CN1795203A - 筛选γ－分泌酶抑制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于测定γ－分泌酶活性的改进方法，该方法的各自组分和所述方法的用途。本发明涉及测定γ－分泌酶活性和检测γ－分泌酶、γ－分泌酶的亚单位蛋白质或者γ－分泌酶样蛋白酶的改进方法；所述方法的具体实施方案一方面涉及鉴定γ－分泌酶和编码γ－分泌酶、γ－分泌酶的亚单位蛋白质或者γ－分泌酶样蛋白酶的cDNA的方法，另一方面涉及鉴定可以抑制γ－分泌酶、γ－分泌酶的亚单位蛋白质或者γ－分泌酶样蛋白酶的活性的物质的方法。此类物质尤其重要，因为它们可以用于例如，作为药学活性化合物，例如，用于治疗阿尔茨海默氏病。

Description

筛选γ-分泌酶抑制剂的方法
本发明涉及测定γ-分泌酶活性的改进方法，涉及所述方法的各种组分和所述方法的用途。本发明是基于WO00/34511 A2的教导，因此，将WO00/34511 A2的内容并入本文作为参考。
阿尔茨海默氏病(AD)是脑的神经变性疾病，其伴随着细胞水平上边缘系统和大脑皮质中神经元的大量损失。在受侵袭的脑部，可以在分子水平上检测到蛋白质沉积，即所称作的蚀斑，其是阿尔茨海默氏病的基本特征。最经常在这些蚀斑中发生的蛋白质是40到42个氨基酸的肽，其称作Aβ肽。该Aβ肽是695到770个氨基酸的明显更大的蛋白质的切割产物，所述蛋白质称作淀粉状蛋白前体蛋白(APP)。
APP是整合跨膜蛋白质，其首先穿过脂双层。到目前为止所述蛋白质的最大部分在细胞外，而较短的C末端结构域导向胞质溶胶(图1)。Aβ肽在图1中以暗灰色显示。约2/3的Aβ肽来自APP的细胞外结构域，约1/3来自APP的跨膜结构域。
除了基于膜的APP，还可以检测到淀粉状蛋白前体蛋白的分泌形式，其由APP的大胞外结构域组成并且称作APPsec(“分泌的APP”)。通过蛋白酶剪切APP形成APPsec，所述剪切通过α分泌酶实现。蛋白酶剪切发生在APP的氨基酸序列位点，其在Aβ肽的氨基酸序列内(Aβ肽的氨基酸残基16后)。从而通过α分泌酶对APP蛋白水解排除了Aβ肽的形成。
从而Aβ肽可以仅以备选加工途径从APP形成。推测两种其他蛋白酶参与该加工途径，一种蛋白酶称作β分泌酶，其在APP中的Aβ肽的N-末端切割，另一种蛋白酶称作γ-分泌酶，其释放Aβ的C-末端(Kang，J.等人，Nature，325，733)(图1)。
更多地了解分泌酶(α分泌酶、β分泌酶、γ-分泌酶)非常重要，尤其在阿尔茨海默氏病的研究，例如，鉴定参与分泌酶调节和Aβ肽形成的分泌酶或者因子中非常重要(Wolfe，M.S.(2001)，J.Med.Chem.，44(13)，2039-2060)。β分泌酶尤其γ-分泌酶的抑制可以导致Aβ产生的减少，另一方面，α分泌酶的激活可以增加APPsec中APP的加工并从而同时减少Aβ肽的形成。在此类研究过程中发现的一种转基因秀丽隐杆线虫(C.elegans)在德国专利申请DE 198 49 073 A1中描述。
有许多迹象表明Aβ肽(Aβ)是阿尔茨海默氏病发生中的关键因子。假定了Aβ-小纤维在细胞培养物中的神经毒性(Yankner，B.A.等人，(1990)Proc Natl Acad Sci USA，87，9020)。在患有唐氏综合征(其中编码APP的基因以一个额外的拷贝存在)的患者中，阿尔茨海默氏病的神经病理学特征甚至也在30岁年龄发生。这里，假设APP的过表达导致向Aβ肽的转化增加(Rumble，B.等人，(1989)，N.Engl.J.Med.，320，1446)。
可能Aβ肽的中心角色的最有力证据是阿尔茨海默氏病的家族形式。这里，在APP基因中β-和γ-分泌酶切割位点的周围区域或者在两种其他AD相关基因(早老蛋白)中发现突变，其在细胞培养中导致Aβ肽产生显著增加(Scheuner，D.等人，(1996)，Nature Medicine，2，864)。有许多迹象表明APP在其加工期间首先由β-分泌酶切割成Aβ肽以便随后作为γ-分泌酶的底物。因此γ-分泌酶在Aβ肽的形成中起关键作用(Wolfe，M.S.(2001)，loc.cit)。
通常，Aβ肽的检测是困难的，因为仅少量APP被转化(Simons M，等人，Neurosci(1996)1；16(3)：899-908)。此外，Aβ肽是约4kDa的非常小的片段，其由于其疏水性特征极倾向于自身聚合。因此，Aβ肽在生理条件下容易沉淀(Hilbich，C.等人，(1991)J.Mol.Biol.，218，149)并且其沉淀形式不能用于检测。
真核细胞中Aβ肽的检测通过免疫学方法进行，所述方法为例如，ELISA、免疫沉淀和蛋白质印迹(Suzuki，N.等人，Science 1994，27，264(5163)1336；Haass，C.等人，(1992)Nature，359，322)。此外，Wolfe等人(1999)描述了用于从纯化的含有PS1(早老蛋白1)的膜级分测定γ-分泌酶活性的体外测定法。这些方法非常耗时，因为它们包括与适宜抗体的孵育步骤、破坏从适宜的细胞培养物或者模式生物(例如，秀丽隐杆线虫)所得的细胞。所述方法不适于自动化测定系统，例如，用于高通量筛选以鉴定特异抑制或者减小γ-分泌酶活性的化合物。这部分是由于γ-分泌酶活性取决于蛋白质的装配(Mattson，(2003)Nature 422，385)，所述蛋白质迄今仅在复杂膜脂质环境中有活性。
此外，根据WO00/34511A2的教导可以阐明γ-分泌酶的活性，WO00/34511A2描述了通过检测Aβ肽测定γ-分泌酶活性和检测γ-分泌酶的方法。WO00/34511A2的方法利用编码融合蛋白的转基因，所述融合蛋白含有：作为γ-分泌酶的酶靶标位点的氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)、5’末端的信号肽(SP)、启动子，和如果适宜，还包括编码和/或非编码核苷酸序列，所述转基因掺入到细胞以便表达所述融合蛋白。
当融合蛋白由细胞中存在的γ-分泌酶特异切割时，形成第一种部分蛋白质，其含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQID NO.2)，并且形成第二种部分蛋白质，其含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)。随后，通过使用例如适宜的报道子检测所述第一种和/或第二种部分蛋白质，所述报道子是例如，报道基因，其由与第一种和/或第二种部分蛋白质偶联的转录激活剂的释放激活。
由于伴随Aβ肽的检测的公知的问题，本发明的问题是例如通过减少背景信号和/或增加信号特异性改进WO00/34511A2的方法，以便提高本发明测定法中的信噪比。
令人惊奇地，减少由于非特异蛋白酶活性导致的第一种和/或第二种部分蛋白质的非特异释放可以提高根据WO00/34511A2的方法中信噪比。这通过例如在WO00/34511A2的融合肽中，排除/避免γ-分泌酶切割位点旁蛋白酶切割位点的任何其他序列/基序和/或内化序列来实现。因此，本发明涉及测定γ-分泌酶活性和检测具有γ-分泌酶活性的蛋白质的改进方法。
该方法的具体实施方案涉及鉴定γ-分泌酶、编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA，和鉴定药学活性化合物的方法，所述化合物可以调节，例如，减小或者抑制具有γ-分泌酶活性的蛋白质。此类物质如果是药学上可接受的和适于治疗阿尔茨海默氏病则尤其重要。
本发明涉及检测γ-分泌酶的方法，其中
1.使用转基因，其编码融合蛋白并且含有下面的成分：
a)第一种核酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，
b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，
c)启动子和，
d)如果适宜，还含有编码和/或非编码核苷酸序列；
2.该转基因掺入到细胞中并且表达融合蛋白；
3.融合蛋白通过细胞内存在的γ-分泌酶在氨基酸序列SEQ ID NO.1内切割，从而形成第一种部分蛋白质，其含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQID NO.2)，和第二种部分蛋白质，其含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)。
4.检测第一种部分蛋白质和/或第二种部分蛋白质，其中所述融合蛋白除了SEQ ID No.1之外不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的一种或多种肽。
优选地，在所述方法中，所述融合蛋白除了SEQ ID No.1之外不含有作为胞吞或胞吐和蛋白酶切割位点的信号的一种或多种肽(即除了SEQ IDNo.1之外的任意其他肽)。
本发明还涉及检测γ-分泌酶活性的方法，其中
1.制备/使用转基因，其编码融合蛋白并且含有下面的成分：
a)第一种核酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，
b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，
c)启动子和，
d)如果适宜，还含有编码和/或非编码核苷酸序列；
2.将该转基因掺入到细胞中并且表达融合蛋白；
3.融合蛋白通过细胞内存在的γ-分泌酶在氨基酸序列SEQ ID NO.1内切割，从而形成第一种部分蛋白质，其含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)，和第二种部分蛋白质，其含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)。
4.测定第二种部分蛋白质的量并且从所形成的第二种部分蛋白质的量确定γ-分泌酶的活性，其中所述融合蛋白除了SEQ ID No.1之外不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的一种或多种肽。
本发明的方法(“Aβ肽筛选测定法”，“γ-分泌酶测定法”)适于体内检测γ-分泌酶(具有γ-分泌酶活性的蛋白质)或者γ-分泌酶的活性，使得可以普遍利用该方法，例如，用于高通量筛选(“HTS”)测定中。所述方法不具有上文提到的常规检测方法的缺点，尤其避免了费力的分离和检测步骤并显著提高了γ-分泌酶活性的特异信号。通过显著减小背景信号和分别避免由于非特异蛋白酶的作用导致的第一和第二种部分蛋白质释放的减少实现了更特异的信号。
本发明方法的一个基本成分是C-末端APP片段，其由γ-分泌酶切割成两个片段-含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一种部分蛋白质和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQID NO.3)的第二种部分蛋白质，含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQID NO.3)的第二种部分蛋白质扩散到细胞的胞质溶胶(图2)。该第二种部分蛋白质可以在细胞的胞质溶胶中容易地检测为例如，与转录激活因子(TAF)的融合蛋白，在报道基因的帮助下，所述第二种部分蛋白质可以作为γ-分泌酶的存在的检测工具或者用于定量γ-分泌酶活性。γ-分泌酶切割位点位于APP的跨膜结构域中(Kang，J.等人，(1987)Nature，325，733)。APP跨膜结构域具有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV40IA42TVIVITLVML。γ-分泌酶在V40、A42或者T43后切割。细胞培养中真核细胞产生的Aβ肽分泌到培养基上清液中。
在适宜报道子系统(例如，TAF和相应报道基因)的帮助下，第二种部分蛋白质的释放可以激活报道子蛋白质的表达，该蛋白质可以在真核细胞中检测到。通过检测报道子蛋白质，可以证明APP中已经发生了γ-分泌酶切割。结果，可以定性和/或定量测定γ-分泌酶的活性。
可以如下更详细地表征本方法的组成：
第一种核苷酸序列编码淀粉状蛋白前体蛋白(APP)或者其含有SEQ IDNO.1的部分，其中所述APP或者其部分不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的任意其他肽基序。优选地，所述第一种核苷酸序列编码含有包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO.6或者SEQID NO.14的蛋白质。在其他实施方案中，所述第一种核苷酸序列编码截短的APP或者经修饰的APP，例如，通过定点诱变可以得到的截短的APP或者经修饰的APP，以便避免编码除了SEQ ID NO.1之外作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的肽基序。在再一个实施方案中，所述第一种核苷酸序列编码的所述APP或者其部分是来源于人、小鼠的APP的蛋白质(例如，APLP1或者APLP2)。
第二种核苷酸序列优选编码任意适宜的信号肽(“SP”)。该信号肽含有例如，根据SEQ ID NO.5的SP(人APP的SP)、根据SEQ ID NO.12的SP(酵母SUC2的SP，“SP2”)、根据SEQ ID NO.13的SP(BM40的SP，“SP3”)，或者例如，根据Heijne等人(Nucl.Acids Res.(1986)，14(11)4683-4690)公知的任意其他信号肽。
作为启动子，可能使用任意适宜的调节性或组成性启动子。该启动子可以适于例如，在哺乳动物细胞、秀丽隐杆线虫、酵母或者果蝇(Drosophila)中表达。用于哺乳动物细胞的适宜的启动子为例如，CMV、HSV TK、SV40、LTR(所有：Clontech，Heidelberg，德国)和RSV(例如，InvitrogenTM lifetechnologies，NV Leek，荷兰)。可用于秀丽隐杆线虫的启动子为例如，unc-119、unc-54、hsp16-2、goa-1和sel-12。为了在酵母中表达，启动子ADH1(组成性)(Vlckova等人(1994)Gene，25(5)，472-4)、GAL1(条件可诱导的)(Selleck等人(1987)Nature 325，173-7)、MET3(条件的)(Cherest等人(1987)Mol Gen Genet 210，307-13)和MET25(参见例如，Kerjan等人(1986)Nucleic Acids Res.14(20)，7861-71)是适宜的。在果蝇中，可能使用例如，启动子MT(金属硫蛋白)、Ac5或者Ds47(所有：InvitrogenTM lifetechnologies)。
优选地，真核细胞可以用于本发明方法中，例如，可以使用人细胞或者非人细胞，例如，猴、仓鼠、小鼠、果蝇、斑马鱼或者酵母，例如，HeLa、HEK293、H4、SH-SY5Y、H9、Cos、CHO、N2A、SL-2或者酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。在本发明的特定实施方案中，使用秀丽隐杆线虫细胞。细胞可以是转基因非人动物的成分。在具体实施方案中，转基因细胞可以是转基因秀丽隐杆线虫的成分。具体地，本发明涉及方法，其中使用例如，来自株系MaV203(InvitrogenTM life technologies，Rockville，MD，USA)或者EGY 48(OriGene Technologies，Inc.Rockville，MD，USA)的酵母细胞。
转基因编码融合蛋白；其由第一和第二种核苷酸序列和如果适宜，其他的核苷酸序列编码的部分蛋白质组成。从而，所述融合蛋白含有第一种部分蛋白质和第二种部分蛋白质和，如果适宜，另一种部分蛋白质。然而，重要的是该融合蛋白除了SEQ ID NO.1之外不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的任意肽基序。技术人员从蛋白酶数据库，例如，MEROPS(Rawlings等人(2002)MEROPS：the protease database.NucleicAcids Res.30，343-346)可以知道已知的蛋白酶切割位点。
优选地，本发明的融合蛋白不含有蛋白酶切割位点，其是胱天蛋白酶(caspase)切割位点，例如，(IVL)ExD，特别地，VEVA、VEVD，在另一实施方案中，本发明的融合蛋白还不含有胞吞或胞吐的信号肽，其是APP内化的信号，例如，NpxY或者Di-亮氨酸，特别是NPTY。
在一个具体实施方案中，融合蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO.14。除了SEQ.ID No.1，所述融合蛋白不含有作为胞吞或胞吐(例如，APP内化信号)和/或蛋白酶(例如，胱天蛋白酶)切割位点的信号的任意(一个或多个)其他肽基序。
具体地，具有SEQ ID NO.15(SPC55GV TAG)的核酸序列的转基因可以用于本发明。在该方法的尤其优选的实施方案中，转基因存在于载体中。本发明的该具体实施方案还涉及成SP-C55-Gal 4-VP16(即，SPC55GV)。在该情况中，由APP的信号肽、APP的C55片段、GAL4和VP16组成的融合蛋白得到表达。定位于跨膜结构域的该蛋白质在C55片段内切割，并且第二种部分蛋白质，即含有C55片段的一部分、GAL4和VP16的融合蛋白的部分可以借助报道质粒检测。
除了转基因构建体SPC55GV，还设想其他报道子构建体，其中，例如，转录活化结构域可以插入SPC55的跨膜结构域和胞质溶胶结构域之间或者标签(例如，MYC、FLAG)可以在N-和C-末端上和SPC55的跨膜结构域和胞质溶胶结构域之间。
所述另一编码核苷酸序列可以编码例如，蛋白质，其可以用于检测第二种部分蛋白质。优选地，所述另一编码编码核苷酸序列因此位于第一种核苷酸序列的3’末端。所述另一编码核苷酸序列编码例如，从许多结构域构建的嵌合蛋白或者另一种蛋白质，例如，含有DNA结合结构域和转录激活结构域的蛋白质。在本发明的具体实施方案中，所述另一编码核苷酸序列编码由GAL4-结合结构域和VP16的转录激活结构域组成的蛋白质(GAL4-VP16，“GV”)，并且另一部分蛋白质优选具有氨基酸序列SEQ.IDNo.7。在酵母细胞中，所述另一部分蛋白质还可以含有LexA-结合结构域(例如，Lex A-VP16)。该另一部分蛋白质尤其适于其中使用酵母株系EGY48的细胞的方法。
具体地，本发明涉及方法，其中所用的细胞经报道质粒共转染。该报道质粒含有处于可调节的启动子控制下的报告基因，例如，该报告基因可以编码GFP和其衍生物，例如，EGFP(增强的绿色荧光蛋白)、EBFP、EYFP、d2EGFP、GFPuv或萤光素酶(例如，Promega，Mannheim，德国)，CAT(例如，Promega)、SEAP(例如，Clontech)、βGal(例如，Clontech)、造胶珊瑚荧光蛋白(RCFP，Clontech)或者程序性细胞死亡诱导因子，例如，Fas、TNF-R1、死亡结构域和同系物(Tartaglia等人(1993)Cell 74，845-53)、ced3、ced4、ced9。作为可调节的启动子，报道质粒可以含有最小启动子，例如，GAL4结合位点联合HIV、CD4启动子或者mec7启动子的最小启动子。适宜的可调节启动子的选择取决于所用的转录-激活结构域。
本发明的具体实施方案涉及所述方法的实施，其中所用的细胞为酵母细胞。在本发明的特定实施方案中在酵母表达载体pDBTrp(InvitrogenTMlife technologies，荷兰，目录号10835023)中整合MET-25启动子(SEQ IDNO.10)，作为酵母表达载体pDBTrp的备选方案，可以选择许多其他表达载体，它们具有不同的启动予(例如，可诱导的GAL-1启动子、组成性活性ADH1启动子)和不同的选择标记(ADE、LEU、TRP、HIS、LYS、PHE)。
本发明的具体实施方案涉及酵母细胞的用途，所述酵母细胞含有稳定整合到它们的基因组或者为染色体外的GAL4-或者LexA-可诱导的报告基因。在这些实施方案中，优选使用酵母株系MaV203(InvitrogenTM lifetechnologies Inc.，Rockville，MD，USA)或EGY48(OriGene Technologies，Inc.，Rockville，MD，USA)。
本发明方法的一个具体实施方案涉及酵母细胞的用途，所述酵母细胞还用另一重组载体转化。优选地，用于这些实施方案的细胞通常没有或者几乎没有任何内源γ-分泌酶或者内源γ-分泌酶活性并且使用上述方法不能检测到。该细胞可以用另一载体转化，所述载体中含有核苷酸序列-优选cDNA，其编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶。例如，可以使用cDNA文库。然后该方法的该实施方案可以用于鉴定γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶或者编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA。可以用于搜索γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA文库可以从任意生物体的细胞或者组织制备，所述细胞或者组织为例如，B细胞、神经元、神经胶质细胞、海马、完整脑、胎盘、肾。优选地，从脊椎动物(例如，仓鼠、大鼠、小鼠、狗、猴、人)，特别是从人细胞或人组织制备cDNA。
对于细胞，其没有转化时不显示出γ-分泌酶活性，但是用cDNA文库转化后显示出γ-分泌酶活性，细胞中存在的cDNA编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶。可以通过公知的方法从表现出该行为的细胞分离该cDNA，并通过公知方法进一步分析。
本发明还涉及转基因，其编码融合蛋白并且含有下面的成分：
a)第一种核酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，
b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，
c)启动子和，
d)第一种核苷酸序列的3’末端的至少一种其他核苷酸序列，其编码DNA结合结构域和转录激活结构域，
其中所述融合蛋白除了SEQ ID NO.1之外不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的任意其他肽。
优选地，第一种核苷酸序列编码CPP或者其部分，其除了SEQ ID NO.1外不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点的信号的任意其他肽基序。所述转基因可以，例如，具有核苷酸序列SEQ ID NO.15。转基因可以存在于适宜的载体，例如，pcDNA 3.1+或pDBTrp中。本发明的另一实施方案是方法，其涉及本发明的转基因和/或载体用于产生转基因细胞的用途，从而，任选地，所述转基因细胞用于成为非人生物体的成分，所述非人生物体适于作为体内报道子生物体。例如，所述转基因和/或载体可以用于产生转基因秀丽隐杆线虫。在另一实施方案中，所述转基因和/或载体可以用于产生转基因酵母细胞，例如，酿酒酵母。
本发明还涉及产生转基因非人生物体，例如，转基因秀丽隐杆线虫的方法，其中含有所述转基因的所述转基因和/或载体经微注射到生物体(例如，秀丽隐杆线虫)的生殖腺。本发明还涉及细胞，其含有本发明的转基因，还涉及转基因秀丽隐杆线虫，其含有所述转基因。本发明还涉及含有本发明的所述转基因的细胞，尤其酵母细胞，所述转基因优选存在于适宜的载体中。此外，本发明涉及分别含有根据本发明的转基因和cDNA文库的细胞，优选酵母细胞，所述细胞适于作为cDNA表达文库(cDNA文库)的受试者。
本发明涉及所述转基因或者重组细胞，优选酵母或者秀丽隐杆线虫的细胞的用途，用于测定或者鉴定γ-分泌酶、编码γ-分泌酶的cDNA、编码γ-分泌酶的亚单位蛋白质的cDNA、编码γ-分泌酶样蛋白质的cDNA或者γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白质的活性的方法中，所述细胞用于鉴定γ-分泌酶活性(γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶)或者其过程的抑制剂的方法中的用途。
具体地，本发明涉及鉴定调节(即抑制、减小、增加或者改变)γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性的物质(效应物)的方法，该方法包括下面的步骤：
1.产生转基因非人生物体，例如，转基因秀丽隐杆线虫或者酿酒酵母，或者转基因细胞，所述转基因非人生物体或者转基因细胞含有本发明的转基因。所述转基因非人生物体或者转基因细胞还含有报道质粒，该报道质粒携带蛋白质结合位点、最小启动子和报告基因和如果适宜，cDNA，其编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶，其中所述转基因非人生物体或者转基因细胞表达转基因和，如果适宜，所述cDNA编码的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶；
2.将所述转基因非人生物体或者转基因细胞与所要研究的受试物质孵育；和
3.检测第二种部分蛋白质的量。
本发明还涉及鉴定γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的效应物的方法，其中
1.制备/使用本发明的转基因；
2.所述转基因和报道质粒和如果适宜，编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA整合到细胞的基因组并且所述转基因编码的融合蛋白和如果适宜，cDNA编码的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶在将要研究的物质存在下表达。
3.融合蛋白
a)被细胞中存在的γ-分泌酶在氨基酸序列SEQ ID NO.1内切割，从而
b)形成含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一种部分蛋白质和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二种部分蛋白质；和
4.定量或定性测定所述第二种部分蛋白质。
本发明还涉及鉴定抑制γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性的物质的方法，其中编码含有信号肽和SEQ IDNO.1的蛋白质的转基因在所要研究的物质和报道质粒的存在下表达，并且测定所要研究的物质对形成的第二种部分蛋白质的量的效果，所述第二种部分蛋白质含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)。
本发明还涉及通过本发明方法鉴定的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的抑制剂。
本发明方法可以例如结合C55-Gal 4-VP16系统(即由C55、GAL4和VP16组成的融合蛋白或者使用编码相应融合蛋白的核酸)用于：
1.鉴定和测定(定性和/或定量)γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性。
2.鉴定不同组织、细胞或者生物体或物种中γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶。鉴定和分离编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的相关cDNA和该cDNA的进一步用途。
3.体内筛选，例如在酵母细胞(例如，酿酒酵母)、秀丽隐杆线虫或者细胞培养物中体内筛选以能够测定γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性而不用免疫生物学方法。
4.使用本发明的方法鉴定和表征物质，例如，药学活性化合物，所述物质调节γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的酶活性或者生物活性，例如，γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的效应物(抑制剂、激活剂、调节剂)。具体地，该方法可以用于HTS(高通量筛选)。通过使用HTS系统，可以鉴定用于治疗阿尔茨海默氏病和/或预防性治疗的物质。
5.阿尔茨海默氏病的研究或背景下例如，促进更深入了解突变的APP或者其片段，或者基于膜的蛋白酶的功能。
6.所描述的融合蛋白/转基因，例如，SP-C55-Gal 4-VP16中的C55可以由本发明的其他片段替换，并且利用本发明方法可以研究γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶、其活性和调节。
本发明的另一实施方案是含有药学活性化合物的药物组合物，所述药学活性化合物抑制已经通过本发明的方法鉴定的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性。
本发明的另一实施方案是制备药物组合物的方法，该方法包括本发明的方法和配制所述鉴定的药学活性化合物。
本发明的再一实施方案是是制备药物的方法，所述方法包括a)根据本发明的方法和b)将所鉴定的药学活性化合物与药学惰性无机和/或有机赋形剂混合。
本发明的另一实施方案是用于检测γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质，或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性的测试试剂盒，其含有本发明的转基因、载体或者细胞。
图1：图1显示了淀粉状蛋白前体蛋白(同种型APP695和同种型APP770或APP751)和分泌酶切割产物。
图2：示意性显示了本发明的原理：N-末端的β-分泌酶切割位点；跨膜结构域中的γ-分泌酶切割位点；C100＝APP的C100片段；GAL4-VP16＝DNA结合结构域、转录激活结构域(由DNA结合结构域和转录激活因子组成)，其结合报道质粒的DNA上的蛋白质结合结构域。
图3：表达质粒SP-C100-GAL4-VP16的构建：aa＝氨基酸；限制性切割位点Sac I、Hind III和Kpn I指出质粒上切割位点的位置。
图4：表达质粒pDBTrp-MET25-SP-C100-GAL4-VP16：用于在酵母中表达转基因的表达质粒的构建。
下面的实施例将阐明本发明并且不应认为是限制发明构思。
实施例：
实施例1：构建含有SP-C100-GAL4/VP16的表达质粒pcDNA3.1+
该质粒编码与APP的C末端100个氨基酸残基(C100)融合的APP信号肽(SP)。C100以Aβ肽的N-末端开始并以APP的C末端结束。其必须被γ-分泌酶额外地切割以便释放Aβ肽。
GAL4/VP16(Seq ID No.7)与SP-C100(Seq ID No.6)的C末端融合。GAL4/VP16含有酵母转录激活因子GAL4的前147个氨基酸残基和来自单纯疱疹病毒的转录激活因子VP16的78个C末端氨基酸残基。作为融合蛋白，GAL4片段接收DNA结合的功能，而VP16片段激活转录(Sadowski等人，1988)。pcDNA3.1+(InvitrogenTM life technologies，荷兰，目录号V79020)作为质粒载体。
实施例2：报道质粒pGL2-MRG5-EGFP的构建
哺乳动物细胞报道质粒pGL2-MRG5是pGL2(Promega)，其中pGL2中含有人免疫缺陷病毒(HIV)核心启动子(Kretzschmar等人，1994)上游的GAL4 DNA结合位点的来自pMRG5(Ikeda等人，1998)的DNA片段插入到pGL2的萤光素酶报道基因的上游。为了容易在细胞培养中检测，将萤光素酶报道基因用从载体pEGFP-N1(Clontech Laboratories，Heidelberg)得到的EGFP(增强的绿色荧光蛋白)的基因替代。
实施例3：人成神经细胞瘤细胞的共转染
人成神经细胞瘤细胞SH-SY5Y(ATCC CRL-2266)用实施例1和2的质粒共转染然后在波长480nm的光的照射下通过显微术分析，在所述波长下EGFP被激发。可能检测到显示出强绿色荧光的表达EGFP的细胞。为了确保绿色荧光特异依赖于报道质粒表达EGFP，仅用报道质粒pGL2-MRG5-EGFP转染SH-SY5Y细胞。在这些细胞中，不能检测到绿色荧光。该表达通过GAL4-VP16激活，其假定GAL4/VP16从SP-C100-GAL4/VP16的C末端蛋白水解释放。
实施例4：使用C100-Ga14/VP16系统检测编码cDNA文库中γ-分泌酶的cDNA
通过将含有ADH启动子和GAL4DB结构域的pDBTrp的部分(位于CYH2基因和多克隆位点之间)用含有SP-C100-GAL4/VP16上游的来自p415MET25(Mumberg等人，1994)的MET25启动子的DNA片段替换将SP-C100-GAL4/VP16克隆到酵母表达载体pDBTrp(InvitrogenTM lifetechnologies，荷兰，目录号10835023)中处于MET25启动子控制下。用该构建体转化酵母株系MaV203(InvitrogenTM life technologies)。MaV203经遗传修饰并且含有三种GAL4-可诱导的报道基因(URA3、HIS3、lacZ)，它们稳定整合到基因组中(Vidal等人，1996)。在MaV203中，GAL4/VP16从SP-C100-GAL4/VP16蛋白质的蛋白水解释放导致URA3和HIS3读出的激活，从而允许在缺乏尿嘧啶和组氨酸的平板上生长。
SP-C100-GAL4/VP16 cDNA在MaV203中的表达仅导致报道子的低活性，从而该体内功能测定系统适于筛选和检测cDNA文库中编码γ-分泌酶的cDNA的表达。
实施例5：通过筛选人B细胞cDNA文库鉴定γ-分泌酶
来自实施例4的重组MaV203酵母株系用于对人B细胞cDNA文库(ATCC 87286；美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA，U.S.A.；Elledge等人，1991)筛选编码具有γ-分泌酶活性的蛋白质的cDNA。备选地，整合到酵母表达载体p415-MET25(Mumberg等人，1994)或者p415-ADH1(Mumberg等人，1995)的人海马cDNA文库可以用于筛选编码γ-分泌酶或者具有γ-分泌酶样活性蛋白质的cDNA。
实施例6：克隆SP2-C100和SP2-C100-GAL4/VP16
将SP-C100-GAL4/VP16(实施例1中描述)的人信号肽编码区用来自酵母SUC2基因(SP2；SEQ ID NO.12)的信号肽替代，导致编码SP2-C100-GAL4/VP16(SEQ ID NO.19)的构建体。
通过用5’引物和3’引物扩增C100的成熟形式的编码区(没有信号序列，参见SEQ ID NO.4)构建SP2-C100，其中所述5’引物包括SUC2-信号肽的编码序列(SEQ ID NO.12)，所述3’引物相应于天然终止密码子(Kang等人，(1987))。为了方便交换信号肽，设计引物EH47(SEQ ID NO.23)和EH49(SEQ ID NO.24)使得所得PCR产物含有额外的NheI位点，其连接信号肽的编码区和成熟肽。
EH47：5’-GCTCTAGAATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGC
AGCC AAAATATCTGCAGCGCTAGCTGATGCAGAATTCCGACATGAC-3’
EH49：5’-CGGGATCCCTAGGCGCCGTTCTGCATCTGCTCAAAGAAC-3’
通过EcoRI切割切除SP2-C100的C100片段并用C100-GAL4/VP16代替得到SP2-C100-GAL4/VP16。将该片段克隆到如实施例4中描述的含有MET25启动子的酵母表达载体pDBTrp(InvitrogenTM lifetechnologies，荷兰，目录号10835023)。
实施例7：克隆SP2-C-GAL4/VP16-100
为了得到构建体SP2-C-GAL4/VP16-100(SEQ ID NO.17)，通过使用下面的引物进行了三次独立的PCR反应：
EH53：5’-ACTATATCTAGAATGCTTTTGC-3’
EH54：5’-TTCGATAGAAGACAGTAGCTTGCCAGATCTACCTTTCTTCTTCAGCATC ACCAA-3’
EH55：5’-TTGGTGATGCTGAAGAAGAAAGGTAGATCTGGCAAGCTACTGTCTTCT ATCGAA-3’
EH56：5’-ATGATGAATGGATGTGTACTGGCCACTAGTACCCCCACCGTACTCGTC AATT-3’
EH57：5’-AATTGACGAGTACGGTGGGGGTACTAGTGGCCAGTACACATCCATTC ATCAT-3’
EH59：5’-CGATAAGCTTGATATCGAATTC-3’：
1)使用SP2-C100作为模板，通过使用引物EH53(SEQ ID NO.25)和EH54(SEQ ID NO.26)扩增C100的胞外结构域和跨膜结构域从而PCR产物还含有3’侧翼区，其与GAL4/VP16编码区重叠。
2)使用引物EH55(SEQ ID NO.27)和EH56(SEQ ID NO.28)，和作为DNA模板的GAL4/VP16，进行PCR反应以扩增编码区与相应于SP2-C100的每一边的5’-和3’-侧翼区。
3)通过使用引物EH57(SEQ ID NO.29)和EH 59(SEQ ID NO.30)扩增编码C100的细胞质结构域的SP2-C100的3’-片段，导致与GAL4/VP16编码区5’重叠。所得PCR产物(约200bp，720bp，和100bp)经纯化并用于EH53和EH59存在下的最后PCR，EH53和EH59相应于SP2-C100的5’-和3’-末端。将约1000bp的最终PCR产物克隆到来自如实施例4描述的含有MET25启动子的pDBTrp(InvitrogenTM life technologies，荷兰，目录号10835023)的酵母表达载体中。
实施例8：克隆SP3-C100、SP3-C100-GAL4/VP16和SP3-C-GAL4/VP16-100
为了在哺乳动物细胞系统中产生表达SP3-C100、SP3-C100-GAL4/VP16(SEQ ID No.21)和SP3-C-GAL4/VP16-100(SEQ IDNO.32)的三种质粒载体，将C100、C100-GAL4/VP16或C-GAL4/VP16-100从来自实施例6或7的酵母表达载体亚克隆到哺乳动物表达载体pRc/CMV(Invitrogen，目录号V75020)中，该载体含有BM40信号肽(SP3；SEQ IDNO.13)的编码区。C100、C100-GAL4/VP16或C-GAL4/VP16-100的编码区连接到实施例6中描述的唯一NheI限制性位点中与SP3编码区处于框内。
实施例9：提高C100-GAL4/VP16在酵母中的表达
来自经转化的酵母的粗裂解物中不同构建体的表达水平的定量揭示与用编码与酵母suc2信号肽融合物的载体转化的酵母细胞的裂解物相比，SP-C100-GAL4/VP16的表达非常低。例如，SP-C100-GAL4/VP16的表达导致预期大小的特定带的强烈表达。然而，通过免疫印迹也可以检测到具有更高电泳迁移率的带，表明酵母中重组蛋白质的非特异降解。对于C-GAL4/VP16-100，蛋白质的稳定性提高了(见下文)，在C-GAL4/VP16-100中，GAL4/VP16结构域插入到C100框内，接近γ-分泌酶切割位点。两种融合蛋白都得到与编码没有GAL4/VP16的C100的构建体相当的表达水平，表明C100和GAL4/VP16之间两种不同的融合不干扰蛋白质表达。
实施例10：改善酵母中背景
由于信号肽交换导致C100-GAL4/VP16的增加的表达与酵母株系MaV203中URA3、HIS3和lacZ报道子系统的非特异活化的强烈增加相关。因为酵母缺少γ-分泌酶活性，所以这最可能是由于细胞蛋白酶对C100-GAL4/VP16的非特异加工和活性GAL4/VP16的释放。
通过将GAL4/VP16结构域移动到更接近γ-分泌酶切割位点，基本上消除了用C100-GAL4/VP16检测到C100跨膜结构域和GAL4/VP16结构域的氨基末端之间位点上的非特异蛋白质水解切割。
通过检查报道子系统的GAL4/VP16-独立的激活在MaV203中试验了多种构建体的切割。用SP-C100-GAL4/VP16转化MaV203显示出Ura+，His-表型(参见实施例4)。通过用SP2肽替换SP信号肽(得到SP2-C100-GAL4/VP16)增加表达水平导致所有读出强烈激活到类似于在阳性对照——组成性表达全长GAL4蛋白质(由质粒pCL1编码；ClontechLaboratories)的MaV203——中检测到的水平。相比，表达SP2-C-GAL4/VP16-100(其以与SP2-C100-GAL4/VP16相当的水平表达)的MaV203细胞显示出Ura--、His--表型，如通过用空载体对照转化MaV203所显示的。
因此，SP2-C-GAL4/VP16-100可以在酵母中高水平表达，但是仍然表现出GAL4-独立报道子的极低非特异激活。SP2-C-GAL4/VP16-100蛋白质的高水平表达联合非特异切割/报道子激活的低背景是读出系统具有令人惊奇的优化信噪比的前提条件。
实施例11：在哺乳动物中通过γ-分泌酶加工SP3-C-GAL4/VP16-100
为了阐明哺乳动物细胞中表达的SP3-C-GAL4/VP16-100蛋白质被γ-分泌酶活性正确加工，将SP3-C-GAL4/VP16-100转染到哺乳动物细胞，其已经表明内源性表达γ-分泌酶活性(Haass等人，1992)。为了在哺乳动物细胞中表达，如实施例8中描述的，将SP2-C-GAL4/VP16-100中的信号肽用来源于基底膜蛋白质BM40的信号肽替换，公知BM40高水平表达(SP3；SEQ ID NO.13)。通过定量Aβ向培养基的分泌监视γ-分泌酶的加工。通过夹层ELISA，使用单克隆抗体6E10和生物素化4G8(Senetek PLC，Napa，California，USA；参考Kim等人，1990)分别作为捕获抗体和检测抗体检测分泌的Aβ。
用SP3-C100转化后，观察到与空载体对照相比Aβ分泌增加8倍。用SP3-C100-GAL4/VP16或SP3-C-GAL4/VP16-100转化的细胞分泌相似量的Aβ，表明GAL4/VP16的C-末端和近膜融合都不干扰γ-分泌酶的蛋白水解加工。
实施例12：哺乳动物细胞中表达的C-Gal4/VP16-100对GAL4/VP16-独立的报道基因的转录激活
通过γ-分泌酶加工C100-GAL4/VP16和C-GAL4/VP16-100导致释放含有GAL4/VP16的多肽和来自C100的侧翼部分的额外氨基酸。用实施例2中描述的哺乳动物报道子-质粒pGL2-MRG5-EGFP(Ikeda等人，1998)共转染SP3-C100-GAL4/VP16和SP3-C-GAL4/VP16-100，质粒pGL2-MRG5-EGFP含有人免疫缺陷病毒(HIV)核心启动子上游的GAL4DNA结合位点和编码EGFP的cDNA。用含有GAL4/VP16的融合共转染pGL2-MRG5-EGFP导致在两种情况中出现GFP-阳性细胞。
实施例13：构建哺乳动物表达质粒SP3-C55-GAL4/VP16：
含有APP的C100序列和GAL4/VP16的构建体含有γ-分泌酶的切割位点和胱天蛋白酶样蛋白酶的切割位点。为了避免非特异胱天蛋白酶样活性能够在真实的γ-分泌酶位点和GAL4/VP16结构域之间切割SP3-C100-GAL4/VP16而释放GAL4/VP16并激活哺乳动物细胞中的报道子系统，缺失SP3-C100-GAL4/VP16中所含的编码APP的细胞质结构域的C100的45个氨基酸C-末端片段。除去C100的C末端45个氨基酸还消除了APP的C-末端的“内化肽”，其在插入到质膜后指导APP的胞吞。
从而，哺乳动物表达质粒SP3-C55-GAL4/VP16含有BM40信号肽(SeqID No.13)、APP-C100的N-末端55个氨基酸残基(C55；Seq ID No.6)和GAL4/VP16。C55以Aβ肽的N-末端开始并以APP的跨膜结构域结束。在SP3-C55-GAL4/VP16蛋白质中，仅存在γ-分泌酶的切割位点。C55含有γ-分泌酶切割位点并且必须由γ-分泌酶切割以便释放Aβ肽和GAL4/VP16。此外，因为SP3-C55-GAL4/VP16中不存在胞吞内化信号肽，仅质膜结合的C55-GAL4/VP16的γ-分泌酶催化切割将释放Aβ肽和激活报道子系统的GAL4/VP16依赖性转录。
通过在GAL4/VP16序列后导入终止密码子(TAG)后从载体SP3-C-GAL4/VP16-100得到表达质粒。这通过用PCR产生的DNA片段替换SP3-C-GAL4/VP16-100的HpaI-ClaI片段实现，所述PCR用SP3-C-GAL4/VP16-100作为DNA模板，在GAL4/VP16中唯一HapI位点上游的5’引物，和3’引物(5’-CCATCGATTTTCTAACCCCCACCGTA-3’；Seq ID No.31)，该PCR在GAL4/VP16可读框C-末端导入TAG终止密码子(下划线)和ClaI限制性位点。
实施例14：稳定转染的HEK293细胞
用质粒SP3-C55-GAL4/VP16和萤光素酶报道质粒PGL2-MRG5(实施例2中描述)共转染HEK293细胞(人胚胎肾细胞系，(ATCC))。随后，将稳定细胞系与400μg/ml遗传霉素(GibcoBRL)孵育以选择新霉素抗性克隆，之后表征SP3-C55-GAL4/VP16和萤光素酶的稳定表达。
实施例15：HEK293细胞的瞬时转染
在多孔12板中用SP3-C55-GAL4/VP16载体(0.03μg)和pGL2-MRG5萤光素酶报道子载体(1μg)共转染HEK293细胞。
化合物DPAT(来自Elan Pharmaceuticals；Dovey等人，2001)和L-685，458(来自Merck Pharmaceuticals；Shearman等人，2000)都是公知的γ-分泌酶抑制剂，它们剂量依赖性抑制萤光素酶活性和Aβ产生，并显示出IC50分别为14nM(DAPT)和19nM(L-685，458)。
通过Bright-Glo Luciferase Assay试剂盒(Promega)定量萤光素酶活性。如实施例11中描述，使用抗体4G8和6E10(来自Senetek)通过ELISA定量细胞培养基中的Aβ。这些抗体对Aβ肽的氨基酸17-24(4G8)和1-17(6E10)是特异的。
在瞬时转染实验中，还通过免疫沉淀和免疫印迹定量Aβ。两种方法都鉴定了相应于Aβ肽的4kDa带。
实施例16：稳定转染的HEK293细胞的药理学表征
根据实施例14鉴定了稳定表达SP3-C55-GAL4/VP16和MRG5-萤光素酶构建体的HEK293细胞的克隆。该细胞克隆用于检查稳定转染的哺乳动物细胞测定系统对DAPT(来自Elan Pharm.；Dovey等人，2001)和L-685，458(来自Merck Pharm.；Shearman等人，2000)的应答。两种化合物都显示出剂量依赖性抑制萤光素酶活性(24小时处理)，IC50分别为230nM(DAPT)和130nM(L-685，458)。
实施例17：鉴定γ-分泌酶的抑制剂
为了鉴定γ-分泌酶的抑制剂，在Multi-Well 96板中孵育稳定双转染的HEK293细胞(见实施例14)，该测定中存在浓度为10μM或更小的待研究的化合物(例如，化合物文库筛选)，并在24小时后测定萤光素酶活性。使用Luciferase Assay System试剂盒(Promega)、Bright-Glo LuciferaseAssay试剂盒(Promega)，或者用于萤光素酶定量的任意其他方法可以定量萤光素酶活性。萤光素酶活性的下降反映了γ-分泌酶活性的下降。
参考文献：
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对于秀丽隐杆线虫工作(转基因)：
Mello，C.和Fire，A.(1995)DNA transformation.In：Epstein，H.F.和Shakes，D.C.，ed.Caenorhabditis elegans：Modern Biological Analysis ofan Organism.Methods in Cell Biology，Vol.48.Academic Press，San Diego，CA，451-482页。
SEQ ID No.1(APP片段)
GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML
SEQ ID No.2(APP片段(第一种部分蛋白质))
GAIIGLMVGGVV
SEQ ID No.3(APP片段(第二种部分蛋白质))
VIVITLVML
SEQ ID No.4(C100片段)
LDAEFREDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG AIIGLMVGGV VIATVIVITL
VMLKKKQYTS IHHGVVEVDA AVTPEERHLS KMQQNGYENP TYKFFEQMQN
SEQ ID No.5(人APP的信号肽(SP))
MLPGLALFLL AAWTARA
SEQ ID No.6(C55片段)
LDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII
GLMVGGVVIA TVIVITLVML KK
SEQ ID No.7(GAL4-VP16)
MKLLSSIEQA CDICRLKKLK CSKEKPKCAK CLKNNWECRY SPKTKRSPLT
RAHLTEVESR LERLEQLFLL IFPREDLDMI LKMDSLQDIK ALLTGLFVQD
NVNKDAVTDR LASVETDMPL TLRQHRISAT SSSEESSNKG QRQLTVSPEF
PGIWAPPTDV SLGDELHLDG EDVAMAHADA LDDFDLDMLG DGDSPGPGFT
PHDSAPYGAL DMADFEFEQM FTDALGIDEY GG
SEQ ID No.8(SP-C100-GAL4-VP16)
GGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCG
CGATGTAC
GGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC
ATTAGTTC
ATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCC
CAACGACC
CCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTG
ACGTCAAT
GGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTAC
GCCCCCTA
TTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTT
TCCTACTT
GGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAA
TGGGCGTG
GATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTT
TTGGCACC
GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTAC
TGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAA
GCTTCACAGCTAGCGCA
CTCGGTGCCCCGCGCAGGGTCGCGATGCTGCCCGGTTTGGCACTGTTCCTGCTGGCCGCCTGGA
CGGCTCGGGCGCTGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATT
GGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGT
GTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCA
TTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGAT
GCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACGCGCGGGGT
ACCCCGGCG ATGAAGC TACTGTCTTC TATCGAACAA GCATGCGATA TTTGCCGACT
TAAAAAGCTC AAGTGCTCCA AAGAAAAACC GAAGTGCGCC AAGTGTCTGA
AGAACAACTG GGAGTGTCGC TACTCTCCCA AAACCAAAAG GTCTCCGCTG
ACTAGGGCAC ATCTGACAGA AGTGGAATCA AGGCTAGAAA GACTGGAACA
GCTATTTCTA CTGATTTTTC CTCGAGAAGA CCTTGACATG ATTTTGAAAA
TGGATTCTTT ACAGGATATA AAAGCATTGT TAACAGGATT ATTTGTACAA
GATAATGTGA ATAAAGATGC CGTCACAGAT AGATTGGCTT CAGTGGAGAC
TGATATGCCT CTAACATTGA GACAGCATAG AATAAGTGCG ACATCATCAT
CGGAAGAGAG TAGTAACAAA GGTCAAAGAC AGTTGACTGT ATCG
CCGGAATTCCCGGGGATCTGGGC CCCCCCGAC CGATGTCAGC CTGGGGGACG
AGCTCCACTT AGACGGCGAG GACGTGGCGA TGGCGCATGC CGACGCGCTA
GACGATTTCG ATCTGGACAT GTTGGGGGAC GGGGATTCCC CGGGGCCGGG
ATTTACCCCC CACGACTCCG CCCCCTACGG CGCTCTGGAT ATGGCCGACT
TCGAGTTTGA GCAGATGTTT ACCGATGCCC TTGGAATTGA CGAGTACGGT GGGTAG
SEQ ID No.9(人APP)
AGTTTCCTCG GCAGCGGTAG GCGAGAGCAC GCGGAGGAGC GTGCGCGGGG GCCCCGGGAG
ACGGCGGCGG TGGCGGCGCG GGCAGAGCAA GGACGCGGCG GATCCCACTC GCACAGCAGC
GCACTCGGTG CCCCGCGCAG GGTCGCGATG CTGCCCGGTT TGGCACTGCT CCTGCTGGCC
GCCTGGACGG CTCGGGCGCT GGAGGTACCC ACTGATGGTA ATGCTGGCCT
GCTGGCTGAA
CCCCAGATTG CCATGTTCTG TGGCAGACTG AACATGCACA TGAATGTCCA GAATGGGAAG
TGGGATTCAG ATCCATCAGG GACCAAAACC TGCATTGATA CCAAGGAAGG CATCCTGCAG
TATTGCCAAG AAGTCTACCC TGAACTGCAG ATCACCAATG TGGTAGAAGC CAACCAACCA
GTGACCATCC AGAACTGGTG CAAGCGGGGC CGCAAGCAGT GCAAGACCCA TCCCCACTTT
GTGATTCCCT ACCGCTGCTT AGTTGGTGAG TTTGTAAGTG ATGCCCTTCT CGTTCCTGAC
AAGTGCAAAT TCTTACACCA GGAGAGGATG GATGTTTGCG AAACTCATCT TCACTGGCAC
ACCGTCGCCA AAGAGACATG CAGTGAGAAG AGTACCAACT TGCATGACTA CGGCATGTTG
CTGCCCTGCG GAATTGACAA GTTCCGAGGG GTAGAGTTTG TGTGTTGCCC ACTGGCTGAA
GAAAGTGACA ATGTGGATTC TGCTGATGCG GAGGAGGATG ACTCGGATGT CTGGTGGGGC
GGAGCAGACA CAGACTATGC AGATGGGAGT GAAGACAAAG TAGTAGAAGT AGCAGAGGAG
GAAGAAGTGG CTGAGGTGGA AGAAGAAGAA GCCGATGATG ACGAGGACGA TGAGGATGGT
GATGAGGTAG AGGAAGAGGC TGAGGAACCC TACGAAGAAG CCACAGAGAG AACCACCAGC
ATTGCCACCA CCACCACCAC CACCACAGAG TCTGTGGAAG AGGTGGTTCG AGTTCCTACA
ACAGCAGCCA GTACCCCTGA TGCCGTTGAC AAGTATCTCG AGACACCTGG GGATGAGAAT
GAACATGCCC ATTTCCAGAA AGCCAAAGAG AGGCTTGAGG CCAAGCACCG AGAGAGAATG
TCCCAGGTCA TGAGAGAATG GGAAGAGGCA GAACGTCAAG CAAAGAACTT GCCTAAAGCT
GATAAGAAGG CAGTTATCCA GCATTTCCAG GAGAAAGTGG AATCTTTGGA ACAGGAAGCA
GCCAACGAGA GACAGCAGCT GGTGGAGACA CACATGGCCA GAGTGGAAGC CATGCTCAAT
GACCGCCGCC GCCTGGCCCT GGAGAACTAC ATCACCGCTC TGCAGGCTGT TCCTCCTCGG
CCTCGTCACG TGTTCAATAT GCTAAAGAAG TATGTCCGCG CAGAACAGAA GGACAGACAG
CACACCCTAA AGCATTTCGA GCATGTGCGC ATGGTGGATC CCAAGAAAGC CGCTCAGATC
CGGTCCCAGG TTATGACACA CCTCCGTGTG ATTTATGAGC GCATGAATCA GTCTCTCTCC
CTGCTCTACA ACGTGCCTGC AGTGGCCGAG GAGATTCAGG ATGAAGTTGA TGAGCTGCTT
CAGAAAGAGC AAAACTATTC AGATGACGTC TTGGCCAACA TGATTAGTGA ACCAAGGATC
AGTTACGGAA ACGATGCTCT CATGCCATCT TTGACCGAAA CGAAAACCAC CGTGGAGCTC
CTTCCCGTGA ATGGAGAGTT CAGCCTGGAC GATCTCCAGC CGTGGCATTC TTTTGGGGCT
GACTCTGTGC CAGCCAACAC AGAAAACGAA GTTGAGCCTG TTGATGCCCG CCCTGCTGCC
GACCGAGGAC TGACCACTCG ACCAGGTTCT GGGTTGACAA ATATCAAGAC GGAGGAGATC
TCTGAAGTGA AGATGGATGC AGAATTCCGA CATGACTCAG GATATGAAGT TCATCATCAA
AAATTGGTGT TCTTTGCAGA AGATGTGGGT TCAAACAAAG GTGCAATCAT TGGACTCATG
GTGGGCGGTG TTGTCATAGC GACAGTGATC GTCATCACCT TGGTGATGCT GAAGAAGAAA
CAGTACACAT CCATTCATCA TGGTGTGGTG GAGGTTGACG CCGCTGTCAC CCCAGAGGAG
CGCCACCTGT CCAAGATGCA GCAGAACGGC TACGAAAATC CAACCTACAA GTTCTTTGAG
CAGATGCAGA ACTAGACCCC CGCCACAGCA GCCTCTGAAG TTGGACAGCA AAACCATTGC
TTCACTACCC ATCGGTGTCC ATTTATAGAA TAATGTGGGA AGAAACAAAC CCGTTTTATG
ATTTACTCAT TATCGCCTTT TGACAGCTGT GCTGTAACAC AAGTAGATGC CTGAACTTGA
ATTAATCCAC ACATCAGTAA TGTATTCTAT CTCTCTTTAC ATTTTGGTCT CTATACTACA
TTATTAATGG GTTTTGTGTA CTGTAAAGAA TTTAGCTGTA TCAAACTAGT GCATGAATAG
ATTCTCTCCT GATTATTTAT CACATAGCCC CTTAGCCAGT TGTATATTAT TCTTGTGGTT
TGTGACCCAA TTAAGTCCTA CTTTACATAT GCTTTAAGAA TCGATGGGGG ATGCTTCATG
TGAACGTGGG AGTTCAGCTG CTTCTCTTGC CTAAGTATTC CTTTCCTGAT CACTATGCAT
TTTAAAGTTA AACATTTTTA AGTATTTCAG ATGCTTTAGA GAGATTTTTT TTCCATGACT
GCATTTTACT GTACAGATTG CTGCTTCTGC TATATTTGTG ATATAGGAAT TAAGAGGATA
CACACGTTTG TTTCTTCGTG CCTGTTTTAT GTGCACACAT TAGGCATTGA GACTTCAAGC
TTTTCTTTTT TTGTCCACGT ATCTTTGGGT CTTTGATAAA GAAAAGAATC CCTGTTCATT
GTAAGCACTT TTACGGGGCG GGTGGGGAGG GGTGCTCTGC TGGTCTTCAA TTACCAAGAA
TTCTCCAAAA CAATTTTCTG CAGGATGATT GTACAGAATC ATTGCTTATG ACATGATCGC
TTTCTACACT GTATTACATA AATAAATTAA ATAAAATAAC CCCGGGCAAG ACTTTTCTTT
GAAGGATGAC TACAGACATT AAATAATCGA AGTAATTTTG GGTGGGGAGA AGAGGCAGAT
TCAATTTTCT TTAACCAGTC TGAAGTTTCA TTTATGATAC AAAAGAAGAT GAAAATGGAA
GTGGCAATAT AAGGGGATGA GGAAGGCATG CCTGGACAAA CCCTTCTTTT AAGATGTGTC
TTCAATTTGT ATAAAATGGT GTTTTCATGT AAATAAATAC ATTCTTGGAG GAGC
SEQ ID No.10(重组质粒pDBTrp-MET25-SP-C100-GAL4-VP16)
ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAG
GACGGATCGCTTGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAA
TTTACTCTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGT
AGAAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAGCGT
ACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGAT
AAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGATGAAACAATT
CGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTA
GAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTAT
TTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAA
AGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAAT
ACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATCTGCAGCT
CTGGCCCGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACA
ATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAA
CGTCTTGCTGGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGC
TCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTTTCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCA
GAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGAC
TAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGA
TGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCGCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCT
GATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTG
TTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAA
TAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTC
TGGAAAGAAATGCATACGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCT
CACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGG
AATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCA
TTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTC
ATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCAT
TACGCTGACTTGACGGGACGGCGCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAG
CGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTG
CTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCA
ACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGT
AGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAAT
CCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGA
TAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGG
AGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCC
CGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGG
GAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTG
AGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGC
CTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCT
GATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGA
CCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCC
CGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGT
GAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGC
TTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGA
CCATGATTACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGTACCGATCCCG
AGCTTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCAGTATAATG
TTACATGCGTACACGCGTCTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTGAAATATAAATAACGTTCTTA
ATACTAACATAACTATAAAAAAATAAATAGGGACCTAGACTTCAGGTTGTCTAACTCCTTCCTT
TTCGGTTAGAGCGGATGTGGGGGGAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATA
TCGACAAAGGAAAAGGGGCCTGTTTACTCACAGGCTTTTTTCAAGTAGGTAATTAAGTCGTTTC
TGTCTTTTTCCTTCTTCAACCCACCAAAGGCCATCTTGGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTCATAGAAATAATACAGAAGTAGATGTTGAATTAGATTAAACTGAAGATATATAATT
TATTGGAAAATACATAGAGCTTTTTGTTGATGCGCTTAAGCGATCAATTCAACAACACCACCAG
CAGCTCTGATTTTTTCTTCAGCCAACTTGGAGACGAATCTAGCTTTGACGATAACTGGAACATT
TGGAATTCTACCCTTACCCAAGATCTTACCGTAACCGGCTGCCAAAGTGTCAATAACTGGAGCA
GTTTCCTTAGAAGCAGATTTCAAGTATTGGTCTCTCTTGTCTTCTGGGATCAATGTCCACAATT
TGTCCAAGTTCAAGACTGGCTTCCAGAAATGAGCTTGTTGCTTGTGGAAGTATCTCATACCAAC
CTTACCGAAATAACCTGGATGGTATTTATCCATGTTAATTCTGTGGTGATGTTGACCACCGGCC
ATACCTCTACCACCGGGGTGCTTTCTGTGCTTACCGATACGACCTTTACCGGCTGAGACGTGAC
CTCTGTGCTTTCTAGTCTTAGTGAATCTGGAAGGCATTCTTGATTAGTTGGATGATTGTTCTGG
GATTTAATGCAAAAATCACTTAAGAAGGAAAATCAACGGAGAAAGCAAACGCCATCTTAAATAT
ACGGGATACAGATGAAAGGGTTTGAACCTATCTGGAAAATAGCATTAAACAAGCGAAAAACTGC
GAGGAAAATTGTTTGCGTCTCTGCGGGCTATTCACGCGCCAGAGGAAAATAGGAAAAATAACAG
GGCATTAGAAAAATAATTTTGATTTTGGTAATGTGTGGGTCCTGGTGTACAGATGTTACATTGG
TTACAGTACTCTTGTTTTTGCTGTGTTTTTCGATGAATCTCCAAAATGGTTGTTAGCACATGGA
AGAGTCACCGATGCTAAGTTATCTCTATGTAAGCTACGTGGCGTGACTTTTGATGAAGCCGCAC
AAGAGATACAGGATTGGCAACTGCAAATAGAATCTGGGGATCCCCCCTCGACGGATGCAAGGGT
TCGAATCCCTTAGCTCTCATTATTTTTTGCTTTTTCTCTTGAG.GTSGTCACATGATCGCAAAA
TGGCAAATGGCACGTGAAGCTGTCGATATTGGGGAACTGTGGTGGTTGGCAAATGACTAATTAA
GTTAGTCAAGGCGCCATCCTCATGAAAACTGTGTAACATAATAACCGAAGTGTCGAAAAGGTGG
CACCTTGTCCAATTGAACACGCTCGATGAAAAAAATAAGATATATATAAGGTTAAGTAAAGCGT
CTGTTAGAAAGGAAGTTTTTCCTTTTTCTTGCTCTCTTGTCTTTTCATCTACTATTTCCTTCGT
GTAATACAGGGTCGTCAGATACATAGATACAATTCTATTACCCCCATCCATACATCTAGAACTA
GTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTCACAGCTAGCGCACTCGGTGCCCCGC
GCAGGGTCGCGATGCTGCCCGGTTTGGCACTGTTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCT
GGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCA
GAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGA
CAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGT
GGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGC
TACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACGCGCGGGGTACCCCGGCGATGA
AGCTACTGTCTTCTATCGAACAAGCATGCGATATTTGCCGACTTAAAAAGCTCAAGTGCTCCAA
AGAAAAACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTGAAGAACAACTGGGAGTGTCGCTACTCTCCCAAAACC
AAAAGGTCTCCGCTGACTAGGGCACATCTGACAGAAGTGGAATCAAGGCTAGAAAGACTGGAAC
AGCTATTTCTACTGATTTTTCCTCGAGAAGACCTTGACATGATTTTGAAAATGGATTCTTTACA
GGATATAAAAGCATTGTTAACAGGATTATTTGTACAAGATAATGTGAATAAAGATGCCGTCACA
GATAGATTGGCTTCAGTGGAGACTGATATGCCTCTAACATTGAGACAGCATAGAATAAGTGCGA
CATCATCATCGGAAGAGAGTAGTAACAAAGGTCAAAGACAGTTGACTGTATCGCCGGAATTCCC
GGGGATCTGGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGAC
GTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATT
CCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTT
CGAGTTTGAGCAGATGTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGGTAGGGATCCACT
AGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGACCCCGGGTGCTA
GCAAGGCCTTGTGGCCAGCCATGGCAACTAGTGCGGCCGCTAAGTAAGTAAGACGTCGAGCTCT
AAGTAAGTAACGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTTTGGACTTCTTCGCCAGAGGTTTGGTCAAGTC
TCCAATCAAGGTTGTCGGCTTGTCTACCTTGCCAGAAATTTACGAAAAGATGGAAAAGGGTCAA
ATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTA
TTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAA
ACGAAAATTCTTGTTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGCAT
GAGGTCGCTCTTATTGACCACACCTCTACCGGCATGCCGAGCAAATGCCTGCAAATCGCTCCCC
ATTTCACCCAATTGTAGATATGCTAACTCCAGCAATGAGTTGATGAATCTCGGTGTGTATTTTA
TGTCCTCAGAGGACAATACCTGTTGTAATCGTTCTTCCACACGGATCCCAATTCGCCCTATAGT
GAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTA
CCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCG
CACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCG
CATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGC
GCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCT
CTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAAC
TTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGAC
GTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATC
TCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGC
TGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCCTGATGCGG
TATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCAGGCAAGTGCACAAACAATACTTAA
ATAAATACTACTCAGTAATAACCTATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGA
GTCTTTTACACCATTTGTCTCCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTA
AGCGCATCACCAACATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGC
TCTCTTGCCTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGC
TTCTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTATGTTG
CAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGGTATTCTTGCC
ACGACTCATCTCCATGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCAGAGCCAAAACATC
CTCCTTAGGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGGAGTGCCTGAACTATTTTTATAT
GCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCGGGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCA
CACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGAATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTG
CAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAA
GCTGCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTT
GGCCCTCTCCTTTTCTTTTTTCGACCGAATTAATTCTTAATCGGCAAAAAAAGAAAAGCTCCGG
ATCAAGATTGTACGTAAGGTGACAAGCTATTTTTCAATAAAGAATATCTTCCACTACTGCCATC
TGGCGTCATAACTGCAAAGTACACATATATTACGATGCTGTCTATTAAATGCTTCCTATATTAT
ATATATAGTAATGTCGTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAG
CCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCC
GCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCAC
CGAAACGCGCGA
SEQ ID No.11(SP-C100-GAL4-VP16融合蛋白)
MLPGLALFLL AAWTARALDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII
GLMVGGVVIA TVIVITLVML KKKQYTSIHH GVVEVDAAVT PEERHLSKMQ
QNGYENPTYK FFEQMQNARG TPAMKLLSSI EQACDICRLK KLKCSKEKPK
CAKCLKNNWE CRYSPKTKRS PLTRAHLTEV ESRLERLEQL FLLIFPREDL
DMILKMDSLQ DIKALLTGLF VQDNVNKDAV TDRLASVETD MPLTLRQHRI
SATSSSEESS NKGQRQLTVS PEFPGIWAPP TDVSLGDELH LDGEDVAMAH
ADALDDFDLD MLGDGDSPGP GFTPHDSAPY GALDMADFEF EQMFTDALGI
DEY GG
SEQ ID No.12(酵母SUC2基因的信号肽(SP2))
MLLRAFLFLLAGFAAKISAALA
SEQ ID No.13(哺乳动物基底膜蛋白质BM40的信号肽(SP3))
MRAWIFFLLCLAGRALA
SEQ ID No.14(SP-C55-GAL4-VP16)
MLPGLALFLL AAWTARALDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII
GLMVGGVVIA TVIVITLVML KKKGRSGKLL SSIEQACDIC RLKKLKCSKE
KPKCAKCLKN NWECRYSPKT KRSPLTRAHL TEVESRLERL EQLFLLIFPR
EDLDMILKMD SLQDIKALLT GLFVQDNVNK DAVTDRLASV ETDMPLTLRQ
HRISATSSSE ESSNKGQRQL TVSPEFPGIW APPTDVSLGD ELHLDGEDVA
MAHADALDDF DLDMLGDGDS PGPGFTPHDS APYGALDMAD FEFEQMFTDA
LGIDEYGG
SEQ ID No.15(SP-C55-GAL4/VP16-TAG)
   1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg
  61 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg
 121 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc
 181 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt
 241 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata
 301 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc
 361 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc
 421 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt
 481 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt
 541 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca
 601 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg
 661 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc
 721 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg
 781 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca
 841 ctgcttaact ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagaccca agcttctgcc
 901 tgccgcctgc ctgcctgcca ctgagggttc ccagcaccat gagggcctgg atcttctttc
 961 tcctttgcct ggccgggagg gctctggcag ccccgctagc tgatgcagaattccgacatg
1021 actcaggata tgaagttcat catcaaaaat tggtgttctt tgcagaagat gtgggttcaa
1081 acaaaggtgc aatcattgga ctcatggtgg gcggtgttgt catagcgaca gtgatcgtca
1141 tcaccttggt gatgctgaag aagaaaggta gatctggcaa gctactgtct tctatcgaac
1201 aagcatgcga tatttgccga cttaaaaagc tcaagtgctc caaagaaaaa
ccgaagtgcg
1261 ccaagtgtct gaagaacaac tgggagtgtc gctactctcc caaaaccaaa
aggtctccgc
1321 tgactagggc acatctgaca gaagtggaat caaggctaga aagactggaa cagctatttc
1381 tactgatttt tcctcgagaa gaccttgaca tgattttgaa aatggattct ttacaggata
1441 taaaagcatt gttaacagga ttatttgtac aagataatgt gaataaagat gccgtcacag
1501 atagattggc ttcagtggag actgatatgc ctctaacatt gagacagcat agaataagtg
1561 cgacatcatc atcggaagag agtagtaaca aaggtcaaag acagttgact gtatcgccgg
1621 aattcccggg gatctgggcc cccccgaccg atgtcagcct gggggacgag ctccacttag
1681 acggcgagga cgtggcgatg gcgcatgccg acgcgctaga cgatttcgat ctggacatgt
1741 tgggggacgg ggattccccg ggtccgggat ttacccccca cgactccgcc ccctacggcg
1801 ctctggatat ggccgacttc gagtttgagc agatgtttac cgatgccctt ggaattgacg
1861 agtacggtgg gggttagaaa atcgataccg tcgaggccgc tcgagcatgc atctagaggg
1921 ccctattcta tagtgtcacc taaatgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc
1981 tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc
2041 cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg
2101 tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa
2161 tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggaacca gctggggctc gaggggggat
2221 ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg
2281 accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc
2341 gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg gcatcccttt agggttccga
2401 tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt
2461 gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat
2521 agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat
2581 ttataaggga ttttggggat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa
2641 tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt aaatatttgc ttatacaatc
2701 ttcctgtttt tggggctttt ctgattatca accggggtgg gtaccgagct cgaattctgt
2761 ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccaggcagg cagaagtatg
2821 caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca
2881 ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact
2941 ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta
3001 atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag
3061 tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc ttggatatcc
3121 attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga
3181 ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa
3241 cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt
3301 ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg
3361 ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa
3421 gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac
3481 cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt
3541 gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact
3601 cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg
3661 ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg
3721 acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc
3781 atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt
3841 gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc
3901 gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg
3961 ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg
4021 attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct
4081 ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta
4141 ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat
4201 ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct
4261 ggatcccgtc gacctcgaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa
4321 ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg
4381 gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca
4441 gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg
4501 tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg
4561 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg
4621 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa
4681 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg
4741 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc
4801 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc
4861 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc
4921 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg
4981 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc
5041 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga
5101 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc
5161 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac
5221 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg
5281 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc
5341 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa
5401 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta
5461 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt
5521 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag
5581 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca
5641 gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc
5701 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt
5761 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag
5821 ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt
5881 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat
5941 ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt
6001 gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc
6061 ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat
6121 cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag
6181 ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt
6241 ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg
6301 gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta
6361 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc
6421 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc
SEQ ID No.16(重组质粒pDBTrp-MET25-SP-C-Ga14/VP16-100)
   1 gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt
  61 cttaggacgg atcgcttgcc tgtaacttac acgcgcctcg tatcttttaa tgatggaata
 121 atttgggaat ttactctgtg tttatttatt tttatgtttt gtatttggat tttagaaagt
 181 aaataaagaa ggtagaagag ttacggaatg aagaaaaaaa aataaacaaa ggtttaaaaa
 241 atttcaacaa aaagcgtact ttacatatat atttattaga caagaaaagc agattaaata
 301 gatatacatt cgattaacga taagtaaaat gtaaaatcac aggattttcg tgtgtggtct
 361 tctacacaga caagatgaaa caattcggca ttaatacctg agagcaggaa gagcaagata
 421 aaaggtagta tttgttggcg atccccctag agtcttttac atcttcggaa aacaaaaact
 481 attttttctt taatttcttt ttttactttc tatttttaat ttatatattt atattaaaaa
 541 atttaaatta taattatttt tatagcacgt gatgaaaagg acccaggtgg cacttttcgg
 601 ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg
 661 ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatctg cagctctggc ccgtgtctca
 721 aaatctctga tgttacattg cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc
 781 tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg
 841 ctggaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg
 901 cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctttcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc
 961 agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt
1021 cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac
1081 tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccgcggg aaaacagcat tccaggtatt
1141 agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg
1201 gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc
1261 tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg
1321 taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat acgcttttgc cattctcacc
1381 ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa
1441 attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc
1501 catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa
1561 atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt
1621 tttctaatca gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg
1681 ggactgcgca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc
1741 gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg
1801 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact
1861 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg
1921 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg
1981 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac
2041 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca
2101 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga
2161 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc
2221 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca ggggggaacg cctggtatct ttatagtcct
2281 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggccg
2341 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct
2401 tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc
2461 tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc
2521 gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat
2581 taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt
2641 aatgtgagtt acctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcct
2701 atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat
2761 tacgccaagc tcggaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggtacc gatcccgagc
2821 tttgcaaatt aaagccttcg agcgtcccaa aaccttctca agcaaggttt tcagtataat
2881 gttacatgcg tacacgcgtc tgtacagaaa aaaaagaaaa atttgaaata taaataacgt
2941 tcttaatact aacataacta taaaaaaata aatagggacc tagacttcag gttgtctaac
3001 tccttccttt tcggttagag cggatgtggg gggagggcgt gaatgtaagc gtgacataac
3061 taattacatg atatcgacaa aggaaaaggg gcctgtttac tcacaggctt ttttcaagta
3121 ggtaattaag tcgtttctgt ctttttcctt cttcaaccca ccaaaggcca tcttggtact
3181 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
3241 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttcatagaa ataatacaga agtagatgtt
3301 gaattagatt aaactgaaga tatataattt attggaaaat acatagagct ttttgttgat
3361 gcgcttaagc gatcaattca acaacaccac cagcagctct gattttttct tcagccaact
3421 tggagacgaa tctagctttg acgataactg gaacatttgg aattctaccc ttacccaaga
3481 tcttaccgta accggctgcc aaagtgtcaa taactggagc agtttcctta gaagcagatt
3541 tcaagtattg gtctctcttg tcttctggga tcaatgtcca caatttgtcc aagttcaaga
3601 ctggcttcca gaaatgagct tgttgcttgt ggaagtatct cataccaacc ttaccgaaat
3661 aacctggatg gtatttatcc atgttaattc tgtggtgatg ttgaccaccg gccatacctc
3721 taccaccggg gtgctttctg tgcttaccga tacgaccttt accggctgag acgtgacctc
3781 tgtgctttct agtcttagtg aatctggaag gcattcttga ttagttggat gattgttctg
3841 ggatttaatg caaaaatcac ttaagaagga aaatcaacgg agaaagcaaa cgccatctta
3901 aatatacggg atacagatga aagggtttga acctatctgg aaaatagcat taaacaagcg
3961 aaaaactgcg aggaaaattg tttgcgtctc tgcgggctat tcacgcgcca gaggaaaata
4021 ggaaaaataa cagggcatta gaaaaataat tttgattttg gtaatgtgtg ggtcctggtg
4081 tacagatgtt acattggtta cagtactctt gtttttgctg tgtttttcga tgaatctcca
4141 aaatggttgt tagcacatgg aagagtcacc gatgctaagt tatctctatg taagctacgt
4201 ggcgtgactt ttgatgaagc cgcacaagag atacaggatt ggcaactgca aatagaatct
4261 ggggatcccc cctcgacgga tgcaagggtt cgaatccctt agctctcatt attttttgct
4321 ttttctcttg aggtcacatg atcgcaaaat ggcaaatggc acgtgaagct gtcgatattg
4381 gggaactgtg gtggttggca aatgactaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa
4441 actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct
4501 cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt
4561 tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt
4621 cagatacata gatacaattc tattaccccc atccatactc tagaatgctt ttgcgagctt
4681 tccttttcct cttggctggt tttgcagcca aaatatctgc agcgctagct gatgcagaat
4741 tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg
4801 tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc atagcgacag
4861 tgatcgtcat caccttggtg atgctgaaga agaaaggtag atctggcaag ctactgtctt
4921 ctatcgaaca agcatgcgat atttgccgac ttaaaaagct caagtgctcc aaagaaaaac
4981 cgaagtgcgc caagtgtctg aagaacaact gggagtgtcg ctactctccc aaaaccaaaa
5041 ggtctccgct gactagggca catctgacag aagtggaatc aaggctagaa agactggaac
5101 agctatttct actgattttt cctcgagaag accttgacat gattttgaaa atggattctt
5161 tacaggatat aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca agataatgtg aataaagatg
5221 ccgtcacaga tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc tctaacattg agacagcata
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SEQ ID No.17(SP2-C-GAL4/VP16-100)
atgcttttgcgagctttccttttcctcttggctggttttgcagccaaaatatctgcagcgctag
ctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgc
agaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcg
acagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaaggtagatctggcaagctactgtctt
ctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaa
gtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccg
ctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctac
tgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagc
attgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggct
tcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcgg
aagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggc
ccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcg
catgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccggggccgg
gatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagca
gatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggggtactagtggccagtacacatcc
attcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaaga
tgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacggcgccta
g
SEQ ID No.18(SP2-C-GAL4/VP16-100)
mllraflfllagfaakisaaladaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvvia
tvivitlvmlkkkgrsgkllssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrsp
ltrahltevesrlerleqlfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrla
svetdmpltlrqhrisatssseessnkgqrqltvspefpgiwapptdvslgdelhldgedvama
hadalddfdldmlgdgdspgpgftphdsapygaldmadfefeqmftdalgideygggtsgqyts
ihhgvvevdaavtpeerhlskmqqngyenptykffeqmqnga*
SEQ ID No.19(SP2-C100-GAL4/VP16)
atgcttttgcgagctttccttttcctcttggctggttttgcagccaaaatatctgcagcgctag
ctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgc
agaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcg
acagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaacagtacacatccattcatcatggtg
tggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacgg
ctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacgcgcggggtaccccggcgatg
aagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctcca
aagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaac
caaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaa
cagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttac
aggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcac
agatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcg
acatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcc
cggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgagga
cgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggat
tccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgact
tcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggtag
SEQ ID No.20(SP2-C100-GAL4/VP16)
mllraflfllagfaakisaaladaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvvia
tvivitlvmlkkkqytsihhgvvevdaavtpeerhlskmqqngyenptykffeqmqnargtpam
kllssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrspltrahltevesrlerle
qlfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrlasvetdmpltlrqhrisa
tssseessnkgqrqltvspefpgiwapptdvslgdelhldgedvamahadalddfdldmlgdgd
spgpgftphdsapygaldmadfefeqmftdalgideygg
SEQ ID No.21(SP3-C100-GAL4/VP16)
atgagggcctggatcttctttctcctttgcctggccgggagggctctggcagccccgctagctg
atgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcaga
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gtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaacagtacacatccattcatcatggtgtgg
tggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggcta
cgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacgcgcggggtaccccggcgatgaag
ctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaag
aaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaa
aaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacag
ctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacagg
atataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacaga
tagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgaca
tcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccgg
ggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgt
ggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattcc
ccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcg
agtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtggg
SEQ ID No.22(SP3-C100-GAL4/VP16)
mrawiffllclagralaapladaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvviat
vivitlvmlkkkqytsihhgvvevdaavtpeerhlskmqqngyenptykffeqmqnargtpamk
11ssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrspltrahltevesrlerleq
lfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrlasvetdmplt1rqhrisat
ssseessnkgqrqltvspefpgiwapptdvslgdelhldgedvamahadalddfdldmlgdgds
pgpgftphdsapygaldmadfefeqmftdalgideygg
SEQ ID No.23(引物EH47)
GCTCTAGAATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGC AGCC
AAAATATCTGCAGCGCTAGCTGATGCAGAATTCCGACATGAC
SEQ ID No.24(引物EH49)
CGGGATCCCTAGGCGCCGTTCTGCATCTGCTCAAAGAAC
SEQ ID No.25(引物EH53)
ACTATATCTAGAATGCTTTTGC
SEQ ID No.26(引物EH54)
TCGATAGAAGACAGTAGCTTGCCAGATCTACCTTTCTTCTTCAGCATC ACCAA
SEQ ID No.27(引物EH55)
TTGGTGATGCTGAAGAAGAAAGGTAGATCTGGCAAGCTACTGTCTTCT ATCGAA
SEQ ID No.28(引物EH56)
ATGATGAATGGATGTGTACTGGCCACTAGTACCCCCACCGTACTCGTC AATT
SEQ ID No.29(引物EH57)
AATTGACGAGTACGGTGGGGGTACTAGTGGCCAGTACACATCCATTC ATCAT
SEQ ID No.30(引物EH59)
CGATAAGCTTGATATCGAATTC
SEQ ID No.31(引物C55-3’)
CCATCGATTTTCTAACCCCCACCGTA
SEQ ID No.32(质粒SP3-C-GAL4/VP16-100)
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atagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaa
atttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggc
gttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagtta
ttaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataa
cttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatga
cgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacg
gtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtc
aatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctactt
ggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaa
tgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatggg
agtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattga
cgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactag
agaacccactgcttaactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagcttc
tgcctgccgcctgcctgcctgccactgagggttcccagcaccatgagggcctggatcttctttc
tcctttgcctggccgggagggctctggcagccccgctagctgatgcagaattccgacatgactc
aggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggt
gcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtga
tgctgaagaagaaaggtagatctggcaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttg
ccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaac
tgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaag
tggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttga
catgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaa
gataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaa
cattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaag
acagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggg
gacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcg
atctggacatgttgggggacggggattccccggggccgggatttaccccccacgactccgcccc
ctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaatt
gacgagtacggtgggggtactagtggccagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttg
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gatatcaagcttatcgataccgtcgaggccgctcgagcatgcatctagagggccctattctata
gtgtcacctaaatgctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatct
gttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcct
aataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggt
ggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggc
tctatggaaccagctggggctcgaggggggatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgc
ggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcct
ttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcggg
gcatccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattaggg
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aaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttaaatatttgcttatacaatc
ttcctgtttttggggcttttctgattatcaaccggggtgggtaccgagctcgaattctgtggaa
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gcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatg
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ttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaata
ggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc
                            序列表
<110>塞诺菲-安万特德国有限公司
<120>筛选γ-分泌酶抑制剂的方法
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：APP片段
<400>3
Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu
  l            5
<210>4
<211>100
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：C100片段
<400>4
Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln
  1            5               10               15
Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly A1a Ile
           20               25               30
Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile
        35              40               45
Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly
    50               55               60
Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser
 65               70               75               80
Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu
              85               90               95
Gln Met Gln Asn
          100
<210>5
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg
  1            5               10               15
Ala
<210>6
<211>55
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：C55片段
<400>6
Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln
 1             5              10                15
Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile
           20               25               30
Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile
       35               40               45
Thr Leu Val Met Leu Lys Lys
    50               55
<210>7
<211>232
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：GAL4-VP16
<400>7
Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu
  1            5               10               15
Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu
           20               25               30
Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro
        35               40              45
Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu
    50               55               60
Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile
65               70               75                80
Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu
              85               90               95
Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala
          100              105              110
Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser
      115               120              125
Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu
   130              135              140
Thr Val Ser Pro Glu Phe Pro Gly Ile Trp Ala Pro Pro Thr Asp Val
145              150              155              160
Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala
             165              170              175
His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly
          180              185              190
Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly
       195              200               205
Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu  Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala
   210              215                220
Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly
225              230
<210>8
<211>1813
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：突变基因
<400>8
ggcaaggctt gaccgacaat tgcatgaaga atctgcttag ggttaggcgt tttgcgctgc   60
ttcgcgatgt acgggccaga tatacgcgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt  120
aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta  180
cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga  240
cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt  300
tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta  360
ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg  420
actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt  480
tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc  540
accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccgcgt gtacggtggg aggtctatat  600
aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac  660
gactcactat agggagaccc aagctggcta gcgtttaaac ttaagcttca cagctagcgc  720
actcggtgcc ccgcgcaggg tcgcgatgct gcccggtttg gcactgttcc tgctggccgc  780
ctggacggct cgggcgctgg atgcagaatt ccgacatgac tcaggatatg aagttcatca  840
tcaaaaattg gtgttctttg cagaagatgt gggttcaaac aaaggtgcaa tcattggact  900
catggtgggc ggtgttgtca tagcgacagt gatcgtcatc accttggtga tgctgaagaa  960
gaaacagtac acatccattc atcatggtgt ggtggaggtt gacgccgctg tcaccccaga 1020
ggagcgccac ctgtccaaga tgcagcagaa cggctacgaa aatccaacct acaagttctt 1080
tgagcagatg cagaacgcgc ggggtacccc ggcgatgaag ctactgtctt ctatcgaaca 1140
agcatgcgat atttgccgac ttaaaaagct caagtgctcc aaagaaaaac cgaagtgcgc 1200
caagtgtctg aagaacaact gggagtgtcg ctactctccc aaaaccaaaa ggtctccgct 1260
gactagggca catctgacag aagtggaatc aaggctagaa agactggaac agctatttct 1320
actgattttt cctcgagaag accttgacat gattttgaaa atggattctt tacaggatat 1380
aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca agataatgtg aataaagatg ccgtcacaga 1440
tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc tctaacattg agacagcata gaataagtgc 1500
gacatcatca tcggaagaga gtagtaacaa aggtcaaaga cagttgactg tatcgccgga 1560
attcccgggg atctgggccc ccccgaccga tgtcagcctg ggggacgagc tccacttaga 1620
cggcgaggac gtggcgatgg cgcatgccga cgcgctagac gatttcgatc tggacatgtt 1680
gggggacggg gattccccgg ggccgggatt taccccccac gactccgccc cctacggcgc 1740
tctggatatg gccgacttcg agtttgagca gatgtttacc gatgcccttg gaattgacga 1800
gtacggtggg tag                                                    1813
<210>9
<211>3354
<212>DNA
<213>人
<400>9
agtttcctcg gcagcggtag gcgagagcac gcggaggagc gtgcgcgggg gccccgggag   60
acggcggcgg tggcggcgcg ggcagagcaa ggacgcggcg gatcccactc gcacagcagc  120
gcactcggtg ccccgcgcag ggtcgcgatg ctgcccggtt tggcactgct cctgctggcc  180
gcctggacgg ctcgggcgct ggaggtaccc actgatggta atgctggcct gctggctgaa  240
ccccagattg ccatgttctg tggcagactg aacatgcaca tgaatgtcca gaatgggaag  300
tgggattcag atccatcagg gaccaaaacc tgcattgata ccaaggaagg catcctgcag  360
tattgccaag aagtctaccc tgaactgcag atcaccaatg tggtagaagc caaccaacca  420
gtgaccatcc agaactggtg caagcggggc cgcaagcagt gcaagaccca tccccacttt  480
gtgattccct accgctgctt agttggtgag tttgtaagtg atgcccttct cgttcctgac  540
aagtgcaaat tcttacacca ggagaggatg gatgtttgcg aaactcatct tcactggcac  600
accgtcgcca aagagacatg cagtgagaag agtaccaact tgcatgacta cggcatgttg  660
ctgccctgcg gaattgacaa gttccgaggg gtagagtttg tgtgttgccc actggctgaa  720
gaaagtgaca atgtggattc tgctgatgcg gaggaggatg actcggatgt ctggtggggc  780
ggagcagaca cagactatgc agatgggagt gaagacaaag tagtagaagt agcagaggag  840
gaagaagtgg ctgaggtgga agaagaagaa gccgatgatg acgaggacga tgaggatggt  900
gatgaggtag aggaagaggc tgaggaaccc tacgaagaag ccacagagag aaccaccagc  960
attgccacca ccaccaccac caccacagag tctgtggaag aggtggttcg agttcctaca 1020
acagcagcca gtacccctga tgccgttgac aagtatctcg agacacctgg ggatgagaat 1080
gaacatgccc atttccagaa agccaaagag aggcttgagg ccaagcaccg agagagaatg 1140
tcccaggtca tgagagaatg ggaagaggca gaacgtcaag caaagaactt gcctaaagct 1200
gataagaagg cagttatcca gcatttccag gagaaagtgg aatctttgga acaggaagca 1260
gccaacgaga gacagcagct ggtggagaca cacatggcca gagtggaagc catgctcaat 1320
gaccgccgcc gcctggccct ggagaactac atcaccgctc tgcaggctgt tcctcctcgg 1380
cctcgtcacg tgttcaatat gctaaagaag tatgtccgcg cagaacagaa ggacagacag 1440
cacaccctaa agcatttcga gcatgtgcgc atggtggatc ccaagaaagc cgctcagatc 1500
cggtcccagg ttatgacaca cctccgtgtg atttatgagc gcatgaatca gtctctctcc 1560
ctgctctaca acgtgcctgc agtggccgag gagattcagg atgaagttga tgagctgctt 1620
cagaaagagc aaaactattc agatgacgtc ttggccaaca tgattagtga accaaggatc 1680
agttacggaa acgatgctct catgccatct ttgaccgaaa cgaaaaccac cgtggagctc 1740
cttcccgtga atggagagtt cagcctggac gatctccagc cgtggcattc ttttggggct 1800
gactctgtgc cagccaacac agaaaacgaa gttgagcctg ttgatgcccg ccctgctgcc 1860
gaccgaggac tgaccactcg accaggttct gggttgacaa atatcaagac ggaggagatc 1920
tctgaagtga agatggatgc agaattccga catgactcag gatatgaagt tcatcatcaa 1980
aaattggtgt tctttgcaga agatgtgggt tcaaacaaag gtgcaatcat tggactcatg 2040
gtgggcggtg ttgtcatagc gacagtgatc gtcatcacct tggtgatgct gaagaagaaa 2100
cagtacacat ccattcatca tggtgtggtg gaggttgacg ccgctgtcac cccagaggag 2160
cgccacctgt ccaagatgca gcagaacggc tacgaaaatc caacctacaa gttctttgag 2220
cagatgcaga actagacccc cgccacagca gcctctgaag ttggacagca aaaccattgc 2280
ttcactaccc atcggtgtcc atttatagaa taatgtggga agaaacaaac ccgttttatg 2340
atttactcat tatcgccttt tgacagctgt gctgtaacac aagtagatgc ctgaacttga 2400
attaatccac acatcagtaa tgtattctat ctctctttac attttggtct ctatactaca 2460
ttattaatgg gttttgtgta ctgtaaagaa tttagctgta tcaaactagt gcatgaatag 2520
attctctcct gattatttat cacatagccc cttagccagt tgtatattat tcttgtggtt 2580
tgtgacccaa ttaagtccta ctttacatat gctttaagaa tcgatggggg atgcttcatg 2640
tgaacgtggg agttcagctg cttctcttgc ctaagtattc ctttcctgat cactatgcat 2700
tttaaagtta aacattttta agtatttcag atgctttaga gagatttttt ttccatgact 2760
gcattttact gtacagattg ctgcttctgc tatatttgtg atataggaat taagaggata 2820
cacacgtttg tttcttcgtg cctgttttat gtgcacacat taggcattga gacttcaagc 2880
ttttcttttt ttgtccacgt atctttgggt ctttgataaa gaaaagaatc cctgttcatt 2940
gtaagcactt ttacggggcg ggtggggagg ggtgctctgc tggtcttcaa ttaccaagaa 3000
ttctccaaaa caattttctg caggatgatt gtacagaatc attgcttatg acatgatcgc 3060
tttctacact gtattacata aataaattaa ataaaataac cccgggcaag acttttcttt 3120
gaaggatgac tacagacatt aaataatcga agtaattttg ggtggggaga agaggcagat 3180
tcaattttct ttaaccagtc tgaagtttca tttatgatac aaaagaagat gaaaatggaa 3240
gtggcaatat aaggggatga ggaaggcatg cctggacaaa cccttctttt aagatgtgtc 3300
ttcaatttgt ataaaatggt gttttcatgt aaataaatac attcttggag gagc       3354
<210>10
<211>8331
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：重组质粒
<400>10
acgaaagggc ctcgtgatsc gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc  60
ttaggacgga tcgcttgcct gtaacttaca cgcgcctcgt atcttttaat gatggaataa 120
tttgggaatt tactctgtgt ttatttattt ttatgttttg tatttggatt ttagaaagta 180
aataaagaag gtagaagagt tacggaatga agaaaaaaaa ataaacaaag gtttaaaaaa 240
tttcaacaaa aagcgtactt tacatatata tttattagac aagaaaagca gattaaatag 300
atatacattc gattaacgat aagtaaaatg taaaatcaca ggattttcgt gtgtggtctt 360
ctacacagac aagatgaaac aattcggcat taatacctga gagcaggaag agcaagataa 420
aaggtagtat ttgttggcga tccccctaga gtcttttaca tcttcggaaa acaaaaacta  480
ttttttcttt aatttctttt tttactttct atttttaatt tatatattta tattaaaaaa  540
tttaaattat aattattttt atagcacgtg atgaaaagga cccaggtggc acttttcggg  600
gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc  660
tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatctgc agctctggcc cgtgtctcaa  720
aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat catgaacaat aaaactgtct  780
gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc  840
tggaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa atgggctcgc  900
gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tttcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca  960
gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc 1020
agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact 1080
cctgatgatg catggttact caccactgcg atccgcggga aaacagcatt ccaggtatta 1140
gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg 1200
ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct 1260
caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt 1320
aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata cgcttttgcc attctcaccg 1380
gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa 1440
ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc 1500
atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa 1560
tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt 1620
ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga gcattacgct gacttgacgg 1680
gacggcgcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1740
tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1800
aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1860
tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 1920
agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1980
taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 2040
caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 2100
agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagcattgag 2160
aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 2220
gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag gggggaacgc ctggtatctt tatagtcctg 2280
tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggccga 2340
gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 2400
ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 2460
ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 2520
aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 2580
aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2640
atgtgagtta cctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctccta 2700
tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 2760
acgccaagct cggaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggtaccg atcccgagct 2820
ttgcaaatta aagccttcga gcgtcccaaa accttctcaa gcaaggtttt cagtataatg 2880
ttacatgcgt acacgcgtct gtacagaaaa aaaagaaaaa tttgaaatat aaataacgtt 2940
cttaatacta acataactat aaaaaaataa atagggacct agacttcagg ttgtctaact 3000
ccttcctttt cggttagagc ggatgtgggg ggagggcgtg aatgtaagcg tgacataact 3060
aattacatga tatcgacaaa ggaaaagggg cctgtttact cacaggcttt tttcaagtag 3120
gtaattaagt cgtttctgtc tttttccttc ttcaacccac caaaggccat cttggtactt 3180
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3240
tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttcatagaaa taatacagaa gtagatgttg 3300
aattagatta aactgaagat atataattta ttggaaaata catagagctt tttgttgatg 3360
cgcttaagcg atcaattcaa caacaccacc agcagctctg attttttctt cagccaactt 3420
ggagacgaat ctagctttga cgataactgg aacatttgga attctaccct tacccaagat 3480
cttaccgtaa ccggctgcca aagtgtcaat aactggagca gtttccttag aagcagattt 3540
caagtattgg tctctcttgt cttctgggat caatgtccac aatttgtcca agttcaagac 3600
tggcttccag aaatgagctt gttgcttgtg gaagtatctc ataccaacct taccgaaata 3660
acctggatgg tatttatcca tgttaattct gtggtgatgt tgaccaccgg ccatacctct 3720
accaccgggg tgctttctgt gcttaccgat acgaccttta ccggctgaga cgtgacctct 3780
gtgctttcta gtcttagtga atctggaagg cattcttgat tagttggatg attgttctgg 3840
gatttaatgc aaaaatcact taagaaggaa aatcaacgga gaaagcaaac gccatcttaa 3900
atatacggga tacagatgaa agggtttgaa cctatctgga aaatagcatt aaacaagcga 3960
aaaactgcga ggaaaattgt ttgcgtctct gcgggctatt cacgcgccag aggaaaatag 4020
gaaaaataac agggcattag aaaaataatt ttgattttgg taatgtgtgg gtcctggtgt 4080
acagatgtta cattggttac agtactcttg tttttgctgt gtttttcgat gaatctccaa 4140
aatggttgtt agcacatgga agagtcaccg atgctaagtt atctctatgt aagctacgtg 4200
gcgtgacttt tgatgaagcc gcacaagaga tacaggattg gcaactgcaa atagaatctg 4260
gggatccccc ctcgacggat gcaagggttc gaatccctta gctctcatta ttttttgctt 4320
tttctcttga ggtsgtcaca tgatcgcaaa atggcaaatg gcacgtgaag ctgtcgatat 4380
tggggaactg tggtggttgg caaatgacta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga 4440
aaactgtgta acataataac cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg 4500
ctcgatgaaa aaaataagat atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt 4560
tttccttttt cttgctctct tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc 4620
gtcagataca tagatacaat tctattaccc ccatccatac atctagaact agtggatccc 4680
ccgggctgca ggaattcgat atcaagcttc acagctagcg cactcggtgc cccgcgcagg 4740
gtcgcgatgc tgcccggttt ggcactgttc ctgctggccg cctggacggc tcgggcgctg 4800
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt 4860
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc 4920
atagcgacag tgatcgtcat caccttggtg atgctgaaga agaaacagta cacatccatt 4980
catcatggtg tggtggaggt tgacgccgct gtcaccccag aggagcgcca cctgtccaag 5040
atgcagcaga acggctacga aaatccaacc tacaagttct ttgagcagat gcagaacgcg 5100
cggggtaccc cggcgatgaa gctactgtct tctatcgaac aagcatgcga tatttgccga 5160
cttaaaaagc tcaagtgctc caaagaaaaa ccgaagtgcg ccaagtgtct gaagaacaac 5220
tgggagtgtc gctactctcc caaaaccaaa aggtctccgc tgactagggc acatctgaca 5280
gaagtggaat caaggctaga aagactggaa cagctatttc tactgatttt tcctcgagaa 5340
gaccttgaca tgattttgaa aatggattct ttacaggata taaaagcatt gttaacagga 5400
ttatttgtac aagataatgt gaataaagat gccgtcacag atagattggc ttcagtggag 5460
actgatatgc ctctaacatt gagacagcat agaataagtg cgacatcatc atcggaagag 5520
agtagtaaca aaggtcaaag acagttgact gtatcgccgg aattcccggg gatctgggcc 5580
cccccgaccg atgtcagcct gggggacgag ctccacttag acggcgagga cgtggcgatg 5640
gcgcatgccg acgcgctaga cgatttcgat ctggacatgt tgggggacgg ggattccccg 5700
gggccgggat ttacccccca cgactccgcc ccctacggcg ctctggatat ggccgacttc 5760
gagtttgagc agatgtttac cgatgccctt ggaattgacg agtacggtgg gtagggatcc 5820
actagtccag tgtggtggaa ttctgcagat atccagcaca gtggcggccg ctcgaccccg 5880
ggtgctagca aggccttgtg gccagccatg gcaactagtg cggccgctaa gtaagtaaga 5940
cgtcgagctc taagtaagta acggccgcca ccgcggtgga gctttggact tcttcgccag 6000
aggtttggtc aagtctccaa tcaaggttgt cggcttgtct accttgccag aaatttacga 6060
aaagatggaa aagggtcaaa tcgttggtag atacgttgtt gacacttcta aataagcgaa 6120
tttcttatga tttatgattt ttattattaa ataagttata aaaaaaataa gtgtatacaa 6180
attttaaagt gactcttagg ttttaaaacg aaaattcttg ttcttgagta actctttcct 6240
gtaggtcagg ttgctttctc aggtatagca tgaggtcgct cttattgacc acacctctac 6300
cggcatgccg agcaaatgcc tgcaaatcgc tccccatttc acccaattgt agatatgcta 6360
actccagcaa tgagttgatg aatctcggtg tgtattttat gtcctcagag gacaatacct 6420
gttgtaatcg ttcttccaca cggatcccaa ttcgccctat agtgagtcgt attacaattc 6480
actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 6540
ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 6600
cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggacg cgccctgtag cggcgcatta 6660
agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 6720
cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 6780
gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 6840
aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 6900
cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 6960
acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 7020
tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta 7080
acgtttacaa tttcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 7140
gcaggcaagt gcacaaacaa tacttaaata aatactactc agtaataacc tatttcttag 7200
catttttgac gaaatttgct attttgttag agtcttttac accatttgtc tccacacctc 7260
cgcttacatc aacaccaata acgccattta atctaagcgc atcaccaaca ttttctggcg 7320
tcagtccacc agctaacata aaatgtaagc tttcggggct ctcttgcctt ccaacccagt 7380
cagaaatcga gttccaatcc aaaagttcac ctgtcccacc tgcttctgaa tcaaacaagg 7440
gaataaacga atgaggtttc tgtgaagctg cactgagtag tatgttgcag tcttttggaa 7500
atacgagtct tttaataact ggcaaaccga ggaactcttg gtattcttgc cacgactcat 7560
ctccatgcag ttggacgata tcaatgccgt aatcattgac cagagccaaa acatcctcct 7620
taggttgatt acgaaacacg ccaaccaagt atttcggagt gcctgaacta tttttatatg 7680
cttttacaag acttgaaatt ttccttgcaa taaccgggtc aattgttctc tttctattgg 7740
gcacacatat aatacccagc aagtcagcat cggaatctag agcacattct gcggcctctg 7800
tgctctgcaa gccgcaaact ttcaccaatg gaccagaact acctgtgaaa ttaataacag 7860
acatactcca agctgccttt gtgtgcttaa tcacgtatac tcacgtgctc aatagtcacc 7920
aatgccctcc ctcttggccc tctccttttc ttttttcgac cgaattaatt cttaatcggc 7980
aaaaaaagaa aagctccgga tcaagattgt acgtaaggtg acaagctatt tttcaataaa 8040
gaatatcttc cactactgcc atctggcgtc ataactgcaa agtacacata tattacgatg 8100
ctgtctatta aatgcttcct atattatata tatagtaatg tcgtttatgg tgcactctca 8160
gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg 8220
acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 8280
ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg a          8331
<210>11
<211>355
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：突变蛋白质
<400>11
Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg
  1            5               10               15
Ala Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His
           20               25               30
Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
       35                40              45
Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val
    50               55               60
Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His
 65               70               75               80
Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu
               85              90               95
Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe
          100              105              110
Glu Gln Met Gln Asn Ala Arg Gly Thr Pro Ala Met Lys Leu Leu Ser
      115               120              125
Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys
   130               135              140
Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu
145              150              155              160
Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His
             165              170              175
Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu
          180              185              190
Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser
      195               200              205
Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn
   210              215               220
Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp
225              230              235              240
Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser
              245              250              255
Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Pro Glu
          260              265              270
Phe Pro Gly Ile Trp Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu
      275               280              285
Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu
   290              295               300
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro
305              310              315              320
Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala
              325              330              335
Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu
          340              345              350
Tyr Gly Gly
      355
<210>12
<211>22
<212>PRT
<213>酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)
<400>12
Met Leu Leu Arg Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys
  1             5              10               15
Ile Ser Ala Ala Leu Ala
           20
<210>13
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：信号肽
<400>13
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
  1            5               10               15
Ala
<210>14
<211>308
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：突变蛋白质
<400>14
Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg
  1            5               10               15
Ala Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His
           20               25               30
Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
       35               40               45
Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val
    50               55               60
Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gly Arg Ser Gly Lys Leu Leu
 65               70               75               80
Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys
              85               90               95
Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp
          100              105              110
Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala
       115              120              125
His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe
   130              135              140
Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp
145              150              155              160
Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp
             165              170              175
Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr
          180              185              190
Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser
       195              200              205
Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Pro
   210              215               220
Glu Phe Pro Gly Ile Trp Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp
225              230              235              240
Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala
             245              250              255
Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly
          260              265              270
Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met
       275              280              285
Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp
   290              295              300
Glu Tyr Gly Gly
305
<210>15
<211>6454
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：突变基因
<400>15
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg   60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg  120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc  180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt  240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata  300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc  360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc  420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt  480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt  540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca  600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg  660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc  720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg  780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca  840
ctgcttaact ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagaccca agcttctgcc  900
tgccgcctgc ctgcctgcca ctgagggttc ccagcaccat gagggcctgg atcttctttc  960
tcctttgcct ggccgggagg gctctggcag ccccgctagc tgatgcagaa ttccgacatg 1020
actcaggata tgaagttcat catcaaaaat tggtgttctt tgcagaagat gtgggttcaa 1080
acaaaggtgc aatcattgga ctcatggtgg gcggtgttgt catagcgaca gtgatcgtca 1140
tcaccttggt gatgctgaag aagaaaggta gatctggcaa gctactgtct tctatcgaac 1200
aagcatgcga tatttgccga cttaaaaagc tcaagtgctc caaagaaaaa ccgaagtgcg 1260
ccaagtgtct gaagaacaac tgggagtgtc gctactctcc caaaaccaaa aggtctccgc 1320
tgactagggc acatctgaca gaagtggaat caaggctaga aagactggaa cagctatttc 1380
tactgatttt tcctcgagaa gaccttgaca tgattttgaa aatggattct ttacaggata 1440
taaaagcatt gttaacagga ttatttgtac aagataatgt gaataaagat gccgtcacag 1500
atagattggc ttcagtggag actgatatgc ctctaacatt gagacagcat agaataagtg 1560
cgacatcatc atcggaagag agtagtaaca aaggtcaaag acagttgact gtatcgccgg 1620
aattcccggg gatctgggcc cccccgaccg atgtcagcct gggggacgag ctccacttag 1680
acggcgagga cgtggcgatg gcgcatgccg acgcgctaga cgatttcgat ctggacatgt 1740
tgggggacgg ggattccccg ggtccgggat ttacccccca cgactccgcc ccctacggcg 1800
ctctggatat ggccgacttc gagtttgagc agatgtttac cgatgccctt ggaattgacg 1860
agtacggtgg gggttagaaa atcgataccg tcgaggccgc tcgagcatgc atctagaggg 1920
ccctattcta tagtgtcacc taaatgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc 1980
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 2040
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 2100
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 2160
tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggaacca gctggggctc gaggggggat 2220
ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 2280
accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 2340
gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg gcatcccttt agggttccga 2400
tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt 2460
gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 2520
agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat 2580
ttataaggga ttttggggat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 2640
tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt aaatatttgc ttatacaatc 2700
ttcctgtttt tggggctttt ctgattatca accggggtgg gtaccgagct cgaattctgt 2760
ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccaggcagg cagaagtatg 2820
caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca 2880
ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact 2940
ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta 3000
atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag 3060
tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc ttggatatcc 3120
attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga 3180
ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa 3240
cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt 3300
ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg 3360
ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa 3420
gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 3480
cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 3540
gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 3600
cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg 3660
ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg 3720
acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc 3780
atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt 3840
gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc 3900
gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg 3960
ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg 4020
attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct 4080
ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta 4140
ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 4200
ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 4260
ggatcccgtc gacctcgaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 4320
ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 4380
gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 4440
gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 4500
tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 4560
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 4620
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 4680
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 4740
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 4800
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 4860
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc 4920
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 4980
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 5040
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 5100
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 5160
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 5220
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 5280
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 5340
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 5400
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 5460
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 5520
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 5580
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 5640
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 5700
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 5760
tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 5820
ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 5880
tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 5940
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 6000
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 6060
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 6120
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 6180
ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 6240
ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 6300
gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 6360
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6420
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc                             6454
<210>16
<211>8259
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：重组质粒
<400>16
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt   60
cttaggacgg atcgcttgcc tgtaacttac acgcgcctcg tatcttttaa tgatggaata  120
atttgggaat ttactctgtg tttatttatt tttatgtttt gtatttggat tttagaaagt  180
aaataaagaa ggtagaagag ttacggaatg aagaaaaaaa aataaacaaa ggtttaaaaa  240
atttcaacaa aaagcgtact ttacatatat atttattaga caagaaaagc agattaaata  300
gatatacatt cgattaacga taagtaaaat gtaaaatcac aggattttcg tgtgtggtct  360
tctacacaga caagatgaaa caattcggca ttaatacctg agagcaggaa gagcaagata  420
aaaggtagta tttgttggcg atccccctag agtcttttac atcttcggaa aacaaaaact  480
attttttctt taatttcttt ttttactttc tatttttaat ttatatattt atattaaaaa  540
atttaaatta taattatttt tatagcacgt gatgaaaagg acccaggtgg cacttttcgg  600
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg  660
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatctg cagctctggc ccgtgtctca  720
aaatctctga tgttacattg cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc  780
tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg  840
ctggaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg  900
cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctttcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc  960
agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt 1020
cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac 1080
tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccgcggg aaaacagcat tccaggtatt 1140
agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg 1200
gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc 1260
tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg 1320
taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat acgcttttgc cattctcacc 1380
ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa 1440
attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc 1500
catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa 1560
atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt 1620
tttctaatca gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg 1680
ggacggcgca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 1740
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 1800
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 1860
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 1920
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 1980
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 2040
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 2100
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga 2160
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 2220
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca ggggggaacg cctggtatct ttatagtcct 2280
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggccg 2340
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 2400
tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 2460
tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 2520
gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 2580
taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 2640
aatgtgagtt acctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcct 2700
atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 2760
tacgccaagc tcggaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggtacc gatcccgagc 2820
tttgcaaatt aaagccttcg agcgtcccaa aaccttctca agcaaggttt tcagtataat 2880
gttacatgcg tacacgcgtc tgtacagaaa aaaaagaaaa atttgaaata taaataacgt 2940
tcttaatact aacataacta taaaaaaata aatagggacc tagacttcag gttgtctaac 3000
tccttccttt tcggttagag cggatgtggg gggagggcgt gaatgtaagc gtgacataac 3060
taattacatg atatcgacaa aggaaaaggg gcctgtttac tcacaggctt ttttcaagta 3120
ggtaattaag tcgtttctgt ctttttcctt cttcaaccca ccaaaggcca tcttggtact 3180
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3240
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttcatagaa ataatacaga agtagatgtt 3300
gaattagatt aaactgaaga tatataattt attggaaaat acatagagct ttttgttgat 3360
gcgcttaagc gatcaattca acaacaccac cagcagctct gattttttct tcagccaact 3420
tggagacgaa tctagctttg acgataactg gaacatttgg aattctaccc ttacccaaga 3480
tcttaccgta accggctgcc aaagtgtcaa taactggagc agtttcctta gaagcagatt 3540
tcaagtattg gtctctcttg tcttctggga tcaatgtcca caatttgtcc aagttcaaga 3600
ctggcttcca gaaatgagct tgttgcttgt ggaagtatct cataccaacc ttaccgaaat 3660
aacctggatg gtatttatcc atgttaattc tgtggtgatg ttgaccaccg gccatacctc 3720
taccaccggg gtgctttctg tgcttaccga tacgaccttt accggctgag acgtgacctc 3780
tgtgctttct agtcttagtg aatctggaag gcattcttga ttagttggat gattgttctg 3840
ggatttaatg caaaaatcac ttaagaagga aaatcaacgg agaaagcaaa cgccatctta 3900
aatatacggg atacagatga aagggtttga acctatctgg aaaatagcat taaacaagcg 3960
aaaaactgcg aggaaaattg tttgcgtctc tgcgggctat tcacgcgcca gaggaaaata 4020
ggaaaaataa cagggcatta gaaaaataat tttgattttg gtaatgtgtg ggtcctggtg 4080
tacagatgtt acattggtta cagtactctt gtttttgctg tgtttttcga tgaatctcca 4140
aaatggttgt tagcacatgg aagagtcacc gatgctaagt tatctctatg taagctacgt 4200
ggcgtgactt ttgatgaagc cgcacaagag atacaggatt ggcaactgca aatagaatct 4260
ggggatcccc cctcgacgga tgcaagggtt cgaatccctt agctctcatt attttttgct 4320
ttttctcttg aggtcacatg atcgcaaaat ggcaaatggc acgtgaagct gtcgatattg 4380
gggaactgtg gtggttggca aatgactaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa 4440
actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct 4500
cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt 4560
tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt 4620
cagatacata gatacaattc tattaccccc atccatactc tagaatgctt ttgcgagctt 4680
tccttttcct cttggctggt tttgcagcca aaatatctgc agcgctagct gatgcagaat 4740
tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg 4800
tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc atagcgacag 4860
tgatcgtcat caccttggtg atgctgaaga agaaaggtag atctggcaag ctactgtctt 4920
ctatcgaaca agcatgcgat atttgccgac ttaaaaagct caagtgctcc aaagaaaaac 4980
cgaagtgcgc caagtgtctg aagaacaact gggagtgtcg ctactctccc aaaaccaaaa 5040
ggtctccgct gactagggca catctgacag aagtggaatc aaggctagaa agactggaac 5100
agctatttct actgattttt cctcgagaag accttgacat gattttgaaa atggattctt 5160
tacaggatat aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca agataatgtg aataaagatg 5220
ccgtcacaga tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc tctaacattg agacagcata 5280
gaataagtgc gacatcatca tcggaagaga gtagtaacaa aggtcaaaga cagttgactg 5340
tatcgccgga attcccgggg atctgggccc ccccgaccga tgtcagcctg ggggacgagc 5400
tccacttaga cggcgaggac gtggcgatgg cgcatgccga cgcgctagac gatttcgatc 5460
tggacatgtt gggggacggg gattccccgg gtccgggatt taccccccac gactccgccc 5520
cctacggcgc tctggatatg gccgacttcg agtttgagca gatgtttacc gatgcccttg 5580
gaattgacga gtacggtggg ggtactagtg gccagtacac atccattcat catggtgtgg 5640
tggaggttga cgccgctgtc accccagagg agcgccacct gtccaagatg cagcagaacg 5700
gctacgaaaa tccaacctac aagttctttg agcagatgca gaacggcgcc tagggatccc 5760
ccgggctgca ggaattcgat atcaagctta tcgataccgt cgaccccggg tgctagcaag 5820
gccttgtggc cagccatggc aactagtgcg gccgctaagt aagtaagacg tcgagctcta 5880
agtaagtaac ggccgccacc gcggtggagc tttggacttc ttcgccagag gtttggtcaa 5940
gtctccaatc aaggttgtcg gcttgtctac cttgccagaa atttacgaaa agatggaaaa 6000
gggtcaaatc gttggtagat acgttgttga cacttctaaa taagcgaatt tcttatgatt 6060
tatgattttt attattaaat aagttataaa aaaaataagt gtatacaaat tttaaagtga 6120
ctcttaggtt ttaaaacgaa aattcttgtt cttgagtaac tctttcctgt aggtcaggtt 6180
gctttctcag gtatagcatg aggtcgctct tattgaccac acctctaccg gcatgccgag 6240
caaatgcctg caaatcgctc cccatttcac ccaattgtag atatgctaac tccagcaatg 6300
agttgatgaa tctcggtgtg tattttatgt cctcagagga caatacctgt tgtaatcgtt 6360
cttccacacg gatcccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacaattcac tggccgtcgt 6420
tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 6480
tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 6540
gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 6600
gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 6660
gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 6720
gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 6780
tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 6840
ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 6900
atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 6960
aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt 7020
tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc aggcaagtgc 7080
acaaacaata cttaaataaa tactactcag taataaccta tttcttagca tttttgacga 7140
aatttgctat tttgttagag tcttttacac catttgtctc cacacctccg cttacatcaa 7200
caccaataac gccatttaat ctaagcgcat caccaacatt ttctggcgtc agtccaccag 7260
ctaacataaa atgtaagctt tcggggctct cttgccttcc aacccagtca gaaatcgagt 7320
tccaatccaa aagttcacct gtcccacctg cttctgaatc aaacaaggga ataaacgaat 7380
gaggtttctg tgaagctgca ctgagtagta tgttgcagtc ttttggaaat acgagtcttt 7440
taataactgg caaaccgagg aactcttggt attcttgcca cgactcatct ccatgcagtt 7500
ggacgatatc aatgccgtaa tcattgacca gagccaaaac atcctcctta ggttgattac 7560
gaaacacgcc aaccaagtat ttcggagtgc ctgaactatt tttatatgct tttacaagac 7620
ttgaaatttt ccttgcaata accgggtcaa ttgttctctt tctattgggc acacatataa 7680
tacccagcaa gtcagcatcg gaatctagag cacattctgc ggcctctgtg ctctgcaagc 7740
cgcaaacttt caccaatgga ccagaactac ctgtgaaatt aataacagac atactccaag 7800
ctgcctttgt gtgcttaatc acgtatactc acgtgctcaa tagtcaccaa tgccctccct 7860
cttggccctc tccttttctt ttttcgaccg aattaattct taatcggcaa aaaaagaaaa 7920
gctccggatc aagattgtac gtaaggtgac aagctatttt tcaataaaga atatcttcca 7980
ctactgccat ctggcgtcat aactgcaaag tacacatata ttacgatgct gtctattaaa 8040
tgcttcctat attatatata tagtaatgtc gtttatggtg cactctcagt acaatctgct 8100
ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac 8160
gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca 8220
tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcga                        8259
<210>17
<211>1089
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：突变基因
<400>17
atgcttttgc gagctttcct tttcctcttg gctggttttg cagccaaaat atctgcagcg   60
ctagctgatg cagaattccg acatgactca ggatatgaag ttcatcatca aaaattggtg  120
ttctttgcag aagatgtggg ttcaaacaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggcggt  180
gttgtcatag cgacagtgat cgtcatcacc ttggtgatgc tgaagaagaa aggtagatct  240
ggcaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag  300
tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac  360
tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg  420
ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt  480
ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat  540
aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta  600
acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt  660
caaagacagt tgactgtatc gccggaattc ccggggatct gggccccccc gaccgatgtc  720
agcctggggg acgagctcca cttagacggc gaggacgtgg cgatggcgca tgccgacgcg  780
ctagacgatt tcgatctgga catgttgggg gacggggatt ccccggggcc gggatttacc  840
ccccacgact ccgcccccta cggcgctctg gatatggccg acttcgagtt tgagcagatg  900
tttaccgatg cccttggaat tgacgagtac ggtgggggta ctagtggcca gtacacatcc  960
attcatcatg gtgtggtgga ggttgacgcc gctgtcaccc cagaggagcg ccacctgtcc 1020
aagatgcagc agaacggcta cgaaaatcca acctacaagt tctttgagca gatgcagaac 1080
ggcgcctag                                                         1089
<210>18
<211>362
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：突变蛋白质
<400>18
Met Leu Leu Arg Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys
  1            5               10               15
Ile Ser Ala Ala Leu Ala Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
           20               25               30
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser
       35               40               45
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
    50               55               60
Thr Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gly Arg Ser
 65               70               75               80
Gly Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu
              85               90               95
Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu
          100              105              110
Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro
       115              120              125
Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu
   130              135              140
Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile
145              150              155              160
Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu
             165              170              175
Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala
          180              185              190
Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser
       195              200              205
Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu
   210              215              220
Thr Val Ser Pro Glu Phe Pro Gly Ile Trp Ala Pro Pro Thr Asp Val
225              230              235              240
Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala
             245              250              255
His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly
          260              265              270
Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly
       275              280              285
Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala
   290              295              300
Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly Gly Thr Ser Gly Gln Tyr Thr Ser
305              310              315              320
Ile His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu
             325              330              335
Arg His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr
          340              345              350
Lys Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn Gly Ala
       355              360
<210>19
<211>1080
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：突变基因
<400>19
atgcttttgc gagctttcct tttcctcttg gctggttttg cagccaaaat atctgcagcg 60
ctagctgatg cagaattccg acatgactca ggatatgaag ttcatcatca aaaattggtg  120
ttctttgcag aagatgtggg ttcaaacaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggcggt  180
gttgtcatag cgacagtgat cgtcatcacc ttggtgatgc tgaagaagaa acagtacaca  240
tccattcatc atggtgtggt ggaggttgac gccgctgtca ccccagagga gcgccacctg  300
tccaagatgc agcagaacgg ctacgaaaat ccaacctaca agttctttga gcagatgcag  360
aacgcgcggg gtaccccggc gatgaagcta ctgtcttcta tcgaacaagc atgcgatatt  420
tgccgactta aaaagctcaa gtgctccaaa gaaaaaccga agtgcgccaa gtgtctgaag  480
aacaactggg agtgtcgcta ctctcccaaa accaaaaggt ctccgctgac tagggcacat  540
ctgacagaag tggaatcaag gctagaaaga ctggaacagc tatttctact gatttttcct  600
cgagaagacc ttgacatgat tttgaaaatg gattctttac aggatataaa agcattgtta  660
acaggattat ttgtacaaga taatgtgaat aaagatgccg tcacagatag attggcttca  720
gtggagactg atatgcctct aacattgaga cagcatagaa taagtgcgac atcatcatcg  780
gaagagagta gtaacaaagg tcaaagacag ttgactgtat cgccggaatt cccggggatc  840
tgggcccccc cgaccgatgt cagcctgggg gacgagctcc acttagacgg cgaggacgtg  900
gcgatggcgc atgccgacgc gctagacgat ttcgatctgg acatgttggg ggacggggat  960
tccccgggtc cgggatttac cccccacgac tccgccccct acggcgctct ggatatggcc 1020
gacttcgagt ttgagcagat gtttaccgat gcccttggaa ttgacgagta cggtgggtag 1080
<210>20
<211>359
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：突变蛋白质
<400>20
Met Leu Leu Arg Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys
  1            5               10               15
Ile Ser Ala Ala Leu Ala Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
           20               25               30
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser
       35               40               45
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
    50               55               60
Thr Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr
 65               70               75               80
Ser Ile His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu
              85               90               95
Glu Arg His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr
          100              105              110
Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn Ala Arg Gly Thr Pro Ala Met
       115              120              125
Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys
   130              135              140
Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys
145              150              155              160
Asn Ash Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu
             165              170               175
Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu
          180              185              190
Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu
       195              200              205
Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe
   210              215               220
Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser
225              230              235              240
Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala
             245              250               255
Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr
          260              265              270
Val Ser Pro Glu Phe Pro Gly Ile Trp Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser
      275               280              285
Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His
   290              295               300
Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp
305              310              315              320
Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala
             325              330              335
Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Giu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu
          340              345              350
Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly
      355
<210>21
<211>1074
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：突变基因
<400>21
atgagggcct ggatcttctt tctcctttgc ctggccggga gggctctggc agccccgcta   60
gctgatgcag aattccgaca tgactcagga tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc  120
tttgcagaag atgtgggttc aaacaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt  180
gtcatagcga cagtgatcgt catcaccttg gtgatgctga agaagaaaca gtacacatcc  240
attcatcatg gtgtggtgga ggttgacgcc gctgtcaccc cagaggagcg ccacctgtcc  300
aagatgcagc agaacggcta cgaaaatcca acctacaagt tctttgagca gatgcagaac  360
gcgcggggta ccccggcgat gaagctactg tcttctatcg aacaagcatg cgatatttgc  420
cgacttaaaa agctcaagtg ctccaaagaa aaaccgaagt gcgccaagtg tctgaagaac  480
aactgggagt gtcgctactc tcccaaaacc aaaaggtctc cgctgactag ggcacatctg  540
acagaagtgg aatcaaggct agaaagactg gaacagctat ttctactgat ttttcctcga  600
gaagaccttg acatgatttt gaaaatggat tctttacagg atataaaagc attgttaaca  660
ggattatttg tacaagataa tgtgaataaa gatgccgtca cagatagatt ggcttcagtg  720
gagactgata tgcctctaac attgagacag catagaataa gtgcgacatc atcatcggaa  780
gagagtagta acaaaggtca aagacagttg actgtatcgc cggaattccc ggggatctgg  840
gcccccccga ccgatgtcag cctgggggac gagctccact tagacggcga ggacgtggcg  900
atggcgcatg ccgacgcgct agacgatttc gatctggaca tgttggggga cggggattcc  960
ccgggtccgg gatttacccc ccacgactcc gccccctacg gcgctctgga tatggccgac 1020
ttcgagtttg agcagatgtt taccgatgcc cttggaattg acgagtacgg tggg       1074
<210>22
<211>358
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：突变蛋白质
<400>22
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
  1            5               10               15
Ala Ala Pro Leu Ala Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu
           20               25               30
Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn
       35               40               45
Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr
    50               55               60
Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser
 65               70               75               80
Ile His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu
              85               90               95
Arg His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr
          100              105              110
Lys Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn Ala Arg Gly Thr Pro Ala Met Lys
       115              120              125
Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys
   130              135               140
Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn
145              150              155              160
Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr
             165               170              175
Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln
          180              185              190
Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys
       195              200              205
Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val
   210              215              220
Gln Asp Ash Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val
225              230              235               240
Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr
             245               250              255
Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val
          260              265              270
Ser Pro Glu Phe Pro Gly Ile Trp Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu
       275              280              285
Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala
   290              295               300
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser
305              310              315              320
Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu
             325              330              335
Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly
          340              345              350
Ile Asp Glu Tyr Gly Gly
      355
<210>23
<211>95
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>23
gctctagaat gcttttgcaa gctttccttt tccttttggctggttttgca gccaaaatat 60
ctgcagcgct agctgatgca gaattccgac atgac                           95
<210>24
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>24
cgggatccct aggcgccgtt ctgcatctgc tcaaagaac                      39
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>25
actatatcta gaatgctttt gc                                        22
<210>26
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>26
ttcgatagaa gacagtagct tgccagatct acctttcttc ttcagcatca ccaa     54
<210>27
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>27
ttggtgatgc tgaagaagaa aggtagatct ggcaagctac tgtcttctat cgaa      54
<210>28
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>28
atgatgaatg gatgtgtact ggccactagt acccccaccg tactcgtcaa tt        52
<210>29
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>29
aattgacgag tacggtgggg gtactagtgg ccagtacaca tccattcatc at        52
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>30
cgataagctt gatatcgaat tc                                         22
<210>31
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>31
ccatcgattt tctaaccccc accgta                                        26
<210>32
<211>6634
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：重组质粒
<400>32
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg   60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg  120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc  180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt  240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata  300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc  360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc  420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt  480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt  540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca  600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg  660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc  720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg  780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca  840
ctgcttaact ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagaccca agcttctgcc  900
tgccgcctgc ctgcctgcca ctgagggttc ccagcaccat gagggcctgg atcttctttc  960
tcctttgcct ggccgggagg gctctggcag ccccgctagc tgatgcagaa ttccgacatg 1020
actcaggata tgaagttcat catcaaaaat tggtgttctt tgcagaagat gtgggttcaa 1080
acaaaggtgc aatcattgga ctcatggtgg gcggtgttgt catagcgaca gtgatcgtca 1140
tcaccttggt gatgctgaag aagaaaggta gatctggcaa gctactgtct tctatcgaac 1200
aagcatgcga tatttgccga cttaaaaagc tcaagtgctc caaagaaaaa ccgaagtgcg 1260
ccaagtgtct gaagaacaac tgggagtgtc gctactctcc caaaaccaaa aggtctccgc 1320
tgactagggc acatctgaca gaagtggaat caaggctaga aagactggaa cagctatttc 1380
tactgatttt tcctcgagaa gaccttgaca tgattttgaa aatggattct ttacaggata 1440
taaaagcatt gttaacagga ttatttgtac aagataatgt gaataaagat gccgtcacag 1500
atagattggc ttcagtggag actgatatgc ctctaacatt gagacagcat agaataagtg 1560
cgacatcatc atcggaagag agtagtaaca aaggtcaaag acagttgact gtatcgccgg 1620
aattcccggg gatctgggcc cccccgaccg atgtcagcct gggggacgag ctccacttag 1680
acggcgagga cgtggcgatg gcgcatgccg acgcgctaga cgatttcgat ctggacatgt 1740
tgggggacgg ggattccccg gggccgggat ttacccccca cgactccgcc ccctacggcg 1800
ctctggatat ggccgacttc gagtttgagc agatgtttac cgatgccctt ggaattgacg 1860
agtacggtgg gggtactagt ggccagtaca catccattca tcatggtgtg gtggaggttg 1920
acgccgctgt caccccagag gagcgccacc tgtccaagat gcagcagaac ggctacgaaa 1980
atccaaccta caagttcttt gagcagatgc agaacggcgc ctagggatcc cccgggctgc 2040
aggaattcga tatcaagctt atcgataccg tcgaggccgc tcgagcatgc atctagaggg 2100
ccctattcta tagtgtcacc taaatgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc 2160
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 2220
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 2280
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 2340
tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggaacca gctggggctc gaggggggat 2400
ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 2460
accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 2520
gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg gcatcccttt agggttccga 2580
tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt 2640
gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 2700
agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat 2760
ttataaggga ttttggggat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 2820
tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt aaatatttgc ttatacaatc 2880
ttcctgtttt tggggctttt ctgattatca accggggtgg gtaccgagct cgaattctgt 2940
ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccaggcagg cagaagtatg 3000
caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca 3060
ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact 3120
ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta 3180
atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag 3240
tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc ttggatatcc 3300
attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga 3360
ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa 3420
cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt 3480
ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg 3540
ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa 3600
gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 3660
cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 3720
gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 3780
cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg 3840
ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg 3900
acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc 3960
atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt 4020
gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc 4080
gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg 4140
ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg 4200
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ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta 4320
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ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 4860
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 4920
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tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 5040
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc 5100
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ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 5220
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 5280
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tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 5400
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 5460
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ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 5640
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tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 5820
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 5880
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 5940
tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 6000
ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 6060
tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 6120
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 6180
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 6240
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 6300
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 6360
ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 6420
ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 6480
gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 6540
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6600
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc                             6634

Claims (53)

1.检测γ-分泌酶活性的方法，其中
A.使用编码融合蛋白质的转基因，其含有
a)第一种核苷酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，
b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，
c)启动子和，
d)如果适宜，其他编码和/或非编码核苷酸序列；
B.将该转基因掺入到细胞中并且表达融合蛋白质；
C.融和蛋白质在氨基酸序列SEQ ID NO.1内部通过细胞中存在的γ-分泌酶切割，从而形成含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一种部分蛋白质和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二种部分蛋白质，
D.检测所述第一种部分蛋白质和/或第二种部分蛋白质，
所述方法的特征在于除了SEQ ID NO.1外所述融合蛋白质不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点信号的一种或多种肽。
2.检测γ-分泌酶活性的方法，其中
A.使用转基因，其编码融合蛋白质并且含有下面的成分：
a)第一种核苷酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，
b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，
c)启动子和，
d)如果适宜，其他编码和/或非编码核苷酸序列；
B.将该转基因掺入到细胞中并且表达融合蛋白质；
C.融和蛋白质在氨基酸序列SEQ ID NO.1内部通过细胞中存在的γ-分泌酶切割，从而形成含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一种部分蛋白质和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二种部分蛋白质，
D.测定第二种部分蛋白质的量并且从所形成的第二种部分蛋白质的量确定γ-分泌酶的活性，
所述方法的特征在于除了SEQ ID NO.1外所述融合蛋白质不含有作为胞吞或胞吐和/或蛋白酶切割位点信号的一种或多种肽。
3.权利要求1和权利要求2之一要求保护的方法，其中肽基序是胱天蛋白酶切割位点。
4.权利要求1到3之一要求保护的方法，其中第一种核苷酸序列编码淀粉状蛋白前体蛋白(APP)或者其部分，其中所述肽是NPTY和/或VEVD。
5.权利要求1到4之一要求保护的方法，其中第一种核苷酸序列编码从氨基酸序列SEQ ID NO.4衍生的蛋白质。
6.权利要求1到4之一要求保护的方法，其中第二种核苷酸序列编码人APP(SEQ ID NO.5)、SUC2(SEQ ID NO.12)或者BM40(SEQ ID NO.13)的信号肽。
7.权利要求1到6之一要求保护的方法，其中信号肽具有氨基酸序列SEQ ID NO.5。
8.权利要求1到7之一要求保护的方法，其中启动子是用于在哺乳动物细胞、秀丽隐杆线虫、酵母或者果蝇中表达的启动子。
9.权利要求1到8之一要求保护的方法，其中启动子是CMV、HSVTK、RSV、SV40、LTR、unc119、unc54、hsp16-2、G0A1、sel-12、ADH1、GAL1、MET3、MET25、MT、Ac5或者Ds47启动子。
10.权利要求1到9之一要求保护的方法，其中细胞是真核细胞。
11.权利要求1到10之一要求保护的方法，其中细胞是人细胞。
12.权利要求1到10之一要求保护的方法，其中细胞是非人细胞。
13.权利要求12中要求保护的方法，其中细胞是HeLa、293、H4、SH-SY5Y、H9、Cos、CHO、N2A、SL-2或者酵母细胞。
14.权利要求12中要求保护的方法，其中细胞是秀丽隐杆线虫细胞。
15.权利要求13中要求保护的方法，其中细胞是转基因秀丽隐杆线虫的成分。
16.权利要求13中要求保护的方法，其中细胞是酿酒酵母细胞。
17.权利要求1到16一项或多项中要求保护的方法，其中融合蛋白质含有氨基酸序列SEQ ID NO.6。
18.权利要求1到17一项或多项中要求保护的方法，其中其他编码核苷酸序列位于第一种核苷酸序列的3’末端。
19.权利要求1到18一项或多项中要求保护的方法，其中其他编码核苷酸序列编码表达为与第一种部分蛋白质和第二种部分蛋白质的融合蛋白质并且可以用于检测第二种部分蛋白质的蛋白质。
20.权利要求1到19一项或多项中要求保护的方法，其中其他编码核苷酸序列编码含有DNA结合结构域和转录激活结构域的蛋白质。
21.权利要求1到20一项或多项中要求保护的方法，其中其他编码核苷酸序列编码由GAL4-结合结构域和VP16(GAL4-VP16)的转录激活结构域组成的蛋白质。
22.权利要求1到21一项或多项中要求保护的方法，其中细胞用报道质粒共转染，其中所述报道质粒含有处于可调节启动子控制下的报道子基因。
23.权利要求22中要求保护的方法，其中可调节启动子可通过转录激活结构域激活。
24.权利要求23中要求保护的方法，其中报道质粒编码EGFP(增强的绿色荧光蛋白质)、Ura 3、His 3或Lac Z的报道子基因并且可调节启动子含有GAL4结合位点和HIV的最小启动子。
25.权利要求1到24一项或多项中要求保护的方法，其中转基因含有编码SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20或SEQ ID NO.22的核苷酸序列。
26.权利要求1到25一项或多项中要求保护的方法，其中转基因存在于载体中。
27.权利要求1到26一项或多项中要求保护的方法，其中重组载体是pcDNA 3.1+。
28.权利要求1到27一项或多项中要求保护的方法，其中在细胞中未检测到内源γ-分泌酶活性。
29.权利要求1到28一项或多项中要求保护的方法，其中使用cDNA文库共转染细胞。
30.权利要求29中要求保护的方法，其中cDNA文库中存在从人或者非人组织或者人或者非人细胞制备的cDNA。
31.权利要求28到30一项或多项中要求保护的方法的用途，用于鉴定编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA，其中
a)鉴定其中可以检测到γ-分泌酶活性的细胞和
b)从该细胞分离编码γ-分泌酶的cDNA。
32.转基因，其含有
a)第一种核酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，
b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，
c)启动子和，
d)第一种核苷酸序列的3’末端的至少一种其他核苷酸序列，其编码DNA结合结构域和转录激活结构域。
33.权利要求32中要求保护的转基因，其中第一种核苷酸序列编码APP或者APP的部分。
34.权利要求32到33一项或多项中要求保护的转基因，其中转基因具有编码SEQ ID NO.14的核苷酸序列。
35.载体，其含有权利要求32到34一项或多项中要求保护的转基因。
36.权利要求35中要求保护的载体，其中载体是载体pDBTrp或pcDNA 3.1+。
37.产生转基因细胞的方法，其中用权利要求35到36一项或多项中要求保护的载体转染细胞。
38.产生转基因秀丽隐杆线虫的方法，其中将权利要求31到33一项或多项中要求保护的转基因微注射到秀丽隐杆线虫的生殖腺。
39.细胞，其含有权利要求32到34一项或多项中要求保护的转基因。
40.转基因秀丽隐杆线虫，其含有权利要求32到34一项或多项中要求保护的转基因。
41.酵母细胞，其含有权利要求32到34一项或多项中要求保护的转基因。
42.细胞，其含有
a)权利要求32到34一项或多项中要求保护的转基因；
b)cDNA文库，和
c)报道质粒。
43.权利要求42中要求保护的细胞的用途，用于鉴定cDNA，所述cDNA编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶。
44.鉴定编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA的方法，其中
1)产生权利要求42中要求保护的细胞和
2)确定是否形成第二种部分蛋白质。
45.权利要求42中要求保护的细胞的用途，用于鉴定γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的抑制剂的方法中。
46.鉴定抑制γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性的物质的方法，其中该方法包括下面的方法步骤：
A.产生转基因非人生物体或者转基因细胞，其中转基因非人生物体或者转基因细胞含有转基因，该转基因含有下面的成分：
a)第一种核酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，
b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，
c)启动子和，
d)如果适宜，其他编码和/或非编码核苷酸序列；
转基因非人生物体或者转基因细胞还含有报道质粒，其携带蛋白质结合位点、最小启动子和报道子基因和，如果适宜，编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA，其中
转基因非人生物体或者转基因细胞表达转基因和，如果适宜，所述cDNA编码的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶；
B.将转基因非人生物体或者转基因细胞与待研究的物质孵育和
C.测定第二种部分蛋白质的量。
47.鉴定抑制γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性的物质的方法，其中
A.使用转基因，其含有下面的成分：
a)第一种核酸序列，其编码含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质，
b)处于第一种核苷酸序列的5’末端的第二种核苷酸序列，其编码信号肽，
c)启动子和，
d)如果适宜，其他编码和/或非编码核苷酸序列；
B.该转基因和报道质粒和，如果适宜，编码γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的cDNA掺入到细胞并且在待研究的物质存在下表达所述转基因编码的融合蛋白质和，如果适宜，所述cDNA编码的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶，
C.融合蛋白质
a)经切割，结果形成含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ IDNO.2)的第一种部分蛋白质和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二种部分蛋白质，或者
b)不经细胞中存在的γ-分泌酶切割，结果形成不可检测量的第一和/或第二种部分蛋白质。
D.测定第二种部分蛋白质的量。
48.鉴定抑制γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性的物质的方法，其中在待研究的物质存在下表达编码含有信号肽和SEQ ID NO.1的融合蛋白质的转基因并确定待研究的物质对所形成的第二种部分蛋白质的量的影响，所述第二种部分蛋白质含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)。
49.γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的抑制剂，其通过权利要求46-48之一中要求保护的方法鉴定。
50.药物组合物，其含有药学活性化合物，所述药学活性化合物抑制权利要求46-48之一中要求保护的方法中的γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性。
51.制备药物组合物的方法，其包括权利要求46-48之一中要求保护的方法和配制所鉴定的药学活性化合物。
52.制备药物的方法，其包括
a)权利要求46-48中一项或多项要求保护的方法和b)将所鉴定的药学活性化合物与药学惰性有机和/或无机赋形剂混合。
53.测试试剂盒，其用于检测γ-分泌酶、γ-分泌酶的亚单位蛋白质或者γ-分泌酶样蛋白酶的活性，所述试剂盒含有根据前面权利要求任一项的转基因、载体或者细胞。
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