DE69123724T2

DE69123724T2 - Verfahren zur diagnose von hiv-infektionen

Info

Publication number: DE69123724T2
Application number: DE69123724T
Authority: DE
Inventors: Faycal Bey; Jean-Paul Bureau; Klaus Scherrer
Original assignee: Pro-Soma
Current assignee: Pro-Soma
Priority date: 1990-10-12
Filing date: 1991-10-11
Publication date: 1997-04-10
Anticipated expiration: 2011-10-12
Also published as: JPH05502799A; FI922667A7; EP0506914A1; CA2069417A1; FI922667A0; WO1992007270A1; ATE146597T1; AU8740691A; EP0506914B1; AU652192B2; DE69123724D1

Description

Die Erfindung betrifft diagnostische Verfahren zur Diagnose von Krebs und HIV-Infektion.
Die Europäische Patentanmeldung 219,368 A (entspricht der US Patentanmeldung Nr. 07/298,791) offenbart bestimmte Antikörper, die gegen Proteine gerichtet sind, welche einen Bestandteil des "Prosoms" bilden. Prosomen sind intrazelluläre Partikel und werden von Schmid et al. wie folgt beschrieben: "Das Prosom: ein ubiquitärer morphologisch unverkennbarer mit reprimierten mRNP assoziierter RNP-Partikel und spezifische SxRNA und charakteristische Proteine enthaltend," The EMBO Journal, 3(1), 29-34 (1984). Das Prosom wurde auch als "Proteasom" oder "mcp" (multicatalytic protease) bezeichnet.
Seit Anfangs 1990 sind monoklonale Maus-Antikörper gegen Prosomenproteine im Handel von Organon Teknika nv in Turnhout, Belgien, erhältlich. Die im Handel erhältlichen monoklonalen Antikörper sind solche, die gegen die Prosomenproteine p23K, p25K, p27K, p29K (p28, p33K), p30/33K, p31K und gegen Anti-p21K ("prosomenähnlicher Partikel") gerichtet wurden. Diese Antikörper werden im bei Organon Teknika nv erhältlichen Research Reaqent News, (Jan. 1990) detaillierter beschrieben.
In der EP 219,368 A1 wird auch offenbart, dass Prosomen an vielen physiologischen Prozessen beteiligt sein können, die mit der Differenzierung von Zellen und Organismen, der Kommunikation zwischen Zellen und mit Autoimmunerkrankungen zusammenhängen. Zudem wird offenbart, dass die gegen Prosomen gerichteten monoklonalen Antikörper bei der Diagnose beispielsweise von Krebs nützlich sein können.
In Research Reaqent News gehören zu den Verwendungszwecken des monoklonalen Antikörpers gegen Prosomenproteine das Studium der Molekularbiologie der Prosomen, die Verteilung spezifischer Prosomentypen in normalen und pathologischen Zellen und Geweben, Messenger- und anderen Ribonukleinproteinen.
Das Prosom ist auch schon mit "Proteasomen" oder "mcp" (multicatalytic protease) bezeichnet worden. Die Europäische Patentanmeldung 0 345 750 A2 offenbart eine polifunktionelle Protease und deren Antikörper. Bei der in jener Patentanmeldung beschriebenen polyfunktionalen Protease kann es sich um das Prosom handeln.
In der EP 0 345 750 wird die Bestimmung der polyfunktionalen Proteaseaktivität mehrerer gut- und bösartiger Krankheiten (Luftröhrenkrebs, Leberkrebs, Lungenkrebs, Eierstockkrebs und Leukämie) beschrieben.
An keiner Stelle wird beschrieben oder vorgeschlagen, dass die Anwesenheit von Prosomen ausserhalb der Zelle bei der Diagnose infektiöser Krankheiten wie AIDS oder HIV möglicherweise von Nutzen sein könnten oder dass diese extrazellulären Prosomen möglicherweise bei der Diagnose von Kolonkrebs Verwendung finden könnten.
Es konnte festgestellt werden, dass HIV-infizierte Personen überraschenderweise einen höheren Gehalt an extrazellulären Prosomen in ihrem Blut aufwiesen als Personen, die nicht an dieser Krankheit leiden. Anwesenheit und Menge dieser extrazellulären Prosomen können mittels gewisser markierter antiprosomaler proteinmonoklonaler Antikörper (beispielsweise gegen die Prosomenproteine p25K, p27K, p29K (p28K, p33K), p30/33K und p31K gerichtete monoklonale Antikörper) nachgewiesen werden. Die Erfindung beinhaltet deshalb ein Verfahren zur Diagnose einer HIV-Infektion mittels dieser antiprosomaler proteinmonoklonaler Antikörper, unabhängig von deren Herkunft, um die Anzahl an extrazellulären Prosomen im Blut festzustellen und zu messen.
Ein solches Verfahren würde typischerweise folgende Schritte beinhalten: Erhalten einer Blutprobe eines möglicherweise HIV- infizierten Patienten; Extraktion des Blutanteils, der extrazelluläre Prosomen enthält; in Kontaktbringen oder Vereinen des extrahierten Anteils mit einem immunchemischen Agens, das eines oder mehrere der beschriebenen monoklonalen Antikörper enthält; und Nachweisen der Anwesenheit und der relativen Menge an aus extrazellulären und monoklonalen Antikörpern gebildeten Immunkomplexen. Sind diese Resultate einmal vorhanden, können sie mit den "Norm"- Werten einer nicht an den Krankheiten leidenden Person verglichen werden.
Die Menge dieser extrazellulären Prosomen kann auch dadurch festgestellt werden, dass die Proteaseaktivität in einem extrahierten Anteil der Blutprobe, der diese extrazellulären Prosomen enthält, gemessen wird. Je grösser die Prosomenzahl ausfällt, desto grösser ist auch die Proteaseaktivität.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Diagnose des HIV.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt verschiedene Graphiken zu Beispiel 1:
Die Abbildung A zeigt aus Kälberserum hergestellte Prosomen, die auf einen 0,5 % Sarkosylsaccharosegradienten (5 - 25 %) geladen wurden.
Die Abbildung B zeigt aus menschlichen Seren hergestellte Prosomen, die 3' endmarkiert wurden: Die RNA wurden phenolextrahiert und auf einem 8 % Acrylamidharnstoffgel analysiert. Die Säule 1 stellt Marker dar, Säule 2 enthält Prosomenseren und Säule 3 enthält Helazellenprosomen.
Die Abbildung C ist eine Western-Blot-Analyse von Gradientenfraktionen mit 5 anti-Prosom monoklonalen Antikörpern.
Figur 2 zeigt den erhöhten Anteil an extrazellulären Prosomen bei Krebs: Western-Blot-Analyse aus normalen menschlichen Seren und aus Kolonkrebs-Patienten isolierter extrazellulärer Prosomen (Vergleichsdaten).

Beste Ausführungsform der Erfindung

I. Antikörper

Die Antikörper werden vorzugsweise zur Isolierung und Identifizierung der extrazellulären Prosomen des zu diagnosizierenden Patienten verwendet. Solche Antikörper sind vorzugsweise monoklonale Antikörper oder monospezifische polyklonale (beispielsweise affinitätsgereinigte) Antikörper, obwohl auch polyklonale Antikörper und Antikörperfragmente verwendet werden können.
Antikörper gegen Prosomenproteine, die in Diagnosesets und erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden, sind vorzugsweise gegen die verschiedenen Prosomenproteine gerichtete monoklonale Antikörper. Es können jedoch auch polyklonale Antikörper und modifizierte polyklonale Antikörper verwendet werden.
Gegen die Proteine produzierte monoklonale Antikörper können mittels biologisch reiner Zelllinien von immortalisierten antikörperproduzierenden Zellen erhalten werden. Immortalisierte antikörperproduzierende Zellen können mittels verschiedener dem Stand der Technik entsprechenden Verfahren erhalten werden, die allgemein folgende Schritte umfassen: 1) Induzieren geeigneter Zellen, wie beispielsweise Lymphozyten, um spezifische Antikörper zu erhalten (beispielsweise durch Injizieren eines Immunogens, wie beispielsweise des Polypeptids in Fig. 1 oder Fig. 2), 2) Immortalisieren dieser Zellen und 3) Auswahl von Klonen aus diesen Zellen, die Antikörper der gewünschten Spezifität und Affinität produzieren. Eines der Verfahren könnte beispielsweise jenes nach Kohler und Millstein, Nature, Band 256, 495-497 (1975) sein. Dieses Verfahren umfasst das Immunisieren von Mäusen mit dem speziellen Peptid (beispielsweise jenem aus Fig. 1 oder Fig. 2), das Isolieren von Milzzellen und deren Fusion mit Mausmyelomazellen, um Hybridomzellen zu erhalten. Selbstverständlich können anstelle von Mäusen auch andere Tiere verwendet werden.
Alle hierin spezifisch identifizierten gegen Prosomenproteine gerichteten Antikörper sind von Organon Teknika nv im Handel erhältlich. Zelllinien, die monoklonale Antikörper gegen p27K und p31K produzieren, wurden bei der Collection Nationale de Cultures et des Microorganismes des Institut Pasteur unter den Nummern 1-588 und 1-589 hinterlegt. Die Antikörper können wie in der EP 219,368 A1 beschrieben (entspricht der US Patentanmeldung Nr. 07/298,791) hergestellt werden.

II. Peptidsubstrate

Die Peptide und Peptidderivate gemäss der allgemeinen Formel
Leu-Leu-Val-Tyr
können in einem für Peptide konventionellen Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können die Verbindungen mittels der Festphasenmethode nach Merrifield synthetisiert werden. Verschiedene Trägermaterialien und Strategien sind bekannt, siehe beispielsweise Barany und Merrifield in The Peptides. Analysis, Synthesis. Biology, Band 2, E. Gross und J. Meienhofer, Herausgeber., (Acad. Press, N.Y., 1980), Kneib-Cordonier und Mullen Int. J. Pedtide Protein Res., 30, 705-739 (1987) und Fields und Noble Int. J. Peptide Protein Res., 35, 161-214 (1990).
Die Entfernung der Schutzgruppen und, im Falle der Festphasenpeptidsynthese, die Abspaltung vom Trägermaterial kann, je nach Art der Schutzgruppen und des Typs des an das Trägermaterial gebundenen Linkers, auf verschiedene Arten erfolgen. Im Normalfall findet das Aufheben des Schutzes unter sauren Bedingungen und in Anwesenheit eines Radikalfängers statt. Vgl. beispielsweise Bände 3, 5 und 9 der Serie über The Peptides Analysis, Synthesis, Biology, supra.
Eine weitere Möglichkeit ist die Anwendung von Enzymen in der Peptidsynthese; bezüglich Überblicksartikel vergleiche beispielsweise H.D. Jakubke in The Peptides, Analysis, Synthesis, BIOLOGY, Band 9, S. Udenfriend und J. Meienhofer, Hrsg., (Acad. Press. N.Y., 1987).

III. Diagnoseverfahren

In einem bevorzugten erfindungsgemässen Diagnoseverfahren werden gegen die extrazellulären Prosomen gerichtete (beispielsweise mit einer fluoreszierenen Verbindung) markierte Antikörper zur Identifizierung und Isolierung im Blut eines Patienten vorhandener extrazellulärer Prosomen verwendet. Die Menge so markierten Prosomen wird gemessen und gezählt und die Messung mit einem Norm- oder Standardwert verglichen.
Im Verfahren können verschiedene Mittel verwendet werden.
Der Begriff "immunchemisches Reagens" bedeutet so, wie er hier verwendet wird, dass die Antikörper mit geeigneter Selektivwirkung an einen geeigneten Träger gebunden oder mit einer Markiersubstanz versehen worden sind. Oft verwendete Träger sind die innere Wand einer Microtestvertiefung oder einer Küvette, eines Röhrchens oder Kapillarröhrchens, eines Membranfilters, von Teststreifen, oder die Oberfläche von Partikeln wie Latexpartikel, Kügelchen, rote Blutkörperchen, Farb-Sol, Metall-Sol (zum Beispiel Gold-Sol) oder Metallverbindungen als Solpartikel. Oft verwendete Markiersubstanzen sind verschiedene radioaktive Isotope, fluoreszierende Verbindungen, Enzyme, Farb-Sole oder als Solpartikel verwendete Metallverbindungen.
In einem Nachweisverfahren von extrazellulären Prosomen wird ein immunchemisches Reagens, das antiprosomale Protein-Antikörper enthält, mit der Testflüssigkeit in Kontakt gebracht. Anschliessend werden die zwischen den Antikörpern und den Prosomen in der Testflüssigkeit gebildeten Immunkomplexe auf die Anwesenheit einer immunchemischen Reaktion untersucht. Die immunchemische Reaktion ist vorzugsweise eine Sandwichreaktion (Weiterverwendung eines markierten Antikörpers), eine Agglutinationsreaktion (Verwendung von Spls), eine Kompetitionsreaktion oder eine Inhibitionsreaktion.
In einem Immunassay werden gegen die zu untersuchende Zelle(n) gerichtete Antikörper an eine Festphase gebunden, beispielsweise an die Innenseite eines Teströhrchens. Die Körperflüssigkeit mit dem Blutanteil, der extrazelluläre Prosomen enthalten sollte, wird dann ebenfalls in das Teströhrchen gegeben, um den Antikörper zu binden. In das mit dem Antigen-Antikörper-Komplex beschichtete Röhrchen wird eine bekannte Menge geeigneter antiprosomaler Protein-Antikörper oder mit einer fluoreszierenden Verbindung markierte Antikörper gegeben. Die Fluoreszenz-Menge wird so gemessen und mit einem Normwert verglichen.
Fachleuten sind andere Diagnose-Testsets bekannt, die möglicherweise so angepasst werden können, dass sie in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten. Zu Immundiagnose- Testsets gehören beispielsweise der Radio-Immunassay oder der Enzym-Immunaktivitätsassay ("EIA") wie sie in dem wiedereingesetzten US-Patent Nr. 32,696 von Schuurs et al. beschrieben werden. Ein Lichtstreuungs-Immunassay-System wird in der EP 0,254,430 A2 von Ortho Diagnostic Systems, Inc. (entspricht der am 26. Juni 1986 eingereichten US Serien-Nr. 879,236) offenbart. In den US Patenten Nr. 4,376,110 und Nr. 4,486,530 von Hybritech Inc. wird ein Diagnose-Testset beschrieben, in dem zwei monoklonale Antikörper mit hoher Bindungsaffinität verwendet werden.

IV. Protease-Aktivität

Die Menge extrazellulärer Prosomen kann auch festgestellt werden, indem die Protease-Aktivität in einem extrahierten Anteil Blut, das diese extrazellulären Prosomen enthalten sollte, gemessen wird. Je grösser die Anzahl Prosomen, desto höher ist die Protease-Aktivität.
Die Höhe der Protease-Aktivität im Pool kann unter Verwendung des folgenden Substrats gemessen werden:
Leu-Leu-Val-Tyr-MCA
5 Mikroliter verdauten 0,22 pM des Substrates in 30 Minuten (siehe Fig. D). MCA steht für 4-methyl-7-cumarylamido.
Die Erfindung wird durch die folgenden veranschaulichenden Beispiele weiter erklärt.

BEISPIEL 1

Menschliches Serum oder Kälberserum wurde bei 3000 U/min und danach bei 12'000 U/min zentrifugiert, um alle toten Zellen oder zurückbleibenden Debris zu entfernen. Der gereinigte Überstand wurde anschliessend 18 Stunden bei 37'000 U/min durch ein Saccharose- Kissen in einem Beckman Ti6O-Rotor zentrifugiert, um die Partikel zu sammeln. Das Pellet wurde in einer 0,5 % Sarkosyl enthaltenden Pufferl sung bei 50'000 U/min während 5 Stunden in einem Beckman T170-Rotor resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wurde mittels Polyacrylamidgelelektrophorese ("PAGE") und Western-Blot mit antiprosomalen monoklonalen Antikörpern, die über die Anwesenheit von Prosomenantigenen verfügen, analysiert. Wenn intakte Prosomen auf einen 5-21 % Saccharosegradienten gegeben wurden, konnten sie in der 19S-Region (Abbildung A der Fig. 1) beobachtet werden. Prosomenproteine wurden in jeder Fraktion des Saccharosegradienten mittels Western-Blot unter Verwendung verschiedener antiprosomaler monoklonaler Antikörper (anti-p25K, anti-p27K, anti-p29K, antip31K und anti-p33K) und sekundärem antimausperoxidasekonjugiertem Antikörper (Abbildung C der Fig. 1, MG-Marker sind rechts abgebildet) gezeigt. Diese extrazellulären Prosomen enthalten im 70er Nukleotidbereich pRNAs (Abbildung B), wie durch 3'-Markierung und Acrylamidharnstoffgelelektrophorese festgestellt.
Es wurden Proteaseassays durchgeführt, die zeigen, dass diese Prosomen mulitkatalytische Protease-Aktivität besitzen:

PROTEASE-AKTIVITÄT IM POOL

(5 µl in 30 Minuten verdauten 0,22 pM des Substrats Leu-Leu-Tyr-MCA)

BEISPIEL 2 (vergleichendes Beispiel)

Aus Seren von gesunden Personen und von an Kolonkrebs leidenden Patienten wurden mittels Differentialzentrifugierung in Anwesenheit von Sarkosyl wie in Beispiel 1 beschrieben extrazelluläre Prosomen hergestellt. Die Pellets wurden in einer Probepufferlösung (2% B-mercaptoethanol, 2 % SDS, 0,0 M Tris-Cl pH 6,8, 12 % Saccharose und Bromphenolblau) resuspendiert und mittels Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert, danach auf eine Nitrozellulose- Membran transferiert und mit einer Mischung aus folgenden antiprosomalen monoklonalen Antikörpern getestet: anti-p27K (Ib5) und anti-p25K (7A11). Die fixierten antiprosomalen monoklonalen Antikörper wurden durch an Peroxidase gekoppelte Kaninchen-Antimaus-IgG- Antikörper nachgewiesen und durch ein Standard-Reagens (0,02 % Chlor-Napthol in methanolphosphatgepufferter Kochsalzlösung 20/80 mit 1/1000 Volumen H&sub2;O&sub2;) entwickelt. Jede Säule in Fig. 2 entspricht aus 4 ml Serum gereinigten extrazellulären Prosomen:
(1 und 2): Seren von Patienten mit Kolonkrebs und
(3 und 4): Seren von Kontrollpatienten
Die Verwendung spezifischer Beispiele und Ausführungen sollen das Gebiet der Erfindung, die in den Ansprüchen definiert ist, nicht einschränken.

SEQUENZ-LISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) BEWERBER
(A) NAME: PRO-SOMA SARL
(B) STRASSE: 9, Rue Larrey
(C) STADT: Paris
(D) LAND: Frankreich
(E) POSTLEITZAHL: F 75 005
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Diagnoseverfahren
(iii) ANZAHL SEQUENZEN: 1
(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR. 1:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Protein
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO. 1:
Leu Leu Val Tyr
1

Claims

1. In vitro-Verfahren zur Diagnose einer Infektion mit dem humanen Immundefizienz-Virus bei einem Patienten, umfassend:

- quantitative Bestimmung der Menge oder des Prozentsatzes an im Blut des Patienten oder in Fraktionen davon vorhandenen extrazellulären Prosomen, und

- Vergleich der so erhaltenen Anzahl oder des Prozentsatzes mit dem Standard-Wert einer nicht mit dem humanen Immundefizienz- Virus infizierten Person.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei das Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Menge oder des Prozentsatzes an extrazellulären Prosomen die Analyse des Bluts des Patienten oder von Extrakten daraus mittels markierter Antikörper, markierter Antikörper-Fragmente oder daraus hergestellter Mischungen umfasst.

3. Verfahren gemäss Anspruch 2, wobei die Antikörper oder Antikörper-Fragmente aus einer aus gegen die Prosomenproteine p25K, p27K, p29K (p28K, p33K), p30/33K und p31K gerichteten Antikörpern bestehenden Gruppe ausgewählt oder davon abgeleitet werden.

4. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei das Verfahren zum Erhalten einer quantitativen Bestimmung extrazellulärer Prosomen die Analyse des Bluts des Patienten oder von Fraktionen davon mittels des Substrats:

Leu-Leu-Val-Tyr- L 4-methyl-7-coumarylamido]

zur Bestimmung der Proteaseaktivität eines der genannten extrazellulären Prosomen umfasst.

5. Verfahren zur Verwendung des Substrats:

Leu-Leu-Val-Tyr-[4-methyl-7-coumarylamido]

zur Herstellung eines Diagnose-Testsets zur Diagnose des humanen Immundefizienz-Virus.