FILAMENT-REKRUTIERUNG FLUORESZIERENDER PROTEINE ZUR ANALYSE UND IDENTIFIKATION VON PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN
Die vorliegende Erfindung betrifft a) Fusions-Polypeptide, welche als Gesamt- Polypeptid multimere Aggregate (z.B. Filamente) bilden und aus zwei oder mehr Peptid-Domänen heterologer Herkunft bestehen, von denen mindestens eine für die AggregaWFilament-Bildung des Gesamt-Polypeptids hinreichend ist und m destens eine weitere Domäne aus einem Polypeptid bzw. einer Polypepti Domäne (Bait-Polypeptid) besteht, dessen/deren Fähigkeit mit anderen mod zierten oder nicht-modifizierten, bereits bekannten oder noch unbekannten Poly- peptiden (Prey-Domäne) zu interagieren untersucht werden soll, sowie b) Aggre- gat- (Filament) bildende, nicht-kovalent gebundene Polypeptid-Komplexe, in denen ein oder mehrere Polypeptid(e) enthalten ist/sind, welche die Multimerisie- rung vermitteln sowie mindestens ein Polypeptid oder auch Fusions-Polypeptid heterologer Polypeptid-Domänen (Bait-Polypeptid), dessen Fähigkeit mit anderen modifizierten oder nicht-modifizierten, bereits bekannten oder noch unbekannten Polypeptiden (Prey-Polypeptid) zu interagieren untersucht werden soll.
Die Erfindung zeichnet sich dabei dadurch aus, daß der Nachweis der Protein- Protein-Interaktion, die untersucht bzw, identifiziert werden soll, auf der Detektion des Prey-Polypeptids bzw. von Prey-Domänen-enthaltenden Polypeptiden beruht, die in Bait-Domäne-enthaltende polymere Strukturen, z.B. Filamente, rekrutiert werden. Um diese Protein-Protein-Interaktion-indizierende Rekrutierung detektie- ren zu können, werden Prey-Polypeptide in Form von Fusionsproteinen mit fluoreszierenden Polypeptiden (z.B DsRED, GFP, YFP, CFP, BFP1), die durch re- kombinante DNA-Technologien hergestellt werden können, verwendet, oder die Prey-Polypeptide mittels Fluoreszenz-markierter sekundärer Reagenzien z.B. FITC-markierter Antikörper nachgewiesen. Die Antikörper können dabei das interessierende Prey-Polypeptid selbst oder eine daran direkt oder indirekt gekoppelte Struktur erkennen, z.B. einen Peptid-Tag, der durch rekombinante Techniken eingeführt wird. Die Erfindung zeichnet sich weiterhin dadurch aus, daß die Interaktion von Bait- und Prey-Polypeptiden in lebenden Zellen erfolgt, die stabil oder transient mit entsprechenden Nukleinsäure-Konstrukten transfiziert wurden. Das beschriebene Verfahren ist weiterhin geeignet, die genannten Wechselwirkungen in experimentell transient membran-permeabilisierten, aber ansonst vitalen Zellen, sowie in fixierten Zellen oder auch in zellfreien Systemen zu untersuchen.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung, den Polypeptiden zugrundeliegende Nukleinsäuresequenzen, Vektoren, die diese erfindungsgemäßen Nukleinsäure- sequenzen enthalten, mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Vektoren transfizierte Zellen, und Zusammensetzungen, enthaltend erfindungsgemäße Gegenstände.
Für die oben genannten und später näher ausgeführten FIT-Anwendungen sind prinzipiell alle filamentbildenden Polypeptide oder Polypeptid-Domänen geeignet, die eine Filamentbildung auch dann erlauben, wenn sie in Form von Fusionsproteinen mit heterologen Peptid-Domänen vorliegen oder die Rekrutierung von Bindeproteinen erlauben, die als Fusionsproteine mit heterologen Polypeptid- Domänen exprimiert werden können, ohne daß ihre Bindefähigkeit an das fila- mentbildende Protein verloren geht. Beispiele hierfür sind manche Mitglieder der
„death domain" (DD)-Proteinfamilie (z.B. TRADD), manche „caspase-recruitment domain" (CARD)-Domäne enthaltenden Proteine (z.B. RAIDD und RICK) oder manche Polypeptide mit einer „death effector domain" DED-Domäne (z.B. Caspa- se-8, FLIP). Desweiteren sind auch filamentbildende nicht-kovalent gebundene Polypeptid-Komplexe geeignet, die ein Bait-Polypeptid der beschriebenen Art enthalten. Beispiele hierfür sind Komplexe aus TRADD und TRAF1 oder TRAF2 oder Fusionsproteine von TRAF1 oder TRAF2 oder deren TRAF-Domänen mit heterologen Polypeptid-Domänen. Weiterhin sind auch alle die Polypeptide als Polymerisierungskomponente des Bait-Komplexes geeignet, die fluoreszenzmik- roskopisch darstellbare charakteristische Strukturen ausbilden.
Damit werden in einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfindungsgemäß Bait-Polypeptide zur Verfügung gestellt, die (i) einen Abschnitt (1) mit einer DD, CARD oder DED enthalten (ii) einen N-terminal oder C-terminal von Abschnitt (1) gelegenen Abschnitt (2), welcher ein Peptidlinker ist, und (iii) einen Abschnitt (3), welcher ein Polypeptid repräsentiert dessen Protein-Protein- Interaktionsfähigkeiten analysiert werden sollen bzw. für welches noch unbekannte Interaktionspartner identifiziert werden sollen. In einer weiteren Ausführungsform werden Bait-Polypeptide zur Verfügung gestellt, die (i) einen Abschnitt (1) mit einer Polypeptid-Domäne, die direkt oder indirekt an filamentbildende Poly- peptid-Einheit binden, enthalten, (ii) einen N-terminal oder C-terminal von Abschnitt (1) gelegenen Abschnitt (2), welcher ein Peptidlinker ist, und (iii) einen Abschnitt (3), welcher ein Polypeptid repräsentiert, dessen Protein-Protein- Interaktionsfähigkeiten analysiert bzw. für welches noch unbekannte Interaktionspartner identifiziert werden sollen, enthalten.
Desweiteren werden in einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfindungsgemäß Prey-Polypeptide zur Verfügung gestellt, die (i) einen Abschnitt (1) enthalten, der mittels Fluoreszenz direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann und zudem (ii) einen N-terminal oder C-terminal von Abschnitt (1) gelegenen Abschnitt (2) enthalten, welcher ein Peptidlinker ist, und (iii) einen Abschnitt (3), welcher jegliches Polypeptid repräsentierten kann dessen Protein-Protein- Interaktionsfähigkeiten analysiert werden soll.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen erfindungsgemäße Bait- Polypeptide in ihrem Abschnitt (1) entweder eine Aminosäuresequenz eines filamentbildenden Polypeptids, eine funktioneile Variante einer filamentbildenden Polypeptid-Sequenz oder ein Fragment hiervon auf, oder eine Aminosäurese- quenz eines Polypeptids, einer funktionellen Variante eines Polypeptids oder eines Polypeptid-Fragments, das an ein filamentbildendes Polypeptid binden kann. Unter einer funktioneilen Variante werden Sequenzen verstanden, die zumindest tw., vorzugsweise mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 80 % der nativen Sequenz aufweisen und sich durch bspw. Deletion(en), lnsertion(en) und/oder mindestens eine Mutation von der nativen Sequenz unterscheiden. Hierbei ist eine Sequenzhomologie von mindestens 90, vorzugsweise mindestens 95 und am stärksten bevorzugt mindestens 97 % mit der entsprechenden nativen Sequenz bevorzugt. Bei einem funktionellen Fragment kann es sich um N- Terminal, C-terminal oder intrasequentiell verkürzte native filamentbildende Poly- peptid-Sequenzen handeln, insbesondere um gewisse Domänen, vorzugsweise mindestens eine, stärker bevorzugt mindestens eine filamentbildende Domäne der nativen Vollängen-Sequenz. Auch biologisch aktive Varianten dieser Fragmente werden erfindungsgemäß mitoffenbart.
Bevorzugt sind dabei solche filamentbildende Polypeptide, deren funktioneile Va- rianten oder Fragmente eine CARD, DD oder DED Domäne enthalten.
Ganz besonders bevorzugt ist als Abschnitt (1) der Bait-Polypeptide die DD von RIP (Rezeptor-interacting protein), RAIDD (RIP-associated ICH-1/CED-3 homolo- gous protein with a death domain) oder TRADD (TNF receptor 1-associated death domain protein), die DED von FLIP (FLICE-inhibitory protein) oder Caspase-8, oder die CARD von RAIDD, RICK, oder E10, oder die TRADD bindende TRAF (TNF receptor associated factor)-Domäne von TRAF1, TRAF2 oderTRAF3.
Als Prey-Polypeptide sind ganz besonders bevorzugt Polypeptide oder Polypeptid-Domänen in Form von Fusionsproteinen mit fluoreszierenden Proteinen wie DsRED, GFP und GFP-Varianten.
Der Linkerabschnitt (2) zwischen den Abschnitten (1) und (3) der Bait- wie auch der Prey-Polypeptide stellt sich bei erfindungsgemäßen Polypeptidkonstrukten bspw. als eine flexible Verbindung dar, die vorzugsweise die intrinsischen Protein- Protein-Interaktionseigenschaften der durch diesen Linker verbundenen Polypep- tid-Domänen nicht wesentlich beeinflußt. In Spezialfälleή, in denen Prey- Polypeptide analysiert werden sollen, die mit multimeren (z.B. dimeren oder trime- ren) Domänen interagieren, oder in denen aus einer Prey-Polypeptid-cDNA- Bibliothek Interaktionspartner für multimerisierte Bait-Polypeptide identifiziert werden sollen, werden vorzugsweise Bait-Polypeptide mit Linker mit intrinsischen Multimerisierungseigenschaften (bspw. Di.- Tri- oder Hexamere) gewählt. Solche Linker werden auch verwendet, um eine erhöhte Stabilität von Prey-Polypeptiden zu erreichen, die eine intrinsische Multimerisierungs-Tendenz aufweisen. Im Falle eines Linkers der als Dimerisierungsmodul (Linkertyp 2a) wirkt, wird beispielsweise die dimerisierende coiled-coil Domäne des Hefe Transkriptionsfaktors GCN4 verwendet.
Ein Trimerisierungsmodul (Linkertyp 2b) als Linker kann bspw. aus der coiled-coil Strukturen bildenden N-TRAF Domäne von TRAF-Proteinen bestehen.
In jedem Fall können die Sequenzen von nativen Polypeptiden oder Fragmenten dieser nativen Polypeptide, die als Linker in Abschnitt (2) eines erfindungsgemä- ßem Polypeptids zum Einsatz kommen, auch in Form biologisch aktiver Varianten derselben im Sinne dieser Erfindung und nach obiger Definition auftreten.
Alternativ sind in Abschnitt (2) andere, natürlich vorkommende oder synthetisch hergestellte Linker-Peptide denkbar. Grundsätzlich kann ein Linker einer nativen oder variierten (Teil)sequenz aller Organismen, vorzugsweise aus Vertebraten, insbesondere aus Säugetieren, vor allem aus dem Menschen, entsprechen. Ferner sind als Linker bspw. alle Sequenzabschnitte von Proteinen geeignet, die durch Ausbildung von Supersekundärstrukturen Di- oder Multimere generieren, z.B. "Coiled-Coil-Helices".
Offenbart werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch alle sich aus den erfindungsgemäßen Konstrukten durch spezifische Linkerwahl (2) ergebenden Di-
oder Multimere, auf die sich die Gesamtoffenbarung zu erfindungsgemäßen Kon- strukten inhaltsgleich bezieht. Insoweit fällt ein Di- oder Multimer von erfindungsgemäßen Polypeptiden nach Maßgabe der vorliegenden Offenbarung immer unter den weiteren Begriff „erfindungsgemäßes Polypeptid".
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind DNA-Sequenzen, die für Fusionsproteine der vorgenannten erfindungsgemäßen Art kodieren (Nuklein- säurekonstrukte) oder einen solchen für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierenden Bereich enthalten. Derartige DNA-Sequenzen werden in Expressionsvektoren exprimiert, wobei auch die entsprechenden Expressionsvektoren, die eine DNA-Sequenz für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine enthalten, Gegenstand der Erfindung sind. Vorzugsweise'besitzen erfindungsgemäße Vektoren die Fähigkeit zur Expression und/oder Amplifikation in einer prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zelle.
Weiterhin gehören zur vorliegenden Erfindung solche Wirtszellen, die mit DNA- Sequenzen (Nukleinsäurekonstrukte), die für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine kodieren, stabil oder transient transfiziert sind. Ganz besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang Wirtszellen, die mit erfindungsgemäßen Expressionsvektoren oder erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten transfiziert sind, wobei die Expressionsvektoren wiederum DNA-Sequenzen enthalten, die für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine kodieren. Erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz, kodierend für ein Polypeptid nach einem der vorgenannten Ansprüche, enthalten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Expression und Detektion von erfindungsgemäßen Polypeptiden und deren eventueller Protein-Protein-Interaktion, wobei ein erfindungsgemäßes Expressions- und De- tektionsverfahren typischerweise gekennzeichnet ist durch (a) Bereitstellen erfindungsgemäßer Paare von Vektoren oder Nukleinsäurekonstrukten, die für ein filamentbildendes Bait-Polypeptid oder einen ein filamentbildenden Bait- Polypeptid-enthaltenden Komplex kodieren sowie einem oder mehreren Prey- Polypeptiden bzw, Prey-Polypeptid-Banken, (b) Transfektion von Zellen mit ge-
maß Verfahrensschritt (a) erhaltenen Vektoren oder Nukleinsäurekonstrukten, (c) Kultivierung der gemäß (b) transfizierten Zellen, und (d) Analyse der möglichen Protein-Protein-Interaktion von unter entsprechenden Bedingungen exprimierten erfindungsgemäßen Polypeptiden aufgrund der Rekrutierung von Prey- Polypeptiden in die Bait-Polypeptid enthaltenden Filamente der Wirtszellen und dem anschließenden Fluoreszenz-technischem Nachweis der Prey-Polypeptide. Der Nachweis der Protein-Protein-Interaktion beruht dabei darauf, daß nur im Fall einer vorliegenden Interaktion von Bait- und Prey-Polypeptid letzteres in Filamen- ten detektiert werden kann. Die Expression der Fusionsproteine erfolgt hierbei typischerweise durch folgende Vorgehensweisen:
1. transiente Kotransfektion eines Vektors kodierend für ein Bait-Polypeptid oder mehreren Vektoren kodierend für die Komponenten eines filamentbildenden Bait- Polypeptid-enthaltenden Komplexes sowie eines ödere mehreren Vektoren, der/die für Prey-Polypeptide kodieren nach dem Stand der Technik in geeigneten Expressionssystemen.
2. Transfektion eines oder mehrer Vektoren kodierend für ein Prey-Polypeptid in Zellen die stabil ein Bait-Polypeptid oder die Komponenten eines filamentbildenden Bait-Polypeptid-enthaltenden Komplexes exprimieren.
3. Transfektion eines oder mehrer Vektoren kodierend für ein Bait-Polypeptid oder mehreren Vektoren kodierend für die Komponenten eines filamentbildenden Bait- Polypeptid-enthaltenden Komplexes in Zellen, die stabil ein Prey-Polypeptid exprimieren.
4. Transfektion eines oder mehrer Vektoren kodierend für ein Bait-Polypeptid oder mehreren Vektoren kodierend für die Komponenten eines filamentbildenden Bait- Polypeptid-enthaltenden Komplexes in einen Pool von Zellen, die jeweils stabil ein oder wenige von Zelle zu Zelle jedoch oft verschiedene Prey-Polypeptide exprimieren (Prey-Polypeptid Library).
Zusammenfassend ist festzustellen, dass erfindungsgemäß Fusionsproteine (bzw. Proteinkomplexe) mit filamentbildenden Eigenschaften (Bait-Polypeptide /
Bait-Polypeptid-Komplexe) zur Verfügung gestellt werden, die es erlauben Protein-Protein-Interaktionen auf zellulärer Ebene in lebenden Zellen nachzuweisen, dadurch daß die Rekrutierung interagierender Proteine oder Peptid-Domänen (Prey-Polypeptide) in diese Filamente z.B. mikroskopisch durch Fluoreszenztech- niken (Verwendung von fluoreszierenden Fusionsproteinen, Antikörperfärbung) nachgewiesen wird. Die Prey-Polypeptid-abhängige „Färbung" der Bait- Polypeptid-enthaltenden Filamente ist somit indikativ für das Vorhandensein einer direkten oder, in Einzefällen auch indirekten Protein-Protein-Interaktion zwischen der Bait-Domäne des Bait-Polypeptids und der Prey-Domäne des Prey- Polypeptids.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert.
Figur 1 zeigt filamentbildende Fusionsproteine aus filamentbildenden Polypeptid- Domänen (TRADD, AS 185-328; RIP, AS 558-671; RAIDD, AS 85-199 bzw. 1- 120; RICK, AS 361-540; E10, komplettes Protein; FLIP, AS 1-202; Caspase 8, AS 1-260) und einer heterologen Polypeptiddomäne, die selbst keine filamentbildenden Eigenschaften, besitzt. Um eine einfache Visualisierung der filamentbildenden heterologen Fusionsproteine zu ermöglichen, wurde in diesen Beispielen fluoreszierende Proteine (GFP, YFP) als Fusionspartner der filamentbildenden Poly- peptid-Domäne verwendet. In praktischen Anwendungen werden jedoch anstatt der fluoreszierenden Proteine, solche Polypeptid-Domänen verwendet, die hinsichtlich ihrer Protein-Protein-Interaktions-Möglichkeiten analysiert werden sollen und die selbst nicht fluoreszieren.
Figur 2 zeigt beispielhaft die Rekrutierung verschiedener Prey-Polypeptide (Sentrin-GFP, clAP1-GFP, IKK1-GFP, IKK2-GFP, NEMO-GFP) in die Filamente eines Bait-Proteinkomplexes, der aus TRADD und TRAF1 besteht. Die zelluläre Verteilung des Prey-Polypeptids in der Abwesenheit des Bait-Komplexes oder eines seiner Komponenten ist gleichfalls gezeigt. Da das filamentbildende TRADD Polypeptid und TRAF1 natürlicher Weise miteinander interagieren, ist es in diesem Fall für die Analyse von Protein-Protein-Interaktionen von TRAF1 mit Prey-
Polypeptiden nicht notwendig, ein heterologes Bait-Fusionspolypeptid aus der filamentbildenden Domäne von TRADD und TRAF1 zu verwenden.
Figur 3 zeigt beispielhaft die Rekrutierung verschiedener Prey-Polypeptide (TRAF4-GFP, TRAF4-TD-YFP) in die Filamente des Bait-Fusipnsproteins TRAF4- TRADD-DD, das aus TRAF4 und der filamentbildenden Todesdomäne (DD) von TRADD besteht. Die zelluläre Verteilung der Prey-Polypeptide in der Abwesenheit des Bait-Fusionsprotein ist gleichfalls gezeigt. Die Prey-Proteine binden dabei nicht an die filamentbildende TRADD-Todesdomäne allein (Daten nicht gezeigt).
Figur 4 zeigt beispielhaft die Rekrutierung des Prey-Polypeptids TRAF2-GFP in die Filamente des Bait-Fusionsproteins TRAF2-NT-TRADD-DD, das aus der N- terminalen Domäne von TRAF2 und der filamentbildenden Todesdomäne (DD) von TRADD besteht. Die zelluläre Verteilung des Prey-Polypeptids in der Abwesenheit des Bait-Fusionsprotein ist gleichfalls gezeigt. Das Prey-Protein bindet dabei nicht an die filamentbildende TRADD-Todesdomäne allein (Daten nicht ge- zeigt).
Figur 5 zeigt die beispielhaft die FIT-Analyse der Interaktion des IKK-Komplexes mit einer Reihe potentieller Bindeproteine. Expressionsplasmide für die angegebenen GFP-Fusionsproteine (Prey-Polypeptide) wurden jeweils einem Expressi- onsplasmid, das für das filamentbildende Bait-Fusionsprotein IKKγ-TRADD-DD kodiert, kotransfiziert. IKKγ-TRADD-DD ist ein Fusionsprotein aus der Gerüstkomponente IKKγ des IKK-Komplexes, der selbst keine Filamente bildet, und der filamentbildenden Todesdomäne (DD) von TRADD. Dieses Fusionsprotein allein bildet mit hoher Effizienz Filamente wie in (A) durch Antikörperfärbung mit einem TRADD-spezifischen Antikörper und einem Cy5-markiertem Sekundär-Antikörper mittels konfokaler Mikroskopie gezeigt ist. Binden nun GFP-Fusionsproteine, die selbst keine Filamente bilden, direkt oder indirekt an IKKγ-TRADD-DD, ist dies durch mikroskopischen Nachweis fluoreszierender Filamente nachweisbar (in (B) beispielhaft gezeigt für TRAF1 -GFP, dem GFP-Fusionsprotein eines natürlich vorkommenden Spaltprodukts von TRAF1 (TRAF1-TD-GFP) sowie IKK1-GFP, IKK2- GFP und IKKγ-GFP). Zur Quantifizierung wurden ca. 80-120 GFP-Fusionsprotein exprimierende Zellen auf die Anwesenheit von fluoreszierenden Filamenten hin
untersucht (C). Es ist bekannt, daß IKK1, IKK2 und IKKγ (auch NEMO genannt) einen stabilen Komplex bildenden, in dem insbesondere mehrere IKKγ Moleküle zu finden sind. In guter Übereinstimmung damit, findet sich in der FIT-Analyse in 95-100 % der transfizierten Zellen eine Rekrutierung von IKK1- GFP, IKK2-GFP und IKKγ-GFP in die IKKγ-TRADD-DD Filamente. Die in diesem FIT-Experiment gefundenen Interaktionen der IKKγ-TRADD-DD Filamente mit den Kinasen NIK und TAK ist gleichfalls in Übereinstimmung mit Literaturdaten. Die Interaktion der IKKγ-TRADD-DD Filamente mit TRAF3, TRAF4 sowie TRAF1 und insbesondere dem TRAF1 -Spaltprodukt TRAF1-TD stellen neue Befunde dar. Um die Spezifität einer Bindung an den interessierenden IKKγ Teil des filamentbildenden Fusionsproteins zu kontrollieren, wurden alle GFP-Fusionsproteine auch mit der filamentbildenden Domäne DD allein kotransfiziert und analysiert. Hierbei konnten mit den verwendeten GFP-Fusionsproteinen in keinem Fall fluoreszierende Filamente gefunden werden. Es ist zu beachten, daß das gesamte TRAF1 schlechter an den IKK-Komplex bindet als das durch Protease-Prozessierung entstehende TRAF1 -Fragment (TRAF1-TD-GFP).
Figur 6 zeigt beispielhaft wie das FIT-Prinzip zur in vivo Analyse der kinetischen Eigenschaften von Protein-Protein-Interaktionen genutzt werden kann. Das in Fi- gur 5 bereits vorgestellte filamentbildende Fusionsprotein IKKγ-TRADD-DD wurde mit TRAF1-GFP (gefüllte Symbole) und TRAF1-TD-GFP (offene Symbole) kotransfiziert. (A) Zur Analyse der Dissoziation der GFP-Fusionsproteine aus IKK- Komplex-Filamenten wurden transfizierte Zellen in einem Gebiet (Region B), das die gesamte Zelle mit Ausnahme eines IKKγ-TRADD-DD-GFP-Fusionsprotein Filaments umfaßt, mit hoher Laserleistung gebleicht und die zeitliche Abnahme der Filamentfluoreszenz bestimmt (FLIP (Fluoreszenz loss of photobleaching)- Analyse, Region M) (oberes Panel). Diese Analysen wurden an mehreren Zellen durchgeführt. Die Auswertung der Daten zeigt, daß beide GFP-Fusionsproteine mit gleicher Kinetik von den IKK-Komplex-Filamenten dissoziieren (unteres Pa- nel). (B) Da die Assoziationskinetik eines Proteins von seiner Konzentration abhängig ist, wurden für die Analyse des Assoziationverhaltens von TRAF1-GFP und TRAF1-TD-GFP an den IKK-Komplex, IKKγ-TRADD-DD-GFP-Fusionsprotein
Filamente untersucht, die die gleiche Fluoreszenz-Intensität aufwiesen. Es wurde nun ein definierter Bereich des Filaments (Region M) mit hoher Laserleistung gebleicht und anschließend die zeitliche Zunahme der Filamentfluoreszenz in diesem Bereich bestimmt (FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)- Analyse) (oberes Panel). Diese Analysen wurden gleichfalls an mehreren Zellen durchgeführt. Die Datenauswertung (unteres Panel) zeigt, daß das prozessierte TRAF1 -Fragment wesentlich schneller an die IKKγ-DD Filamente assoziierte als das komplette TRAF1 -Molekül. Da bei gleicher Dissoziationskonstante eine höhere Assoziationsratenkonstante eine höhere Affinität bedingt, erklären diese Mes- sungen sehr gut den in Figur 5 gezeigten Befund, daß das TRAF1-TD-GFP- Fusionsprotein besser als TRAF1-GFP an die IKKγ-TRADD-DD Filamente bindet.
Konstrukt (A): TRAF6-TRADD-DD
NH2-[TRAF6]-[2AS-Linker]-[TRADD(169-312)]-COOH
Konstrukt (B): Myc-TRADD-DD-TNF-R2(cyt)
NH2-[myc-tag]-[2AS-Linker]-ITRADD(169-312)H2AS-Linker]-[TNF-R2(286-461 )]- COOH
Konstrukt (C): yc-Caspase-8(1-277)-TNF-R2(cyt)
NH2-[myc-tag]-[2AS-Linker]-[Caspase-8(1-277)]-[4AS-ünker]-[TNF-R2(286-461)]- COOH
Konstrukt (D): TRAF4-TRADD-DD NH2-[TRAF4]-[2AS-Linker]-[TRADD(169-312)]-COOH
Konstrukt (E): TRAF2-NT-TRADD-DD
NH2-[TRAF6]-[2AS-Linker]-[TRADD(169-312)]-COOH
Konstrukt (F): IKKγ-TRADD-DD
NH2-[IKKγH2AS-Linker]-[TRADD(169-312)]-COOH
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Koexpression bzw. einzelne Expression erfindungsgemäßer Bait- und Prey- Polypeptide
Beispiel 2
Expression des erfindungsgemäßen Bait-Komplexes aus TRADD und TRAF1
Beispiel 3, 4 und 5 Expression des erfindungsgemäßen Bait-Fusionsproteine TRAF4-TRADD-DD, TRAF2-NT-TRADD-DD und IKKγ-TRADD-DD sowie Rekrutierung von entsprechenden Prey-Proteinen.
Beispiel 6 Analyse der kinetischen Eigenschaften der Interaktion von IKKγ-TRADD-DD mit TRAF1 und TRAF1-TD mit Hilfe von GFP-Fusionsproteinen.
Beispiel 7
Konstruktion der erfindungsgemäßen Polypeptide TRAF2-NT-TRADD-DD, TRAF4-TRADD-DD, TRAF6-TRADD-DD, Myc-TRADD-DD-TNF-R2(cyt), Myc- Caspase-8-TNF-R2(cyt) und IKKγ-TRADD-DD.
Die Fusionsproteine wurden, wie folgt, hergestellt:
TRAF6-TRADD-DD:
1. cDNA für humanes TRAF6 wurde mit den Primern 1 und 2 mittels proof-reading PCR amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine Bgl2-
Schnittstelle und in das 3'-Ende eine Sac2-Schnittstelle eingeführt. Nach Verdau mit Bgl2 und Sac2 wurde die TRAF6-cDNA in den mit Bgl2 und Sac2 geschnittenen pEGFP-N1 Vektor eingefügt. Das so erhaltene Konstrukt pEGFP- N1-TRAF6-GFP kodiert für ein TRAF6 Fusionsprotein mit C-terminalem GFP.
2. cDNA für die AS 169-312 + Stopkodon des humanen TRADD (TRADD(169- 312)) wurde mit den Primern 3 und 4 mittels proof-reading PCR amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine Sac2-Schnittstelle und in das 3'-Ende eine Not1 -Schnittstelle eingeführt. Nach Verdau mit Sac2 und Not1 wurde die TRADD(169-312) cDNA in das mit Sac2 und Not1 geschnittenen pEGFP-N1-TRAF6-GFP Plasmid eingefügt. Das durch den Sac2/Not1- Verdau des pEGFP-N1-TRAF6-GFP Plasmids anfallende GFP-cDNA- Fragment wurde zuvor entfernt. Das so erhaltenen Plasmid pEGFP-N1- TRAF6-TRADD-DD kodiert für ein TRAF6-Protein, an das C-terminal einige Linker-kodierte AS sowie DD des TRADD Proteins folgt.
Myc-TRADD-DD-TNF-R2(cyt):
1. cDNA für die N-terminal myc (mit Start-ATG)-getaggten AS 195-312 des humanen TRADD wurden mit den Primern 5 und 6 mittels proof-reading PCR aus einem ein entsprechendes myc-getaggtes TRADD-Fragment kodierendem
Plasmid amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine HindS-Schnittstelle und in das 3'-Ende eine EcoR1 -Schnittstelle eingeführt. Nach Verdau mit Hind3 und EcoR1 wurde die myc-TRADD-cDNA in den mit Hind3 und EcoR1 geschnittenen pcDNA3.1 Vektor eingefügt. Das so erhalte- nen Konstrukt pcDNA3.1-myc-TRADD-DD kodiert für ein N-terminales myc- getaggtes TRADD-Fragment, das die DD des Moleküls beinhaltet.
2. cDNA für die AS 286-461des humanen TNF-R2 wurden mit den Primern 7 und 8 mittels proof-reading PCR aus Kym1-Gesamt-RNA durch RT-PCR amplifi- ziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine EcoR1-
Schnittstelle und in das 3'-Ende eine Not1 -Schnittstelle eingeführt. Nach Verdau mit EcoR1 und Not1 wurde die TNF-R2-cDNA-Fragment in das mit EcoR1
und Not1 geschnittenen pcDNA3.1-myc-TRADD-DD Plasmid eingefügt. Das so erhaltenen Konstrukt pcDNA3.1-myc-TRADD-DD-TNFR2(cyt) kodiert für ein N-terminales myc-getaggtes Fusionsprotein, aus einem auf den myc-tag folgenden TRADD-Fragment, das die DD des Moleküls beinhaltet, einigen Lin- ker-kodierten AS und einem C-terminalen Fragment, das für die zytoplasmati- sche Domäne des TNF-R2 kodiert.
Myc-Caspase-8(1-277)-TNF-R2(cyt):
1. cDNA für die AS 1-277 der humanen Caspase-8 wurden mit den Primern 9 und 10 mittels proof-reading PCR aus Kym1-Gesamt-RNA durch RT-PCR amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine BamH1- Schnittstelle und in das 3'-Ende eine EcoR5-Schnittstelle eingeführt. Nach Verdau mit BamH1 und EcoR5 wurde das Caspase-8-cDNA-Fragment in den mit BamH1 und EcoRδ geschnittenen pcDNA3.1-myc-TRADD-DD Vektor klo- niert, aus dem durch diesen Verdau gleichzeitig das TRADD-Fragment dele- tiert wurde. Das so erhaltenen Konstrukt pcDNA3.1-myc-Caspase-8(1-277) kodiert für ein N-terminal, myc-getaggtes Caspase-8 Fragment, das u.a. die DED des Moleküls enthält.
2. cDNA für die AS 286-461 des humanen TNF-R2 wurden mit den Primern 7 und 8 mittels proof-reading PCR aus Kym1-Gesamt-RNA durch RT-PCR amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine EcoR5- Schnittstelle und in das 3'-Ende eine Not1 -Schnittstelle eingeführt. Nach Verdau mit EcoRδ und Not1 wurde die TNF-R2-cDNA-Fragment in das mit EcoR5 und Not1 geschnittenen pcDNA3.1-myc-Caspase-8(1-277) Plasmid eingefügt.
Das so erhaltenen Konstrukt pcDNA3.1-myc-Caspase-8(1-277)-TNFR2(cyt) kodiert für ein N-terminales myc-getaggtes Fusionsprotein aus einem auf den myc-tag folgenden Caspase-8-Fragment, das die DED des Moleküls beinhaltet, einigen Linker-kodierten AS und einem C-terminalen Fragment, das für die zytoplasmatische Domäne des TNF-R2 kodiert.
TRAF4-TRADD-DD:
1. cDNA für humanes TRAF4 wurde mit den Primern 11 und 12 mittels proof- reading PCR amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine BamH1 -Schnittstelle und in das 3'-Ende eine Sac2-Schnittstelle eingeführt. Nach Verdau mit BamH1 und Sac2 wurde die TRAF4-CDNA in den mit Bgl2 und Sac2 geschnittenen pEGFP-N1 Vektor eingefügt. Das so erhaltene Konstrukt pEGFP-N1-TRAF4-GFP kodiert für ein TRAF4 Fusionsprotein mit C- terminalem GFP und einer zwischen TRAF4 und GFP liegenden Linker.
2. cDNA für die AS 169-312 + Stopkodon des humanen TRADD wurde mit den Primern 3 und 4 mittels proof-reading PCR amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine Sac2-Schnittstelle und in das 3'-Ende eine Not1 -Schnittstelle eingeführt. Nach Verdau mit Sac2 und Not1 wurde die TRADD(169-312) cDNA in das mit Sac2 und Not1 geschnittene pEGFP-N1- TRAF4-GFP Plasmid eingefügt. Das durch den Sac2/Not1 -Verdau des pEGFP-N1-TRAF4-GFP Piasmids anfallende GFP-cDNA-Fragment wurde zuvor entfernt. Das so erhaltenen Konstrukt pEGFP-N1-TRAF4-TRADD-DD kodiert für ein TRAF4-Protein, einigen Linker-kodierten AS auf die C-terminal die DD des TRADD Proteins folgt.
TRAF2-NT-TRADD-DD
1. cDNA für die N-terminalen 272 Aminosäuren des humanen TRAF2 (TRAF2- NT) wurde mit den Primern 13 und 14 mittels proof-reading PCR amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine BamH1 -Schnittstelle und in das 3'-Ende eine Sac2-Schnittstelle eingeführt. Nach Verdau mit BamH1 und Sac2 wurde die TRAF2-NT-cDNA in den mit Bgl2 und Sac2 geschnittenen pEGFP-N1 Vektor eingefügt. Das so erhaltene Konstrukt pEGFP- N1-TRAF2-NT-GFP kodiert für ein C-terminales Fusionsprotein der N- terminalen 180 Aminosäuren des TRAF2-Proteins mit GFP.
2. cDNA für die AS 169-312 + Stopkodon des humanen TRADD wurde aus dem Komnstrukt TRAF6-TRADD-DD durch Restriktionsverdau mit Sac2 und Not1 gewonnen. Nach Verdau des Piasmids pEGFP-N1-TRAF2-NT-GFP mit Sac2
und Not1 wurde das TRADD(169-312) cDNA-Fragment in dieses eingefügt. Das durch den Sac2/Not1 -Verdau des pEGFP-N1-TRAF2-NT-GFP Plasmid anfallende GFP-cDNA-Fragment wurde zuvor entfernt. Das so erhaltenen Plasmid pEGFP-N1-TRAF2-NT-TRADD-DD kodiert für ein Fusionsprotein be- stehend aus den 272 N-terminalen Aminosäuren des TRAF2-Proteins, einigen
Linker-kodierten AS sowie der DD des TRADD Proteins.
IKKγ-TRADD-DD
1. cDNA für die gesamte kodierende Region des humanen IKKD (auch NEMO genannt) wurde mit den Primern 15 und 16 mittels proof-reading PCR amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine BamH1- Schnittstelle und in das 3'-Ende eine Sac2-Schnittstelle eingeführt. Nach Verdau mit BamH1 und Sac2 wurde die IKKD-cDNA in den mit Bgl2 und Sac2 geschnittenen pEGFP-N1 Vektor eingefügt. Das so erhaltene Konstrukt pEGFP- N1-IKKD-GFP kodiert für ein C-terminales Fusionsprotein des IKKD-Proteins mit GFP.
2. cDNA für die AS 169-312 + Stopkodon des humanen TRADD wurde aus dem Komnstrukt TRAF6-TRADD-DD durch Restriktionsverdau mit Sac2 und Not1 gewonnen. Nach Verdau des Piasmids pEGFP-N1-IKKD-GFP mit Sac2 und
Not1 wurde das TRADD(169-312) cDNA-Fragment in dieses eingefügt. Das durch den Sac2/Not1 -Verdau des pEGFP-N1-IKKD-GFP Plasmid anfallende GFP-cDNA-Fragment wurde zuvor entfernt. Das so erhaltenen Plasmid pEGFP-N1-IKKD-TRADD-DD kodiert für ein Fusionsprotein bestehend aus dem kompletten IKKD-Protein, einigen Linker-kodierten AS sowie der DD des
TRADD Proteins.
Alle Klonierungs- und PCR-Amplifikationsschritte erfolgten nach üblichen Standardprozeduren mit den nachfolgenden Primern. Alle Konstrukte wurden zur Veri- fikation der cDNA-Sequenz sequenziert. Die Aminosäure-Numerierung und cDNA Sequenzverifikation erfolgte aufgrund der in der Genbank abgelegten und öffentlich zugänglichen Informationen (humanes TRAF2, Accession-No: U12597; hu-
manes TRAF4, Accession-No: X80200; humanes TRAF6, Accession-No: U78798; humanes TRADD, Accession-No: L41690; humanen TNF-R2, Accession-No: M55994; humane Caspase-8, Accession-No: NM001228, human IKKγ (NEMO), Accession-No.: NM003639).
Primer 1 :
5' GAC CAC AGA TCT GTT ACT ATG AGT CTG CTA AAC TGT G 3'
Primer 2: 5' CGG CTC GAG TTA CCG CGG GAG ATC CTC CAG GTC AGT TTA GTC 3' Primer 3: 5' ACA CAT CCG CGG GGT GGC GAC GGG GAG GTC GCT TCG 3'
Primer 4: 5' TTT ATA GCG GCC GCA GGT CTA GGC CAG GCC GCC ATT GGG 3'
Primer 5:
5' CCC AAG CTT GTC AAC ATG GCA TCA ATG CAG AAG CTG ATC 3'
Primer 6:
5' CCG GAA TTC GGC CAG GCC GCC ATT GGG ATC GGT 3'
Primer 7:
5' CCG GAT ATC GAA TTC CAG GTG AAA AAG AAG CCC TTG TGC 3'
Primer 8:
5' AAA TAT GCG GCC GCA CAG CCC ACA CCG GCC TGG TTA ACT 3'
Primer 9: 5' CGC GGG ATC CCC ATG GAC TTC AGC AGA AAT CTT TAT GAT 3'
Primer 10:
5' CCG GAT ATC CCT GTC CCT AAT GCT GTG AAG TTT GGG 3'
Primer 11
5' CAC GGA TCC CCC GCC ATG CCT GGC TTC GAC TAG 3'
Primer 12
5' CGG CTC CAG TTA CCG CGG GCT GAG GAT CTT CCG GGG CAG TTC 3'
Primer 13 5' CGG GAT CCT CTC ATG GCT GCA GCT AGC GTG ACC CCC CCT GGC 3'
Primer 14
5' TCC CCG CGG GCACCT CTG CAG GAG CTCTGA CCC 3'
Primer 15
5' CGG GAT CCT TGG ATG AAT AGG CAC CTC TGG AAG 3'
Primer 16
5' TCC CCG CGG CTC AAT GCA CTC CAT GAC ATG TAT CTG 3'
1 Verwendete Abkürzungen:
CARD caspase-recruitment domain
CFP cyan fluorescent protein clAP cellular inhibitor of apoptosis
DD death domain
DED death effector domain"
DsRED Discosom sp. Red
FADD Fas-associated protein with death domain
FIT Filament-based Interaction Trap
FITC Fluorescein Isothiocyanat
FLICE FADD-like ICE
FLIP FLICE inhibitory protein
GFP green fluorescent protein
IKK inhibitor of kappaB kinase
NEMO NF-kappaB essential Modulator
RAIDD RIP-associated ICH-1/CED-3-homologous protein with a death domain
RICK RIP-like mteracting CLARP kinase
RIP receptor interacting protein
TD TRAF domain
TNF Tumor-Nekrose-Faktor
TRADD TNF receptor-1 associated protein with death domain
TRAF TNF receptor associated factor
YFP yellow fluorescent protein