FI103730B - Molekyylikloonauksella aikaansaadut haiman saarekesoluantigeenit - Google Patents

Description

103730

Molekyylikloonauksella aikaansaadut haiman saarekesoluan-tigeenit Tämä keksintö koskee haiman saarekesoluantigeeneja, 5 jotka sitoutuvat vasta-aineisiin, joita on löydetty insuliinista riippuvaisen (tyyppi I) sokeritaudin (IDDM) vaivaamien potilaiden seerumeista. Erikoisemmin keksintö koskee proteiineja ja peptidejä, jotka sitoutuvat saarekesoluvasta-aineisiin (ICA) ja jotka on valmistettu yhdistel-10 mä-DNA- (rDNA) tai synteettisillä menetelmillä. Keksintö koskee myös kloonattua DNA:ta, joka koodittaa sellaisia ICA-proteiineja tai peptidejä. Esillä olevan keksinnön ICA-proteiinit ja peptidit ovat käyttökelpoisia immunotes-tireagensseina IDDM:n esioirediagnostisoinnissa.

15 Lisääntyvät todisteet solu- ja humoraalivälittei- sistä IDDM:ään liittyneistä epänormaalisuuksista ovat johtaneet hypoteesiin, että tauti on autoimmuunisairaus. Haiman saarekkeiden insuliinia tuottavia β-soluja vastaan kohdistettuja seerumivasta-aineita on tunnistettu immuno-20 fluoresenssilla (G.F. Bottazzo, A. Florin-Christensen ja D. Doniach: Islet Cell Antibodies in Diabetes Mellitus

With Autoimmune Polyendocrine Deficiencies, Lancet ii: 1279 - 1283 (1974), ja A.C. MacCuish, J. Jordan, C.J.

: Campbell, L.J.P. Duncan ja W.J. Irvine: Antibodies to Is- 25 let-cell in Insulin-dependent Diabetics With Coexistent ;***j Autoimmune Disease, Lancet ii: 1529 - 1533 (1974)). Näitä .···. autovasta-aineita havaitaan 70 - 80 % vastadiagnosoiduilta « · diabeetikoilta (NDD), mutta vain 0,1 - 1 % normaaleilta • · * kontrollikohteilta (C.H.Brogren ja A. Lernmark: Islet Cell ... 30 Antobodies in Diabetes, Clin. Endocrinol. Metab. ΙΛ: 409 - ♦ · · *·]#* 430 (1982), ja G. F. Bottazzo, R. Pujol-Borrell ja D.

• · « *·* * Doniach: Humoral and Cellular Immunity in Diabetes : Mellitus, Clin. Immunol. Allergy 1: 139 - 159 (1981)).

ICA:t ovat tulleet hyväksytyiksi yhdeksi IDDM:ää ennusta-*. 35 vaksi tekijäksi. Nykyisestä ICA:a koskevasta tiedosta on 2 103730 esittänyt yhteenvedon A. Lernmark, Diabetic Medicine 4: 285 - 292 (1987).

Tavanomainen ICA-testi sisältää haiman osien altistamisen seerumeille, värjäämisen toisella vasta-aineella, 5 jossa on joko fluoresoiva (G.F. Bottazzo et ai., supra) tai entsyymileima (P.G. Colman, M. Tatkus, A. Rabizadeh, C. Cahill ja G.S. Eisenbarth: Assay for Islet Cell Antibodies with Rat Pancreas and Peroxidase Protein A. Diabetes Care 367 - 368 (1988)), ja havainnoimisen 10 mikroskoopilla. Toinen samanlainen menetelmä sisältää bio-tiini-avidiinikerroksen muodostamisen ja immunofluoresens-situnnistuksen (T. Kobayashi, T. Sugimoto, T. Itoh, K. Kosaka, T. Tanaka, S. Suwa, K. Kato ja K. Tsuju: The Prevalence of Islet Cell Antibodies in Japanese Insulin-de-15 pendent and Non-insulin-dependent Diabetic Patients Studied by Indirect Immunofluorescence and by a New Mwthod. Diabetes 35: 335 - 340 (1986)). Nämä menetelmät ovat aikaa vieviä, työläitä, vaikeita toistaa ja niillä on rajoitettu herkkyys. Helpompikäyttöisen ICA-immunotestin 20 kehittäminen sallisi laajalle levinneen epidemiologian ja IDDM korrelaation testaamisen, ja lopulta taudin ennustamisen seulontatestillä.

Nykyisten ICA-testien pääasiallisin rajoitus on rajoitettu tieto ja karakterisointi osaa ottavista saare- : 25 kesoluantigeeneista. ICA:t voivat olla matalatiitterisiä :***: tai matalan affiniteetin omaavia ja vain karakterisoiduil- • · · la antigeeneillä saavutettavissa. iCA-antigeenit, joita • · · tunnistetaan immunof luoresenssitestillä, ovat erikoisen • · · kiinnostavia; nämä antigeenit voivat sisältää: ... 30 (1) saarekesolun pinnan osia (N.K. MacLaren, S.W.

• · ·

Hugng ja J. Fogh: Antibody to Cultured Human Insulinoma • · · ·) * Cells in Insulin-dependent Diabetes. Lancet 1: 997 - 1000 ::: (1975) ja A. Lernmark, Z.R. Freedman, C. Hofmann, A.H.

Rubenstein, D.F. Steiner, R.L. Javkson, R.J. Winter ja 35 H.S. Traisman: Islet-cell-surface Antibodies in Juvenile 3 103730

Diabetes Mellitus. N. Engl. J. Med. 299: 375 - 380 (1978)), (2) insuliinin (J.P. Palmer, C.M. Aspiin, P. Clemons, K. Lyen, O. Tetpati, P.K. Raghu ja T. L. Paquette: 5 Insulin Antibodies in Insulin-dependent Diabetics Before Insulin Treatment. Science 222: 1337 - 1339 (1983) ja S. Srikanta, A.T. Ricker, D.K. McCulloch, J.S. Soelder, G.S. Eisenbarth ja J.P. Palmer: Autoimmunity to Insulin, Beta Cell Dysfunction, and Development of Insulin-dependent 10 Diabetes Mellitus. Diabetes 35: 139 - 142 (1986)), (3) 64000 daltonin (64 kd) painoisen saarekeprote- iinin, jonka sijainti solussa on tuntematon (S. Baekkes-kov, J.H. Nielsen, B. Marner, T. Bilde, J. Ludvigsson ja A. Lernmark: Autoantibodies in Newly Diagnosed Diabetic 15 Children Immunoprecipitate Human Pancreatic Islet Cell Proteins. Nature 298: 167 - 169 (1982)), ja (4) sytoplasmiset antigeenit (G.F. Bottazzo, A. Florin-Christensen ja D. Doniach: Islet Cell Antibodies in Diabetes Mellitus With Autoimmune Polyendocrine 20 Deficiencies. Lancet 2: 1279 - 1283 (1974), A.C. MacCuish, J. Jordan, C.J. Campbell, L.J.P. Duncan ja W.J. Irvine: Antibodies to Islet-Cell in Insulin-Dependent Diabetics ·.· With Coexistent Autoimmune Disease. Lancet 2: 1529 - 1533 ,·· (1974), R. Lendrum, G. Walker ja D.R. Gambli: Islet-Cell : 25 Antibodies in Juvenile Diabetes Mellitus of Recent Onset.

Lancet 1: 880 - 883 (1975), ja W.J. Irvine, C.J. McCallum, • · · R.S. Gray, G.J. Gampbell, L.J.P. Duncan, J.W. Farquhar, H.

• · ·

Vaughan ja P.J. Morris: Pancreatic Islet Cell Antibodies • · · in Diabetes Mellitus Correlated With The Duration and Type ... 30 of Diabetes, Co-existent Autoimmune Disease, and HLA-type.

• · ·

Diabetes 26: 138 - 147 (1977).

• · · *·’ ’ (5) glykokonjugaatit (R.C. Nayak, M.A.K. Omar, A.

::: Rabizadeh, S. Srikanta ja G.S. Eisenbarth, "Cytoplasmic"

Islet Cell Antibodies: Evidence That the Target Antigen is 35 a Sialoglycoconjugate. Diabetes 34: 617 - 619 (1985)? P.

4 103730

Vardi, E.E. Dibella, T.J. Pasquarello ja S. Srikanta, Islet Cell Autoantibodies: Pathobiology and Clinical Applications. Diabetes Care 10: 645 - 56 (1987); B.K. Gillard, J.W. Thomas, L.J. Nell ja D.M. Marcus, Antibodies Against 5 Ganglioside GT3 in the Sera of Patients with Type I Diabetes Mellitus. Journal of Immunology 142: 3826 - 32 (1989)).

64 kd antigeeni on karakterisoitu koon ja isoelekt-risen pisteen suhteen immunopresipitoimalla radioaktiivi-10 seksi leimattuja saarekeproteiineja, mutta mitään sekvens-sitietoa ei ole olemassa. Kaksi julkaisua osoittavat vasta-aineen, joka tunnistaa tämän proteiinin prediabeetti-sessa seerumissa kuin myös juuri diagnosoidussa diabeet-tisessa seerumissa, suuren yleisyyden (S. Baekkeskov, M. 15 Landin, J.K. Kristensen, S. Srikanta, G. Jan Bruining, R. Mandrup-Poulsen, C. de Beaufort, J.S. Soeldner, G. Eisen-barth, F. Lindgren, G. Sundquist ja A. Lernmark: Antibodies to a 64000 MW Human Islet Cell Antigen Precede the Clinical Onset of Insulin-dependent Diabetes. J. Clin. 20 Invest. 79: 926 - 934 (1987), ja M.A. Atkinson, N.K. MacClaren, W.J. Riley, D.W. Sharp ja L. Holmes: Mr 64000 Autoantibodies (64 KA) Predict Insulin Dependent Diabetes. American Diabetes Assoc. 48th Annual Meeting (1988) Abs-::; trakti numero 391).

j ·.. 25 Joidenkin muiden molekyyli lajien on karakterisoitu :***; Western-blottauksella olevan "yhteisiä antigeenejä", jotka ·***. on tunnistettu diabeettisissa seerumeissa (D.G. Karounos, • * · V.J. Virta, L.J. Neil ja J.W. Thomas: Analysis of Human • · · and RINm5F Islet Cell Antigens. American Diabetes Assoc.

... 30 Res. Symp. Woods Hole, MA. Lokakuu 1987; abstrakti numero • · · 120). Näillä antigeeneillä on molekyylipainot 150 kd, 84 • ♦ · kd, 60 kd, 49 kd ja 36 kd.

: : : Esillä oleva keksintö esittää sarjan kloonattuja nukleiinihappoja, jotka koodittavat yhtä tai useampaa pro-35 teiinia tai proteiinifragmenttia, jotka sitoutuvat selek- 5 103730 tiivisesti haiman saarekesoluvasta-aineisiin (ICA). Sellaisia kloonattuja nukleiinihappoja kuvaavat cDNA-insertit talletetuissa yhdistelmä-bakteriofaageissa ATCC 40550, 40551, 40552, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 ja 40706.

5 Esillä oleva keksintö esittää niin ollen myös ICA- proteiinit ja niiden peptidifragmentit, joita koodittavat kloonatut nukleiinihapot ja jotka ovat käyttökelpoisia insuliinista riippuvaisen (tyyppi I) sokeritaudin (IDDM) diagnostisoinnissa. Sellaisten proteiinien ja peptidien 10 kyky sitoutua ICA:n vasta-aineen sitoutumiskohdalle antaa myös kyvyn sitoutua ihmisen immunoglobuliiniin, IDDM:ään osaa ottaviin T-soluihin tai B-soluihin, sisältäen kiertävän immunoglobuliinin, kiertävät T-solut ja B-solut, tai estää niiden toiminta.

15 Esillä olevan keksinnön ICA-proteiinit ja peptidit saadaan sellaisilla menetelmillä, kuten esillä olevien kloonattujen nukleiinihappojen täydellisellä tai osittaisella ekspressiolla, vaihtoehtoisesti sen jälkeen tapahtuvalla fragmentaatiolla? ja peptidi- tai polypeptidisyn-20 teesillä, joka perustuu aminohapposekvensseihin, jotka on määritetty esillä olevista kloonatuista cDNA:sta tai täy-sipitkistä ICA-antigeenigeeneistä, jotka voidaan määrittää ·.· tai eristää saarekesolujen nukleiinihappokir jastoista esillä olevien kloonattujen komplementaaristen cDNA-sek-| 25 venssien avulla. Niin ollen sellaiset ICA-proteiinit ja peptidit sisältävät täysipitkät ICA-proteiinit, jotka ovat • · · ;***; läsnä saarekesolujen sisällä tai pinnalla ja joita koodit- .·;·. taa ihmisen geeni, jonka mRNA on ainakin osittain komple mentaarinen esillä olevien kloonattujen cDNA:den täydel- ... 30 lisen sekvenssin kanssa. Esillä olevan keksinnön ICA-pro- • « « • « · teiineihin ja peptideihin sisällytetään myös proteiinit, « · · *·’ ’ joita ekspressoivat yhdistelmäkloonausvektorit, jotka si- : sältävät esillä olevat cDNA-insertit, ja sellaisten pro- : : teiinien fragmentit, jotka saadaan osittaisella ekspres- 35 siolla tai jälkeen päin tapahtuvalla fragmentaatiolla, 6 103730 kuten restriktioendonukleaaseilla. Esillä olevan keksinnön ICA-proteiinit ja peptidit sisältävät myös peptidit, jotka saadaan proteiinisynteesillä, kuten ne, jotka ovat pituudeltaan 3 aminohappoa tai pidempiä, jotka edustavat ICA-5 epitooppeja tai sen analogeja tai johdannaisia.

Esillä oleva keksintö tarjoaa useita merkittäviä etuja. ICA-antigeenien molekulaarinen kloonaus suo mahdollisuuden valmistaa suuria ja toistettavia määriä materiaalia käytettäväksi IDDM:n tutkimuksessa ja diagnostisoin-10 nissa, kuten myös suo mahdollisuuden tutkia biologisia mekanismeja, jotka ottavat osaa saarekesolujen tuhoutumiseen ja ICA:n ilmestymiseen. Puhtaan antigeenin suurten määrien saatavuus mahdollistaa erittäin herkkien ja spesifisten immunotestien kehittämisen, joita testejä voidaan 15 käyttää seulottaessa yleisväestöä esioireellisen IDDM:n suhteen tai IDDM:n kehittymisalttiuden suhteen.

Kuviot 1- 5, 14 ja 15 ovat ATCC:hen tallennettujen ICA-kloonien reaktiivisuusprofiileja, jotka kloonit on valmistettu esillä olevan keksinnön mukaisesti diabeetti-20 silla ja normaaleilla seerumeilla esimerkeissä kuvatuissa olosuhteissa.

Kuvio 6 on kontrolliprofiili, jossa on käytetty kloonausfaagia ilman yhdistelmäinserttiä.

Kuviot 7 ja 16 ovat ICA-kloonien seerumiprofiilien 25 yhteenvedot osoittaen reaktiivisuusarvot, jotka on ilmoi-tettu kuvioiden 1 - 5 ja 14 - 15, vastaavassa järjestyk- • · · .···, sessä, näkötulkinnalla.

• · .•j*. Kuviot 8 - 13, 17 ja 18 ovat tiettyjen ICA-kloonien i » · DNA- ja päätellyt proteiinisekvenssit.

... 30 Kuvio 19 esittää immunosaostuksen tulokset yhdellä • · « *·* * ICA-kloonilla käytettäessä diabeettisia ja normaaleja see- « « · *.* ’ rumeita.

: Tässä käytettynä termi "ICA-antigeenit" pitää ym- märtää viittaavan esillä olevan keksinnön esittämiin pro-·. 35 teiineihin ja peptideihin, vaikka on tiedostettava, että 7 103730 joissain tapauksissa peptidimuodot eivät ole "antigeenejä" tarkasti ottaen, nimittäin ne ovat hapteenisia, koska ne vaativat kiinnittymisen tavanomaiseen makromolekulaariseen kantajaan pystyäkseen stimuloimaan vasta-aineiden tuottoa 5 isäntäeläimessä.

Lisäksi "kloonatut nukleiinihapot", "kloonatut ICA-antigeenisekvenssit", "cDNA-insertit" ja niiden kaltaiset termit viittaavat insertteihin, jotka sisältyvät talletettuihin yhdistelmäfaageihin ATCC 40550, 40551, 40552, 10 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 ja 40706, ja myös muihin täysipitkien geenien nukleiinihapposekvensseihin, tai sellaisten sekvenssien fragmentteihin, jotka sisältävät sellaisia talletettuja sekvenssejä. On tiedostettava, että yksi tai useampi täysipitkä ICA-antigeeni karakterisoidaan 15 homologian suhteen yllä talletettuihin cDNA-insertteihin, kuitenkin on mahdollista, että kaksi tai useampi sellaista cDNA-inserttiä vastaa yksittäistä ICA-antigeenia. Esimerkiksi insertti kannassa ATCC 40703 tuntuu sisältävän sekä ATCC 40550:n että ATCC 40554:n insertit ja näin ollen nämä 20 kolme inserttiä voivat kaikki vastata yksittäisen ICA-an-tigeenin eri ja/tai päällekkäisiä alueita.

Kloonattujen ICA-antigeenisekvenssien valmistus

Yleisesti esillä olevan keksinnön kloonatut ICA- : antigeenisekvenssit saadaan ekspressoimalla ihmisen geene- | 25 jä sopivassa yhdistelmäkloonausvektorissa, esim. bakterio- • · « : : faagissa, ja testaamalla tuloksena syntynyt geenikirjasto IDDM-seerumilla valiten ne antigeenit, jotka iCA-vasta- • ♦ · aineet tunnistavat. Yhdistelmäantigeenit seulotaan sitten ryhmällä diabeettisia ja normaaleja seerumeita määritet- e.;.t 30 täessä tunnistettujen kloonien taut ispesi f isyys.

· ·

Tietyt talletetut kloonit saatiin tarkemmin seuraa- • * · « « « *. valla menetelmällä (lisäyksityiskohdat voidaan löytää alla ♦ olevista esimerkeistä). Ihmisen cDNA-kirjasto muodostet-: *: tiin eristämällä RNA puhdistetuista ihmisen haimasaarek-

35 keistä. Tämä RNA fraktioitiin kromatograf iällä poly-A

103730

O

mRNArn erottamiseksi muusta RNA:sta, kuten ribosomaalises-ta RNA:sta ja hajonneen RNA:n fragmenteista. Eristetylle mRNA:lie suoritettiin käänteistranskriptaasireaktio kaupallisesti saatavalla cDNA-käyttöpakkauksella (Bethesda 5 Research Laboratories), ligoitiin EcoRI DNA-linkkereihin ja ligoitiin lambda gtll-käsivarsiin in vitro-pakkausta varten. Ligoitu lambda pakattiin käyttäen kaupallista käyttöpakkausta (Stratagene) ja sitten amplifioitiin bak-teerimatolla maljalla.

10 Faagikirjasto seulottiin vasta-aineilla, jotka oli saatu tyypin I sokeritaudin omaavilta autoimmuunipotilail-ta. Faagilla infektoiduille bakteereille suoritettiin aga-roosimaljalevitys ja yhdistelmäproteiinin ekspressio indusoitiin kemiallisesti. Proteiini talletettiin suodattimil-15 le, jotka sitten testattiin seerumilla. Plakit, jotka tuntuivat olevan positiivisia, eristettiin agaroosimaljoilta ja puhdistettiin kahdella eristyskierroksella. Kloonauksen jälkeen lambda gt-ll-faagi infektoitiin bakteeri-isäntään suuren mittakaavan ekspressiota varten. Kloonatun cDNA:n 20 ekspressoimien proteiinien spesifisyys arvioitiin kloonattua ihmisproteiinia sisältävien bakteeriuutosten Western-blottauksella. Ajettiin preparatiiviset polyakryyliamidi-geelit ja ne siirrettiin sähkön avulla membraaneille, membraanit leikattiin kaistoiksi ja niiden annettiin rea- • '·· 25 goida normaalin ja diabeettisen seerumisar jän kanssa.

♦ · ·

Kloonit, jotka muodostivat proteiineja, jotka reagoivat :***: ainoastaan tai valtaosaltaan diabeettisten seerumeiden kanssa, valittiin.

• · · ·

Yhdistelmäkloonausvektorit ja jatkokloonaus 30 Kuten alalla on tavanomaisesti tunnettu, esillä • · ·

olevan keksinnön cDNA-transkriptit, kuten kirjasto-cDNA

• · · ’. tai kloonausvektorista katkaistut cDNA-insertit, voidaan :.:V sisällyttää useisiin yhdistelmäkloonausvektoreihin halut- : : tujen sekvenssien amplifikaatiota ja haluttujen ICA-anti- 35 geenien ekspressiota varten. Yhdistelmäkloonausvektorin 103730 9 ymmärretään olevan biokemiallinen molekyyli tai rakenne, esim. DNA, joka sallii polynukleotidisekvenssien insertion ja insertoitujen polynukleotidisekvenssien replikaation, kun vektori on sopivasti viety sisään isäntäsoluun. Eks-5 pressiovektori sisältää lisäksi ominaisuuden, että se ekspressoi insertoidun polynukleotidin koodittamaa proteiinia. Ekspressiovektorissa insertoitu ICA-antigeenisek-venssi on toimivasti liitetty sopivaan säätelysekvenssiin, joka kykenee vaikuttamaan ICA-antigeenin ekspressioon so-10 pivassa isännässä. Osaa ottava säätelysekvenssi voi vaihdella riippuen valitusta isännästä ja transformaatiomene-telmästä. Nämä asiat kuuluvat alan tavanomaisten taitojen piiriin.

Sopivat yhdistelmäkloonausvektorit sisältävät plas-15 midit, virukset ja bakteriofaagin, ja integroitumiskykyi-set DNA-fragmentit (nimittäin fragmentit, jotka kykenevät integroitumaan isännän genomiin rekombinaatiolla). Eks-pressiovektorit ovat erikoisen suositeltavia ja niistä on esimerkkeinä, ilman rajoituksia, bakteerin pEMBL-, pMMB-20 ja pUK-vektorit, hiivan pAAH5-, pYE4- ja pAB112-vektorit, nisäkkään pRSV-vektori, lehmänrokkoviruksesta peräisin olevat vektorit, papilloomaviruksesta peräisin olevat vektorit, retrovirusvektorit ja sukkulavektorit, kuten pCDM8. Yleissilmäystä varten katso D.M. Glover, DNA Cloning: A

ί " 25 Practical Approach (1985) IRL Press Ltd. Sopivat isäntäso- • · « *...· lut sisältävät prokaryootit, hiivan ja korkeammat euka- • · · ryoottiset solut sisältäen nisäkässolut.

cDNA-inserttien jatkokloonaus voi sisältää insertin irrottamisen ligaatiota varten eri kloonausvektoriin. In-30 sertti voidaan irrottaa käyttäen restriktioentsyymiä, joka vastaa linkkereitä, joita käytettiin alkuperäisessä inser- • · · • tiossa, tai käyttäen restriktioentsyymejä, jotka valitaan insertin restriktiokartan perusteella. Irrotettu cDNA voi- » « i daan insertoida toiseen sopivaan vektoriin sekvensointia, 35 amplifikaatiota tai ekspressiota varten, miten halutaan.

• 'tt I > · « « 10 103730

Jos alkuperäisessä kloonausvektorissa olevat terminaaliset restriktiokohdat on tuhottu, muita entsyymejä voidaan käyttää insertin talteenottamiseen ja tuloksena syntyneet viereiset kloonausvektorialueet deletoidaan tavanomaisin 5 keinoin.

Täysipitkän geenin kloonaus

Esillä olevan keksinnön cDNA-inserttien fragmentteja voidaan käyttää eristettäessä täysipitkät cDNA-tai genomiset DNA-kloonit sopivista kirjastoista standar-10 deilla menetelmillä. Kohdekirjasto levitetään maljoille, annetaan kasvaa, siirretään suodattimille ja annetaan reagoida DNA-koettimien kanssa. Sellaiset DNA-koettimet muodostetaan cDNA-inserttien restriktiofragmenteista sellaisilla menetelmillä, kuten päähän leimauksella, nick-15 translaatiolla, random priming-transkriptiolla tai fotoke miallisilla tavoilla. Oligonukleotideja voidaan syntetisoida, leimata ja käyttää hybridisaatiokoettimina. RNA-koettimia voidaan myös valmistaa jatkokloonatusta cDNA:sta sopivien templaattien transkriptiolla.

20 Yhdistelmäkloonausvektorit, esim. faagi tai plas- midit, jotka tuntuvat reagoivan osittaisten cDNA-kloonien kanssa, seulotaan uudelleen ja sitten restriktiokartoite-taan. Lupaavat kloonit sekvensoidaan sitten alkuperäisten koettimien hybridisaation varmistamiseksi ja laajemman : : 25 sekvenssitiedon saamiseksi suuremmasta fragmentista. Jos : *·· täysipitkiä klooneja ei saada tällä menetelmällä, täydel- • · · linen nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa ihmisen gee-niä, voidaan koota yhteen kloonattujen fragmenttien pääl-lekkäisten sekvenssien avulla.

30 Vaihtoehtoinen menetelmä pidempien fragmenttien, ja mahdollisesti täysipitkien kloonien, saamiseksi käyttää • · · S*·' vasta-aineita, jotka on valmistettu osittaisten kloonien • · · ekspressoimia ICA-antigeeneja vastaan. Halutun antigeenin • ·.· tunnistuksen jälkeen sitä voidaan käyttää immunogeenina • 35 korkean tiitterin ja affiniteetin omaavien monoklonaalis- 1X 103750 ten tai polyklonaalisten vasta-aineiden tuottamisessa. Sellaiset vasta-aineet sallivat pidempien cDNA-kloonien ja kirjastossa pienempinä määrinä läsnäolevien cDNA-kloonien tunni stuksen.

5 Antigeeni- ja peptidisynteesi ICA-antigeenit, tässä määriteltyinä, voidaan valmistaa useilla eri tavoilla esillä olevan keksinnön esittämistä klooneista ja sekvenssitiedoista. Voidaan yksinkertaisesti ekspressoida proteiineja esillä olevan keksin-10 nön mukaisesti saaduista ICA-antigeeniklooneista, erikoisesti talletetuista klooneista. Sellaisia ekspressoituja proteiineja, tai niiden fragmentteja tai digestiotuot-teita, voidaan käyttää antigeeneinä sidottaessa saarekesoluvasta-aineisiin. Bakteeriekspression uutteiden suora 15 käyttö ei kuitenkaan ehkä ole mahdollista kaikissa tapauksissa, koska ihmisen seerumi reagoi normaalisti epäspesifisestä E. coli-proteiinien kanssa. Sellaisissa tapauksissa ekspressoidut ICA-antigeenit voidaan eristää tavanomaisin menetelmin, kuten elektroforeettisella erotuksella, 20 jota seuraa kiinnitys membraaneille (Western-blottaus), tai pylväskromatografiällä tai affiniteettipuhdistuksella (esim. anti-B-galaktosidaasi-affiniteettiresiinikromato-grafia tai muut tavanomaiset biokemialliset tavat, esim. suola- tai lämpösaostus).

: 25 Vaihtoehtoisesti peptidifragmentit voidaan synte- • *·· tisoida hyvin tunnetuilla menetelmillä aminohapposekvens- seistä, jotka on päätelty ICA-antigeenikloonien kokeelli- :***: sesti määriteltyjen DNA-sekvenssien perusteella. Voidaan • · · syntetisoida päällekkäisiä peptidejä ja testata niiden 30 reaktiivisuutta ICA-seerumien kanssa. Kun reaktiiviset peptidit on löydetty, voidaan valmistaa pienempiä peptide- • « · jä pienimmän reagoivan yksikön, nimittäin epitoopin, kar- • · · toittamiseksi.

:'j 35 12 103730

Menetelmät

Esillä olevan keksinnön esittämien ICA-antigeenien tärkein käyttö on IDDM:n diagnosoinnissa ja ennustamisessa. Sellaisessa menetelmässä annetaan verinäytteen, taval-5 lisesti seeruminäytteen, reagoida valitun yhden ICA-anti-geenin tai ICA-antigeenisarjän kanssa ja immunoreaktiivi-suus määritetään millä tahansa tavanomaisella menetelmällä. Edelleen ajatellaan, että immunoreaktiivisuusprofiili eri ICA-antigeeneilla voi suoda diagnostisesti merkittävää 10 tietoa koskien taudin luonnetta, esim. alatyyppejä, taudin vaihetta, taudin alkamisen läheisyyttä, terapian tehokkuutta, esim. immuuniterapian, ja niiden kaltaisia.

Esillä olevien ICA-antigeenien lisäkäyttö on auto-reaktiivisten B-solujen tunnistus ja merkintä.

15 Esillä olevien ICA-antigeenien eräs käyttö on saa- rekereaktiivisten T-solupopulaatioiden tunnistus. ICA-an-tigeenit voivat toimia stimuloivina antigeeneinä T-solu-viljelmälle sallien merkittävästi parantuneen T-solukloo-nien tuoton, tunnistuksen ja kasvun. On ajateltu, että 20 lCA:n T-solutunnistus voi olla merkittävä prediabeettisen vaiheen diagnostisoinnissa ja että autoreaktiivisten T-solujen määrän tarkastelu voi antaa osoituksen taudin kulusta ja immuunimoduloivien terapioiden käyttökelpoisuudesta. Lisäksi ICA:n aiheuttama T-soluviljelmien muodos-25 tuminen voi suoda in vitro-mallin diabetesterapioiden : ·.. suunnittelulle.

;**; Esillä olevaa keksintöä kuvataan nyt, mutta sen ei

• M

.*··. ole tarkoitettu olevan rajattu, seuraavilla esimerkeillä.

• · ·

Esimerkit 30 1. cDNA-kirjasto ... Langerhans ' in saarekkeet puhdistettiin tohtoreiden • · ·

Paul Lacy'n ja David Scharp'in toimesta Washington • · · ' University' ssä, St. Louis, MO, USA, seuraten julkaistua : menetelmää (C. Ricordi, P.E. Lacy, E.H. Finke, B.J. Olack 35 ja D.W. Scharp: An Automated Method for Isolation of Human . Pancreatic Islets. Diabetes 37: 413 - 420 (1988)). Lyhyes- 13 103730 ti, ihmisen haimaa käsiteltiin kollagenaasilla ja sitten hienonnettiin. Ficoll-gradienttisentrifugaatiota käytettiin eristettäessä saarekkeet, joita sitten viljeltiin 1 viikko huoneen lämpötilassa. Saarekkeet jäädytettiin ja 5 kuljetettiin.

Kun oli otettu vastaan, saarekkeet sulatettiin, yhdistettiin ja pestiin. RNA uutettiin käyttäen guanidi-nium tiosyanaattia ja seostettiin selektiivisesti litium-kloridilla (G. Cathala, J.F. Savouret, B. Mendez, B.L.

10 West, M. Karin, J.A. Martial ja J.D. Baxter: A Method for Isolation of Intact, Transtationally Active Ribonucleic Acid. DNA 3: 239 - 335 (1983)). Noin 770 pg kokonais- RNA:ta saatiin kustakin ml:sta sentrifugoituja saarekkeita. Lähetti-RNA puhdistettiin käyttäen Pharmacia'n oli-15 go (dT)-selluloosaa tyyppiä 7 (Pharmacia Fine Chemicals,

Piscataway, NJ, USA) seuraten Maniatis et ai. kuvaamaa menetelmää (T. Maniatis, E.F. Fritsel ja J. Sambrook: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory, sivut 197 - 198). Noin 30 pg RNA:ta 20 saatiin kromatografian jälkeen. In vitro translaatio käyttäen BRL:n käyttöpakkausta numero 8110 (Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD, USA) ja 35S-metioniinia osoitti, että syntyi proteiineja laajalla molekyylipaino-välillä.

25 BRL:n numero 8267SA-käyttöpakkausta käytettiin cDNA-synteesi in. Kymmenen (10) pg poly-A* RNA: ta käytettiin raektiossa. Päät tasoitettiin T4-DNA polymeraasilla • · · .·**. (Pharmacia) ja cDNA metyloitiin EcoRI metylaasilla (New ·»»

England Biolabs, Beverly, MA, USA) ja S-adenosyylimetio- • · · 30 niinillä ja ligoitiin EcoRI-linkkereihin. cDNA digestoi- ... tiin EcoRI-entsyymillä ja ajettiin Biogel A15M-pylväässä • · · '·[/ (BioRad Laboratories, Rockville Center, NY, USA) linkkeri- • · · en ja fragmenttien erottamiseksi.

cDNA ligoitiin lambda gt-ll-käsivarsiin ja pakat-35 tiin Stratagene’n Gigapack Plus-käyttöpakkauksella (Stara-tagene Cloning Systems, LaJolla, CA, USA). Saatiin kirjas- 14 103730 to, joka sisälsi noin 8,5 x 105 insertin omaavaa kloonia (mitattu5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-B-D-galaktopyranosi-dilla) ja amplifioitiin E. coli Y1090-kannassa (Strata-gene).

5 2. Seerumit

Seerumit juuri diagnosoiduilta diabeetikoilta saatiin tohtori William Riley'Itä, University of Florida, Gainesville, FL, USA, ja tohtori Alan Drash'lta, Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA.

10 Normaalit (ei-diabeettiset) seerumit kerättiin laborato- riohenkilöiltä. Seerumit adsorboitiin useaan kertaan suodattimille, jotka oli valmistettu joko (a) lyysaamalla lambda-infektoidut E. coli-kannat kloroformilla ja huuhtomalla nitroselluloosasuodattimia tässä lysaatissa, tai (b) 15 valmistamalla suodattimet asettamalla isopropyyli-S-tioga-laktopyranosidissa (IPTG) huuhdotut suodattimet lambda-infektoidun E. coli-kannan maljan päälle oleellisesti samalla tavalla kuin seulottaessa kirjastoa. Seerumit laimennettiin 1/20 - 1/200 blotto-liuokseen (5 % rasvatonta 20 Carnation-kuivamaitoa, 10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20 ja 0,05 % natriumatsidi) raa'an fraktiomi-sen jälkeen, kuten alla on kuvattu.

3. Seulonta

Seulontamenetelmä perustuu standardeihin menetel- 25 miin (T.V. Huynh, R.A. Young ja R.W. Davis: Constructing : and Screening cDNA Libraries in lambda-gtlO and lambda- 0 gtll in DNA Cloning. D.M. Glover toim. (1985) IRL Press, .*% sivut 490 - 78). Suodattimet valmistettiin mal jäämällä • ·· noin 50000 plakkia muodostavaa yksikköä (pfu) kirjastosta • « r 30 kullekin 10:lie 150 mm:n agaroosimaljalle. Noin 3 tunnin ... kasvatuksen jälkeen 42 °C:ssa suodattimet (nitroselluloosa • · · **[/ Schleicher ja Schuell'lta, Keene, NH, USA), jotka sisälsi- • · · vät IPTG:tä, laitettiin maljojen päälle ja kasvatusta jatkettiin 37 °C:ssa joko 3-4 tuntia tai yli yön. Suodatti-35 met peitettiin blotto-liuoksella ja säilytettiin 4 °C:ssa.

15 103730

Alunperin kaikki suodattimilla tehdyt vasta-aine-reaktiot suoritettiin huoneen lämpötilassa 3 tunnin ajan. Myöhemmissä kokeissa seerumi-inkuboinnit suoritettiin yli yön 4 °C:ssa blotto-liuoksessa ilman Tween-20:ta, kun taas 5 sekundaari-vasta-ainereaktiot suoritettiin huoneen lämpö tilassa 1,5 tunnin ajan. Kaikki inkuboinnit ja pesut suoritettiin tasoravistelijoilla varovaisella ravistelulla.

Kirjasto seulottiin ihmisen vasta-ainekoettimilla useita kertoja. Ensimmäisessä tapauksessa vasta-aine oli 10 puhdistettu diabeettisista seerumeista HPLCrllä. Toisessa ja kolmannessa tapauksessa seerumit oli saostettu 50 % ammoniumsulfaatilla ja dialysoitu. Ensimmäistä ja kolmatta seulontaa varten kahden seerumin seosta käytettiin kaikkiin puhdistusvaiheisiin. Toisessa seulonnassa käytettiin 15 20 diabeettisen seerumin muodostamaa seosta primaaripuh- distuksiin. Lisäseulonnassa 22 seerumia yhdistettiin, saostettiin ammoniumsulfaatilla ja dialysoitiin ja kunkin seerumin lopullinen käyttölaimennus oli 1/500 blottoliuok-sessa ilman Tween-20:ta.

20 Kun oli inkuboitu diabeettisissa seerumeissa, suo dattimet pestiin Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), TBSrssä, joka sisälsi 0,05 % Tween-20:ta, ja sitten TBSrssä, kussakin 5-10 minuuttia. Suodattimien sitoutunut ihmisen vasta-aine tunnistettiin antamalla reagoida 25 alkaaliseen fosfataasiin konjugoidun kanin anti-ihmis-·'·.. IgG:n kanssa (1/500 blotto-liuoksessa, Dakopatts'in vasta- aine D-336 - DAKO Corp., Santa Barbara, CA, USA). Suodat- « * · .···. timet pestiin TBS/Tween-20:ssä, TBSrssä, TBSrssä ja sitten tunnistuspuskurissa (0,1 M Tris-HCl, pH 9,5, 0,1 M NaCl, • · « 30 0,05 M MgCl2, jota BRL on suositellut käytettäväksi DNA- ... tunnistus-käyttöpakkauksessaan numero 8239SA). Lisättiin • · · *·* ' kromogeeniset substraatit (nitro-blue tetratsolium ja 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti) ja reaktio suojattiin valolta. Kun väri oli kehittynyt, suodattimet pestiin . 35 vedellä, sitten 10 mM Trisrllä (pH 8,0), 1 mM EDTArlla ·. (TE) ja kuivattiin. Parhaat plakkihavainnot tehtiin, kun ·"· suodattimet olivat yhä heikosti märkiä.

16 103730

Positiivisten plakkien sijainnit paikallistettiin alkuperäisillä maljoilla asettamalla suodattimet niiden kanssa päällekkäin. Primaariseulontaa varten poistettiin positiivisen plakin sisältävä osa käyttäen steriilin Pas-5 teur-pipetin paksua päätä. Seuraavissa seulonnoissa, joissa yksittäiset plakit voitiin erottaa, käytettiin pipetin ohkaista päätä. Plakit eluoitiin plakkisäilytyspuskuriin (Maniatis et ai., supra) ja eluoitiin ainakin useita tunteja.

10 Yllä olevat seulontamenetelmät tuottivat spesifiset talletetut ICA-kloonit, jotka on kuvattu tässä lukuunottamatta ICA-12.3-kloonia, joka eristettiin seuraavasti.

Noin 106 plakkia muodostavaa yksikköä faagikirjas-tosta seulottiin DNA-hybridisaatiolla ICA-12 cDNA:n kanssa 15 homologisten sekvenssien läsnäolon suhteen. Faagiplakit, jotka oli levitetty 20 agarmaljalle, replikoitiin nailon-suodattimille ja faagi-DNA denaturoitiin ja kiinnitettiin hybridisaatiota varten tavanomaisella menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Benton ja Davis (1977), Science 196: 180.

20 Hybridisaatiokoetin oli agaroosigeelistä puhdistettu kloonattu ICA-12 cDNA-näyte, joka oli erotettu plasmidivekto-ristaan EcoRI-digestiolla. cDNA-segmentti merkittiin 32P:llä käyttäen random primer-leimausmenetelmää (Feinberg ja Vogelstein (1984), Anal. Biochem. 137: 266). Koettimen 25 hybridisaatio nailonsuodattimille suoritettiin menetelmän : mukaisesti, jonka ovat kuvanneet Berent et ai., (1985)

BioTech. 3: 208. Faagiplakit, joiden tunnistettiin sisäl- • · · tävän ICA-12-koettimelle homologista DNA:ta, poimittiin • · · .·;·. alkuperäisiltä maljoilta ja faagit replikoitiin toista • « * 30 hybridisaatioseulontakierrosta varten. Yksittäiset plakit, ... jotka säilyivät positiivisina ICA-12-sekvenssien suhteen, II» • · · karakterisoitiin sitten niiden cDNA-inserttien ominaisuuk- « « · sien suhteen. Kloonin ICA-12.3 havaittiin DNA-sekvenssi-analyysin mukaan sisältävän koko proteiinia koodittavan j'”: 35 mRNA-sekvenssin, josta ICA-12 sisältää osan.

17 103730 4. Ekspressio

Yksittäisten kloonien ekspressoimat proteiinit analysoitiin ekspressoimalla klooneja E. coli-isännissä. ICA-12:ksi ja ICA-13:ksi tunnistettujen kloonien alkuperäiset 5 ekspressiot suoritettiin lysogeeneissa, jotka oli muodostettu klooneista standardeilla menetelmillä (Huynh et ai.). Seuraavat ekspressiot suoritettiin infektiivisellä ekspressiolla E. coli-kantaan CAG-456 (M. Snyder, S. Elledge, D. Sweetser, R.A. Young ja R.W. Davis: Fgt-11: 10 Gene Isolation with Antibody Probes and Other Applications, Meth. Enzymology 154: 107 - 128 (1987)). Solut kerättiin ja lyysattiin suspendoimalla uudelleen Laemmli’n näytepuskuriin (U.K. Laemmli, Nature 227: 680 (1970)).

Paremmat elektroforeesitulokset saatiin, kun näytteet so-15 nikoitiin DNA:n koon pienentämiseksi ja viskositeetin alentamiseksi.

Suoritettiin proteiinigeelielektroforeesi ja puoli-kuiva siirto sähköisesti joko nitroselluloosalle (Schleicher ja Schuell) tai Immobilon'lie (Millipore Com-20 pany, Bedford, MA, USA). Geelit värjättiin Coomassie Blue-värillä ja suodattimet tunnistettiin immunoreaktion avulla käyttäen samoja seerumeita, joita käytettiin seulottaessa kirjastoa, kuten yllä on yksityiskohtaisesti kuvattu.

5. Kloonianalyysi 25 Yksittäisten kloonien käyttökelpoisuuden arvioimi- : *.. seksi IDDMrn diagnostisoimisessa kukin klooni testattiin reaktiivisuutensa suhteen sarjalla diabeettisia ja normaa- • · · ·*". leja seerumeita. Tämä suoritettiin antamalla kunkin see- • · · rumin reagoida kunkin kloonin Western-blot-kaistan kanssa.

• · · 30 Preparatiivisen geelielektroforeesin jälkeen suoritettiin puolikuiva proteiinien siirto sähkön avulla suodattimille.

• · « ;n Identtiset 3 mm kaistat leikattiin suodattimista ja ne • · · altistettiin eri seerumeille. Antigeenirintamien paikallistaminen suoritettiin vertaamalla analyyttisiin Western-35 blotteihin ja kaistoihin, joiden oli annettu raegoida an-ti-3-galaktosidaasi-vasta-aineen kanssa (1/2000 monoklo- 18 103730 naalinen vasta-aine Promega'lta, Madison, WI, USA). Vasta-aineinkubointi ja tunnistus toisella vasta-aineella on kuvattu yllä.

ICA-12:ksi, ICA-13:ksi, ICA-208:ksi, ICA-302:ksi, 5 ICA-313:ksi, ICA-505:ksi ja ICA-525:ksi tunnistettujen kloonien reaktiivisuusprofiilit on esitetty kuvioissa 1 -5, 14 ja 15. Identtiset suodatinkaistat leikattiin prepa-ratiivisesta elektrosiirrosta ja annettiin reagoida dia-beettisten ja normaalien seerumeiden kanssa (ICA-12, 13, 10 208, 302 ja 313 varten kaistojen annettiin reagoida 20 diabeettisen ja 10 normaalin seerumin kanssa; kun taas 14 diabeettista ja 6 normaalia seerumia käytettiin ICA-505:lie ja 525:lie). Kontrolliprofiili, käyttäen vektoria (lambda gt-11), jossa ei ollut mitään DNA-inserttiä, on 15 esitetty kuviossa 6.

Suodatinkaistat luokitettiin myös voimakkuuden mukaan, 1 = heikosti reagoiva, 2, 3 ja 4 = hyvin vahvasti reagoiva. Yhteenvedot reaktiivisuusluokista on annettu kuvioissa 7 ja 16. Kuviossa 7 seerumit 21 - 30, joilla on 20 etuliite "c", ovat normaaleja kontrolliseerumeita, kun taas diabeettiset seerumit on esitetty niiden lähteen tunnistusnumeron perusteella. Kuviossa 16 seerumit 15 - 20, joilla on etuliite "MRC", ovat normaaleja kontrolliseerumeita, kun taas jälleen diabeettiset seerumit on esitetty 25 niiden lähteen tunnistusnumeroiden perusteella. Molemmissa kuvioissa kloonin otsikon alla osoitetut numerot edustavat ;***; immunoreaktiivisuuden voimakkuutta arvioituna silmämääräi- « · · .···. sesti.

• · • · ·

Joidenkin ensimmäisessä seulonnassa tunnistettujen • · · 30 kloonien havaittiin olevan reagoimattomia Western-blotis- ... sa. Näiden kloonien seerumireaktiivisuuden testaamiseksi « · · *·’ ’ lambda gt-ll-faagia ekspressoitiin E. coli-kannassa • · · CAG456, kuten yllä, ja antigeeni uutettiin käsittelemällä : bakteereita 4 mg/ml lysotsyymillä (Sigma, St. Louis, MO,

. 35 USA) 25 mM Tris, pH 8, 10 mM EDTA, 50 mM glukoosi ja 2 mM

·. fenyylimetyylisulfonyylikloridi (PMSF)-liuoksessa 5 minuu- 19 103730 ttia huoneen lämpötilassa. Solut pelletoitiin 4 °C:ssa ja suspendoitiin uudelleen jääkylmään puskuriin (500 mM nat-riumkloridi, 1 % NP-40, 50 mM Tris, pH 8, 1 mg/ml aproti-niini (Sigma), 2 mM PMSF, 2 pg/ml kymostatiini (Sigma), 5 2 pg/ml Antipain'ia (Sigma) ja 2 pg/ml pepstatiinia). An tigeenin uutos jatkui 30 minuuttia jäissä, jona aikana liuos sonikoitiin. Näytteet ajettiin alas Eppendorf-mik-rofuugissa 5 minuuttia 4 °C:ssa ja supernatantit käytettiin immunopresipitaatioon.

10 Immuunireaktiot sisälsivät: 15 μΐ pesupuskuria (50 mM Tris, 150 mM natriumkloridi, 1 % NP-40, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 2,5 μΐ ihmisen seerumia ja 10 μΐ uutosta. Reaktiot jätettiin yli yön. Antigeeni-vasta-ainekompleksit otettiin talteen käyttäen 20 pl:aa 50 % Proteiini-A Sepharose CL-15 4B-suspensiota (Pharmacia) 1 tunti jäissä. Resiini pestiin kuusi kertaa 500 pl:lla pesupuskuria ja kerran vedellä. PAGE-näytepuskuri lisättiin ja näytteitä keitettiin 5 minuuttia, sentrifugoitiin 5 minuuttia ja ajettiin 8 % geeleissä. Siirto sähkön avulla suoritettiin ja blottien an-20 nettiin reagoida anti-fi-galaktosidaasi-vasta-aineen kanssa (1/1000 laimennus, Sigma numero G4644 blotto-liuoksessa), jonka jälkeen niiden annettiin reagoida alkaaliseen fosfa-taasiin kiinnitetyn anti-hiiri-Ig:n kanssa (DAKO numero D314) ja kehitettiin väriliuoksissa. Tulokset ICA-512 uu-25 tokselle on esitetty kuviossa 19. Nuolet osoittavat yhdis-telmäantigeenin sijainnin.

.**. Eri kloonien DNA-insertin koko määritettiin kasvat- • · • · · .···. tamalla niitä joko maljalysaattina tai nestelysaattina .··«. (Maniatis et ai., supra). Lambda-DNA uutettiin ja katkais- • · · 30 tiin EcoRI-entsyymillä ja analysoitiin koon suhteen aga-... roosigeelielektroforeesilla.

• t · ’·* ’ Yllä tunnistetut kloonit, jotka reagoivat pääasial- • · · V ' lisesti diabeettisten seerumeiden kanssa, on talletettu : American Type Culture Collection’iin, Rockville, MD, USA.

,···. 35 Talletusnumerot ja määrätyt inserttikoot on esitetty alla ·. olevassa taulukossa 1.

20 1 0 3 7 3 0 TAULUKKO 1

Kloonin numero ATCC numero Insertin koko (kb) ICA-12 40550 1,400 5 ICA-13 40553 5,043 ICA-208 40554 0,575 ICA-302 40551 0,794 ICA-313 40552 2,391 ICA-12.3 40703 3,243 10 ICA-525 40704 3,4 ICA-505 40705 0,346 ICA-512 40706 1,8 DNA-insertit siirrettiin Stratagene Bluescript-vek-15 toriin. Sekvensointi suoritettiin standardeilla menetelmillä käyttäen T7 Sequencing-käyttöpakkausta (Pharmacia) yhdessä Stratagene ExoIII/Mung-pavun nukleaasi-käyttöpak-kauksen kanssa, jolla muodostettiin päällekkäin menevät plasmidien deleetiosarjät.

20 Käytettävissä oleva sekvensointitieto kahdeksasta yllä tunnistetusta yhdeksästä kloonista on esitetty kuvioissa 8 - 13, 17 ja 18. Sekvenssin oletetaan olevan täydellinen ICA-12:lie, 302:lie, 313:lie, 208:lie, 505:lie, 12.3:lie, kun taas vain osittainen sekvenssi on saatavissa 25 ICA-13:lie ja 525:lie. DNA-sekvenssit ovat kokeellisesti : *.. saatuja, kuten yllä on kuvattu. Kaikki kolme mahdollista ;***: lukuraamia molemmissa orientaatioissa tutkittiin proteii- «M 1 j nin koodauskyvyn, nimittäin pitkien avoimien lukuraamien, ·«« suhteen. Todennäköisin proteiinisekvenssi kullekin kloo- • · · 30 nille on esitetty isoilla kirjaimilla DNA-sekvenssin alla (paitsi ICA-505: lie, jolle käytettävissä oleva tieto ei • · · salli proteiiniantigeenia koodittavan lukuraamin määrit- • · · ’·' tämistä).

: : Esillä oleva keksintö on erikoisesti kuvattu ja 35 esitetty esimerkeillä yllä. On ajateltu, että keksintöön voidaan tehdä useita muita muunnoksia ja modifikaatioita ilman, että poiketaan sen hengestä ja piiristä.

Claims (8)

103730

1. Eristetty haiman saarekesoluantigeeni, tunnettu siitä, että se sisältää yhdistelmäkloonausvek- 5 torin ATCC 40550, 40551, 40552, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 tai 40706 DNA-insertin koodittaman aminohapposekvenssin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty antigeeni, tunnettu siitä, että sillä on yhdistel- 10 mäkloonausvektorin ATCC 40550, 40551, 40552, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 tai 40706 DNA-insertin koodittansa aminohapposekvenssi.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen eristetty antigeeni, tunnettu siitä, että se on saatu ai- 15 kaan sellaista antigeeniä koodittavan insertin sisältävän yhdistelmä-DNA-vektorin ekspressiolla.

4. Menetelmä insuliinista riippuvaisen sokeritaudin diagnosoimiseksi, tunnettu siitä, että potilaasta saatu verinäyte saatetaan kosketukseen antigeeni- 20 reagenssin kanssa, joka antigeenireagenssi sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen antigeenin, ja määritetään potilaan verinäytteen vasta-aineen sitoutu-minen antigeenireagenssiin.

: 5. Eristetty nukleiinihappo, tunnettu ' 25 siitä, että se koodittaa patenttivaatimuksen 1 tai 2 mu- • · · kaista antigeeniä. • ♦

6. Yhdistelmäkloonausvektori, tunnettu • · *···1 siitä, että se sisältää insertin, joka koodittaa patent- • · · *.1 ' tivaatimuksen 1 tai 2 mukaista antigeeniä.

7. Viljeltävä solu, tunnettu siitä, että • · · '•S : se on transformoitu patenttivaatimuksen 6 mukaisella yh- di s telmä kloonaus vektorilla.

\ 8. Menetelmä insuliinista riippuvaiseen sokeri- tautiin liittyvien T-solujen tai B-solujen läsnäolon to- • 1 '·;· 35 teamiseksi ihmisen verinäytteessä, tunnettu sii- tä, että verinäyte saatetaan kosketukseen minkä tahansa 103730 patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen antigeenin kanssa, ja määritetään sitoutuminen antigeeniin ja verinäytteen T-solujen tai B-solujen välillä. • · • · · • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · • · · • · · • · · 1 · · • · · • · · « • · · • · · 103730