ES2307012T3 - Metodo para la deteccion de la actividad de gamma-secretasa. - Google Patents
Metodo para la deteccion de la actividad de gamma-secretasa. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para la detección de la actividad de gamma-secretasa, en el que A. se utiliza un transgen que codifica una proteína de fusión que comprende: a) una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ ID Nº 1), en donde dicha proteína se puede escindir dentro de dicha secuencia de aminoácidos por parte de gamma-secretasa presente en una célula, con lo que se forman una primera proteína parcial, que contiene la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVV (SEQ ID Nº 2), y una segunda proteína parcial, que contiene la secuencia de aminoácidos VIVI TLVML (SEQ ID Nº 3), b) en el extremo 5'' de la primera secuencia de nucleótidos, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal, c) un promotor y d) secuencias de nucleótidos codificadoras adicionales que codifican una proteína que es expresada como una proteína de fusión con la primera proteína parcial y la segunda proteína parcial y que se utiliza para la detección de la segunda proteína parcial y, si es apropiado, secuencias de nucelótidos no codificadoras adicionales; B. este transgen se incorpora en una célula humana o una célula eucariótica no humana y se expresa la proteína de fusión; C. la proteína de fusión se escinde dentro de la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 1 mediante gamma-secretasa presente en la célula, con lo que se forman la primera proteína parcial y la segunda proteína parcial, y D. se detecta la segunda proteína parcial, caracterizado porque con la excepción de SEQ ID Nº 1 de que dicha proteína de fusión no contenga uno o más motivos de péptidos que actúen como una señal para la endocitosis o exocitosis y/o el sitio de escisión de la proteasa.
Description
Método para la detección de la actividad de
\gamma-secretasa.
La invención se refiere a procedimientos
mejorados para la determinación de la actividad de
\gamma-secretasa y al uso de los procedimientos.
La invención se basa en las enseñanzas del documento WO 00/34511
A2.
La enfermedad de Alzheimer (AD - siglas en
inglés) es un trastorno neurodegenerativo del cerebro, que va
acompañado, al nivel celular, de una pérdida masiva de neuronas en
el sistema límbico en la corteza del cerebro. En las zonas del
cerebro afectadas, depósitos de proteínas, las denominados placas,
se pueden detectar al nivel molecular, lo cual es una
característica esencial de la enfermedad de Alzheimer. La proteína
que aparece lo más frecuentemente en estas placas es un péptido de
40 a 42 aminoácidos,que se designa péptido A\beta. Este péptido
A\beta es un producto de escisión de una proteína
significativamente mayor de 695 a 770 aminoácidos, la denominada
proteína precursora amiloide (APP - siglas en inglés).
La APP es una proteína integral de la
transmembrana, la cual atraviesa primero la bicapa de lípidos. Con
mucho, la parte mayor de la proteína es extracelular, mientras que
el dominio C-terminal más corto está dirigido en el
citosol (Figura 1). El péptido A\beta se muestra en gris oscuro en
la Figura 1. Aproximadamente dos tercios del péptido A\beta
proceden del dominio extracelular y aproximadamente un tercio
procede del dominio de transmembrana de APP.
Además de la APP basada en la membrana, se puede
detectar una forma secretada de la proteína precursora amiloide que
consiste en el ectodominio grande de la APP y se designa APP_{sec}
("APP secretada"). La APP_{sec} se forma a partir de APP por
escisión proteolítica, lo cual se efectúa por la
\alpha-secretasa. La escisión proteolítica tiene
lugar en un lugar de la secuencia de aminoácidos de APP, el cual
está dentro de la secuencia de aminoácidos del péptido A\beta
(detrás del residuo aminoácido 16 del péptido A\beta). La
proteolisis de APP por la \alpha-secretasa
excluye, así, la formación del péptido A\beta.
Así, el péptido A\beta sólo puede formarse a
partir de APP en una vía de tratamiento alternativa. Se postula que
dos proteasas adicionales están implicadas en la vía de tratamiento,
una proteasa, que se designa \beta-secretasa, que
se escinde en el extremo N del péptido A\beta en la APP, y la
segunda proteasa, que se designa \gamma-secretasa,
que libera el extremo C del péptido A\beta (Kang, J. et
al., Nature, 325, 733) (Figura 1).
Con el fin de aprender más de las secretasas
(\alpha-secretasa,
\beta-secretasa,
\gamma-secretasa) es de gran interés, en
particular en el contexto de investigaciones sobre la enfermedad de
Alzheimer, p. ej. para la identificación de las secretasas o
factores implicados en la regulación de secretasas y en la formación
de péptidos A\beta (Wolfe, M.S. (2001), J. Med. Chem.,
44(13), 2039-2060). La inhibición de
\beta-secretasa y, en particular de
\gamma-secretasa, podría conducir a una reducción
en la producción de A\beta, por otro lado una activación de la
\alpha-secretasa podría aumentar el tratamiento de
APP en APP_{sec} y, así, reduciría simultáneamente la formación
del péptido A\beta. Una C. elegans transgénica, la cual se
encuentra en el transcurso de investigaciones de este tipo, se
describe en la solicitud de patente alemana DE 198 49 073 A1.
Existen muchos indicios de que el péptido
A\beta (A\beta) es un factor crucial en la aparición de la
enfermedad de Alzheimer. Entre otros, se postula la neurotoxicidad
de fibrillas de A\beta en el cultivo de células (Yankner, B.A.
et al., (1990) Proc Natl Acad Sci USA, 87, 9020). En
pacientes con síndrome de Down, en los que el gen que codifica APP
se produce en una copia adicional, la neuropatología característica
de la enfermedad de Alzheimer también se produce incluso a una edad
de 30 años. Aquí, se asume que a la sobre-expresión
de APP le sigue una conversión incrementada en el péptido A\beta
(Rumble, B. et al., (1989), N. Engl. J. Med., 320,
1446).
Probablemente, el indicio más fuerte del papel
central del péptido A\beta son las formas familiares de la
enfermedad de Alzheimer. Aquí, se encuentran mutaciones en el gen
APP en torno a la zona de los sitios de escisión de las \beta- y
\gamma-secretasas o en dos genes asociados a AD
adicionales (presenilinas), lo cual conduce en el cultivo de
células a un incremento significativo en la producción de péptido
A\beta (Scheuner, D. et al., (1996), Nature Medicine, 2,
864).
Existe un cierto número de indicios del hecho de
que la APP se escinde primeramente en el péptido A\beta por parte
de la \beta-secretasa durante su tratamiento con
el fin de servir subsiguientemente como un sustrato para la
\gamma-secretasa. Por lo tanto, la
\gamma-secretasa tiene un papel crucial en la
formación del péptido A\beta (Wolfe, M.S. (2001), loc.cit).
En general, es difícil la detección de péptido
A\beta, ya que solamente se convierte una pequeña cantidad de APP
(Simons M, et al., Neurosci (1996)
1;16(3):899-908). Además, el péptido A\beta
es un fragmento muy pequeño de aproximadamente 4 kDa, que tiene una
gran tendencia a la auto-agregación debido a su
carácter hidrófobo. Por consiguiente, el péptido A\beta precipita
fácilmente bajo condiciones fisiológicas (Hilbich, C. et al.,
(1991) J. Mol. Biol., 218, 149) y en su forma precipitada no está
disponible para la detección.
\global\parskip0.930000\baselineskip
La detección del péptido A\beta en células
eucarióticas se lleva a cabo por medio de métodos inmunobiológicos,
tales como, p. ej. ELISA, inmunoprecipitación y transferencia
Western (Suzuki, N. et al., Science 1994, 27,
264(5163) 1336; Haass, C. et al., (1992) Nature, 359,
322). Además, un ensayo in vitro para la determinación de la
actividad de \gamma-secretasa a partir de
fracciones de membrana purificadas que contienen PS1 (presenilina
1) se describió por Wolfe et al. (1999). Estos procedimientos
son muy laboriosos, ya que implican etapas de incubación con
anticuerpos apropiados, etapas que destruyen las células obtenidas a
partir de un cultivo de células adecuado u organismos modelos (p.
ej., C. elegans). Dichos métodos no son adecuados en un
sistema de ensayo automatizado, p. ej. para un rastreo de alto
rendimiento, para identificar compuestos, que específicamente
inhiben o disminuyen la actividad de una
\gamma-secretasa. En parte esto se debe a que la
actividad de \gamma-secretasa depende de un
conjunto de proteínas (Mattson, (2003) Nature 422, 385), que, hasta
la fecha, sólo es activo en un entorno de lípidos de la membrana
complejos.
Además, la actividad de la
\gamma-secretasa se puede demostrar de acuerdo con
las enseñanzas del documento WO00/
34511A2, el cual describe un procedimiento para la determinación de la actividad de \gamma-secretasa y para la detección de \gamma-secretasa mediante la detección del péptido A\beta. El procedimiento del documento WO00/34511A2 utiliza un transgen que codifica una proteína de fusión que comprende: la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ ID Nº 1) en calidad del sitio diana enzimático de \gamma-secretasa, un péptido señal (SP - siglas en inglés) en el extremo 5', un promotor y, si es apropiado, secuencias de nucleótidos codificadoras y/o no codificadoras adicionales que se incorporan en una célula con el fin de expresar dicha proteína de fusión.
34511A2, el cual describe un procedimiento para la determinación de la actividad de \gamma-secretasa y para la detección de \gamma-secretasa mediante la detección del péptido A\beta. El procedimiento del documento WO00/34511A2 utiliza un transgen que codifica una proteína de fusión que comprende: la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ ID Nº 1) en calidad del sitio diana enzimático de \gamma-secretasa, un péptido señal (SP - siglas en inglés) en el extremo 5', un promotor y, si es apropiado, secuencias de nucleótidos codificadoras y/o no codificadoras adicionales que se incorporan en una célula con el fin de expresar dicha proteína de fusión.
Cuando la proteína de fusión se escinde
específicamente por la \gamma-secretasa presente
en la célula, se forma una primera proteína parcial que contiene la
secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVV (SEQ ID Nº 2), y se forma una
segunda proteína parcial que contiene la secuencia de aminoácidos
VIVITLVML (SEQ ID Nº 3). Subsiguientemente, se detectan dichas
primera y/o segunda proteínas parciales, p. ej. mediante el uso de
un informador adecuado, el cual es, p. ej. un gen informador, que
es activado por la liberación de un activador de la transcripción
acoplado a la primera y/o segunda proteínas parciales.
Debido a los problemas conocidos acompañados de
la detección de péptido A\beta, el problema de la presente
invención es mejorar el procedimiento del docuemnto WO00/34511A2, p.
ej. disminuyendo la señal de fondo y/o aumentando la especificidad
de la señal, con el fin de mejorar la relación señal/ruido en el
ensayo de la invención.
Sorprendentemente, es posible mejorar la
relación señal/ruido en un procedimiento de acuerdo con el documento
WO00/34511A2 al disminuir la liberación inespecífica de las primera
y/o segunda proteínas parciales debido a una actividad inespecífica
de la proteasa. Esto se consigue, p. ej. en el péptido de fusión del
documento WO00/34511A2, mediante la exclusión/anulación de
cualesquiera otras secuencias/motivos de sitios de escisión de
proteasa y/o secuencias de internalización - junto al sitio de
escisión de la \gamma-secretasa. Por lo tanto, la
presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para la
determinación de la actividad de \gamma-secretasa
y la detección de una proteína que tiene actividad de
\gamma-secretasa.
Realizaciones particulares del procedimiento se
refieren a procedimientos para la identificación de una
\gamma-secretasa, de un ADNc que codifica una
\gamma-secretasa, una proteína subunidad de
\gamma-secretasa, o una proteinasa similar a
\gamma-secretasa, y a procedimientos para la
identificación de un compuesto farmacéutico activo, el cual puede
modular, p. ej. disminuir o inhibir la actividad de una proteína que
tiene actividad de \gamma-secretasa. Sustancias
de este tipo son de particular interés, si son farmacéuticamente
aceptables y adecuadas para el tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de una
\gamma-secretasa, en el que
- A.
- se utiliza un transgen que codifica una proteína de fusión que comprende:
- a)
- una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ ID Nº 1), en donde dicha proteína se puede escindir dentro de dicha secuencia de aminoácidos por parte de \gamma-secretasa presente en una célula, con lo que se forman una primera proteína parcial, que contiene la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVV (SEQ ID Nº 2), y una segunda proteína parcial, que contiene la secuencia de aminoácidos VIVI TLVML (SEQ ID Nº 3),
- b)
- en el extremo 5' de la primera secuencia de nucleótidos, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal,
- c)
- un promotor y
- d)
- secuencias de nucleótidos codificadoras adicionales que codifican una proteína que es expresada como una proteína de fusión con la primera proteína parcial y la segunda proteína parcial y que se utiliza para la detección de la segunda proteína parcial y, si es apropiado, secuencias de nucelótidos no codificadoras adicionales;
- B.
- este transgen se incorpora en una célula humana o una célula eucariótica no humana y se expresa la proteína de fusión;
- C.
- la proteína de fusión se escinde dentro de la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 1 mediante \gamma-secretasa presente en la célula, con lo que se forman la primera proteína parcial y la segunda proteína parcial, y
- D.
- se detecta la segunda proteína parcial,
en donde con la excepción de SEQ ID
Nº 1 de que dicha proteína de fusión no contenga uno o más motivos
de péptidos que actúen como una señal para la endocitosis o
exocitosis y/o el sitio de escisión de la
proteasa.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En dicho procedimiento dicha proteína de fusión
no contiene uno o más péptidos (es decir, junto a SEQ ID Nº 1
cualquier péptido adicional) que actúen como una señal para la
endocitosis o exocitosis y el sitio de escisión de la proteasa, con
la excepción de la SEQ ID Nº 1.
La invención se refiere también a un
procedimiento para la detección de la actividad de una
\gamma-secretasa, en el que
\vskip1.000000\baselineskip
- A.
- se utiliza un transgen que codifica una proteína de fusión y contiene los siguientes constituyentes:
- a)
- una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ ID Nº 1), en donde dicha proteína se puede escindir dentro de dicha secuencia de aminoácidos por parte de \gamma-secretasa presente en una célula, con lo que se forman una primera proteína parcial, que contiene la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVV (SEQ ID Nº 2), y una segunda proteína parcial, que contiene la secuencia de aminoácidos VIVI TLVML (SEQ ID Nº 3),
- b)
- en el extremo 5' de la primera secuencia de nucleótidos, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal,
- c)
- un promotor y
- d)
- secuencias codificadoras adicionales que codifican una proteína que es expresada como una proteína de fusión con la primera proteína parcial y la segunda proteína parcial y que se utiliza para la detección de la segunda proteína parcial y, si es apropiado, secuencias de nucelótidos no codificadoras adicionales;
- B.
- este transgen se incorpora en una célula humana o una célula eucariótica no humana y se expresa la proteína de fusión;
- C.
- la proteína de fusión se escinde dentro de la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 1 mediante \gamma-secretasa presente en la célula, con lo que se forman la primera proteína parcial y la segunda proteína parcial, y
- D.
- se determina la cantidad de la segunda proteína parcial y se determina la actividad de la \gamma-secretasa a partir de la cantidad de la segunda proteína parcial formada,
caracterizado porque con la
excepción de SEQ ID Nº 1 de que dicha proteína de fusión no contenga
uno o más motivos de péptidos que actúen como una señal para la
endocitosis o exocitosis y/o el sitio de escisión de la
proteasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos de acuerdo con la invención
("ensayo de rastreo de péptido A\beta", "ensayo de
\gamma-secretasa") son adecuados para la
detección in vivo de una \gamma-secretasa
(proteína con actividad de \gamma-secretasa) o de
la actividad de una \gamma-secretasa, que permite
emplear los procedimientos universalmente, incluso, p. ej., en
ensayos de rastreo de alto rendimiento ("HTS"). Los
procedimientos no tienen las desventajas antes mencionadas de los
procedimientos de detección convencionales, en particular se evitan
laboriosas etapas de aislamiento y detección y se mejora
significativamente la actividad de la
\gamma-secretasa. Se alcanza la señal más
específica mediante una señal de fondo considerablemente reducida y
la anulación, respectivamente la disminución de la liberación de
las primera y segunda proteínas parciales debido a la acción de
proteasas no específicas.
Un elemento esencial de los procedimientos de
acuerdo con la invención es que el fragmento de APP
C-terminal, el cual es escindido por la
\gamma-secretasa en dos fragmentos - una primera
proteína parcial que contiene la secuencia de aminoácidos
GAIIGLMVGGVV (SEQ ID Nº 2) y una segunda proteína parcial que
contiene la secuencia de aminoácidos VIVITLVML (SEQ ID Nº 3) la
segunda proteína parcial que contiene la secuencia de aminoácidos
VIVITLVML (SEQ ID Nº 3) se difunde en el citosol de la célula
(Figura 2). Esta segunda proteína parcial, la cual se puede
detectar fácilmente en el ciitosol de una célula, p. ej. en forma de
una proteína de fusión con un factor de activación de la
transcripción (TAF - siglas en inglés) y con la ayuda de un gen
informador; sirve como una herramienta de detección de la presencia
de \gamma-secretasa o la cuantificación de la
actividad de una \gamma-secretasa. El sitio de
escisión de la \gamma-secretasa está localizado en
el dominio de la transmembrana de la APP (Kang, J. et al.,
(1987) Nature, 325, 733). El dominio de la transmembrana de APP
tiene la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVV_{40} IA_{42}
TVIVITLVML. La \gamma-secretasa se escinde detrás
de V_{40}, A_{42} o T_{43}. El péptido A\beta, el cual se
produce por células eucarióticas en el cultivo de células se
secreta en el sobrenadante del medio.
Con la ayuda de un sistema informador adecuado
(p. ej. TAF y el correspondiente gen informador), la liberación de
la segunda proteína parcial puede activar la expresión de una
proteína informadora, la cual se puede detectar en células
eucarióticas. Por medio de la detección de la proteína informadora,
se puede demostrar que ha tenido lugar una escisión de
\gamma-secretasa en la APP. Como resultado de
ello, la \gamma-secretasa o la actividad de la
\gamma-secretasa se puede determinar cualitativa
y/o cuantitativamente.
\newpage
Los constituyentes del procedimiento se pueden
caracterizar con mayor detalle como sigue:
La primera secuencia de nucleótidos codifica una
proteína precursora amiloide (APP) o una parte de la misma que
comprende la SEQ ID Nº 1, en donde dicha APP o parte de la misma no
contiene ningún motivo de péptido adicional que actúe como una
señal para la endocitosis o exocitosis y/o el sitio de escisión de
la proteasa. Preferiblemente, dicha primera secuencia de
nucleótidos codifica una proteína que contiene una secuencia de
aminoácidos que comprende SEQ ID Nº 1, p. ej. SEQ ID Nº 6, o SEQ ID
Nº 14. En realizaciones adicionales, la primera secuencia de
nucleótidos codifica una APP truncada o una APP modificada, p. ej.
obtenible mediante mutagénesis dirigida al lugar, con el fin de
evitar la codificación de un motivo de péptido que actúe como una
señal para la endocitosis o exocitosis y/o el sitio de escisión de
la proteasa junto a SEQ ID Nº 1. Todavía en otra realización, dicha
APP o parte de la misma codificada por dicha primera secuencia de
nucleótidos es una proteína derivada de APP de un ser humano,
ratón, (p. ej., APLP1 o APLP2).
La segunda secuencia de nucleótidos codifica
preferiblemente cualquier péptido señal ("SP" - siglas en
inglés) adecuado. El péptido señal contiene, p. ej. los SPs de
acuerdo con la SEQ ID Nº 5 (SP de APP humana), SEQ ID Nº 12 (SP de
SUC2 de levaduras, "SP2"), o SEQ ID Nº 13 (SP de BM40,
"SP3") o cualquier otro péptido señal conocido, p. ej. de
acuerdo con Heijne et al. (Nucl. Acids Res. (1986),
14(11) 4683-4690).
En calidad de un promotor, es posible utilizar
cualquier promotor regulable o constitutivo adecuado. El promotor
puede ser adecuado, p. ej., para la expresión en células de
mamíferos, en C. elegans, en levaduras o en Drosophila.
Promotores adecuados para células de mamíferos son, p. ej., CMV, HSV
TK, SV40, LTR (todas de: Clontech, Heidelberg, Alemania) y RSV (p.
ej. Invitrogen® life technologies, NV Leek, Holanda). Promotores que
se pueden utilizar para C. elegans son, p. ej.,
unc-119, unc-54,
hsp16-2, goa-1 y
sel-12. Para la expresión en levaduras, son
adecuados los promotores ADH1 (constitutivo) (Vlckova et al.
(1994) Gene, 25(5), 472-4), GAL1
(condicionalmente inducible) (Selleck et al. (1987) Nature
325, 173-7), MET3 (condicional) (Cherest et
al. (1987) Mol Gen Genet 210, 307-13) y MET25
(véase, p. ej., Kerjan et al. (1986) Nucleic Acids Res.
14(20), 7861-71). En Drosophila, es posible
utilizar, p. ej., los promotores MT (metalotionina), Ac5 o Ds47
(todos de: Invitrogen® life technologies).
En el procedimiento se emplea una célula
eucariótica, p. ej. una célula humana o una célula no humana, p.
ej. de mono, hámster, ratón, Drosophila, pez cebra o levaduras. P.
ej., se puede emplear una célula HeLa, HEK293, H4,
SH-SY5Y, H9, Cos, CHO, N2A, SL-2 o
de Saccharomyces cerevisiae. En una realización particular
de la invención, se emplea una célula de C. elegans. La
célula puede ser un constituyente de un animal transgénico, no
humano. En una realización particular, la célula transgénica puede
ser un constituyente de una C. elegans trasngénica. En
particular, la invención se refiere a procedimientos en los cuales
se utilizan células de levaduras, p. ej. de la cepa MaV203
(Invitrogen® life technologies, Rockville, MD, EE.UU.) o EGY 48
(OriGene Technologies, Inc. Rockville, MD, EE.UU.).
El transgen codifica una proteína de fusión;
éste se compone de las proteínas parciales que son codificadas por
la primera y la segunda secuencias de nucleótidos y, si es
apropiado, secuencias de nucleótidos adicionales. Así, la proteína
de fusión contiene la primera proteína parcial y la segunda proteína
parcial y, si es apropiado, una proteína parcial adicional. Sin
embargo, es importante que la proteína de fusión no contenga ningún
motivo de péptido que actúe como una señal para la endocitosis o
exocitosis y/o sitio de escisión de la proteasa, excepto la SEQ ID
Nº 1.
Sitios de escisión de la proteasa conocidos son
conocidos por el experto a partir de bases de datos de proteasas,
p. ej. MEROPS (Rawlings et al. (2002) MEROPS: the protease
database. Nucleic Acids Res. 30,
343-346).
Preferiblemente, la proteína de fusión de
acuerdo con la presente invención no contiene un sitio de escisión
de la proteasa, que es un sitio de escisión de caspasa, p. ej.
(IVL)ExD, especialmente VEVA, VEVD, y en otra realización,
la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención no
contiene un péptido señal para la endocitosis o exocitosis, la cual
es una señal para la internalización de APP, p. ej., NpxY o
di-leucina, en especial NPTY.
En una realización específica, la proteína de
fusión tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 14. Junto a la
SEQ. ID Nº 1, dicha proteína de fusión no contiene ningún (uno o
más) motivo de péptido adicional que actúe como una señal para la
endocitosis o exocitosis (p. ej., señal de internalización de APP)
y/o el sitio de escisión de una proteasa (p. ej. caspasa).
En particular, en el procedimiento se puede
emplear un transgen con la secuencia de nucleótidos de acuerdo con
SEQ ID Nº 15 (SPC55GV TAG). En realizaciones particularmente
preferidas del procedimiento, el transgen se presenta en un vector.
Esta realización específica de la invención se designa también como
SP-C55-Gal 4-VP16
(es decir, SPC55GV). En este caso, se expresa una proteína de fusión
que consiste en el péptido señal de APP, el fragmento C55 de APP,
GAL4 y VP16. Esta proteína, localizada en el dominio de la
transmembrana, se escinde dentro del fragmento C55 y la segunda
proteína parcial, es decir la parte de la proteína de fusión que
contiene una parte del fragmento C55, GAL4 y VP16, se detecta con
la ayuda de un plásmido informador.
Junto a la construcción del transgen SPC55GV,
también se pueden concebir otras construcciones de informador en
las que, p. ej., el dominio de activación de la transcripción podría
estar insertado entre el dominio de la transmembrana y el dominio
citosólico de SPC55 o una etiqueta (p. ej. MYC, FLAG) en los
extremos N y C y entre la transmembrana y el dominio citosólico de
SPC55.
La secuencia de nucleótidos codificadora
adicional puede codificar una proteína, la cual se puede utilizar
para la detección de la segunda proteína parcial. Preferiblemente,
por lo tanto, la secuencia de nucleótidos codificadora adicional
está situada en el extremo 3' de la primera secuencia de
nucleótidos. La secuencia de nucleótidos codificadora adicional
codifica, p. ej., una proteína quimérica u otra proteína que está
construida a partir de un cierto número de dominios, p. ej. una
proteína que contiene un dominio de unión a ADN y un dominio de
activación de la transcripción. En una realización particular de la
invención, la secuencia de nucleótidos codificadora adicional
codifica una proteína que consiste en un dominio de unión a GAL4 y
el dominio de la activación de la transcripción de VP16
(GAL4-VP16, "GV"), y la proteína parcial
adicional tiene preferiblemente entonces la secuencia de
aminoácidos SEQ ID Nº 7. En células de levaduras, la proteína
parcial adicional puede contener también un dominio de unión a LexA
(p. ej., Lex A-VP16). Esta proteína parcial
adicional es particularmente adecuada para procedimientos en los
cuales se utilizan células de la cepa EGY48 de levaduras.
En particular, la invención se refiere a
procedimientos en los cuales se utilizan células que se
co-transfectan con un plásmido informador. El
plásmido informador contiene un gen informador bajo el control de un
promotor regulable. P. ej., el gen informador puede codificar GFP y
sus derivados, p. ej. EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein -
proteína fluorescente verde reforzada), EBFP, EYFP, d2EGFP, GFPuv o
Luciferasa (p. ej., Promega, Mannheim, Alemania), CAT (p. ej.
Promega), SEAP (p. ej. Clontech), \betaGal (p. ej. Clontech),
proteína de fluorescencia del coral del arrecife (RCFP - siglas en
inglés, Clontech) o factores inductores de la apoptosis, p. ej.
Fas, TNF-R1, dominio de la muerte y homólogos
(Tartaglia et al. (1993) Cell 74, 845-53),
ced3, ced4, ced9. En calidad de un promotor regulable, el plásmido
informador puede contener un promotor mínimo, p. ej. un sitio de
unión a GAL4 en combinación con el promotor mínimo de VIH, del
promotor de CD4 o el promotor de mec7. La elección del promotor
regulable adecuado depende del dominio de activación de la
transcripción utilizado.
Una realización particular de la invención se
refiere a la implementación del procedimiento, en el que las
células utilizadas son células de levaduras. Como alternativa al
vector de expresión en levaduras pDBTrp (Invitrogen® life
technologies, Holanda, Nº de Cat. 10835023) en el cual, en una
realización especial de la invención, está integrado un promotor
MET-25 (SEQ ID Nº 10), se puede seleccionar un gran
número de otros vectores de expresión con diferentes promotores (p.
ej. el promotor GAL-1 inducible, el promotor ADH1
constitutivamente activo) y con diferentes marcadores de selección
(ADE, LEU, TRP, HIS, LYS, PHE).
Una realización particular de la invención se
refiere al uso de células de levaduras, que contienen genes
informadores inducibles por GAL4 o LexA, integrados de manera
estable en su genoma o extracromosomal. En estas realizaciones se
utilizan preferiblemente las cepas de levaduras MaV203 (Invitrogen®
life technologies Inc., Rockville, MD, EE.UU.) o EGY48 (OriGene
Technologies, Inc., Rockville, MD, EE.UU).
Una realización particular de los procedimientos
se refiere al uso de una célula que fue adicionalmente transfectada
con un vector recombinante adicional. Preferiblemente, la célula, la
cual se utiliza para estas realizaciones, normalmente no tiene o
apenas tiene actividad de \gamma-secretasa
endógena o de \gamma-secretasa endógena y no es
detectable utilizando los procedimientos antes mencionados. Esta
célula se puede emplear transformada con un vector adicional en el
cual está contenida una secuencia de nucleótidos - preferiblemente
un ADNc - la cual codifica una \gamma-secretasa,
una proteína subunidad de \gamma-secretasa, o una
proteínasa similar a \gamma-secretasa. P. ej., se
puede emplear un banco de ADNc. Esta realización del procedimiento
se puede utilizar, entre otros, para identificar una
\gamma-secretasa, una proteína subunidad de
\gamma-secretasa o una proteinasa similar a una
\gamma-secretasa o un ADNc, el cual codifica una
\gamma-secretasa, una proteína subunidad de
\gamma-secretasa o una proteinasa similar a una
\gamma-secretasa. Bancos de ADNc que se pueden
investigar en cuanto a una \gamma-secretasa, una
proteína subunidad de \gamma-secretasa o una
proteinasa similar a una \gamma-secretasa se
pueden preparar a partir de células o tejidos de cualquier
organismo, p. ej. células B, neuronas, células glia, hipocampo,
cerebro completo, placenta, riñones. Preferiblemente, el ADNc se
prepara a partir de vertebrados (p. ej. hámster, rata, ratón, perro,
mono, ser humano), en especial a partir de células humanas o
tejidos humanos.
En el caso de células las cuales, sin
transfección, no exhiben actividad de
\gamma-secretasa, pero que después de la
transfección con un banco de ADNc exhiben actividad de
\gamma-secretasa, el ADNc presente en la célula
codifica una \gamma-secretasa, una proteína
subunidad de \gamma-secretasa, o una proteínasa
similar a \gamma-secretasa. Este ADNc se puede
aislar por procedimientos conocidos a partir de células que exhiben
este comportamiento y, además, se pueden analizar por métodos
conocidos.
La presente descripción también describe un
transgen, el cual codifica una proteína de fusión y contiene los
siguientes constituyentes:
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ ID Nº 1),
- b)
- en el extremo 5' de la primera secuencia de nucleótidos, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal,
- c)
- un promotor y,
\newpage
- d)
- al menos una secuencia de nucleótidos adicional en el extremo 3' de la primera secuencia de nucleótidos, la cual codifica un dominio de unión a ADN y un dominio de activación de la transcripción,
en donde, junto a SEQ ID Nº 1,
dicha proteína de fusión no contiene uno o más péptidos que actúan
como una señal para la endocitosis o exocitosis y/o un sitio de
escisión de
proteasa.
Preferiblemente, la primera secuencia de
nucleótidos codifica APP o una parte de la misma que no comprende,
junto a la SEQ ID Nº 1 ningún motivo de péptido adicional que actúe
como una señal para la endocitosis o exocitosis y/o el sitio de
escisión de proteasa.
El transgen puede tener, p. ej., la secuencia de
nucleótidos SEQ ID Nº 15.
El transgen puede estar presente en un vector
adecuado, p. ej. pcDNA 3.1+ o pDBTrp. Otra realización de la
descripción es un procedimiento, el cual se refiere al uso del
transgen y/o del vector para la producción de una célula
transgénica, con lo cual, opcionalmente, dicha célula transgénica se
utiliza para convertirse en un constituyente de un organismo no
humano, adecuado como un organismo informador in vivo. P.
ej., dicho transgen y/o vector se puede utilizar para la producción
de una C. elegans transgénica. En otra realización, dicho
transgen y/o el vector se utilizan para la producción de células de
levadura transgénicas, p. ej. S. cerevisiae.
La descripción también describe un procedimiento
para la producción de un organismo transgénico no humano, p. ej. de
una C. elegans transgénica, en donde dicho transgen y/o un
vector que comprende dicho transgen se microinyecta en las gónadas
del organismo, p. ej. de una C. elegans. La descripción
también describe una célula, la cual contiene un transgen de
acuerdo con la invención, y a una C. elegans transgénica, la
cual contiene dicho transgen. La descripción también describe una
célula, en particular una célula de levadura, la cual contiene
dicho transgen, preferiblemente presente en un vector adecuado.
Además, la descripción describe, en particular, células,
preferiblemente células de levadura, que contienen el transgen y un
banco de ADNc, respectivamente, que son adecuados para ser objeto
de un banco de expresión de ADNc (banco de ADNc).
La descripción describe el uso de dichas células
transgénicas o recombinantes, preferiblemente células de levaduras
o de C. elegans en un procedimiento para la determinación o
identificación de \gamma-secretasa, ADNc que
codifica \gamma-secretasa, ADNc que codifica una
proteína subunidad de \gamma-secretasa, ADNc que
codifica una proteinasa similar a
\gamma-secretasa, o la actividad de
\gamma-secretasa, una proteína subunidad de
\gamma-secretasa o una proteinasa similar a
\gamma-secretasa, al uso de dichas células en un
procedimiento para la identificación de inhibidores de la actividad
de \gamma-secretasa
(\gamma-secretasa, una proteína subunidad de
\gamma-secretasa o una proteinasa similar a
\gamma-secretasa), y a procedimientos de los
mismos.
En particular, la descripción describe
procedimientos para la identificación de sustancias (efectores), las
cuales modulan (es decir, inhiben, disminuyen, aumentan o alteran)
la actividad de una \gamma-secretasa, una
proteína subunidad de \gamma-secretasa o una
proteinasa similar a \gamma-secretasa, conteniendo
el procedimiento las siguientes etapas:
- 1.
- Producción de un organismo transgénico no humano, p. ej. de una C. elegans o Saccharomyces cerevisiae transgénica o de una célula transgénica, conteniendo el organismo transgénico no humano o la célula transgénica el transgen,
- conteniendo el organismo transgénico no humano o la célula transgénica, además, un plásmido informador, portando el plásmido informador un sitio de unión a la proteína, un promotor mínimo y un gen informador y,
- si es apropriado, un ADNc que codifica la \gamma-secretasa, la proteína subunidad de \gamma-secretasa, o la proteinasa similar a \gamma-secretasa, en el que
- el organismo transgénico no humano o la célula transgénica expresa el transgen y, si es apropriado, la \gamma-secretasa, una proteína subunidad de \gamma-secretasa, o una proteinasa similar a \gamma-secretasa codificada por el ADNc;
- 2.
- el organismo transgénico no humano o la célula transgénica se incuba con una sustancia de ensayo a investigar; y
- 3.
- se detecta la cantidad de la segunda proteína parcial.
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción también describe un procedimiento
para la identificación de efectores de
\gamma-secretasa, una proteína subunidad de
\gamma-secretasa, o una proteinasa similar a
\gamma-secretasa, en el que
- 1.
- se prepara/utiliza un transgen de acuerdo con la invención;
- 2.
- dicho transgen y un plásmido informador y, si es apropriado, un ADNc, el cual codifica una \gamma-secretasa, una proteína subunidad de \gamma-secretasa, o una proteinasa similar a \gamma-secretasa se integran en el genoma de una célula y la proteína de fusión codificada por dicho transgen y, si es apropriado, la \gamma-secretasa, la proteína subunidad de \gamma-secretasa, o la proteinasa similar a \gamma-secretasa codificada por el ADNc se expresan en presencia de una sustancia a investigar;
- 3.
- la proteína de fusión es
- a)
- escindida dentro de la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 1 por la \gamma-secretasa presente en la célula, de modo que
- b)
- se forman una primera proteína parcial que contiene la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVV (SEQ ID Nº 2) y una segunda proteína parcial que contiene la secuencia de aminoácidos VIVITLVML (SEQ ID Nº 3); y
- 4.
- dicha segunda proteína parcial se determina cualitativa o cuantitativamente.
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción también describe procedimientos
para la identificación de sustancias que inhiben la actividad de
una \gamma-secretasa, una proteína subunidad de
\gamma-secretasa, o una proteinasa similar a
\gamma-secretasa, en que un transgen que codifica
una proteína que contiene un péptido señal y la SEQ ID Nº 1 se
expresa en presencia de una sustancia a investigar y de un plásmido
informador, y se determina el efecto de la sustancia a investigar
sobre la cantidad de la segunda proteína parcial formada,
conteniendo la segunda proteína parcial la secuencia de aminoácidos
VIVITLVML (SEQ ID Nº 3).
La descripción también se refiere a inhibidores
de una \gamma-secretasa, una proteína subunidad de
\gamma-secretasa o una proteinasa similar a
\gamma-secretasa, los cuales son identificados por
los procedimientos de la invención.
Entro otros, los procedimientos se pueden
utilizar, p. ej., en unión con el sistema C55-Gal
4-VP16 (es decir, una proteína de fusión que
consiste en C55, GAL4 y VP16 o utilizando un ácido nucleico que
codifica una correspondiente proteína de fusión) para:
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- La identificación y determinación (cualitativa y/o cuantitativa) de la actividad de una \gamma-secretasa, una proteína subunidad de \gamma-secretasa o una proteinasa similar a \gamma-secretasa .
- 2.
- La identificación de \gamma-secretasas, una proteína subunidad de \gamma-secretasa o una proteinasa similar a \gamma-secretasa en diferentes tejidos, células y organismos o especies. La identificación y el aislamiento de los ADNcs en cuestión que codifican \gamma-secretasa, una proteína subunidad de \gamma-secretasa o una proteinasa similar a \gamma-secretasa y el uso adicional de los ADNcs.
- 3.
- El rastreo in vivo, p. ej. en células de levadura (p. ej., Saccharomyces cerevisiae), en C. elegans o en un cultivo de células, permitiendo determinar la actividad de la \gamma-secretasa, una proteína subunidad de \gamma-secretasa o una proteinasa similar a \gamma-secretasa sin utilizar métodos inmunobiológicos.
- 4.
- Uso del procedimiento de la presente invención para la identificación y caracterización de sustancias, p. ej. compuestos farmacológicamente activos, los cuales modulan la actividad enzimática o biológica de la \gamma-secretasa, una proteína subunidad de \gamma-secretasa o una proteinasa similar a \gamma-secretasa, p. ej. efectores (inhibidores, activadores, moduladores) de la \gamma-secretasa, una proteína subunidad de \gamma-secretasa o una proteinasa similar a \gamma-secretasa. En particular, este procedimiento se puede emplear en un HTS (High Throughput Screening - rastreo de alto rendimiento). Mediante el uso de sistemas de ensayo HTS, se pueden identificar sustancias, las cuales se pueden emplear para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y/o para el tratamiento preventivo.
- 5.
- Investigaciones sobre o en el contexto de la enfermedad de Alzheimer, p. ej. fomentando una comprensión más profunda de APP mutada o fragmentos de la misma, o la función de proteasas basadas en la membrana.
- 6.
- Las proteínas de fusión/transgenes descritos, p. ej. C55 en SP-C55-Gal 4-VP16, se pueden reemplazar por otros fragmentos de acuerdo con la invención y la \gamma-secretasa, una proteína subunidad de \gamma-secretasa o una proteinasa similar a \gamma-secretasa, su actividad y regulación se pueden investigar con la ayuda de los procedimientos.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización de la presente descripción es
una composición farmacéutica que comprende un compuesto farmacéutico
activo, el cual inhibe la actividad de una
\gamma-secretasa, una proteína subunidad de
\gamma-secretasa o una proteinasa similar a
\gamma-secretasa, la cual ha sido identificada por
un procedimiento según se describe más arriba.
Una realización adicional de la presente
descripción es un procedimiento para preparar una composición
farmacéutica que comprende un procedimiento según se describe y
formular dicho compuesto farmacéutico activo identificado.
Todavía una realización adicional de la presente
descripción es un procedimiento para preparar un producto
farmacéutico, que comprende a) un procedimiento según se describe y
b) mezclar el compuesto farmacéutico activo identificado con un
excipiente inorgánico y/u orgánico farmacéutico inerte.
Y todavía otra realización de la presente
descripción es un kit de ensayo para detectar la actividad de
\gamma-secretasa, una proteína subunidad de
\gamma-secretasa o una proteinasa similar a
\gamma-secretasa, que comprende el transgen,
vector o célula según se describe más arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: La Figura 1 muestra la proteína del
precursor amiloide (isoforma APP695 e isoformas APP770 o APP751) y
productos de escisión de secretasa.
Figura 2: muestra esquemáticamente el principio
en el que se basan los procedimientos:
sitio de escisión de
\beta-secretasa en el extremo N; sitio de escisión
de \gamma-secretasa en el dominio de la
transmembrana; C100 = fragmento C100 de APP;
GAL4-VP16 = dominio de unión a ADN, dominio de
activación de la transcripción (que consiste en el dominio de unión
a ADN y en el activador de la transcripción), el cual une el
dominio de unión a la proteína en el ADN del plásmido
informador.
Figura 3: Construcción de los plásmidos de
expresión
SP-C100-GAL4-VP16:
aa = aminoácidos; sitios de escisión de
restricción Sac I, Hind III y Kpn I que indican la posición del
sitio de escisión en el plásmido.
Figura 4: Plásmido de expresión
pDBTrp-MET25-SP-C100-GAL4-VP16:
Construcción del plásmido de expresión para la
expresión del transgen en levaduras.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos deben ilustrar la
presente invención y no se considran como una limitación del
concepto inventivo.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido codifica el péptido señal (SP) de
APP, el cual está condensado a los 100 residuos aminoácidos
C-terminales de APP (C100). C100 comienza con el
extremo N del péptido A\beta y termina con el extremo C de APP.
Éste debe ser escindido adicionalmente por parte de la
\gamma-secretasa con el fin de liberar el péptido
A\beta. GAL4/VP16 (Seq ID Nº 7) se condensó al extremo C de
SP-C100 (Seq ID Nº 6). GAL4/VP16 comprende los
primeros 147 residuos aminoácidos del activador de la trasncripción
de levaduras GAL4 y los 78 residuos aminoácidos
C-terminales de VP16, un activador de la
transcripción procedente del virus Herpes simplex. En calidad de
proteína de fusión, el fragmento GAL4 adopta la función de la unión
al ADN, mientras que el fragmento VP16 activa la transcripción
(Sadowski et al., 1988).
pcDNA3.1+ (Invitrogen® life technologies,
Holanda, Nº de Cat. V79020) sirve como el vector del plásmido.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido informador de células de mamíferos
pGL2-MRG5 es pGL2 (Promega), en el cual un fragmento
de ADN procedente de pMRG5 (Ikeda et al., 1998), el cual
comprende cinco sitios de unión a ADN de GAL4 más arriba del
promotor del núcleo del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
(Kretzschmar et al., 1994), se inserta más arriba del gen
informador de luciferasa de pGL2. Para una detección más fácil en el
cultivo de células, el gen informador de luciferasa se reemplazó
por el gen para EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein - proteína
fluorescente verde reforzada) obtenido del vector
pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, Heidelberg).
\vskip1.000000\baselineskip
Células de neuroblastoma humanas
SH-SY5Y (ATCC CRL-2266) se
co-transfectaron con los dos plásmidos de los
Ejemplos 1 y 2 y luego se analizaron al microscopio bajo irradiación
con luz de una longitud de onda de 480 nm, por medio de lo cual se
excita la EGFP. Era posible detectar células que expresan EGFP que
exhiben una intensa fluorescencia verde. Con el fin de asegurar que
la fluorescencia verde depende específicamente de la expresión de
la EGFP por el plásmido informador, células SH-SY5Y
se transfectaron sólo con el plásmido informador
pGL2-MRG5-EGFP. En estas células no
era detectable una fluorescencia verde. La expresión fue activada
por GAL4-VP16, lo cual presupone una liberación
proteolítica de GAL4/VP16 a partir del extremo C de
SP-C100-GAL4/VP16.
\vskip1.000000\baselineskip
SP-C100-Gal4/VP16
se clonó en el vector de expresión de levaduras pDBTrp (Invitrogen®
life technologies, Holanda, Nº de Cat. 10835023) bajo el control
del promotor MET25, reemplazando la porción de pDBTrp que contiene
el promotor ADH y los dominios GAL4DB (situados entre el gen CYH2 y
el sitio de clonación múltiple) con un fragmento de ADN que
contiene el promotor MET25 procedente de 415MET25 (Mumberg et
al., 1994) más arriba de
SP-C100-Gal4-VP16.
La cepa de levaduras MaV203 (Invitrogen® life technologies) se
transformó con esta construcción. MaV203 está genéticamente
modificada y contiene tres genes informadores inducibles por GAL4
(URA3, HIS3, lacZ), los cuales están establemente integrados en el
genoma (Vidal et al., 1996). En MaV203 la liberación
proteolítica del dominio GAL4/VP16 procedente de la proteína
SP-C100-Gal4-VP16
dio como resultado la activación de la lectura de URA3 y HIS3,
permitiendo el crecimiento sobre placas que carecen de uracilo o
hisitidina.
La expresión del ADNc de
SP-C100-Gal4-VP16 en
MaV203 dio como resultado sólo una baja actividad de los
informadores, de modo que este sistema de ensayo funcional in
vivo es adecaudo para rastrear y detectar la expresión de un
ADNc para una \gamma-secretasa en un banco de
ADNc.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de levaduras MaV203 recombinante
procedente del Ejemplo 4 se utilizó con el fin de rastrear un banco
de ADNc de células B humanas (ATCC 87286; American Type Culture
Collection, Manassas, VA, EE.UU.; Elledge et al., 1991) para
un ADNc que codifica una proteína con actividad de
\gamma-secretasa. Alternativamente, también se
puede emplear un banco de ADNc del hipocampo humano, integrado en
los vectores de expresión de levaduras p415-MET25
(Mumberg et al., 1994) o p415-ADH1 (Mumberg
et al., 1995) para el rastreo de un ADNc que codifica una
\gamma-secretasa o una proteína con actividad
similar a \gamma-secretasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La región codificadora del péptido señal humano
de SP-C100-GAL4/VP16 (según se
describe en el Ejemplo 1) se reemplazó por un péptido señal
derivado del gen SUC2 de levaduras (SP2; SEQ ID Nº 12), dando como
resultado una construcción que codifica
SP2-C100-GAL4/VP16 (SEQ ID Nº
19).
SP2-C100 se construyó
amplificando la región codificadora de la forma madura de C100 (sin
la secuencia señal, véase la SEQ ID Nº 4) con un cebador 5', el
cual incluía la secuencia codificadora del péptido señal SUC2 (SEQ
ID Nº 12) y un cebador 3' correspondiente al codón de terminación
natural (Kang et al., (1987)). Con el fin de facilitar el
intercambio del péptido señal, los cebadores EH47 (SEQ ID Nº 23) y
EH49 (SEQ ID Nº 24) se diseñaron de modo que el producto de PCR
resultante contenía un sitio NheI adicional que unía las reguiones
codificadoras para el péptido señal y el péptido maduro.
El
SP2-C100-GAL4/VP16 se obtuvo
mediante escisión con EcoRI para escindir el fragmento C100 de
SP2-C100 y reemplazarlo por
C100-GAL4/VP16.
Los fragmentos se clonaron en el vector de
expresión pDBTrp de levaduras (Invitrogen® life technologies,
Holanda, Nº de Cat. 10835023) que contiene el promotor MET25, según
se describe en el Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener la construcción
SP2-C-GAL4/VP16-100
(SEQ ID Nº 17), se realizaron tres reacciones PCR independientes
utilizando los siguientes cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
1) Utilizando SP2-C100 como
plantilla, el ectodominio y el dominio de la transmembrana de C100
se amplificaron mediante el uso de los cebadores EH53 (SEQ ID Nº
25) y EH54 (SEQ ID Nº 26), de manera que el producto de PCR
contenía también la región 3'-flanqueante, la cual
se solapa con la región codificadora GAL4/VP16.
2) Utilizando los cebadores EH55 (SEQ ID Nº 27)
y EH56 (SEQ ID Nº 28) y GAL4/VP16 en calidad de la plantilla de
ADN, se realizó una reacción PCR para amplificar la región
codificadora con regiones 5'- y 3'-flanqueantes
correspondientes a cada lado de SP2-C100.
3) el segmento 3' de SP2-C100,
que codifica el dominio citoplasmático de C100 se amplificó mediante
el uso de los cebadores EH57 (SEQ ID Nº 29) y EH59 (SEQ ID Nº 30),
resultando un solapamiento en 5' con la región codificadora
GAL4/VP16. Los productos de PCR resultantes (de aproximadamente 200
pb, 720 pb y 100 pb) se purificaron y utilizaron para una PCR final
en presencia de EH53 y EH59, correspondientes a los extremos 5' y 3'
de SP2-C100. El producto de PCR final de
aproximadamente 1000 pb se clonó en un vector de expresión de
levaduras derivado de DBTrp (Invitrogen® life technologies,
Holanda, Nº de Cat. 10835023) que contenía el promotor MET25, según
se describe en el Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Para crear los tres vectores de plásmidos para
la expresión de SP3-C100,
SP3-C100-GAL4/VP16 (SEQ ID Nº 21) y
SP3-C-GAL4/VP16-100
(SEQ ID Nº 32) en sistemas de células de mamíferos, C100,
C100-GAL4/VP16 o
C-GAL4/VP16-100 se
sub-clonaron a partir de los vectores de expresión
en levaduras del Ejemplo 6 ó 7 en el vector de expresión en
mamíferos pRc/CMV (Invitrogen, Nº de Cat. V75020), el cual contiene
la región codificadora del péptido señal BM40 (SP3; SEQ ID Nº 13).
Las regiones codificadoras de C100, C100-GAL4/VP16 o
C-GAL4/VP16-100 se ligaron en el
marco a la región codificadora SP3 en el sitio de restricción NheI
único descrito en el Ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
La cuantificación del nivel de expresión de
diferentes construcciones en lisados brutos de levadura transformada
reveló que la expresión de
SP-C100-GAL4/VP16 era muy baja,
comparado con lisados de células de levaduras transformadas con
vectores que codifican fusiones con el péptido señal suc2 de
levaduras. Por ejemplo, la expresión de
SP2-C100-GAL4/VP16 dio como
resultado una fuerte expresión de una banda específica del tamaño
esperado. Sin embargo, también se podían detectar bandas con una
mayor movilidad electroforética mediante inmunotransferencia,
indicando una degradación no específica de la proteína recombinante
en levaduras. La estabilidad de la proteína se mejoró en el caso de
C-GAL4/VP16-100 (véase más abajo) en
el que el dominio GAL4/VP16 se insertó en marco en C100, próximo al
sitio de escisión de \gamma-secretasa. Las dos
proteínas de fusión daban niveles de expresión equiparables a la
construcción que codifica C100 sin GAL4/VP16, indicando que las dos
fusiones diferentes entre C100 y GAL4/VP16 no interferían con la
expresión de la proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión incrementada de
C100-GAL4/VP16 debida al intercambio de los péptidos
señal se correlacionaba con un fuerte incremento en la activación
no específica de los sistemas informadores URA3, HIS3 y lacZ en la
cepa de levaduras MaV203. Dado que las levaduras carecen de
actividad de \gamma-secretasa, esto se debía, lo
más probablemente, a un tratamiento no específico de
C100-GAL4/VP16 mediante proteasas celulares y a la
liberación de GAL4/VP16 activa.
Al desplazar el dominio GAL4/VP16 más próximo al
sitio de escisión de \gamma-secretasa se eliminó
esencialmente la escisión proteolítica no específica detectada con
C100-GAL4/VP16 en los sitios entre el dominio de la
transmembrana de C100 y el extremo amino-terminal
del dominio GAL4/VP16.
La escisión de las diversas construcciones se
sometió a ensayo en MaV203 al examinar la activación
GAL4/VP16-dependiente de los sistemas
informadores.
La transformación de MaV203 con
SP-C100-GAL4/VP16 exhibía un
fenotipo Ura^{+}, His^{-} (véase el Ejemplo 4). El aumento de
los niveles de expresión al reemplazar el péptido SP con el péptido
señal SP2 (para dar
SP2-C100-GAL4/VP16) resultó en una
fuerte activación de todas las lecturas a un nivel similar al
detectado en el control positivo, expresando MaV203 de forma
constitutiva la proteína GAL4 de longitud completa (codificada por
el plásmido pCL1; Clontech Laboratories).
En contraposición, células de MaV203 que
expresan
SP2-C-GAL4/VP16-100,
el cual se expresa a niveles equiparables a
SP2-C100-GAL4/VP16, exhibían un
fenotipo Ura^{-}-, His^{-}, tal como el exhibido también por
MaV203 transformada con un control del vector vacío.
Por lo tanto,
SP2-C-GAL4/VP16-100
se puede expresar grandemente en levaduras, pero sigue exhibiendo
una activación no específica muy baja de los informadores
GAL4-dependientes. La expresión a alto nivel de la
proteína
SP2-C-GAL4/VP16-100,
combinada con un fondo bajo de escisión no específica/activación
del informador, es un requisito previo para un sistema de lectura
con una relación señal a ruido sorprendentemente optimizada.
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar que la proteína
SP3-C-GAL4/VP16-100
expresada en células de mamífero se procesa correctamente mediante
la actividad de \gamma-secretasa,
SP3-C-GAL4/VP16-100
se transfectó en células de mamífero que habían demostrado expresar
actividad de \gamma-secretasa de forma endógena
(Haass et al., 1992). Para la expresión en células de
mamífero, el péptido señal en
SP2-C-GAL4/VP16-100
se reemplazó, según se describe en el Ejemplo 8, por un péptido
señal de mamífero derivado de la proteína de la membrana basal BM40,
el cual es conocido por su alto nivel de expresión (SP3; SEQ ID Nº
13). El procesamiento de \gamma-secretasa se
vigiló cuantificando la secreción de A\beta en el medio de
cultivo. El A\beta secretado se detectó mediante un ELISA
sándwich utilizando anticuerpos monoclonales 6E10 y 4G8 biotinilado
(Senetek PLC, Napa, California, EE.UU.; véase Kim et al.,
1990) en calidad de anticuerpos de captura y detección,
respectivamente.
Después de la transfección con
SP3-C100 se observó un incremento óctuple en la
secreción de A\beta en comparación con el control del vector
vacío. Células transfectadas con
SP3-C100-GAL4/VP16 o
SP3-C-GAL4/VP16-100
secretaban cantidades similares de A\beta, indicando que ni la
fusión C-terminal ni la fusión de yuxtamembrana de
GAL4/VP16 interfiere con el procesamiento proteolítico por parte de
\gamma-secretasa.
\vskip1.000000\baselineskip
El procesamiento de
C100-GAL4/VP16 y
C-GAL4/VP16-100 por parte de
\gamma-secretasa resulta en la liberación de un
polipéptido que contiene GAL4/VP16 y aminoácidos adicionales de
partes flanqueantes de C100.
SP3-C100-GAL4/VP16 y
SP3-C-GAL4/VP16-100
se co-transfectaron con el plásmido informador de
mamíferos pGL2-MRG5-EGFP (Ikeda
et al., 1998) descrito en el Ejemplo 2, el cual contiene
cinco sitios de unión a ADN GAL4 más arriba del promotor del núcleo
del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y del ADNc que
codifica EGFP. La co-transfección de
pGL2-MRG5-EGFP con las fusiones que
contienen GAL4/VP16 resultó en la aparición de células
GFP-positivas en ambos casos.
Construcciones que contenían la secuencia C100
de APP y GAL4/VP16 contienen tanto el sitio de escisión de
\gamma-secretasa como un sitio de escisión de
proteasas similares a caspasa. Para evitar que una actividad
similar a caspasa inespecífica pueda escindir
SP3-C100-GAL4/VP16 entre el
auténtico sitio de \gamma-secretasa y el dominio
GAL4/VP16 para liberar GAL4/VP16 y activar el sistema informador en
células de mamífero, se suprimió el segmento
C-terminal de 45 aminoácidos de C100 contenido en
SP3-C100-GAL4/VP16, que codifica el
dominio citoplásmico de APP. La separación de los 45 aminoácidos
C-terminales de C100 también elimina un péptido
"señal de internalización" en el extremo C de APP que dirige
la endocitosis de APP después de haber sido insertado en la
membrana del plasma.
Así, el plásmido de expresión en mamíferos
SP3-C55-GAL4/VP16 comprende el
péptido señal BM40 (Seq ID Nº 13), los 55 residuos aminoácidos
N-terminales (C55; Seq ID Nº 6) de
APP-C100, y GAL4/VP16. C55 comienza con el extremo
N del péptido A\beta y termina con el dominio de la transmembrana
de APP. En la proteína
SP3-C55-GAL4/VP16, sólo está
presente el sitio de escisión para
\gamma-secretasa. C55 comprende el sitio de
escisión de \gamma-secretasa y debe ser escindido
por la \gamma-secretasa con el fin de liberar el
péptido A\beta y GAL4/VP16. Además, debido a que no está presente
el péptido señal de internalización endocítico en
SP3-C55-GAL4/VP16, sólo la escisión
catalizante por \gamma-secretasa de
C55-GAL4/VP16 del plasma asociado a la membrana
liberará péptido A\beta y activará la transcripción
GAL4/VP16-dependiente del sistema informador.
El plásmido de expresión se derivó del vector
SP3-C-GAL4/VP16-100
mediante la introducción de un codón de terminación (TAG) detrás de
la secuencia GAL4/VP16. Esto se realizó reemplazando el fragmento
HpaI-ClaI de
SP3-C-GAL4/VP16-100
por un fragmento de ADN generado por PCR utilizando
SP3-C-GAL4/VP16-100
en calidad de la plantilla de ADN, un cebador 5' más arriba del
sitio HpaI único en GAL4/VP16, y un cebador 3'
(5'-CCATCGATTTTCTAACCCCCACCGTA-3';
Seq ID Nº 31) que introduce un codón de terminación TAG (subrayado)
y un sitio de restricción ClaI en el extremo C del marco de lectura
abierto de GAL4/VP16.
Células HEK293 (línea de células de Riñón
Embrionario Humano, (ATCC)) se co-transfectaron con
el plásmido SP3-C55-GAL4/VP16 y el
plásmido informador de luciferasa PGL2-MRG5
(descrito en el Ejemplo 2).
Subsiguientemente, se seleccionaron líneas de
células estables mediante incubación con 400 \mug/ml de geneticina
(GibcoBRL) para seleccionar clones resistentes a neomicina y,
después, se caracterizaron para la expresión estable de
SP3-C55-GAL4/VP16 y luciferasa.
Células HEK293 se
co-transfectaron con el vector
SP3-C55-GAL4/VP16 (0,03 \mug) y el
vector informador de luciferasa pGL2-MRG5 (1
\mug) en 12 placas de múltiples pocillos.
Los compuestos DPAT (de Elan Pharmaceuticals;
Dovey et al., 2001) y L-685,458 (de Merck
Pharmaceuticals; Shearman et al., 2000), ambos conocidos
inhibidores de \gamma-secretasa, inhibían la
actividad de luciferasa de forma dependiente de la dosis y la
producción de A\beta, y exhibían una CI_{50} de 14 nM (DAPT) y
19 nM (L-685,458), respectivamente.
La actividad de luciferasa se cuantificó
mediante el kit de ensayo de luciferasa Bright-Glo
(Promega). A\beta en el medio celular se cuantificó mediante
ELISA, utilizando los anticuerpos 4G8 y 6E10 (de Senetek), según se
describe en el Ejemplo 11. Estos anticuerpos son específicos de los
aminoácidos 17-24 (4G8) y 1-17
(6E10) del péptido A\beta.
\global\parskip0.900000\baselineskip
En experimentos de transfección transitoria,
A\beta se detectó también mediante inmunoprecipitación y mediante
inmunotransferencia. Ambos métodos identificaron una banda de 4 kDa
correspondiente al péptido A\beta.
Un clon de células HEK293, que expresa de manera
estable las construcciones tanto
SP3-C55-GAL4/VP16 como
MRG5-luciferasa se identificó de acuerdo con el
Ejemplo 14. Este clon de células se utilizó para examinar la
respuesta del sistema de ensayo de células de mamífero transfectado
de manera estable a DAPT (de Elan Pharm.; Dovey et al.,
2001) y L-685,458 (de Merck Pharm; Shearman et
al., 2000). Los dos compuestos exhibían una inhibición de la
actividad de luciferasa, dependiente de la dosis (24 h de
tratamiento) con una CI_{50} de 230 nM (DAPT) y 130 nM
(L-685,458), respectivamente.
Para la identificación de inhibidores de
\gamma-secretasa, se incuban células HEK293
doblemente transfectadas de manera estable (véase el Ejemplo 14),
en placas Multi-Well 96, en presencia del o de los
compuestos en investigación (p. ej., rastreo del banco de
compuestos) a una concentración de 10 \muM o menos en el ensayo,
y la actividad de luciferasa se determina 24 horas más tarde. La
actividad de luciferasa se puede cuantificar con el kit de Sistema
de Ensayo de Luciferasa (Promega), el kit de Ensayo de Luciferasa
Bright-Glo (Promega), o cualquier otro método para
la cuantificación
de luciferasa. Una disminución en la actividad de luciferasa refleja una disminución en la actividad de \gamma-secretasa.
de luciferasa. Una disminución en la actividad de luciferasa refleja una disminución en la actividad de \gamma-secretasa.
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de APP
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm32
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de APP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de APP
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm34
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento C100
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento C55
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción da la Secuencia
Artificial: fragmento GAL4-VP16
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
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<211> 1813
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Mutágeno
\newpage
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<400> 8
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
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<211> 3354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8331
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido recombinante
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 355
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Muteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\newpage
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<400> 12
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Péptido señal
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<400> 13
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 308
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Muteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6454
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Mutágeno
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8259
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1089
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Mutágeno
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Muteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1080
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Mutágeno
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 359
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Muteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211>
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Mutágeno
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 358
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Muteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm77
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<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm82
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6634
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (27)
1. Un procedimiento para la detección de la
actividad de \gamma-secretasa, en el que
- A.
- se utiliza un transgen que codifica una proteína de fusión que comprende:
- a)
- una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ ID Nº 1), en donde dicha proteína se puede escindir dentro de dicha secuencia de aminoácidos por parte de \gamma-secretasa presente en una célula, con lo que se forman una primera proteína parcial, que contiene la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVV (SEQ ID Nº 2), y una segunda proteína parcial, que contiene la secuencia de aminoácidos VIVI TLVML (SEQ ID Nº 3),
- b)
- en el extremo 5' de la primera secuencia de nucleótidos, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal,
- c)
- un promotor y
- d)
- secuencias de nucleótidos codificadoras adicionales que codifican una proteína que es expresada como una proteína de fusión con la primera proteína parcial y la segunda proteína parcial y que se utiliza para la detección de la segunda proteína parcial y, si es apropiado, secuencias de nucelótidos no codificadoras adicionales;
- B.
- este transgen se incorpora en una célula humana o una célula eucariótica no humana y se expresa la proteína de fusión;
- C.
- la proteína de fusión se escinde dentro de la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 1 mediante \gamma-secretasa presente en la célula, con lo que se forman la primera proteína parcial y la segunda proteína parcial, y
- D.
- se detecta la segunda proteína parcial,
caracterizado porque con la
excepción de SEQ ID Nº 1 de que dicha proteína de fusión no contenga
uno o más motivos de péptidos que actúen como una señal para la
endocitosis o exocitosis y/o el sitio de escisión de la
proteasa.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un procedimiento para la detección de la
actividad de \gamma-secretasa, en el que
- A.
- se utiliza un transgen que codifica una proteína de fusión y contiene los siguientes constituyentes:
- a)
- una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ ID Nº 1), en donde dicha proteína se puede escindir dentro de dicha secuencia de aminoácidos por parte de \gamma-secretasa presente en una célula, con lo que se forman una primera proteína parcial, que contiene la secuencia de aminoácidos GAIIGLMVGGVV (SEQ ID Nº 2), y una segunda proteína parcial, que contiene la secuencia de aminoácidos VIVI TLVML (SEQ ID Nº 3),
- b)
- en el extremo 5' de la primera secuencia de nucleótidos, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal,
- c)
- un promotor y
- d)
- secuencias codificadoras adicionales que codifican una proteína que es expresada como una proteína de fusión con la primera proteína parcial y la segunda proteína parcial y que se utiliza para la detección de la segunda proteína parcial y, si es apropiado, secuencias de nucelótidos no codificadoras adicionales;
- B.
- este transgen se incorpora en una célula humana o una célula eucariótica no humana y se expresa la proteína de fusión;
- C.
- la proteína de fusión se escinde dentro de la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 1 mediante \gamma-secretasa presente en la célula, con lo que se forman la primera proteína parcial y la segunda proteína parcial, y
- D.
- se determina la cantidad de la segunda proteína parcial y se determina la actividad de la \gamma-secretasa a partir de la cantidad de la segunda proteína parcial formada,
caracterizado porque con la
excepción de SEQ ID Nº 1 de que dicha proteína de fusión no contenga
uno o más motivos de péptidos que actúen como una señal para la
endocitosis o exocitosis y/o el sitio de escisión de la
proteasa.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 y 2, en el que el motivo de péptido es un sitio
de escisión de caspasa.
4. El procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la primera secuencia de
nucleótidos codifica una proteína precursora amiloide (APP) o una
parte de la misma, en donde dicho dicho motivo de péptido que actúa
como una señal para la endocitosis o exocitosis es NPTY y dicho
dicho motivo de péptido que actúa como un sitio de escisión de
proteasas es VEVD.
5. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la primera secuencia de
nucleótidos codifica una proteína que se deriva de la secuencia de
aminoácidos SEQ ID Nº 4.
6. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la segunda secuencia de
nucleótidos codifica el péptido señal de APP humana (SEQ ID Nº 5),
SUC2 (SEQ ID Nº 12) o BM40 (SEQ ID Nº 13).
7. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el péptido señal tiene la
secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 5.
8. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el promotor es un promotor para la
expresión en células de mamíferos, en C. elegans, en
levaduras o en Drosophila.
9. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el promotor es el promotor CMV,
HSV TK, RSV, SV40, LTR, unc119, unc54, hsp16-2,
G_{0}A1, sel-12, ADH1, GAL1, MET3, MET25, MT, Ac5
o Ds47.
10. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la célula es una célula HeLa, 293, H4,
SH-SY5Y, H9, Cos, CHO, N2A, SL-2 o
de levadura.
11. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la célula es una célula de C. elegans.
12. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la célula es un constituyente de una C. elegans
transgénica.
13. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la célula es una célula de Saccharomyces
cerevisiae.
14. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que la proteína de fusión contiene la
secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 6.
15. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que la secuencia de nucleótidos
codificadora adicional está localizada en el extremo 3' de la
primera secuencia de nucleótidos.
16. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que la secuencia de nucleótidos
codificadora adicional codifica una proteína que contiene un dominio
de unión a ADN y un dominio de activación de la transcripción.
17. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que la secuencia de nucleótidos
codificadora adicional codifica una proteína que consiste en un
dominio de unión a GAL-4 y en el dominio de
activación de la transcripción de VP16
(GAL-4-VP16).
18. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 17, en el que la célula se cotransfecta con un
plásmido informador, en que el plásmido informador contiene un gen
informador bajo el control de un promotor regulable.
19. El procedimiento según la reivindicación 18,
en el que el promotor regulable es activable por el dominio de
activación de la transcripción.
20. El procedimiento según la reivindicación 19,
en el que el plásmido informador codifica el gen informador para
EGFP (proteína fluorescente verde reforzada), Ura 3, His 3 o Lac Z
y el promotor regulable contiene sitios de unión a GAL4 y un
promotor mínimo de VIH.
21. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que el transgen comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID Nº 14.
22. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 21, en el que el transgen está presente en un
vector.
23. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 22, en el que el vector recombinante es pcDNA
3.1+.
24. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 23, en el que en la célula no se puede detectar
una actividad de \gamma-secretasa endógena.
25. El procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 24, en el que la célula se
co-transfecta utilizando un banco de ADNc.
26. El procedimiento según la reivindicación 25,
en el que ADNc preparado a partir de tejido humano o no humano o
células humanas o no humanas está presente en el banco de ADNc.
27. El uso de un procedimiento según una o más
de las reivindicaciones 24 a 26 para la identificación de un ADNc
que codifica una \gamma-secretasa, una proteína
subunidad de \gamma-secretasa, o una proteinasa
similar a \gamma-secretasa, en el que
- a)
- se identifica una célula en la que es detectable la actividad de una \gamma-secretasa y
- b)
- el ADNc que codifica la \gamma-secretasa se aísla de esta célula.
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