ES2292493T3 - Metodo inmunoenzimatico de cuantificacion. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo policlonal para uso diagnóstico, caracterizado por el hecho de que reconoce la región que comprende los aminoácidos H486-S496 de PTEC, pero no reconoce el péptido PTECDelta16, concretamente PTEC sin motivo de fijación de ésteres de colesterol, caracterizado por el hecho de que dicho anticuerpo se produce después de unir el péptido consistente en Cys His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser de PTEC (siendo H486-S496 la secuencia ID-5) a la proteína transportadora de KLH.
Description
Método inmunoenzimático de cuantificación.
Ámbito del invento: El presente invento hace
referencia a Pruebas de laboratorio creadas para detectar y
cuantificar la proteína transferidora de ésteres de colesterol
(PTEC) contenida en muestras biológicas y sintéticas para uso
clínico, con objeto de evaluar el riesgo de aterogénesis y para su
uso en investigaciones relacionadas con la PTEC, aportándose en
particular un anticuerpo policlonal para uso diagnóstico.
Antecedentes: En la década de 1970 se estableció
una correlación definitiva entre los niveles y tipos de
lipoproteínas y la cardiopatía. Se ha observado que los altos
niveles de lipoproteínas de baja densidad (LDL) pueden ocasionar un
aumento en la incidencia de la cardiopatía, y que la demora en la
eliminación de estas partículas prolonga su tiempo de permanencia
en el plasma, las expone a modificaciones estructurales e incrementa
su interacción con las paredes arteriales. Además, las alteraciones
de la apoliproteína B (Apo B) reducen la capacidad de estas
partículas para fijarse a sus receptores, siendo por tanto
mayormente reconocidas por los receptores macrofágicos. La
incapacidad de los macrofágicos para regular la asimilación de las
LDL ocasiona una acumulación de ésteres de colesterol y la
formación de células espumosas, fenómeno éste que favorece la
aparición de la aterogénesis.
La ateroesclerosis es un fenómeno que comienza
en la infancia y la adolescencia y persiste toda la vida. Sus
consecuencias, como la oclusión arterial y sus conocidas
manifestaciones clínicas (infarto agudo de miocardio, accidentes
vasculares cerebrales, gangrena de las extremidades inferiores,
etc.), empiezan muchos años antes de que se detecten con la
alteración de las paredes vasculares. Algunos pacientes con niveles
lípidos séricos superiores a lo normal también presentan una mayor
incidencia de este tipo de enfermedad, como es el caso de los
diabéticos, nefrópatas o hiperlipidémicos congénitos, entre muchos
otros. Para detectar la posibilidad de que a estos pacientes se les
declare la ateroesclerosis y sus manifestaciones clínicas, se
evalúan los llamados "factores de riesgo coronario". Estos
factores indican el grado de exposición del individuo a
circunstancias susceptibles de determinar un mayor riesgo de
presentar enfermedades relacionadas con esta posibilidad; es decir,
sirven para determinar el riesgo de aterogénesis. Los factores de
riesgo coronario son como sigue:
\bullet Concentración elevada de lipoproteínas
y colesterol total de baja densidad
\bullet Tensión arterial alta
\bullet Tabaquismo
\bullet Diagnóstico de cardiopatía
isquémica
\bullet Hipoalfalipoproteinemia (bajos niveles
de lipoproteínas de alta densidad o HDL)
\bullet Diabetes
\bullet Obesidad
\bullet Antecedentes familiares de cardiopatía
prematura
\bullet Sexo masculino
\bullet Proteinuria
\bullet Hipertrigliceridemia.
Para comprobar si el paciente está expuesto a
los factores de riesgo de la enfermedad coronaria se realizan
entrevistas guiadas, exploraciones, determinaciones de lipidogramas,
electrocardiogramas y radiografías torácicas. Si se sospecha una
insuficiencia vascular periférica, se incluyen arteriografías y
ecografías Doppler.
Los elementos considerados en esta evaluación se
utilizan para la detección y el seguimiento de pacientes incluidos
en los llamados "grupos de riesgo", compuestos por individuos
que, debido a diferentes patologías, presentan uno, varios o todos
los factores de riesgo coronario. Sin embargo, hay un gran número de
personas en peligro de aterogénesis sin detectar detectado porque
todavía no presentan las manifestaciones clínicas correspondientes
y, por tanto, no están incorporadas a los grupos de riesgo. Como no
hay un diagnóstico temprano de estos individuos, se pierden muchos
años valiosos de prevención y, cuando las manifestaciones clínicas
acaban apareciendo, el daño suele ser irreversible.
Además, los estudios que evalúan los factores de
riesgo de aterogénesis, basándose en la concentración de
lipoproteínas en el plasma de los pacientes incluidos en algún grupo
de riesgo, son inconsistentes. Después están los pacientes
incluidos en los grupos de riesgo que no presentan la descripción
clínica típicamente indicativa del riesgo de aterogénesis, como
evolución sin dolor con sólo una sensación de fatiga y falta de
aire, y los que pasan inadvertidos porque se confunden sus síntomas
con diversas patologías. En consecuencia, es preciso ampliar el
reconocimiento del paciente, buscando manifestaciones atípicas.
También están los casos en que, aunque un
individuo se halle expuesto a factores de riesgo, no se le
manifiesta la ateroesclerosis. No todos los factores evaluables
para determinar el riesgo de aterogénesis son fidedignos. Algunos
de los más comentados se incluyen en el lipidograma, como los altos
niveles de colesterol total y LDL, y los bajos niveles de HDL en la
sangre, que sirven para calcular el índice aterógeno. Este índice es
un parámetro arbitrario, considerado poco fiable para evaluar el
riesgo de aterogénesis, según se ha comprobado experimentalmente.
Así, por ejemplo, en pruebas con conejos sometidos a dietas altas en
colesterol durante períodos largos se obtuvieron altos niveles de
colesterol total, colesterol libre, colesterol esterificado y
colesterol asociado a las LDL, bajos niveles de colesterol asociado
a las HDL, hipertrigliceridemia, un alto porcentaje de
esterificación y un alto índice aterógeno; sin embargo, no
presentaron aterogénesis.
En conclusión, el método utilizado actualmente
para evaluar el riesgo de aterogénesis presenta limitaciones
graves. En primer lugar está la limitación del tamaño y el tipo de
población con probabilidad de ser evaluada, debido a la inversión
en tiempo y dinero precisa para las pruebas diagnósticas, lo cual
dificulta la detección temprana de los individuos en peligro de
aterogénesis que aún no se hallan en grupos de riesgo, y resta
eficacia a la prevención de sus complicaciones. Segundo, aunque los
parámetros diagnósticos utilizados ofrezcan un grado de
certidumbre, casi todos son cualitativos; y algunos de carácter
cuantitativo, los más importantes, son objeto de discusión en la
actualidad y, por tanto, sólo puede hablarse de "una fuerte
sospecha clínica de riesgo de ateroesclerosis", dado que los
resultados no son completamente fidedignos. Tercero, poco se sabe
sobre la homeostasis de lípidos en los humanos, y en los mamíferos
en general, y no ha sido posible demostrar la existencia de una
relación clara entre muchos de los parámetros considerados como
factores de riesgo de aterogénesis y sus manifestaciones clínicas,
por lo cual la determinación de dicho riesgo no puede asentarse en
bases sólidas sin una auténtica comprensión de los factores que
intervienen en la aterogénesis y de sus manifestaciones
clínicas.
Hay otros factores de posible utilidad para
demostrar el riesgo de aterogénesis de una manera más fidedigna,
como la determinación de los niveles de la proteína transferidora de
ésteres de colesterol (PTEC) en el plasma. Esta proteína se ha
estudiado mucho y, de todos los factores que intervienen en la
homeostasis de los lípidos, es uno de los más conocidos. La PTEC
desempeña un cometido importante en el metabolismo de las
lipoproteínas y en la aparición de la enfermedad coronaria
arterial, por cuanto tiende a generar altos niveles de LDL y de
lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) que se asocian a la
evolución de la ateroesclerosis (Marotti-KR,
Castle-CK, Boyle-TP,
Lin-AH, Murray-RW y
Melchior-GW, 1993, Nature
364(6432):73-5). La PTEC es una proteína
multifuncional que fomenta el intercambio de ésteres de colesterol
entre las HDL y las LDL y el intercambio de ésteres de colesterol y
triacilgliceroles entre las HDL y las VLDL; su efecto en el
catabolismo de las HDL influye en su contenido de ésteres de
colesterol y en su composición, tamaño y estructura esférica
(Rye-KA, Hime-NJ y
Barter-PJ, 1995. J. Biol. Chem.
270(1):
189-196) (Bruce-C, Chouinerd-RA y Tall-AR, 1998, Annu. Rev. Nutr. 18:297-330).
189-196) (Bruce-C, Chouinerd-RA y Tall-AR, 1998, Annu. Rev. Nutr. 18:297-330).
La PTEC también participa en la reutilización
del colesterol depositado en los tejidos periféricos durante la
lipólisis de las lipoproteínas (Jiang-XC,
Moulin-P, Quinet-E,
Goldberg-IJ, Yacoub-LK,
Agellon-LB, Compton-D,
Schnitzer-Polokoff-R y
Tall-AR, 1991. J. Biol. Chem.
266(7):4631-9) (Nagashima-M,
McLean-J y Lawn-R, 1988, J.
Lipid. Res. 29:1643-1649)
(Tall-A, 1995, Annu. Rev. Biochem.
64:235-257). Este transporte, al que damos el
nombre de "transporte inverso del colesterol", confiere a la
PTEC el carácter de proteína antiaterógena, y de ahí su importancia
en la propensión o resistencia a la ateroesclerosis
(Kondo-I, Berg-K,
Drayna-D, Lawn-R, 1989, Clin.
Genet. 35(1): 49-56)
(Bruce-C, Chouinerd-RA y
Tall-AR, 1998, Annu. Rev. Nutr.
18:297-330). De acuerdo con lo anterior, el factor
determinante de su capacidad antiaterógena no es el nivel de las
HDL del plasma, sino la distribución de los tamaños de su población,
que presenta una sólida correlación con los niveles de la PTEC
(Brown-ML, Inazu-A,
Hesler-CB, Agellon-LB,
Mann-C, Whitlock-ME,
Marcel-YL, Milne-RW,
Koizumi-J, Mabuchi-H, 1989,
Nature 342(6248):
448-51).
448-51).
En trabajos experimentales se ha observado que
las especies mamíferas carentes de PTEC por naturaleza son
resistentes a la aparición de la cardiopatía arterial.
Por el contrario, en individuos transgénicos de
estas mismas especies que expresan PTEC puede observarse una
disminución del tamaño y de los niveles de HDL. En consecuencia, la
expresión de PTEC aumenta la propensión a sufrir cardiopatía
arterial atribuible a la dieta (Rye-KA,
Hime-NJ y Barter-PJ, 1995, J.
Biol. Chem. 270(1): 189-196). De
manera similar, se ha observado que los humanos con deficiencia
genética de PTEC presentan niveles de HDL mucho más altos que los
de los individuos normales (hipoalfalipoproteinemia). Estos
individuos parecen tener una incidencia menor de cardiopatía
(Inazu-A, Quinet-EM,
Wang-S, Browun-ML,
Stevenson-S, Barr-ML,
Moulin-P y Tall-AR, 1992,
Biochemistry 31(8):2352-8). Sin
embargo, los ratones transgénicos con hipertrigliceridemia que
expresan PTEC están protegidos contra la aterogénesis
(Homanics-GE, de Silva-HV,
Osada-J, Zhang-SH,
Wong-H, Borensztajin-J y
Maeda-N, 1995, J. Biol. Chem.
269:16376-16382).
De acuerdo con lo anterior, el carácter
aterógeno o antiaterógeno de la PTEC se establece en correlación con
el nivel de HDL y puede actuar como agente aterógeno mediante el
aumento de los niveles de lipoproteínas de baja densidad,
eliminando ésteres de colesterol de HDL para incorporarlos a LDL y
VLDL. El carácter antiaterógeno de la PTEC se basa en su capacidad
para acelerar la transferencia del colesterol presente en los
tejidos periféricos a fin de incorporarlo a las HDL; es decir,
contrarrestando el efecto aterógeno a través del "transporte
inverso del colesterol". En consecuencia, podemos afirmar que,
al evaluar los niveles de PTEC en correlación con la distribución
de tamaños y contenidos de colesterol de las HDL, es posible
establecer su capacidad aterógena o antiaterógena junto con el
riesgo de aterogénesis en todos los tipos de dislipidemias.
Partiendo del resultado de esta prueba, puede establecerse si es
necesario proseguir con la evaluación de los restantes factores de
riesgo. También puede realizarse el seguimiento de pacientes
diagnosticados, evaluando la eficacia de los programas de
prevención o, si procede, la eficacia de dietas y/o
tratamientos.
Aunque existen referencias a otros sistemas de
cuantificación de la PTEC contenida en el plasma, hasta la fecha,
debido al tipo de equipo necesario, sólo se han establecido métodos
de uso limitado por su complejidad técnica. Tal es el caso de la
patente estadounidense US-05.770.355, registrada por
Brocia, Robert W. en abril de 1998 con el título de "Equipo de
pruebas cardiopáticas y método para determinar el factor de riesgo
cardiopático y la eficacia del tratamiento de las cardiopatías".
Esta patente requiere la síntesis de una partícula artificial y el
uso de colesterol unido a una molécula fluorescente, lo cual limita
su uso a laboratorios provistos del equipo necesario para medir la
fluorescencia.
K. Saito et al: "Epitope mapping for
the anti-rabbit cholesterol ester transfer protein
monoclonal antibody that selectively inhibits triglyceride
transfer", Journal of Lipid Research vol. 40, agosto de
1999, páginas 2013-2021, revela que los segmentos
del terminal carboxílico de la PTEC (E465-S473) de
humanos, y K485-S493 de conejos, ambos extendidos
por al menos un residuo (sin especificar) más allá del terminal
aminoácido o carboxílico, son responsables de la transferencia del
éster de colesterol y de triglicérido.
La patente W0-36.139.168 revela
un método para aumentar el colesterol HDL en un mamífero mediante el
estímulo de una respuesta inmunitaria que inhibe las funciones de
la PTEC. Se acoplaron péptidos de PTEC a portadores como la
hemocianina de lapa californiana (KLH) o la ovoalbúmina, para
aumentar la inmunogenia. Entre los epítopos utilizados se menciona
el denominado H486-S496 de la PTEC acoplado a KLH
(véase la reivindicación 5 y el Ejemplo 2 de la página 9, segundo
párrafo).
El objeto subyacente del presente invento es
aportar medios para detectar y cuantificar niveles de PTEC en
muestras biológicas y sintéticas de una forma sencilla y rápida que
permita mejorar la detección, el diagnóstico y el seguimiento de
individuos en riesgo de ateroesclerosis, incluso en ausencia de
manifestaciones clínicas relacionadas con esta patología y aunque
no estén incorporados a grupos de riesgo. Esto se logrará mediante
la incorporación del presente sistema a protocolos y equipos
utilizados habitualmente en laboratorios clínicos humanos y
veterinarios.
En la figura 1 se muestran pruebas del tipo
inmunotransferencia con uso del anticuerpo policlonal
anti-PTEC H486-S496 contra plasma
humano (vía A) y plasma de conejo (vía B). El anticuerpo policlonal
anti-PETC H486-S496 reconoce la
PTEC de -67 kDa; en pruebas efectuadas con extractos brutos
procedentes de lípidos y tejidos perfundidos se obtuvo exactamente
el mismo resultado; para descartar la posibilidad de falsos
positivos en los que el anticuerpo reconoce la albúmina del plasma,
en todas las pruebas se incluyeron controles contra la albúmina
sérica bovina (BSA) (vía C). Como el resultado de estos controles es
negativo, el anticuerpo policlonal reconoce la PTEC
específicamente;
En la figura 2 se presenta un gráfico cuyos
valores de la curva típica se obtuvieron utilizando péptido
sintético H486-S496 y el resultado de la
cuantificación de la PTEC en 25 muestras de plasma humano. Según
estos resultados, los niveles de PTEC contenidos en el grupo de
muestra oscilan entre 2 y 3 \mug/ml, equivalentes a
28-31 pM/ml. Estos resultados se obtuvieron con
este sistema de cuantificación de la PTEC.
Secuencia ID-1. Secuencia de
oligonucleótidos codificantes, compatible con los oligonucleótidos
no codificantes de la secuencia ID-2 en
multiplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Se
corresponde con la secuencia procedente de las bases 1391 a 1414
del exón 15 del ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de la PTEC.
Tiene una longitud de 24 nt, un contenido del 45,8% de
guanina-citosina (G-C) y una
temperatura de fusión de 55,9ºC.
Secuencia ID-2. Secuencia de
oligonucleótidos no codificantes, compatible con los
oligonucleótidos codificantes de la secuencia ID- en
multiplicaciones de la RCP. Es complementaria de la secuencia
procedente de las bases 1852 a 1828 del exón 16 del ARNm de la
PTEC. Tiene una longitud de 25 nt, un contenido del 48,0% de
G-C y una temperatura de fusión de 55,3ºC.
Secuencia ID-3. Secuencia de
nucleótidos del fragmento de PTEC recuperado del clon
pMosBlue/PTEC3' y subclonado en pGex-2T,
para generar el clon pGex-2T/PTEC3'. Al subclonar el
fragmento de PTEC, tres nucleótidos del vector pMos (subrayado) se
transportan de tal manera que el clon pGex-2T/PTEC3'
incluye estos nucleótidos entre la región codificadora de
glutatión-S transferasa (GST) y la codificadora de
PTEC.
Secuencia ID-4. Secuencia de
aminoácidos correspondiente a la sección PTEC de la proteína
genotecnológica GST/PTECCOH, codificada por el clon
pGex2T-PTEC 3'. Esta secuencia corresponde a los 33
residuos últimos de su terminal carboxílico, desde 1464 a S495, que
comprende los residuos F481, L488, F491 y L495, importantes para
mantener la actividad de transferencia de ésteres de colesterol
(Tall-A, 1995, Annu. Rev. Biochem.
64:235-257). Este epítopo tiene un alto contenido de
estructura de hélice \alpha y comprende la totalidad del motivo
fijador de ésteres de colesterol (desde G473 hasta S496)
(Matsunaga-A, Araki-K,
Moriyama-K, Handa-K,
Arakawa-F, Nishi-K,
Sasaki-J y Arakawa-K, 1993,
Biochem. Biophys. Acta. 1166(1):131-4)
(Wang-S, Wang-X,
Deng-L, Rassart-E,
Milne-RW, Tall-AR, 1993, J.
Biol. Chem. 268(3): 1955-9). El peso
molecular (PM), el punto isoeléctrico (PI) y la carga a pH7 se
obtuvieron con ayuda del programa DANstar (Lasergene).
Secuencia ID-5. Secuencia del
péptido PTEC sintético H486-S496, diseñado para la
producción del anti cuerpo policlonal IgY anti-PETC
H486-S496. Este péptido tiene un residuo de cisteína
en el extremo "N" que se utiliza para unirlo a la proteína
transportadora. La estructura secundaria, recogida en un informe de
Tall-A (1995), Annu. Rev. Biochem.
64:235-257, la hemos confirmado mediante los
algoritmos de Chou-Fasman y
Garnier-Robson. El péptido comprende tres de los
cuatro residuos que revisten especial importancia para conservar la
capacidad de fijación a lípidos neutros, concretamente los F481,
L488, F491 y L495, indicados con letras negras. Los datos del peso
molecular (PM), el punto isoeléctrico (PI) y la carga a pH7 se
obtuvieron con ayuda del programa DANstar (Lasergene); el valor pH
con el que el péptido se hace soluble en agua se obtuvo
experimentalmente.
El presente invento, descrito en la
reivindicación 1, el equipo de la reivindicación 12, el método de
las reivindicaciones 8 y 11, y el uso de la reivindicación 8, así
como las presentes formas de realización, reflejan un sistema para
detectar y cuantificar PTEC. El uso del presente sistema permite
identificar, evaluar y realizar el seguimiento de pacientes con
dislipidemias, cuyos efectos están relacionados con alteraciones del
nivel de la PTEC presente en el plasma, para evaluar su riesgo de
ateroesclerosis. El presente sistema se ha diseñado para uso en
prácticas clínicas y/o investigaciones relacionadas con la PTEC.
Pueden utilizarse muestras de orígenes diferentes, tanto biológico
como sintético, preferiblemente plasma o suero, extractos celulares
o procedentes de tejidos, medios de cultivo y antígenos purificados
o semipurificados.
La proteína GST/PTECCOH tiene un peso aproximado
de 67 kDa, de los cuales 3,7 kDa corresponden al terminal
carboxílico de la PTEC, y el resto al glutatión-S
transferasa. La proteína GST/PTECCOH se ha diseñado para utilizarla
tanto en pruebas ELISA como de inmunotransferencia, a modo de patrón
que permite identificar y cuantificar PTEC mediante el uso de
anticuerpos dirigidos específicamente contra su terminal
carboxílico.
La secuencia de la sección correspondiente a la
PTEC, en la proteína fusionada GST/PTECCOH, se presenta como una
secuencia ID-4. Ésta abarca los 33 residuos últimos
del terminal carboxílico de la PTEC, desde 1464 hasta S495, tiene
un elevado contenido de estructura de hélice \alpha y comprende la
totalidad del motivo fijador de ésteres de colesterol (desde G473
hasta S496). En el diseño del patrón para las pruebas ELISA y de
inmunotransferencia se escogió el extremo carboxílico de la PTEC
porque comprende residuos P481, L488, F491 y L495 y porque se ha
demostrado experimentalmente que estos residuos revisten especial
importancia para mantener la actividad de transferencia de ésteres
de colesterol (Wang-S, Kussie-P,
Deng-L y Tall-A, 1995, J. Biol.
Chem 270(2):612-618),
(Jiang-X, Bruce-C,
Cocke-T, Wang-S,
Boguski-M y Tall-A, Biochem.
34:7258-7263) (Matsunaga-A,
Araki-K, Moriyama-K,
Handa-K, Arakawa-F,
Nishi-K, Sasaki-J y
Arakawa-K, 1993, Biochem. Biophys. Acta
1166(1): 131-4) (Wang-S,
Wang-X, Deng-L,
Rassart-E, Milne-RW,
Tall-AR, 1993, J. Biol. Chem.
268(3):1955-9). De este modo, la
cuantificación de PTEC sólo tendrá como patrón el carboxilo de PTEC
que comprende los puntos necesarios para mantener su capacidad de
fijación a los ésteres de colesterol.
Otra ventaja de utilizar este patrón es que no
precisa la purificación de la PTEC procedente de fuentes naturales.
La purificación de la proteína genotecnológica es más sencilla y
rápida que la de la PTEC procedente de plasma; puede obtenerse más
proteína genotecnológica de cultivos bacterianos que PTEC de plasma;
la pureza de los preparados genotecnológicos es superior a la de
las purificaciones del plasma, y una mayor pureza reduce el riesgo
de falsos positivos y cuantificaciones erróneas. La generación de
proteínas genotecnológicas puede realizarse en condiciones
controladas, a diferencia de las muestras biológicas, que dependen
de una gran cantidad de variables, incontrolables en su mayoría.
Finalmente, la proteína genotecnológica únicamente induce el extremo
carboxílico, y por tanto no sólo evita una reacción cruzada contra
otras proteínas, sino también contra otros epítopos de
PTEC.
PTEC.
El sistema de detección y cuantificación de PTEC
requiere el uso de un anticuerpo específicamente dirigido contra el
punto de fijación de lípidos neutros para garantizar que sólo se
detecte la PTEC que conserve este epítopo y que por consiguiente
conserve la capacidad de fijación a lípidos neutros, incluidos los
ésteres de colesterol. Debemos añadir aquí que, hasta ahora, se han
dado a conocer numerosas mutaciones y ediciones alternativas de
ésteres de colesterol, la mayoría de las cuales no se traducen, o se
traducen en proteínas que no segregan plasma. Sólo una de estas
variaciones de PTEC, procedente del exón nueve (PTEC\Delta9), se
segrega deficientemente en el medio extracelular
(Quinet-E, Yang-TP,
Marinos-C y Tall-A, 1993, J.
Biol. Chem 268(23):16891-16894).
Pese a la inactividad de esta versión del
PTEC\Delta9 en la transferencia de lípidos, conserva el epítopo
fijador de lípidos neutros y por tanto es detectable mediante el
anticuerpo anti-PTEC H486-S496; sin
embargo, como se sabe que se segrega deficientemente en el medio
extracelular y no se conoce su presencia en el plasma, su efecto en
la cuantificación de PTEC mediante este sistema será mínimo o
nulo.
No obstante, durante los trabajos previos al
presente documento localizamos otra versión de PTEC sin el motivo
de fijación de ésteres de colesterol (PTEC\Delta16), y por tanto
sin capacidad para la fijación de lípidos neutros. Esta versión de
PTEC\Delta16 se encuentra en grandes cantidades en el plasma y
podría ser detectada por anticuerpos dirigidos contra cualquier
epítopo de la versión original de PTEC, excepto los anticuerpos
dirigidos contra el motivo de fijación de ésteres de colesterol.
Por consiguiente, el anticuerpo generado para
este sistema no debería reconocer la cuantificación de la variedad
PTEC\Delta16 y debería evitar la generación de anticuerpos
dirigidos contra cualquier otra proteína presente en el plasma de
mamífero y contra cualquier otro epítopo PTEC; además, es una medida
de seguridad que evita falsos positivos y cuantificaciones
erróneas. Por esta razón se descartó su uso como antígeno para
completar PTEC purificada de cualquier especie de mamífero, y en su
lugar se diseñó un péptido sintético como antígeno. Un péptido
sintético puede obtenerse con un alto grado de pureza y, según como
se diseñe, permite generar anticuerpos contra un epítopo
específico.
Para diseñar este péptido se secuenció el
producto transcriptasa inversa-reacción en cadena de
la polimerasa (TI-RCP), multiplicado con un par de
oligonucleótidos provistos de secuencias ID-1 e
ID-2. Esta secuencia se trasladó a una secuencia de
aminoácidos y se analizó con ayuda del programa DNAstar (Lasergene),
del cual se obtuvo la previsión del índice de hidrofobicidad del
tipo Kyte-Doolittle, y la estructura secundaria con
los algoritmos de Chou-Fasman y
Garnier-Robson.
Partiendo de esta información y de las
características requeridas para el presente sistema de
cuantificación de PTEC, diseñamos el péptido sintético, teniendo en
cuenta las consideraciones siguientes:
Debe incluirse en el motivo de fijación de
lípidos neutros. Es decir, en los 26 residuos últimos del
carboxilo PTEC (Wang-S, Deng-L,
Milne-RS y Tall-AR, 1992, J.
Biol. Chem. 267(25):17487-17490). De este
modo, el anticuerpo sólo puede reconocer la versión de PTEC que
comprende este epítopo.
Debe comprender el mayor número posible de
residuos considerados importantes para mantener la capacidad de
fijación de lípidos. Los residuos de F481, L488, F491 y L495,
importantes en la actividad de transferencia de ésteres de
colesterol, figuran entre los 26 aminoácidos del motivo de fijación
de lípidos (Tall-A, 1995, Annu. Rev.
Biochem. 64:235-257). Con esto, no sólo
centramos el reconocimiento del anticuerpo contra el motivo de
fijación de lípidos neutros, sino también contra los residuos de
máxima importancia para el mantenimiento de esta capacidad.
Su secuencia no presenta homología con otros
epítopos de PTEC ni con otras proteínas expresadas en mamíferos o
gallinas. Aunque pueden obtenerse anticuerpos utilizando
cualquier modelo animal que no exprese PTEC, para el anticuerpo que
requiere este sistema es preferible recurrir a las gallinas y
asegurar así una fuerte respuesta inmunitaria, debido a la
diferencia filogénica. Por esta razón, el diseño del péptido no debe
permitir la homología con proteínas expresadas en las gallinas. Por
otra parte, el anticuerpo sólo debe reconocer PTEC y únicamente en
un epítopo, por lo cual el péptido sintético no deberá tener
homología con otras proteínas ni con ningún otro epitopo de
PTEC.
Su tamaño debe permitir el mínimo número
posible de márgenes de reconocimiento por el sistema
inmunológico. Un péptido que cumpla esta condición permite
generar anticuerpos policlonales capaces de reconocer epítopos
específicos con exactitud igual o superior a la de un anticuerpo
monoclonal.
Debe tener un residuo de cisteína en su
extremo "N", para dirigir su fijación hacia la proteína
transportadora. Un residuo de cisteína en el extremo "N"
del péptido permite dirigir su fijación hacia una proteína
transportadora, a fin de que queden expuestos todos los márgenes de
reconocimiento del sistema inmunológico.
Debe estar en una región cuya respuesta
inmunitaria se haya demostrado. En trabajos anteriores se
demostró que el extremo carboxílico de la PTEC humana genera una
respuesta inmunitaria que obtiene un anticuerpo monoclonal contra
este motivo (Swenso-T, Hesler-CB,
Browun-ML, Quinet-E,
Trotta-PP, Haslanger-MF,
Gaeta-FC, Marcel-yl,
Miline-RW y Tall-AR, 1989, J.
Biol. Chem. 264:14318-14326). Sin embargo, no
se han determinado los márgenes de reconocimiento de este
anticuerpo dentro de los 26 aminoácidos que comprenden este epítopo.
Por ello, al no poder descartar la posibilidad de que existan
márgenes no antigénicos en este epítopo y de que uno de ellos
coincida con la secuencia de péptido sintético diseñada por
nosotros, nuestro diseño se comprobó experimentalmente.
De acuerdo con lo anterior, diseñamos el péptido
sintético PTEC H486-S496, cuya secuencia se expresa
como secuencia ID-5, y que tiene las
características siguientes: La secuencia del péptido se encuentra
inserta en el motivo de fijación de ésteres de colesterol y
corresponde a la secuencia de residuos H486 a S496 de PTEC de
conejo; es decir, los once residuos últimos de la proteína, siendo
por tanto incapaz de reconocer la versión PTEC\Delta16. Su
secuencia comprende tres de los cuatro residuos que revisten
especial importancia para el mantenimiento de la unión fijadora de
lípidos: L488, F491 y L495. La secuencia del péptido sintético no
tiene homología con otros epítopos de PTEC ni con otras proteínas de
mamíferos o gallinas; en cambio, presenta una elevada homología con
el terminal carboxílico de la PTEC de varias especies: 100% con
conejos, humanos y monos, y 20% con el hámster. Como este péptido
consta de sólo once residuos, únicamente presenta un margen de
reconocimiento al sistema inmunitario. Se agregó un residuo de
cisteína a la secuencia de PTEC original, para dirigir la fijación
hacia la proteína transportadora. La capacidad antigénica del
péptido sintético PTEC H486-S496 se demostró
mediante la obtención del anticuerpo policlonal
anti-PTEC H486-S496.
A fin de obtener el anticuerpo policlonal
anti-PTEC H486-S496, el péptido PTEC
H486-S496 se unió a la proteína transportadora de
KLH. Se utilizó KLH en lugar de seroalbúmina bovina para evitar la
generación de anticuerpos capaces de reconocer la albúmina presente
en el plasma, ocasionando falsos positivos y cuantificaciones
erróneas en los resultados de las pruebas. Los anticuerpos se
obtienen en animales modelo, preferiblemente en gallinas blancas
LEGHORN inoculadas subcutáneamente una vez a la semana según el
protocolo normal de 63 días. El valor de los anticuerpos del plasma
se determina mediante la técnica ELISA. Las inmunoglobulinas G (IgG)
de los huevos se aíslan. Si se utilizan otros animales modelo, se
aíslan las IgG del plasma. Aunque este anticuerpo puede obtenerse
de varios animales modelo que no expresan PTEC, el valor del
obtenido en las gallinas será mucho más alto.
Debe señalarse que, por causa del diseño del
péptido sintético utilizado como antígeno, el anticuerpo policlonal
generado para este sistema únicamente reconoce residuos H486 a S496
presentes en el motivo de fijación de ésteres de colesterol. Este
epítopo comprende tres de los cuatro residuos que revisten especial
importancia para el mantenimiento de la capacidad fijadora de
lípidos: L488, F491 y L495. Además, por tener un solo margen de
reconocimiento, ofrece mayor exactitud que el anticuerpo monoclonal
mencionado anteriormente. De acuerdo con el diseño del antígeno y
las pruebas experimentales del anticuerpo, no reconoce la versión
PTEC\Delta16, otras proteínas de mamífero o de gallina, ni otros
epítopos de PTEC; pero sí reconoce las PTEC de otras especies,
porque la región escogida en el diseño del antígeno está muy
conservada en varias especies de mamíferos.
El objeto de este sistema es detectar y
cuantificar PTEC en el máximo número posible de muestras, de una
forma sencilla y rápida. Para ello se utiliza el clásico método
ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción). Como patrones de esta
prueba se utiliza la proteína genotecnológica GST/PTECCOH y/o el
péptido sintético PTEC H486-S496. El antígeno de
control y las muestras a cuantificar, preferiblemente plasma o
suero, se unen a la placa ELISA según los procedimientos habituales
de los laboratorios clínicos.
Si se utilizan muestras de plasma o de suero,
preferiblemente se requiere una de 20-5 pl que no
necesite tratamiento previo. El nivel mínimo de detección de este
sistema es 0,018 pM (1 pg) de PTEC, siendo el nivel máximo 360 pM
(20 pg). La curva típica sugerida para el plasma humano y de conejo
es:
(pM/100 \muL)
0,250
0,166
0,125
0,100
0,083
0,071
0,062
0,055
Se recomienda una dilución inicial de plasma o
suero de 1:15.000, 100 \mul por pocillo. Esta dilución deberá
ajustarse, si el nivel de PTEC de la muestra supera los límites de
la curva.
Se utiliza anticuerpo policlonal
anti-PTEC H486-S496 como el de la
reivindicación 1 a modo de anticuerpo primario exclusivamente para
detectar el motivo responsable de la fijación de lípidos neutros a
la PTEC, en los patrones y en las muestras. En función del origen
del anticuerpo primario (gallina o mamífero) se escoge el anticuerpo
secundario, preferiblemente comercial, unido a la peroxidasa,
anti-IgY o anti-IgG,
respectivamente. Para utilizar el anticuerpo primario en la técnica
ELISA, la dilución preferible es 1:5000. El anticuerpo secundario
debe ser preferiblemente comercial y unido a la peroxidasa, diluido
como recomiende su fabricante.
El número máximo de muestras admisibles por
duplicado en cada secuencia es 39, en un protocolo que comprenda la
curva típica y un control negativo. Experimentalmente hemos
descartado falsos positivos mediante el uso de una combinación de
controles negativos, pero el control negativo debe incluirse por
duplicado a fin de tener en cuenta el error experimental del
usuario del sistema.
Como la PTEC está muy conservada en los
mamíferos, este sistema es capaz de reconocer PTEC en el plasma de
especies que expresen PTEC de forma natural, o de especies
transgénicas que tengan este gen, a condición de que se conserve la
homología con los 11 residuos últimos del terminal carboxílico. Por
ello, este sistema se utiliza en trabajos clínicos humanos y
veterinarios.
El sistema descrito es la base para el diseño de
un equipo de diagnóstico, de uso rápido y sencillo en la
determinación de niveles de PTEC de gran número de muestras, que no
existe hasta la fecha. El equipo según el presente invento se
define en la reivindicación 12 y está diseñado para uso clínico,
preferiblemente utilizando muestras de plasma o suero procedentes
de especies que expresen PTEC de forma natural, o de especies
transgénicas que posean este gen. Deben conservar la homología en
los 11 aminoácidos últimos del extremo carboxílico.
Este equipo puede adaptarse fácilmente a
muestras de orígenes diferentes, biológicos y sintéticos, tanto para
laboratorios clínicos humanos como veterinarios y para diversos
usos de investigación.
Los componentes de este equipo son:
-PBS 10X
-Amortiguador de fijación, ph 9,6 50 mM
(Na_{2}CO_{3} 35 mM+NaCO_{3} 15 mM+NaN_{3} 20 \mug/ml)
-Amortiguador de
fosfato-citrato
- \quad
- Fosfato de Na- ácido cítrico 0,05 M, pH 5
Proteína genotecnológica GST/PTECCOH
Péptido sintético PTEC
H486-S496
\vskip1.000000\baselineskip
- -Primer anticuerpo
- IgY o IgG Anti-PTEC H486-S496
\vskip1.000000\baselineskip
1. El antígeno de control (GST/PTECCOH y/o PTEC
H486-S496) y la curva típica se diluyen en 100
\mul de amortiguador de fijación.
2. Unir los antígenos y las muestras a la placa
ELISA, incubando durante dos horas a 37ºC.
3. Eliminar los antígenos y bloquear con 200
\mul de ovoalbúmina 0,5 mg/ml, en un amortiguador de carbonato
durante una hora a 37ºC. Al final de la incubación, lavar cuatro
veces con 0,1% de tampón fosfato salino-Tween
(PBST).
4. Incubar con 100 \mul de
anti-PTEC H486-S496, en una dilución
de 1:5000 en PBST, durante una hora, a 37º C. Al final de la
incubación, lavar cuatro veces con PBST.
5. Incubar con 100 \mul del anticuerpo
secundario unido a peroxidasa, anti-IgY o
anti-IgG, según el caso, en la dilución recomendada
por el fabricante en el PBST. Incubar durante una hora a 37ºC. Al
final de la incubación, lavar cuatro veces con PBST y dos veces con
H_{2}O.
6. Desarrollar con 100 \mul de sustrato para
peroxidasa, preferiblemente ortofenilendiamina (OFD), en las
condiciones recomendadas por el fabricante.
7. Incubar durante 20 minutos en la oscuridad,
detener la reacción con 50 \mul de H_{2}SO_{4} 1,5 M para
leer a 490 nm.
Todo el procedimiento se realiza con la placa
ELISA cubierta, evitando las gradientes de temperatura.
Al incluir la cuantificación de PTEC entre los
parámetros para diagnosticar el riesgo de aterogénesis, la
certidumbre del diagnóstico aumenta significativamente por ser un
parámetro cuantitativo que ha sido capaz de establecer una relación
clara con muchos de los parámetros considerados como factores de
riesgo de aterogénesis y sus manifestaciones clínicas. Por esta
razón, a fin de facilitar la implementación del presente sistema en
las clínicas, hemos diseñado el equipo anteriormente descrito. La
facilidad de uso de este equipo permite aplicarlo sistemáticamente
en la práctica clínica, e identificar a individuos que no presentan
manifestaciones clínicas de ateroesclerosis ni figuran en los
grupos de riesgo. Lo anterior facilita la detección de individuos
en riesgo de aterogénesis no diagnosticado o con síndromes atípicos.
Igualmente simplifica el diagnóstico y seguimiento de los
pacientes, así como la evaluación de la eficacia de los tratamientos
que se les dispensen.
Los instrumentos generados en la creación de
este equipo de cuantificación de PTEC admiten usos diversos. Los
oligonucleótidos con secuencias ID-1 e
ID-2 se diseñaron para multiplicaciones por RCP,
pero también pueden utilizarse como sondas moleculares contra
productos ADN y RCP que contengan su secuencia. El oligonucleótido
con secuencia ID-2 también puede utilizarse como
sonda contra el mensajero de la PTEC, pero no así el oligonucleótido
con secuencia ID-1. Ambos pueden ser instrumentos
para futuros trabajos, tanto en investigación como en tratamiento
de pacientes afectados por dislipidemias, relacionados con la
expresión de PTEC.
Los clones pMosBlue/CETP3' y
pGex2T/CETP3' también pueden utilizarse para obtener sondas
específicas contra productos ADN, ARNm y RCR de la PTEC. El clon
pMosBlue/CETP3' puede utilizarse para subclonar el fragmento
ADNc de PTEC en otros vectores con diferentes finalidades, desde la
obtención de sondas y otras proteínas genotecnológicas hasta los
protocolos experimentales para el tratamiento de pacientes afectados
de dislipidemias relacionadas con PTEC. El clon
pGex2T/CETP3'también puede utilizarse para subclonar y para obtener
grandes cantidades de proteína genotecnológica GST/PTECCOH en forma
soluble, por medio de un método sencillo y barato.
La proteína genotecnológica se ha diseñado para
utilizarla como patrón en pruebas ELISA y de inmunotransferencia en
la práctica clínica, a fin de identificar y cuantificar PTEC por
medio de anticuerpos dirigidos específicamente contra el terminal
carboxílico. En pruebas del tipo inmunotransferencia es un control
y/o patrón positivo de fácil gestión, lo cual no sería posible con
proteínas o con péptidos ligeros. La obtención de esta proteína
fusionada o genotecnológica aporta un patrón para identificar y
cuantificar PTEC más fidedigno que las purificadas a partir de
fuentes naturales. Esta proteína genotecnológica también tiene
aplicaciones en el campo de la investigación; por ejemplo, en
estudios de estructuras con sistemas de alta resolución como la
cristalografía de rayos X; en estudios de actividades, por contener
el epítopo que otorga la capacidad de fijación en lípidos; en
cromatografía de afinidades para la purificación de anticuerpos u
otras moléculas similares al terminal carboxílico de PTEC; en la
producción de anticuerpos contra el carboxilo de PTEC, sin necesidad
de fijación a proteínas transportadoras, entre otras muchas.
El péptido sintético PTEC
H486-S496 es útil no sólo para la producción de
anticuerpos y como patrón en el protocolo ELISA, sino incluso como
instrumento importante en estudios de estructuras y actividades.
El uso del presente sistema de detección y
cuantificación de PTEC permite identificar, evaluar y realizar el
seguimiento de pacientes con dislipidemias, cuyos efectos están
relacionados con alteraciones del nivel de PTEC presente en el
plasma, para evaluar el riesgo de aterogénesis. El presente sistema
facilita la manipulación de gran número de muestras de forma rápida
y sencilla, permitiendo el uso sistemático de esta prueba en
laboratorios clínicos humanos y veterinarios, y ampliando así el
tamaño de la población evaluable. Aunque utiliza preferiblemente
muestras de plasma o suero, también puede adaptarse para extractos
celulares o hísticos, medios de cultivo, antígenos purificados o
semipurificados, etc., lo cual amplía enormemente su campo de uso en
la investigación.
El uso de este equipo puede ampliarse a la
investigación de hechos y fenómenos presentes en la homeostasis de
lípidos, así como en el estudio de las características físicas,
químicas y biológicas de PTEC y sus moléculas relacionadas,
utilizando muestras obtenidas a partir de modelos experimentales
biológicos o no biológicos, preferiblemente extractos de tejidos,
órganos o células en cultivo, medios de cultivo, proteínas
genotecnológicas y péptidos sintéticos.
Tomando como modelo el conejo blanco de Nueva
Zelanda (Oryctolagus cuniculus), se obtuvo ARN total del
hígado utilizando el procedimiento descrito por
Sumikawa-K, Parker-I y
Miledi-R (1989, Methods in Neurosciences
1:30-45), aislándose el fragmento ARN
poli(A*) mediante cromatografía por el método
oligo(dt)-celulosa. El ADNc se sintetizó con
el sistema comercial para TI-RCP (Perkin Elmer),
utilizando ARNm del hígado. Para el protocolo TI-RCP
se diseñó un conjunto de oligonucleótidos con ayuda del programa
Mac Vector. El diseño de oligonucleótidos permite la multiplicación
específica del extremo 3' del ADNc de las PTEC, lo cual es
especialmente difícil dadas las características de la secuencia
ADNc de las PTEC, siendo la más determinante su alto contenido de
G-C (más del 65%). Como consecuencia de lo anterior,
se establecieron los parámetros siguientes en el diseño de los
oligonucleótidos utilizados en el protocolo RCP:
SECUENCIA: ADNc de PTEC de conejo,
publicado por Nagashima-M, McLean-J
y Lawn-R en 1988 (J. Lipid. Res.
29:1643-1649).
SECUENCIA ANALIZADA: desde el nucleótido
1 hasta el nucleótido 1870.
TAMAÑO DE LOS OLIGONUCLEÓTIDOS: desde 18
hasta 30 bases.
TEMPERATURA DE FUSIÓN:
55-80ºC.
CONTENIDO DE G-C:
45-55%.
TAMAÑO DEL PRODUCTO
400-1000 pb.
- \quad
- Oligonucleótido respecto a oligonucleótido (cualquiera) = 4
- \quad
- Oligonucleótido respecto a oligonucleótido (sólo G-C) = 2
- \quad
- Extremo 3' respecto a extremo 3' = 2
\vskip1.000000\baselineskip
Este diseño sólo permite una opción de
oligonucleótidos codificantes próximos al extremo 3' y una de
oligonucleótidos no codificantes con la que es compatible. Las
secuencias de este conjunto de oligonucleótidos se muestran como
secuencia ID-1 (oligonucleótido codificante) y
secuencia ID-2 (oligonucleótido no codificante).
Este conjunto de oligonucleótidos genera un producto de 462 pb,
desde la base 1391 hasta la 1852, que se extiende entre el extremo
3' del exón 15 y la región no codificante del exón 16 del ARNm de la
PTEC. La temperatura para una alineación óptima es 59,9ºC, el
porcentaje de G-C 60,4% y la temperatura de fusión
83,2ºC.
El producto RCP generado por este conjunto de
oligonucleótidos se clonó en el vector pMosBlueT (Amersham).
Esta estrategia hizo posible integrar los puntos de restricción de
las bandas BamHI y Smal en el producto RCP, a fin de permitir su
subclonación en el vector de expresión pGex-2T
(Pharmacia LKB Biothec), en el marco correcto de orientación y
lectura para la expresión de la proteína fusionada. Así se generaron
dos plásmicos recombinados clonados con el extremo 3' del ADNc de
PTEC, denominados clon pMosBlue/PTEC3' y clon
pGex-2T/PTEC3'.
El clon pGex-2T/PTEC3' se
transformó en la cepa bacteriana Escherichia coli
DH5\alpha, para obtener proteínas genotecnológicas fusionadas al
glutatión-S transferasa (GST). La cepa transformada
se cultiva durante ocho horas a 37ºC, en 500 ml de medio de cultivo
Super Luria al que se añaden 50 \mug/ml de ampicilina. La
inducción del cultivo se conduce con 0,4 mM de
isopropil-\beta-D-tio-galactósido
(IPTG) durante tres horas. Después de la incubación, las bacterias
se lisan mecánicamente y la proteína fusionada GST/PTECCOH se
recupera en una columna de glutatión-agarosa (SIGMA)
utilizando un protocolo conocido (Smith-DB y
Corcoran-LM, 1995, Expression and Purification
of Glutathion-S Transferase Fusion Proteins, en
Short Protocols in Molecular Biology
[Ausbet-MF, Brent-R,
Kingston-RE, Moore-DDR,
Seidman-JG y Strhl-K], WILEY, 3rd
ed. pp 16.18-16.31).
Los péptidos unidos a la KLH se utilizaron para
producir los anticuerpos, preferiblemente en gallinas, mediante un
protocolo patrón de 63 días y con inoculaciones subcutáneas una vez
por semana. Las inoculaciones consistieron en 200 \mug de BSA /
200 \mul de PBS + 200 \mul de aditivo Freund completo (Sigma
Inmuno Chemicals) en la primera aplicación, y en 200 \mug de BSA
/ 150 \mul de PBS + 150 \mul de aditivo Freund incompleto
(Sigma Inmuno Chemicals) en aplicaciones subsiguientes. El valor del
anticuerpo del plasma se determinó mediante la técnica ELISA. Las
IgY se aislaron de huevos recogidos durante dos semanas. Tanto la
fijación como la producción de anticuerpos y la valoración mediante
ELISA de la primera muestra de plasma se hicieron con ADI (Alpha
Diagnostic International).
Las condiciones de uso del anticuerpo policlonal
anti-PTEC H486-S496 se normalizaron
en pruebas del tipo inmunotransferencia contra plasma humano y de
conejo, y extractos de lípidos brutos y disminuidos procedentes de
tejidos perfundidos. Se utilizaron el anticuerpo primario en
diluciones de 1:5.000 y el anticuerpo secundario antigallina IgG
(H+L) conjugado con peroxidasa (PIRCE) 1:10.000. Los bloques y las
incubaciones se realizaron con una suspensión de leche descremada
en polvo al 2,5% en solución de trisborato salina
(TBS-Tween) al 0,1% y a 37ºC durante una hora. La
visualización se efectuó con sustrato SuperSignal (PIRCE) en placas
autorradiográficas X-OMAT (Kodak), para la
determinación cuantitativa o cualitativa de PTEC. En estas pruebas
se utilizó BSA como control negativo. Para descartar la posibilidad
de que el anticuerpo reconociera inespecíficamente la albúmina, cuyo
peso molecular es próximo a la PTEC (~67 kDa), se incluyeron
controles negativos con BSA. En todas las pruebas realizadas, el
anticuerpo anti-PTEC H486-S496
reconoce específicamente las PTEC. Los resultados de estas pruebas
pueden verse en la
figura 1.
figura 1.
Se normalizaron las condiciones de uso del
anticuerpo policlonal anti-PTEC
H486-S496 en pruebas ELISA contra plasma humano y
de conejo. Se utilizaron el anticuerpo primario en diluciones de
1:2.000 y el anticuerpo secundario antigallina IgG (H+L) conjugado
con peroxidasa (PIRCE) 1:2.000. Los bloques y las incubaciones se
realizaron con PBS-Tween al 0,1%, a temperatura
ambiente y durante una hora. La visualización se efectuó con OFD
(orto-fenilendiamina diclorhidrato, SIGMA). Las
lecturas de la absorbencia se realizaron a 450 nm. En estas pruebas
se utilizó BSA como control negativo. Para descartar la posibilidad
de que el anticuerpo reconociera inespecíficamente la albúmina, se
incluyeron controles negativos con BSA. Algunos resultados obtenidos
con este sistema de cuantificación de PTEC se muestran en la figura
2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTA DE
SECUENCIAS
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN
1 (secuencia de
nucleótidos).
- LOCUS:
- PTEC conejo; 24 nt
- DEFINICIÓN:
- Oligonucleótido codificante, proteína transferidora de ésteres de colesterol (PTEC) de conejo, ARNm
- FUENTE:
- Oryctolagus cuniculus, desde ADNc hasta ARNm.
- ORGANISMO:
- Conejo blanco de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus)
Eukariota; Metazoa; Chordata;
Craniata; Vertebrata; Mammalia; Eutheria; Lagomorpha; Leporidae;
Oryctolagus
- REFERENCIA:
- Desde la base 1391 hasta la base 1414
- COMENTARIOS:
- Ubicación en el extremo 3' del exón 15, región codificante
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN
2 (secuencia de
nucleótidos).
- LOCUS:
- PTEC conejo; 25 nt
- DEFINICIÓN:
- Oligonucleótido no codificante, proteína transferidora de ésteres de colesterol de conejo, ARNm
- FUENTE:
- Oryctolagus cuniculus, desde ADNc hasta ARNm.
- ORGANISMO:
- Conejo blanco de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus)
Eukariota; Metazoa; Chordata;
Craniata; Vertebrata; Mammalia; Eutheria; Lagomorpha; Leporidae;
Oryctolagus.
- REFERENCIA:
- Desde la base 1852 hasta la base 1828
- COMENTARIOS:
- Ubicación en la región no codificante del exón 16.
\newpage
IDENTIFICACIÓN 3 (secuencia
de
nucleótidos).
- LOCUS:
- pMosBlueT; 3 nt - PTEC de conejo, 472 nt
- DEFINICIÓN:
- Extremo 3' del ARNm de la proteína transferidora de ésteres de colesterol (PTEC) del conejo, con un codón de vector pMosBlueT en su extremo 5'. Fragmento subclonado del vector pMosBlueT al vector pGex-2T.
- FUENTE:
- Oryctolagus cuniculus, desde ADNc hasta ARNm.
- ORGANISMO:
- Conejo blanco de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus)
Eukariota; Metazoa; Chordata;
Craniata; Vertebrata; Mammalia; Eutheria; Lagomorpha; Leporidae;
Oryctolagus.
- REFERENCIA:
- Desde 1391 (exón 15) hasta la base 1852 (exón 16).
- COMENTARIOS:
- El codón de terminación PTEC se encuentra en la base 496 (con letras negras). La sección marcada pMos (subrayada) corresponde al codón transportado desde el vector pMosBlueT durante la subclonación en el vector pGex-2T.
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN
4 (secuencia de
aminoácidos)
- LOCUS:
- PTEC conejo; 33 aa
- DEFINICIÓN:
- Sección correspondiente a PTEC en la proteína genotecnológica GST/PTECCOH.
- FUENTE:
- Oryctolagus cuniculus
- ORGANISMO:
- Conejo blanco de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus)
Eukariota; Metazoa; Chordata;
Craniata; Vertebrata; Mammalia; Eutheria; Lagomorpha; Leporidae;
Oryctolagus.
- REFERENCIA:
- Desde el residuo Ile 464 a Ser 496
- COMENTARIOS:
- Extremo carboxílico: motivo de fijación de ésteres de colesterol; alto contenido de estructura hélice \alpha; responsable de la actividad de transferencia de los ésteres de colesterol. Los residuos Phe 481, Leu 488, Phe 491 y Leu 495 se muestran en color negro.
- Nº DE AA
- 33
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA PTEC EN
GST/PTECCOH
\vskip1.000000\baselineskip
- ESTRUCTURA
- hélice \alpha
- Peso molecular (daltonios)
- 3731,1
- Punto isoeléctrico
- 3,99
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN
5 (secuencia de
aminoácidos)
- LOCUS:
- PTEC conejo; 12 aa
- DEFINICIÓN:
- Secuencia sintética, trasladada desde la secuencia de nucleótidos del producto RCP, obtención mediante oligonucleótidos con secuencias ID-1 e ID-2.
- FUENTE:
- Oryctolagus cuniculus
- ORGANISMO:
- Conejo blanco de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus)
Eukariota; Metazoa; Chordata;
Craniata; Vertebrata; Mammalia; Eutheria; Lagomorpha; Leporidae;
Oryctolagus.
- REFERENCIA:
- Desde el residuo His 486 hasta Ser 496 + cisteína en el extremo "N".
- COMENTARIOS:
- Extremo carboxílico; motivo de fijación de ésteres de colesterol; alto contenido de estructura hélice \alpha; responsable de la actividad de transferencia de los ésteres de colesterol. Los residuos Leu 488, Phe 491 y Leu 495 se muestran en color negro.
- Nº DE AA
- 12
\vskip1.000000\baselineskip
PTEC PÉPTIDO
H486-S496 Cys His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser
Leu
Ser
- ESTRUCTURA
- hélice \alpha
- Peso molecular (daltonios)
- 1373,9
- Punto isoeléctrico
- 5,09
SOLUBLE EN H_{2}O
pH9,5
<110> Universidad Nacional Autónoma de
México
\hskip1cm Alonso García, Ana Lucía
\hskip1cm Mas Oliva, Jaime
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Sistema para la cuantificación de la
proteína transferidora de ésteres de colesterol en muestras
sintéticas y biológicas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCT 00053
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/MX 00/00053
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-12-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> MX 99ll575
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-12-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryctolagus cuniculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido codificante,
proteína transferidora de ésteres de colesterol (PTEC) de conejo,
ARNm.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Desde la base 1391 hasta la base
1414. Ubicación en el extremo 3' del exón 15, región
codificante.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatcaaccc cgagattatc actc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryctolagus cuniculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido no codificante,
proteína transferidora de ésteres de colesterol de conejo, ARNm.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Desde la base 1852 hasta la base
1828. Ubicación en la región no codificante del exón 16.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtttactt gagaggcaga gagag
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 475
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
<2l3> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Extremo 3' del ARNm de la proteína transferidora de
ésteres de colesterol del conejo, desde la base 1391 (exón 15)
hasta la base 1852 (exón 16), con un codón de vector pMosBlueT en su
extremo 5'.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento subclonado del vector
pMosBlueT al vector pGex-2T. El primer codón (GAT)
corresponde al codón transportado desde el vector pMosBlueT durante
la subclonación en el vector pGex-2T.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3' exón 15.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (43)..(117)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región codificante del exón 16. El
codón de paro de la PTEC (TAG) se encuentra en la base 496.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Sección correspondiente a PTEC en la proteína
genotecnológica GST/PTECCOH. Desde el residuo Ile 464 a Ser 496.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Terminal carboxílico, motivo de
fijación de ésteres de colesterol, responsable de la actividad de
transferencia de los ésteres de colesterol.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> HÉLICE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Alto contenido de estructura hélice
\alpha; peso molecular 3731,1 daltonios; punto isoeléctrico
3,99.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia sintética, trasladada desde la secuencia de
nucleótidos del producto RCP, obtención mediante oligonucleótidos
con secuencias 1 y 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Desde el residuo His 486 hasta Ser
496 + cisteína en el extremo "N".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> FIJACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> <2)..(l2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Terminal carboxílico, motivo de
fijación de ésteres de colesterol, responsable de la actividad de
transferencia de los ésteres de colesterol. Se muestran los residuos
Leu 488, Phe 491 y Leu 495.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> HÉLICE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Alto contenido de estructura hélice
\alpha; peso molecular 1373,9 daltonios, punto isoeléctrico 5,09,
soluble en H_{2}O pH 9.5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu
Ser}
Claims (16)
1. Un anticuerpo policlonal para uso
diagnóstico, caracterizado por el hecho de que reconoce la
región que comprende los aminoácidos H486-S496 de
PTEC, pero no reconoce el péptido PTEC\Delta16, concretamente PTEC
sin motivo de fijación de ésteres de colesterol,
caracterizado por el hecho de que dicho anticuerpo se produce
después de unir el péptido consistente en Cys His Leu Leu Val Asp
Phe Leu Gln Ser Leu Ser de PTEC (siendo H486-S496
la secuencia ID-5) a la proteína transportadora de
KLH.
2. El anticuerpo policlonal de la reivindicación
1, caracterizado por el hecho de que es un anticuerpo del
tipo IgY.
3. Un método inmunoenzimático para detectar y
cuantificar la proteína transferidora de ésteres de colesterol en
muestras biológicas y sintéticas, caracterizado por el hecho
de que las muestras se ponen en contacto con el anticuerpo
policlonal de una de las reivindicaciones 1 o 2.
4. El método de la reivindicación 3,
caracterizado por el hecho de que el anticuerpo policlonal es
del tipo IgY.
5. El método de una de las reivindicaciones 3 a
4, caracterizado por el hecho de que el anticuerpo policlonal
de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 se utiliza como
anticuerpo primario.
6. El método de una de las reivindicaciones 3 a
5, caracterizado por el hecho de que se utiliza un anticuerpo
secundario unido a la peroxidasa para hacer evidente la
reacción.
7. El método de una de las reivindicaciones 3 a
6, caracterizado por el hecho de que la proteína de fusión
compuesta de proteína GST, fusionada en el extremo "N" de la
PTEC de conejo, consistente en los residuos
I464-S496 (Ile Asn Pro Gen Ile Ile Thr Leu Asp Gey
Cys Leu Leu Leu Gln Met Asp Phe Gly Phe Pro Lys His Leu Leu Val Asp
Phe Leu Gln Ser Leu Ser), y/o el péptido sintético His Leu Leu Val
Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser, se utilizan como patrón.
8. Uso del péptido sintético Cys His Leu Leu Val
Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser unido a la proteína transportadora de
KLH para la generación de anticuerpos policlonales de una de las
reivindicaciones 1 o 2.
9. El uso de la reivindicación 8, obteniéndose
el anticuerpo policlonal mediante inoculación de animales modelo,
preferiblemente la gallina.
10. Uso del anticuerpo policlonal de cualquiera
de las reivindicaciones 1 o 2 en inmunoanálisis, preferiblemente
ELISA o inmunotransferencia (Western-Blot).
11. Un método in vitro para diagnosticar
el riesgo de aterogénesis o dislipidemia, caracterizado por
el hecho de que la fase de la detección y cuantificación de la
proteína transferidora de ésteres de colesterol en muestras
biológicas y sintéticas se realiza poniendo las muestras en contacto
con el anticuerpo policlonal de cualquiera de las reivindicaciones
1 o 2 para diagnosticar el riesgo de aterogénesis o
dislipidemia.
12. Un equipo para diagnosticar el riesgo de
aterogénesis, basado en la cuantificación de los niveles de PTEC en
el plasma, caracterizado por el hecho de contener: a) la
proteína genotecnológica de la proteína GST, fusionada en el
extremo "N" de la PTEC de conejo, consistente en los residuos
I464-S496 (Ile Asn Pro Glu Ile Ile Thr Leu Asp Gly
Cys Leu Leu Leu Gln Met Asp Phe Gln Phe Pro Lys His Leu Leu Val Asp
Phe Leu Gln Ser Leu Ser) y/o el péptido sintético His Leu Leu Val
Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser, y b) como anticuerpo primario, el
anticuerpo policlonal de cualquiera de las reivindicaciones 1 o
2.
13. El equipo de la reivindicación 12,
caracterizado por el hecho de que comprende un anticuerpo
secundario unido a una enzima, preferiblemente peroxidasa, para
hacer evidente la reacción.
14. El equipo de la reivindicación 12,
caracterizado por el hecho de que se utiliza en la detección
y cuantificación de PTEC en muestras biológicas y sintéticas.
15. El equipo de la reivindicación 12,
caracterizado por el hecho de que está diseñado para
utilizarlo en la práctica clínica humana y veterinaria.
16. El equipo de la reivindicación 12,
caracterizado por el hecho de que se utiliza en la detección,
evaluación y seguimiento de pacientes con dislipidemia y/o riesgo
de aterogénesis.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015190903A1 (es) * | 2014-06-11 | 2015-12-17 | Universidad Nacional Autonoma De Mexico | Péptidos derivados del dominio c-terminal de cetpi como moléculas bloqueadoras del efecto citotóxico inducido por lipopolisacáridos en septicemia y choque séptico |
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| MX347400B (es) | 2012-06-29 | 2017-04-18 | Univ Nac Autónoma De México | Vacuna de aplicacion nasal contra el desarrollo de la enfermedad aterosclerotica y el higado graso. |
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| US5604105B1 (en) * | 1990-10-12 | 1999-08-24 | Spectral Diagnostics Inc | Method and device for diagnosingand distinguishing chest pain in early onset thereof |
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| US5705388A (en) * | 1994-12-23 | 1998-01-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | CETP Ribozymes |
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-
2000
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015190903A1 (es) * | 2014-06-11 | 2015-12-17 | Universidad Nacional Autonoma De Mexico | Péptidos derivados del dominio c-terminal de cetpi como moléculas bloqueadoras del efecto citotóxico inducido por lipopolisacáridos en septicemia y choque séptico |
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