JP4903046B2 - γ−セクレターゼ阻害剤のスクリーニング方法 - Google Patents
γ−セクレターゼ阻害剤のスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4903046B2 JP4903046B2 JP2006529722A JP2006529722A JP4903046B2 JP 4903046 B2 JP4903046 B2 JP 4903046B2 JP 2006529722 A JP2006529722 A JP 2006529722A JP 2006529722 A JP2006529722 A JP 2006529722A JP 4903046 B2 JP4903046 B2 JP 4903046B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- secretase
- protein
- cell
- seq
- gamma
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
- C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
Description
1.以下の成分を含む、融合タンパク質をコードするトランスジーンを用い:
a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(配列番号1)を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
b)第一のヌクレオチド配列の5’末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
c)プロモーター、および、
d)場合により、さらなるコードおよび/または非コードヌクレオチド配列;
2.前記トランスジーンを細胞に組み込み、融合タンパク質を発現させ;
3.配列番号1のアミノ酸配列内で、前記融合タンパク質を細胞に存在するγ−セクレターゼによって切断し、それにより、アミノ酸配列GAIIGLMVGGVV(配列番号2)を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列VIVITLVML(配列番号3)を含む第二の部分タンパク質を形成させ、および、
4.第一の部分タンパク質および/または第二の部分タンパク質を検出し、ここにおいて、前記融合タンパク質は、配列番号1の他には、エンドまたはエキソサイトーシスおよび/またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する1種またはそれ以上のペプチドを含まない。
1.融合タンパク質をコードするトランスジーンを製造するか、または、用い、前記トランスジーンは、以下の成分を含む:
a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(配列番号1)を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
b)第一のヌクレオチド配列の5’末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
c)プロモーター、および、
d)場合により、さらなるコードおよび/または非コードヌクレオチド配列;
2.前記トランスジーンを細胞に組み込み、融合タンパク質を発現させ;
3.配列番号1のアミノ酸配列内で、前記融合タンパク質を細胞に存在するγ−セクレターゼによって切断し、それにより、アミノ酸配列GAIIGLMVGGVV(配列番号2)を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列VIVITLVML(配列番号3)を含む第二の部分タンパク質を形成させ;
4.第二の部分タンパク質の量を測定し、形成された第二の部分タンパク質の量からγ−セクレターゼの活性を測定し、
ここにおいて、前記融合タンパク質は、配列番号1の他には、エンドまたはエキソサイトーシスおよび/またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する1種またはそれ以上のペプチドを含まない。
第一のヌクレオチド配列は、配列番号1を含むアミロイド前駆体タンパク質(APP)またはその部分をコードしており、ここにおいて、前記APPまたはその部分は、エンドまたはエキソサイトーシスおよび/またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用するいかなるペプチドモチーフも含まない。好ましくは、前記第一のヌクレオチド配列は、配列番号1を含むアミノ酸配列を含むタンパク質、例えば配列番号6または配列番号14をコードする。さらなる実施形態において、第一のヌクレオチド配列は、配列番号1以外の、エンドまたはエキソサイトーシスおよび/またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用するペプチドモチーフをコードしないようにするため、短縮化されたAPP、または、改変されたAPPをコードし、これらは例えば部位特異的変異誘発によって得ることができる。さらなる他の実施形態において、前記第一のヌクレオチド配列によってコードされた前記APPまたはそれらの部分は、ヒト、マウスのAPP(例えば、APLP1またはAPLP2)由来のタンパク質である。
a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVMTLVML(配列番号1)を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
b)第一のヌクレオチド配列の5’末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
c)プロモーター、および、
d)第一のヌクレオチド配列の3’末端における、少なくとも1つのさらなるヌクレオチド配列、ここにおいて、前記ヌクレオチド配列は、DNA結合ドメイン、および、転写活性化ドメインをコードしており、
前記融合タンパク質は、配列番号1以外のエンドまたはエキソサイトーシスおよび/またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する1種またはそれ以上のペプチドを含まない。
1.トランスジェニック非ヒト生物(例えばトランスジェニックC.エレガンスもしくはサッカロミセス・セレビジエ)、または、トランスジェニック細胞を製造する工程、ここにおいて、前記トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、本発明に係るトランスジーンを含み、
前記トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、レポータープラスミドをさらに含み、前記レポータープラスミドは、タンパク質結合部位、最小プロモーターおよびレポーター遺伝子を有し、および
場合により、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするcDNAを有し、
ここにおいて、前記トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、前記トランスジーンを発現し、場合により、前記cDNAによってコードされたγ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼを発現する;
2.前記トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞を、調べようとする試験物質とインキュベートする工程;および、
3.第二の部分タンパク質の量を検出する工程。
1.本発明に係るトランスジーンを製造する/用いる;
2.γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードする前記トランスジーンおよびレポータープラスミド、および、場合によりcDNAを、細胞のゲノムに組み込み、前記トランスジーンによってコードされた融合タンパク質、および、場合により、前記cDNAによってコードされたγ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼを、調べようとする物質の存在下で発現させる;
3.前記融合タンパク質は、
a)配列番号1のアミノ酸配列内で、前記細胞中に存在するγ−セクレターゼによって切断され、それにより、
b)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVV(配列番号2)を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列VIVITLVML(配列番号3)を含む第二の部分タンパク質が形成される;および、
4.前記第二の部分タンパク質を定性的または定量的に測定する。
1.γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性の同定および測定(定性的および/または定量的)。
図2:図2は、本プロセスが基づく原理を模式的に示す:N末端におけるγ−セクレターゼ切断部位;膜貫通ドメインにおけるγ−セクレターゼ切断部位;C100=APPのC100フラグメント;GAL4−VP16=DNA結合ドメイン、転写活性化ドメイン(DNA結合ドメイン、および、転写活性化因子からなる)であり、レポータープラスミドのDNAにおけるタンパク質結合ドメインに結合する。
図3:発現プラスミドのSP−C100−GAL4−VP16の構築:aa=アミノ酸;制限切断部位SacI、HindIIIおよびKpnIは、プラスミド上の切断部位の位置を示す。
図4:発現プラスミドのpDBTrp−MET25−SP−C100−GAL4−VP16:酵母中でトランスジーンを発現させるための発現プラスミドの構築。
上記プラスミドは、APPのC末端の100個のアミノ酸残基(C100)に融合したAPPシグナルペプチド(SP)をコードする。C100は、Aβ−ペプチドのN末端から始まり、APPのC末端で終わる。C100は、Aβ−ペプチドを放出するために、γ−セクレターゼでさらに切断されなければならない。
GAL4/VP16(配列番号7)を、SP−C100のC末端(配列番号6)に融合させた。GAL4/VP16は、酵母の転写活性化因子GAL4の第一の147個のアミノ酸残基、および、VP16の78個のC末端のアミノ酸残基、単純疱疹ウイルス由来の転写活性化因子を含む。融合タンパク質として、GAL4フラグメントは、DNAと結合する機能を担っており、VP16フラグメント は、転写を活性化する(Sadowski等,1988年)。
pcDNA3.1+(インビトロジェンTMライフテクノロジーズ,オランダ,カタログ番号V79020)は、プラスミドベクターとして役立つ。
哺乳動物細胞レポータープラスミドpGL2−MRG5では、pGL2(プロメガ)において、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)コアプロモーター(Kretzschmar等,1994年)上流に5つのGAL4のDNA結合部位を含むpMRG5由来のDNAフラグメント(Ikeda等,1998年)が、pGL2のルシフェラーゼのレポーター遺伝子の上流に挿入されている。細胞培養中でのより簡単な検出のために、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子を、ベクターpEGFP−N1(クロンテック・ラボラトリーズ,ハイデルベルグ)から得られたEGFP(強化緑色蛍光タンパク質)遺伝子で置き換えた。
ヒト神経芽腫細胞SH−SY5Y(ATCC CRL−2266)を、実施例1および2の両方のプラスミドでコトランスフェクションし、次に、顕微鏡でEGFPを励起する、波長480nmの光の照射下で解析した。強い緑色蛍光を示すEGFP発現細胞を検出することができた。この緑色蛍光がレポータープラスミドによるEGFPの発現に特異的に依存していることを確認するために、SH−SY5Y細胞をレポータープラスミドpGL2−MRG5−EGFPのみでトランスフェクションした。これら細胞において、緑色蛍光は検出できなかった。この発現はGAL4−VP16によって活性化されたが、これは、タンパク質分解によるSP−C100−GAL4/VP16のC末端からのGAL4/VP16の放出を前提としている。
SP−C100−Gal4/VP16を、MET25プロモーターの制御下で、ADHプロモーターとGAL4DBドメイン(CYH2遺伝子とマルチクローニング部位の間に位置する)を含むpDBTrpの部分を、SP−C100−Gal4−VP16の上流にp415MET25(Mumberg等,1994年)由来のMET25プロモーターを含むDNAフラグメントで置き換えることにより、酵母発現ベクターpDBTrp(インビトロジェンTMライフテクノロジーズ,オランダ,カタログ番号10835023)中にクローニングした。酵母MaV203株(インビトロジェンTMライフテクノロジーズ)を、このコンストラクトで形質転換した。MaV203は遺伝子組換えにより改変されており、3つのGAL4誘導型レポーター遺伝子(URA3、HIS3、lacZ)を含み、これらは安定してゲノムに組み込まれている(Vidal等,1996年)。MaV203中で、タンパク質分解により、SP−C100−Gal4−VP16タンパク質からGAL4/VP16ドメインが放出され、それにより、URA3およびHIS3の読み出しが活性化され、ウラシルまたはヒスチジンが欠失したプレート上で増殖した。
MaV203中でSP−C100−Gal4−VP16cDNAの発現ではレポーターの低い活性のみが生じ、このインビボでの機能的な分析システムが、cDNAライブラリーにおけるγ−セクレターゼに関するcDNAのスクリーニングおよびその発現の検出に適するようになった。
ヒトB細胞cDNAライブラリー(ATCC87286;American Type Culture Collection,マナサス,バージニア州,米国;Elledge等,1991年)を、γ−セクレターゼ活性を有するタンパク質をコードするcDNAに関してスクリーニングするために、実施例4の組換えMaV203酵母株を用いた。あるいは、酵母発現ベクターp415−MET25(Mumberg等,1994年)またはp415−ADH1(Mumberg等,1995年)に組み込まれたヒト海馬のcDNAライブラリーも、γ−セクレターゼまたはγ−セクレターゼ様の活性を有するタンパク質をコードするcDNAに関するスクリーニングのために用いることができる。
SP−C100−GAL4/VP16(実施例1で記載した通り)のヒトシグナルペプチドに関するコード領域を、酵母SUC2遺伝子(SP2;配列番号12)から得られたシグナルペプチドで置き換え、SP2−C100−GAL4/VP16(配列番号19)をコードするコンストラクトが得られた。
SUC2−シグナルペプチドのコード配列(配列番号12)を含む5’−プライマーと、天然の停止コドン相当する3’−プライマー(Kang等,(1987年))を用いて、C100の成熟型(シグナル配列を含まない、配列番号4を参照)のコード領域を増幅することによって、SP2−C100を構築した。シグナルペプチドの交換を容易にするために、プライマーEH47(配列番号23)とEH49(配列番号24)を、得られたPCR産物が、シグナルペプチドと成熟ペプチドのコード領域を連結する新たなNheI部位を含むように設計した。
EH49:5’−CGGGATCCCTAGGCGCCGTTCTGCATCTGCTCAAAGAAC−3’
このフラグメントを、実施例4に記載した通りに、MET25プロモーターを含む酵母発現ベクターpDBTrp(インビトロジェンTMライフテクノロジーズ,オランダ,カタログ番号10835023)にクローニングした。
コンストラクトSP2−C−GAL4/VP16−100(配列番号17)を得るために、3つの独立したPCR反応を、以下のプライマーの使用によって行った:
EH53:5’−ACTATATCTAGAATGCTTTTGC−3’
EH54:5’−TTCGATAGAAGACAGTAGCTTGCCAGATCTACCTTTCTTCTTCAGCATCACCAA−3’
EH55:5’−TTGGTGATGCTGAAGAAGAAAGGTAGATCTGGCAAGCTACTGTCTTCTATCGAA−3’
EH56:5’−ATGATGAATGGATGTGTACTGGCCACTAGTACCCCCACCGTACTCGTCAATT−3’
EH57:5’−AATTGACGAGTACGGTGGGGGTACTAGTGGCCAGTACACATCCATTCATCAT−3’
EH59:5’−CGATAAGCTTGATATCGAATTC−3’。
2)SP2−C100の両端に対応する5’−および3’−フランキング領域を有するコード領域を増幅するために、プライマーEH55(配列番号27)とEH56(配列番号28)、および、DNAテンプレートとしてGAL4/VP16を用いて、PCR反応を行った。
3)プライマーEH57(配列番号29)とEH59(配列番号30)を用いるすることによって、C100の細胞質内のドメインをコードするSP2−C100の3’−セグメントを増幅し、GAL4/VP16コード領域の5’−オーバーラップを得た。得られたPCR産物(約200bp、720bp、および、100bp)を精製し、SP2−C100の5’−および3’末端に相当するEH53とEH59の存在下での最終的なPCRに用いた。
哺乳動物細胞系中でSP3−C100、SP3−C100−GAL4/VP16(配列番号21)、および、SP3−C−GAL4/VP16−100(配列番号32)を発現させるのための3種のプラスミドベクターを作るために、C100、C100−GAL4/VP16またはC−GAL4/VP16−100のいずれかを、実施例6または7の酵母発現ベクターから、BM40シグナルペプチド(SP3;配列番号13)のコード領域を含む哺乳動物発現ベクターpRc/CMV(インビトロジェン,カタログ番号V75020)にサブクローニングした。C100、C100−GAL4/VP16、または、C−GAL4/VP16−100のコード領域を、実施例6に記載したSP3コード領域の唯一のNheI制限部位に、フレーム内でライゲートした。
形質転換された酵母からの粗溶解産物中で、異なるコンストラクトの発現レベルを定量した結果、SP−C100−GAL4/VP16の発現は、酵母SUC2シグナルペプチドとの融合体をコードするベクターで形質転換された酵母細胞からの溶解産物と比較して極めて低いことが明らかになった。例えば、SP2−C100−GAL4/VP16の発現により、期待したサイズの特異的なバンドの強い発現がみられた。しかしながら、免疫ブロッティングにより、より高い電気泳動移動度を有するバンドも検出することができ、これは、酵母において組換えタンパク質が非特異的に分解されていることを示していた。このタンパク質の安定性は、GAL4/VP16ドメインを、C100のγ−セクレターゼ切断部位の近傍でフレーム内に挿入したC−GAL4/VP16−100の場合に改善された(以下を参照)。両方の融合タンパク質は、GAL4/VP16を含まずC100をコードするコンストラクトと同等の発現レベルを得たが、これは、2種の異なるC100とGAL4/VP16との融合は、タンパク質発現を妨害しないことを示していた。
シグナルペプチドの交換によるC100−GAL4/VP16発現の増加は、酵母株MaV203における、URA3、HIS3およびlacZレポーターシステムの非特異的な活性化の大きな増加と関連していた。酵母はγ−セクレターゼ活性がないため、これは、細胞のプロテアーゼによるC100−GAL4/VP16の非特異的プロセシングと、活性なGAL4/VP16の放出による可能性が最も高い。
γ−セクレターゼ切断部位の近傍へGAL4/VP16ドメインを移動することによって、C100の膜貫通ドメインと、GAL4/VP16ドメインのアミノ末端との間の部位での、C100−GAL4/VP16で検出された非特異的なタンパク質分解的切断を実質的に除去した。
レポーターシステムのGAL4/VP16依存性の活性化を試験することによって、MaV203での様々なコンストラクトの切断を試験した。
MaV203のSP−C100−GAL4/VP16での形質転換により、Ura+、His-の表現型が示された(実施例4を参照)。SPシグナルペプチドをSP2ペプチドで置き換えること(SP2−C100−GAL4/VP16を得る)によって発現レベルが増加することにより、全ての読み出しが、全長GAL4タンパク質(プラスミドpCL1によってコードされた;クロンテック・ラボラトリーズ)を構成的に発現するポジティブコントロールのMaV203で検出されたレベルと同様のレベルまで強く活性化された。
それに対して、SP2−C100−GAL4/VP16に匹敵するレベルでSP2−C−GAL4/VP16−100を発現するMaV203細胞は、Ura-、His - の表現型を示し、空のベクターコントロールで形質転換されたMaV203も同様であった。
従って、酵母では、SP2−C−GAL4/VP16−100を高度に発現させることができるが、それでもなおGAL4依存性レポーターの極めて低い非特異的な活性化を示した。SP2−C−GAL4/VP16−100タンパク質の高いレベルの発現、それにあわせて非特異的な切断/レポーター活性化の低いバックグラウンドは、驚異的に最適化されたシグナル/ノイズ比を有する読み出しシステムの必要条件である。
哺乳動物細胞で発現されたSP3−C−GAL4/VP16−100タンパク質は、γ−セクレターゼ活性によって正確にプロセシングされることを実証するために、SP3−C−GAL4/VP16−100を、γ−セクレターゼ活性を内因的に発現することがわかっている哺乳動物細胞にトランスフェクションした(Haass等,1992年)。哺乳動物細胞での発現のために、実施例8に記載している通りに、SP2−C−GAL4/VP16−100中のシグナルペプチドを、高いレベルの発現で知られている基底膜タンパク質BM40から得られた哺乳動物のシグナルペプチド(SP3;配列番号13)で置き換えた。γ−セクレターゼのプロセシングを、培地へのAβの分泌を定量することによってモニターした。分泌されたAβを、モノクローナル抗体6E10と、ビオチン化した4G8をそれぞれ捕獲および検出抗体として用いたサンドイッチELISAによって検出した(セネテックPLC(Senetek PLC),ナパ,カリフォルニア州,米国;Kim等,1990年を参照)。
SP3−C100でトランスフェクションした後に、空のベクターコントロールと比較して、Aβ分泌の8倍の増加を観察した。SP3−C100−GAL4/VP16またはSP3−C−GAL4/VP16−100でトランスフェクションされた細胞は、同様の量のAβを分泌し、これは、C末端もGAL4/VP16の膜近傍の融合も、γ−セクレターゼによるタンパク質分解のプロセシングを妨害しないことを示していた。
γ−セクレターゼによるC100−GAL4/VP16とC−GAL4/VP16−100のプロセシングによって、C100のフランキング部分から、GAL4/VP16と、追加のアミノ酸を含むポリペプチドが放出された。SP3−C100−GAL4/VP16及びSP3−C−GAL4/VP16−100を、実施例2に記載した、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)コアプロモーター上流の5つのGAL4のDNA結合部位及びEGFPをコードするcDNAを含む哺乳動物のレポータープラスミドpGL2−MRG5−EGFP(Ikeda等,1998年)と共にコトランスフェクションした。pGL2−MRG5−EGFP及びGAL4/VP16を含む融合体をコトランスフェクションすることにより、いずれの場合も、GFP陽性細胞が生じた。
APPのC100配列とGAL4/VP16を含むコンストラクトは、γ−セクレターゼの切断部位と、カスパーゼ様プロテアーゼの切断部位の両方を含む。非特異的なカスパーゼ様活性が、SP3−C100−GAL4/VP16を本来のγ−セクレターゼ部位とGAL4/VP16ドメインとの間で切断し、GAL4/VP16を放出して、哺乳動物細胞におけるレポーターシステムを活性化する可能性を回避するために、SP3−C100−GAL4/VP16に含まれる、APPの細胞質内のドメインをコードする、C100の45個のアミノ酸からなるC末端セグメントを削除した。また、C100のC末端の45個のアミノ酸を除去することによって、細胞質膜に挿入された後のAPPのエンドサイトーシスを指示するAPPのC末端における「内在化シグナル」ペプチドも除去される。
従って、哺乳動物の発現プラスミドSP3−C55−GAL4/VP16は、BM40シグナルペプチド(配列番号13)、APP−C100のN末端の55個のアミノ酸残基(C55;配列番号6)、および、GAL4/VP16を含む。C55は、Aβ−ペプチドのN末端で始まり、APPの膜貫通ドメインで終わる。SP3−C55−GAL4/VP16タンパク質において、γ−セクレターゼの切断部位のみが存在する。C55はγ−セクレターゼ切断部位を含み、Aβ−ペプチドとGAL4/VP16を放出するためにはγ−セクレターゼによって切断されなければならない。その上、SP3−C55−GAL4/VP16には細胞内の内在化シグナルペプチドが存在しないために、細胞質膜結合型のC55−GAL4/VP16の切断を触媒するγ−セクレターゼのみが、Aβ−ペプチドを放出し、レポーターシステムのGAL4/VP16依存性転写を活性化すると予想される。
GAL4/VP16配列の後に停止コドン(TAG)を導入することによって、ベクターSP3−C−GAL4/VP16−100から発現プラスミドを得た。これは、DNAテンプレートとしてSP3−C−GAL4/VP16−100を用い、GAL4/VP16の唯一のHpaI部位の上流の5’−プライマー、および、GAL4/VP16のオープンリーディングフレームのC末端にTAG停止コドン(下線で示す)と、ClaI制限部位を導入する3’−プライマー(5’−CCATCGATTTTCTAACCCCCACCGTA−3’;配列番号31)を用いたPCRによって生成したDNAフラグメントで、SP3−C−GAL4/VP16−100のHpaI−ClaIフラグメントを置き換えることによって行われた。
HEK293細胞(ヒト胎児腎臓細胞系(ATCC))を、プラスミドSP3−C55−GAL4/VP16と、ルシフェラーゼレポータープラスミドPGL2−MRG5(実施例2に記載した)でコトランスフェクションした。その後、ネオマイシン耐性クローンを選択するために、400μg/mlのゲネチシン(ギブコBRL(GibcoBRL))とインキュベートことによって安定な細胞系を選択し、その後、SP3−C55−GAL4/VP16とルシフェラーゼの安定な発現に関して特徴付けられた。
マルチウェル12プレートで、HEK293細胞を、SP3−C55−GAL4/VP16ベクター(0.03μg)と、pGL2−MRG5ルシフェラーゼレポーターベクター(1μg)でコトランスフェクションした。
化合物のDPAT(エラン・ファーマシューティカルズ(Elan Pharmaceuticals)製;Dovey等,2001年)、および、L−685,458(メルク・ファーマシューティカルズ(Merck Pharmaceuticals)製;Shearman等,2000年)は、いずれも既知のγ−セクレターゼ阻害剤であり、用量依存性でルシフェラーゼ活性とAβ生産を阻害し、それぞれ14nM(DAPT)、19nM(L−685,458)のIC50を示した。
ブライト−グロー(Bright−Glo)ルシフェラーゼ分析キット(プロメガ)で、ルシフェラーゼ活性を定量した。細胞培地中のAβを、ELISAで、実施例11に記載した抗体4G8および6E10(セネテック製)を用いて定量した。これら抗体は、Aβ−ペプチドのアミノ酸17〜24(4G8)、および、1〜17(6E10)に特異的である。
一過性トランスフェクション実験において、免疫沈降反応と免疫ブロッティングによってもAβが同定された。両方の方法により、Aβ−ペプチドに相当する4kDaのバンドが同定された。
実施例14に従って、SP3−C55−GAL4/VP16とMRG5−ルシフェラーゼコンストラクトの両方を安定して発現するHEK293細胞のクローンを同定した。この細胞のクローンを用いて、DAPT(エラン・ファーマシューティカルズ製;Dovey等,2001年)と、L−685,458(メルク・ファーマシューティカルズ製;Shearman等,2000年)に対する、安定してトランスフェクションされた哺乳動物細胞の分析システムの応答性を試験した。両方の化合物は、用量依存性でルシフェラーゼ活性の阻害を示し(24時間の処理)、IC50は、それぞれ230nM(DAPT)、および、130nM(L−685,458)であった。
γ−セクレターゼ阻害剤を同定するために、安定して二重にトランスフェクションされたHEK293細胞(実施例14を参照)を、マルチウェル96プレート中で、分析中の濃度が10μMまたはそれ未満の調査中の化合物(例えば化合物ライブラリースクリーニング)の存在下でインキュベートし、24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ分析システムキット(プロメガ)、ブライト−グロールシフェラーゼ分析キット(プロメガ)、または、ルシフェラーゼ定量化のためのその他のあらゆる方法を用いてルシフェラーゼ活性を定量することができる。ルシフェラーゼ活性の減少は、γ−セクレターゼ活性の減少を示す。
Dovey et al. (2001) J. Neurochem. 76, 173.
Elledge et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1731.
Estus et al. (1992) Science 255, 726.
Haass et al. (1992) Nature 359, 322.
Heijne et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14(11), 4683-4690.
Hilbich et al. (1991) J. Mol. Biol. 218, 149.
Ikeda et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 18, 10.
Kang et al. (1987) Nature 325, 733.
Kim et al. (1990) Neurosci. Res. Comm. 7, 113.
Kretzschmar et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14, 3927.
Maruyama et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 202, 1517.
Mattson (2003) Nature 422, 385.
Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 5767.
Mumberg et al. (1995) Gene 156, 119.
Rumble et al. (1989), N. Engl. J. Med. 320, 1446.
Sadowski et al. (1988) Nature 335, 563.
Scheuner et al. (1996), Nature Medicine 2, 864.
Shearman et al. (2000) Biochemistry 39, 8698.
Simons et al. (1996) J. Neurosci. 16(3), 899-908.
Suzuki et al. (1994) Science 264(5163),1336-1340.
Vidal et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10315.
Yankner et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9020.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith,
J. A., and Struhl, K. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, pp. 13.7.1-13.7.2, Greene Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York
Mello, C. and Fire, A. (1995) DNA transformation. In: Epstein, H.F. and Shakes, D.C., ed. Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. Methods in Cell Biology, Vol. 48. Academic Press, San Diego, CA, pp. 451-482.
GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML
GAIIGLMVGGVV
VIVITLVML
LDAEFRHDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG AIIGLMVGGV VIATVIVITL
VMLKKKQYTS IHHGVVEVDA AVTPEERHLS KMQQNGYENP TYKFFEQMQN
MLPGLALFLL AAWTARA
LDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII
GLMVGGVVIA TVIVITLVML KK
MKLLSSIEQA CDICRLKKLK CSKEKPKCAK CLKNNWECRY SPKTKRSPLT
RAHLTEVESR LERLEQLFLL IFPREDLDMI LKMDSLQDIK ALLTGLFVQD
NVNKDAVTDR LASVETDMPL TLRQHRISAT SSSEESSNKG QRQLTVSPEF
PGIWAPPTDV SLGDELHLDG EDVAMAHADA LDDFDLDMLG DGDSPGPGFT
PHDSAPYGAL DMADFEFEQM FTDALGIDEY GG
GGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTAC
GGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTC
ATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACC
CCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAAT
GGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTA
TTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTT
GGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTG
GATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACC
GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTA
ATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCACAGCTAGCGCA CTCGGTGCCCCGCGCAGGGTCGCGATGCTGCCCGGTTTGGCACTGTTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACGCGCGGGGTACCCCGGCG ATGAAGC TACTGTCTTC TATCGAACAA GCATGCGATA TTTGCCGACT TAAAAAGCTC AAGTGCTCCA AAGAAAAACC GAAGTGCGCC AAGTGTCTGA AGAACAACTG GGAGTGTCGC TACTCTCCCA AAACCAAAAG GTCTCCGCTG ACTAGGGCAC ATCTGACAGA AGTGGAATCA AGGCTAGAAA GACTGGAACA GCTATTTCTA CTGATTTTTC CTCGAGAAGA CCTTGACATG
ATTTTGAAAA TGGATTCTTT ACAGGATATA AAAGCATTGT TAACAGGATT ATTTGTACAA GATAATGTGA ATAAAGATGC CGTCACAGAT AGATTGGCTT CAGTGGAGAC TGATATGCCT CTAACATTGA GACAGCATAG AATAAGTGCG ACATCATCAT CGGAAGAGAG TAGTAACAAA GGTCAAAGAC AGTTGACTGT ATCG CCGGAATTCCCGGGGATCTGGGC CCCCCCGAC CGATGTCAGC CTGGGGGACG AGCTCCACTT AGACGGCGAG GACGTGGCGA TGGCGCATGC CGACGCGCTA GACGATTTCG ATCTGGACAT GTTGGGGGAC GGGGATTCCC CGGGGCCGGG ATTTACCCCC CACGACTCCG CCCCCTACGG CGCTCTGGAT ATGGCCGACT TCGAGTTTGA GCAGATGTTT ACCGATGCCC TTGGAATTGA CGAGTACGGT GGGTAG
AGTTTCCTCG GCAGCGGTAG GCGAGAGCAC GCGGAGGAGC GTGCGCGGGG GCCCCGGGAG
ACGGCGGCGG TGGCGGCGCG GGCAGAGCAA GGACGCGGCG GATCCCACTC GCACAGCAGC
GCACTCGGTG CCCCGCGCAG GGTCGCGATG CTGCCCGGTT TGGCACTGCT CCTGCTGGCC
GCCTGGACGG CTCGGGCGCT GGAGGTACCC ACTGATGGTA ATGCTGGCCT GCTGGCTGAA
CCCCAGATTG CCATGTTCTG TGGCAGACTG AACATGCACA TGAATGTCCA GAATGGGAAG
TGGGATTCAG ATCCATCAGG GACCAAAACC TGCATTGATA CCAAGGAAGG CATCCTGCAG
TATTGCCAAG AAGTCTACCC TGAACTGCAG ATCACCAATG TGGTAGAAGC CAACCAACCA
GTGACCATCC AGAACTGGTG CAAGCGGGGC CGCAAGCAGT GCAAGACCCA TCCCCACTTT
GTGATTCCCT ACCGCTGCTT AGTTGGTGAG TTTGTAAGTG ATGCCCTTCT CGTTCCTGAC
AAGTGCAAAT TCTTACACCA GGAGAGGATG GATGTTTGCG AAACTCATCT TCACTGGCAC
ACCGTCGCCA AAGAGACATG CAGTGAGAAG AGTACCAACT TGCATGACTA CGGCATGTTG
CTGCCCTGCG GAATTGACAA GTTCCGAGGG GTAGAGTTTG TGTGTTGCCC ACTGGCTGAA
GAAAGTGACA ATGTGGATTC TGCTGATGCG GAGGAGGATG ACTCGGATGT CTGGTGGGGC
GGAGCAGACA CAGACTATGC AGATGGGAGT GAAGACAAAG TAGTAGAAGT AGCAGAGGAG
GAAGAAGTGG CTGAGGTGGA AGAAGAAGAA GCCGATGATG ACGAGGACGA TGAGGATGGT
GATGAGGTAG AGGAAGAGGC TGAGGAACCC TACGAAGAAG CCACAGAGAG AACCACCAGC
ATTGCCACCA CCACCACCAC CACCACAGAG TCTGTGGAAG AGGTGGTTCG AGTTCCTACA
ACAGCAGCCA GTACCCCTGA TGCCGTTGAC AAGTATCTCG AGACACCTGG GGATGAGAAT
GAACATGCCC ATTTCCAGAA AGCCAAAGAG AGGCTTGAGG CCAAGCACCG AGAGAGAATG
TCCCAGGTCA TGAGAGAATG GGAAGAGGCA GAACGTCAAG CAAAGAACTT GCCTAAAGCT
GATAAGAAGG CAGTTATCCA GCATTTCCAG GAGAAAGTGG AATCTTTGGA ACAGGAAGCA
GCCAACGAGA GACAGCAGCT GGTGGAGACA CACATGGCCA GAGTGGAAGC CATGCTCAAT
GACCGCCGCC GCCTGGCCCT GGAGAACTAC ATCACCGCTC TGCAGGCTGT TCCTCCTCGG
CCTCGTCACG TGTTCAATAT GCTAAAGAAG TATGTCCGCG CAGAACAGAA GGACAGACAG
CACACCCTAA AGCATTTCGA GCATGTGCGC ATGGTGGATC CCAAGAAAGC CGCTCAGATC
CGGTCCCAGG TTATGACACA CCTCCGTGTG ATTTATGAGC GCATGAATCA GTCTCTCTCC
CTGCTCTACA ACGTGCCTGC AGTGGCCGAG GAGATTCAGG ATGAAGTTGA TGAGCTGCTT
CAGAAAGAGC AAAACTATTC AGATGACGTC TTGGCCAACA TGATTAGTGA ACCAAGGATC
AGTTACGGAA ACGATGCTCT CATGCCATCT TTGACCGAAA CGAAAACCAC CGTGGAGCTC
CTTCCCGTGA ATGGAGAGTT CAGCCTGGAC GATCTCCAGC CGTGGCATTC TTTTGGGGCT
GACTCTGTGC CAGCCAACAC AGAAAACGAA GTTGAGCCTG TTGATGCCCG CCCTGCTGCC
GACCGAGGAC TGACCACTCG ACCAGGTTCT GGGTTGACAA ATATCAAGAC GGAGGAGATC
TCTGAAGTGA AGATGGATGC AGAATTCCGA CATGACTCAG GATATGAAGT TCATCATCAA
AAATTGGTGT TCTTTGCAGA AGATGTGGGT TCAAACAAAG GTGCAATCAT TGGACTCATG
GTGGGCGGTG TTGTCATAGC GACAGTGATC GTCATCACCT TGGTGATGCT GAAGAAGAAA
CAGTACACAT CCATTCATCA TGGTGTGGTG GAGGTTGACG CCGCTGTCAC CCCAGAGGAG
CGCCACCTGT CCAAGATGCA GCAGAACGGC TACGAAAATC CAACCTACAA GTTCTTTGAG
CAGATGCAGA ACTAGACCCC CGCCACAGCA GCCTCTGAAG TTGGACAGCA AAACCATTGC
TTCACTACCC ATCGGTGTCC ATTTATAGAA TAATGTGGGA AGAAACAAAC CCGTTTTATG
ATTTACTCAT TATCGCCTTT TGACAGCTGT GCTGTAACAC AAGTAGATGC CTGAACTTGA
ATTAATCCAC ACATCAGTAA TGTATTCTAT CTCTCTTTAC ATTTTGGTCT CTATACTACA
TTATTAATGG GTTTTGTGTA CTGTAAAGAA TTTAGCTGTA TCAAACTAGT GCATGAATAG
ATTCTCTCCT GATTATTTAT CACATAGCCC CTTAGCCAGT TGTATATTAT TCTTGTGGTT
TGTGACCCAA TTAAGTCCTA CTTTACATAT GCTTTAAGAA TCGATGGGGG ATGCTTCATG
TGAACGTGGG AGTTCAGCTG CTTCTCTTGC CTAAGTATTC CTTTCCTGAT CACTATGCAT
TTTAAAGTTA AACATTTTTA AGTATTTCAG ATGCTTTAGA GAGATTTTTT TTCCATGACT
GCATTTTACT GTACAGATTG CTGCTTCTGC TATATTTGTG ATATAGGAAT TAAGAGGATA
CACACGTTTG TTTCTTCGTG CCTGTTTTAT GTGCACACAT TAGGCATTGA GACTTCAAGC
TTTTCTTTTT TTGTCCACGT ATCTTTGGGT CTTTGATAAA GAAAAGAATC CCTGTTCATT
GTAAGCACTT TTACGGGGCG GGTGGGGAGG GGTGCTCTGC TGGTCTTCAA TTACCAAGAA
TTCTCCAAAA CAATTTTCTG CAGGATGATT GTACAGAATC ATTGCTTATG ACATGATCGC
TTTCTACACT GTATTACATA AATAAATTAA ATAAAATAAC CCCGGGCAAG ACTTTTCTTT
GAAGGATGAC TACAGACATT AAATAATCGA AGTAATTTTG GGTGGGGAGA AGAGGCAGAT
TCAATTTTCT TTAACCAGTC TGAAGTTTCA TTTATGATAC AAAAGAAGAT GAAAATGGAA
GTGGCAATAT AAGGGGATGA GGAAGGCATG CCTGGACAAA CCCTTCTTTT AAGATGTGTC
TTCAATTTGT ATAAAATGGT GTTTTCATGT AAATAAATAC ATTCTTGGAG GAGC
ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGGACGGATCGCTTGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGATGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATCTGCAGCTCTGGCCCGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTGGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTTTCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCGCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATACGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGTACCGATCCCGAGCTTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCAGTATAATGTTACATGCGTACACGCGTCTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTGAAATATAAATAACGTTCTTAATACTAACATAACTATAAAAAAATAAATAGGGACCTAGACTTCAGGTTGTCTAACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGTGGGGGGAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATATCGACAAAGGAAAAGGGGCCTGTTTACTCACAGGCTTTTTTCAAGTAGGTAATTAAGTCGTTTCTGTCTTTTTCCTTCTTCAACCCACCAAAGGCCATCTTGGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATAGAAATAATACAGAAGTAGATGTTGAATTAGATTAAACTGAAGATATATAATTTATTGGAAAATACATAGAGCTTTTTGTTGATGCGCTTAAGCGATCAATTCAACAACACCACCAGCAGCTCTGATTTTTTCTTCAGCCAACTTGGAGACGAATCTAGCTTTGACGATAACTGGAACATTTGGAATTCTACCCTTACCCAAGATCTTACCGTAACCGGCTGCCAAAGTGTCAATAACTGGAGCAGTTTCCTTAGAAGCAGATTTCAAGTATTGGTCTCTCTTGTCTTCTGGGATCAATGTCCACAATTTGTCCAAGTTCAAGACTGGCTTCCAGAAATGAGCTTGTTGCTTGTGGAAGTATCTCATACCAACCTTACCGAAATAACCTGGATGGTATTTATCCATGTTAATTCTGTGGTGATGTTGACCACCGGCCATACCTCTACCACCGGGGTGCTTTCTGTGCTTACCGATACGACCTTTACCGGCTGAGACGTGACCTCTGTGCTTTCTAGTCTTAGTGAATCTGGAAGGCATTCTTGATTAGTTGGATGATTGTTCTGGGATTTAATGCAAAAATCACTTAAGAAGGAAAATCAACGGAGAAAGCAAACGCCATCTTAAATATACGGGATACAGATGAAAGGGTTTGAACCTATCTGGAAAATAGCATTAAACAAGCGAAAAACTGCGAGGAAAATTGTTTGCGTCTCTGCGGGCTATTCACGCGCCAGAGGAAAATAGGAAAAATAACAGGGCATTAGAAAAATAATTTTGATTTTGGTAATGTGTGGGTCCTGGTGTACAGATGTTACATTGGTTACAGTACTCTTGTTTTTGCTGTGTTTTTCGATGAATCTCCAAAATGGTTGTTAGCACATGGAAGAGTCACCGATGCTAAGTTATCTCTATGTAAGCTACGTGGCGTGACTTTTGATGAAGCCGCACAAGAGATACAGGATTGGCAACTGCAAATAGAATCTGGGGATCCCCCCTCGACGGATGCAAGGGTTCGAATCCCTTAGCTCTCATTATTTTTTGCTTTTTCTCTTGAG.GTSGTCACATGATCGCAAAATGGCAAATGGCACGTGAAGCTGTCGATATTGGGGAACTGTGGTGGTTGGCAAATGACTAATTAAGTTAGTCAAGGCGCCATCCTCATGAAAACTGTGTAACATAATAACCGAAGTGTCGAAAAGGTGGCACCTTGTCCAATTGAACACGCTCGATGAAAAAAATAAGATATATATAAGGTTAAGTAAAGCGTCTGTTAGAAAGGAAGTTTTTCCTTTTTCTTGCTCTCTTGTCTTTTCATCTACTATTTCCTTCGTGTAATACAGGGTCGTCAGATACATAGATACAATTCTATTACCCCCATCCATACATCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTCACAGCTAGCGCACTCGGTGCCCCGCGCAGGGTCGCGATGCTGCCCGGTTTGGCACTGTTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACGCGCGGGGTACCCCGGCGATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAACAAGCATGCGATATTTGCCGACTTAAAAAGCTCAAGTGCTCCAAAGAAAAACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTGAAGAACAACTGGGAGTGTCGCTACTCTCCCAAAACCAAAAGGTCTCCGCTGACTAGGGCACATCTGACAGAAGTGGAATCAAGGCTAGAAAGACTGGAACAGCTATTTCTACTGATTTTTCCTCGAGAAGACCTTGACATGATTTTGAAAATGGATTCTTTACAGGATATAAAAGCATTGTTAACAGGATTATTTGTACAAGATAATGTGAATAAAGATGCCGTCACAGATAGATTGGCTTCAGTGGAGACTGATATGCCTCTAACATTGAGACAGCATAGAATAAGTGCGACATCATCATCGGAAGAGAGTAGTAACAAAGGTCAAAGACAGTTGACTGTATCGCCGGAATTCCCGGGGATCTGGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGATGTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGGTAGGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGACCCCGGGTGCTAGCAAGGCCTTGTGGCCAGCCATGGCAACTAGTGCGGCCGCTAAGTAAGTAAGACGTCGAGCTCTAAGTAAGTAACGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTTTGGACTTCTTCGCCAGAGGTTTGGTCAAGTCTCCAATCAAGGTTGTCGGCTTGTCTACCTTGCCAGAAATTTACGAAAAGATGGAAAAGGGTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTGTTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGCATGAGGTCGCTCTTATTGACCACACCTCTACCGGCATGCCGAGCAAATGCCTGCAAATCGCTCCCCATTTCACCCAATTGTAGATATGCTAACTCCAGCAATGAGTTGATGAATCTCGGTGTGTATTTTATGTCCTCAGAGGACAATACCTGTTGTAATCGTTCTTCCACACGGATCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCAGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCTCCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAACATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGCTCTCTTGCCTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGCTTCTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTATGTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGGTATTCTTGCCACGACTCATCTCCATGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCAGAGCCAAAACATCCTCCTTAGGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGGAGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCGGGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGAATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTTTTCTTTTTTCGACCGAATTAATTCTTAATCGGCAAAAAAAGAAAAGCTCCGGATCAAGATTGTACGTAAGGTGACAAGCTATTTTTCAATAAAGAATATCTTCCACTACTGCCATCTGGCGTCATAACTGCAAAGTACACATATATTACGATGCTGTCTATTAAATGCTTCCTATATTATATATATAGTAATGTCGTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGA
MLPGLALFLL AAWTARALDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII
GLMVGGVVIA TVIVITLVML KKKQYTSIHH GVVEVDAAVT PEERHLSKMQ
QNGYENPTYK FFEQMQNARG TPAMKLLSSI EQACDICRLK KLKCSKEKPK
CAKCLKNNWE CRYSPKTKRS PLTRAHLTEV ESRLERLEQL FLLIFPREDL
DMILKMDSLQ DIKALLTGLF VQDNVNKDAV TDRLASVETD MPLTLRQHRI
SATSSSEESS NKGQRQLTVS PEFPGIWAPP TDVSLGDELH LDGEDVAMAH
ADALDDFDLD MLGDGDSPGP GFTPHDSAPY GALDMADFEF EQMFTDALGI
DEY GG
MLLRAFLFLLAGFAAKISAALA
MRAWIFFLLCLAGRALA
MLPGLALFLL AAWTARALDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII
GLMVGGVVIA TVIVITLVML KKKGRSGKLL SSIEQACDIC RLKKLKCSKE
KPKCAKCLKN NWECRYSPKT KRSPLTRAHL TEVESRLERL EQLFLLIFPR
EDLDMILKMD SLQDIKALLT GLFVQDNVNK DAVTDRLASV ETDMPLTLRQ
HRISATSSSE ESSNKGQRQL TVSPEFPGIW APPTDVSLGD ELHLDGEDVA
MAHADALDDF DLDMLGDGDS PGPGFTPHDS APYGALDMAD FEFEQMFTDA
LGIDEYGG
1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg
61 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg
121 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc
181 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt
241 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata
301 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc
361 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc
421 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt
481 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt
541 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca
601 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg
661 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc
721 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg
781 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca
841 ctgcttaact ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagaccca agcttctgcc
901 tgccgcctgc ctgcctgcca ctgagggttc ccagcaccat gagggcctgg atcttctttc
961 tcctttgcct ggccgggagg gctctggcag ccccgctagc tgatgcagaa ttccgacatg
1021 actcaggata tgaagttcat catcaaaaat tggtgttctt tgcagaagat gtgggttcaa
1081 acaaaggtgc aatcattgga ctcatggtgg gcggtgttgt catagcgaca gtgatcgtca
1141 tcaccttggt gatgctgaag aagaaaggta gatctggcaa gctactgtct tctatcgaac
1201 aagcatgcga tatttgccga cttaaaaagc tcaagtgctc caaagaaaaa ccgaagtgcg
1261 ccaagtgtct gaagaacaac tgggagtgtc gctactctcc caaaaccaaa aggtctccgc
1321 tgactagggc acatctgaca gaagtggaat caaggctaga aagactggaa cagctatttc
1381 tactgatttt tcctcgagaa gaccttgaca tgattttgaa aatggattct ttacaggata
1441 taaaagcatt gttaacagga ttatttgtac aagataatgt gaataaagat gccgtcacag
1501 atagattggc ttcagtggag actgatatgc ctctaacatt gagacagcat agaataagtg
1561 cgacatcatc atcggaagag agtagtaaca aaggtcaaag acagttgact gtatcgccgg
1621 aattcccggg gatctgggcc cccccgaccg atgtcagcct gggggacgag ctccacttag
1681 acggcgagga cgtggcgatg gcgcatgccg acgcgctaga cgatttcgat ctggacatgt
1741 tgggggacgg ggattccccg ggtccgggat ttacccccca cgactccgcc ccctacggcg
1801 ctctggatat ggccgacttc gagtttgagc agatgtttac cgatgccctt ggaattgacg
1861 agtacggtgg gggttagaaa atcgataccg tcgaggccgc tcgagcatgc atctagaggg
1921 ccctattcta tagtgtcacc taaatgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc
1981 tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc
2041 cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg
2101 tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa
2161 tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggaacca gctggggctc gaggggggat
2221 ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg
2281 accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc
2341 gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg gcatcccttt agggttccga
2401 tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt
2461 gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat
2521 agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat
2581 ttataaggga ttttggggat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa
2641 tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt aaatatttgc ttatacaatc
2701 ttcctgtttt tggggctttt ctgattatca accggggtgg gtaccgagct cgaattctgt
2761 ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccaggcagg cagaagtatg
2821 caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca
2881 ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact
2941 ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta
3001 atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag
3061 tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc ttggatatcc
3121 attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga
3181 ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa
3241 cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt
3301 ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg
3361 ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa
3421 gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac
3481 cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt
3541 gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact
3601 cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg
3661 ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg
3721 acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc
3781 atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt
3841 gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc
3901 gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg
3961 ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg
4021 attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct
4081 ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta
4141 ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat
4201 ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct
4261 ggatcccgtc gacctcgaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa
4321 ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg
4381 gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca
4441 gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg
4501 tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg
4561 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg
4621 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa
4681 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg
4741 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc
4801 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc
4861 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc
4921 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg
4981 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc
5041 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga
5101 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc
5161 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac
5221 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg
5281 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc
5341 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa
5401 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta
5461 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt
5521 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag
5581 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca
5641 gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc
5701 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt
5761 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag
5821 ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt
5881 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat
5941 ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt
6001 gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc
6061 ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat
6121 cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag
6181 ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt
6241 ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg
6301 gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta
6361 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc
6421 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc
1 gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt
61 cttaggacgg atcgcttgcc tgtaacttac acgcgcctcg tatcttttaa tgatggaata
121 atttgggaat ttactctgtg tttatttatt tttatgtttt gtatttggat tttagaaagt
181 aaataaagaa ggtagaagag ttacggaatg aagaaaaaaa aataaacaaa ggtttaaaaa
241 atttcaacaa aaagcgtact ttacatatat atttattaga caagaaaagc agattaaata
301 gatatacatt cgattaacga taagtaaaat gtaaaatcac aggattttcg tgtgtggtct
361 tctacacaga caagatgaaa caattcggca ttaatacctg agagcaggaa gagcaagata
421 aaaggtagta tttgttggcg atccccctag agtcttttac atcttcggaa aacaaaaact
481 attttttctt taatttcttt ttttactttc tatttttaat ttatatattt atattaaaaa
541 atttaaatta taattatttt tatagcacgt gatgaaaagg acccaggtgg cacttttcgg
601 ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg
661 ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatctg cagctctggc ccgtgtctca
721 aaatctctga tgttacattg cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc
781 tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg
841 ctggaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg
901 cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctttcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc
961 agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt
1021 cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac
1081 tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccgcggg aaaacagcat tccaggtatt
1141 agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg
1201 gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc
1261 tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg
1321 taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat acgcttttgc cattctcacc
1381 ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa
1441 attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc
1501 catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa
1561 atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt
1621 tttctaatca gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg
1681 ggacggcgca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc
1741 gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg
1801 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact
1861 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg
1921 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg
1981 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac
2041 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca
2101 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga
2161 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc
2221 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca ggggggaacg cctggtatct ttatagtcct
2281 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggccg
2341 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct
2401 tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc
2461 tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc
2521 gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat
2581 taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt
2641 aatgtgagtt acctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcct
2701 atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat
2761 tacgccaagc tcggaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggtacc gatcccgagc
2821 tttgcaaatt aaagccttcg agcgtcccaa aaccttctca agcaaggttt tcagtataat
2881 gttacatgcg tacacgcgtc tgtacagaaa aaaaagaaaa atttgaaata taaataacgt
2941 tcttaatact aacataacta taaaaaaata aatagggacc tagacttcag gttgtctaac
3001 tccttccttt tcggttagag cggatgtggg gggagggcgt gaatgtaagc gtgacataac
3061 taattacatg atatcgacaa aggaaaaggg gcctgtttac tcacaggctt ttttcaagta
3121 ggtaattaag tcgtttctgt ctttttcctt cttcaaccca ccaaaggcca tcttggtact
3181 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
3241 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttcatagaa ataatacaga agtagatgtt
3301 gaattagatt aaactgaaga tatataattt attggaaaat acatagagct ttttgttgat
3361 gcgcttaagc gatcaattca acaacaccac cagcagctct gattttttct tcagccaact
3421 tggagacgaa tctagctttg acgataactg gaacatttgg aattctaccc ttacccaaga
3481 tcttaccgta accggctgcc aaagtgtcaa taactggagc agtttcctta gaagcagatt
3541 tcaagtattg gtctctcttg tcttctggga tcaatgtcca caatttgtcc aagttcaaga
3601 ctggcttcca gaaatgagct tgttgcttgt ggaagtatct cataccaacc ttaccgaaat
3661 aacctggatg gtatttatcc atgttaattc tgtggtgatg ttgaccaccg gccatacctc
3721 taccaccggg gtgctttctg tgcttaccga tacgaccttt accggctgag acgtgacctc
3781 tgtgctttct agtcttagtg aatctggaag gcattcttga ttagttggat gattgttctg
3841 ggatttaatg caaaaatcac ttaagaagga aaatcaacgg agaaagcaaa cgccatctta
3901 aatatacggg atacagatga aagggtttga acctatctgg aaaatagcat taaacaagcg
3961 aaaaactgcg aggaaaattg tttgcgtctc tgcgggctat tcacgcgcca gaggaaaata
4021 ggaaaaataa cagggcatta gaaaaataat tttgattttg gtaatgtgtg ggtcctggtg
4081 tacagatgtt acattggtta cagtactctt gtttttgctg tgtttttcga tgaatctcca
4141 aaatggttgt tagcacatgg aagagtcacc gatgctaagt tatctctatg taagctacgt
4201 ggcgtgactt ttgatgaagc cgcacaagag atacaggatt ggcaactgca aatagaatct
4261 ggggatcccc cctcgacgga tgcaagggtt cgaatccctt agctctcatt attttttgct
4321 ttttctcttg aggtcacatg atcgcaaaat ggcaaatggc acgtgaagct gtcgatattg
4381 gggaactgtg gtggttggca aatgactaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa
4441 actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct
4501 cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt
4561 tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt
4621 cagatacata gatacaattc tattaccccc atccatactc tagaatgctt ttgcgagctt
4681 tccttttcct cttggctggt tttgcagcca aaatatctgc agcgctagct gatgcagaat
4741 tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg
4801 tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc atagcgacag
4861 tgatcgtcat caccttggtg atgctgaaga agaaaggtag atctggcaag ctactgtctt
4921 ctatcgaaca agcatgcgat atttgccgac ttaaaaagct caagtgctcc aaagaaaaac
4981 cgaagtgcgc caagtgtctg aagaacaact gggagtgtcg ctactctccc aaaaccaaaa
5041 ggtctccgct gactagggca catctgacag aagtggaatc aaggctagaa agactggaac
5101 agctatttct actgattttt cctcgagaag accttgacat gattttgaaa atggattctt
5161 tacaggatat aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca agataatgtg aataaagatg
5221 ccgtcacaga tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc tctaacattg agacagcata
5281 gaataagtgc gacatcatca tcggaagaga gtagtaacaa aggtcaaaga cagttgactg
5341 tatcgccgga attcccgggg atctgggccc ccccgaccga tgtcagcctg ggggacgagc
5401 tccacttaga cggcgaggac gtggcgatgg cgcatgccga cgcgctagac gatttcgatc
5461 tggacatgtt gggggacggg gattccccgg gtccgggatt taccccccac gactccgccc
5521 cctacggcgc tctggatatg gccgacttcg agtttgagca gatgtttacc gatgcccttg
5581 gaattgacga gtacggtggg ggtactagtg gccagtacac atccattcat catggtgtgg
5641 tggaggttga cgccgctgtc accccagagg agcgccacct gtccaagatg cagcagaacg
5701 gctacgaaaa tccaacctac aagttctttg agcagatgca gaacggcgcc tagggatccc
5761 ccgggctgca ggaattcgat atcaagctta tcgataccgt cgaccccggg tgctagcaag
5821 gccttgtggc cagccatggc aactagtgcg gccgctaagt aagtaagacg tcgagctcta
5881 agtaagtaac ggccgccacc gcggtggagc tttggacttc ttcgccagag gtttggtcaa
5941 gtctccaatc aaggttgtcg gcttgtctac cttgccagaa atttacgaaa agatggaaaa
6001 gggtcaaatc gttggtagat acgttgttga cacttctaaa taagcgaatt tcttatgatt
6061 tatgattttt attattaaat aagttataaa aaaaataagt gtatacaaat tttaaagtga
6121 ctcttaggtt ttaaaacgaa aattcttgtt cttgagtaac tctttcctgt aggtcaggtt
6181 gctttctcag gtatagcatg aggtcgctct tattgaccac acctctaccg gcatgccgag
6241 caaatgcctg caaatcgctc cccatttcac ccaattgtag atatgctaac tccagcaatg
6301 agttgatgaa tctcggtgtg tattttatgt cctcagagga caatacctgt tgtaatcgtt
6361 cttccacacg gatcccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacaattcac tggccgtcgt
6421 tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca
6481 tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca
6541 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt
6601 gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc
6661 gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg
6721 gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat
6781 tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg
6841 ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct
6901 atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa
6961 aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt
7021 tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc aggcaagtgc
7081 acaaacaata cttaaataaa tactactcag taataaccta tttcttagca tttttgacga
7141 aatttgctat tttgttagag tcttttacac catttgtctc cacacctccg cttacatcaa
7201 caccaataac gccatttaat ctaagcgcat caccaacatt ttctggcgtc agtccaccag
7261 ctaacataaa atgtaagctt tcggggctct cttgccttcc aacccagtca gaaatcgagt
7321 tccaatccaa aagttcacct gtcccacctg cttctgaatc aaacaaggga ataaacgaat
7381 gaggtttctg tgaagctgca ctgagtagta tgttgcagtc ttttggaaat acgagtcttt
7441 taataactgg caaaccgagg aactcttggt attcttgcca cgactcatct ccatgcagtt
7501 ggacgatatc aatgccgtaa tcattgacca gagccaaaac atcctcctta ggttgattac
7561 gaaacacgcc aaccaagtat ttcggagtgc ctgaactatt tttatatgct tttacaagac
7621 ttgaaatttt ccttgcaata accgggtcaa ttgttctctt tctattgggc acacatataa
7681 tacccagcaa gtcagcatcg gaatctagag cacattctgc ggcctctgtg ctctgcaagc
7741 cgcaaacttt caccaatgga ccagaactac ctgtgaaatt aataacagac atactccaag
7801 ctgcctttgt gtgcttaatc acgtatactc acgtgctcaa tagtcaccaa tgccctccct
7861 cttggccctc tccttttctt ttttcgaccg aattaattct taatcggcaa aaaaagaaaa
7921 gctccggatc aagattgtac gtaaggtgac aagctatttt tcaataaaga atatcttcca
7981 ctactgccat ctggcgtcat aactgcaaag tacacatata ttacgatgct gtctattaaa
8041 tgcttcctat attatatata tagtaatgtc gtttatggtg cactctcagt acaatctgct
8101 ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac
8161 gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca
8221 tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcga
atgcttttgcgagctttccttttcctcttggctggttttgcagccaaaatatctgcagcgctagctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaaggtagatctggcaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccggggccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggggtactagtggccagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacggcgcctag
mllraflfllagfaakisaaladaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvviatvivitlvmlkkkgrsgkllssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrspltrahltevesrlerleqlfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrlasvetdmpltlrqhrisatssseessnkgqrqltvspefpgiwapptdvslgdelhldgedvamahadalddfdldmlgdgdspgpgftphdsapygaldmadfefeqmftdalgideygggtsgqytsihhgvvevdaavtpeerhlskmqqngyenptykffeqmqnga*
atgcttttgcgagctttccttttcctcttggctggttttgcagccaaaatatctgcagcgctagctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaacagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacgcgcggggtaccccggcgatgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggtag
mllraflfllagfaakisaaladaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvviatvivitlvmlkkkqytsihhgvvevdaavtpeerhlskmqqngyenptykffeqmqnargtpamkllssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrspltrahltevesrlerleqlfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrlasvetdmpltlrqhrisatssseessnkgqrqltvspefpgiwapptdvslgdelhldgedvamahadalddfdldmlgdgdspgpgftphdsapygaldmadfefeqmftdalgideygg
atgagggcctggatcttctttctcctttgcctggccgggagggctctggcagccccgctagctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaacagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacgcgcggggtaccccggcgatgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtggg
mrawiffllclagralaapladaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvviatvivitlvmlkkkqytsihhgvvevdaavtpeerhlskmqqngyenptykffeqmqnargtpamkllssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrspltrahltevesrlerleqlfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrlasvetdmpltlrqhrisatssseessnkgqrqltvspefpgiwapptdvslgdelhldgedvamahadalddfdldmlgdgdspgpgftphdsapygaldmadfefeqmftdalgideygg
GCTCTAGAATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGC AGCC AAAATATCTGCAGCGCTAGCTGATGCAGAATTCCGACATGAC
CGGGATCCCTAGGCGCCGTTCTGCATCTGCTCAAAGAAC
ACTATATCTAGAATGCTTTTGC
TTCGATAGAAGACAGTAGCTTGCCAGATCTACCTTTCTTCTTCAGCATC ACCAA
TTGGTGATGCTGAAGAAGAAAGGTAGATCTGGCAAGCTACTGTCTTCT ATCGAA
ATGATGAATGGATGTGTACTGGCCACTAGTACCCCCACCGTACTCGTC AATT
AATTGACGAGTACGGTGGGGGTACTAGTGGCCAGTACACATCCATTC ATCAT
CGATAAGCTTGATATCGAATTC
CCATCGATTTTCTAACCCCCACCGTA
gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtcgactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttaactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagcttctgcctgccgcctgcctgcctgccactgagggttcccagcaccatgagggcctggatcttctttctcctttgcctggccgggagggctctggcagccccgctagctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaaggtagatctggcaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccggggccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggggtactagtggccagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacggcgcctagggatcccccgggctgcaggaattcgatatcaagcttatcgataccgtcgaggccgctcgagcatgcatctagagggccctattctatagtgtcacctaaatgctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggaaccagctggggctcgaggggggatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcggggcatccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttggggatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttaaatatttgcttatacaatcttcctgtttttggggcttttctgattatcaaccggggtgggtaccgagctcgaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccaggcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttggatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcccgtcgacctcgagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc
Claims (37)
- γ−セクレターゼの活性を検出するプロセスであって、
A.以下:
a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(配列番号1)を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
b)第一のヌクレオチド配列の5'末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
c)プロモーター、および、
d)場合により、さらなるコードおよび/または非コードヌクレオチド配列;
を含み、融合タンパク質をコードするトランスジーンを用いる、
B.トランスジーンを細胞に組み込ませ、融合タンパク質を発現させ;
C.配列番号1のアミノ酸配列内で、融合タンパク質を細胞に存在するγ−セクレターゼによって切断し、それにより、アミノ酸配列GAIIGLMVGGVV(配列番号2)を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列VIVITLVML(配列番号3)を含む第二の部分タンパク質を形成させ、そして、
D.第一の部分タンパク質および/または第二の部分タンパク質を検出し、
融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号14および配列番号18から成る群から選ばれる
ことを特徴とする、上記プロセス。 - γ−セクレターゼの活性を検出するプロセスであって、
A.以下:
a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(配列番号1)を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
b)第一のヌクレオチド配列の5'末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
c)プロモーター、および、
d)場合により、さらなるコードおよび/または非コードヌクレオチド配列;
を含み、融合タンパク質をコードするトランスジーンを用いる、
B.トランスジーンを細胞に組み込ませ、融合タンパク質を発現させ;
C.配列番号1のアミノ酸配列内で、融合タンパク質を細胞に存在するγ−セクレターゼによって切断し、それにより、アミノ酸配列GAIIGLMVGGVV(配列番号2)を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列VIVITLVML(配列番号3)を含む第二の部分タンパク質を形成させ、そして、
D.第二の部分タンパク質の量を測定し、形成された第二の部分タンパク質の量からγ−セクレターゼの活性を測定し、
ここにおいて、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号14および配列番号18から成る群から選ばれることを特徴とする、上記プロセス。 - プロモーターは、哺乳動物細胞、C.エレガンス、酵母またはショウジョウバエにおける発現のためのプロモーターである、請求項1または2に記載のプロセス。
- プロモーターは、CMV、HSV TK、RSV、SV40、LTR、unc119、unc54、hsp16−2、G0A1、sel−12、ADH1、GAL1、MET3、MET25、MT、Ac5またはDs47プロモーターである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプロセス。
- 細胞は、真核細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプロセス。
- 細胞は、ヒト細胞である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のプロセス。
- 細胞は、非ヒト細胞である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のプロセス。
- 細胞は、HeLa、293、H4、SH−SY5Y、Cos、CHO、N2A、SL−2または酵母細胞である、請求項5に記載のプロセス。
- 細胞は、C.エレガンスの細胞である、請求項7に記載のプロセス。
- 細胞は、トランスジェニックC.エレガンスの構成成分である、請求項8に記載のプロセス。
- 細胞は、サッカロミセス・セレビジエの細胞である、請求項8に記載のプロセス。
- 細胞は、レポータープラスミドとコトランスフェクションされており、レポータープラスミドは、レポーター遺伝子を調節可能なプロモーターの制御下に含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載のプロセス。
- 調節可能なプロモーターは、転写活性化ドメインによって活性化可能である、請求項12に記載のプロセス。
- レポータープラスミドは、EGFP(強化緑色蛍光タンパク質)、Ura3、His3またはLacZに関するレポーター遺伝子をコードし、調節可能なプロモーターは、GAL4結合部位と、HIVの最小プロモーターを含む、請求項13に記載のプロセス。
- トランスジーンは、配列番号14、または、配列番号18をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載のプロセス。
- トランスジーンは、ベクター中に存在する、請求項1〜15のいずれか一項に記載のプロセス。
- 組換えベクターは、pcDNA3.1+である、請求項1〜16のいずれか一項に記載のプロセス。
- 細胞中で内因性のγ−セクレターゼ活性が検出されない、請求項1〜17のいずれか一項に記載のプロセス。
- 細胞は、cDNAライブラリーを用いてコトランスフェクションされる、請求項1〜18のいずれか一項に記載のプロセス。
- ヒトもしくは非ヒト組織、または、ヒトもしくは非ヒト細胞から製造されたcDNAが、cDNAライブラリーに存在する、請求項19に記載のプロセス。
- a)γ−セクレターゼの活性が検出可能な細胞を同定し、そして
b)この細胞からγ−セクレターゼをコードするcDNAを単離する、
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするcDNAを同定するための、請求項18〜20のいずれか一項に記載のプロセスの使用。 - a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(配列番号1)を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
b)第一のヌクレオチド配列の5'末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
c)プロモーター、および、
d)第一のヌクレオチド配列の3'末端における、DNA結合ドメイン、および、転写活性化ドメインをコードする少なくとも1つのさらなるヌクレオチド配列
を含み、
コードされている融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号14および配列番号18から成る群から選ばれる
ことを特徴とする、トランスジーン。 - 請求項22に記載のトランスジーンを含むベクター。
- ベクターは、ベクターpDBTrpまたはpcDNA3.1+である、請求項23に記載のベクター。
- 細胞が、請求項23または24に記載のベクターでトランスフェクションされる、トランスジェニック細胞の製造プロセス。
- 請求項22に記載のトランスジーンは、C.エレガンスの性腺にマイクロインジェクションされる、トランスジェニックC.エレガンスの生産プロセス。
- 請求項22に記載のトランスジーンを含む細胞。
- 請求項22に記載のトランスジーンを含む、トランスジェニックC.エレガンス。
- 請求項22に記載のトランスジーンを含む酵母細胞。
- a)請求項22に記載のトランスジーン;
b)cDNAライブラリー、および、
c)レポータープラスミド、
を含む細胞。 - γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするcDNAを同定するための、請求項30に記載の細胞の使用。
- 1)請求項30に記載の細胞を製造し、そして、
2)第二の部分タンパク質が形成されているかどうかを決定する、
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼのcDNAを同定するプロセス。 - γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性の阻害剤を同定するためのプロセスにおける、請求項30に記載の細胞の使用。
- γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を阻害する物質の同定プロセスであって:
A.トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞を製造する工程、ここにおいて、トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、以下の成分:
a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(配列番号1)を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
b)第一のヌクレオチド配列の5'末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
c)プロモーター、および
d)場合により、さらなる非コードおよび/またはコードヌクレオチド配列;
を有し、
コードされている融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号14および配列番号18から成る群から選ばれる
ことを特徴とする、トランスジーンを含み、
トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、タンパク質結合部位、最小プロモーターおよびレポーター遺伝子、および、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするcDNAを有するレポータープラスミドを含み、
ここにおいて、トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、トランスジーンを発現し、cDNAによってコードされたγ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼを発現する;B.トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞を、調べようとする物質とインキュベートする工程、および、
C.第二の部分タンパク質の量を測定する工程、
を含む、上記プロセス。 - γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を阻害する物質の同定プロセスであって、
A.以下の成分:
a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(配列番号1)を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
b)第一のヌクレオチド配列の5'末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
c)プロモーター、および
d)場合により、さらなるコードおよび/または非コードヌクレオチド配列;
を含み、
コードされている融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号14および配列番号18から成る群から選ばれる
ことを特徴とする、トランスジーンを用いる、
B.このトランスジーンおよびレポータープラスミド、ならびに、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするcDNAを細胞に組み込ませ、調査しようとする物質の存在下で、トランスジーンによってコードされた融合タンパク質、および、cDNAによってコードされたγ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼを発現させ、
C.融合タンパク質が、
a)切断され、その結果として、アミノ酸配列GAIIGLMVGGVV(配列番号2)を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列VIVITLVML(配列番号3)を含む第二の部分タンパク質が形成され、または、
b)細胞に存在するγ−セクレターゼによって配列番号1のアミノ酸配列内で切断されず、その結果として、検出可能な量の第一および/または第二の部分タンパク質が形成されない、
D.第二の部分タンパク質の量を測定する、
上記プロセス。 - γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を阻害する物質を同定するプロセスであって、調べようとする物質の存在下で、シグナルペプチドおよび配列番号1を含む融合タンパク質をコードするトランスジーンを発現させ、調べようとする物質の、形成された第二の部分タンパク質の量に対する効果を測定し、第二の部分タンパク質は、アミノ酸配列VIVITLVML(配列番号3)を含み、
融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号14および配列番号18から成る群から選ばれる
ことを特徴とする、上記プロセス。 - 請求項1〜36のいずれか一項に記載のトランスジーン、ベクターまたは細胞を含む、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を検出するための試験キット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP20030011807 EP1481987A1 (en) | 2003-05-26 | 2003-05-26 | Method for screening inhibitors of the gamma-secretase |
EP03011807.9 | 2003-05-26 | ||
PCT/EP2004/004550 WO2004104037A1 (en) | 2003-05-26 | 2004-04-29 | Method for screening inhibitors of the gamma-secretase |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008502302A JP2008502302A (ja) | 2008-01-31 |
JP2008502302A5 JP2008502302A5 (ja) | 2010-07-15 |
JP4903046B2 true JP4903046B2 (ja) | 2012-03-21 |
Family
ID=33104072
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006529722A Expired - Fee Related JP4903046B2 (ja) | 2003-05-26 | 2004-04-29 | γ−セクレターゼ阻害剤のスクリーニング方法 |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7892778B2 (ja) |
EP (2) | EP1481987A1 (ja) |
JP (1) | JP4903046B2 (ja) |
KR (1) | KR101215855B1 (ja) |
CN (1) | CN1795203B (ja) |
AT (1) | ATE393779T1 (ja) |
AU (1) | AU2004241151B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0410736A (ja) |
CA (1) | CA2526790C (ja) |
DE (1) | DE602004013440T2 (ja) |
DK (1) | DK1631584T3 (ja) |
ES (1) | ES2307012T3 (ja) |
HK (1) | HK1091215A1 (ja) |
IL (1) | IL172119A (ja) |
MX (1) | MXPA05012663A (ja) |
NO (1) | NO334058B1 (ja) |
RU (1) | RU2373284C2 (ja) |
WO (1) | WO2004104037A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007028655A2 (en) * | 2005-09-09 | 2007-03-15 | H. Lundbeck A/S | Drug discovery for neurodevelopmental disorders and their complications |
US20090130691A1 (en) * | 2005-09-16 | 2009-05-21 | Institut De Recherches Cliniques De Montreal | Screening proteinase modulators using a chimeric protein and ski-i proprotein convertase substrates and inhibitors |
KR100883158B1 (ko) * | 2005-10-26 | 2009-02-10 | 주식회사 뉴젝스 | 살아있는 세포에서 단백질분해효소의 활성 측정 방법 |
JP2007300856A (ja) * | 2006-05-11 | 2007-11-22 | Hiroshi Mori | アミロイドタンパク質模倣物 |
WO2008061673A2 (en) * | 2006-11-24 | 2008-05-29 | Synthon B.V. | Drug discovery for cancer |
CN104880441B (zh) * | 2015-05-14 | 2017-12-22 | 上海皓拓生物技术有限公司 | β‑分泌酶特异性抑制剂的筛选方法及其筛选系统 |
WO2017041037A1 (en) * | 2015-09-04 | 2017-03-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Disruption of the interaction between amyloid beta peptide and dietary lipids |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002528074A (ja) * | 1998-10-24 | 2002-09-03 | アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | アルツハイマー病の研究のためのモデル生物としてのトランスジェニックシーエレガンス |
JP2002531141A (ja) * | 1998-12-07 | 2002-09-24 | アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | Aβ−ペプチドのスクリーニングアッセイ |
WO2002093177A2 (en) * | 2001-05-11 | 2002-11-21 | Medical Research Council | Assays for identifying modulators of rhomboid polypeptides |
JP2002543797A (ja) * | 1999-05-05 | 2002-12-24 | ベーリンガー インゲルハイム ファルマ コマンディトゲゼルシャフト | 膜結合基質を特異的に切断するプロテアーゼを発見する方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998015828A1 (en) * | 1996-10-07 | 1998-04-16 | Scios Inc. | Method to identify direct inhibitors of the beta-amyloid forming enzyme gamma-secretase |
-
2003
- 2003-05-26 EP EP20030011807 patent/EP1481987A1/en not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-04-29 AT AT04730223T patent/ATE393779T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-04-29 RU RU2005140567/13A patent/RU2373284C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-04-29 AU AU2004241151A patent/AU2004241151B2/en not_active Ceased
- 2004-04-29 EP EP04730223A patent/EP1631584B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-29 DE DE602004013440T patent/DE602004013440T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-29 ES ES04730223T patent/ES2307012T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-29 JP JP2006529722A patent/JP4903046B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-04-29 MX MXPA05012663A patent/MXPA05012663A/es active IP Right Grant
- 2004-04-29 BR BRPI0410736-5A patent/BRPI0410736A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-04-29 CN CN2004800142844A patent/CN1795203B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-04-29 DK DK04730223T patent/DK1631584T3/da active
- 2004-04-29 CA CA2526790A patent/CA2526790C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-04-29 WO PCT/EP2004/004550 patent/WO2004104037A1/en active IP Right Grant
- 2004-05-19 US US10/849,423 patent/US7892778B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-11-22 IL IL172119A patent/IL172119A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-11-25 KR KR1020057022603A patent/KR101215855B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-12-19 NO NO20056029A patent/NO334058B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-10-25 HK HK06111751.0A patent/HK1091215A1/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002528074A (ja) * | 1998-10-24 | 2002-09-03 | アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | アルツハイマー病の研究のためのモデル生物としてのトランスジェニックシーエレガンス |
JP2002531141A (ja) * | 1998-12-07 | 2002-09-24 | アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | Aβ−ペプチドのスクリーニングアッセイ |
JP2002543797A (ja) * | 1999-05-05 | 2002-12-24 | ベーリンガー インゲルハイム ファルマ コマンディトゲゼルシャフト | 膜結合基質を特異的に切断するプロテアーゼを発見する方法 |
WO2002093177A2 (en) * | 2001-05-11 | 2002-11-21 | Medical Research Council | Assays for identifying modulators of rhomboid polypeptides |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1795203B (zh) | 2010-06-16 |
DK1631584T3 (da) | 2008-09-01 |
MXPA05012663A (es) | 2006-05-25 |
EP1631584B1 (en) | 2008-04-30 |
NO334058B1 (no) | 2013-12-02 |
KR20060015312A (ko) | 2006-02-16 |
AU2004241151B2 (en) | 2009-04-09 |
CA2526790C (en) | 2013-12-24 |
JP2008502302A (ja) | 2008-01-31 |
EP1481987A1 (en) | 2004-12-01 |
ATE393779T1 (de) | 2008-05-15 |
NO20056029L (no) | 2006-02-24 |
CA2526790A1 (en) | 2004-12-02 |
CN1795203A (zh) | 2006-06-28 |
KR101215855B1 (ko) | 2012-12-31 |
WO2004104037A1 (en) | 2004-12-02 |
BRPI0410736A (pt) | 2006-06-27 |
EP1631584A1 (en) | 2006-03-08 |
HK1091215A1 (en) | 2007-01-12 |
IL172119A (en) | 2010-12-30 |
ES2307012T3 (es) | 2008-11-16 |
US7892778B2 (en) | 2011-02-22 |
RU2373284C2 (ru) | 2009-11-20 |
AU2004241151A1 (en) | 2004-12-02 |
RU2005140567A (ru) | 2006-06-27 |
DE602004013440T2 (de) | 2009-05-20 |
DE602004013440D1 (de) | 2008-06-12 |
US20050032150A1 (en) | 2005-02-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2249617C2 (ru) | ТРАНСКРИПЦИОННАЯ РЕГУЛЯТОРНАЯ ДНК ГЕНА ХОМЯКА EF-1α | |
KR102007061B1 (ko) | 다중 면역 스크리닝 분석 | |
KR101215855B1 (ko) | 감마-세크레타제의 억제제를 스크리닝하는 방법 | |
CA2404253C (en) | Novel ecdysone receptor-based inducible gene expression system | |
KR100886312B1 (ko) | 단백질-단백질의 상호작용을 분석하는 방법 | |
US6773920B1 (en) | Delivery of functional protein sequences by translocating polypeptides | |
US6699686B1 (en) | Modified nuclear glucocorticoid receptor, fusion protein, and DNA fragments coding for said receptor and said fusion protein | |
US20040033600A1 (en) | Ecdysone receptor-based inducible gene expression system | |
CN101213203A (zh) | 在转录后水平调节核酸表达的方法和组合物 | |
US11820998B2 (en) | Porcine Thy1 gene promoter specifically expressed in neurons | |
AU766751B2 (en) | Abeta-peptide screening assay | |
EP0741787A1 (en) | Mammalian expression systems for hepatitis c virus envelope genes | |
CN110343713A (zh) | 一种基于人源tlr4基因的多功能双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用 | |
US20040168210A1 (en) | Transgenic fish and beta-catenin signaling pathway model | |
CN110777147A (zh) | 一种ikzf3基因沉默的t细胞及其应用 | |
CN104862336B (zh) | 一种表达乙肝病毒受体——人ntcp的小鼠模型的构建方法 | |
CA2395490A1 (en) | Repressible sterility of animals | |
AU782109B2 (en) | Repressible sterility of animals | |
CN102051378A (zh) | 以病毒mRNA核转运为靶点的抗HIV-1药物筛选方法 | |
CN114196700A (zh) | 使肝细胞直接重编程为胰岛样细胞的方法和试剂盒 | |
MXPA01005486A (en) | A&bgr;-PEPTIDE SCREENING ASSAY |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100309 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20100527 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100629 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100910 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100917 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101224 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111011 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111104 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111206 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120104 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150113 Year of fee payment: 3 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |