DE60033603T2

DE60033603T2 - Secretorischer Rezeptor für das thyroid-stimulierenden Hormon (TSHR), und Verfahren zum Nachweis des anti-TSHR Antikörpers

Info

Publication number: DE60033603T2
Application number: DE60033603T
Authority: DE
Inventors: Yoshiyuki Kyoto-shi Hattori; Takashi Kyoto-shi Akamizu
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1999-08-24
Filing date: 2000-08-23
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2020-08-24
Also published as: EP1078986B1; DE60033603D1; US6933364B1; EP1078986A2; EP1078986A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen rekombinanten, löslichen humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon (hiernach als "sTSHR" bezeichnet), welcher sekretorisch ist bzw. sekretiert (abgesondert) wird und Reaktivität mit einem Autoantikörper gegen den humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon hat; ein Verfahren zur Herstellung von sTSHR, umfassend die Infektion einer Insektenzelle, insbesondere Hi-five-Zellen, mit einem rekombinanten Baculovirus, hergestellt durch Einfügen eines für den sTSHR kodierenden Gens und Kultivierung der infizierten Zellen; ein Reagenz für die Untersuchung eines Antikörpers gegen den humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon, wie etwa einen Autoantikörper, unter Verwendung von sTSHR; und ein Verfahren zur Messung eines Antikörpers gegen den humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon, wie etwa ein Autoantikörper, unter Verwendung von sTSHR.
2. Kurze Beschreibung des Stands der Technik
Ein humaner Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon (hiernach als "TSHR" bezeichnet) ist ein Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon (hiernach als "TSH" bezeichnet), welches auf der Schilddrüsenmembran vorhanden ist. Wenn das von der Hirnanhangdrüse (Hypophyse) abgesonderte TSH an den TSHR auf der Schilddrüsenfollikelzellmebran bindet, sondert die Schilddrüse T3 und T4 mit metabolischen Funktionen ab. Der TSHR ist ein Rezeptor mit sieben transmembranen Bereichen mit einer relativen Molekülmasse von etwa 95.000 bis 100.000.
Die Basedow-Krankheit (Graves' Disease) ist eine Hyperthyreose (Hyperthyroidismus), die durch die Beschleunigung der Bildung und Sekretion von Schilddrüsenhormonen induziert wird. Als ihre Ursache kann die Anwesenheit einer stimulativen Substanz, welche die Sekretion von Schilddrüsenhormonen in Patientenserum beschleunigt, aufgezählt werden. Es ist aus den bisherigen Studien bekannt, dass ein Autoantikörper für den TSHR in dem Patientenserum vorhanden ist und die Hyperthyreose durch Aktivierung eines Rezeptors für das thyroideastimulierende Hormon induziert. Folglich hat die Messung des Autoantikörpers für den TSHR eine beachtliche Signifikanz bei der Durchführung der klinischen Diagnose.
Die Messung eines Anti-TSHR Autoantikörpers wurde bisher durch das von Smith entwickelte Verfahren (Endocr. Rev. 9: 106-120 (1988)) durchgeführt. In diesem Verfahren wird der Anti-TSHR Autoantikörper unter Verwendung einer porcinen (vom Schwein stammenden) Schilddrüsenmembranfraktion als die TSHR-Quelle und durch gegenseitiges Konkurrieren von ¹²⁵I-markiertem bovinen (vom Rind stammendem) TSH und eines Anti-TSHR-Autoantikörper in Patientenserum miteinander als die TSHR-Quelle gemessen.
Da jedoch in dem herkömmlichen Verfahren eine Kreuzreaktion, nämlich die Bindung von porcinem TSHR an einen Autoantikörper gegen humanes TSHR in humanem Serum untersucht wird, gibt es die Möglichkeit, dass die Untersuchungsergebnisse die Bindung des ursprünglich im lebenden Körpers gebildeten humanen TSHR an den Autoantikörper gegen humanen TSHR im humanem Serum nicht richtig widerspiegeln. Da ebenfalls Sequenzen von Aminosäureresten des humanen TSHR und des poreinen TSHR tatsächlich unterschiedlich voneinander sind, wird erwartet, dass die Ergebnisse des herkömmlichen Verfahrens mit der Bindung des Autoantikörpers gegen den humanen TSHR nicht übereinstimmen. Zusätzlich zu diesen Problemen gibt es ein weiteres Problem, dass es schwierig ist, die porcine Schilddrüsenmembranfraktion herzustellen, die als die THSR-Quelle in einer großen Menge verwendet wird.
Natürlich ist es bevorzugt, den humanen TSHR für die Messung eines Antikörpers für humanen TSHR zu verwenden. Da es jedoch in der Wirklichkeit unmöglich ist natürlichen TSHR vom Menschen zu erhalten, wurden Versuche unternommen, es durch genetische Rekombinationstechniken herzustellen. Insbesondere ist es zur Reinigung von TSHR durch seine Expression in einer großen Menge wichtig, einen TSHR zu erzeugen, welcher Reaktivität mit einem gegen humanen TSHR gerichteten Antikörper hat und sekretiert wird.
Der TSHR ist ein Rezeptor mit sieben transmembranen Bereichen (Siebentransmembran-Rezeptor) und seine erste N-terminale extrazelluläre Domäne nimmt den Hauptteil des TSHR ein, so dass angenommen wird, dass die Bindungsregion für einen Autoantikörper gegen humanen TSHR in diesem Bereich vorhanden ist. Obwohl bisher durch eine Vielzahl von Forschungsgruppen Versuche unternommen wurden, löslichen TSHR, das durch die erste N-terminale extrazelluläre Domäne von TSHR in einer großen Menge unter Verwendung von Insektenzellen oder tierischen Zellen gebildet wird zu exprimieren, reicherte sich der exprimierte lösliche TSHR in jedem Fall als unlösliches Protein innerhalb der Zellen an, ohne erfolgreich eine extrazelluläre Sekretion zu bewirken und eine große Menge des löslichen TSHR zu reinigen. (Journal of Molecular Endocrinology, 10: 127-142 (1993)); Endocrinology, 138: 1658-1666 (1997); The Journal of Biological Chemistry, 270: 1543-1549 (1995) Journal of Immunology, 158; 2798-2804 (1997); Molecular and Cellular Endocrinology, 147: 133-142 (1999); Endocrinology, 138: 1559-1566 (1997); Autoimmunity, 14: 315-320 (1993). Zusätzlich wurde berichtet, dass der lösliche TSHR keine Affinität für TSH hat und nur eine schwache Reaktivität mit einem im Serum von Patienten mit der Basedow-Krankheit vorhandenen Anti-TSHR-Antikörper zeigt.
Es wurde berichtet, dass ein löslicher TSHR (aa1-309), in welchem 106 Aminosäurereste von der extrazellulären Domäne des C-Terminus von TSHR entfernt waren, in den extrazellulären Teil von CHO-Zellen abgesondert wurde (The Journal of Biological Chemistry, 272: 18959-18965 (1997)). Jedoch hat dieser lösliche TSHR mit deletiertem C-Terminus keine Affinität für TSH und es wird angenommen, dass das Epitop eines Anti-TSHR-Antikörpers aus Patienten mit Basedow-Krankheit ebenfalls in dem deletierten Bereich ist, so dass er nicht bei der Messung von Anti-TSHR-Autoantikörpern verwendet werden kann.
RAPOPORT B. et al, Endocrine Reviews 19(6); (1998): Seiten 673-716 ist auf die Interaktionen des TSH-Rezeptors mit TSH und mit Autoantikörpern gerichtet.
KOSUGI S. et al; Molecular and Cellular Endocrinology 128; (1997), Seiten 11-18 beschreibt eine Epitopanalyse von TSHR.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind, einen rekombinanten löslichen humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon (sTSHR), welcher sekretiert wird und eine Reaktivität mit einem Autoanitkörper in den humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon hat; ein Verfahren zur Herstellung von sTSHR, ein Reagenz unter Verwendung von sTSHR und ein Messungsverfahren, welches sTSHR verwendet, zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgaben und andere werden durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt, welche sich auf einen rekombinanten, löslichen humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon definiert gemäß Anspruch 1, eine Zusammensetzung definiert gemäß Anspruch 9, ein Verfahren, definiert gemäß Anspruch 10 und ein Verfahren definiert gemäß Anspruch 11 bezieht. Bevorzugte Ausführungsformen werden gemäß der abhängigen Ansprüche definiert.
KURZE ERLÄUTERUNGEN DER ZEICHNUNGEN
Die 1 zeigt schematisch Strukturen des sTSHR (6 Sorten) der vorliegenden Erfindung, die in den Beispielen exprimiert werden. Der sTSHR enthält die, in welchem 6 Histidinreste an den C-Terminus der Aminosäurereste (vom 1. bis zum 410. Aminosäurerest vom N-Terminus) eines extrazellulären Domänenteils des natürlichen TSHR (SEQ ID NO: 5 und 20) hinzugefügt sind, in welchem ein Teil der Aminosäurereste vom 338. bis zum 366. Aminosäurerest vom N-Terminus des TSHR deletiert sind (SEQ ID NO: 11 und 22), in welchem jeder Aminosäurerest in einem Aminosäurerestteil vom 352. bis zum 356. Aminosäurerest vom N-Terminus (ein Teil mit Tyrosin-Tyrosin-Valin-Phenylalanin-Phenylalanin) des natürlichen TSHR durch Alanin substituiert ist (SEQ ID NO: 8 und 21), in welchem 6 Histidinreste an den C-Terminus der Aminosäurereste (vom 1. bis zum 415. Aminosäurerest vom N-Terminus) des extrazellulären Domänenteils des natürlichen TSHR hinzugefügt sind (SEQ ID NO: 13 und 23), in welchem 42 Aminosäurereste mit der Signalsequenz des Baculovirus gp 67-Protein, die durch 38 Aminosäurereste gebildet wird, an den N-Terminus und 6 Histidinreste an den C-Terminus der Aminosäurereste (vom 21. bis zum 410.
Aminosäurerest vom N-Terminus) eines extrazellulären Domänenteils des natürlichen TSHR hinzugefügt sind (SEQ ID NO: 17 und 24), und welchem 42 Aminosäurereste mit der Signalsequenz des Baculovirus gp 67-Proteins, die durch 38 Aminosäurereste gebildet wird, an den N-Terminus und 6 Histidinreste zu dem C-Terminus der Aminosäurereste (vom 21. bis zum 415. Aminosäurerest vom N-Terminus) eines extrazellulären Domänenteils des natürlichen TSHR hinzugefügt sind (SEQ ID NO: 8 und 25).
Die 2 zeigt ein Ergebnis des Nachweises der sTSHR-Expression in einer Kulturüberstandfraktion (M) und einer Zellextraktfraktion (C) einer Insektenzelle, die mit einem rekombinanten Virus infiziert ist, in welchem cDNR eingefügt wurde, die für jede der 6 in der 1 gezeigten Sorten von sTSHR kodiert, durchgeführt durch Western-Blotting (das Western-Blot-Verfahren) unter Verwendung eines Anti-His₆-Antikörpers.
Die 3 zeigt ein Ergebnis des Nachweises jeder 4 Sorten von sTSHR-Proteinen, die aus einer Kulturüberstandfraktion (M) und einer Zellextraktfraktion (C) durch Metallaffinitätschromatographie gereinigt wurden, durchgeführt durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-His₆-Antikörpers.
Die 4 zeigt ein Ergebnis des Nachweises des sTSHR-Proteins, das aus einer Kulturüberstandfraktion (B) und einer Zellextraktfraktion (A) unter Verwendung einer ConA-Säule oder einer Lentil-Lectin-Säule gereinigt wurde, durchgeführt durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-His₆-Antikörpers.
Die 5 zeigt ein Ergebnis, in welchem ein sTSHR-Protein mit der Signalsequenz vom humanem TSHR, das aus einer Kulturüberstandfraktion (A) und einer Zellextraktion (B) gereinigt wurde, und ein sTSHR-Protein mit der Signalsequenz des Baculovirus gp 67-Protein, das aus einer Kulturüberstandfraktion (c) einer Zellextraktfraktion (D) durch Metallaffinitätschromatographie gereinigt wurde, mit verschiedenen Enzymen verdaut und dann durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-His₆-Antikörpers nachgewiesen wurde.
Die 6 zeigt ein Ergebnis (A), in welchem Insektenzellen, die mit einem Glycosidase-Inhibitor dMM oder SW behandelt wurden, mit einem rekombinanten Virus infiziert und die Kulturüberstände nach 3 Tagen nach der Infektion für den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit der sTSHR-Sekretion in den Kulturüberstand durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-His₆-Antikörpers verwendet wurden, und ein Ergebnis (B), in welchem der gewonnene Kulturüberstand (Medium) durch Metallaffinitätschromatographie gereinigt, mit Endo H zuckerverdaut und dann durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-His6-Antikörpers nachgewiesen wurde.
Die 7 zeigt ein Ergebnis von Experimenten ob die TBII-Aktivität in Seren von Patienten mit der Basedow-Krankheit oder Hypothyreose (Hypothyroidismus) durch Reaktionen der Seren mit sTSHR gehemmt werden kann, oder nicht. A1 bis A6 entsprechen den Seren von Patienten mit TSAb-Aktivität und B1 bis B6 entsprechen Seren mit Patienten mit TSBAb-Aktivität.
Die 8 zeigt ein Ergebnis der Experimente, ob die TSAb-Aktivität durch vorherige Reaktion der Seren aus Patienten mit der Basedow-Krankheit mit TSAb-Aktivität mit sTSHR absorbiert werden kann, oder nicht.
Die 9 zeigt ein Ergebnis der Untersuchung ob die TSBAb-Aktivität durch vorhergehende Reaktion von Seren von Patienten mit Hypothyreose mit TSBAb-Aktivität mit sTSHR absorbiert werden kann, oder nicht.
Die 10 zeigt ein Ergebnis der Reaktion von Seren aus Patienten mit der Basedow-Krankheit oder Patienten mit Hypothyreose oder Seren von gesunden Personen in einem Fall (+) in welchem sTSHR, gereinigt durch Metallaffinitätschromatographie aus einer Kulturüberstandfraktion, auf einer Nickel-immobilisierten Platte mit 96 Vertiefungen durch Chelatbindung immobilisiert wurde, oder einen anderen Fall (-), in welchem eine krude Reinigungsfraktion von sTSHR nicht immobilisiert war.
Die 11 ist eine graphische Darstellung (Chromatogramm), die die Bindungsfähigkeit von sTSHR an TSH zeigt, wobei sie ein Ergebnis des sTSHR der Nr. 5 in 1, enthalten in einer Kulturüberstandsfraktion, zeigt. In der Zeichnung zeigen die offenen Quadrate ein Ergebnis an, wenn ¹²⁵I-TSH abgetrennt wurde, die schwarzen Kreise zeigen ein Ergebnis an, wenn eine gemischte Lösung aus ¹²⁵I-TSH und sTSHR aufgetrennt wurde, und die offenen Kreise zeigen ein Ergebnis an, wenn eine gemischte Lösung aus ¹²⁵I-TSH, sTSHR und bTSH aufgetrennt wurde.
Die 12 ist eine graphische Darstellung (Chromatogramm), die die Bindungsfähigkeit von sTSHR an TSH zeigt, wobei sie ein Ergebnis des sTSHR Nr. 5 in der 1, enthalten in einer Zellextraktfraktion, zeigt. In der Zeichnung zeigen offene Quadrate ein Ergebnis an, wenn ¹²⁵I-TSH aufgetrennt wurde, die schwarzen Kreise zeigen ein Ergebnis an, wenn eine gemischte Lösung aus ¹²⁵I-TSH und sTSHR aufgetrennt wurde, und die offenen Kreise zeigen ein Ergebnis an, wenn eine gemischte Lösung aus ¹²⁵I-TSH, sTSHR und bTSH aufgetrennt wurde.
Die 13 ist eine graphische Darstellung (Chromatogramm), die die Bindungsfähigkeit von sTSHR an TSH zeigt, wobei sie ein Ergebnis des sTSHR Nr. 6 in der 1, enthalten in einer Kulturüberstandfraktion, zeigt. In der Zeichnung zeigen offene Quadrate ein Ergebnis an, wenn ¹²⁵I-TSH aufgetrennt wurde, die schwarzen Kreise zeigen ein Ergebnis an, wenn eine gemischte Lösung aus ¹²⁵I-TSH und sTSHR aufgetrennt wurde, und die offenen Kreise zeigen ein Ergebnis an, wenn eine gemischte Lösung aus ¹²⁵I-TSH, sTSHR und bTSH aufgetrennt wurde.
Die 14 ist eine graphische Darstellung (Chromatogramm), die die Bindungsfähigkeit von sTSHR an TSH zeigt, wobei sie ein Ergebnis des sTSHR Nr. 6 in der 1, enthalten in einer Kulturüberstandfraktion, zeigt. In der Zeichnung zeigen offene Quadrate ein Ergebnis an, wenn ¹²⁵I-TSH aufgetrennt wurde, die schwarzen Kreise zeigen ein Ergebnis an, wenn eine gemischte Lösung aus ¹²⁵I-TSH und sTSHR aufgetrennt wurde, und die offenen Kreise zeigen ein Ergebnis an, wenn eine gemischte Lösung aus ¹²⁵I-TSH, sTSHR und bTSH aufgetrennt wurde.
Die 15 ist eine graphische Darstellung (Chromatogramm), die die Bindungsfähigkeit von sTSHR an TSH zeigt, wobei sie ein Ergebnis des sTSHR Nr. 4 in der 1, enthalten in einer Kulturüberstandsfraktion, zeigt. In der Zeichnung zeigen offene Quadrate ein Ergebnis an, wenn ¹²⁵I-TSH aufgetrennt wurde, die schwarzen Kreise zeigen ein Ergebnis an, wenn eine gemischte Lösung aus ¹²⁵I-TSH und sTSHR aufgetrennt wurde, und die offenen Kreise zeigen ein Ergebnis an, wenn eine gemischte Lösung aus ¹²⁵I-TSH, sTSHR und bTSH aufgetrennt wurde.
Die 16 ist eine graphische Darstellung (Chromatogramm), die die Bindungsfähigkeit von sTSHR an TSH zeigt, wobei sie ein Ergebnis des sTSHR Nr. 4 in der 1, enthalten in einer Kulturüberstandsfraktion, zeigt. In der Zeichnung zeigen offene Quadrate ein Ergebnis an, wenn ¹²⁵I-TSH aufgetrennt wurde, die schwarzen Kreise zeigen ein Ergebnis an, wenn eine gemischte Lösung aus ¹²⁵I-TSH und sTSHR aufgetrennt wurde, und die offenen Kreise zeigen ein Ergebnis an, wenn eine gemischte Lösung aus ¹²⁵I-TSH, sTSHR und bTSH aufgetrennt wurde.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
1. sTSHR
Der sTSHR der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung von genetischen Rekombinationstechniken hergestellt werden. Von diesen Techniken kann das Baculovirus-Insektenzellenexpressionssystem als ein besonders bevorzugtes Expressionssystem als ein Beispiel angegeben werden. Der sTSHR, der seinen hoch geordnete Struktur behält, kann in einer großen Menge durch Herstellung eines rekombinanten Baculovirus erhalten werden, in welchem ein Gen, das für den sTSHR kodiert, stromabwärts eines starken Baculoviruspromotors eingefügt wird, und Insektenzellen mit dem auf diese Weise präparierten Virus infiziert werden. Da die Baculovirus-DNA eine Größe von etwa 130 kDa hat, ist es schwierig, das sTSHR-Gen direkt einzufügen. Demgemäß ist es bei der Herstellung des sTSHR der vorliegenden Erfindung bevorzugt, ein rekombinantes Baculovirus durch Einfügen des interessierenden Gens in einen Transfervektor zu erhalten, welcher eine homologe Rekombination mit der Baculovirus-DNA induzieren kann, und dann eine Cotransfektion des Vektors zusammen mit der Baculovirus-DNA in eine Insektenzelle durchzuführen, um eine homologe Rekombination und die Bildung von rekombinanter Baculovirus-DNA in der Insektenzelle zu induzieren.
Die Gen-(DNA)-Sequenz, die für den TSHR codiert, wurde bereits beschrieben und ist allgemein bekannt (z. B. BBRC, 165: 1184 (19989)). Folglich kann, auf der Grundlage eines derartigen Berichts, der Transfervektor durch Herstellung einer DNA-Sequenz aufgebaut werden, die für seinen extrazellulären Domänenrest kodiert und dann Einfügen davon stromabwärts eines starken Baculoviruspromotors, wie etwa des Polyhedrinpromotors oder Ähnliche.
Als der extrazelluläre Domänenrest von TSHR können 415 Aminosäurereste vom 1. bis zum 415. Aminosäurerest vom N-Terminus und 410 Aminosäurereste vom 1. bis zum 410. Aminosäurerest vom N-Terminus beispielhaft angegeben werden. Hierbei ist eine Sequenz vom 1. bis zum 20. Aminosäurerest vom N-Terminus, eine sogenannte Signalsequenz, im sTSHR vorhanden. Erfindungsgemäß hat der schließlich hergestellte sTSHR diese Signalsequenz nicht, aber wenn der Vektor oder Ähnliche konstruiert werden, wird eine Nucleotidsequenz hinzugefügt, die die Sequenz vom 1. bis zum 20. Aminosäurerest vom N-Terminus im natürlichen TSHR kodiert. Ebenfalls kann die Sequenz eine Signalsequenz des Baculovirus oder einer Insektenzelle kodieren. Zum Beispiel kann eine Signalsequenz bestehend aus 38 Aminosäureresten eines Hüllproteins (Membranproteins), gp 67, des Baculovirus als die Baculovirus-Signalsequenz verwendet werden. Erfindungsgemäß ist es bevorzugt eine derartige Baculovirussignalsequenz zu verwenden, wenn Hi-five-Zellen bevorzugt als die Insektenzellen für die Herstellung von sTSHR verwendet werden.
Der sTSHR der vorliegenden Erfindung kann in einem Aminosäurerestteil vom 338. bis zum 366. Aminosäurerest vom N-Terminus und/oder in einem Aminosäurerestteil vom 352. bis zum 356. Aminosäurerest vom N-Terminus im Vergleich mit der natürlichen Sequenz einer Mutation unterzogen werden, wie etwa einer Deletion, einer Substitution, einer Insertion oder einer Addition, solange er sekretorisch ist und eine Reaktivität mit einem Autoantikörper gegen den humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon hat. Speziell kann ein sTSHR beispielsweise angegeben werden, in welchem ein Aminosäurerestteil vom 338. bis zum 366. Aminosäurerest deletiert ist, oder in welchem alle Aminosäurereste vom 352. bis zum 356. Aminosäurerest vom N-Terminus durch Alanin substituiert sind.
Zusätzlich zu diesen Mutationen kann eine Mutation, in welchem ein Gen, das sechs Histidinreste kodiert, in die 3'-Seite des Codons eingefügt ist, das die Aminosäurereste von der 410. bis zur 415. Aminosäure kodiert, in dem sTSHR der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Die sechs Histidinreste sind nützlich, wenn eine Reinigung des sTSHR durch Metallchelataffinitätschromatographie oder ein Nachweis von sTSHR unter Verwendung eines Anti-His6-Antikörpers durchgeführt wird.
Um den extrazellulären Domänenteil alleine zu exprimieren wird ein Stoppcodon z. B. in der 3'-Seite eines Codons eingefügt, dass den 410. Aminosäurerest vom N-Terminus von TSHR kodiert, oder, wenn das für sechs Histidinreste kodierende Gen eingefügt wird, in der 3'-Seite des Codons, das für die sechs Histidinreste kodiert.
Die Cotransfektion der Baculovirus-DNA und des Transfervektors ist nicht besonders beschränkt und kann in Übereinstimmung mit einem herkömmlichen Verfahren, wie etwa Lipofektion oder Ähnlichem, durchgeführt werden.
Die auf diese Art hergestellte sTSHR-Expression Insektenzelle kann auf die herkömmliche Weise kultiviert werden. Speziell kann eine statische Kultur unter Verwendung eines gewöhnlichen Kulturgerätes und eine Massenkultur unter Verwendung eines gewöhnlichen Kulturgerätes als Beispiel genannt werden. In diesem Fall kann das Zellkulturgerät vom Spinnerkolbentyp oder eines vom Tanktyp sein.
In einer mit dem rekombinanten Virus infizierten Insektenzelle erreicht die Expression von sTSHR während 48 bis 72 Stunden nach der Infektion ihren Scheitelpunkt durch die Wirkung eines in dem rekombinanten Virus vorhandenen Polyhedrinpromotors. Da der sTSHR der vorliegenden Erfindung aus der Insektenzelle in den Kulturüberstand sekretiert wird, kann er erhalten werden durch Gewinnung des Kulturüberstands während 72 bis 96 Stunden nach Infektion mit dem rekombinanten Virus und unter Einsatz gewöhnlicher Proteinreinigungstechniken, wie etwa Chromatographie oder Ähnliche. Spezieller kann er unter Verwendung von Lectin-Affinitätschromatographie, mit Affinität für Zuckerketten, gereinigt werden. Ebenfalls kann, wenn ein Gen in einer derartigen Art und Weise mutiert wird, dass, wie vorher beschrieben, sechs Histidinreste an dem C-Terminus des sTSHR hinzugefügt werden, das sTSHR ebenfalls durch Metallaffinitätschromatographie unter Verwendung der sechs Histidinreste gereinigt werden.
Gewöhnliche Insektenzellen können als der Wirt für die Expression von sTSHR verwendet werden. Und von diesen können Insekten Hi-five-Zellen (z. B. Hi five cells, hergestellt von Invitrogen Katalognummer B855-02 usw.) beispielsweise als besonders bevorzugte Insektenzellen angegeben werden. Wenn Insektenzellen, wie etwa die Hi-five-Zellen, als die Wirtzzellen verwendet werden, kann eine Suspensionskultur durchgeführt werden, so dass die Möglichkeit der Kultivierung unter Verwendung eines geeigneten Geräts wirkungsvoll erreicht werden kann.
Wie später in den Beispielen gezeigt wird, ist der erfindungsgemäße sTSHR, hergestellt durch Expression eines Gens mit einer Sequenz, die die Baculovirussignalsequenz am 5'-Terminus codiert unter Verwendung von Hi-five-Zellen als Insektenzellen, ein besonders bevorzugter sTSHR, weil er sektretorisch ist und, zusätzlich zu seiner Reaktivität mit einem Anti-TSHR-Antikörper zeigt er eine hervorragende Affinität sowohl für einen Antikörper aus Patienten mit der Basedow-Krankheit (hiernach bezeichnet als "TSAb"), welche die Schilddrüse durch ihre Bindung an TSHR stimulieren, und auch einem anderen Antikörper (hiernach als "TSBAb" bezeichnet), der die Bindung zwischen TSH und TSR blockiert.
Da das sTSHR der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid ist, kann es ebenfalls durch chemische Synthese von seinen Teil-Fragmenten, entsprechend den allgemeinen Techniken bei der Herstellung von Polypeptiden, und dann Verknüpfung der Teil-Fragmente hergestellt werden.
2. Reagenz für die Untersuchung von Anti-TSHR-Antikörper unter Verwendung von sTSHR
Das erfindungsgemäße Reagenz ist z. B. ein Reagenz, das sTSHR gebunden an einen wasserunlöslichen, festen Träger enthält. Gemäß einem derartigen Reagenz kann z. B. ein Anti-TSHR-Autoantikörper in humanem Serum durch Bindung davon an einen festen Träger über sTSHR und dann Verwendung eines markierten Antikörpers für humanes Immunglobulin gemessen werden.
Beispiele des verwendbaren festen Trägers enthalten plattenförmige Materialien, wie etwa Mikrotiterplatten und Ähnliche, und perlenförmige Träger aus Kunststoffen, wie etwa Polystyrol, Polypropylen und Ähnliche, und von anorganischen Substanzen, wie etwa Metallperlen und Ähnliche.
Beispiele des Verfahrens zur Bindung des sTSHR an einen festen Träger enthalten ein Verfahren, in welchem der sTSHR physikalisch durch in Kontakt bringen mit einem festen Träger absorbiert wird (direktes Beschichtungsverfahren), und ein Verfahren, in welchem er über einen Anti-TSHR-Antikörper gebunden wird. Ebenfalls kann, in dem Fall von sTSHR, in welchem, wie vorher beschrieben, sechs Histidinreste an seinen C-Terminus hinzugefügt sind, ein Verfahren verwendet werden, in welchem er unter Verwendung eines mit einer Metallbeschichtung behandelten festen Trägers mit den Histidinresten chelatgebunden wird, oder ein Verfahren, in welchem er über einen Anti-His₆-Antikörper für die Histidinreste gebunden wird, kann ebenfalls verwendet werden.
In einem Beispiel des direkten Beschichtungsverfahrens oder des Chelatbindungsverfahrens werden etwa 100 μl einer sTSHR-Lösung mit einer Proteinkonzentration von etwa 10 μg/ml mit einem festen Träger in Kontakt gebracht und dann über Nacht still stehen gelassen. Ebenfalls wird in einem Beispiel des Verfahrens, in welchem die Verbindung über einen Anti-THSR-Antikörper oder einen Anti-His₆-Antikörper erfolgt, der Anti-TSHR-Antikörper oder der Anti-His₆-Antikörper in einer PBS-Lösung gelöst, um eine Konzentration von etwa 2 μg/ml zu ergeben, 100 μl der Lösung werden mit einem festen Träger in Kontakt gebracht und über Nacht still stehen gelassen, und dann werden 100 μl einer sTSHR-Lösung mit einer Proteinkonzentration von etwa 1 mg/ml dazugegeben und etwa über Nacht still stehen gelassen.
Das Reagenz der vorliegenden Erfindung für die Verwendung bei der Messung des Antikörpers gegen den humanen thyroideastimulierenden Hormonrezeptor ist ein Reagenz, welches eine physiologische Konzentration des in einem humanen Serum enthaltenen Anti-TSHR-Autoantikörpers usw. genau und schnell messen kann. Dieses Reagenz ist nicht besonders beschränkt, solange es sTSHR enthält, und es kann ein Reagenz zur Durchführung einer kompetitiven Untersuchung oder ein Reagenz zur Durchführung einer Sandwichuntersuchung sein. Zusätzlich kann es andere Reagenzien enthalten, welche in Abhängigkeit vom Untersuchungsmodus erforderlich sind, wie etwa Waschwasser und ein Reagenz für den Markierungsnachweis. Außerdem kann das Reagenz Trägerstoffe oder Verdünnungsmittel enthalten, welche in diesem Gebiet allgemein akzeptiert werden.
Folglich erfolgt die Messung des Anti-TSHR-Antikörpers entweder gemäß einem Sandwich-Assay oder gemäß einem kompetitiven Assay durch Bindung eines Anti-TSHR-Antikörpers an einen festen Träger über den sTSHR. Wenn zum Beispiel ein Sandwich-Assay eingesetzt wird, kann er unter Verwendung eines markierten Antikörpers gegen humanes Immunglobulin durch spezifische Bindung des an einen festen Träger über den sTSHR gebundenen Antikörpers gegen humanes Immunglobulin an den Anti-TSHR-Antikörper, oder Ähnliches, und Nachweis der Markierung erfolgen. Ebenfalls kann ein markierter TSH oder ein markierter Anti-TSHR-Antikörper in dem Fall eines kompetitiven Assays verwendet werden. Wenn das markierte TSH verwendet wird, wobei das markierte TSH und der Anti-TSHR-Antikörper kompetitiv an das sTSHR binden, wird die Menge des Anti-TSHR-Antikörpers durch Nachweis des an den sTSHR gebundenen markierten TSH gemessen. In diesem Fall kann ein TSH nicht humanen Ursprungs, wie etwa bovinen Ursprungs, als das TSH verwendet werden, aber es ist besonders bevorzugt, ein humanes TSH oder ein TSH, welches immunochemisch damit identisch ist, zu verwenden, wie etwa ein rekombinantes humanes TSH. Wenn ein markierter Anti-TSHR-Antikörper verwendet wird, wird die Menge des Anti-TSHR-Antikörpers durch kompetitive Bindung des markierten Anti-TSHR-Antikörpers und des Anti-TSHR-Auotantikörpers oder Ähnlichem im Serum an den sTSHR und Nachweis des an den TSHR gebunden markierten TSH gemessen.
Beispiele der Markierung enthalten eine Markierungssubstanz, die gewöhnlich auf dem Gebiet der immunologischen Messung verwendet wird, wie etwa eine radioaktive Substanz, eine fluoreszierende Substanz, eine lumineszierende Substanz, ein Enzym, beispielsweise alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase, und Ähnliche.
3. Monoklonaler Anti-TSHR-Antikörper
Ein monoklonaler Antikörper für TSHR kann einfach durch Verwendung des erfindungsgemäßen sTSHR als das Immunogen und unter Einsatz von gewöhnlichen Screeningtechniken erhalten werden. Da der erfindungsgemäße sTSHR einen extrazellulären Domänenteil vom TSHR umfasst, ist der monoklonale Antikörper ein Antikörper, welcher ebenfalls den natürlichen, auf menschlichen Zellen exprimierten TSHR erkennen kann.
Demgemäß bieten dieser monoklonale Antikörper die Möglichkeit als ein innerer Wirkstoff für Krankheiten, in welchen TSHR eine Rolle spielt, zusätzlich zu seiner Verwendung als ein Messreagenz für den Anti-TSHR-Autoantikörper.
Die vorliegende Erfindung ist ein rekombinanter sTSHR, welcher wirkungsvoll bei der Diagnose von Autoimmunerkrankungen ist. Seine charakteristischen Punkte sind, dass er sekretorisch ist und eine Reaktivität mit einem Anti-TSHR-Autoantikörper hat. Ein derartiger rekombinanter TSHR ist nicht allgemein bekannt und wird durch die vorliegende Erfindung zum ersten Mal bereitgestellt. Da der sTSHR sekretorisch ist, kann insbesondere in dem Fall einer Fraktion, in welchem er in einen Kulturüberstand durch eine Zellkultur sekretiert wird, eine Reihe von Schritten von seiner Expression bis zur Reinigung bequem durchgeführt werden, und als ein Ergebnis weist er eine Wirkung auf, dass er leicht und in einer großen Menge hergestellt werden kann. Wenn Insektenzellen, wie etwa Hi-five-Zellen, als die Wirtzzellen besonders bevorzugt verwendet werden, kann die Massenproduktion leicht durch den Insektenzellen eigenen Effekt erzielt werden, dass unter Verwendung eines geeigneten Geräts eine Suspensionskultur durchgeführt werden kann.
Von den Mitgliedern des sTSHR der vorliegenden Erfindung erfordert ein Protein, welches wie vorher beschrieben in eine Kulturüberstandsfraktion abgesondert wird, bei seiner Gewinnung aus einem Kulturmedium keine Behandlung mit einer Protease, wie etwa Trypsin oder Ähnliche, und kann mittels Zentrifugation oder Ähnlichem gereinigt werden, welche nur eine extrem geringe Möglichkeit von Einflüssen auf den sTSHR haben. Da folglich die Zerstörung der Wirtzzellen zur Durchführung seiner Reinigung nicht notwendig ist, kann die Möglichkeit einer Kontamination mit Unreinheiten aus den Wirtzzellen verringert werden, und da das Kulturmedium für Insektenzellen keine Zugabe von Proteinbestandteilen oder Ähnlichem zum serumfreien Medium erfordert, kann die andere Wirkung der Ermöglichung einer Reinigung mit hoher Reinheit ebenfalls erzielt werden.
Zusätzlich zu dem vorhergehenden hat der erfindungsgemäße sTSHR ebenfalls eine Affinität für TSH. Im Ergebnis können verschiedene Affinitätsreinigungseinrichtungen bei seinem Reinigungsverfahren eingesetzt werden, und er kann als ein Material zur Bereitstellung eines neuartigen Reagenz für die Verwendung in der Messung von TSH und eines Anti-TSHR-Autoantikörpers eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden ausführlich beschrieben; jedoch ist sie nicht darauf beschränkt.
Beispiel 1
Isolation des sTSHR-Gens
Eine Reihe von genetischen Rekombinationstechniken in den Beispielen wurden unter Bezugnahme auf die Verfahren von Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Harbor Laboratory 1982) durchgeführt.
Zunächst wurde eine mRNA aus humanen Schilddrüsenzellen (operativ entferntes Schilddrüsengewebe) durch das Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chlorform-Extraktionsverfahren isoliert. In diesem Fall wurde Poly(A) + RNA unter Verwendung von Oligo(dT)-Cellulose (Collaborative Research Inc., Type 2) präpariert.
Die cDNR von humanen Schilddrüsenzellen wurden durch Zugabe von 5 μg Poly(A) + RNA zur einer Reaktionslösung synthetisiert, die eine reverse Transkriptase vom Moloney Murine Leukemia Virus (GIBCO-BRL, 300 Einheiten), einem RNase-Inhibitor aus der humanen Plazenta (hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries, 15 Einheiten) und einem Zufallsprimer bestehend aus 6 Basen (0,5 μg) und Durchführung der Reaktion bei 37°C für 60 Minuten synthetisiert.
Beispiel 2
Konstruktion eines Transfervektors mit eingefügter sTSHR-cDNA, die für die Aminosäurereste des N-Terminus bis zur 410. Aminosäure des natürlichen TSHR codiert:
Die cDNA, die einen extrazellulären Domänenteil von TSHR (Teil mit 410 Aminosäureresten vom 1. bis zu 410. Aminosäurerest vom N-Terminus) wurde durch PCR unter Verwendung der cDNA von humanen Schilddrüsenzellen als die Matrize amplifiziert. Ein Primer in Sinnrichtung shTSHR-1 (SEQ ID NO: 1), in welchem eine EcoRI-Erkennungssequenz (das 4. Guanin bis zu dem 9. Cytosin vom 5'-Ende in der SEQ ID NO: 1) und eine Kozak Sequenz mit drei Basen (das 10. Adenin bis zu dem 12 Cytosin vom 5'-Ende in der SEQ ID NO: 1) an das 5'-Ende eines Oligonucleotids mit 17 Basen vom Initiationscodon von TSHR fusioniert wurde, und ein Gegensinn-Primer ahTSHR-1 (SEQ ID NO: 2), in welchem eine EcoRV-Erkennungssequenz (das 4. Guanin bis zum 9. Cytosin vom 5'-Ende in der SEQ ID NO: 2) an das 5'-Ende eines Oligonucleotids fusioniert war, welches komplementär zu dem Sequenzteil bestehend aus 24 Basen stromaufwärts vom Codon entsprechend dem 410. Aminosäurrest vom N-Terminus vom TSHR war, wurden als die PCR-Primer verwendet, und die PCR erfolgte in einer Reaktionslösung mit DNA-Polymerase (Vent DNA Polymerase, Biolabs).
Hinsichtlich der Präparation von doppelsträngiger DNA, die für sechs hintereinander liegende Histidinreste (Histidin-Markierung; histidin tag) kodiert, wurden zwei Oligonucleotide (SEQ ID NO: 3 und 4) in einer derartigen Art und Weise präpariert, dass, wenn ein erstes Oligonucleotid, das den Histidin-Tag und ein Stopp-Codon kodiert, komplementär an ein zweites Oligonucleotid komplementär zu dem ersten Oligonucleotid in einer Lösung komplementär gebunden ist, bestimmte Sequenzen (N-Terminus 3 Basen und C-Terminus 2 Basen in SEQ ID NO: 3 und N-Terminus 4 Basen und C-Terminus 3 Basen in SEQ ID NO: 4) in der N-terminalen Seite des Histidin-Tag, wenn er mit StuI verdaut wird, und in der C-terminalen Seite wenn er mit NotI verdaut wird, gebildet werden. Danach wurden diese zwei Nucleotide gemischt, erwärmt und dann wieder auf Raumtemperatur gebracht, um komplementär zu binden, um eine für ein Histidin-Tag kodierende doppelsträngige DNA zu präparieren, welche in ein Plasmid mit StuI- und NotI-Erkennungssequenzen eingefügt werden kann.
Die Konstruktion eines rekombinanten sTSHR-Transfervektors erfolgte durch Behandlung eines Transfervektors pBac PAK9 (hergestellt durch Clonetech) mit StuI und NotI, Einfügen der für ein Histidin-Tag kodierenden DNA in den Vektor, welcher nachfolgend mit EcoRI und StuI behandelt wurde, und dann Einbringen der cDNA, die für den extrazellulären Domänenteil von TSHR kodiert.
Die Struktur des auf diese Weise konstruierten sTSHR und eine entsprechende Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz werden in der 1 (Nr. 1), SEQ ID NOs: 20 bzw. 5 gezeigt.
Beispiel 3
Präparation eines Transfervektors mit eingefügter cDNA, die für den sTSHR entsprechend den Aminosäureresten vom N-Terminus zur 410. Aminosäure des natürlichen TSHR entspricht, in welchem alle Aminosäurereste vom 352. bis zum 356. Aminosäurerest vom N-Terminus durch Alanin substituiert sind:
Unter Verwendung der in Beispiel 1 erhaltenen humanen Schilddrüsen-cDNA als das Ausgangsmaterial wurde ein Transfervektor mit eingefügter cDNA, die für den sTSHR kodiert, in welchem die Aminosäurereste vom 352. bis zum 356. Aminosäurerest vom N-Terminus des natürlichen TSHR durch Alanin substituiert waren, hergestellt.
Durch Einsatz des Überlappungs-Verlängerungsverfahrens (GENE, 77: 51-59 (1989)) wurde eine cDNA hergestellt, die den Rezeptor kodiert, in welchem ein Aminosäurerestteil mit hoher Hydrophobizität (der 352. bis zum 356. Aminosäurerest vom N-Terminus), der in dem C-Terminus des extrazellulären Domänenteils vorhanden ist, durch Alanin substituiert wurde. Zunächst wurde ein Sinn-Primer shTSHR-2 (SEQ ID NO: 6), in welchem ein für fünf Alaninreste kodierendes DNA-Fragment (16 Basen vom 3'-Ende in der SEQ ID NO: 6) an das 3'-Ende von 18 Basen fusioniert wurde, die die Aminosäurereste gerade vor dem Aminosäureteil kodieren, und ein Gegensinn-Primer ahTSHR-2 (SEQ ID NO: 7), in welchem ein Oligonucleotid mit Basen komplementär zu den fünf Alaninresten (15 Basen am 3'-Ende in SEQ ID NO: 7) an das 5'-Ende eines Oligonucleotids mit 19 Basen komplementär zu einem DNA-Fragment fusioniert war, das die Aminosäurereste gerade hinter dem Aminosäureteil kodiert, hergestellt, und unter Verwendung der Primer shTSHR-1 und ahTSHR-1, verwendet in Beispiel 2, und den verschiedenen Kombination von shTSHR-1 mit ahTSHR-2 und shTSHR-2 mit ahTSHR-1 erfolgte eine separate PCR-Amplifikation unter Verwendung der humanen Schilddrüsenzellen-cDNA als die Matrize, um ein cDNA-Fragment herzustellen, in welchem die fünf Alaninreste kodierende cDNA an die 3'-Endseite der cDNA fusioniert war, die einen N-terminalen Aminosäurerestteil vom 1. bis zum 350. Aminosäurerest des natürlichen TSHR kodiert, und ein cDNA-Fragment, in welchem die fünf Alaninreste kodierende cDNA an die 5'-Endseite der cDNA fusioniert war, die einen N-terminalen Aminosäurerestteil vom 357. bis zum 410. Aminosäurerest des natürlichen TSHR kodiert. Da diese zwei cDNA-Fragmente die gleiche, fünf Alaninreste kodierende Nukleotidsequenz an dem 3'-Ende oder 5'-Ende haben, wurde eine sTSHR kodierende cDNA, in welchen ein Bereich des natürlichen TSHR mit hoher Hydrophobizität, nämlich die Aminosäurereste vom 352. bis zum 356. Aminosäurerest vom N-Terminus, mit Alaninresten substituiert wurden, durch Mischen davon für ein komplementäres Binden und Durchführung von PCR-Amplifikation unter Verwendung von shTSHR-1 und ahTSHR-1 präpariert.
Danach wurde durch dasselbe, in Beispiel 2 gezeigte Vorgehen, die auf diese Weise hergestellte cDNA mit EcoRI und EcoRV behandelt und in den Transfervektor mit angehängtem Histidin-Tag eingefügt, welcher vorher mit EcoRI und StuI behandelt wurde.
Die Struktur des auf diese Weise in diesem Beispiel hergestellten sTSHR, in welchem die Aminosäurereste vom 352. bis zum 356. Aminosäurerest vom N-Terminus des natürlichen TSHR durch Alaninreste substituiert waren, und seine entsprechende Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz werden in der 1 (Nr. 2), SEQ ID NOs: 21 bzw. 8 gezeigt.
Beispiel 4
Präparation eines Transfervektors mit eingefügter cDNA, die für einen sTSHR kodiert, der den Aminosäureresten vom N-Terminus bis zum 410. Aminosäurerest des natürlichen TSHR entspricht, in welchem ein Aminosäurerestteil vom 338. bis zum 366. Aminosäurerest vom N-Terminus deletiert ist:
Unter Verwendung der in Beispiel 1 erhaltenen cDNA von humanen Schilddrüsenzellen 1 als das Ausgangsmaterial wurde ein Transfervektor mit eingefügter cDNA präpariert, der einen sTSHR kodiert, in welchem ein Aminosäurerestteil vom 338. bis zum 366. Aminosäurerest vom N-Terminus des natürlichen TSHR deletiert war.
Durch Einsatz des Überlappungsverlängerungsverfahrens wurde eine cDNA präpariert, die den Rezeptor kodiert, in welchem ein Bereich (vom 338. bis zum 366. Aminosäurerest vom N-Terminus) mit einem Aminosäurerestteil mit stark hydrophobem Charakter (352. bis zum 356. Aminosäurerest vom N-Terminus), der in dem C-Terminus des extrazellulären Domänenrest vorhanden ist, deletiert war. Zunächst wurden ein Sinn-Primer shTSHR-3 (SEQ ID NO: 9) und ein Gegensinn-Primer ahTSHR-3 (SEQ ID NO: 10) hergestellt, in welchem entsprechende Oligonucleotide fusioniert waren, die für Aminosäurereste vor und nach dem Aminosäureteil kodieren, hergestellt, und unter Verwendung der in Beispiel 2 verwendeten Primer shTSHR-1 und ahTSHR-1, und in entsprechenden Kombinationen von shTSHR-1 mit ahTSHR-3 und von shTSHR-3 mit ahTSHR-1, wurde eine PCR-Amplifikation unter Verwendung der cDNA von humanen Schilddrüsenzellen als die Matrize getrennt durchgeführt, wodurch ein cDNA-Fragment hergestellt wurde, in welchem ein Teil, der für Aminosäurereste vom 367. bis zum 370. Aminosäurerest vom N-Terminus des natürlichen TSHR kodiert, an das 3'-Ende eines Teils fusioniert war, der für die Aminosäurereste vom 1. bis zum 337. Aminosäurerest des gleichen Rezeptors kodiert, und ein cDNA-Fragment, in welchem ein Teil, der für Aminosäurereste vom 334. bis zum 337. Aminosäurerest vom N-Terminus des natürlichen TSHR kodiert, an die 5'-Endseite eines Teils fusioniert war, der für die Aminosäurereste vom 334. bis zum 337. Aminosäurerest des gleichen Rezeptors kodiert. Da diese zwei cDNA-Fragmente den gleichen Frequenzabschnitt mit 24 Basen haben, wurde eine cDNA, die einen sTSHR kodiert, in welchem ein Aminosäurerestteil vom 338. bis zum 366. Aminosäurerest vom N-Terminus des natürlichen TSHR deletiert war, durch Mischen davon für ein komplementäres Binden und dann Durchführung von PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer shTSHR-1 und ahTSHR-1 hergestellt.
Danach wurde durch das gleiche wie in Beispiel 2 gezeigte Vorgehen die auf diese Weise präparierte cDNA mit EcoRI und EcoRV behandelt und in den Transfervektor mit angefügtem Histidin-Tag eingefügt, welcher vorher mit EcoRI und StuI behandelt wurde.
Die Struktur des sTSHR der auf diese Weise in diesem Beispiel hergestellt wurde, in welchem die Aminosäurereste vom 338. bis zum 366. Aminosäurerest vom N-Terminus des natürlichen TSHR deletiert waren, und seine entsprechende Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenz werden in der 1 (Nr. 3) SEQ ID NOs: 22 bzw. 11 gezeigt.
Beispiel 5
Konstruktion eines Transfervektors mit eingefügter cDNA, die für einen sTSHR codiert, der den Aminosäureresten vom N-Terminus bis zum 415. Aminosäurerest des natürlichen TSHR entspricht:
Unter Verwendung der cDNA der in Beispiel 1 erhaltenen humanen Schilddrüsenzellen als das Ausgangsmaterial folgte eine Konstruktion eines Transfervektors mit eingefügter cDNA von sTSHR.
Eine cDNA, die einen extrazellulären Domänenteil (einen Teil mit 415 Aminosäureresten vom 1. bis zum 415. Aminosäurerest vom N-Terminus) von TSHR kodiert, wurde durch PCR unter Verwendung der cDNA der humanen Schilddrüsenzellen als die Matrize amplifiziert.
Der shTSHR-1 und ein Gegensinn-Primer ahTSHR-4 (SEQ ID NO: 12), komplementär zu einer Teilsequenz von 20 Basen stromaufwärts von einem Codon, welche dem 415. Aminosäurerest vom N-Terminus von TSHR entspricht, wurden als die PCR-Primer für die Amplifizierung des Teils von 415 Aminosäureresten vom 1. bis zum 415. Aminosäurerest vom N-Terminus von TSHR verwendet, und die PCR erfolgte in einer Reaktionslösung, die eine DNA-Polymerase enthält.
Danach wurde die auf diese Weise hergestellte cDNA mit EcoRI behandelt und dann, durch das gleiche wie in Beispiel 2 gezeigte Vorgehen, in den Transfervektor mit angehängtem Histidin-Tag eingefügt, welcher vorher mit EcoRI und StuI behandelt wurde.
Die Struktur die auf diese Weise konstruierten sTSHR und seine entsprechenden Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenz werden in der 1 (Nr. 4), den SEQ ID NOs: 23 bzw. 13 gezeigt.
Beispiel 6
Präparation eines Transfervektors mit eingebrachter cDNA, die einen Rezeptor kodiert, in welchem die Signalsequenz des Baculovirus gp 67-Protein an den N-Terminus von sTSHR entsprechend den Aminosäureresten vom 21. bis zum 410. Aminosäurerest des natürlichen TSHR hinzugefügt ist:
Unter Verwendung der in Beispiel 1 präparierten cDNA der Schilddrüsenzellen, und einer anderen cDNA, die die Signalsequenz des Baculovirus gp 67-Proteins kodiert, als die Ausgangsmaterialien, wurde eine cDNR hergestellt, die ein Protein kodiert, in welchem 42 Aminosäurereste (SEQ ID NO: 19), die die Signalsequenz von Baculovirus gp 67-Protein enthalten, an den N-Terminus vom sTSHR entsprechend einem Teil vom 21. bis zum 410. Aminosäurerest des natürlichen TSHR hinzugefügt waren.
Die cDNA, die die Signalsequenz des Baculovirus gp 67-Proteins zu kodiert, kann durch PCR amplifiziert werden, z. B. unter Verwendung eines DNA-Fragments, in welches die Signalsequenz des Baculovirus gp 67-Proteins eingefügt wurde (pAcGP67 A Baculovirus-Transfervektor, PharMingen) als die Matrize. Ein Sinn-Primer sGP67 (SEQ ID NO: 15) in welchem eine BamHI Erkennungssequenz (das 4. Guanin bis zu dem 9. Cytosin vom 5'-Ende in der SEQ ID NO: 15) und eine Kozak- Sequenz mit 3 Basen (10. Adenin bis zum 12. Cytosin vom 5'-Ende in der SEQ ID NO: 15) wurden an das 5'-Ende eines Oligonucleotids mit 20 Basen vom Initiationscodon der Signalsequenz des Baculovirus gp 67-Proteins fusioniert, und ein Gegensinn-Primer aGP67 (SEQ ID NO: 16), in welchem eine EcoRI Erkennungssequenz (4. Guanin bis zum 9. Cytosin vom 5'-Ende in der SEQ ID NO: 16) war an das 5'-Ende eines Oligonucleotids fusioniert, das komplementär war zu einer Teilsequenz bestehend aus 20 Basen stromaufwärts von einem Codon entsprechend dem 40. Aminosäurerest vom N-Terminus der Aminosäurereste, die die Signalsequenz des Baculovirus-gp 67-Proteins enthalten, wurden als die PCR-Primer verwendet, und die PCR erfolgte in einer Reaktionslösung, die eine DNA-Polymerase enthält (Vent DNA Polymerase, hergestellt durch Biolabs).
Danach wurde diese cDNA mit BamHI und EcoRI behandelt und in den Transfervektor mit angehängtem Histidin-Tag, gezeigt in Beispiel 2, eingebracht, welcher vorher mit BamHI und EcoRI behandelt wurde.
Die cDNA, die einen extrazellulären Domänenteil (einen Teil von 390 Aminosäureresten vom 21. bis zum 410. Aminosäurerest vom N-Terminus) von TSHR kodiert, wurde unter Verwendung der in Beispiel 1 präparierten cDNA von humanen Schilddrüsenzellen als die Matrize durch PCR amplifiziert. Ein Sinn-Primer shTSHR-4 (SEQ ID NO: 14) in welchem eine EcoRI-Erkennungssequenz (das 4. Guanin bis zu dem 9. Cytosin vom 5'-Ende in der SEQ ID NO: 14) an das 5'-Ende eines Oligonucleotids mit 20 Basen gezählt von einem Codon entsprechend dem 21. Aminosäurerest von TSHR fusioniert war, und der Gegensinn-Primer ahTSHR-1 wurden als die PCR-Primer verwendet und die PCR erfolgte in einer Reaktionslösung, die eine DNA-Polymerase enthält (Vent DNA Polymerase, hergestellt durch Biolabs).
Danach wurde diese cDNA mit EcoRI und EcoRV behandelt und zwischen der DNA für die Baculovirus gp 67-Proteinsignalsequenz und der DNA für den Histidin-Tag des Transfervektors mit der Baculovirus gp 67-Proteinsignalsequenz und dem angehängten Histidin-Tag eingefügt, welcher vorher mit EcoRI und StuI behandelt wurde.
Die Struktur der cDNA, die für einen Rezeptor kodiert, in welchem die Signalsequenz des Baculovirus gp-67-Proteins an den N-Terminus von sTSHR entsprechend den Aminosäureresten vom 21. bis zum 410. Aminosäurerest von natürlichen TSHR angefügt war und seine Nucleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz werden in der 1 (Nr. 5), SEQ ID NOs: 24 bzw. 17 gezeigt.
Beispiel 7
Herstellung eines Transfervektor mit eingefügter cDNA, die für einen Rezeptor kodiert, in welchem die Signalsequenz des Baculovirus gp-67-Proteins an den N-Terminus des sTSHR entsprechend den Aminosäureresten vom 21. bis zum 415. Aminosäurerest vom natürlichen TSHR zugefügt ist:
Unter Verwendung der in Beispiel 1 präparierten cDNA der Schilddrüsenzellen und einer weiteren cDNA, die für die Signalsequenz des Baculovirus gp-67-Proteins kodiert, als die Ausgangsmaterialen, wurde eine cDNA hergestellt, die für ein Protein kodiert, in welchem die Signalsequenz des Baculovirus gp-67-Proteins an den N-Terminus des sTSHR entsprechend einem Teil vom 21. bis zum 450. Aminosäurerest vom N-Terminus des natürlichen TSHR hinzugefügt war.
Die cDNA, die die Signalsequenz des Baculovirus gp-67-Proteins kodiert, wurde durch das gleiche wie in Beispiel 1 gezeigte Verfahren hergestellt und in den Transfervektor angehängtem Histidin-Tag eingefügt.
Die cDNA, die einen extrazellulären Domänenteil (einen Teil mit 395 Aminosäureresten vom 21. bis zum 450. Aminosäurerest vom N-Terminus) des TSHR codiert, wurde durch PCR unter Verwendung der cDNA von humanen Schilddrüsenzellen als Matrize amplifiziert. Unter Verwendung des Sinn-Primvers shTSHR-4 und des Gegensinn-Primers ahTSHR-4 als die PCR-Primer erfolgte die PCR in einer Reaktionslösung, die eine DNA-Polymerase enthält.
Danach wurde diese cDNA mit EcoRI behandelt und zwischen die DNA für die Baculovirus gp-67-Proteinsignalsequenz und die DNA für das Histidin-Tag des Transfervektors mit der Baculovirus gp-67-Proteinsignalsequenz und dem angehängten Histidin-Tag, gezeigt in Beispiel 6, eingebracht, welcher vorher mit EcoRI und StuI behandelt wurde.
Die Struktur der cDNA, die einen Rezeptor kodiert, in welchem die Signalsequenz des Baculovirus gp-67-Proteins an den N-Terminus von sTSHR entsprechend den Aminosäureresten vom 21. bis 415. Aminosäurerest vom natürlichen TSHR kodiert, und seine Nucleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz werden in der 1 (Nr. 6), SEQ ID NOs: 25 bzw. 18 gezeigt.
Beispiel 8
Expression von sTSHR in Insektenzellen:
SF9-Insektenzellen wurden einer Cotransfektion mit dem rekombinanten Transfervektor und einer viralen DNA-Präparation (pBac PAK6; hergestellt von Clontech) als ein mit Bsu36-verdauter Expressionsvektor unterzogen und dann für 4 bis 5 Tage kultiviert, um einen rekombinanten Baculovirus herzustellen. Der sTSHR wurde durch Infektion von High-five-Insektenzellen mit dem rekombinanten Virus in einem Medium für Insektenzellen unter Verwendung von EX-CELL 400 (hergestellt von JRH BIOSCIENCES) und Kultivierung der Zellen bei 27°C über einen Zeitraum von 72 bis 96 Stunden exprimiert.
Der so gewonnene Kulturüberstand wurde als eine Kulturüberstandsfraktion verwendet und die gewonnenen Insektenzellen wurden mit PBS mit 0,5 % Triton-X aufgebrochen, um die resultierende lösliche Fraktion als eine lösliche Zellextraktfraktion zu verwenden. Jede der Kulturüberstandsfraktion und der löslichen Zellextraktfraktion wurden durch eine SDS-Polyacrylamidgel-(10 %) Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran (Immobilon-P Transfer Membranes; hergestellt durch MILLIPORE) transferiert. Als nächstes wurde die PVDF-Membran einer Blockierungsbehandlung unter Verwendung von PBS mit 0,05 % Tween 20 und 5 % Magermilch unterzogen und dann mit einem auf 1/500 mit PBS verdünnten Anti-His₆-Antikörper (Anti-His₆-Peroxidase; hergestellt durch Boehringer Mannheim) gemischt, und nachfolgend die Reaktion bei Raumtemperatur für 1 Stunde durchgeführt.
Nach der Reaktion wurde die Membran mit PBS gewaschen, und es wurde eine Reaktion mit einem chemilumeneszenten Meerrettichperoxidasesubstrat (Renaissance; hergestellt durch DuPont NEN) herbeigeführt. Die leuchtende Reaktion wurde durch Exposition mit einem Röntgenfilm (MEDICAL FILM; hergestellt durch KONICA) sichtbar gemacht, um die Expression von sTSHR zu bestätigen. Die Ergebnisse werden in der 2 gezeigt.
Wie aus der 2 ersichtlich, wurde, wenn der sTSHR (1 in der Zeichnung) bestehend aus dem Aminosäureresten vom 1. bis zum 410. Aminosäurerest vom N-Terminus des natürlichen TSHR, oder der sTSHR (2 in der Zeichnung), in welchem die Aminosäurereste vom 352. bis zum 356. Aminosäurerest mit Alaninresten substituiert waren, exprimiert wurden, ein sTSHR von etwa 58 kDa in der Kulturüberstandsfraktion nachgewiesen, und ein TSHR von etwa 63 oder 49 kDa wurde in der intrazellulären Fraktion nachgewiesen. Andererseits, wenn der sTSHR (3 in der Zeichnung), in welchem die Aminosäurereste vom 338. bis zum 366. Aminosäurerest vom N-Terminus des natürlichen TSHR deletiert waren, exprimiert wurde, wurde ein sTSHR von etwa 53 kDa in der Kulturüberstandsfraktion nachgewiesen und ein TSHR von etwa 58 oder 43 kDa wurde in der intrazellulären Fraktion nachgewiesen.
Zusätzlich wurde, wenn der sTSHR (4 in der Zeichnung) bestehend aus den Aminosäureresten vom 1. bis zum 415. Aminosäurerest vom N-Terminus vom natürlichen TSHR oder die sTSHR (5 oder 6 in der Zeichnung), in welchem die Signalsequenz des Baculovirus gp 67-Proteins an den N-Terminus von sTSHR hinzugefügt wurden, die für die Aminosäurereste vom 21. bis zum 410. Aminosäurerest oder vom 21. bis zum 415. Aminosäurerest exprimieren, ein sTSHR von 58 kDa in der Kulturüberstandsfraktion nachgewiesen, und ein TSHR von etwa 64 oder 50 kDa wurde in der intrazellulären Fraktion nachgewiesen.
Folglich wurde der sTSHR in den extrazellulären Teil mit nahezu der gleichen Effektivität unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit der hydrophoben Region, die in der extrazellulären Domänenregion des natürlichen TSHR vorhanden ist, nämlich die Aminosäurereste vom 338. bis zum 366. oder die vom 352. bis zum 356. Aminosäurerest vom N-Terminus, und unabhängig vom Unterschied in den Signalsequenzen sekretiert.
Beispiel 9
Reinigung von sTSHR unter Verwendung von Metallaffinitätschromatographie:
Jede der in den Beispielen 2, 5, 6 und 7 beschreiben sTSHR-Proben (sTSHR-Proben der Nr. 1, 4, 5 und 6, gezeigt in der 1) wurden durch das in Beispiel 8 gezeigte Verfahren exprimiert und jeder sTSHR in der Kulturüberstandsfraktion und der Zellextraktfraktion wurde durch Metallaffinitätschromatographie gereinigt. Hinsichtlich der Reinigung des sTSHR aus einer Kulturüberstandsfraktion wurde die Kulturüberstandsfraktion über Nacht gegen PBS dialysiert, NaCl und Imidazol wurden dazugegeben, um Endkonzentrationen von 0,5 M bzw. 20 mM zu erreichen, die Mischung wurde auf eine Nickelaffinitätssäule (His Trap; hergestellt von Pharmacia Biotec.) gegeben, und der sTSHR wurde an der Nickelaffinitätssäule absorbiert unter Verwendung der Chelatbindung der sechs Histidinreste, angefügt an den C-Terminus von sTSHR, mit Nickel. Die Elution des absorbierten sTSHR wurde unter Verwendung von PBS mit 250 mM Imidazol als ein Kompetitor und 0,5 M NaCl durchgeführt. Hinsichtlich der Reinigung von sTSHR aus einer Zellextraktfraktion, wurde die lösliche Zellextraktfraktion des Beispiels 5 mit NaCl und Imidazol gemischt, um Endkonzentrationen von 0,5 M bzw. 20 mM zu ergeben, gefolgt durch Reinigung unter Verwendung der Nickelaffinitätssäule in der gleichen Art und Weise wie im Fall des Kulturüberstands. Die Ergebnisse werden in der 3 gezeigt. In der 3 wurde der nach der Reinigung erhaltene sTSHR der in der 1 gezeigten Nr. 1, 4, 5 oder 6 mit einem Anti-His₆-Antikörper durch Western-Blotting nachgewiesen.
Es ist aus der 3 ersichtlich, dass der sTSHR leicht durch Metallaffinitätschromatographie unter Verwendung des zu dem C-Terminus von sTSHR hinzugefügten Histidin-Tags gereinigt werden kann.
Beispiel 10
Reinigung von sTSHR unter Verwendung einer Lectinsäule:
Die Reinigung von sTSHR aus der Kulturüberstandsfraktion und der Zellextraktfraktion, in welcher der in Beispiel 2 beschriebene sTSHR (sTSHR Nr. 1, gezeigt in 1) durch das in Beispiel 8 gezeigte Verfahren exprimiert wurde, erfolgte unter Verwendung des zu dem sTSHR hinzugefügten Zuckers unter Verwendung einer ConA-Säule (His Trap Lentil Lectin; hergestellt durch Pharmacia Biotec.), mit einer starken Affinität für oligomannosidische und Hybridzuckerketten und einer Lentil-Lectin-Säule (HiTrap Lentil Lectin; hergestellt durch Pharmacia Biotec.) mit Affinität für Zuckerketten, in welchen ihren reduzierenden Endseiten mit Fucose modifiziert sind. Hinsichtlich der Reinigung von sTSHR aus dem Kulturüberstand wurde die Kulturüberstandsfraktion des Beispiels 8 über Nacht gegen PBS, gemischt mit NaCl, MnCl₂, CaCl₂ und Tris-HCl (pH 7,4), um Endkonzentrationen von 0,5 M, 1 mM, 1 mM bzw. 20 mM zu ergeben, dialysiert, und die Mischung wurde auf die ConA-Säule und die Lentil-Lectin-Säule gegeben zur Bindung des sTSHR an die entsprechenden Lectin-Säulen. Die Elution des diese Weise an die Lectin-Säulen absorbierten sTSHR erfolgte unter Verwendung einer Elutionslösung mit 1 M Methyl-α-D-mannopyranoisid als ein Kompetitor, 0,5 m NaCl und 20 mM Tris-HCl (pH 7,4).
Hinsichtlich der Reinigung von sTSHR aus der Zellextraktfraktion wurde die lösliche Zellextraktfraktion des Beispiels 8 mit NaCl, MnCl₂, CaCl₂ und Tris-HCl (pH 7,4) gemischt, um Endkonzentrationen von 0,5 M, 1 mM, 1 mM bzw. 20 mM zu ergeben, und die Mischung wurde auf die Lectin-Säulen in der gleichen Art und Weise wie im Fall der Kulturüberstandsfraktionen gegeben. Die Ergebnisse werden in der 4 gezeigt.
Wie aus der 4 ersichtlich, bindet in dem Fall des sTSHR der Zellextraktfraktion (A in der Zeichnung) ein 49 kDa-Protein von den Proteinen mit 62 kDa und 49 kDa nicht an das ConA, aber mehrere % der hochmolekularen Gewichtsseite 62 kDa wurde an ConA gebunden. Zusätzlich band der sTSHR der Zellextraktfraktion nicht an Lentil-Lectin. Andererseits, wenn der sTSHR der Kulturüberstandsfraktion (B in der Zeichnung) auf ConA und Lentil-Lectin gegeben wurde, wurde er sowohl von ConA als auch Lentil-Lectin gebunden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das 63 kDa sTSHR-Protein der Zellextraktfraktion ein Glycoprotein ist, an welchem N-Zuckerketten, wie etwa oligomannosidische und Hybridzuckerketten zugefügt sind, aber ihre reduzierenden Endseiten sind nicht mit Fucose modifiziert, und die N-Zuckerketten nicht an das 49 kDa sTSHR-Protein der Zellextraktfraktion hinzugefügt sind. Andererseits wird gezeigt, dass die N-Zuckerketten, wie etwa oligomannosidische und Hybridzuckerketten mit Fucose modifizierten reduzierenden Endseiten an das 58 kDa sTSHR-Protein der Kulturüberstandsfraktion hinzugefügt sind.
Folglich ist ersichtlich, dass der sTSHR der Kulturüberstandsfraktion unter Verwendung von ConA oder Lentil-Lectin gereinigt werden kann.
Beispiel 11
Zuckerketten von sTSHR:
Es wurde berichtet, dass sechs Additionsstellen für N-Zuckerketten in dem extrazellulären Domänenrest des humanen TSHR vorhanden sind, und dass die Addition von O-Zuckerketten nicht auftritt (Endocrine Rev. 13: 61-76 (1992)) und dass Insektenzellen allgemein keine Proteine mit Hybridzuckerketten synthetisieren. Es wurde ebenfalls berichtet, dass Zuckerketten mit verschiedenen Eigenschaften hinzugefügt werden, wenn die Signalfrequenz eines Baculovirus oder einer Insektenzelle an den extrazellulären Domänenrest des humanen TSHR angehängt wird (MCE, 147: 133-142 (1999)). Demgemäß wurde eine Kulturüberstandsfraktion und eine Zellextraktfraktion, in welchem der in Beispiel 2 oder Beispiel 6 beschriebene sTSHR (der sTSHR der Nr. oder Nr. 5 in der 1) durch das in den Beispielen 8 oder 9 beschriebene Verfahren exprimiert wurde, unter Verwendung von Zucker verdauenden Enzymen einer Identifikation von Zuckerketten unterzogen. Der Zuckerverdau erfolgte durch Zugabe von Endo F2 (Endolycosidase F, rec.; hergestellt durch Boehringer Mannheim), Endo H (Endoglycosidase H; hergestellt durch Boehringer Mannheim), α-Mannosidase (α-Mannosidasesuspension; hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries) und PNGase (N-Glycosidase F, rec.; hergestellt durch Boehringer Mannheim) als Zucker verdauende Enzyme mit Spezifität für N-Zuckerketten zu einer Kulturüberstandsfraktion oder einer Zellextraktfraktion, die einen sTSHR enthalten an welchen die humane TSHR-Signalsequenz, beschriebenen in Beispiel 2, oder die Baculovirus gp 67-Signalsequenz, beschrieben in Beispiel 6, hinzugefügt wurde.
Nach dem Verdau erfolgte die Untersuchung der N-Zuckerketten durch Nachweis des Zucker verdauten Proteins durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-His6-Antikörpers. Ebenfalls ist Endo F2 ein Enzym, welches Hybridzuckerketten verdaut, Endo H verdaut oligomannosidische Zuckerketten und Hybridzuckerketten, α-Mannosidase verdaut hauptsächlich α-1,2- und α-1,6-Bindungen von Mannose, die in den Enden vorhanden sind, und PNGase verdaut alle N-Zuckerketten.
Die Ergebnisse des sTSHR (Nr. 1 in 1) mit der humanen TSHR-Signalsequenz und des sTSHR (Nr. 5 in 1) mit der Baculovirus-Signalsequenz, die beide in den Zellextraktfraktionen vorhanden sind, werden in den 5B bzw. 5D gezeigt.
Gemäß der 5 wurde der sTSHR mit einer der Signalsequenzen nicht durch die Endo F2-Behandlung verdaut, aber durch die Endo H-Behandlung verdaut, und seine Größe wurde deutlich durch die α-Mannosedasebehandlung reduziert, so dass angenommen wird, dass er oligomannosidische Zuckerketten hat, welche viele Mannosemoleküle an den Enden der Zuckerketten haben. Andererseits wurde sowohl der sTSHR mit der humanen TSHR-Signalsequenz (5A) als auch der sTSHR mit der Baculovirus gp 67-Signalsequenz (5C) nicht durch die Behandlungen mit Endo F2 und Endo H verdaut, und ihre Größen wurden durch die α-Mannosidasebehandlung leicht reduziert, so das angenommen wird, dass sie verkürzte oligomannosidische Zuckerketten haben mit einer geringen Anzahl von Mannosemolekülen an den Enden der Zuckerketten. Zusätzlich, da die Größen der in der Zellextraktfraktion und der Kulturüberstandfraktion enthaltenen sTSHR-Proteine durch die PNGase-Behandlung unabhängig von dem Unterschied in den Signalsequenzen nahezu auf das gleiche Niveau reduziert wurden, wird angenommen, dass sie Proteine mit dem gleichen Aminosäurerestteil sind, die lediglich unterschiedliche Zuckerketten habenS.
Da TSHR mit verkürzten oligomannosidischen Zuckerketten mit einer geringen Anzahl von Mannosemolekülen an den Zuckerketten, wie im Fall des sTSHR der vorliegenden Erfindung, nicht bekannt sind, ist dies ein neuer Fund.
Beispiel 12
Einfluss von Glycosidase-Inhibitoren auf die Sekretion von sTSHR:
Es wurde jüngst berichtet, dass der Transport des TSHR an die Zelloberfläche in Abhängigkeit von den Unterschied in den an den TSHR hinzugefügten Zuckerketten schwankt (J. Biol. Chem., 273: 33423-33428 (1998)). Demgemäß wurden, um zu untersuchen, ob die Addition von verkürzten oligomannosidischen Zuckerketten wichtig für die Sekretion von sTSHR in den Zellkulturüberstand ist, unter Verwendung des in Beispiel 6 beschriebenen sTSHR Hi-five-Insektenzellen für 1 Stunde mit 1 mM des α-Mannosidase I-Inhibitor 1-Deoxymannojirimycin (dMM) oder 10 μg/ml des α-Mannosidase-II-Inhhbitor Swansonine (SW) behandelt, mit dem rekombinanten Virus infiziert und für 3 Tage kultiviert, und dann wurde der Kulturüberstand gewonnen, um die Anwesenheit oder Abwesenheit der sTSHR- Sekretion in dem Kulturüberstand durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-His₆-Antikörpers nachzuweisen. Die Ergebnisse werden in der 6 gezeigt.
Wie aus der 6 ersichtlich, wurde der sTSHR, an welchen eine oligomannosidische Zuckerkette (GlcNac)₂(Man)₈ zugefügt war, exprimiert, wenn das dMM in der Reaktion verwendet wurde, und der sTSHR, zu dem eine andere oligomannosidische Zuckerkette (GlcNac)₂(Man)₅(GlcNac) hinzugefügt war, wurde exprimiert, wenn das SW verwendet wurde. Wie aus der
6A ersichtlich, wurde die Sekretion von sTSHR in den Zellkulturüberstand in jedem Fall der Reaktionen mit dMM und SW beobachtet. Ebenfalls wurde gemäß 6B, wenn der gewonnene Zellkulturüberstand durch Metallaffinitätschromatographie gereinigt, mit Endo H Zucker verdaut und dann durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-His6-Antikörpers nachgewiesen wurde, die sTSHR-Proteine, die in den Zellen mit dMM oder SW exprimiert wurden, durch Endo H Zucker-verdaut, wodurch die Hinzufügung von oligomannosidischen Zuckerketten dazu bestätigt wurde. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird angenommen, dass die zuzugebenden Zuckerketten für die Sekretion des sTSHR in dem Zellkulturüberstand nicht notwendigerweise verkürzte oligomannosidische Zuckerketten sind.
Beispiel 13
Absorptionstest von TBII Serum von Patienten mit der Basedow-Krankheit oder Patienten mit Hypothyreose unter Verwendung von sTSHR:
Antiserum von Patienten mit der Basedow-Krankheit oder Patienten mit Hypothyreose (IgG) hemmt die Bindung von ¹²⁵I-TSH am solubilisierte Schilddrüsenmembranen (sogenannte TBII). Ein Assay unter Verwendung dieser Wirkung wird herkömmlich für die Diagnose bei Patienten mit der Basedow-Krankheit verwendet. Der in Beispiel 2 (Nr. 5 in 1) beschriebene sTSHR mit einer humanen TSHR-Signalsequenz und der sTSHR, an welchem eine Baculovirus gp 67-Signalsequenz hinzugefügt war, wie in Beispiel 6 beschrieben (Nr. 5 in 1), wurden durch die in den Beispielen 8 und 9 beschriebenen Verfahren exprimiert und ihre Einflüsse auf die Wirkungen der Patienten-IgG (Seren von 6 Fällen von Patienten mit Basedow-Krankheit mit TSAb-Aktivität und von 6 Fällen von Patienten mit Hypothyreose mit TSBAb-Aktivität) bei der Hemmung der Bindung von TSH an Schilddrüsenmembranen wurde untersucht.
Jede der sTSHR-Proben wurde vorher mit jedem Patientenserum für 1 Stunde gemischt und TBII in dem Patientenserum wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen TBII Untersuchungsreagenziensatzes (TRAB "Cosmic" II; hergestellt durch Cosmic Corporation) gemessen. Der sTSHR, an welchem die Baculovirus gp 67-Signalsequenz hinzugefügt war (Nr. 5 in der 1), der in jeder der Kulturüberstandsfraktionen und der Zellextraktfraktionen enthalten war, absorbierte in den 6 Fällen der Patientenseren mit TSAb-Aktivität TBII vollständig (7A) und absorbierte in den 6 Fällen der Patientenseren mit TSBAb-Aktivität ebenfalls TBII (7B). Andererseits absorbierte der sTSHR, an welchem die humane TSHR-Signalsequenz hinzugefügt war (Nr. 1 in 1) in einem Fall der Patientenseren mit TSAb-Aktivität vollständig TBII, das in jeder der Kulturüberstandsfraktionen und der Zellextraktfraktionen enthalten war, aber die verbleibenden fünf Fälle von Serum zeigten eine geringe TBII-Absorptionsrate (7C). In der Kulturüberstandsfraktion und der Zellextraktfraktion wurde, ausgenommen in einem Fall, TBII in 5 Fällen vollständig vom Serum mit TSBAb-Aktivität absorbiert (7D).
Folglich war hinsichtlich des TBII von IgG von Patienten mit der Basedow-Krankheit oder Patienten mit Hypothyreose in dem Fall des sTSHR, in welchem die humane TSHR-Signalsequenz zugefügt war, die Absorption von TBII in Serum mit TSBAb-Aktivität gut, aber die Absorption von TBII in Serum mit TSAb-Aktivität war nicht gut. Andererseits war in dem Fall des sTSHR, in welchem die Baculovirus-Signalsequenz hinzugefügt war, die Absorption von TBII in beiden Fällen von Seren mit TSBAb-Aktivität als auch TSAb-Aktivität gut.
Beispiel 14
Absorptionstest der TSAb-Aktivität im Serum von Patienten mit Basedow-Krankheit unter Verwendung von sTSHR:
Serum von Patienten mit Basedow-Krankheit (IgG) mit TSAb-Aktivität induziert die Produktion von cyclischen AMP (cAMP) durch seine Bindung an TSHR, welcher in den Schilddrüsenzellen vorhanden ist. Folglich wurden der in Beispiel 2 (Nr. 1 in 1) beschriebene sTSHR mit der humanen TSHR-Signalsequenz und der in Beispiel 6 (Nr. 5 in 1) beschriebene sTSHR, in welchem die Baculovirus gp 67-Signalsequenz hinzugefügt wurde, durch die Verfahren beschrieben in Beispielen 8 und 9 exprimiert, und ihre Einflüsse auf die cAMP-Produktionsaktivität (TSAb-Aktivität) von Schilddrüsenzellen wurde durch Patienten-IgG (Seren mit TSAb-Aktivität von drei Fällen von Basedow-Krankheit) untersucht.
Jeder der sTSHR-Proben wurde vorher mit jedem Patientenserum für 1 Stunde gemischt, die TSAb-Aktivität in den Patienten wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen TSAb-Untersuchungsreagenziensatzes (TSAb kit "Yamasa"; hergestellt durch Yamasa Shoyu) gemessen. Die Ergebnisse werden in der 8 gezeigt.
Der sTSHR, an welchem die Baculovirus gp 67-Signalsequenz hinzugefügt war (Nr. 5 in 1), der in jeder Kulturüberstandfraktion und der Zellextraktfraktion enthalten war, absorbierte vollständig die TSAb-Aktivität in allen der 3 Fälle von Seren (8A). Andererseits absorbierte der sTSHR, in welchem die humane Signalsequenz hinzugefügt war (Nr. 1 in 1), der in jeder der Kulturüberstandsfraktion und der Zellextraktfraktion enthalten war, vollständig die TSAb-Aktivität nur in einem Fall, aber die bleibenden zwei Fälle von Seren zeigten ein geringes TSAb-Aktivitätsabsorptionsverhältnis (8B).
Beispiel 15
Absorptionstest der TSBAb-Aktivität im Serum von Patienten mit Hypothyreose unter Verwendung von sTSHR:
Antiserum (IgG) mit TSBAb-Aktivität in Patienten mit Hypothyreose hemmt die Produktion von cyclischen AMP (cAMP) durch TSHR, welcher in den Schilddrüsenzellen vorhanden ist. Demgemäß wurden der in Beispiel 2 (Fr. 1 in 1) beschriebene sTSHR mit der humanen TSHR-Signalsequenz, der in Beispiel 6 beschriebene sTSHR, an welchem die Baculovirus gp-67-Signalsequenzen hinzugefügt war (Nr. 5 in 1), durch die in Beispielen 8 und 9 beschriebenen Verfahren exprimiert und ihre Einflüsse auf die Wirkung der Patienten IgG (Seren mit TSBAb-Aktivität von 3 Fällen von Hypothyreose) bei der Hemmung der TSHR-Aktivierung wurde durch das selbe Vorgehen wie in Beispiel 14 untersucht.
Jeder der sTSHR-Proben wurden vorher mit jedem Patientenserum für 1 Stunde gemischt und die TSBAb-Aktivität in den Patientenseren wurde unter Verwendung des TSAb-Untersuchungsreagenziensatzes gemessen. Die Ergebnisse werden in der 9 gezeigt.
Der sTSHR, an welchen die Baculovirus gp-67-Signalsequenzen zugefügt wurde, (Nr. 5 in der 1), der in jeder der Kulturüberstandfraktion und der Zellextraktion enthalten war, absorbierte nahezu vollständig die TSBAb-Aktivität in allen 3 Fällen der Seren (9A). Andererseits zeigt in dem Fall des sTSHR mit der humanen Signalsequenz (Nr. 1 in 1), der in der Kulturüberstandsfraktion enthaltene sTSHR nahezu keine Absorption der TSBAb-Aktivität in einem Fall der Seren, aber er absorbierte die TSBAb-Aktivität vollständig in den verbleibenden zwei Fällen der Seren (9A). Ebenfalls zeigte der in der Zellextraktfraktion enthaltene sTSHR ein geringes TSBAb-Aktivitätsabsorptionsverhältnis in allen Fällen der Seren (9B).
Beispiel 16
Nachweis von Anti-TSHR-Autoantikörpern unter Verwendung von sTSHR:
Der sTSHR, in welchem die Baculovirus gp-67-Signalsequenzen wie in dem Beispiel 6 beschrieben hinzugefügt wurde (Nr. 5 in 1) wurde durch das in den Beispielen 8 und 9 beschriebenen Verfahren exprimiert, durch Chelatbindung an eine Nickelimmobilisierte Platte mit 96 Vertiefungen gebunden (Ni-NTA HisSorb Strips; hergestellt durch QIAGEN) und dann durch Zugabe von 200fach mit PBS verdünnten Seren, von Patienten mit der Basedow-Krankheit (2 Fälle von Seren von Patienten mit TSABb-Aktivität (A1 und A4) und 2 Fälle von Seren von Patienten mit Hypothyroidismus mit TSBAb-Aktivität (B2 und B3), 4 Fälle insgesamt) oder normale humane Seren (2 Fälle) reagieren gelassen.
Nach der Reaktion reagierten diese Proben mit einem Antikörper gegen humanes IgG, der mit einer alkalischen Phosphatase markiert war (anti-humanes IgG Gammaketten alkalisches Phosphatasekonjugat; hergestellt von BIOSOURCE), welcher 2000fach mit PBS verdünnt wurde, und der an sTSHR gebundene Anti-TSHR-Antikörper (IgG) wurde nachgewiesen. Die Ergebnisse werden in der 10 gezeigt.
Wie in der 10 gezeigt, zeigten die normalen humanen Seren nahezu die gleiche Extinktion unabhängig ob der sTSHR in der Vertiefung gebunden war oder nicht. Andererseits, wenn Seren von Patienten mit der Basedow-Krankheit oder Patienten mit Hypothyreose verwendet wurden, wurde eine signifikant hohe Extinktion nur in den Vertiefungen gemessen, in welchen der sTSHR gebunden war.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse ist es offensichtlich, dass der sTSHR der vorliegenden Erfindung eine Reaktivität mit einem Antikörper gegen den humanen Rezeptor des thyroideastimulierenden Hormons hat und nützlich als ein Reagenz zur Messung eines Anti-TSHR-Autoantikörpers oder einer ähnlichen Substanz ist, welche in den Seren von Patienten mit der Basedow-Krankheit vorhanden ist.
Beispiel 17
Bindung von sTSHR an bTSH:
Der in den Beispielen 5, 6 oder 7 (Nr. 4, 5 oder 6 in 1) beschriebene sTSHR wurde durch die in den Beispielen 8 und 9 beschriebenen Verfahren exprimiert und für die Untersuchung seiner Bindungsfähigkeit an Bovine TSH (bTSH) verwendet. Jeder in der Kulturüberstandsfraktion oder der Zellextraktfraktion enthaltene sTSHR wurde in eine Lösung hergestellt durch Mischung von ¹²⁵I-TSH oder ¹²⁵I-TSH mit procinem TSHR gemischt, und die Mischung wurde bei 37°C für 1 Stunde stehen gelassen. Danach wurde die Mischung auf eine Gelfiltrationssäule (G3000-XL, hergestellt durch Tosoh) aufgebracht und durch eine Elutionslösung mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 50 mM NaCl aufgetrennt. Das Eluat wurde in Intervallen von 0,5 Minuten gewonnen und die in jeder Fraktion enthaltene Menge an ¹²⁵I-TSH wurde unter Verwendung einer γ-Zählvorrichtung gemessen. Die Ergebnisse werden in den 11 bis 16 gezeigt.
In den Chromatogrammen der 11 bis 16 zeigt der nach 8 bis 8,5 Minuten nachgewiesene Scheitelpunkt einen Komplex von sTSHR mit ¹²⁵I-TSH an, der nach 10,5 Minuten nachgewiesene Scheitelpunkt zeigt ¹²⁵I-TSH an, und der nach 12 Minuten nachgewiesen Scheitelpunkt zeigt ¹²⁵I an. In dem Fall des sTSHR mit der Signalsequenz des Baculovirus gp 67-Proteins wie in Beispiel 6 oder 7 beschrieben (Nr. 5 oder 6 in 1), wurde ein Scheitelpunkt, der einen Komplex des Rezeptors enthalten in der Kulturüberstandsfraktion mit dem ¹²⁵I-TSH anzeigt, nachgewiesen, wenn sie gemischt wurden (11 und 13), aber dieser Scheitelpunkt wurde nicht nachgewiesen, wenn bTSH zugegeben wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass der sTSHR der vorliegenden Erfindung eine Affinität für TSH hat.
Andererseits, wurde in dem Fall des in der Zellextraktfraktion enthaltenen sTSHR ein zu dem vorhergehenden ähnlicher Scheitelpunkt nicht nachgewiesen, wenn er mit ¹²⁵I-TSH gemischt wurde (12 und 14). Ebenfalls wurde in dem Fall des sTSHR mit der humanen TSHR-Signalsequenz, wie in Beispiel 5 beschrieben (Nr. 4 in der 1), der sowohl in der Kulturüberstandsfraktion als auch der Zellextraktfraktion erhalten war, ein Scheitelpunkt, der einen Komplex von sTSHR mit ¹²⁵I-TSH anzeigt, nachgewiesen, wenn er mit ¹²⁵I-TSH gemischt wurde (15 und 16). Es ist aus diesen Ergebnissen ersichtlich, dass der sTSHR mit der Signalsequenz des Baculovirus gp 67-Proteins und der in die Kulturüberstandsfraktion sekretiert wird, eine Affinität für TSH hat.
Diese Anmeldung basiert auf den Japanischen Anmeldungen Nr. Hei 11-236983, eingereicht am 24. August 1999 und Nr. 2000-38214, eingereicht am 10. Februar 2000.
Während die Erfindung ausführlich und unter Bezugnahme auf die spezifischen Ausführungsformen davon beschrieben wurde, wird es für den Fachmann deutlich sein, das verschiedene Änderungen und Modifikationen darin erfolgen können, ohne vom Umfang davon abzuweichen.
Ein rekombinanter löslicher humaner Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon mit einem extrazellulären Domänenrest eines humanen Rezeptors für das thyroideastimulierende Hormon, oder eine Mutante davon, der sekretorisch ist, und Reaktivität mit einem Autoantikörper für den humanen Rezeptor des thyroideastimulierenden Hormons hat; eine Zusammensetzung für die Untersuchung eines Antikörpers gegen den humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon mit dem Rezeptor und ein Trägerstoff oder Verdünnungsmittel; ein Verfahren für die Untersuchung eines Antikörpers gegen den humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon mit Reaktion eines Antikörpers gegen den humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon mit dem Rezeptor; und ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten löslichen humanen Rezeptors für das thyroideastimulierende Hormon, welcher sekretiert wird und Reaktivität mit einem Autoantikörper gegen den humanen Rezeptor des thyroideastimulierenden Hormons hat, mit Infektion von Insektenzellen mit einem rekombinanten Baculovirus mit einem eingeführten extrazellulären Domänenrest eines Gens, das einen humanen Rezeptor das thyroideastimulierende Hormon kodiert, oder eine Mutante davon, und Kultivierung der infizierten Zellen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinanter, löslicher humaner Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon, mit einem extrazellulären Domänenrest eines humanen Rezeptors für das thyroideastimulierende Hormon, oder eine Mutante davon, erhältlich durch Expression eines humanen TSHR-Gens, welches 390 Aminosäurereste von der 21. bis 410. Aminosäure vom N-Therminus eines nativen humanen Rezeptors für das thyroideastimulierende Hormon kodiert, in Hi-five-Zellen, und welcher in den extrazellulären Raum der Zellen sekretiert wird und Reaktivität mit einem Autoantikörper gegen den humanen Rezeptor des thyroideastimulierende Hormons und eine Affinität für ein thyroideastimulierendes Hormon hat, wobei N-Zuckerketten mit Fucose-modifizierten reduzierenden Endseiten zu dem Rezeptor hinzugefügt sind.
Rezeptor nach Anspruch 1, welcher 395 Aminosäurereste von der 21. bis 415. Aminosäure vom N-Terminus des nativen humanen Rezeptors für das thyroideastimulierende Hormon umfasst.
Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 2, welcher die Aminosäurereste von der 338. bis 366. Aminosäure vom N-Terminus eines nativen humanen Rezeptors für das thyroideastimulierende Hormon umfasst, welche wenigstens einer Mutation ausgewählt aus Deletion, Substitution, Insertion und Addition unterzogen sind.
Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, welcher die Aminosäurereste von der 352. bis 356. Aminosäure vom N-Terminus eines nativen humanen Rezeptors für das thyroideastimulierende Hormon umfasst, welche wenigstens einer Mutation ausgewählt aus Deletion, Substitution, Insertion und Addion unterzogen sind.
Rezeptor nach Anspruch 1, welcher die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR. 17 hat
Rezeptor nach Anspruch 2, welcher die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR. 18 hat.
Rezeptor nach Anspruch 1 mit einer relativen Molekülmasse von 58 kDa.
Rezeptor nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Signalsequenz des gp 67 Proteins von Baculovirus an das 5'-Ende angefügt ist.
Zusammensetzung für die Untersuchung eines Antikörpers gegen den humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon, umfassend den Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen Träger oder ein Verdünnungsmittel.
Verfahren für die Untersuchung eines Antikörpers gegen den humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon, umfassend die Reaktion eines Antikörpers gegen den humanen Rezeptor für das thyroideastimulierende Hormon mit dem Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten löslichen humanen Rezeptors für das thyroideastimulierende Hormon definiert nach Ansprüchen 1 bis 8, umfassend die Infektion von Hi-five-Zellen mit einem rekombinanten Baculovirus, in das ein Teil der extrazellulären Domäne des Gens eingefügt wurde, das für den humanen Rezeptor des thyroideastimulierende Hormons oder einer Mutante davon kodiert, und Kultivierung der infizierten Zellen.