAは他のヒト遺伝子中に見出される配列をコ
ードし、そして遺伝子のこの全族はCEA族の蛋白質をコ
ードすることができる。 本発明は、また、下に記載する塩基配列またはその断
片、ならびにそれとハイブリダイゼーション可能な配列
からなる、2839塩基対を有するDNA配列に関する； 同様にCEA族の構成員である蛋白質をコードするそれ
以上の配列は、以後に実施例中に示されている。 本発明は、また、核酸、例えば、DNAからなるインサ
ートを有する複製可能な組換えクローニングビヒクル
（「ベクター」）に関し、この核酸はCEAペプチドをコ
ードする塩基配列またはそれとハイブリダイゼーション
可能な塩基配列からなる。 本発明は、また、複製可能な組換えクローニングビヒ
クルまたは前述のcDNAとハイブリダイゼーション可能な
核酸で形質転換／トランスフェクション、感染または注
入した細胞に関する。こうして、本発明は、また、クロ
ーニングビヒクルを使用しないで、遊離の核酸を使用す
る細胞のトランスフェクションに関する。 なおさらに、本発明は、前述のトランスフェクショ
ン、感染または注入した細胞によって発現されたポリペ
プチドに関し、前記ポリペプチドはCEA、ならびに前記
ポリペプチドの標識された形態と免疫学的交差反応性を
示す。本発明は、また、前述の複製可能な組換えクロー
ニングビヒクルでトランスフェクション、感染または注
入した細胞の発現生成物のアミノ酸配列、すなわち、合
成ペプチドを有するポリペプチド、ならびに標識された
形態のポリペプチドに関する。換言すると、本発明は、
前述の発現生成物の全アミノ酸配列またはその５以上の
アミノ酸を有するその一部に相当するアミノ酸配列を有
する合成ペプチドに関する。 本発明は、さらに、前述のポリペプチドに対して特異
的な抗体調製物に関する。 本発明の他の面は、工程 （ａ）試験試料を前述の抗体調製物と接触させ、そして （ｂ）試料中のCEAへ結合する前記抗体調製物を決定す
る、 を含んでなる試験試料中のCEAまたは機能的同等体を検
出するイムノアッセイ法に関する。 本発明は、また、工程 （ａ）試験試料を核酸プローブと接触させ、前記プロー
ブは、CEAペプチド配列またはそれとハイブリダイゼー
ション可能な塩基配列をコードする塩基配列からなる核
酸からなり、そして （ｂ）得られたハイブリダイゼーションしたプローブの
形成を決定する、 を含んでなる試験試料中のCEAまたは関連する核酸（DNA
またはRNA）を検出する核酸ハイブリダイゼーション法
に関する。 本発明は、また、工程 ａ）動物またはヒトの患者に、本発明による標識された
（例えば、Ｘ線、放射線標識、あるいはＮΜＲで検出可
能な常磁性物質で標識した）抗体調製物を導入し、そし
て ｂ）患者におけるこのような抗体調製の存在を標識の検
出により検出する、 を含んでなる生体内で患者における癌胎児性抗原または
その機能的同等体の存在を検出する方法に関する。 他の面において、本発明は、本発明による抗体調製物
を治療的目的に使用すること、すなわち、抗体調製物を
放射線核種または毒素に取付けて複合体を形成し、そし
てこのような複合体の有効量を動物またはヒトの患者
に、例えば、注射により、導入すること、に関する。標
識した複合体は患者中のCEAに結合し、そして放射線核
種または毒素はCEAを発現する細胞を破壊する役目をす
るであろう。 いくつかのCEAエピトープは独特である。これらは、
種々のCEA様抗原を免疫学的に区別するために有用であ
ったエピトープである。ペプチドのエピトープは、抗原
の直線のアミノ酸配列および／または蛋白質のフォルデ
ィング（folding）から生ずる面によって定義される。
蛋白質のフォルディングに要求される情報は、一次アミ
ノ酸配列中にコードされる。したがって、抗原の差は、
究極的には、異なるCEA分子の一次構造における差から
生ずる。こうして、CEA種におけるCEA蛋白質中に存在す
る差は、一次アミノ酸配列の決定によって決定すること
ができる。これはCEAの遺伝子の各々をクローニングし
かつ配列決定することによって最も容易に達成される。
癌の診断にどの遺伝子生成物が最も有用であるかを決定
するために、独特プローブを各遺伝子のために選択する
ことができ、そして各遺伝子の発現を異なる腫瘍の型に
おいて核酸ハイブリダイゼーション技術によって決定す
ることができる。本発明は、CEA族の異なる構成員をコ
ードする潜在的遺伝子を同定し、そしてそれらのための
理論的一次アミノ酸配列を決定するために道具を提供す
る。自動化されたペプチド合成法を使用すると、これら
の抗原における独特配列の対応するペプチドを合成でき
る。これらのペプチドを使用して、これらの配列に対す
る抗体を生成することができ、これらの抗体は、無傷の
CEA分子において、免疫化された動物によって認識され
ることができない。これが達成されると、各抗原を測定
するための特異的なイムノアッセイを実施するために、
これらの抗原の差を利用することができる。 広範な種類の宿主／クローニングビヒクルの組み合わ
せを、本発明に従い調製された二本鎖核酸のクローニン
グに使用できる。例えば、有用なクローニングビヒクル
は、次のものから成ることができる：染色体、非染色体
および合成のDNA配列のセグメント、例えば、SV40の種
々の既知の誘導体および既知のバクテリアのプラスミ
ド、例えば、E.coliからのプラスミド、例えば、col E
1、pCR1、pBR322、pMB89およびそれらの誘導体、より広
い宿主範囲のプラスミド、例えば、RP4、およびファー
ジのDNA、例えば、ファージの多数の誘導体、例えば、N
M989、および他のDNAファージ、例えば、M13およびフィ
ラメンテアス（Filamenteous）一本鎖DNAファージおよ
びプラスミドとファージのDNAとの組み合わせから誘導
されるベクター、例えば、ファージDNAを使用するよう
に修飾されたプラスミドまたは他の発現制御配列または
酵母菌プラスミド、例えば、２μプラスミドまたはその
誘導体。有用な宿主は、次のものを包含することができ
る：バクテリアの宿主、例えば、E.coli、例えば、E.co
li HB 101、E.coli X1776、E.coli X2282、E.coli
MRC1およびシュードモナス（Pseudomonas）、バシル
ス スブチルス（Bacillus subtillus）、バシルス
ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophil
us）および他のE.coli、バシルス、酵母菌および他の菌
・カビ類、動物または植物の雑種、例えば、培養におけ
る動物（ヒトを含む）または植物の細胞または他の宿
主。もちろん、すべての宿主／ベクターの組み合わせが
同等に有効であるというわけではない。宿主／ベクター
の組み合わせの特定の選択は、本発明の範囲を逸脱しな
いで、記載する原理を正当に考慮した後、この当業者に
よってなされることができる。 さらに、各特定のクローニングビヒクルの範囲内で、
本発明による核酸の挿入のために種々の部位を選択する
ことができる。これらの部位は、通常、それらを切断す
る制限エンドヌクレアーゼによって表示される。例え
ば、pBR322において、Pst1部位はベーターラクタマーゼ
のための遺伝子中に、その蛋白質のアミノ酸181および1
82をコードするヌクレオチドのトリプレットの間に位置
する。pBR322において、２つのHind IIエンドヌクレア
ーゼ認識部位の１つはアミノ酸101および102をコードす
るトリプレットの間に存在し、そしていくつかのTag部
位の１つはベーターラクタマーゼのアミノ酸45をコード
するトリプレットに存在する。同様な方法において、こ
のプラスミドにおけるEcoR I部位およびPVU II部位は解
読領域の外側に存在し、そしてEcoR I部位は、それぞ
れ、テトラサイクリンおよびアンピシリンに対する耐性
をコードする遺伝子の間に位置する。これらの部位はこ
の分野においてよく認識されている。もちろん、本発明
において有用なクローニングビヒクルは、選択したDNA
断片の挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位を有す
る必要はないことを理解すべきである。その代わり、ビ
ヒクルを切断し、そして別の手段により断片に接合する
ことができる。 組換え核酸分子を形成するために選択した核酸断片を
取付けるための、ここにおいて選択したベクターまたは
クローニングビヒクル、とくに部位は、種々の因子によ
って決定され、それらの因子の例は、特定の制限酵素に
対して感受性の部位の数、発現すべき蛋白質の大きさ、
宿主細胞の酵素による蛋白質分解的減成に対する所望蛋
白質の感受性、精製の間の除去が困難な宿主細胞蛋白質
により発現される蛋白質の汚染、発現の特性、例えば、
ベクター配列に関する開始コドンおよび停止コドンの位
置、およびこの分野において認識されている他の因子で
ある。特定の遺伝子のためのベクターの挿入部位の選択
は、これらの因子のバランスによって決定され、すべて
の区画（section）が所定の場合に同等に有効であると
いうわけではない。 核酸配列をクローニングビヒクル中に挿入して組換え
核酸分子を形成する方法は、例えば、dA−dTテイリング
（tailing）、直接結合、合成リンカー、エキソヌクレ
アーゼおよびポリメラーゼ連結修復反応および引続く結
合、あるいは適当なポリメラーゼおよび適当な一本鎖鋳
型を使用する核酸の伸張および引続く結合を包含する。 また、クローニングビヒクルの選択した部位に挿入さ
れた核酸配列または核酸断片は、所望ポリペプチドまた
は成熟蛋白質のための実際の構造遺伝子の一部ではない
ヌクレオチドを含むことができるか、あるいは所望ポリ
ペプチドまたは成熟蛋白質のための完全な構造遺伝子の
断片のみを含むことができる。 異質遺伝子を含有するクローニングビヒクルまたはベ
クターを使用して適当な宿主を形質転換して、その宿主
がその異質遺伝子を複製できるようにしかつこの異質遺
伝子またはこの一部によって解読された蛋白質を発現す
ることができる。適当な宿主の選択は、また、ある数の
この分野で認識されている因子によって制御される。こ
れらは、例えば、選択したベクターとの適合性、ハイブ
リッドプラスミドによってコードされた蛋白質の毒性、
所望蛋白質の回収の容易さ、発現特性、生物安全性およ
びコストを包含する。特定の組換えDNA分子の発現のた
めにすべての宿主が同等に有効でないであろうことを理
解して、これらの因子はバランスされなくてはならな
い。 蛋白質の生成レベルは、２つの主要な因子によって支
配される：細胞内のその遺伝子のコピーの数およびそれ
らの遺伝子のコピーが転写および翻訳される効率。次
に、転写および翻訳（それらは一緒になって発現を構成
する）の効率は、通常所望解読配列より前に位置する、
ヌクレオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド配
列または発現制御配列は、なかでも、RNAポリメラーゼ
が相互作用して転写を開始し（プロモーター配列）およ
びリボソームがmRNA（転写の生成物）と結合しかつ相互
作用して翻訳を開始する位置を定める。このような発現
制御配列のすべてが同等の効率で機能するわけではな
い。こうして、所望蛋白質のための特異的解読配列をそ
れらの隣接ヌクレオチド配列から分離し、そしてそれら
を他の既知の発現制御配列の代わりに融合して発現のレ
ベルをより高くすることは有利である。これが達成され
ると、新しく操作された核酸、例えば、DNA、の断片
は、マルチコピーのプラスミドまたはバクテリオファー
ジの誘導体の中に挿入して、細胞内の遺伝子のコピーの
数を増加し、これによって発現された蛋白質の収率を改
良することができる。 いくつかの発現制御配列を前述のようにして使用でき
る。これらは、次のものを包含する:E.coliのラクトー
スオペロン（「lac配列」）のオペレーター、プロモー
ターおよびリボソームの結合および相互作用の配列（例
えば、SD配列のような配列を包含する）、E.coliのトリ
プトファンシンターゼ系の対応する配列（「trp
系」）、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモ
ーター領域（OLPLおよびORR'R）、フイラメンテアス（F
ilamenteous）一本鎖DNAファージの制御領域、あるいは
原核細胞または真核細胞およびそれらのウイルスの遺伝
子の発現を制御する他の配列。したがって、適当な宿主
における特定のポリペプチドの生成を改良するために
は、そのポリペプチドをコードする遺伝子を選択し、そ
してそれを含有する組換え核酸分子から除去し、そして
組換え核酸分子の中に、その前者の発現制御配列の近く
にあるいはそれと一層適当な相関関係で、あるいは前述
の発現制御配列に１つの制御の下に、再挿入することが
できる。このような方法はこの分野において知られてい
る。 ここにおいて使用するとき、「相関関係」は、多くの
因子、例えば、次のものを包含する：組換え核酸分子の
発現増大および促進領域および挿入された核酸配列を分
離する距離、ベクター自体における挿入された核酸配列
または他の配列の転写および翻訳の特性、ベクターの挿
入された核酸配列または他の配列の特定のヌクレオチド
配列、およびベクターの発現増大および促進領域の特定
の特性。 さらに、所望生成物の細胞の収率の増加は、細胞中で
利用できる遺伝子の数の増加に依存する。例示すると、
これは次のようにして達成される。操作した組換え核酸
分子を鋳型のバクテリオファージλ（ＮΜ989）の中に
挿入して、最も簡単にはプラスミドを制限酵素で消化し
て、線状分子を生成し、次いでこれを制限されたファー
ジλクローニングビヒクル［例えば、次の文献に記載さ
れている型のもの、N.M.ムレイ（Murray）ら、「生体外
組換え体の回収を簡素化するラムドイドファージ（Lamb
doid Phage That Simplify the Recovery of In
Vitro Ｒ ecombinants）」、モレキュラー・アンド
・ジェネラル・ジェニティックス（Molec.Gen.Gene
t.）、150、53−61ページ（1977）およびN.E.ムレイ（M
urray）ら、「バクテリオファージT4からのDNAリガーゼ
遺伝子の分子クローニング（Molecular Clonig of th
e DNA Ligaze Gene From Bacteriophage T4）、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mo
l.Biol.）、132、493−505ページ（1979）］と混合し、
そして組換え体DNA分子をDNAリガーゼとのインキュベー
ションにより再環状化する。次いで、所望の組換えファ
ージを前のように選択し、そしてE.coliの宿主菌株を溶
原化するために使用する。 とくに有用なλクローニングビヒクルは、抑制遺伝子
中に温度感受性突然変異体および遺伝子Ｓ中に抑制突然
変異体、その生成物は宿主細胞の溶解のために必要であ
る、および遺伝子Ｅ、その生成物はウイルスの主要なカ
プシド蛋白質である、を含有する。この系を用いると、
溶原性細胞を32℃で生長させ、次いで45℃に加熱してプ
ロファージの切除を誘発する。37℃において延長して生
長させると、細胞内に保持される蛋白質の生産レベルが
高くなり、これらは通常の方法でファージ遺伝子生成物
によって溶解されないので、およびファージ遺伝子のイ
ンサートは包膜されないので、それはそれ以上の転写の
ために利用可能にとどまる。次いで、細胞の人工的溶解
は高い収率で所望生成物を解放する。 さらに、本発明に従って調製されるポリペプチドの収
率は、また、存在するDNA配列のコドンの一部または全
部を異なるコドンで置換することによって改良すること
ができ、これらの置換されたコドンは置き代えられたコ
ドンによってコードされるものと同一のアミノ酸をコー
ドする。 最後に、本発明の組換え核酸分子によって生成された
ポリペプチドの活性は、本発明の範囲から逸脱しない
で、よく知られた手段によって、本発明の核酸配列また
はポリペプチドを断片化、修飾または誘導体化すること
によって改良することができる。 本発明のポリペプチドは、次のものを包含する： （１）前述の細胞によって発現されたポリペプチド、 （２）合成手段によって調製されたポリペプチド、 （３）上の（１）または（２）のポリペプチドの断片、
このような断片はアミノ酸の合成により、あるいは消化
または切断によって生成される。 本発明による合成ペプチドに関すると、ペプチドの化
学的合成は次の刊行物に記載されている:S.B.H.ケント
（Kent），バイオメディカル・ポリマー（Biomedical
Polymers），ゴールドバーグ（Goldberg）,E.P.および
ナカジマ、A.編（アカデミック・プレス、ニューヨー
ク）、213−242（1980）;A.R.ミッチェル（Mitchel
l）、S.B.H.ケント（Kent）、M.エンゲルハード（Engel
hard）およびR.B.メリフィールド（Merrifield）、ジャ
ーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J.Org.Ch
em.）、43、2845−2852（1978）;J.P.タム（Tam）、T.
−W.ウォング（Wong）、M.リーマン（Rieman）、F.−S.
ジョング（Tjoeng）およびR.B.メリフィールド（Merrif
ield）、テトラヘドロン・レターズ（Tet.Let.）、4033
−4036、（1979）;S.モジソブ（Mjsov）、A.R.ミッチェ
ル（Mitchell）およびR.B.メリフィールド（Merrifiel
d）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー
（J.Org.Chem.）、45、550−560（1980）;J.P.タム（Ta
m）、R.D.ジマーチ（DiMarchi）およびR.B.メリフィー
レド（Merrifield）、テトラヘドロン・レターズ（Tet.
Let.）、2851−2854、（1981）；およびS.B.H.ケント
（Kent）、M.リーメン（Riemen）、M.デ・ドウクス（De
Doux）およびR.B.メリフィールド（Merrifield）、蛋
白質配列の分析法についての第IV回国際シンポジウムの
会議録（Proceedings of the IV International S
ymposium on Methods of Protein Sequence Anal
ysis）、（ブルックヘブン・プレス、ブルックヘブン、
ニューヨーク）、イン・プレス、1981。 メリーフィールド（Merifield）の固相手順におい
て、Ｌ−アミノ酸の適当な配列はカルボキシ末端アミノ
酸からアミノ末端アミノ酸に構成される。樹脂のクロロ
メチル基、ベンズヒドリルアミン基または他の基への化
学結合を介してポリスチレン（または他の適当な）樹脂
へ取付けられた適当なカルボキシル末端アミノ酸を使用
して出発して、アミノ酸を次の手順に従い順番に付加す
る。ペプチド−樹脂を、 （ａ） 塩化メチレンで洗浄し、 （ｂ） 塩化メチレン中の５％（v/v）ジイソプロピル
エチルアミン（または他のヒンダード塩基）で室温にお
いて10分間中和し、 （ｃ） 塩化メチレンで洗浄し、 （ｄ） 生長するペプチド鎖のモル量の６倍に等しい量
のアミノ酸を、モル数の1/2倍の量のカーボジイミド
（例えば、ジシクロヘキシルカーボジイミド、またはジ
イソピルカーボジイミド）と10分間０℃において組み合
わせることによって活性化して、アミノ酸の対称無水物
を形成する。使用するアミノ酸は、本来、Ｎ−アルファ
−tert−ブチルオキシカルボニル誘導体として提供され
るべきであり、側鎖は、ペプチド合成において普通に使
用される、ベンジルエステル（例えば、アスパラギン酸
またはグルタミン酸）、ベンジルエーテル（例えば、セ
リン、スレオニン、システインまたはチロシン）、ベン
ジルオキシカルボニル基（例えば、リジン）または他の
保護基で保護されており、 （ｅ） 活性化アミノ酸をペプチド−樹脂と２時間室温
において反応させ、新しいアミノ酸を生長するペプチド
鎖の末端に付加させ、 （ｆ） ペプチド−樹脂を塩化メチレンで洗浄し、 （ｇ） Ｎ−アルファ−（tert−ブチルオキシカルボニ
ル）基を、最も最近付加されたアミノ酸から、塩化メチ
レン中の30〜65％（v/v）、好ましくは50％（v/v）のト
リフルオロ酢酸と室温において10〜30分間反応させるこ
とによって除去し、 （ｈ） ペプチド−樹脂を塩化メチレンで洗浄し、 （ｉ） 要求するペプチド配列が構成されてしまうま
で、工程（ａ）〜（ｈ）を反復する。 次いでペプチドを樹脂から除去し、そして同時に、10％
v/vのアニソールまたは他の適当な（芳香族）スキャン
ベンジャーを含有する無水フッ化水素酸との反応によっ
て、側鎖の保護基を除去する。引続いて、ペプチドをゲ
ル過、イオン交換、高圧液体クロマトグラフィー、ま
たは他の適当な手段によって精製する。 ある場合において、化学的合成は固相樹脂を用いない
で実施することができ、この場合において、合成反応は
完全に溶液中で実施される。反応はこの分野において同
様でありかつよく知られており、そして最終生成物は本
質的に同一である。 ポリペプチドの消化は、蛋白質分解酵素、ことにその
基質の特異性がアミノ酸の所望配列にすぐに隣接する部
位においてポリペプチドを切断する酵素を使用すること
によって達成できる。 ポリペプチドの切断（cleavage）は化学的手段によっ
て達成できる。アミノ酸間の特定の結合は、特異的試薬
との反応によって切断できる。実施例は次のものを包含
する：メチオニンを含む結合は臭化シアンによって切断
される；アスパラギニル−グリシン結合はヒドロキシル
アミンによって切断される。 合成ペプチド類およびそれらに対する抗体をつくる目
的に対して重要であることと信じられる配列の非制限的
列挙は、次の通りである。各抗原は３つのレベルにカテ
ゴリー化される:1）内部に潜在的に有用な部位を含有す
る大きい領域;2）１のサブ領域および;3）合成ペプチド
抗原としての使用するためのプライムターゲツトである
と考えられる個々の部位。 本発明は次の利点を有する： （１）本発明によるCEAをコードする核酸は、その一部
分である完全な遺伝子を分離するためのプローブとして
使用できる。 （２）それはCEA遺伝子族の他の構成員を分離するため
のプローブとして使用できる。 （３）それは種々の腫瘍の型におけるこの遺伝子の発現
を決定するためにオリゴヌクレオチドプローブとして使
用できる。 （４）このヌクレオチド配列は、合成ペプチドの生成の
ための蛋白質の一次アミノ酸配列を予測するために使用
することができ、そしてCEA族の構成員を区別するため
に使用できる。 （５）上の配列から誘導された合成ペプチドは、配列特
異的抗体を生成するために使用できる。 （６）CEA族の各構成員についてのイムノアッセイは、
これらの配列特異的抗体および合成特異的ペプチドを用
いて生成することができる。 （７）CEA族の異なる構成員が異なる型の癌のための臨
床的に有用なマーカーであることが決定された場合、こ
れらのイムノアッセイは異なる型の癌のための診断に使
用できる。 本発明によるポリペプチドは、慣用の手段により、放
射線部分、例えば、I125、酵素、色素および蛍光性化合
物を使用して標識することができ、これらの標識は単な
る例である。 本発明によるイムノアッセイのためのいくつかの可能
な立体的配置を使用できる。これらのアッセイにおいて
使用できる読出し系は多数存在し、そしてこのような系
の非制限的例は、蛍光性および比色の酵素系、ラジオア
イソトープ標識および誘導体および化学ルミネセンス系
を包含する。イムノアッセイ法の２つの例は、次の通り
である： （１） 本発明による抗体調製物（それらから誘導され
たFabまたはＦ（ab）’断片を含む）を使用する酵素結
合イムノアッセイ（ELISA）、固相（例えば、マイクロ
タイター板またはラテックスのビーズ）に、酵素に接合
するもの以外の特異的をもつ精製された抗CEA抗体を取
付ける。この固相抗体をCEAを含有する試料と接触させ
る。洗浄後、固相抗体−CEA複合体を、接合した抗ペプ
チド抗体（または接合した断片）と接触させる。結合し
ない接合体を洗浄除去した後、酵素のための発色性また
は蛍光発生性の基質を添加することによって、色または
蛍光を発生させる。発生した色または蛍光は、試料中の
CEAの量に比例する。 （２） 蛍光的に標識されたペプチドまたはcLV7によっ
て特定化された配列の合成ペプチドを使用する競合蛍光
測定イムノアッセイ。この実施例において、細胞によっ
て発現された精製されたペプチドまたはその合成ペプチ
ドを蛍光的に標識する。固相に、精製された抗CEA抗体
を取付ける。次いで、蛍光性ペプチドプローブが添加さ
れているCEA含有試料とこの固相を接触させる。結合
後、過剰のプローブを洗浄除去し、結合したプローブの
量を定量する。結合した蛍光性プローブの量は、試料中
のCEAの量に対して反比例する。 本発明による核酸ハイブリダイゼーション法におい
て、核酸プローブを標識、例えば、酵素、蛍光団、ラジ
オアイソトープ、化学ルミネセント化合物などと接合す
る。最も一般的場合において、プローブを試料と接触さ
せ、そしてハイブリダイゼーション可能な核酸配列の存
在は、発色性酵素基質の存在下に発色させ、蛍光をエピ
フルオレセンス（epifluorescence）により検出するこ
とにより、ラジオアオソトープで標識されたプローブの
オートラジオグラフィーにより、または化学ルミネセン
スにより検出することができる。ハイブリダイゼーショ
ン可能なRNA配列の検出は、（１）ドットブロット法ま
たは（２）インシトウ（in situ）ハイブリダイゼーシ
ョン法によって達成することができる。これらの最後の
２つの技術についての方法は、それぞれ、次の文献に記
載されている:D.ギレスピー（Gillespie）およびJ.ブレ
ッサー（Bresser）、「Na I中のmRNAの固定化（mRNA I
mmobilization in Na I）：クイック・ブロッツ（Qui
ck Blots）」、バイオテクニークス（Biotechnique
s）、184−192、11月/12月、1983およびJ.ロウレンス
（Lawrence）およびR.シンガー（Singer）、「サイトス
ケタル蛋白質についてのメッセンジャーRNA類の細胞内
局在化（Intracellurar Localization of Messenger
RNAs for Cytosketal Proteins）」、細胞（Cel
l）、45、407−415、５月９日、1986。読出し系は前述
のものと同一であり、例えば、酵素標識、放射線標識な
どである。 前述のように、本発明は、また、本発明の前述の複合
体の薬物中の使用に関する。 本発明は、活性成分として、本発明の複合体を固体、
液体または液化ガスの希釈剤と混合して含有する製薬学
的組成物を提供する。 本発明は、さらに、活性成分として、本発明の複合体
を含有する、無菌および／または薬理学的に等張の水溶
液の形態の製薬学的組成物を提供する。 本発明は、また、本発明の複合体を含んでなる投与単
位の形態の薬物を提供する。 本発明は、また、本発明の複合体を含んでなる錠剤
（ロゼンジおよび顆粒を包含する）、糖剤、カプセル
剤、カプレット、ピル、アンプルおよび坐薬の形態の薬
物を提供する。 「薬物」は、ここで使用するとき、医学的投与に適す
る物理的に離散した凝集性の部分を意味する。「投与単
位形態の薬物」は、ここで使用するとき、各々が本発明
の化合物の１日量または１日量の多数倍または約量を担
体と一緒におよび／またはエンベロープ内に包装して含
有する、医学的投与に適する物理的に離散した凝集性の
部分を意味する。 本発明による製薬学的組成物は、例えば、水性または
非水性の希釈剤中の懸濁液、溶液または乳濁液、シロッ
プ、顆粒または粉末の形態を取ることができる。 錠剤、糖剤、カプセル剤、カプレットおよびピルに形
成するために適合する製薬学的組成物（例えば、顆粒）
中に使用する希釈剤は、次のものを包含する：（ａ）充
填剤および増量剤、（ｂ）結合剤、（ｃ）湿潤剤、
（ｄ）崩壊剤、（ｅ）溶解遅延剤、（ｆ）吸着促進剤、
（ｇ）表面活性剤、（ｈ）吸着性担体、（ｉ）潤滑剤。 本発明の製薬学的組成物から形成される錠剤、糖剤、
カプセル剤、カプレットおよびピルは、慣用の被膜、エ
ンベロープおよび保護マトリックスを有することがで
き、これらは不透明化剤を含有することができる。それ
らは、活性成分を腸管のみに、あるいは、好ましくはそ
の特定の部分に、可能ならばある期間にわたって、放出
するように構成することができる。 活性成分は、また、前述の希釈剤の１種または数種と
一緒にマイクロカプセルの形態に構成することができ
る。 非経口的投与のために、溶液および乳濁液は無菌であ
り、そして、適当ならば、血液等張性であるべきであ
る。 本発明の複合体に加えて、本発明による製薬学的組成
物および薬物は、また、他の製薬学的に活性な化合物を
含有することができる。 本発明の薬物を構成する離散した凝集性の部分は、一
般に、それらの形状または包装のおかげで、医学的投与
に適合し、そして、例えば、次のいずれであることもで
きる：錠剤（ロゼンジおよび顆粒を包含する）、ピル、
糖剤、カプセル剤、カプレット、坐薬およびアンプル。
これらの形態のあるものは、活性成分の遅延した放出の
ために構成することができる。ある、このようなカプセ
ル剤は、薬物の一部分を物理的に離散しかつ凝集性とす
る保護的エンベロープを含むことができる。 前述の製薬学的組成物および薬物の調製は、この分野
において知られた任意の方法により、例えば、活性成分
を希釈剤と混合して製薬学的組成物（例えば、顆粒）を
形成し、次いでこの組成物を薬物（例えば、錠剤）に形
成することによって実施される。 活性複合体は、経口的に、非経口的に（例えば、筋肉
内に、腹腔内に、皮下に、あるいは静脈内に）、経直腸
的にまたは局所的に投与することが考えられる。 実施例 実施例１〜８ CEA−ＡをコードするLV7の調製 実施例１ RNAの調製 腫瘍メッセンジャーRNAを、J.ファボラロ（Favolar
o）、E.トレイスマン（Treisman）およびR.ケイメン（K
amen）、メソッズ・イン・エンジモロジー（Methods i
n Enzymology）、65、718、アカデミック・プレス・イ
ンコーポレーテッド（1980）のプロイテナーゼＫ−フェ
ノール抽出法によって調製し、次いでオリゴdTセルロー
スクロマトグラフィーによってポリＡ＋RNA（ポリペプ
チドに翻訳できるほとんどのmRNAを含有する3'−ポリア
デニル化真核生物RNA）を生成した。ほぼ1.2mgのポリＡ
＋RNAを得るために、後期の対数生長後、ほぼ５×109の
ロボ（Lovo）細胞（ATCC CCL 229）を100×850cm3の
ローラーびんから収穫した。細胞を140ミリモルのNaC
l、1.5ミリモルのMgCl2、10ミリモルのトリス−HCl、pH
8、0.5％のNP40、４ミリモルのジチオスレイトールおよ
び20単位/mlの胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤の氷冷溶液
中の均質化によって溶解した。次いで、ナトリウムデオ
キシコレートを0.2％に添加した。細胞質および核は、
ホモジネートを12,000×ｇにおいて20分間遠心すること
によって分離した。細胞質の分画を等体積の0.2モルの
トリス−HCl、25ミリモルのEDTA、0.3ミリモルのNaCl、
２％のドデシル硫酸ナトリウムおよび400μl/mlのプロ
イテナーゼＫと混合し、１時間37℃でインキュベーショ
ンし、次いで等体積のエタノール／クロロホルム（1:1/
v:v）溶液で１回抽出した。核酸は分離した水相のエタ
ノール沈殿により得た。合計のRNAは、ポリＡ＋RNAにつ
いて、0.5モルのNaCl、10ミリモルのトリス−HCl、pH7.
8、0.1％のサルコシル中でオリゴdT（12−18）セルロー
スカラムに通過させることによって濃縮した。洗浄後、
結合したRNAを、塩化ナトリウムの不存在下に同一溶液
で溶離した。 実施例２ mRNAの逆転写 ５μｇのポリＡ＋Lovo RNAを、オリゴdT（12−18）
で逆転写についてプライミングした。50μｌの反応を90
分間42℃において75単位のAMV逆トランスクリプターゼ
（ライフ・サイエンシズ・インコーポレーテッド、米国
フロリダ州、セントペテルスバーグ）を使用して実施し
た。RNAをアルカリ性加水分解により除去し、そして一
本鎖cDNAを、それぞれ、DNAポリメラーゼＩおよびT4DNA
ポリメラーゼの大きい断片（クレノー）とともにインキ
ュベーションすることによって一本鎖および平滑末端
（blunt end）とした。 実施例３ pLV7（プラスミドLV7）のクローニグ 合成EcoR I DNAリンカー（5'pGGAATTCC 3'）を、実
施例２に記載するようにして調製したcDNAの末端に、過
剰のT4DNAリガーゼ［20ウェイス（Weiss）単位］との平
滑末端結合によって取付けた。過剰のリンカーを［セフ
ァデックス（SEPHADEX）」Ｇ−50のゲル透過クロマトグ
ラフィーによって除去し、EcoR I制限酵素による切断お
よびA15m（バイオラド、ラボラトリーズ、米国カリフォ
ルニア州リッチモンド）のアガロース排除クロマトグラ
フィーによる分画によって、EcoR I接着末端（stiky e
nd）を発生させた。500bpより大きいDNA断片を、アガロ
ースゲルの大きさ分類後に、選択し、95％のエタノール
で沈殿させた。DNAを小さい体積の10ミリモルのトリス
−HCl、pH7.8、１ミリモルのEDTA中に再懸濁し、そして
等モル量のラムダgtl1の5'ホスファターゼ化EcoR I末端
アーム（プロメガ・バイオテク、米国ウィスコンシン州
マディソン）に添加した。このファージは有利な性質を
もち、ラムダgtl1のEcoR I部位に挿入された異質DNAは
ベーターガラクトシダーゼ融合蛋白質の一部として翻訳
され、これはCEAに対する抗体との免疫反応性について
スクリーニングすることができる。DNAをT4DNAリガーゼ
の存在下に100〜200μl/mlの濃度において24時間結合し
た。３μｌの結合したDNAを生体外ラムダパケージング
混合物（packaging mix）（ストラタジーン、米国カリ
フォルニア州サンディエゴ）に添加し、そしてパーケー
ジングされた粒子をE.coli宿主y1088（ATCC 27195）の
感染によってアッセイした。400万のファージのうち
で、120万はcDNAインサートを有することがベーターガ
ラクトシダーゼの相補性によって決定された。 実施例４ 免疫ブロッティングによる融合ポリペプチドのスクリー
ニング ５万のファージを、E.coliY1090（ATCC 37197）上
で、10ミリモルのMgSO4および100μg/mlのアンピシリン
を含むLB−ブロスを含有する12枚の150mmの皿の各々に
おいてスクリーニングのために配置した。ある場合にお
いて、ファージのストック（stock）は、スクリーニン
グ前に、増幅および力価決定（titering）によって調製
した。ファージを42℃で４時間溶解的に生長させ、次い
で10ミリモルのIPTG（イソプロピルチオガラクトシド）
で含浸したニトロセルロースの円形体を皿の上に配置
し、そして37℃でさらに２時間インキュベーションし
た。この期間の間、融合蛋白質の合成は誘発され、そし
てニトロセルロースのマトリックスへ吸収された蛋白質
を変性ELISAフォーマットにおいてスクリーニングし
た。出願人のライブラリーにおいて、あるLovo蛋白質は
CEAまたはCEA関連エピトープの一部分を発現することが
でき、この部分は適当な抗体によつて認識することがで
きる。出願人は、自然のCEA（180kd）に対して向けられ
た商業的に入手可能な抗血清および還元しかつアルキル
化されたCEAに対して会社内で調製された抗血清を利用
して、フィルター上で抗原を検出した。これらのウサギ
のポリクローナル抗血清をPBS/T（0.05％の「ツイーン
−20」および0.01％のチメロサルを含有するリン酸塩緩
衝化食塩水（50ミリモルのNaリン酸塩、pH7.3、150ミリ
モルのNaCl））中で希釈し、そして２時間インキュベー
ションしてニトロセルロースの円形体へ付着する蛋白質
を認識できるようにした。過剰の抗体を除去し、そして
融合蛋白質へ結合したウサギIgG分子を、アルカリ性ホ
スファターゼと接合したマウス抗ウサギIgG抗体によっ
て検出した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
ホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムの存在
下に、色を検出した。暗色に着色するプラークの像をマ
ークし、そして潜在的な陽性の区域の回復についてマス
ターファージ平板で検索（key）した。反復した希釈、
免疫ブロッティングによるスクリーニングおよびアッセ
イの増幅後に、抗CEA反応性ペプチドを発現しつづける
ファージを使用してDNAを調製した。 実施例５ DNAの操作 T.マニアチス（Maniatis）、E.F.フイツリトシ（Frit
sch）およびJ.サムブルック（Sambrook）、モレキュラ
ークローニグ、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecu
lar Cloning,A Laboratory Mannual）、コールド・
スプリング・ハーバー、（1982）に従い、ファージDNA
を調製した。DNAのセグメントを低融点のアガロースゲ
ルから分離し、そしてブルースクライブ（Bluescribe）
プラスミドベクター（ストラトギーン、米国カリフォル
ニア州サンディエゴ）中のサブクローニグのために挿入
した。DNAの配列決定は、F.サンガー（Sanger）、S.ニ
ックレン（Nicklen）およびA.R.クールソン（Coulso
n）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）US
A、74、5463−5467、（1977）のジデオキシ停止法によ
って実施した。 実施例６ 酵素イムノアッセイによるラムダcLV7（cDNA LV7）に
おけるCEA反応性の検出 ラムダcLV7をE.coliY1089中において20分間イソプロ
ピルチオガラクトシドで誘発し、そして37℃において１
時間生長させた。細胞を５分間ベックマン・マイクロフ
ージ（Beckman Microfuge）中で室温において遠心し
た。細胞をもとの体積の１％で、10μg/mlのロイペプチ
ンおよびペプスタチン、10ミリモルのEDTA、１ミリモル
のフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび0.01％の
チメロサルを含有する50モルのトリス−HCl、pH7.5、中
に懸濁させた。細胞を−80℃で凍結し、融解し、そして
０℃で６分間超音波処理した。超音波処理した懸濁液を
遠心し、そして上澄みの流体を酵素結合イムノアッセイ
によりCEA免疫反応性についてアッセイした。リンブロ
（Linbro）96ウェルのマイクロタイタープレートを、40
0ngのマウスのモノクローナル抗ベータガラクトシダー
ゼ抗体で４℃において一夜被覆した。結合しない抗体を
洗浄除去し、そしてプレートをPBS/T（0.05％の「ツイ
ーン−20」および0.01％のチメロサルを含有するリン酸
塩緩衝化食塩水（50ミリモルのNaリン酸塩、pH7.3、150
ミリモルのNaCl））で室温において３時間ブロッキング
した。超音波処理した細胞からの上澄みをPBS/T中で希
釈し、そして100μｌの希釈した抗原を抗体被覆ウェル
に添加した。室温において２時間インキュベーションし
た後、結合しない抗原を洗浄除去し、そして希釈したウ
サギ抗CEA抗体を100μｌのPBS/T中において添加した。
次いで、プレートを２時間室温においてインキュベーシ
ョンした。洗浄後、各ウェルにPBS/T中のヤギ抗ウサギI
gGからの100μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ接
合Igを添加した。室温において２時間インキュベーショ
ンした後、ウェルを洗浄し、そしてペルオキシダーゼの
基質（3,3,5,5'−テトラメチルベンジジンおよび過酸化
水素）５分間添加した。50μｌの８モルの硫酸の添加に
より、発色反応を停止した。450nmの吸収を各ウェルに
ついて決定した。第２図の四角形（open square）は、
前述のような融合蛋白質抗原を加えたウェルを表わす。
＋のデータ点は、上のように処理したが、希釈した融合
蛋白質抗原の代わりに100μｌのPBS/Tを加えたウェルを
表わす。 実施例７ ラムダLV7融合蛋白質の免疫化学的同定 融合蛋白質を含有するE.coliY1089リゼイトを、U.K.
ラエムリ（Laemmli）、ネイチャー（Nature）、227、68
0−685（1970）の方法に従いSDS−PAGE上に展開した。1
0％のアクリルアミドゲル上の電気泳動後、蛋白質は電
気泳動的にニトロセルロースへ移行した。移行後、フィ
ターをPBS/T中でブロッキングした。免疫ブロットを、
ウサギ抗CEAおよび、ヤギ抗ウサギIgGからのセイヨウワ
サビペルオキシダーゼ接合IgGを使用する順次のインキ
ュベーションによって展開した。洗浄後、移行体を４−
クロロ−１−ナフトールとともにインキュベーションし
て帯を可視化した。第３図においてレーン１は対照、す
なわち、ファージを含まないE.coliリゼイドである。第
３図におけるレーン２はラムダcLV7融合蛋白質を含有す
るリゼイトである。第３図の左側の番号は、蛋白質の標
準の移動度および分子量（キロダルトン）を示す。第３
図の右側の番号は、ラムダLV7融合蛋白質（上のしる
し）およびE.coliベータ−ガラクトシダーゼサブユニッ
ト（下のしるし）の計算した分子量および移動度を示
す。 実施例８ cLV7特異的ポリＡ＋RNAの検出 細胞質のポリＡ＋RNAを、Lovo腫瘍細胞からおよびリ
ンパ芽球様系統GM1989（対照の細胞系）から調製した。
５μｇの各RNAを変性し、そして１％のアガロース−2.2
モルのホルムアルデヒドのゲル中で電気泳動させ、次い
でニトロセルロース紙に移した。次いで、移したブロッ
トを２×SSPE、５×デンハルト、50μg/mlの変性サケ精
子DNA中において68℃で18時間のわたって、32P放射線cL
V7DNAと対抗させた。ブロットを0.2×SSPE、0.25％のSD
S中で68℃において２時間洗浄し、次いで「KODAK」Ｘ−
ARフィルム上で２枚の増強スクリーンを使用してオート
ラジオグラフィーにかけた。RNAの大きさマーカー（BRL
インコーポレーテッド、米国マリイランド州ガイサース
バーグ）をアガロースゲルの隣接ウェル中で同時に電気
泳動し、そして0.04％のメチレンブルーで着色すること
によって可視化した。 結果 Lovo cDNA分子から独立に誘導し、ラムダgtl1発現ベ
クター系中に挿入されかつ抗CEA免疫反応性についてポ
リペプチドとしてスクリーニングしたほぼ100万のうち
で、２つの陽性のクローンを分離した。インサートをブ
ルースクライブ（＋）プラスミドクローニグベクターの
EcoR I部位中にサブクローニグし、そしてこれらの１
つ、pcLV7と表示する、をさらに分析した。pcLV7を含有
するEscherichia coli中のプラスミド、ATCC No.6716
9は、1986年７月30日にアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（American Type Culture Collect
ion）（「ATCC」）に受託された。DNA配列の分析によ
り、このクローンのインサートの大きさは859bpであ
り、そしてその配列は第１図に示されている。上の線は
pcLV7のオープンリーデイングフレームのヌクレオチド
配列を表わす。その下は、それをコードするペプチド配
列である。ここにおけるcDNAクローンを表示するために
使用する一般用語はcLV7またはLV7である。この用語に
付加するとき、接頭文字ラムダ−またはｐ−は、このク
ローンが、それぞれ、ラムダファージまたはプラスミド
の中に挿入されたことを意味する。 実施例９〜13 CEA−Ｂをコードする1LV7 cDNAの調製 実施例９ RNAの調製 LV7 cDNAについての実施例１の手順と同一の手順
を、1LV7 cDNAについて従う。 実施例10 mRNAの逆転写 50μｇのポリＡ＋RNAを、逆転写のために、オリゴdt
（12−18）およびランダムデオキシヘキサマーでプライ
ミングした。350μｌの反応を、900単位のAMV逆トラン
スクリプターゼ（ライフ・サイエンシズ・インコーポレ
ーテッド、米国フロリダ州、セントペテルスバーグ）と
ともに、42℃で2.5時間インキュベーションした。次い
で、cDNA/RNAハイブリッドのRNA成分を、RNアーゼＨ、
E.coli DNAポリメラーゼＩおよびE.coli DNAリガーゼ
で、12℃および22℃において各々1.5時間処理すること
によって、cDNA相補性鎖で置換した。分子の末端をT4DN
Aポリメラーゼでポリッシングした（polished）。 実施例11 pLV7のクローニグ 引続く消化工程からの新しく合成されたcDNAに対して
内部のEcoR I部位を保護するために、合計のcDNAを80μ
モルのＳ−アデノシルメチオニンの存在下に37℃におい
て１時間処理した。２〜5kbの大きさの範囲のcDNAセグ
メントを切除し、ゲルのスライスから抽出し、そして10
0倍モル過剰量の合成EcoR Iリンカー（5'pdGGAATTCC
3'）の存在下にT4DNAリガーゼとともにインキュベーシ
ョンした。過剰のリンカーをセファデックスＧ−25（中
程度）のゲル透過クロマトグラフィーにより除去し、そ
してEcoR I接着末端をEcoR I制限酵素の切断によって発
生させた。EcoR I末端cDNAセグメントを、T4DNAリガー
ゼの存在下に５℃において一夜、バクテリオファージの
ベクターのラムダgtl1のEcoR I切断およびホスファター
ゼのアームとともにインキュベーションした。次いで、
結合混合物のアリコートを生体外パッケージング抽出物
（ストラタジーン、米国カリフォリニア州サンディエ
ゴ）と混合し、そしてファージの粒子をE.coliY1089細
胞上で滴定した。 実施例12 ハイブリダイゼーションによる組換え体のスクリーニン
グ 生体外パッケイジングしたライブラリーからの５万の
ファージ（pfu）を、1.4％の寒天、10ミリモルのMgSO4
および100μg/mlのアンピシリンを含有する４枚の150mm
のLBプレートの各々の上に配置した。ファージの大きさ
が直径0.2〜0.5mmとなるまで、ファージに宿主細胞を溶
解させた。次いで、プレートを冷却し、そしてW.D.ベン
トン（Benton）およびR.W.デイビス（Davis）、「単一
プラークへのインシトウのハイブリダイゼーションによ
るラムダGT組換え体クローンのスクリーニング（Screen
ing Lambda GT Recombinant Clones by Hybridiz
ation to Single Plaques In Situ）」、サイエン
ス（Science）、196、180−182、（1977）の方法によ
り、ニトロセルロースのフィルターのレプリカを、調製
した。フィルターを２×SSPE、５×デンハルト、0.1％
のSDS、100μg/mlの変性サケ精子DNA中で予備ハイブリ
ダイゼーションし、そしてハイブリダイゼーションし、
ハイブリダイゼーションのため、2ng/mlの32P標識cLV7
インサートDNAを使用した。非特異的DNAハイブリダイゼ
ーションを0.5×SSPE、0.25％のSDS中のフィルターの洗
浄により除去した。陽性のプラークをオートラジオグラ
フィーにより検出し、取り上げ、そして放射線標識プロ
ーブを使用して２回の追加の連続のハイブリダイゼーシ
ョンについてスクリーニングした。 実施例13 DNAの操作 実施例12からの陽性のプラークのインサートをバクテ
リアのプラスミドのベクター中に導入し、そしてエンド
ヌクレアーゼIII発生二本鎖セグメントをジデオキシ末
端法によって配列決定した。DNA配列をプステル（Puste
ll）DNA配列分析プログラム（IBIインタナショナル、米
国コネチカット州ニューヘブン）を使用してコンピュー
ターによって分析した。 結果 Lovo cDNA分子から独立に誘導し、ラムダgtlIベクタ
ー系中に挿入されかつ放射線標識したLV7プローブとの
反応性についてスクリーニングしたほぼ20万のうちで、
40の陽性のクローンを分離した。これらのうちの最大
（ほぼ3Kb）を配列決定し、その核酸および蛋白質の配
列を第５図に記載する。 Pc1LV7を含有するEscherichia coli中のプラスミ
ド、ATCCNo.67312は、1987年２月６日にアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（American Type Cu
lture Collection）（「ATCC」）に受託された。 DNA配列の分析により、このクローンのインサートの
大きさは2839bpであり。そしてその配列は第５図に示さ
れている。上の行はp1LV7のオープンリーディングフレ
ームのヌクレオチド配列を表わす。その下は、それをコ
ードするペプチド配列である。ここにおけるcDNAクロー
ンを表示するために使用する一般用語はc1LV7または1LV
7である。この用語に付加するとき、接頭文字ラムダ−
またはｐ−は、このクローンが、それぞれ、ラムダファ
ージまたはプラスミドの中に挿入されたことを意味す
る。 実施例14 CEA−ＣをコードするcFL−CEAのクローニグおよび配列
決定 バクテリオファージのベクターのラムダgtl1中の胎児
肝臓cDNAの２×105の独立のインサートを含有する組換
え体ライブラリー（クロンテク、米国カリフォルニア州
バロアルト）を、W.D.ベントン（Benton）およびR.W.デ
イビス（Davis）、サイエンス（Science）、196、180−
182、（1977）に従い放射線ラベルLV7でスクリーニング
した。単一の陽性クローンを選択し、そしてEcoR Iイン
サートをプラスミドのベクターのブルースクリプトKS＋
（ストラタジーン、米国カリフォルニア州サンディエ
ゴ）中にサブクローニグした。検出クローンを両方向に
おいて調製し、そしてF.サンガー（Sanger）、S.ニック
レン（Nicklen）およびA.R.クールソン（Coulson）、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、74、54
63−5467、（1977）のジデオキシ停止法により配列決定
した。このクローン、FL5と表示する、は翻訳停止シグ
ナルの欠如によって判断して不完全であった。Ｆ＋５の
3'末端から誘導される単一のコピーのプローブを使用し
て、前述の商用胎児肝臓ライブラリーを再スクリーニン
グした。５つの陽性のクローンが得られ、インサートを
ブルースクリプトKS＋ベクター中にクローニグし、そし
て最大のFL4と表示するものを配列決定した。これらの
２つのcDNAプラスミド、FL5およびFL4は重複し、そして
一緒に、FL−CEAとここで表示するポリペプチドの全オ
ープンリーディングフレームを含有する。FL−CEAの翻
訳した配列は、次の通りである： 残留配列について、第１アミノ酸がGlnであり、これ
は核酸190の下に存在する。その後、アミノ酸には連続
番号が付されている。 実施例15〜19 CEA−ＤをコードするcBT−20のクローニグおよび配列決
定 実施例15 RNAの調製 腫瘍メッセンジャーRNAを、J.ファボラロ（Favolar
o）、E.トレイスマン（Treisman）およびR.ケイメン（K
amen）、メソッズ・イン・エンジモロジー（Methods i
n Enzymology）、65、718、アカデミック・プレス・イ
ンコーポレーテッド（1980）のプロイテナーゼＫ−フェ
ノール抽出法によって調製し、次いでオリゴdTセルロー
スクロマトグラフィーによってポリＡ＋RNAを生成し
た。ほぼ100μｇのポリＡ＋RNAを得るために、1g（湿潤
重量）のBT−20細胞（ATCC HTB 19）を20mlの氷冷RNA
溶解緩衝液（140ミリモルのNaCl、1.5ミリモルのMgC
l2、10ミリモルのトリス−HCl、pH7.8、0.5％のNP−4
0、４ミリモルのジチオスレイトールおよび20単位/mlの
胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤）中に再懸濁しかつ溶解し
た。ナトリウムデオキシコレートを0.2％に添加した。
細胞質および核は、ホモジネートを12,000×ｇにおいて
20分間遠心することによって分離した。細胞質の分画を
等体積のPK緩衝液（0.2モルのトリス−HCl、25ミリモル
のEDTA、0.3ミリモルのNaCl、２％のドデシル硫酸ナト
リウムおよび400μg/mlのプロイテナーゼＫ）と混合
し、２時間37℃でインキュベーションし、次いで等体積
のフェノール／クロロホルム（1:1/v:v）溶液で１回抽
出した。核酸は分離した水相のエタノール沈殿により得
た。合計のRNAは、ポリＡ＋RNAについて、0.5モルのNaC
l、10ミリモルのトリス−HCl、pH7.8、0.1％のサルコシ
ル中でオリゴdT（12−18）セルロースカラムに通過させ
ることによって濃縮した。洗浄後、結合したRNAを、塩
化ナトリウムの不存在下に同一溶液で溶離した。 実施例16 mRNAの逆転写 10μｇのポリＡ＋BT−20 RNAを、オリゴdT（12−1
8）およびpdN6で逆転写のためにプライミングした。100
μｌの反応を４時間42℃において200単位のAMV逆トラン
スクリプターゼ（ライフ・サイエンシズ・インコーポレ
ーテッド、米国フロリダ州、セントペテルスバーグ）を
使用して実施した。cDNA/mRNAハイブリッドのRNA成分
を、12℃および22℃において各々1.5時間RNアーゼ、E.c
oli DNAポリメラーゼＩおよびE.coli DNAリガーゼで
処理することによって、第２相補性鎖で置換した。分子
の末端をT4DNAポリメラーゼの処理によって平滑にし
た。cDNAをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノ
ール沈殿し、そして10ミリモルのトリス−HCl、pH7.8、
１ミリモルのEDTA（TE）中で調製した「セファデックス
Ｇ−20」スパン（spun）カラムで精製した。 実施例17 cBT20のクローニグ 合成DNAリンカー を、cDNAの末端に、過剰のT4DNAリガーゼとの平滑末端
結合によって取付けた。過剰のリンカーをTE中において
「セファデックス Ｇ−50」（中程度）のクロマトグラ
フィーおよび0.8％の低融点のアガロースゲルの分画に
よつて除去した。BT−20細胞系のポリＡ＋RNAのノザン
ブロットに基づいて、CEA関連mRNAの大きさは3.0kbと推
定された。したがって、２〜4kbの間のcDNA断片を、ゲ
ルのスライスから回収し、そしてエタノール沈殿した。
TE中のcDNAの再懸濁後、EcoR I切断ラムダgt10アームを
1:1の推定モル比においてcDNAへ付加した。結合をT4DNA
リガーゼの存在下に７℃において２日間進行させた。標
識反応のアリコートを商業的に得られるパッケージング
混合物（ストラタジーン、米国カリフォルニア州サンデ
ィエゴ）にラムダ粒子の調製のために添加した。生体外
のパッケージングおよびE.coli宿主ＮΜ514の感染後、5
00万のファージ粒子が得られた。 実施例18 組換え体のライブラリーのスクリーニング 50万のパツケージングされたラムダ粒子をE.coli NM
514の菌叢上に配置し、複製のパターンを、W.D.ベント
ン（Benton）およびR.W.デイビス（Davis）、サイエン
ス（Science）、196、180−182、（1977）に記載されて
いるようにニトロセルロースのシート上に持上げた。種
々のCEA族の構成員の間の反復領域を含有する、32 P標識LV7 cDNAインサートのプローブとのハイブリダ
イゼーションにより、陽性のファージを選択した。この
選択法によって、多数回の連続的スクリーニング後に、
12の陽性のファージが得られた。個々のプラークからの
ファージを増幅し、力価決定し、そしてこれらを使用し
て少量の組換え体ファージDNAを調製した。 実施例19 DNAの操作 T.マニアチス（Maniatis）、E.F.フリトシ（Fritsc
h）およびJ.サムブルック（Sambrook）、モレキュラー
・クローニグ、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecu
lar Cloning,A Laboratory Mannual）、コールド・
スプリング・ハーバー、（1982）に従い、ファージDNA
を調製した。DNAのセグメントを低融点のアガロースゲ
ルから分離し、そしてブルースクプト（Bluescript）プ
ラスミドベクター（ストラトジーン、米国カリフォルニ
ア州サンディエゴ）中のサブクローニングのために挿入
した。DNAの配列決定は、F.サンガー（Sanger）、S.ニ
ックレン（Nicklen）およびA.R.クールソン（Coulso
n）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）US
A、74、5463−5467、（1977）のジデオキシ停止法によ
って実施した。BT20についての翻訳された配列は次の通
りである： 注：位置1380−1281における「nn」および位置1589−15
91における「nnn」は、cBT−20の、まだ、配列決定され
ない3'−翻訳領域を表わす。 残留配列について、第１アミノ酸は第４列のLysであ
り、左から11アミノ酸である。その後、アミノ酸には連
続番号が付されている。 この明細書および特許請求の範囲は例示を目的とし、
限定を意味するものではなく、そして種々の変更および
変化は本発明の精神および範囲を逸脱しないで可能であ
ることは、理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明によるcDNA配列のアミノ酸および核酸
配列（859塩基）である。 第２図は、抗原（「Ag」）の存在下または不存在下にお
ける、本発明によるCEA融合蛋白質の酵素イムノアッセ
イを描写するグラフである。 第３図は、本発明によるCEA融合蛋白質の免疫ブロット
を示す写真である。 第４図は、本発明によるポリＡ＋RNAの検出のためのオ
ートラジオグラフの写真である。 第５図は、本発明によるcDNA配列のアミノ酸および核酸
配列（2839塩基）である。第５図において、残基配列に
ついての第１アミノ酸は右から第２列第３アミノ酸中の
Lysである。その後、残りのアミノ酸は連続番号が付さ
れている。
配列（859塩基）である。 第２図は、抗原（「Ag」）の存在下または不存在下にお
ける、本発明によるCEA融合蛋白質の酵素イムノアッセ
イを描写するグラフである。 第３図は、本発明によるCEA融合蛋白質の免疫ブロット
を示す写真である。 第４図は、本発明によるポリＡ＋RNAの検出のためのオ
ートラジオグラフの写真である。 第５図は、本発明によるcDNA配列のアミノ酸および核酸
配列（2839塩基）である。第５図において、残基配列に
ついての第１アミノ酸は右から第２列第３アミノ酸中の
Lysである。その後、残りのアミノ酸は連続番号が付さ
れている。
フロントページの続き
(72)発明者 ジエイムズ・ジエイ・エルテイング
アメリカ合衆国コネチカツト州06443マ
ジソン・ヘザーウツドドライブ５
(72)発明者 マイケル・イー・カマーク
アメリカ合衆国コネチカツト州06437ギ
ルフオード・ウオーウイネトトレイル46
(56)参考文献 特開 昭60−214261（ＪＰ，Ａ)
Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ，29（1984）ｐ．147−157
Ａｎｎａｌｓ Ｎｗｅ Ｙｏｒｋ Ａ
ｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ，417（1983）ｐ．21−30
札幌医学雑誌 第55巻第２号（昭和61
年４月１日）札幌医科大学発行 第79〜
91頁
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．下記のCEA−Ａ、CEA−Ｂ、CEA−ＣおよびCEA−Ｄの
下にそれぞれ記載されたヌクレオチド配列で示されるポ
リヌクレオチドよりなる群から選ばれる単離された核
酸、あるいは該単離された核酸における少なくとも50個
の連続するヌクレオチドを含む該単離された核酸の断
片。 CEA−A: CEA−B: CEA−C: 及び CEA−D: ２．複製可能な組換えクローニングビヒクル中に挿入さ
れた状態で存在する特許請求の範囲第１項記載の核酸あ
るいは核酸断片。
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| US016683 | 1987-02-19 | ||
| US6003187A | 1987-06-19 | 1987-06-19 | |
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