DE69123723T2 - Diagnostisches verfahren und reagenz für hiv - Google Patents

Diagnostisches verfahren und reagenz für hiv

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Description

  • Die Erfindung betrifft diagnostische Verfahren zur Diagnose der HIV-Infektion.
  • AIDS (Acquired immune deficiency syndrome) ist eine Krankheit, von der angenommen wird, dass sie am ehesten vom humanen Immundefizienzvirus verursacht wird. Das HIV greift vorwiegend zwei verschieden Zellen an, die T4-Lymphozyten und die Makrophagen. Sobald eine Infizierung vorliegt, beginnt sich die Zahl der T4-Lymphozyten normalerweise zu reduzieren. Im Gegensatz zu den T4-Lymphozyten werden die Makrophagen durch die HIV-Infektion nicht zerstört, können aber als Speicher für den Virus dienen Gallo & Montagneir "AIDS in 1988", Scientific American, S. 25 (Okt. 1988).
  • Zur frühen Diagnose einer möglichen HIV-Infektion wird gewöhnlich ein Diagnosetest durchgeführt, mit dem festgestellt wird, ob eine Person über Antikörper gegen HIV verfügt oder nicht. Bei der HIV- Infektion ist die frühe Diagnose besonders wichtig, da dadurch ermöglicht wird, dass der Patient vom frühsten Stadium der Erkrankung an eine optimale medizinische Versorgung erhält und dass eine weitere Verbreitung der Krankheit verhindert wird. Redfield & Burke "HIV Infection: The Clinical Picture", Scientific American, S. 70. (Okt 1988) Vol. 259 Nr. 4.
  • Die Europäische Patentanmeldung 219,368 A (entspricht der US Patentanmeldung Nr. 07/298,791) offenbart bestimmte gegen Proteine, die Bestandteile des "Prosoms" sind, gerichtete monoklonale Antikörper. Prosomen sind zelluläre Partikel, die von Schmid et al wie folgt beschrieben werden: "Das Prosom: ein ubiquitärer morphologisch unverkennbarer mit reprimierten mRNP assoziierter und spezifische ScRNA und charakteristische Proteine enthaltender RNP- Partikel" The EMBO Journal, 3(1), 29-34 (1984).
  • Das Prosom ist auch schon mit "Proteasom" oder "mcp" (multicatalytic protease) bezeichnet worden. Die Europäische Patentanmeldung 0 345 750 A2 offenbart eine polifunktionelle Protease und deren Antikörper. Bei der in jener Patentanmeldung beschriebenen polyfunktionalen Protease kann es sich um das Prosom handeln.
  • Seit Anfangs 1990 sind monoklonale Maus-Antikörper gegen Prosomenproteine im Handel von Organon Teknika nv in Turnhout, Belgien, erhältlich. Die im Handel erhältlichen monoklonalen Antikörper sind solche, die gegen die Prosomenproteine p23K, p25K, p27K, p29K (p28K, p33K), p30/33K, p31K und gegen p21K des prosomenähnlichen Partikels gerichtet sind. Diese Antikörper werden in dem bei Organon Teknika nv erhältlichen Research Reagent News, (Jan. 1990) detaillierter beschrieben.
  • In der EP 219,368 A1 wird auch offenbart, dass Prosomen an vielen physiologischen Prozessen beteiligt sein können, die mit der Differenzierung von Zellen und Organismen, der Kommunikation zwischen Zellen und mit Autoimmunerkrankungen zusammenhängen. Zudem wird offenbart, dass die gegen Prosomen gerichteten monoklonalen Antikörper bei der Diagnose beispielsweise von Krebs nützlich sein können.
  • Gemäss Research ReaGent News gehören zu den Verwendungszwecken des monoklonalen Antikörpers gegen Prosomenproteine das Studium der Molekularbiologie der Prosomen, die Verteilung spezifischer Prosomentypen in normalen und pathologischen Zellen und Geweben, Messenger- und anderen Ribonukleinproteinen.
  • In Biology of the Cell 67, 3, 1989, 22A (Bureau et al.) wird die Identifizierung des mit CD8+ ausgedrückten 27K Prosomenproteins in gesunden Probanden mittels Doppel-Markiertechniken offenbart.
  • An keiner Stelle wird beschrieben oder vorgeschlagen, dass gegen irgend eines dieser Prosomenproteine gerichtete Antikörper für die Diagnose infektiöser Erkrankungen, wie beispielsweise AIDS oder HIV-Infektion, möglicherweise von Nutzen sein könnten.
  • Jetzt wurde festgestellt, dass mit HIV infizierte Personen über Zellen (beispielsweise T4- und T8-Lymphozyten oder B4-Zellen) verfügen, die sich in den Oberflächenantigenen von nicht mit dem Virus infizierten Personen unterscheiden. Überraschenderweise kann die Anwesenheit dieser Oberflächenantigene auf den betreffenden Zellen mit bestimmten markierten gegen Prosomenproteine gerichteten monoklonale Antikörper (d.h. gegen die Prosomenproteine p23K, p25K, p27K, p29K (p28K, p33K), p30/33K und p31 K gerichtete monoklonale Antikörper, sowie gegen p21K des prosomenähnlichen Partikels gerichtete monoklonale Antikörper) nachgewiesen werden.
  • Die Erfindung beihalten deshalb ein Verfahren zur Diagnose einer HIV-Infektion unter Verwendung von gegen Prosomenproteine und p21K des prosomenähnlichen Partikels gerichtete Antikörper, unabhängig von deren Herkunft. Das Verfahren kann verwendet werden, um festzustellen, ob T4-Zellen infiziert worden sind, selbst bevor sie durch das HIV getötet werden, womit das Verfahren als Hilfsmittel zur Frühdiagnose der HIV-Infektion verwendet werden kann.
  • Das Verfahren beinhaltet typischerweise: Beschaffen einer Körperflüssigkeit (beispielsweise Blut), die Zellen enthält, welche mit dem HIV von einem Individuum infiziert werden können; Trennen, Isolieren oder sonstiges Identifizieren der spezifischen in der Flüssigkeit vorhandenen Zellen; Verbinden der so identifizierten oder isolierten Zellen mit einem immunchemischen Agens, das einen oder mehrere der beschriebenen monoklonalen Antikörper enthält; und Nachweisen der Anwesenheit und des relativen Anteils von im Blut vorhandenen Immunkomplexen, die aus Zellen und mit ihnen reaktionsfähigen monoklonalen Antikörpern bestehen. Einmal erhalten, können diese Ergebnisse mit dem "Normwert" einer nicht HIV- infizierten Person verglichen werden.
  • Gegen die Prosomenproteine p27K und p33K gerichtete monoklonale Antikörper können unter Verwendung bestimmter Polypeptide oder Fragmente oder Derivaten davon erhalten werden. Diese Polypeptide verfügen normalerweise über die Gesamtheit oder einen Teil der primären Struktur der in SEQ ID NR. 1 oder SEQ ID NR. 3 gezeigten Peptide und können durch die prokaryotische oder eukaryotische Expression einer exogenen DNA-Quelle erzeugt werden.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von gegen die Prosomenproteine gerichteten Antikörpern, um auf einer Zelloberfläche vorhandene Oberflächen-Antigene zu analysieren, beispielsweise zum Phänotypieren der Zelle. In diesem Zusammenhang werden die Abbildungen in den Figuren 1 bis 8 dazu verwendet, um eine unbekannte weisse Blutzelle zu identifizieren.
    • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Figur 1 zeigt eine Abbildung, die dem Prozentanteil der T4- Lymphozyten in Blut darstellt sind, die mit verschiedenen markierten gegen Prosomenproteine gerichteten monoklonalen Antikörpern sowohl bei nicht HIV-infizierten ("temoins") als auch bei HIV- infizierten Personen reagieren.
  • Figur 2 zeigt eine Abbildung, die die Anzahl von T4-Lymphozyten pro mm³ Probandenblut darstellt, die mit verschiedenen markierten gegen Prosomenproteine gerichteten monoklonalen Antikörpern sowohl bei nicht HIV-infizierten ("temoins") als auch bei HIV-infizierten Personen reagieren.
  • Figur 3 zeigt eine Abbildung, die den Prozentsatz an natürlichen Killerzellen ("NK") im Blut darstellt, die mit verschiedenen markierten, gegen Prosomenproteine gerichteten monoklonalen Antikörpern sowohl bei nicht HIV-infizierten ("temoins") als auch bei HIV-infizierten Personen reagieren.
  • Figur 4 zeigt eine Abbildung, die die Anzahl NK pro mm³ Probandenblut darstellt, die mit verschiedenen markierten gegen Prosomenproteine gerichteten monoklonalen Antikörpern sowohl bei nicht HIV-infizierten ("temoins") als auch bei HIV-infizierten Personen reagieren.
  • Figur 5 zeigt eine Abbildung, die den Prozentsatz an T3-Zellen in Probandenblut darstellt, die mit verschiedenen markierten, gegen Prosomenproteine gerichteten monoklonalen Antikörpern sowohl bei nicht HIV-infizierten ("temoins") als auch bei HIV-infizierten Personen reagieren.
  • Figur 6 zeigt eine Abbildung, die die Anzahl T3-Zellen pro mm³ Probandenblut darstellt, die mit verschiedenen markierten, gegen Prosomenproteine gerichteten monoklonalen Antikörpern sowohl bei nicht HIV-infizierten ("temoins") als auch bei HIV-infizierten Personen reagieren.
  • Figur 7 zeigt eine Abbildung, die den Prozentsatz an T8-Zellen in Probandenblut darstellt, die mit verschiedenen markierten, gegen Prosomenproteine gerichteten monoklonalen Antikörpern sowohl bei nicht HIV-infizierten ("temoins") als auch bei HIV-infizierten Personen reagieren.
  • Figur 8 zeigt eine Abbildung, die den Prozentsatz an B4-Zellen im Blut darstellt, die mit verschiedenen markierten, gegen Prosomenproteine gerichteten monoklonalen Antikörpern sowohl bei nicht HIV-infizierten ("temoins") als auch bei HIV-infizierten Personen reagieren.
  • Figur 9 stellt die cDNA, die für ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert und die Aminosäure-Sequenz dieses Proteins (menschliches p27K Prosomenprotein) dar.
  • Figur 10 stellt die cDNA, die für ein weiteres Protein der vorliegenden Erfindung codiert und die Aminosäure-Sequenz dieses Proteins (menschliches p33K Prosomenprotein) dar.
    • Beste Ausführungsform der Erfindung I. Die Polypeptide
  • Ein Polypeptid oder Peptid ist eine lineare Folge von Aminosäuren, die durch Peptid-Bindungen zwischen den α-Amino- und Carboxy- Gruppen der grenzenden Aminosäuren miteinander verknüpft sind. Bevorzugte Polypeptide zur Verwendung für die Antikörper-Herstellung für den Einsatz in der Erfindung sind in der SEQ ID NR. 1 und in der SEQ ID NR. 3 dargestellt.
  • Das Protein oder Polypeptid kann von ganzen Prosomen abgeleitet werden, die intrazellulär, getrennt im Blut und auf der Oberfläche von Zellmembranen gefunden werden.
  • Die Herstellung der Peptide oder deren Fragmente gemäss der Erfindung kann mittels rekombinanter DNA-Verfahren oder einem in der organischen Chemie für die Peptidsynthese bekannten Verfahren erfolgen.
  • Die in der organischen Chemie bekannten Verfahren sind vor allem bei der Synthese kleinerer Peptidfragmente mit der gewünschten Aktivität (beispielsweise die Eigenschaft, Antikörper zu erzeugen) von Nutzen. Ist die Sequenz eines Fragments einmal bekannt, ist die Synthese für den erfahrenen Peptidchemiker recht schnell durchgeführt. In der organischen Chemie bekannte Verfahren beinhalten das Verbinden der gewünschten Aminosäuren mittels einer Kondensationsreaktion entweder in einer homogenen Phase oder mit Hilfe einer Festphase, wie von Merrifield offenbart. Siehe beispielsweise Merrifield, J. Am. Chem. Society, 85, 2149 (1963) und Wang, J. Am. Chem. Soc., 95, 1328 (1974).
  • Für die Festphasen-Synthese sind verschiedene Trägermaterialien und Strategien bekannt, siehe beispielsweise Barany und Merrifield in The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Band 2, E. Gross und J. Meienhofer, Hrsg., (Acad. Press, N.Y., 1980), Kneib- Cordonier und Mullen Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739 (1987) und Fields und Noble Int. J. Peptide Protein Res., 35, 161- 214 (1990).
  • Rekombinante DNA-Verfahren beinhalten die Herstellung der gewünschten Peptide oder deren Fragmente mittels Expression der rekombinanten Polynukleotide mit einer Polynukleotid-Sequenz, die für ein oder mehrere der betroffenen Peptide in einem geeigneten Mikroorganismus als Wirt dienen. Im allgemeinen beinhaltet dieser Vorgang das Einfügen einer wie in der Figur 1 oder 2 gezeigten DNA-Sequenz in ein Klonen-Vehikel (beispielsweise ein Plasmid, DNA-Phage oder anderen DNA-Sequenzen, die sich in einer Wirtszelle replizieren können); Einfügen dieses Klonen-Vehikels in eine geeignete eukaryotische oder prokaryotische Wirtszelle und Züchten der so transformierten Wirtszelle. Typische Wirtszellen beinhalten Bakterien wie E. coli, Pseudomonas und Bacillus subtilis. Eukaryoten wie zum Beispiel verschiedene Stämme von Hefezelllinien und Zelllinien von Säugetieren sind ebenfalls von grossem Nutzen.
  • Sind die Peptide einmal hergestellt, können für die Erfindung nützliche Fragmente ebenfalls bestimmt werden. Geeignete immunchemisch aktive Peptidfragmente können mittels des in der Patentanmeldung WO 86/06487 von Geysen et al. beschriebenen Verfahrens basierend auf dem "Pep-Scan"-Verfahren gefunden werden; Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., (81) 3998-4002, (1984); und Geysen et al, J. Immunol Meth., (102) 259-274 (1987). Bei diesem Verfahren werden mehrere überlappende Peptide, die Teilsequenzen der kompletten betreffenden Peptide entsprechen, synthetisiert und auf ihre Reaktionsfähigkeit mit den relevanten Antikörpern untersucht.
  • Natürlich müssen die Fragmente oder Peptide nicht ganz genau jenen in der SEQ ID NR. 1 oder SEQ ID NR 3 beschriebenen entsprechen. Es versteht sich von selbst, dass in den Peptiden eine oder mehrere Aminosäuren durch andere Aminosäuren oder analoge Aminosäuren oder Derivate ersetzt werden können, solange die immunochemische Aktivität nicht bedeutend beeinträchtigt ist.
  • Zudem können auch funktionelle Derivate der Peptide verwendet werden. Zu diesen funktionellen Derivaten gehören Säureadditionssalze (wie Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Fumar-, Phosphor-, Ascorbin-, Wein-, Zitronen-, Milch-, Malein und Palmitinsäure und andere bekannte Säuren); Amide der Peptide und insbesondere die C- endständigen Amide; Ester und insbesondere die C-endständigen Ester; und N-Acyl-Derivate, im speziellen die N-terminalen Acyl- Derivate und noch ganz besonders N-Acetyl-Derivate. Alle funktionellen Derivate werden als "Polypeptide", "Peptide" und "Peptidfragmente" gemäss der Erfindung betrachtet.
  • Die Substitution kann gleichermassen auch in der Nucleinsäure- Sequenz der SEQ ID NR. 1 oder der SEQ ID NR. 3 erfolgen. Die Degeneration des genetischen Codes erlaubt es, die Basen eines Codons zu ersetzen, was zu einem anderen Codon führt, jedoch wird immer noch für die gleiche Aminosäure codiert. Beispielsweise ist das Codon für die Aminosäure Glutaminsäure sowohl GAG als auch GAA. Folglich ist es klar, dass für die Expression eines Polypeptids mit der in der SEQ ID NR. 1 oder SEQ ID NR. 3 gezeigten Aminosäuren-Sequenz oder eines Antigenfragments davon eine Nucleinsäuren- Sequenz mit einer solchen alternativen Codon-Zusammensetzung oder eine sich von der in den Figuren gezeigten unterscheidenden Zusammensetzung verwendet werden können.
  • Die Erfindung umfasst ebenfalls eine Nucleinsäuren-Sequenz, die unter strengen Bedingungen mit einer in der SEQ ID NR. 1 oder SEQ ID NR. 3 gezeigten Nucleinsäuren-Sequenz hybridisieren. Diese hybridisierbaren Nucleinsäuren-Sequenzen weisen eine wesentliche Homologie mit einer in der SEQ ID NR. 1 oder SEQ ID NR. 3 gezeigten Nucleinsäuren-Sequenz oder einem Fragment davon auf, können aber nukleotide Substitutionen, Mutationen, Insertionen, Deletionen, Inversionen etc: umfassen und codieren für ein Protein oder ein Polypeptid, das funktionell mit einem Prosomenprotein oder einem Protein des prosomenähnlichen Partikels äquivalent ist. Das entstehende funktionell äquivalente Protein, Polypeptid oder Fragment ist zwar nicht mit einem in der SEQ ID NR. 1 oder SEQ ID NR. 3 gezeigten Protein oder einem Fragment davon identisch, verfügt aber über entsprechende Antigeneigenschaften.
    • II. Antikörper
  • Antikörper werden vorzugsweise dazu verwendet, die Zellen des zu untersuchenden Patienten zu isolieren oder zu identifizieren (das heisst B4-Zellen, T4-Zellen, T8-Zellen, natürliche Killerzellen, T3-Lymphozyten oder Mischungen davon von einem Patienten). Vorzugsweise handelt es sich bei solchen Antikörpern um monoklonale Antikörper oder monospezifische polyklonale (bei-spielsweise affinitätsgereinigte) Antikörper, wobei aber auch polyklonale Antikörper und Antikörper-Fragmente verwendet werden können. Gegen die verschiedenen Zellen gerichtete monoklonale Antikörper sind im Handel von Gesellschaften wie Ortho Diagnostics oder Coultronics Paris, Frankreich, erhältlich oder können hergestellt werden. Beispielsweise werden Antikörper gegen natürliche Killerzellen in der WO 8903396 (unter Beanspruchung der Priorität aus der am 16. Oktober 1987 eingereichten US-Anmeldung Serial Nr. 109,730) beschrieben.
  • Antikörper gegen Prosomenproteine zur Verwendung in Diagnose-Sets und in erfindungsgemässen Verfahren sind vorzugsweise gegen die verschiedenen Prosomenproteine gerichtete monoklonale Antikörper. Es können aber auch polyklonale Antikörper und modifizierte polyklonale Antikörper verwendet werden.
  • Gegen die Proteine erzeugte monoklonale Antikörper können mittels biologisch reiner Zelllinien von Zellen, die immortalisierte Antikörper produzieren, hergestellt werden. Zellen, die immortalisierte Antikörper produzieren, können mittels verschiedener dem Stand der Technik entsprechender bekannter Verfahren erhalten werden, die im allgemeinen die folgenden Schritte umfassen: 1) Induzieren geeigneter Zellen, wie beispielsweise Lymphozyten, um spezifische Antikörper herzustellen (beispielsweise durch Injektion eines Immunogens, wie etwa die Polypeptide aus der SEQ ID NR. 1 oder SEQ ID NR. 3), 2) Immortalisieren dieser Zellen und 3) Auswahl von Klonen aus diesen Zellen, die Antikörper der gewünschten Spezifität und Affinität produzieren. Ein Verfahren wäre beispielsweise dasjenige von Kohler und Millstein, Nature, Band 256, 495-497 (1975). Dieses Verfahren umfasst das Immunisieren von Mäusen mit dem spezifischen Peptid (zum Beispiel mit jenem aus der SEQ ID NR. 1 oder SEQ ID NR. 3), das Isolieren von Milzzellen und deren Fusion mit Mausmyelomazellen, um Hybridome zu erhalten. Natürlich können ausser Mäusen auch andere Tiere verwendet werden.
  • Alle spezifisch identifizierten Antikörper (das heisst die gegen die folgenden Proteine gerichteten: p21K, p23K, p25K, p27K, p29K (p28K, p33K), p30/33K und p31K) sind im Handel von Organon Teknika nv erhältlich. Zelllinien, die monoklonale Antikörper gegen p27K und p31K produzieren, wurden bei der Collection Nationale de Cultures des Microorganismes des Institut Pasteur unter den Nummern I-588 und I-589 hinterlegt. Die Antikörper können auch wie in der EP 219,368 A1 (entspricht der US Patentanmeldung Serial-Nr. 07/298,791) beschrieben hergestellt werden.
  • Bei der Feststellung anhand der T4-Zellen eines Probanden, ob dieser HIV-infiziert ist oder nicht, werden die Antikörper anti-p27K (p=0,01) und anti-p30-33K (p=0,001) vorgezogen (Figuren 1 und 2). Jedoch können auch die Antikörper anti-p29K (p=0,01) und anti-p23K (p=0,001) verwendet werden (Fig. 1).
  • Monoklonale Antikörper gegen eines der folgenden Prosomenproteine können verwendet werden, um die natürlichen Killerzellen eines Probanden zu untersuchen, um festzustellen, ob dieser HIV- infiziert wurde oder nicht: p25K, p29K (p28K, p33K), p30/33K und p31K oder p21K des prosomenähnlichen Partikels (Figuren 3 und 4).
  • Monoklonale Antikörper gegen eines der folgenden Prosomenproteine können verwendet werden, um anhand der T3-Lymphozyten eines Probanden festzustellen, ob dieser HIV-infiziert wurde oder nicht: p23K, p25K, p29K (p28K, p33K), p30/33K und p31K oder p21K des prosomenähnlichen Partikels (Figuren 5 und 6). Bevorzugte Antikörper sind solche, die gegen p21K, p23K, p29K, p30-33K und p31K gerichtet sind.
  • Obwohl auch monoklonale Antikörper gegen eines der Prosomenproteine (p23K, p25K, p27K, p29K (p28K, p33K), p30/33K und p31K) oder p21K des prosomenähnlichen Partikel verwendet werden können, um anhand der T8-Zellen eines Probanden festzustellen, ob dieser HIV- infiziert ist oder nicht, werden die Antikörper anti-p27K und anti-p30-33K bevorzugt (Figur 7).
  • Um anhand der B4-Zellen eines Probanden herauszufinden, ob dieser HIV-infiziert ist oder nicht, wird vorzugsweise der Antikörper anti-p23K verwendet (Figur 8).
    • III. Diagnoseverfahren
  • In einem bevorzugten erfindungsgemässen Diagnoseverfahren werden direkt oder indirekt markierte (beispielsweise mit Phycoerythrin), gegen die verschiedenen Zellen (beispielsweise T3-Lymphozyten, T4- Lymphozyten, T8-Zellen, B4-Zellen oder natürliche Killerzellen) gerichtete Anitkörper zur Identifizierung und Isolierung dieser Zellen im diese Zellen enthaltenden Blut eines Probanden verwendet. Die Zell-Antikörper-Komplexe werden dann mit gegen ebenfalls markierte, beispielsweise mit einer fluoreszierenden Verbindung, Prosomenproteine gerichteten Antikörpern inkubiert. Die Menge an so markierten Zellen wird gemessen oder ausgezählt und danach mit einem Norm- oder Standard-Mass verglichen.
  • Bei diesem Verfahren können verschiedene Vorrichtungen verwendet werden.
  • Der Begriff "immunchemisches Reagens" bedeutet so, wie er hier verwendet wird, dass die Antikörper mit geeigneter Selektivität an einen passenden Träger gebunden oder mit einer Markiersubstanz versehen worden sind. Oft verwendete Träger sind die innere Wand einer Microtestvertiefung oder einer Küvette, eines Röhrchens oder Kapillarröhrchens, eines Membranfilters, von Teststreifen, oder die Oberfläche von Partikeln wie Latexpartikel, Kügelchen, Erythrocyten, Farb-Sol, Metall-Sol (zum Beispiel Gold-Sol) oder Metallverbindungen als Solpartikel. Oft verwendete Markiersubstanzen sind verschiedene radioaktive Isotope, fluoreszierende Verbindungen, Enzyme, Farb-Sole oder als Solpartikel verwendete Metallverbindungen.
  • In einem Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit einer HIV- Infektion in einer die beschriebenen Zellen enthaltenden Flüssigkeit (beispielsweise einer Körperflüssigkeit wie Blut, Lymphe oder Plasma eines Menschen, der möglicherweise mit HIV in Kontakt gekommen ist) wird ein immunochemisches Reagens der Erfindung mit der Testflüssigkeit in Kontakt gebracht. Danach werden die zwischen Anitkörpern und den Oberflächen-Antigenen der beschriebenen Zellen gebildeteten Immunkomplexe auf die Anwesenheit einer immunchemischen Reaktion untersucht. Die immunochemische Reaktion ist vorzugsweise eine Sandwichreaktion (Verwendung markierter Antikörper), eine Agglutinationsreaktion (Verwendung von Sols), eine Kompetitionsreaktion oder eine Inhibitionsreaktion.
  • In einem Typ von immunochemischen Tests werden gegen die zu untersuchende(n) Zelle(n) gerichtete Antikörper an eine Festphase gebunden, beispielsweise an die Innenseite eines Teströhrchens. Die Körperflüssigkeit mit den gewünschten Zellen wird dann ebenfalls in das Teströhrchen gegeben, um sich mit dem Antikörper zu verbinden. In das mit dem Antigen-Antikörper-Komplex beschichtete Röhrchen wird ein immunologisches Reagens gegeben, das eine bekannte Menge des oder der mit einer fluoreszierenden Verbindung markierten, geeigneten antiprosomalen Protein-Antikörper oder Antikörper enthält. Die Fluoreszenz-Menge wird so gemessen und mit einem Normwert verglichen.
  • Fachleuten sind andere Diagnose-Testsets bekannt, die so angepasst werden können, dass sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Zu immunologischen Diagnose-Testsets gehören beispielsweise der Radio-Immunassay oder der Enzym-Immunaktivitätsassay ("EIA") wie sie in dem wiedereingesetzten US-Patent Nr. 32,696 von Schuurs et al. beschrieben werden. Ein Lichtstreuungs- Immunassay-System wird in der EP 0,254,430 A2 von Ortho Diagnostic Systems, Inc. (entspricht der am 26. Juni 1986 eingereichten US Serial-Nr. 879,236) offenbart. In den US-Patenten Nr. 4,376,110 und Nr. 4,486,530 von Hybritech Inc. wird ein Diagnose-Testset beschrieben, in dem zwei monoklonale Antikörper mit hoher Bindungsaffinität verwendet werden.
  • Ein Verfahren zur Phänotypierung einer weissen Blutzelle umfasst das Inkubieren der Zelle mit markierten Antikörpern, die mit einem Prosomenprotein reagieren und die Analyse der Zelloberfläche mittels Markeraktivität auf die Anwesenheit von Proteinen, die mit dem markierten Antikörper reagieren.
    • BEISPIEL I Doppelte Markier-Immunologie
  • Die verschiedenen zu analysierenden Zellen werden gemäss folgender Vorgänge identifiziert und isoliert. Monoklonale mit Phycoerythrin ("PE") markierte Antikörper werden in 0,1 ml Blutaliquote gegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Bei den in den verschiedenen Aliquoten verwendeten monoklonalen Antikörpern handelte es sich um anti-CD3 (T3-PE), anti-CD4 (T4-PE), anti-CD8 (T8-PE), anti-CD2 (11-PE), anti-CD19 (B4-PE), anti-NK (NK-PE). Die roten Blutzellen wurden lysiert und für eine Passage in einem Fliesscytometer QPREP fixiert (Ameisensäure / Formaldehyd - Coultronics France of Paris, Frankreich), um die Zellmembran zu fixieren, damit sichergestellt ist, dass diese während dem Vorgang nicht zerstört wird.
    • BEISPIEL II Doppelte Markier-Immunologie
  • Mausserum wurde 4 bis 5 Stunden bei 4º C inkubiert. Danach wurde es einmal mit konzentriertem PBS gewaschen. Anschliessend wurde es mit gegen Prosomenproteine gerichteten Antikörpern vermischt, inkubiert und bei Raumtemperatur während 30 Minuten abkühlen gelassen. Es wurde ein weiteres Mal mit konzentriertem PBS gewaschen. Danach wurde Ziegen-Antimaus-Fluorescein-Isothiocyanat ("GAM- FITC") zugegeben, um die monoklonalen Antikorper gegen die Prosomenproteine zu zeigen (30 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur). Es wurde noch einmal mit konzentriertem PBS gewaschen. Anschliessend wurde es einmal in 0,5 ml konzentriertem PBS resuspendiert. Die Fluoreszenz-Analyse wurde mittels CFM (flux cytometry) durchgeführt.
    • BEISPIEL III
  • Unter Verwendung der Verfahren aus den Beispielen I und II wurde das Blut von 20 HIV-infizierten Personen (2 davon an AIDS erkrankt) mit dem Blut einer Gruppe nicht-infizierter Individuen verglichen. Die Ergebnisse dieses Vergleichs (HIV-1) ist in den Figuren 1 bis 8 graphisch dargestellt.
    • BEISPIEL IV
  • Die SEQ ID NR. 1 zeigt ein 266-Aminosäure-Polypeptid mit der zugehörigen DNA-Codierung. Die cDNA, die für dieses Protein codiert, wurde aus einer Hela-Zellen-cDNA Expressions-Bibliothek ((lambda)gt11) isoliert, unter Verwendung eines gegen das p27K Prosomenprotein gerichteten monoklonalen Antikörpers (Organon Teknika). Die Insertion wurde in einen pTZ18R Plasmidvektor zur Sequenzierung subkloniert. Der cDNA fehlen ungefähr fünfzig Nukleotide am 5'-Ende (wie mittels Northern-Blot-Analyse festgestellt).
  • Die Länge der DNA beträgt 980 Nucleotide, mit einer Codierungsregion von 798 Nucleotiden (266 Aminosäuren).
    • BEISPIEL V
  • Die SEQ ID NR. 3 zeigt ein 266-Aminosäure-Polypeptid mit der zugehörigen DNA-Codierung. Die cDNA, die für dieses Protein codiert, wurde aus einer Hela-Zellen-cDNA-Expressions-Bibliothek ((lambda)gt11) isoliert unter Verwendung eines gegen das p33K Prosomenprotein gerichteten Antikörpers (62A32). Die Insertion wurde in einem pTZ18R Plasmidvektor zur Sequenzierung subkloniert. Die Sequenzierung des Inserts in beide Richtungen ergab einen offenen Leserahmen von 810 Nukleotiden und eine Sequenz ganzer Länge mit einem grossen 5'-Leader. Die Länge der DNA beträgt 1264 Nucleotide mit einer Codierungsregion von 810 Nucleotiden (269 Aminosäuren).
    • BEISPIEL VI
  • Das Protein aus Beispiel IV (das heisst jenes aus der SEQ ID NR. 1) wird zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das p27K Prosomenprotein verwendet. Das Verfahren umfasst das Immunisieren von Mäusen mit dem Peptid, das Isolieren von Milzzellen aus den Mäusen und deren Fusion mit Mausmyelomazellen, um Hybridome zu erhalten. Diese werden auf jene Hybridome gescreent, die Antikörper gegen das p27K Protein produzieren.
    • BEISPIEL VII
  • Monoklonale Antikörper gegen die Polypeptide aus Beispiel V (das heisst das Protein aus der SEQ ID NR. 3) werden auf ähnliche Art und Weise wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt. SEQUENZ-LISTE

Claims (10)

1. Verfahren zur Diagnose einer Infektion mit dem humanen Immundefizienz-Virus bei einem Patienten, umfassend:
a) Analysieren einer dem Patienten entnommenen Körperflüssigkeit auf die Anwesenheit von auf Zelloberflächen vorhandenen Proteinen mittels markierter Antikörper, markierter Antikörper-Fragmente oder daraus hergestellter Mischungen, wobei die genannten Proteine mit gegen Prosomenproteine oder p21K des prosomenähnlichen Partikels gerichteten Antikörpern reagieren, um eine quantitative Bestimmung der Anzahl oder des Prozentsatzes der Zellen zu erhalten, die das Protein auf ihrer Oberfläche aufweisen; und
b) Vergleich der so erhaltenen Menge oder des Prozentsatzes mit dem Wert einer nicht mit dem humanen Immundefizienz- Virus infizierten Person.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die genannten Antikörper oder Antikörper-Fragmente aus den gegen die Prosomenproteine p23K, p25K, p27K, p29K (p28K, p33K) p30/33K und p31K oder p21K des prosomenähnlichen Partikels gerichteten Antikörper ausgewählt oder davon abgeleitet werden.
3. Verfahren gemäss Anspruch 2, wobei die Zellen die B4-Zellen des Patienten sind und der Antikörper ein anti-p23K monoklonaler Antikörper ist.
4. Verfahren gemäss Anspruch 2, wobei die Zellen T4- Zellen des Patienten sind und der Antikörper ein gegen das in der SEQ ID NO:2 identifiziertes Protein gerichteter anti-p27K Antikörper oder ein Antigenfragment davon ist.
5. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei der Antikörper ein gegen das in der SEQ ID NO:4 identifiziertes Protein gerichteter Antikörper oder ein Antigenfragment davon ist.
6. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Zellen T8- Zellen des Patienten und die Antikörper gegen eines der Prosomenproteine p23K, p25K, p27K, p29K (p28K, p33K), p30/33K und p31K oder p21K des prosomenähnlichen Partikels gerichtete monoklonale Antikörper sind.
7. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Zellen natürliche Killerzellen des Patienten und die Antikörper gegen die Proteine p25K, p29K (p28K, p33K), p30/33K und p31K oder p21K des prosomenähnlichen Partikels gerichtete monoklonale Antikörper sind.
8. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Zellen T3- Lymphozyten des Patienten und die Antikörper gegen eines der folgenden Prosomenproteine gerichtete Antikörper sind: p23K, p25K, p29K (p28K, p33K), p30/33K und p31K oder p21K des prosomenähnlichen Partikels.
9. In vitro-Verfahren zur Diagnose einer Infektion mit dem humanen Immundefizienz-Virus: Identifizierung oder Isolierung von Zellen, die aus einer aus B4-, T4-, T8-Zellen, natürlichen Killerzellen, T3-Lymphozyten oder Mischungen aus diesen Zellen und gegen diese Zellen gerichteten Antikörpern bestehenden Gruppe stammen; Inkubieren der so isolierten oder identifizierten Zellen mittels gegen Prosomenproteine oder p21K des prosomenähnlichen Partikels gerichteter markierter monoklonaler Antikörper; und Analysieren der auf der Zelloberfläche vorhandenen Proteine.
10. Diagnose-Testset zur Diagnose einer Infektion mit dem humanen Immundefizienz-Virus, umfassend: Antikörper, die gegen aus der aus B4-, T4-, T8-Zellen, natürlichen Killerzellen, T3- Lymphozyten oder Mischungen dieser mit einer festen Oberfläche verbundenen Zellen bestehenden Gruppe ausgewählte Zellen gerichtet sind; und eine Diagnoseflüssigkeit, die gegen Prosomenproteine oder p21K des prosomenähnlichen Partikels gerichtete markierte Antikörper enthält.
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