JP3590098B2 - ヒト肺癌細胞に対する抗体及びそれを利用するヒト肺癌検査法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト肺癌細胞と特異的に反応する抗体、及び該抗体が特異的に反応する抗原蛋白質を利用して作製された抗体を用いるヒト肺癌の検査方法並びに該抗原蛋白質をコードするｍＲＮＡを測定することから成るヒト肺癌検査方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
日本国民の疾患別死亡原因の第一位は悪性新生物（ガン）であり、その割合は年々増加の一途を辿っている。特に、近年著しい増加を示す肺癌は、男性における癌死者の第一位を占め、女性における肺癌死亡率も着実に増加している。肺癌は早期に発見し適切な治療が施されれば高い治癒率が得られることから、その早期発見の為の診断法が求められている。
従来、肺癌の診断は、▲１▼胸部レントゲン検査法、▲２▼癌細胞から血中に放出されたＣＥＡ、ＳＣＣ抗原及びＮＳＥ抗原等の腫瘍マーカーによる血清診断法、▲３▼喀痰染色による病理学的細胞診断法（パパニコロウ染色法）などにより行われてきたが、これらの従来法には数々の問題点が指摘されている。例えば、▲１▼胸部レントゲン検査法はＸ線を取り扱う為の施設・設備・技師が必要な上、胸骨の背後の癌病巣の発見が困難であること、▲２▼血清診断法では全ての肺癌（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌、小細胞癌）を網羅するような特異的マーカーが確立されておらず、一部の肺癌のマーカーであるＳＣＣ抗原やＮＳＥ抗原のような従来のマーカーは癌の早期段階では検出が難しいこと、▲３▼病理学的細胞診断法では癌細胞の判定に熟練した技術者が必要な上、判定が手作業のため多検体の処理が難しいことなどが挙げられる。
【０００３】
特に、肺癌の４０〜６０％を占める扁平上皮癌は、その多発部位である気管支周辺部が胸骨の背後に位置するため明瞭なＸ線像を得ることが難しく、胸部レントゲン検査では十分な発見が出来なかった。一方、扁平上皮癌は癌病巣が気管支周辺部に集中するため癌細胞が喀痰中に排出されやすい特徴を持つ。このような理由により喀痰細胞診が扁平上皮癌の重要な診断法となっており、その集団検診への応用による肺癌の早期発見を可能とする方法の開発が求められていた。
従前から、免疫染色法による喀痰細胞診が可能となれば、肺癌の早期診断に大いに役立つと考えられ、種々のマウスモノクローナル抗体を用いた喀痰細胞診の研究が試みられてきた。
マウスモノクローナル抗体はＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６（１９７５）４５９）によるハイブリドーマ技術を利用して生産され、診断分野に広く利用されている。これらのマウスモノクローナル抗体が認識する癌関連抗原としては、癌胎児性抗原・消化管癌抗原（ＧＩＣＡ）・α−フェトプロテイン・ＣＡ１９−９等の消化器癌に対する腫瘍マーカーの他、特に肺癌関連の腫瘍マーカーとしてＳＣＣ抗原やＮＳＥ抗原などがよく知られている。しかしこれらの腫瘍マーカーは総じて特異性・検出率の点で必ずしも満足のいくものとは言いがたく、よりよい癌の検出方法が望まれていた。
【０００４】
これまでに、癌特異的マーカーを得るべく、正常組織と癌組織間の微細な抗原差を検出出来る診断用モノクローナル抗体を得る為の多くの試みがなされてきた。しかしマウスをヒトの癌抗原を含有する混合物で免疫しても、マウスは主としてマウスとヒトの種間で差異のある物質を免疫原として認識するため、ヒト正常組織と癌組織の間の微妙な差異を認識するモノクローナル抗体を得ることは難しい（Ｈａｓｐｅｌ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４５（１９８５）３９５１）。このような理由より、ヒトモノクローナル抗体がこの問題を解決する有効な方法として近年脚光を浴びてきた。
しかし、実際にヒトモノクローナル抗体を作製するにおいては、倫理上の問題から積極的にヒトに癌抗原を免疫することは困難である為、目的とするヒトモノクローナル抗体の作製は極めて限られた範囲のものに限定されていた。従って、これまでのところ、喀痰細胞診等の肺癌細胞診に適するヒトモノクローナル抗体は得られていない。
本発明は、従来の肺癌診断法における上記問題点を解決し、自動化集団検診による肺癌の早期発見と診断率の向上、及び抗体を使った肺癌の治療を目的としてなされたものである。
【０００５】
【課題を解決する為の手段】
本発明者らは上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、肺癌に対して高い特異性を有するヒトモノクローナル抗体を産生する種々のハイブリドーマを作製することに成功し、それに基づいて本発明を完成するに至った。
即ち、本発明者らは、例えば、自ら開発したインターロイキン−２等の各種の因子を添加した免疫賦活培地（特開平４−２８１７９９号）を用いるヒトＢリンパ球の効率的な生体外免疫法、自ら樹立した融合効率の高いヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ作製用融合パートナー（特開昭６０−１４１２８５ 号、特開昭６３−１８５３７４ 号、特開平３−１８３４７７号、特開平３−２９７３８２号、特開平４−２８１７９９号）を用いること等により、喀痰細胞診に適したヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製に成功した。
【０００６】
本発明は、肺癌に対して特異的に反応する抗体、特に、ヒトモノクローナル抗体を利用した肺癌細胞診用試薬及び肺癌検査法に関するものである。また本発明は他の様態として、本発明のヒトモノクローナル抗体が認識する肺癌関連抗原蛋白質を利用して作製されたポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いる肺癌細胞診用試薬及び肺癌の検査法に関する。
更に本発明は、該肺癌関連抗原蛋白質をコードするｍＲＮＡを測定することから成るヒト肺癌検査方法に関するものである。
即ち、本発明は、下記のアミノ酸配列：
Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
及び該アミノ酸配列の一つ又は複数の位置において、アミノ酸残基が欠損、置換又は挿入されているアミノ酸配列を有する蛋白質を抗原として認識する抗体を提供するものである。
このような蛋白質の代表例として、１４−３−３蛋白質と総称される蛋白質ファミリーがある。この蛋白質ファミリーにはＭａｒｔｉｎ等（Ｍａｒｔｉｎ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３３１，２９６（１９９３））やＡｉｔｋｅｎ等（Ａｉｔｋｅｎ等，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１７，４９８（１９９２））が示す蛋白質がある。その中で現在は未だ、細胞質ホスフォリパーゼＡ２（ＥＣ３．１．１．４）がこの１４−３−３蛋白質ファミリーに帰属するかどうかが明らかとなっていない。
【０００７】
１４−３−３蛋白質及び細胞質ホスフォリパーゼＡ２を抗原として認識するモノクローナル抗体の一例としては、
▲１▼ヒト肺癌細胞株、ヒト肺癌組織及び喀痰中のヒト肺癌細胞と反応し、
▲２▼ヒト正常細胞と反応せず、
▲３▼免疫グロブリンクラスがＩｇＭである、
ことを特徴とするハイブリドーマＡＥ−６から産生されるヒトモノクローナル抗体がある。
これは平成５年１１月２５日付で生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託されている（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９８１）。
これらのモノクローナル抗体は、ヒト肺癌に対して高い特異性を示すために、これらを有効成分として含有するヒト肺癌細胞診用試薬、特に喀痰細胞診用試薬を提供することができる。
更に、上述のＡＥ−６由来の抗体に加えて、ＨＢ４Ｃ５，ＢＤ９Ｄ１２，Ｈ４８−Ｇ１１及びＨ９−Ｆ７由来の抗体もヒト肺癌細胞に対し高い特異性を示す。従って、本発明は、これらのモノクローナル抗体の一種又は二種以上を組み合わせて有効成分として含有するヒト肺癌細胞診用試薬を提供するものである。
【０００８】
例えば、ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＡＥ−６の作製法は以下のとおりである。その他のヒトモノクローナル抗体についても基本的に同様の方法で作製することができる。
１．ヒト健常人末梢血からリンパ球を分離し、Ｌ−ロイシル─Ｌ−ロイシンメチルエステルで処理して、細胞障害性あるいはサプレッサーＴ細胞のみを特異的に除去したリンパ球を調製する。
２．このリンパ球を、抗原として用いたヒト肺癌細胞株Ａ５４９と共に、インターロイキン−２、インターロイキン−６及びムラミルジペプチドを含む５％牛胎児血清含有培地で４日間培養し、生体外免疫を行う。
３．生体外免疫したリンパ球とヒト融合パートナー細胞株Ａ４Ｈ１２とを通常のポリエチレングリコールによる方法により融合し、ハイブリドーマを作製する。
【０００９】
本発明者らは、こうして得られるハイブリドーマから、肺扁平上皮癌細胞と特に反応性が高く、また、その他の組織型の肺癌細胞とも広く反応し、しかも正常細胞とは反応しないヒトモノクローナル抗体を作製し、これらのヒトモノクローナル抗体を用いることにより、本発明の喀痰細胞診用試薬を完成したのである。
本発明のヒトモノクローナル抗体は各種標識物質、特にビオチンで標識されていることが好ましい。尚、ヒトモノクローナル抗体の試薬中の濃度は、通常約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲である。二種以上のヒトモノクローナル抗体を使用するときの各抗体の比は当業者が適宜選択し得る。
【００１０】
本発明における喀痰細胞診の手順についての一例を以下に示す。
１．サコマノ変法固定液（例えば、武藤化学薬品株式会社製）中に被検者の痰を喀出させ混合する。
２．痰をスライドガラス上に塗抹し、１時間自然乾燥する。
３．エタノール（９５％）で３０分間固定する。
４．抗体の非特異的吸着を迎えるため、正常ヤギ血清（２％）及びヒトＩｇＭ（１００μｇ／ｍｌ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３０分間処理する。
５．液を捨てる。
６．喀痰細胞診用試薬と３時間反応させる。
７．ＰＢＳで３０分間洗う。
８．アビジン・ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（例えば、ベクター社製）と４５分間反応する。
９．ＰＢＳで３０分間洗う。
１０．ＤＡＢ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、過酸化水素（０．０１％）及びトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．４（５０ｍＭ）から成る基質溶液を添加し、染色を行う。
１１．染色度を調べる。
【００１１】
喀痰細胞診用試薬についての一例を以下に示す。
５μｇ／ｍｌのビオチン標識ヒトモノクローナル抗体ＡＥ−６及び
１０％牛胎児血清を含むＰＢＳ溶液
尚、ヒトモノクローナル抗体のビオチン標識は、通常の方法により行うことができる。又、本発明試薬は、上記成分の他に、牛血清アルブミン、ゼラチン等を適宜含有することができ、そのｐＨはＰＢＳ、バルビタール緩衝液等の緩衝剤で約６．５〜約８．５の範囲とするのが好ましい。
尚、同名のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、ＨＢ４Ｃ５、ＢＤ９Ｄ１２、Ｈ４８−Ｇ１１及びＨ９−Ｆ７は、工業技術院微生物工業研究所に、夫々昭和６３年５月１２日（ＦＥＲＭ ＢＰ−１８７９）、平成４年１０月３０日（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２３５）、平成３年３月６日（ＦＥＲＭ Ｐ−１２０８９）及び平成３年３月６日（ＦＥＲＭ Ｐ−１２０９０）付で寄託されている。
更に本発明は、上記の特定蛋白質をコードするｍＲＮＡが肺癌細胞に於いて正常細胞よりも多量に発現されている事実の発見に基づき、かかるｍＲＮＡを測定することによるヒト肺癌細胞の検査方法を提供するものである。ｍＲＮＡの測定は、ノーザンブロッティング法（Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ 等，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２） で行うことができる。
【００１２】
【実施例】
〔実施例１〕
ハイブリドーマＡＥ−６の樹立とモノクローナル抗体の製造
２４穴マイクロプレートの各ウエルにヒト肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞１ｘ１０４ 個を植えつけ、１０％牛胎児血清を含むＥＲＤＦ培地中で３６時間前培養を行なった後、前もって０．２５ｍＭ Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステルにより処理した末梢血リンパ球１ｘ１０４ 個、を添加し、１０μｇ／ｍｌムラミルジペプチド、１００Ｕ／ｍｌインターロイキン−２、１０Ｕ／ｍｌインターロイキン−６及び５％牛胎児血清を含むＥＲＤＦ培地中で４日免疫感作を行った。免疫感作の検出はｉｎ ｓｉｔｕ免疫染色法（米特許第５，２９０，６８１ 号明細書）にて行った。Ｉｎ ｓｉｔｕ免疫染色法で抗体を産生することが確認されたウエル中のリンパ球（１ｘ１０４ 個）を集め、２ｘ１０６ 個のＡ４Ｈ１２パートナー細胞（ヒトＴ細胞白血病細胞株Ｍｏｌｔ４由来ヒポキサンチン・グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株） と融合して不死化後、ＨＡＴ（１００ｍＭヒポキサンチン、０．４ｍＭアミノプテリン、１６ｍＭチミジン）−１５％牛胎児血清−ＥＲＤＦ培地中でクローニングを行い、最終的にＡＥ−６ハイブリドーマを得ることに成功した。このハイブリドーマを２ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン、５μｇ／ｍｌウシインスリン、３５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２．５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを含むＲＤＦ培地にて無血清培養を行った。ＡＥ−６ハイブリドーマより得られたＩｇＭ抗体の精製は培養上清６〜９Ｌに百分の一量の１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５を加え、ハイドロオキシアパタイトカラム（４．１ｘ２８ｃｍ：１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に平衡化）にチャージ、３カラム容量の５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５にてカラムを洗浄後、抗体を２００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．５にて溶出し、ＩｇＭを含む画分を集めた。プールされた画分を１０、０００ｘｇで１０分間遠心分離した上清を、リン酸緩衝生理食塩水にて平衡化しておいたバイオゲルＡ−１５ｍ（２．８ｘ７５ｃｍ）にてゲル濾過を行った。ＩｇＭを含む画分を２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．２にて３倍量に希釈し、２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．２にて平衡化しておいたＤＥＡＥセルロースカラム（２．４ｘ８ｃｍ）に掛けた。カラムを３倍量の平衡化緩衝液にて洗浄後、抗体を３００ｍＭ迄のＮａＣｌ濃度勾配にて溶出し、ＩｇＭ画分をプールし、ＡＥ−６モノクローナル抗体を得た。
【００１３】
〔実施例２〕
癌組織に対する種々のヒトモノクローナル抗体の反応性
実施例１により得られたＡＥ−６モノクローナル抗体を含む種々のヒトモノクローナル抗体を使い、肺癌及び正常組織との反応性を二抗体法にて検証した。即ち、外科切除により得られた肺癌組織を、ホルマリン固定し、常法に従いパラフィン包埋後、組織切片を作製した。各切片をキシレンにてパラフィンを除去し、０．６％過酸化水素をふくむメタノール中で２０分間放置し、内在性ペルオキシダーゼを不活化した。切片を９５％、８５％、７５％エタノール、更にリン酸緩衝生理食塩水に浸した後、室温加湿下正常山羊血清とインキュベートした。更に、ＡＥ−６モノクローナル抗体と一時間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ抗体と一時間反応させ、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した後、最後にＮ，Ｎ’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）にて発色を行った。
【００１４】
【表１】
【００１５】
表中の数字：陽性検体数／試験検体数
表１の結果から明らかなように、喀痰細胞診にとって特に重要な肺扁平上皮癌細胞に対して高い反応性を示すヒトモノクローナル抗体が多数得られた。また、他の組織型の肺癌についても高率に反応するヒトモノクローナル抗体が得られた。特に、ＡＥ−６抗体は癌組織検体の７８％と反応することが判る。
【００１６】
〔実施例３〕
ヒトモノクローナル抗体ＡＥ−６の癌組織スタンプ標本との反応性を調べた。癌組織スタンプ標本は、肺癌手術の際、切除した癌組織をスライドグラス上に捺印することにより調整した。
【００１７】
【表２】
【００１８】
表２に示したように、ＡＥ−６抗体は、肺扁平上皮癌及び肺腺癌のスタンプ標本とも高率に反応した。
【００１９】
〔実施例４〕
ヒトモノクローナル抗体ＡＥ−６の喀痰との反応性を調べた。癌患者の喀痰を用い、本発明の抗体による染色判定結果と、従来法であるパパニコロウ染色法で判定した結果との比較を行った。
【００２０】
【表３】
【００２１】
表中の数字：癌細胞の検出された症例数／試験症例数
従来法（パパニコロウ染色）により、癌細胞が検出された症例については、本発明の喀痰細胞診法でも全て癌細胞が検出されており、本発明の喀痰細胞診法は、癌細胞の検出能力で従来法と同等となり、簡便さ、大量検体処理能力等の利点を考え合わせると、従来法より優れていると考えられる。
【００２２】
〔実施例５〕
ＡＥ−６モノクローナル抗体が認識する分子量３１ｋＤａの抗原物質の特定
ハイブリドーマＡＥ−６が産生するモノクローナル抗体の認識抗原を明らかにするために、該抗体が反応する肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞中の抗原検索を行った。Ａ５４９細胞を１０％ＦＣＳを含むＥＲＤＦ培地で培養後、その細胞を集め凍結して保存した。氷冷下、この細胞を等量（ｖ／ｗ）の１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と１ｍＭα−トルエンスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水中で超音波破砕し、１０、０００Ｘｇにて２０分間遠心分離して、上清を得た。この上清を還元条件下ＳＤＳ−ゲル電気泳動後、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写しＡＥ−６モノクローナル抗体を反応させた。その後ＰＶＤＦ膜をペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＭ抗体溶液に浸し、洗浄後ＤＡＢにて発色を行った。その結果、３１ｋＤａと４０ｋＤａの位置に発色したバンドが検出された。平行して行ったＡＥ−６抗体固定化カラムクロマトグラフィーにて特に強い結合力を示した、３１ｋＤａの蛋白質につき、更にその同定を行った。
【００２３】
Ａ５４９細胞を前記のごとく超音波破砕し、遠心分離した上清を更に１００、０００Ｘｇで６０分間超遠心分離を行い、上清を得た。この上清を１５０ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５にて平衡化したスーパーデックス７５カラムで流速２．２ｍｌ／ｍｉｎの流速にてクロマトグラフィーを行い、得られた各画分をＡＥ−６モノクローナル抗体を用いたイムノブロッチングで分析して、３１ｋＤａの抗原を含む画分を集めた。この画分を２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液，ｐＨ７．８で平衡化したモノＱカラムクロマトグラフィーにチャージし、流速１ｍｌ／ｍｉｎで１Ｍ ＮａＣｌまでの濃度勾配溶出を行ない、還元条件下ＳＤＳ−ゲル電気泳動後、最終的に３１ｋＤａの蛋白質を単離した。この蛋白質のアミノ酸配列を決定してその同定を行おうとしたがＮ−末端がブロックされていたため、臭化シアン開裂を行い、その断片を還元状態下ＳＤＳ−ゲル電気泳動後ＰＶＤＦ膜へ転写し、アミノ酸配列を調べた。その結果、既に述べたアミノ酸配列を得た。このアミノ酸配列は、前述のごとく１４−３−３蛋白質及び細胞質ホスフォリパーゼＡ２のアミノ酸配列と良く一致し、１４−３−３蛋白質ファミリーに属する９種類の蛋白質に於いて、Ｎ末端から２７番目乃至３６番目の位置に存在することが知られている（Ｍａｒｔｉｎ等、ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．，３３１（１９９３）２９６）。１４−３−３蛋白質は真核細胞生物間で進化論的にその構造が良く保存された蛋白質であり、特に脳中に高濃度で存在していることも知られている（Ａｉｔｋｅｎ等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１７（１９９２）４９８）。
そこで１４−３−３蛋白質の精製方法（Ｇｒａｓｓｏ等、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１２４（１９７７）４９７）に従って、牛脳より１４−３−３蛋白質を精製し、還元条件下ＳＤＳゲル電気泳動して、ＰＶＤＦ膜へ転写後、ＡＥ−６モノクローナル抗体を用いて免疫染色を行った。その結果、牛脳由来１４−３−３蛋白質はＡ５４９細胞由来の抗原物質と同様にＡＥ−６モノクローナル抗体とよく反応することが検証された（図１）。
【００２４】
〔実施例６〕
レコンビナント細胞質由来ホスフォリパーゼＡ２の発現とそのＡＥ−６モノクローナル抗体との反応
アミノ酸配列より特定された蛋白質、即ち１４−３−３蛋白質及びそのファミリー蛋白質とされている細胞質ホスフォリパーゼＡ２が、確かにＡＥ−６モノクローナル抗体と反応することを更に検証するためＡ５４９細胞よりチオシアン酸グアニジン・ＣｓＣｌ法（Ｇｌｉｓｉｎ等：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（１９７４）２６３３）によりＲＮＡを抽出し、１４−３−３蛋白質ファミリーにてよく保存されている塩基配列のプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて６６６塩基対のｃＤＮＡを得た。ＤＮＡ配列を検証したところ、このｃＤＮＡはＺｕｐａｎ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１９９２）８７０７）の報告した細胞質ホスフォリパーゼＡ２と完全に一致した。プライマーに工夫を加えることにより同様の方法にて７５４塩基対の完全な長さの細胞質ホスフォリパーゼＡ２のｃＤＮＡを得ることが出来たので、該遺伝子を哺乳動物細胞発現ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６に挿入し猿由来のＣＯＳ細胞に遺伝子導入し培養を行った。得られたＣＯＳ細胞を破壊し、上清を還元条件下ＳＤＳゲル電気泳動後、ニトロセルロース膜に転写し、ＡＥ−６抗体を用いて二抗体法による免疫染色を行った。図２に示すように発現された細胞質ホスフォリパーゼＡ２が３１ｋＤａの位置で、ＡＥ−６モノクローナル抗体と反応することが明らかとなり、１４−３−３蛋白質ファミリーがＡＥ−６モノクローナル抗体の抗原であることが確認された。
【００２５】
〔実施例７〕
癌及び正常細胞における１４−３−３蛋白質ファミリーｍＲＮＡの発現
癌及び正常細胞における１４−３−３蛋白質ファミリーのｍＲＮＡの発現を検証するために、７５４塩基対の細胞質ホスフォリパーゼＡ２ｃＤＮＡをもとにランダムプライミング法（Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ 等，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２） により３２Ｐ標識プローブを作製した。種々の細胞株よりチオシアン酸グアニジン・ＣｓＣｌ法にてＲＮＡを抽出、アガロースゲル電気泳動を行い、ＲＮＡを分離した後ナイロン膜へ転写した。この膜上のＲＮＡを３２Ｐでラベルした細胞質ホスフォリパーゼＡ２に対するプローブとハイブリダイズし、オートラジオグラフィーを行った（図３）。その結果Ａ５４９肺腺癌細胞株、ＭＣＦ−７乳癌細胞株、ＭＫＮ−４５胃癌細胞株、Ｈｕｈ−６肝癌細胞株から得られたｍＲＮＡにては、細胞質ホスフォリパーゼＡ２のｍＲＮＡが著しく発現されているのに対し、正常肺繊維芽細胞であるＦｌｏｗ２０００細胞では殆ど発現されていなかった。この結果は、ヒト組織中の１４−３−３蛋白質ファミリーのｍＲＮＡを測定することにより癌の診断が可能であることを示すものである。
【００２６】
〔実施例８〕
各種癌組織及び正常組織中のＡＥ−６モノクローナル抗体と反応する分子量３１ｋＤａの抗原量の比較
低温下、凍結した肺癌、正常肺及び肝臓の各組織を裁断後、組織重量当たり３倍容量の１ｍＭ ＥＤＴＡと１ｍＭ ＰＭＳＦを含むリン酸緩衝化生理食塩水を加えてホモゲナイズし、１０、０００ｘｇにて遠心分離して上清を得た。各組織の上清を還元条件下でＳＤＳ−ゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜へ転写してイムノブロッチング法により各臓器中に含まれる抗原量を比較した。即ち、ＰＶＤＦ膜にＡＥ−６モノクローナル抗体を反応後、ペルオキシダーゼを標識した抗ヒトＩｇＭ抗体と反応し、ＤＡＢを基質として用い発色を行った。その結果、ＡＥ−６モノクローナル抗体によって認識される３１ｋＤａ抗原は、正常な肺及び肝臓組織では極めて少量しか検出されないが、肺癌組織では著しくその量が増加していた（図４）。この結果は実施例７の結果とともに、ＡＥ−６モノクローナル抗体を用いるヒト肺癌の免疫学的な診断及び治療の可能性に根拠を与えるものである。
【００２７】
〔実施例９〕
１４−３−３蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体の癌組織への反応性
牛脳より作製した１４−３−３蛋白質を免疫原として用い、常法に従いマウスモノクローナル抗体を作製した。得られたマウスモノクローナル抗体の肺癌及び正常組織との反応性を二抗体法にて検証した。外科切除後ホルマリン固定しパラフィン包埋した組織切片を用いて、マウスモノクローナル抗体による免疫染色を実施例２と同様に行った。その結果、表４に示すごとく肺癌組織検体の全てが該抗体により特異的に染色され、該マウスモノクローナル抗体の肺癌診断における有用性が示された。
【００２８】
【表４】
【００２９】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体及びｍＲＮＡを使用することによって、肺癌、特に扁平上皮癌を喀痰細胞診等により簡便かつ客観的に検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】牛脳由来１４−３−３蛋白質とＡＥ−６モノクローナル抗体との反応を示す電気泳動の写真である。
レーン１： プレステインバイオラッド社製分子量マーカー（低分子）
レーン２： Ａ５４９肺腺癌細胞由来３１ｋＤａ蛋白質
レーン３： 牛脳由来１４─３─３蛋白質
【図２】細胞質ホスフォリパーゼＡ２とＡＥ−６モノクローナル抗体との反応を示す電気泳動の写真である。
レーン１： 遺伝子未導入ＣＯＳ細胞破砕物
レーン２： Ａ５４９細胞由来３１ｋＤａ蛋白質
レーン３： レコンビナント細胞質ホスフォリパーゼＡ２遺伝子導入ＣＯＳ細胞破砕物
【図３】細胞質ホスフォリパーゼＡ２のｍＲＮＡの発現を示すオートラジオグラフィの写真である。
レーン１： Ａ５４９肺腺癌細胞株由来ＲＮＡ
レーン２： ＭＣＦ−７乳癌細胞株由来ＲＮＡ
レーン３： ＭＫＮ−４５胃癌細胞株由来ＲＮＡ
レーン４： Ｈｕｈ−６肝臓癌細胞株由来ＲＮＡ
レーン５： Ｆｌｏｗ２０００正常肺繊維芽細胞株由来ＲＮＡ
【図４】分子量３１ＫＤａの抗原蛋白質とＡＥ−６モノクローナル抗体との反応を示す電気泳動の写真である。
レーン１： 牛脳由来１４─３─３蛋白質
レーン２： 扁平上皮癌組織
レーン３： 肺癌組織
レーン４： 正常肺組織
レーン５： 肺癌組織
レーン６： 正常肺組織
レーン７： 正常肝臓組織
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト肺癌細胞と特異的に反応する抗体、及び該抗体が特異的に反応する抗原蛋白質を利用して作製された抗体を用いるヒト肺癌の検査方法並びに該抗原蛋白質をコードするｍＲＮＡを測定することから成るヒト肺癌検査方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
日本国民の疾患別死亡原因の第一位は悪性新生物（ガン）であり、その割合は年々増加の一途を辿っている。特に、近年著しい増加を示す肺癌は、男性における癌死者の第一位を占め、女性における肺癌死亡率も着実に増加している。肺癌は早期に発見し適切な治療が施されれば高い治癒率が得られることから、その早期発見の為の診断法が求められている。
従来、肺癌の診断は、▲１▼胸部レントゲン検査法、▲２▼癌細胞から血中に放出されたＣＥＡ、ＳＣＣ抗原及びＮＳＥ抗原等の腫瘍マーカーによる血清診断法、▲３▼喀痰染色による病理学的細胞診断法（パパニコロウ染色法）などにより行われてきたが、これらの従来法には数々の問題点が指摘されている。例えば、▲１▼胸部レントゲン検査法はＸ線を取り扱う為の施設・設備・技師が必要な上、胸骨の背後の癌病巣の発見が困難であること、▲２▼血清診断法では全ての肺癌（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌、小細胞癌）を網羅するような特異的マーカーが確立されておらず、一部の肺癌のマーカーであるＳＣＣ抗原やＮＳＥ抗原のような従来のマーカーは癌の早期段階では検出が難しいこと、▲３▼病理学的細胞診断法では癌細胞の判定に熟練した技術者が必要な上、判定が手作業のため多検体の処理が難しいことなどが挙げられる。
【０００３】
特に、肺癌の４０〜６０％を占める扁平上皮癌は、その多発部位である気管支周辺部が胸骨の背後に位置するため明瞭なＸ線像を得ることが難しく、胸部レントゲン検査では十分な発見が出来なかった。一方、扁平上皮癌は癌病巣が気管支周辺部に集中するため癌細胞が喀痰中に排出されやすい特徴を持つ。このような理由により喀痰細胞診が扁平上皮癌の重要な診断法となっており、その集団検診への応用による肺癌の早期発見を可能とする方法の開発が求められていた。
従前から、免疫染色法による喀痰細胞診が可能となれば、肺癌の早期診断に大いに役立つと考えられ、種々のマウスモノクローナル抗体を用いた喀痰細胞診の研究が試みられてきた。
マウスモノクローナル抗体はＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６（１９７５）４５９）によるハイブリドーマ技術を利用して生産され、診断分野に広く利用されている。これらのマウスモノクローナル抗体が認識する癌関連抗原としては、癌胎児性抗原・消化管癌抗原（ＧＩＣＡ）・α−フェトプロテイン・ＣＡ１９−９等の消化器癌に対する腫瘍マーカーの他、特に肺癌関連の腫瘍マーカーとしてＳＣＣ抗原やＮＳＥ抗原などがよく知られている。しかしこれらの腫瘍マーカーは総じて特異性・検出率の点で必ずしも満足のいくものとは言いがたく、よりよい癌の検出方法が望まれていた。
【０００４】
これまでに、癌特異的マーカーを得るべく、正常組織と癌組織間の微細な抗原差を検出出来る診断用モノクローナル抗体を得る為の多くの試みがなされてきた。しかしマウスをヒトの癌抗原を含有する混合物で免疫しても、マウスは主としてマウスとヒトの種間で差異のある物質を免疫原として認識するため、ヒト正常組織と癌組織の間の微妙な差異を認識するモノクローナル抗体を得ることは難しい（Ｈａｓｐｅｌ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４５（１９８５）３９５１）。このような理由より、ヒトモノクローナル抗体がこの問題を解決する有効な方法として近年脚光を浴びてきた。
しかし、実際にヒトモノクローナル抗体を作製するにおいては、倫理上の問題から積極的にヒトに癌抗原を免疫することは困難である為、目的とするヒトモノクローナル抗体の作製は極めて限られた範囲のものに限定されていた。従って、これまでのところ、喀痰細胞診等の肺癌細胞診に適するヒトモノクローナル抗体は得られていない。
本発明は、従来の肺癌診断法における上記問題点を解決し、自動化集団検診による肺癌の早期発見と診断率の向上、及び抗体を使った肺癌の治療を目的としてなされたものである。
【０００５】
【課題を解決する為の手段】
本発明者らは上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、肺癌に対して高い特異性を有するヒトモノクローナル抗体を産生する種々のハイブリドーマを作製することに成功し、それに基づいて本発明を完成するに至った。
即ち、本発明者らは、例えば、自ら開発したインターロイキン−２等の各種の因子を添加した免疫賦活培地（特開平４−２８１７９９号）を用いるヒトＢリンパ球の効率的な生体外免疫法、自ら樹立した融合効率の高いヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ作製用融合パートナー（特開昭６０−１４１２８５ 号、特開昭６３−１８５３７４ 号、特開平３−１８３４７７号、特開平３−２９７３８２号、特開平４−２８１７９９号）を用いること等により、喀痰細胞診に適したヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製に成功した。
【０００６】
本発明は、肺癌に対して特異的に反応する抗体、特に、ヒトモノクローナル抗体を利用した肺癌細胞診用試薬及び肺癌検査法に関するものである。また本発明は他の様態として、本発明のヒトモノクローナル抗体が認識する肺癌関連抗原蛋白質を利用して作製されたポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いる肺癌細胞診用試薬及び肺癌の検査法に関する。
更に本発明は、該肺癌関連抗原蛋白質をコードするｍＲＮＡを測定することから成るヒト肺癌検査方法に関するものである。
即ち、本発明は、下記のアミノ酸配列：
Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
及び該アミノ酸配列の一つ又は複数の位置において、アミノ酸残基が欠損、置換又は挿入されているアミノ酸配列を有する蛋白質を抗原として認識する抗体を提供するものである。
このような蛋白質の代表例として、１４−３−３蛋白質と総称される蛋白質ファミリーがある。この蛋白質ファミリーにはＭａｒｔｉｎ等（Ｍａｒｔｉｎ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３３１，２９６（１９９３））やＡｉｔｋｅｎ等（Ａｉｔｋｅｎ等，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１７，４９８（１９９２））が示す蛋白質がある。その中で現在は未だ、細胞質ホスフォリパーゼＡ２（ＥＣ３．１．１．４）がこの１４−３−３蛋白質ファミリーに帰属するかどうかが明らかとなっていない。
【０００７】
１４−３−３蛋白質及び細胞質ホスフォリパーゼＡ２を抗原として認識するモノクローナル抗体の一例としては、
▲１▼ヒト肺癌細胞株、ヒト肺癌組織及び喀痰中のヒト肺癌細胞と反応し、
▲２▼ヒト正常細胞と反応せず、
▲３▼免疫グロブリンクラスがＩｇＭである、
ことを特徴とするハイブリドーマＡＥ−６から産生されるヒトモノクローナル抗体がある。
これは平成５年１１月２５日付で生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託されている（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９８１）。
これらのモノクローナル抗体は、ヒト肺癌に対して高い特異性を示すために、これらを有効成分として含有するヒト肺癌細胞診用試薬、特に喀痰細胞診用試薬を提供することができる。
更に、上述のＡＥ−６由来の抗体に加えて、ＨＢ４Ｃ５，ＢＤ９Ｄ１２，Ｈ４８−Ｇ１１及びＨ９−Ｆ７由来の抗体もヒト肺癌細胞に対し高い特異性を示す。従って、本発明は、これらのモノクローナル抗体の一種又は二種以上を組み合わせて有効成分として含有するヒト肺癌細胞診用試薬を提供するものである。
【０００８】
例えば、ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＡＥ−６の作製法は以下のとおりである。その他のヒトモノクローナル抗体についても基本的に同様の方法で作製することができる。
１．ヒト健常人末梢血からリンパ球を分離し、Ｌ−ロイシル─Ｌ−ロイシンメチルエステルで処理して、細胞障害性あるいはサプレッサーＴ細胞のみを特異的に除去したリンパ球を調製する。
２．このリンパ球を、抗原として用いたヒト肺癌細胞株Ａ５４９と共に、インターロイキン−２、インターロイキン−６及びムラミルジペプチドを含む５％牛胎児血清含有培地で４日間培養し、生体外免疫を行う。
３．生体外免疫したリンパ球とヒト融合パートナー細胞株Ａ４Ｈ１２とを通常のポリエチレングリコールによる方法により融合し、ハイブリドーマを作製する。
【０００９】
本発明者らは、こうして得られるハイブリドーマから、肺扁平上皮癌細胞と特に反応性が高く、また、その他の組織型の肺癌細胞とも広く反応し、しかも正常細胞とは反応しないヒトモノクローナル抗体を作製し、これらのヒトモノクローナル抗体を用いることにより、本発明の喀痰細胞診用試薬を完成したのである。
本発明のヒトモノクローナル抗体は各種標識物質、特にビオチンで標識されていることが好ましい。尚、ヒトモノクローナル抗体の試薬中の濃度は、通常約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲である。二種以上のヒトモノクローナル抗体を使用するときの各抗体の比は当業者が適宜選択し得る。
【００１０】
本発明における喀痰細胞診の手順についての一例を以下に示す。
１．サコマノ変法固定液（例えば、武藤化学薬品株式会社製）中に被検者の痰を喀出させ混合する。
２．痰をスライドガラス上に塗抹し、１時間自然乾燥する。
３．エタノール（９５％）で３０分間固定する。
４．抗体の非特異的吸着を迎えるため、正常ヤギ血清（２％）及びヒトＩｇＭ（１００μｇ／ｍｌ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３０分間処理する。
５．液を捨てる。
６．喀痰細胞診用試薬と３時間反応させる。
７．ＰＢＳで３０分間洗う。
８．アビジン・ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（例えば、ベクター社製）と４５分間反応する。
９．ＰＢＳで３０分間洗う。
１０．ＤＡＢ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、過酸化水素（０．０１％）及びトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．４（５０ｍＭ）から成る基質溶液を添加し、染色を行う。
１１．染色度を調べる。
【００１１】
喀痰細胞診用試薬についての一例を以下に示す。
５μｇ／ｍｌのビオチン標識ヒトモノクローナル抗体ＡＥ−６及び
１０％牛胎児血清を含むＰＢＳ溶液
尚、ヒトモノクローナル抗体のビオチン標識は、通常の方法により行うことができる。又、本発明試薬は、上記成分の他に、牛血清アルブミン、ゼラチン等を適宜含有することができ、そのｐＨはＰＢＳ、バルビタール緩衝液等の緩衝剤で約６．５〜約８．５の範囲とするのが好ましい。
尚、同名のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、ＨＢ４Ｃ５、ＢＤ９Ｄ１２、Ｈ４８−Ｇ１１及びＨ９−Ｆ７は、工業技術院微生物工業研究所に、夫々昭和６３年５月１２日（ＦＥＲＭ ＢＰ−１８７９）、平成４年１０月３０日（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２３５）、平成３年３月６日（ＦＥＲＭ Ｐ−１２０８９）及び平成３年３月６日（ＦＥＲＭ Ｐ−１２０９０）付で寄託されている。
更に本発明は、上記の特定蛋白質をコードするｍＲＮＡが肺癌細胞に於いて正常細胞よりも多量に発現されている事実の発見に基づき、かかるｍＲＮＡを測定することによるヒト肺癌細胞の検査方法を提供するものである。ｍＲＮＡの測定は、ノーザンブロッティング法（Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ 等，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２） で行うことができる。
【００１２】
【実施例】
〔実施例１〕
ハイブリドーマＡＥ−６の樹立とモノクローナル抗体の製造
２４穴マイクロプレートの各ウエルにヒト肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞１ｘ１０４ 個を植えつけ、１０％牛胎児血清を含むＥＲＤＦ培地中で３６時間前培養を行なった後、前もって０．２５ｍＭ Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステルにより処理した末梢血リンパ球１ｘ１０４ 個、を添加し、１０μｇ／ｍｌムラミルジペプチド、１００Ｕ／ｍｌインターロイキン−２、１０Ｕ／ｍｌインターロイキン−６及び５％牛胎児血清を含むＥＲＤＦ培地中で４日免疫感作を行った。免疫感作の検出はｉｎ ｓｉｔｕ免疫染色法（米特許第５，２９０，６８１ 号明細書）にて行った。Ｉｎ ｓｉｔｕ免疫染色法で抗体を産生することが確認されたウエル中のリンパ球（１ｘ１０４ 個）を集め、２ｘ１０６ 個のＡ４Ｈ１２パートナー細胞（ヒトＴ細胞白血病細胞株Ｍｏｌｔ４由来ヒポキサンチン・グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株） と融合して不死化後、ＨＡＴ（１００ｍＭヒポキサンチン、０．４ｍＭアミノプテリン、１６ｍＭチミジン）−１５％牛胎児血清−ＥＲＤＦ培地中でクローニングを行い、最終的にＡＥ−６ハイブリドーマを得ることに成功した。このハイブリドーマを２ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン、５μｇ／ｍｌウシインスリン、３５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２．５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを含むＲＤＦ培地にて無血清培養を行った。ＡＥ−６ハイブリドーマより得られたＩｇＭ抗体の精製は培養上清６〜９Ｌに百分の一量の１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５を加え、ハイドロオキシアパタイトカラム（４．１ｘ２８ｃｍ：１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に平衡化）にチャージ、３カラム容量の５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５にてカラムを洗浄後、抗体を２００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．５にて溶出し、ＩｇＭを含む画分を集めた。プールされた画分を１０、０００ｘｇで１０分間遠心分離した上清を、リン酸緩衝生理食塩水にて平衡化しておいたバイオゲルＡ−１５ｍ（２．８ｘ７５ｃｍ）にてゲル濾過を行った。ＩｇＭを含む画分を２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．２にて３倍量に希釈し、２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．２にて平衡化しておいたＤＥＡＥセルロースカラム（２．４ｘ８ｃｍ）に掛けた。カラムを３倍量の平衡化緩衝液にて洗浄後、抗体を３００ｍＭ迄のＮａＣｌ濃度勾配にて溶出し、ＩｇＭ画分をプールし、ＡＥ−６モノクローナル抗体を得た。
【００１３】
〔実施例２〕
癌組織に対する種々のヒトモノクローナル抗体の反応性
実施例１により得られたＡＥ−６モノクローナル抗体を含む種々のヒトモノクローナル抗体を使い、肺癌及び正常組織との反応性を二抗体法にて検証した。即ち、外科切除により得られた肺癌組織を、ホルマリン固定し、常法に従いパラフィン包埋後、組織切片を作製した。各切片をキシレンにてパラフィンを除去し、０．６％過酸化水素をふくむメタノール中で２０分間放置し、内在性ペルオキシダーゼを不活化した。切片を９５％、８５％、７５％エタノール、更にリン酸緩衝生理食塩水に浸した後、室温加湿下正常山羊血清とインキュベートした。更に、ＡＥ−６モノクローナル抗体と一時間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ抗体と一時間反応させ、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した後、最後にＮ，Ｎ’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）にて発色を行った。
【００１４】
【表１】
表中の数字：陽性検体数／試験検体数
表１の結果から明らかなように、喀痰細胞診にとって特に重要な肺扁平上皮癌細胞に対して高い反応性を示すヒトモノクローナル抗体が多数得られた。また、他の組織型の肺癌についても高率に反応するヒトモノクローナル抗体が得られた。特に、ＡＥ−６抗体は癌組織検体の７８％と反応することが判る。
【００１６】
〔実施例３〕
ヒトモノクローナル抗体ＡＥ−６の癌組織スタンプ標本との反応性を調べた。癌組織スタンプ標本は、肺癌手術の際、切除した癌組織をスライドグラス上に捺印することにより調整した。
【００１７】
【表２】
表２に示したように、ＡＥ−６抗体は、肺扁平上皮癌及び肺腺癌のスタンプ標本とも高率に反応した。
【００１９】
〔実施例４〕
ヒトモノクローナル抗体ＡＥ−６の喀痰との反応性を調べた。癌患者の喀痰を用い、本発明の抗体による染色判定結果と、従来法であるパパニコロウ染色法で判定した結果との比較を行った。
【００２０】
【表３】
表中の数字：癌細胞の検出された症例数／試験症例数
従来法（パパニコロウ染色）により、癌細胞が検出された症例については、本発明の喀痰細胞診法でも全て癌細胞が検出されており、本発明の喀痰細胞診法は、癌細胞の検出能力で従来法と同等となり、簡便さ、大量検体処理能力等の利点を考え合わせると、従来法より優れていると考えられる。
【００２２】
〔実施例５〕
ＡＥ−６モノクローナル抗体が認識する分子量３１ｋＤａの抗原物質の特定
ハイブリドーマＡＥ−６が産生するモノクローナル抗体の認識抗原を明らかにするために、該抗体が反応する肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞中の抗原検索を行った。Ａ５４９細胞を１０％ＦＣＳを含むＥＲＤＦ培地で培養後、その細胞を集め凍結して保存した。氷冷下、この細胞を等量（ｖ／ｗ）の１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と１ｍＭα−トルエンスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水中で超音波破砕し、１０、０００Ｘｇにて２０分間遠心分離して、上清を得た。この上清を還元条件下ＳＤＳ−ゲル電気泳動後、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写しＡＥ−６モノクローナル抗体を反応させた。その後ＰＶＤＦ膜をペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＭ抗体溶液に浸し、洗浄後ＤＡＢにて発色を行った。その結果、３１ｋＤａと４０ｋＤａの位置に発色したバンドが検出された。平行して行ったＡＥ−６抗体固定化カラムクロマトグラフィーにて特に強い結合力を示した、３１ｋＤａの蛋白質につき、更にその同定を行った。
【００２３】
Ａ５４９細胞を前記のごとく超音波破砕し、遠心分離した上清を更に１００、０００Ｘｇで６０分間超遠心分離を行い、上清を得た。この上清を１５０ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５にて平衡化したスーパーデックス７５カラムで流速２．２ｍｌ／ｍｉｎの流速にてクロマトグラフィーを行い、得られた各画分をＡＥ−６モノクローナル抗体を用いたイムノブロッチングで分析して、３１ｋＤａの抗原を含む画分を集めた。この画分を２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液，ｐＨ７．８で平衡化したモノＱカラムクロマトグラフィーにチャージし、流速１ｍｌ／ｍｉｎで１Ｍ ＮａＣｌまでの濃度勾配溶出を行ない、還元条件下ＳＤＳ−ゲル電気泳動後、最終的に３１ｋＤａの蛋白質を単離した。この蛋白質のアミノ酸配列を決定してその同定を行おうとしたがＮ−末端がブロックされていたため、臭化シアン開裂を行い、その断片を還元状態下ＳＤＳ−ゲル電気泳動後ＰＶＤＦ膜へ転写し、アミノ酸配列を調べた。その結果、既に述べたアミノ酸配列を得た。このアミノ酸配列は、前述のごとく１４−３−３蛋白質及び細胞質ホスフォリパーゼＡ２のアミノ酸配列と良く一致し、１４−３−３蛋白質ファミリーに属する９種類の蛋白質に於いて、Ｎ末端から２７番目乃至３６番目の位置に存在することが知られている（Ｍａｒｔｉｎ等、ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．，３３１（１９９３）２９６）。１４−３−３蛋白質は真核細胞生物間で進化論的にその構造が良く保存された蛋白質であり、特に脳中に高濃度で存在していることも知られている（Ａｉｔｋｅｎ等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１７（１９９２）４９８）。
そこで１４−３−３蛋白質の精製方法（Ｇｒａｓｓｏ等、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１２４（１９７７）４９７）に従って、牛脳より１４−３−３蛋白質を精製し、還元条件下ＳＤＳゲル電気泳動して、ＰＶＤＦ膜へ転写後、ＡＥ−６モノクローナル抗体を用いて免疫染色を行った。その結果、牛脳由来１４−３−３蛋白質はＡ５４９細胞由来の抗原物質と同様にＡＥ−６モノクローナル抗体とよく反応することが検証された（図１）。
【００２４】
〔実施例６〕
レコンビナント細胞質由来ホスフォリパーゼＡ２の発現とそのＡＥ−６モノクローナル抗体との反応
アミノ酸配列より特定された蛋白質、即ち１４−３−３蛋白質及びそのファミリー蛋白質とされている細胞質ホスフォリパーゼＡ２が、確かにＡＥ−６モノクローナル抗体と反応することを更に検証するためＡ５４９細胞よりチオシアン酸グアニジン・ＣｓＣｌ法（Ｇｌｉｓｉｎ等：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（１９７４）２６３３）によりＲＮＡを抽出し、１４−３−３蛋白質ファミリーにてよく保存されている塩基配列のプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて６６６塩基対のｃＤＮＡを得た。ＤＮＡ配列を検証したところ、このｃＤＮＡはＺｕｐａｎ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１９９２）８７０７）の報告した細胞質ホスフォリパーゼＡ２と完全に一致した。プライマーに工夫を加えることにより同様の方法にて７５４塩基対の完全な長さの細胞質ホスフォリパーゼＡ２のｃＤＮＡを得ることが出来たので、該遺伝子を哺乳動物細胞発現ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６に挿入し猿由来のＣＯＳ細胞に遺伝子導入し培養を行った。得られたＣＯＳ細胞を破壊し、上清を還元条件下ＳＤＳゲル電気泳動後、ニトロセルロース膜に転写し、ＡＥ−６抗体を用いて二抗体法による免疫染色を行った。図２に示すように発現された細胞質ホスフォリパーゼＡ２が３１ｋＤａの位置で、ＡＥ−６モノクローナル抗体と反応することが明らかとなり、１４−３−３蛋白質ファミリーがＡＥ−６モノクローナル抗体の抗原であることが確認された。
【００２５】
〔実施例７〕
癌及び正常細胞における１４−３−３蛋白質ファミリーｍＲＮＡの発現
癌及び正常細胞における１４−３−３蛋白質ファミリーのｍＲＮＡの発現を検証するために、７５４塩基対の細胞質ホスフォリパーゼＡ２ｃＤＮＡをもとにランダムプライミング法（Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ 等，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２） により３２Ｐ標識プローブを作製した。種々の細胞株よりチオシアン酸グアニジン・ＣｓＣｌ法にてＲＮＡを抽出、アガロースゲル電気泳動を行い、ＲＮＡを分離した後ナイロン膜へ転写した。この膜上のＲＮＡを３２Ｐでラベルした細胞質ホスフォリパーゼＡ２に対するプローブとハイブリダイズし、オートラジオグラフィーを行った（図３）。その結果Ａ５４９肺腺癌細胞株、ＭＣＦ−７乳癌細胞株、ＭＫＮ−４５胃癌細胞株、Ｈｕｈ−６肝癌細胞株から得られたｍＲＮＡにては、細胞質ホスフォリパーゼＡ２のｍＲＮＡが著しく発現されているのに対し、正常肺繊維芽細胞であるＦｌｏｗ２０００細胞では殆ど発現されていなかった。この結果は、ヒト組織中の１４−３−３蛋白質ファミリーのｍＲＮＡを測定することにより癌の診断が可能であることを示すものである。
【００２６】
〔実施例８〕
各種癌組織及び正常組織中のＡＥ−６モノクローナル抗体と反応する分子量３１ｋＤａの抗原量の比較
低温下、凍結した肺癌、正常肺及び肝臓の各組織を裁断後、組織重量当たり３倍容量の１ｍＭ ＥＤＴＡと１ｍＭ ＰＭＳＦを含むリン酸緩衝化生理食塩水を加えてホモゲナイズし、１０、０００ｘｇにて遠心分離して上清を得た。各組織の上清を還元条件下でＳＤＳ−ゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜へ転写してイムノブロッチング法により各臓器中に含まれる抗原量を比較した。即ち、ＰＶＤＦ膜にＡＥ−６モノクローナル抗体を反応後、ペルオキシダーゼを標識した抗ヒトＩｇＭ抗体と反応し、ＤＡＢを基質として用い発色を行った。その結果、ＡＥ−６モノクローナル抗体によって認識される３１ｋＤａ抗原は、正常な肺及び肝臓組織では極めて少量しか検出されないが、肺癌組織では著しくその量が増加していた（図４）。この結果は実施例７の結果とともに、ＡＥ−６モノクローナル抗体を用いるヒト肺癌の免疫学的な診断及び治療の可能性に根拠を与えるものである。
【００２７】
〔実施例９〕
１４−３−３蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体の癌組織への反応性
牛脳より作製した１４−３−３蛋白質を免疫原として用い、常法に従いマウスモノクローナル抗体を作製した。得られたマウスモノクローナル抗体の肺癌及び正常組織との反応性を二抗体法にて検証した。外科切除後ホルマリン固定しパラフィン包埋した組織切片を用いて、マウスモノクローナル抗体による免疫染色を実施例２と同様に行った。その結果、表４に示すごとく肺癌組織検体の全てが該抗体により特異的に染色され、該マウスモノクローナル抗体の肺癌診断における有用性が示された。
【００２８】
【表４】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体及びｍＲＮＡを使用することによって、肺癌、特に扁平上皮癌を喀痰細胞診等により簡便かつ客観的に検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】牛脳由来１４−３−３蛋白質とＡＥ−６モノクローナル抗体との反応を示す電気泳動の写真である。
レーン１： プレステインバイオラッド社製分子量マーカー（低分子）
レーン２： Ａ５４９肺腺癌細胞由来３１ｋＤａ蛋白質
レーン３： 牛脳由来１４─３─３蛋白質
【図２】細胞質ホスフォリパーゼＡ２とＡＥ−６モノクローナル抗体との反応を示す電気泳動の写真である。
レーン１： 遺伝子未導入ＣＯＳ細胞破砕物
レーン２： Ａ５４９細胞由来３１ｋＤａ蛋白質
レーン３： レコンビナント細胞質ホスフォリパーゼＡ２遺伝子導入ＣＯＳ細胞破砕物
【図３】細胞質ホスフォリパーゼＡ２のｍＲＮＡの発現を示すオートラジオグラフィの写真である。
レーン１： Ａ５４９肺腺癌細胞株由来ＲＮＡ
レーン２： ＭＣＦ−７乳癌細胞株由来ＲＮＡ
レーン３： ＭＫＮ−４５胃癌細胞株由来ＲＮＡ
レーン４： Ｈｕｈ−６肝臓癌細胞株由来ＲＮＡ
レーン５： Ｆｌｏｗ２０００正常肺繊維芽細胞株由来ＲＮＡ
【図４】分子量３１ＫＤａの抗原蛋白質とＡＥ−６モノクローナル抗体との反応を示す電気泳動の写真である。
レーン１： 牛脳由来１４─３─３蛋白質
レーン２： 扁平上皮癌組織
レーン３： 肺癌組織
レーン４： 正常肺組織
レーン５： 肺癌組織
レーン６： 正常肺組織
レーン７： 正常肝臓組織
Claims (5)
- (a) 分子量３１ｋＤａの牛脳由来１４−３−３蛋白質又は細胞質ホスフォリパーゼＡ２を抗原として認識し、(b) ヒト肺癌細胞株、ヒト肺癌組織及び喀痰中のヒト肺癌細胞と反応し、(c) ヒト正常細胞と反応せず、(d) 免疫グロブリンクラスがＩｇＭであることを特徴とする、ヒトモノクローナル抗体。
- ハイブリドーマＡＥ−６（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９８１号）由来である、請求項１記載のヒトモノクローナル抗体。
- 請求項１又は２記載のヒトモノクローナル抗体を有効成分として含有するヒト肺癌細胞診用試薬。
- 請求項３記載の試薬を用いたヒト肺癌検査方法。
- 細胞質ホスフォリパーゼＡ２をコードするｍＲＮＡを測定することから成るヒト肺癌検査方法。
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