PT93166B - Metodo para a producao de antigenios de celulas dos ilheus pancreaticos - Google Patents
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Description
MOLECULAR DIAGNOSTICS INC,
MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ANTIGÉNIOS DE CÉLULAS DOS ILHÉUS PANCREATICOS r
-2FUNDAMENTO DO INVENTO
Este invento está relacionado de células dos ilhéus pancreáticos que se ligam a anticorpos encontrados no soro de pacientes que sofrem de diabetes melitus (Tipo I) dependente de insulina (IDDM). Mais particularmente, o invento está relacionado com proteínas e peptídeos que se ligam a anticorpos de células dos ilhéus pancreáticos (ICA) e que são preparados por métodos de DNA recombinante (rDNA) ou sintéticos. 0 invento também diz respeito a DNA cionado codificador de tais proteínas e peptídeos ICA. As proteínas e peptídeos ICA do presente invento são úteis como reagentes de imunoensaio no diagnostico pré-simptomático de IDDM.
A evidência acumulada das anormalidades celular e humoral associadas a IDDM levou à hipótese de a doença ser uma perturbação auto-imune. Anticorpos do soro dirigidos contra as células beta produtoras de insulina dos ilhéus pancreáticos foram detectados por imunofluorescência, £G.F.,Bottazzo, A, Florin-Christensen, e D. Doniach: Islet Cell Antibodies in Diabetes Mellitus With Autoimmune Polyendocrine Deficiences, Lancet ii:1279-1283 (1974), e A.C. MacCuish, J. Jordan, C.J. Campbell, L.J.P. Duncan, e W.J. Irvine: Antibodies to Islet-cell in Insulin-dependent Diabetics With Coexistent Autoimmune Disease, Lancet ii: 1529-1533 (1974 )J. Este autoanticorpos são observados em 70-80% dos diabéticos recentemente diagnosticados (NDD), mas apenas em 0,1-1% dos indivíduos normais testemunha /C.H. Brogren e A-Lernmark:
Islet Cell Antibodies in Diabetes. Clin. Endocrinol. Metab.
11: 409-430 (1982)7, e G. F. Bottazzo R. Pujol-Borrell, e D, Doniach; Humoral and Cellular Immunity in Diabetes Mellitus. Clin. Immunol. Allergy 1: 139-159 (1981)7. ICAs têm sido aceites com um factor previzível de IDDM. Uma revisão dos conhecimentos actuais sobre ICA está apresentada por A. Lernmark, Diabetic Medicine 4: 285-292 (1987).
-30 ensaio convencional para ICA consiste em expôr secções de pâncreas a soros, corar com um segundo anticorpo portador de uma marca fluorescente /G.F. Bottazzo et al., supra/ ou enzima /*P.C. Colman, M. Tatkus, A. Rabizadeh, C. Cahill, e G.S. Eisenbarth! Assay foi Islet Cell Antibodies withe rat pancreas and peroxidase Protein A. Diabets Care 11: 367-368 (1988)7 e observação ao microscópio. Um outro método semelhante envolve uma sanduiche de biotina-avidina e detecção por imunofluorescência /ΐ. Kobayashi, T. Sugimoto, T. Itoh, K. Kosaka, T. Tamaka, S. Suwa, K. Sato e K. Tsuju: The Prevalence of Islet Cell Antibodies in Japanese Insulin-dependent and Nom-insulin-dependent Diabetic Patients Studied by Indirect Immunofluorescence and by a New Method Diabets 35; 335-340 (1986)7· Estes métodos são demorados, trabalhosos, difíceis de reproduzir e têm uma sensibilidade limitada. O desenvolvimento de um imunoensaio mais conveniente para ICA permitiria a testagem mais alargada para epidemiologia e correlação com IDDM e finalmente a previsão da doença com um teste de despiste.
Uma principal limitação dos testes correntes para ICA é o conhecimento limitado e caracterizado dos antigénios das células dos ilhéus envolvidos. Os ICAs podem ter um título baixo ou afinidade baixa e serem abordáveis apenas com antigénios caracterizados. Os antigénios de ICA que foram detectados pelo teste de imunofluorescência são de interesse especial; estes antigénios podem incluir:
(1) fracções da superfície de células dos ilhéus /Jí.K. MacLaren, S.W. Hugng e J. Fogh: Antibody to Cultured Human Insulinoma Cells in Insulin-dependent Diabetes Lancet JL: 997-1000 (1975) e A. Lernmark, Z.R. Freechmam, C. Hofmann, A.H, Rubenstein, D.F. Steiner, F.L. Jackson, R.J. Winter e H.S. Transmani; Islet-Cel-surface Antibodies in juvenile Diabetes Mellitus. N. Engl. J. Med. 299: 375-380 (1978)7,
Γ
V
(2) insulina /J.P. Palmer, C.M. Asplin, P. Clemons,
K. Lyen, O. Tetpati, P.K. Raghu and T.L. Paquette: Insulin Antibodies in Insulin-dependet Diabetics Before Insulin Treatment. Science 222: 1337-1339 (1983), e S. Srikanta, A.T. Ricker, D.K. McCulloch, J.S. Soeldner, G.S. Eisenbarth e J.P, Palmer: Autoimmunity to Insulin, Beta Cell Dysfunction, e Development of Insulin-dependet Diabetes Mellitus. Diabetes 35: 139-142 (1986)7, (3) uma proteína dos ilhéus de 64000 daltons (64 kd) de localização celular desconhecida /S. Baekkeskov, J.H, Nielsen, B. Marner, T. Bilde, J. Ludvigsson, e A. Lernmark: Autoantibodies in Newly Diagnosed Diabetic Children Immunoprecipitate Human Pancreatic Islet Cell Proteins. Nature 298: 167-169 (1982)7, e (4) antigénios citoplasmáticos /G.F. Bottazzo, A. Florin-Christensen, e D. Doniach; Islet Cell Antibodies in Diabetes Mellitus With Autoimmune Polyendocrine Deficiencies. Lancet 2t 1279-1283 (1974), A.C. MacCuish, J. Jordan, C.J. Campbell, L.P.J. Duncan, e W.J. Irvine: Antibodies to Islet-Cell in Insulin-Dependent Diabetics With Coexistent Autoimmune Disease. Lancet 1529-1533 (1974), R. Lendrum, G. Walker, and D.R. Gambli: Islet-Cell Antibodies in Juvenile Diabetes Mellitus of Recent Onset. Lancet Ij 880-883 (1975), e W.J. Irvine, C.J. McCállum, R.S. Cray, G.J. Campbell, L.P.J. Duncan, J.W. Farquhar, H. Vaughan, e P.J. Morris: Pancreatic Islet Cell Antibodies in Diabetes Mellitus Correlated With The Duration and Type of Diabetes, Co-existent Autoimmune Disease, e HLA-type. Diabetes 26: 138-147 (1977).
(5) glicoconjugados /R.C. Nayak, M.A.K. Ornar, A. Rabizadeh, S. Srikanta, e G.S. Eisenbarth, “Cytoplasmic Islet Cell Antibodies: Evidence That the Target Antigen is a Sialoglycoconjugate. Diabetes 34: 617-619 (1985); P. Vardi, E.E. Dibella, T.J. Pasquarello, e S. Srikanta, Islet Cell Autoantibodies: Pathobiology and Clinicai Applications. Diabetes
Care 10; 645-56 (1987); B.K. Gillard, J.W. Thomas, L.J, Nell and D.M. Marcus, Antibodies Against Ganglioside GT3 in the
Sera of Patients with Type I Diabetes Mellitus. Journal of
Immunology 142; 3826-32 (1989)/.
O antigénio de 64 kd foi ceracterizado relativamente ao tamanho e ponto isoeléctrico por imunoprecipitação de proteínas dos ilhéus marcadas radioactivamente, mas não existe informação sobre a sequência. Duas publicações indicam uma prevalência elevada de anticorpo que reconhece esta proteína em soros de pré-diabéticos assim como em soros de diabéticos recentemente diagnosticados /S. Baekkeskov, M. Landin, J.K. Kristensen, S. Srikanta, G. Jan Bruining, R. Mandrup-Poulsen, C. de Beaufort, J.S. Soeldner, G. Eisenbarth, f. Lindgren, G. Sundguist, and A. Lernmark; Antibodies to a 64.000 MW Human Islet Cell Antigen Precede the Clinicai Onset of Insulin-dependent Diabetes. J. Clin. Invest. 79; 926-934 (1987), and M.A. Atkinson, N.K. Maclaren, W.J. Riley, D.W. Sharp and L. Holmes; Mr 64.000 Autoantibodies (64KA) Predict Insulin Dependet Diabetes. American Diabetes Assoe. 48th Annual Meeting (1988) Abstract #391/.
Algumas outras êspécies moleculares foram caracterizadas por transferência Western como sendo antigênios comuns reconhecidos por soros de diabéticos /D. G. Karounos, V.J. Virta, L.J. Nell, and J.W. Thomas: Analysis of human and RINmSF Islet Cell Antigens.American Diabetes Assoe. Res. Symp. Woods Hole, MA. October 1987; Abstract #120/. Estes antigénio têm pesos moleculares de 150 kd, 84 kd 60 kd, 49 kd, e 36 kd.
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SUMÁRIO DO INVENTO
O presente invento proporciona uma série de ácidos nucleícos cionados que codificam uma ou mais proteínas ai fragmentadas de proteínas que se ligam selectivamente a anticorpos das células dos ilhéus pancreáticos (ICA). Tais ácidos nucleícos cionados são caracterizados pelas suas inserções de cDNA em bacteriofagos recombinantes depositados ATCC 40550, 40551, 40552, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 e 40706.
O presente invento proporciona também proteínas ICA e fragmentos peptídicos de ICA que são codificados pelos ácidos nucleícos cionados e são úteis nodiagnostico de diabetes melitus (Tipo I) dependente de insulina (IDDM). A capacidade de tais proteínas e peptídeos para se ligarem ao sítio de combinação do anticorpo em ICAs também confere utilidade na ligação ou bloqueamento de imunoglobulina humana, células T ou células B envolvidas em IDDM, incluindo imunoglobulina circulante, células T e células B.
As proteínas e peptídeos ICA do presente invento são obtidos por métodos tais como expressão total ou parcial, facultativamente com subsequente fragmentação, dos presentes ácidos nucleícos cionados; e síntese de peptídeos ou polipeptxdeos baseada nas sequências de aminoácidos determinados a partir dos presentes cDNAs cionados ou a partir dos genes dos antigénios ICA de tamanho completo os quais podem ser determinados ou isolados a partir de bibliotecas de ácidos nucleícos de células dos ilhéus com a ajuda das presentes sequências de cDNA clonado complementar. Assim, tais proteínas e peptídeos ICA incluem proteínas ICA de tamanho completo de células de ilhéus e que são expressas pelo gene humano cujo mRNA é pelo menos em parte complementar da sequência completa dos presentes cDNAs cionados, Também estão incluídas nas proteínas e peptídeos ICA do presente invento as proteínas expressas por veículos de clonagem recombinante compreendendo as presentes inserções de cDNA e fragmentos de tais proteínas obtidos por expressão parcial ou por subsequen te fragmentação como seja com nucleases de restrição. As proteínas e peptídeos ICA do presente invento também incluem peptídeos obtidos por síntese proteica, tais como os que têm 3 aminoácidos ou mais de comprimento, os quais representam epítopos de ICA ou análogos ou seus derivados.
presente invento oferece uma série de vantagens significativas. A clonagem molecular dos antigênios ICA permite a preparação de quantidades grandes e reprodutíveis de material para usar em investigação, diagnóstico e tratamento de IDDM, assim como a oportunidade para estudar os mecanismos biológicos envolvidos na destruição de células dos ilhéus e no aparecimento de ICA. A disponibilidade de grandes quantidades de antigénio puro permite o desenvolvimento de imunoensaios altamente sensíveis e específicos que podem ser usados no despiste da população em geral para IDDM pré-simptomático ou uma predisposição para desenvolver IDDM.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
As Figs. 1-5, 14 e 15 perfis de reactividade dos clones de ICA depositados na ATCC preparados de acordo com o presente invento com soros diabéticos e normais nas condições descritas nos Exemplos.
A Fig. 6 é um perfil testemunha usando o fago de clonagem sem inserção recombinante.
,-8As Fig. 7 e 16 são sumários dos perfis de soros dos clones de ICA mostram valores de reactividade atribuídos por interpretações visual dos perfis nas Figs. 1-5 e 14-15, respectivamente.
As Figs. 8-13, 17 e 18 são sequências de DNA e sequências de proteínas deduzidas de clones de ICA particulares.
A Fig. 19 mostra os resultados de imunoprecipitação de um dos clones de ICA com soros diabéticos e normais.
DESCRIÇÃO DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS
Tal como aqui é usado, o termo antigênios ICA deve ser compreendido como referindo-se a proteínas e peptideos proporcionados pelo presente invento mesmo sendo reconhecido que nalguns casos as formas peptídicas não serão antigênios no sentido estricto, i.e., eles serão hapténicos uma vez que necessitarão de ligação a um veículo macromolecular convencional para estimular a produção de anticorpos num animal hospedeiro.
Ainda, os ácidos nucleicos clonados, sequências de antigênio ICA clonados, inserções de cDNA e termos similares deverão referir-se a inserções nos fagos recombinantes depositados ATCC 40550, 40551, 40552, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 e 40706 e também a outras sequências de ácidos nucleicos de genes de tamanho completo ou fragmentos de tais sequências, compreendendo tais sequências depositados. Será reconhecido que um ou mais antigênios
ICA de tamanho completo são caracterizados por homologia com as inserções de cDNA atrás depositadas, no entanto, é possível que duas ou mais de tais inserções de cDNA correspondem a um único antigénio ICA. Por exemplo, a inserção em ATCC 40703 parece englobar as inserções de ATCC 40550 e de ATCC 40554 e portanto estas três inserções podem todas corresponder a fracções diferentes e/ou sobreponíveis de um único antigénio ICA.
PREPARAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE ANTIGÉNIO ICA CLONÃDAS
Em geral, as sequências de antigénio ICA clonados do presente são obtidos através da expressão de genes humanos num veículo de clonagem recombinante adequado, e.g. bacteriófago. e despiste da biblioteca de genes resultante com soro IDDM para seleccionar antigénios que são reconhecidos por anticorpos ICA. Os antigénios recombinantes são então despistados com um painel de soros diabéticos e normais para determinar a especificidade da doença dos clones identificados.
Os clones depositados particulares foram mais particularmente obtidos pelo método que se segue (outros detalhes podem ser encontrados nos Exemplos abaixo). Uma biblioteca de cDNA humano foi obtida extraindo RNA de ilhéus humanos purificados. Este RNA foi fraccionado por cromatografia para separar mRNA poli-A do outro DNA como seja RNA ribossomal e fragmentos de RNA degradado. O mRNA separado foi sujeito a transcrição reversa com um Kit” comercial de cDNA (Bethesda Research Laboratories), ligado a adaptadores de DNA EcoRI e ligado a braços de lambda gt-11 para encapsidação in vitro. O lambda ligado foi encapsidado usando um Kit comercial (Stratagene) e depois amplificado numa camada de bactérias em placa.
-10A biblioteca de fagos foi despistada com anticorpos de pacientes autoimunes com diabetes Tipo I. As bactérias infectadas com fagos foram semeadas em placas de agarose e a expressão de proteína recombinante foi induzida quimicamente. A proteína foi depositada em filtros que foram então despistados com soro. As placas que surgiram como positivas foram isoladas das placas de agarose e purificadas atrás de dois ciclos de isolamento. Após a clonagem, o fago gt-n foi usado para infectar um hospedeiro bacteriano para a expressão em larga escala. A especificidade das proteínas expressas pelo cDNA clonado foi avaliada por transferências Western de extractos bacterianos contendo a proteína humana clonada. Géis preparativos de poliacrilamida foram sujeitos a electroforese e electrotransferidos para membranas, as membranas foram cortadas as^tiras e depois reagiram com uma série de soros normais e diabéticos. Os clones que deram origem a proteínas que reagiram exclusiva ou predominantemente com soros diabéticos foram seleccionados.
Veículos de clonagem recombinante e subclonagem
Como é do conhecimento geral, os produtos de transcrição de cDNA do presente invento, tais como cDNA de bibliotecas de inserções de cDNA removidas de um veículo de clonagem, podem ser incorporados numa variedade de veículos de clonagem recombinante para amplificação da sequências de interesse e para expressão de antigênios ICA de interesse. Um veículo de clonagem recombinante será compreendido como uma molécula ou estrutura bioquímica, e.g., DNA, que permite a inserção de sequências de polinucleotídeos e replicação das sequências de polinucleotídeos inseridos quando o veículo é adequadamente incorporado numa célula hospedeira. Um veículo de expressão inclui ainda a propriedade de expressar a proteína codificadora pelo polinucleotídeo inserido. Num vector de expressão, a sequência de antigênio ICA inserida é operacionalmente ligada a uma sequência de controle adequada capaz de efectuar a expressão do antigênio ICA num hospedeiro adequado. A sequência de controle envolvida variará de acordo com o hospedeiro e método de transfermação selecionado. Estas matérias são conhecidas dos famialiarizados com a área.
Veículos de clonagem recombinante adequados inclui plasmídeos, vírus e bacteriófagos e fragmentos de DNA integráveis (i.e., fragmentos integráveis no genoma hospedeiro através de recombinação), Os veículos de expres são são particularmente preferidos e são exemplificados, sem limitação pelos plasmídeos bacterianos pEMBL, pMMB e pUK, de levedura pAAH5, pYE4 e pAB112, pRSV de mamífero, vectores derivados do vírus da vacina, vectores derivados do vírus papiloma, vectores retrovirais e vectores vai-vem tais como pCDM8. Para uma revisão ver DM. Glover, DNA Cloning: A Practical approach (1985) IRh Press Ltd. Células hospedeiras adequadas incluem procariótas, leveduras e células de eucariotas superiores incluindo células de mamíferos.
A subclonagem de inserções de
CDNA pode envolver excisão da inserção para ligação num veículo de clonagem diferente. A inserção pode ser removida usan do a enzima de restrição correspondendo aos adaptadores usados na inserção original ou usando as enzimas de restrição seleccionados de um mapa de restrição da inserção. O cDNA excisado pode ser inserido num outro vector adequado parabsequenciação, amplificação ou expressão conforme pretendido. No caso dos sítios de restrição terminais no veículo de clonagem original terem sido destruídos, podem ser usados outras enzimas para recuperar a inserção e as regiões delimitantes resul tantes e as regiões delimitantes resultantes do veículo de f
X clonagem eliminadas por meios convencionais.
Clonagem de genes de tamanho total
Fragmentos das inserções de cDNA do presente invento podem ser usados para isolar cDNA clones de cDNA ou de DNA genómico de tamanho total a partir de biblio tecas adequadas por métodos convencionais. A biblioteca alvo é semeada em placas, deixado crescer, transferida para filtros e feita reagir com sondas de DNA. Tais sondas de DNA são geradas a partir de fragmentos de restrição das inserções de DNA por métodos tais como marcação terminal, mick translation, transcrição iniciada ao acaso ou por meios fotoquímicas. Os oligonucleotídeos podem ser sintetizados, marcados e usados como sondas de hibridação. As sondas de RNA podem também ser geradas a partir de cDNA subclonado por transcrição a partir de moldes adequados.
Os veículos de clonagem recombinante, e.g., fagos ou plasmídeos que parecem reagir com os clones de cDNA parcial são novamente despistados e depois fei to o mapa de restrição. Os clones potencialmente com interesse são então sequenciados para confirmar a hibridação das sondas originais e para obter mais informação acerca da sequência no fragmento maior. Se os clones de tamanho completo não forem obtidos neste processo, a sequência completa de ácido nucleico codificador do gene humano, pode ser montada a partir de sequências sobreponíveis de fragmentos clonados.
Om método alternativo para a obtenção de fragmentos maiores e possivelmente clones de tamanho completo, utiliza anticorpos induzidos contra antigénios
ICA expressos por clones parciais. Após identificação de um antigênio de interesse, ele pode ser usado como imunogênio para induzir anticorpos monoclonais ou policlonais de titulo e afinidade elevados. Tais anticorpos premitirão a detecção de clones de cDNA maiores e de clones de cDNA presentes em quantidades baixas nas bibliotecas.
Sintese de antigênios e peptídeos
Os antigênios XCA, conforme aqui definidos, podem ser preparados através de uma série de maneiras diferentes a partir dos clones e informação acerca da sequência proporcionada pelo presente invento. Pode-se simplesmente expressar as proteínas a partir de clones do antigénio ICA obtidos de acordo com o presente invento, particularmente a partir dos clones depositados. Tais proteínas expressas, ou fragmentos ou seus produtos de digestão podem ser usados como antigênios para ligação a anticorpos de células dos ilhéus. No entanto, a utilização directa dos extractos de expressão bacterianos pode ser não possível nalguns casos uma vez que o soro humano normalmente reage inespecíficamente com proteínas de E. coli. Em tais casos, os antigénios ICA expressos podem ser isolados por técnicas convencionais tais como separação electroforética seguida de imobilização em membranas (transferência Western) ou por cromatografia em coluna ou purificação de afinidade (e.g. cromatografia com resina de afinidade anti-beta-galactosidase ou por outros meios bioquímicos convencionais, e.g. precipitação com sal ou pela temperatura).
Como alternativa os fragmentos peptidicos podem ser sintetizados por métodos bem conhecidos
-14a partir das sequências de aminoácidos deduzidos a partir de sequências de DNA determinadas experimentalmente dos clones de antigênio ICà. Peptídeos sobreponíveis podem ser sintetizados e testados quanto à reactividade com soro ICA. A medida que se encontra peptídeos reactivos, peptídeos mais pequenos podem ser preparados de modo a mapear a mais pequena unidade que dá reacção, i.e., o epítopo.
Métodos
Uma das principais utilizações dos antigénios ICA proporcionados pelo presente invento é no diagnóstico e previsão de IDDM. Num destes métodos, uma amostra de sangue, normalmente uma amostra de soro, reage com um antigênio seleccionado de uma série de antigénios ICA e a imuno-reactividade é determinada por qualquer técnica convencional. É ainda considerado que o papel do perfil de imuno-reactividade com diferentes antigénios ICA pode proporcionar informação significativa em termos de diagnóstico respeitante à natureza da doença, e.g. subtipos, o estado da doença, a proximidade do estabelecimento da doença, a eficácia da terapia, e.g. terapia imune e similares.
Uma outra utilização dos presentes antigénios ICA é na identificação, marcação ou destruição específica de células B auto-reactivas. Se os autoanticorpos tiverem um efeito prejudicial na IDDM, é considerado que a terapia anti-células B pode baixar ou parar o progresso da doença de pré-diabetes para IDDM clínica.
Uma outra utilização dos presentes antigénios ICA é na identificação de populações de célu-15las T reactivas com ilhéus. Os antigênios ICA podem servir como antigênios estimuladores para a cultura de células T permitindo melhorar significativamente a clonagem identificação e crescimento de células T. É considerado que a detecção de células T com ICA pode ser importante no diagnóstico do estado pré-diabético e que o controle do nível de células T auto-reactivas pode dar uma indicação do progresso da doença e da utilidade das terapias de modulação imunológica. Ainda, a geração de culturas de células T com ICA pode proporcionar um modelo in vitro para projectar terapias de diabéticos. Finalmente, é considerado que a imunização de células T pode parar ou retardar a auto-imunidade ao gerar uma resposta humoral contra elementos auto-destrutivas.
A capacidade de ligação de antigénios ICA a imunoglobulina ICA humana e células T pode ser usado para bloquear a ligação de ICA a células de ilhéus e a componente das células de ilhéus in vivo e portanto considerados como proporcionando um efeito terapêutico directo.
presente invento será agora ilustrado pelos exemplos que se seghuem não sendo porém por eles limitado.
EXEMPLOS
1. Biblioteca de cDNA
Ilhéus de hangerhans foram purificados pelos Drs. Paul Lacy e David Scharp da Washington Univ., St. Louis, MO,.USA, de acordo com um processo publicado. /C.
-16Ricordi, P.E, Lacy, E.H. Finke, B.J. OLack, e D.W. Scharp:
An Automated Method for Isolation of Human Pancreatic Islets. Diabetes 37: 413-420 (1988)/. Resumidamente, pâncreas humano foi perfusido com clonagem e depois triturado. Usou-se centrifugação em gradiente de Ficoll para isolar os ilhéus os quais foram então cultivados durante 1 semana à temperatura ambiente. Os ilhéus foram congelados e despachados.
Quando da chegada os ilhéus foram descongelados, reunidos e lavados. O RNA foi extraído usando tiocianato de guanidinio e precipitado selectivamente com cloreto de lítio /G. Cathala, J.F. Savouret, B. Mendez, B. L. West, M. Karin, J,A. Martial e J.D. Baxter: A Method for Isolation of Intact, Transtationally Active Ribonucleic Acid.
DNA 329-335 (1983)/. Obteve-se cerca de 770 pg de RNA total a partir de cada ml de ilhéus centrifugados. O RNA mensageiro foi purificado usando OLigo (dT)-celulose Tipo 7 da Pharmacia (Pharmacia Fine Chemical, Piscataway, NJ, USA), seguindo o processo de Maniatis et al, Maniatis, E.F. Fritsel e J. Sambrook: Molecular Clonig, A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory p» 197-198/. Cerca de 30 pg de RNA foram obtidos após cromatografia. A tradução in vitro usando um Kit BRL ^8110 (Bethesda Research Laboratory, Gaithers35 burg, MD, USA) e S-metionina mostrou a produção de proteínas de larga gama de pesos moleculares.
Usou-se um Kit BRL #8267SA na síntese de cDNA Dez (10) pg de RNA poli-A+ foi usado na reacção. Os extremos foram tornados cerses com DNA-polimerase de T4 (Pharmacia) e o cDNA foi metilado com metilase de ECORI (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) e S-adenosilmetionina e ligado a adaptadores EcoRI. O cDNA foi digerido com EcoRI e sugeito a electroforese numa coluna de Biogel A15M (Bio Rad Laboratories, Rockville Center, Ny, USA) para separar os adaptadores e fragmentos.
-17.X
Q cDNA foi ligado a braços lambda gt-11 e encapsidado com um Kit Stratagene Gigapack Plus (stratagene Clonig Systems, LaJolla, CA, USA). Obteve-se uma 5 biblioteca de aproximadamente 8,5 x 10 clones contendo inser ções (medido com 5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-D-galactopiranosido) que se amplificou em E. coli ¥1090 (Stratagene).
2. Soros
Os soros de diabéticos recentemen te diagnosticados foram obtidos do Dr. William Riley na University of Florida, Gainesville, FL, USA e do Dr. Alan Drash no Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA. Soros normais (não diabéticos) foram colhidos de indivíduos no laboratório. Os soros foram adsorvidos com filtros que foram preparados por (a) lise de E. coli infectada com lambda usando clorofórmio e embebendo filtros de nitrocelulose neste lisado ou (b) preparação dos filtros cobrindo os filtros embebidos com isopropil-B-tiogalactopiranosido (IPTG) sobre E. coli infectada com lambda numa placa, essencialmente como para o despiste da biblioteca. Os soros foram diluídos 1/20-1/200 em solução blotto (5% de leite em pó desnatado Carnation, 10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05% de Tween-20 e 0,05% de azida de sódio)após fraccionamento do material bruto como descrito abaixo.
3. Despiste • O processo de despiste baseia-se em protocolos convencionais (T.V. Huynh, R.A. Young e R.W, Davis: Constructing and Screening cDNA hibraries in Fgt 10 and Gft 11 in DNA Cloning. D.M. Glover ed, (1985) IRL Press p. 490-78). Os filtros foram preparados semeando cerca de
50000 unidades formadoras de placas (pfu) da biblioteca por placa de agarose de 150 mm num total de 10 placas. Após crescimento a 422C durante cerca de 3 horas, os filtros (Nitrocelulose de Schleicher e Schnell, Keene, NH, USA) contendo IPTG foram aplicadas sobre as placas e o crescimento continuou a 372C durante 3-4 horas ou durante a noite. Os filtros foram bloqueados com uma solução blotto e guardados a 4SC.
Inicialmente, todas as reacções de anticorpos com filtros foram efectuadas à temperatura ambiente durante 3 horas. Em experiências posteriores as incubações com soros foram feitas durante a noite a 49C em solução blotto sem Tween-20, enquanto que as reacções com anticorpos secundários foram feitas à temperatura ambiente durante 1,5 horas. Todas as incubações subsequentes e lavagens foram feitas em agitadores de plataforma com rotação suave.
A biblioteca foi despistada com sondas de anticorpos humanos várias vezes. No primeiro caso, o anticorpo foi purificado a partir de soros diabéticos por HPLC. No segundo e terceiro os soros foram precipitados com sulfato de amónio a 50% e dialisados. Para o primeiro e terceiro despiste usou-se uma mistura de dois soros em todos os ciclos de purificação. Para o segundo despiste, usou-se uma mistura de 20 soros diabéticos para as purificações principais. Num outro despiste, reuniram-se 22 soros, precipitados com sulfato de amónio e dialisados e a diluição final de trabalho para cada soro foi de 1/500 em blotto sem Tween 20.
Após incubação nos soros diabéticos, os filtros foram lavados 5-10 minutos de cada vez em soro fisiológico com Tris (T3S), T3S com 0,05% de Tween-20 e depois com TBS. O anticorpo humano ligado aos filtros foi detectado por reacção com IgG de coelho anti-IgG humana conjugado com fosfatase alcalina (1/500 em blotto, anticorpo DaKopatts D336-DAKO Corp, Santa Barbara, CA, USA). Os filtros foram lavados em TBS/Tween-20, TBS, TBS, e depois em tampão
-19de detecção (0,1 M Tris-HCl, pH 9,5, O,1M NaCl, 0,05 M MgCl2) recomendado pela BRL para usar no seu kit de detecção de DNA NS. 8239SA). Adicionaram-se substratos cromogénicos (nitro-blue tetrazolium e fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo) e a reacção foi protegida da luz. Após desenvolvimento da côr os filtros foram lavados em água, depois em 10 mM Tris (pH 8,0), lmM EDTA (TE) e secos. A melhor observação das placas foi feita quando os filtros ainda estavam molhados.
As placas positivas foram localizadas nas placas originais por alinhamentos com os filtros. Para os despistes iniciais um pedaço de agar contendo uma placa positiva foi removida usando o extremo fino de uma pipeta Pasteur estéril. Para subsequentes despiste onde se podiam distinguir as placas individuais usou-se o topo da pipeta.
As placas foram eluidas para tampão de armazenamento de placas (Maniatis et al., supra) eluidas durante pelo menos várias horas.
Os métodos de despiste atrás descritos produziram os clones depositados específicos de ICA aqui descritos com excepção de ICA-12.3 que foi isolado como se segue.
Aproximadamente 1© unidades formadoras de placas da biblioteca de fagos forara despistados por hibridação de DNA quanto à presença de sequências homólogas com o cDNA de ICA-12. As placas fágicas distribuídas pelas 20 placas de agar foram transferidas para filtros de nylon e o DNA fágico foi desnaturado e imobilizado para hibridação pelo processo convencional de Benton e Davis (1977) Science 196: 180. A sonda de hibridação foi uma amostra purificada em gel de agarose de cDNA de ICA-12 cionado e separado do seu vector plasmídeo por digestão com EcoRI. O segmento de DNA foi marcado com ‘P pelo método de marcação com iniadores ao acaso (Feinberg e Vogelstein (1984) Anal. Biochem 137:266). A hibridação da sonda com filtros de nylon foi
feíta de acordo com Berent et al,, (1985) Biotech. 3:208. As placas fágicas identificadas como contendo DNA homólogo usando a sonda ICA-r foram repicados a partir das placas mãe e o fago foram replicados para um segundo ciclo de despiste de hibridação. As placas individuais que permaneceram positivas relativamente a sequências ICA-r foram então caracterizados relativamente às propriedades das inserções de cDNA. Encontrou-se por análise de sequência de DNA que o clone ICA-12,3 contem toda a sequência codificadora de proteína do mRNA parcialmente representado em ICA-12.
4. Expressão
As proteínas expressas pelos clones individuais foram analisados através da expressão dos clones em hospedeiros E. coli. As expressões iniciais com clones identificados como ICA-12 e ICA-13 foram feitas com lisogenes gerados com os clones por meios convencionais (Huynh et al). As expressões subsequentes foram feitas por expressão infecciosa em E. coli CAG-456 /M. Snvder, S. Elledge, D. Sweetser, R.A. Young, e R.W. Davis: Fgt-11: Gene Isolation with Antibody Probes and Other Applications, Meth. Enzymology 154: 107-128 (1987)J7. As células foram colhidas e lisadas por ressuspensão em tampão de amostra Laemmli /U.K. Laemmli Nature 227: 680 (1970)}. Obtiveram-se melhores resultados de electroforese quando as amostras foram sonicadas para reduzir o tamanho do DNA e reduzir a viscosidade.
A electroforese das proteínas em gel e a electrotransferência semi-seca para nitrocelulose (Schleicher and Shuell) ou Immobilon (Millipore Company, Bedford, MA, USA) foram efectuadas. Os géis foram corados com azul Coomassie e os filtros foram detectados por imuno-reacção com os mesmos soros usados no despiste da biblioteca conforme detalhado atrás,
21Análise de clones
Para avaliar a utilidade dos clones individuais no diagnóstico de IDDM, cada clone foi testado quanto à reactividade com ura painel de soros diabéticos e normais. Isto foi feito reagindo cada um dos soros com uma tira de transferência Western de cada clone. A electroforese preparativa em gel foi seguida de electrotransferência semi-seca das proteínas para os filtros. Tiras idênticas de 3 mm foram cortadas dos filtros e expostas aos vários soros. A localização das bandas de antigénio foi feita por referência a transferências Western analíticas e as tiras reagiram com o anticorpo anti-beta-galactosidase (1/2000 de anticorpo monoclonal da Promega, Madison, WI, USA). A incubação e detecção de anticorpos com anticorpo secundário foram descritos atrás.
Os perfis de reactividade dos clones identificados como ICA-12, ICA-13, ICA-208, ICA-313, ICA-505, e ICA-525 estão apresentados nas Figs. 1-5, 14 e 15 dos desenhos. Tiras de filtros idênticos foram cortadas da electrotransferência preparativa e reagiram com soros diabéticos e normais (para ICA-12, 13, 208, 302 e 313, as tiras reagiram com 20 soros diabéticos e 10 soros normais; enquanto que se usou 14 soros diabéticos e 6 soros normais para ICA-505 e 525). Na Fig. 5 está apresentado um perfil testemunha usando o vector (lambda gt-11) não tendo inserção de DNA.
As tiras de filtros foram também avaliadas de acordo com a intensidade, 1 = reactividade fraca, 2, 3 e 4 = reactividade muito forte. Nas Figs. 7 e 16 dos desenhos estão apresentados sumários das classificações de reactividade. Na Fig. 7 os soros 21-30 portadores do prefixo õ são os soros normais de controle, enquanto os soros diabéticos são apresentados com o número de identificação de sua fonte. Na Fig. 16, os soros 15-20 portadores do perfixo MRC são soros normais testemunha, enquanto novamente os soros dia béticos são apresentados com os seus números de identificação das fontes. Em ambas as Figuras, os números mostrados sob os títulos dos clones representam a força da imuno-reactividade atribuída por interpretação visual.
Alguns clones identificados no primeiro despiste foram observados como não reactivos nas transferências Western. Para testar a reactividade com soro destes clones, o fago lambda gt-li foi expresso em E. coli CAG456 como atrás e o antigênio foi extraído tratando as bactérias com 4 mg/ml de lisozima (Sigma, St. Louis, MO, USA) em 25 mM Tris, pH 8, 10 mM EDTA, glucose 50 mM e cloreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 2 mM durante 5 minutos à temperatura ambiente. As células foram sedimentadas a 42C e ressuspensas em tampão arrefecido em gelo (cloreto de sódio 500 mM, 1% MP-40, 50 mM Tris, pH 8, 1 mg/ml de aprotinina (Sigma), mM PMSF, 2 pg/ml de quimostatina (Sigma), 2 pg/ml de Antipain (Sigma) e 2 pg/ml de pepstatina. A extracção de antigénio prosseguiu durante 30 minutos em gelo, durante este período a solução foi sonicada. As amostras foram centrifugadas numa microcentrífuga.Eppendorf durante 5 minutos a 4SC e os sobrenadantes foram usados para imunoprecipitação.
As reacçoes imunes consistiram em: 15 pl de tampão de lavagem (50 mM Tris, cloreto de sódio 150 mM, 1% NP-40, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 2,5 pl de soro humano e 10 pl de extracto). As reacçoes foram deixadas a correr durante a noite. Os complexos antigénio-anticorpo foram recuperados com 20 pl de uma pasta a 50% de Proteina-A Sepharose CL-4B (Pharmacia) durante 1 hora em gelo. A resina foi lavada seis vezes com 500 pl de tampão de lavagem e uma vez com água. Adicionou-se tampão de amostra de PAGE e as amostras foram fervidas durante 5 minutos centrifugadas durante 5 minutos e sujeitas a electroforese em géis de 8%. A electrotrans ferência foi efectuada e as transferências reagidas com anticorpo anti-beta-galactosidase (diluição 1/1000 da Sigma ^4644 em solução blotto) seguido de anti-soro anti-Ig de ratinho
-23acoplado a fosfatase alcalina (DAKO D314) e revelação com corantes. Esteg resultados estão apresentados na FIG. 19 para um extrato de ICA-512. As setas indicam a posição de antigénio recombinante.
tamanho da inserção de DNA para os vários clones foi determinados crescendo-os num lisado em placas ou líquido (Maniatis, et al., supra). O DNA de lambda foi extraído e cortado com EcoRI e analisado quanto ao tamanho por electróforese em gel de agarose.
Os clones atrás identificados que reagiram predominantemente com os soros diabéticos foram âepo sitados na American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA. Os números de depósitos e os tamanhos das inserções determinados estão apresentados na Tabela 1 abaixo.
TABELA 1
Clone $ ATCC Tamanho da inserção (kb)
| ICA-12 | 40550 | 1,400 |
| ICA-13 | 40553 | 5,043 |
| ICA-208 | 40554 | 0,575 |
| ICA-302 | 40551 | 0,794 |
| ICA-313 | 40552 | 2,391 |
| ICA-12,3 | 40703 | 3.243 |
| ICA-525 | 40704 | 3,4 |
| ICA-505 | 40705 | 0,346 |
| ICA-512 | 40706 | 1,8 |
-24As inserções de DNA foram transferidas para um vector Bluescript Stratagene. A sequênciação foi feita por técnicas convencionais usando o Kit de sequen ciação T7 (Pharmacia) em conjunção com o kit ExoIIX/Mung
Bean Nuclease Stratgene para gerar séries de deleções sobreponíveis dos plasmídeos.
A informação de sequenciação disponível em oito dos nove clones atrás identificados está apresentada nas Figs. 8-13, 17 e 18 dos desenhos. A sequência é considerada como completo para ICA-12, 302, 313, 208, 505, 12,3, enquanto só existe sequenciação parcial para ICA-13 e 525. As sequências de DNA são as experimentalmente derivadas como descrito atrás. As três grelhas de leitura possíveis em ambas as orientações foram examinadas quanto à capacidade codificadora de proteínas, i.e., grelhas de leitura abertas e longas. A sequência proteica mais provável para cada clone está apresentada um letras maiusculas por baixo da sequência de DNA (excepto para ICA-505 para o qual a informação disponível não permite a identificação da grelha de leitura codifi cadora do antigênio proteico).
O presente invento foi particularmente descrito e exemplificado atrás. Atrás considerado que muitas outras variações e modificações do invento podem ser feitas sem se afastarem do seu espirito e âmbito.
Claims (9)
- REIVINDICAÇÕES:lâ. - Método para a obtenção de uma proteína ou peptídeo isolado ou de um fragmento de tal proteína ou peptídeo, caracterizado por se incorporar na referida proteína ou peptídeo a sequência de aminoácidos codificada pela inserção de DNA do veículo de clonagem recombinante ATCC 40550, 40551, 50442, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 ou 40706.
- 2ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma proteína isolada a qual é uma proteína de tamanho completo expressa pelo gene humano cujo mRNA é em parte complementar da sequência completa da inserção de DNA do veículo de clonagem recombinante ATCC 40550, 40551, 40552, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705, ou 40706, ou um fragmento proteico ou peptídico de tal proteína.
- 3â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma proteína ou peptídeo isolado que possui a sequência de aminoácidos codificados pela inserção de DNA do veículo de clonagem recombinante ATCC 40550, 40551, 40552, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 ou 40706 ou que é fragmento peptídico de tal sequência que tem pelo menos 3 aminoácidos de comprimento.
- 4â. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se obter uma proteína ou peptídeo isolado, obtida por expressão num vector de DNA recombinante compreendendo uma inserção codificadora de tal proteína ou peptídeo ou por síntese peptídica.
- 5ê. - Método de diagnostico de diabetes melitus dependente de insulina num paciente, caracterizado por uma amostra de sangue obtida a partir de tal pa ciente ser posta em contacto com um reagente antigênio compreendendo uma proteína de peptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, é determinada a ligação do anticorpo da amostra de sangue do paciente ao reagente antigênio.
- 6â. - Método para obtenção de um ácido nucleico isolado que codifica uma proteína ou peptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou um ácido nuclei co isolado hibridável com ele, caracterizado por se induzir no referido ácido nucleico as inserções de DNA em bacterófagos recombinantes ATCC 40550, 40551, 40552, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 e 40706.
- 7ã. - Veículo de clonagem recombinante, caracterizado por compreender uma inserção gue codi fica uma proteína ou peptídeo de qualquer uma das reivindica ções 1 a 3.
- 8â. - Célula susceptível de ser cultivada, caracterizada por ter sido transformada com um veículo de clonagem recombinante da reivindicação 7.
- 9â. - Método para detecção da presença de células T ou de células B que estejam envolvidas em diabetes melitus dependente de insulina numa amostra de sangue humano, caracterizado por a amostra de sangue ser pos ta em contacto com a proteína ou peptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e ser determinada a ligação entre tal proteína ou peptídeo e células B ou células T de amostra de sangue.-27<<lOâ. - Método para a obtenção de uma preparação farmacêutica para o bloqueamento de imunoglubulina humana, células T de células B envolvidas nos diabetes melitus dependente de insulina, caracterizado por se incluir na referida composição a proteína ou peptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4.Lisboa, 15 de Fevereiro de 1990
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