ES2306755T3 - Modelo de tauopatia. - Google Patents

Abstract

Levadura microbiana manipulada, que comprende una secuencia de nucleótidos introducida o una variante alélica, un minigén, un gen sintético o un homólogo de los mismos que codifican para tau.

Description

Modelo de tauopatía.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un modelo de levadura para la tauopatía como en la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas. Este modelo de levadura manipulada se puede utilizar en el cribado ("screening") farmacéutico y para el modelado de enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal con Parkinsonismo) y para el modelado in vivo de la bioquímica de la proteína tau. Se puede utilizar como un ensayo, ensayo automatizado o ensayo de cribado con alto rendimiento para identificar agentes, compuestos o señales químicas que directa o indirectamente afectan a la bioquímica de tau (proteína tau o tau-proteína) y, en particular, de la fosforilación de la proteína tau, que comprende las etapas de: crecimiento de la línea de células de levadura en un medio apropiado, comprendiendo dicha célula de levadura un polinucleótido o secuencia de ADN introducida, una variante alélica, minigén o un homólogo del mismo, que codifica para la proteína tau, isoformas de la proteína tau u homólogos funcionales de las mismas y expresa o sobreexpresa la proteína tau u homólogos funcionales de la misma y en el que dicha célula de levadura comprende una proteína quinasa que es capaz de modular directa o indirectamente la proteína tau, la adición del compuesto o señal química de ensayo al medio; y la medición del grado en que la proteína tau u homólogos funcionales de la misma son fosforilados.

La enfermedad de Alzheimer, una enfermedad neurodegenerativa a la que está dirigida el ensayo de cribado de la presente invención, es la forma más común de demencia senil, afectando aproximadamente al 5% de individuos por encima de la edad de 65 y un 20% de aquellos que están por debajo de los 80. Se ha estimado que existen entre 2,5 y 3 millones de pacientes que padecen de la enfermedad de Alzheimer en los Estados Unidos y hasta 6 millones en Europa. Estas cifras aumentarán exponencialmente durante las próximas décadas, ya que la proporciona de personas de la tercera edad en la población aumenta exponencialmente y debido a que la incidencia de la enfermedad de Alzheimer por sí misma aumenta exponencialmente con la edad.

Hasta ahora, no existen ni procedimientos precisos para un diagnóstico precoz, ni ningún procedimiento o fármaco para el tratamiento eficaz de la enfermedad de Alzheimer. El desarrollo para el mercado de una intervención terapéutica para esta enfermedad humana principal representa por tanto una oportunidad comercial significativa.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurodegenerativo caracterizado histopatológicamente por la pérdida de sinapsis en grupos particulares de neuronas y finalmente en una fase clínica posterior, por la pérdida de estas mismas neuronas. La patología post-mortem revela la abundante presencia de dos lesiones principales en el cerebro, denominadas placas seniles y ovillos neurofibrilares (Delacourte, 1999).

El mecanismo que provoca la pérdida sináptica y neuronal aún no es comprensible. Diversas mutaciones diferentes en el gen que codifica para la proteína precursora del amiloide (APP) en algunas familias con enfermedad de Alzheimer familiar de inicio temprano (EOFAD) apoya una hipótesis de "primer amiloide" en que la deposición extracelular de péptidos amiloides derivados de APP es un suceso patogénico temprano (para revisiones, véase Ardí et al., 1998; Selkoe, 2000). En la mayoría de otras familias con EOFAD, la enfermedad está causada por mutaciones en el gen que codifica para Presenilina-1 (PS1), mientras que en algunas familias raras los miembros afectados portan un gen de Presenilina-2 mutante. El aumento del metabolismo de APP amiloidogénico y de la deposición de amiloides se consideran como un suceso patogénico primario, lo cual, sin embargo, no implica que se alcance un consenso general en el efecto patogénico primario de dicha deposición de péptidos amiloides en el cerebro y cómo dicha deposición daría lugar a la neurodegeneración y demencia.

Las placas seniles son depósitos fibrilares extracelulares de péptidos amiloides, rodeados de neuritas distróficas, que contienen agregados de tau. Los depósitos de amiloides se encuentran en el parenquimo cerebral, pero también de manera prominente en las paredes vasculares de los vasos sanguíneos cerebrales más profundos en todos los casos de enfermedad de Alzheimer, ya sea de inicio temprano o inicio tardío o casos esporádicos. Los depósitos de amiloides en placas seniles y en vasos sanguíneos cerebrales contienen péptidos amiloides de 40 y 42 aminoácidos de longitud. Estos se derivan mediante división proteolítica de la proteína precursora de amiloides (APP) más grande, una glicoproteína anclada a la membrana, 100 a 110 kDa de tamaño.

Por otro lado, los ovillos neurofibrilares (NFT) son inclusiones intraneuronales de filamentos helicoidales apareados (PHF) que en sí mismos son agregados de proteína tau, una proteína asociada a los microtúbulos. La proteína tau se refiere a un grupo de hasta 6 isoformas de esta fosfoproteína citosólica (aproximadamente 60-70 kDa)Se cree que la hiperfosforilación de tau representa la causa principal de su agregación en los PHF y todas las posteriores disfunciones en términos de estabilidad citoesquelética y sináptica, crecimiento neurítico y transporte axonal. Se considera que las neuronas que contienen ovillos neurofibrilares están fuertemente implicadas y no son capaces de funcionar normalmente. La muerte neuronal de dichas células es evidente a partir de la presencia de ovillos "fantasma" en el cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer, es decir, residuos de neuronas portadoras de ovillos muertas de las que esencialmente sólo los ovillos neurofibrilares insolubles han permanecido.

Las dianas de la enfermedad de Alzheimer se estudian actualmente mediante modelos de ratones transgénicos para la enfermedad de Alzheimer (para revisiones, véase Van Leuven 2000; Dewachter et al., 2000). Estos modelos se centran en APP y PS1, ya que las mutaciones en APP y PS1 provocan EOFAD y ya que los pacientes son síndrome de Down (trisomía 21 donde se localiza el gen de APP) desarrollan la patología de la enfermedad de Alzheimer en su segunda o tercera década, debido a la sobreexpresión de APP por el efecto dosificador del gen. Los ratones transgénicos únicos o dobles, es decir, ratones transgénicos de APP y APP x PS1 en los que los transgenes contienen una o más mutaciones clínicas de EOFAD, muestran un fenotipo de patología amiloide prominente y robusto. Esto recapitula la patología amiloide de pacientes con AD casi exactamente en los términos de depósitos de amiloides en el parenquimo y en los vasos sanguíneos cerebrales (Van Dorpe et al., 2000; Dewachter et al., 2000). De manera significativa, y muy destacada, aunque se observa la hiperfosforilación de tau en las neuritas hinchadas que rodean las placas neuríticas en estos ratones, no se han formado ovillos neurofibrilares en el cerebro de estos ratones transgénicos portadores de amiloides (Van Dorpe et al., 2000).

Es materia de un intenso debate si los déficits cognitivos demostrados en los ratones transgénicos de APP y APP x PS1 son relevantes para los déficits cognitivos en los pacientes humanos de Alzheimer. En el cerebro de los pacientes, el declive cognitivo se correlaciona mucho mejor con la presencia y sitios de neuritas distróficas que contienen PHF y ovillos neurofibrilares que con la deposición de placas amiloides. Una hipótesis popular sostiene que aunque un suceso patogénico primario debe implicar un metabolismo de APP aberrante, el mecanismo por el cual la neurona degenera es esencialmente una disfunción o interrupción del citoesqueleto neuronal. Esto perjudica al transporte axonal, y quizás también al transporte dendrítico, y es debido a la hiperfosforilación de tau que finalmente da lugar a su deposición como PHF.

Por otro lado, se han generado ratones transgénicos que sobreexpresan la proteína tau humana, natural o un mutante clínico, que ocasionan otro tipo de demencia, es decir, la demencia frontotemporal con Parkinsonimo unido al cromosoma 17 (FTDP-17) (para revisión, véase Heurink, 2000).

Aunque estos ratones transgénicos con mau no desarrollan un fenotipo relacionado con el Alzheimer, demuestran la interferencia masiva y patológica de la tau humana con transporte axonal, provocando el "hinchamiento" de los axones, la degeneración axonal y como fenómeno secundario, la pérdida muscular y problemas motrices (Spittaels et al., 1999, 2000). Este fenotipo es recuperado, de manera más sorprendente, por GSK-3\beta en ratones transgénicos dobles, en que de manera próxima a la tau humana, también se expresa GSK-3\beta (Spittaels et al., 2000). En el ratón transgénico doble, el mayor nivel de hiperfosforilación de proteína tau se correlaciona con un descenso del hinchamiento, alivio de la axonopatía y de los problemas motrices y musculares (Spittaels et al., 2000). Esto indica claramente una dualidad en el papel de GSK-3\beta y otras quinasas que eventualmente (u obligatoriamente) están implicadas en el mecanismo de señalización "upstream" o "downstream" de GSK-3\beta. Estos hallazgos complican evidentemente cualquier esquema existente en el que se sugiere o apoya la hiperfosforilación de tau de ser la causa directa del problema axonal. En este sentido, los ratones transgénicos tau o GSK-3\beta no son adecuados como modelos para elucidar los mecanismos moleculares por los que se "desencadena" y "ejecuta" la patología de tau. Dichos mecanismos deben y pueden estudiarse en paradigmas celulares, preferiblemente tan simples como sea posible, con el fin de definir las características esenciales y fundamentales de los mecanismos de señalización y sus implicaciones fenotípicas. La presente invención describe dicho paradigma celular que, aparte de la facilidad de manipulación, tanto genética como epigenéticamente en términos de parámetros medioambientales y del medio, proporciona un sistema sencillo que además es un plus esencial para los fines de cribado de alto rendimiento.

Descripción resumida de la invención

La presente invención describe células de levadura manipuladas que son modelos para aspectos de la enfermedad de alzheimer y para otra enfermedad neurodegenerativa, tal como la demencia frontotemporal con Parkinsonismo, en la que dichas células de levadura manipuladas expresan una isoforma de la proteína tau natural o mutante humana mediante la introducción de una secuencia de ADN que codifica una de estas isoformas. Un aspecto adicional de la presente invención es que las células de levadura manipuladas expresan una isoforma de la proteína tau natural o mutante humana mediante la introducción de una secuencia de ADN que codifica una de estas isoformas y también son capaces de expresar una tau-quinasa que es un modulador directo o indirecto del estado de fosforilación de la isoforma de la proteína tau expresada en la misma célula. En un aspecto adicional de la presente invención, dichas células de levadura manipuladas contienen secuencias de ADN introducidas que codifican y son capaces de expresar dicha proteína tau y dicha proteína tau-quinasa que son capaces, directa o indirectamente, de modular el estado de fosforilación de la proteína tau. En aún otro aspecto de la presente invención, dichas células de levadura manipuladas contienen una secuencia de ADN introducida que comprende una secuencia de control, correctamente integrada para permitir la expresión de la proteína tau humana, la isoforma de la proteína tau u homólogos funcionales de las mismas y también comprende una secuencia de ADN que codifica y es capaz de expresar una proteína tau quinasa u otra quinasa capaces de la modulación directa o indirecta del estado de fosforilación de la proteína
tau.

La secuencia de ADN de la presente invención que codifica y es capaz de expresar una proteína quinasa que es capaz, directa o indirectamente, de modular el sitio de fosforilación de la proteína tau, puede ser endógena, pero puede también introducirse para establecer o provocar una mayor producción de la quinasa elegida, tal como subunidades "cofactorizadas" o de acceso o activadores o moduladores.

La presente invención incluye también la progenie y todas las posteriores generaciones de las células en las se introdujeron dicha secuencia o secuencias de ADN.

Las células de levadura manipuladas de la presente invención se utilizan como modelo de levadura para un modelo de levadura para la tauopatía como en la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos. Este modelo de levadura manipulada se puede utilizar en el cribado farmacéutico y para el modelado de enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal con Parkinsonismo) y para el modelado in vivo de la bioquímica de la proteína tau. Se puede utilizar como un ensayo, ensayo automatizado o ensayo de cribado con alto rendimiento para identificar agentes, compuestos o señales químicas que directa o indirectamente afectan a la bioquímica de tau (proteína tau o tau-proteína) y, en particular, de la fosforilación de la proteína tau, que comprende las etapas de: crecimiento de la línea de células de levadura en un medio apropiado, comprendiendo dicha célula de levadura un polinucleótido o secuencia de ADN introducida, una variante alélica, minigén o un homólogo del mismo, que codifica para la proteína tau, isoformas de la proteína tau u homólogos funcionales de las mismas y expresa o sobreexpresa la proteína tau u homólogos funcionales de la misma y en el que dicha célula de levadura comprende una proteína quinasa que es capaz de modular directa o indirectamente la proteína tau, la adición del compuesto o señal química de
ensayo al medio; y la medición del grado en que la proteína tau u homólogos funcionales de la misma son fosforilados.

Realizaciones ilustrativas de la invención

La presente invención se basa en la noción de que el modelado de todos los aspectos neurodegenerativos de la enfermedad de Alzheimer es el requisito más importante y esencial.

Breve descripción de las figuras

Figura 1

Expresión heteróloga de la proteína tau en S. cerevisiae natural. Análisis de transferencia Western de los extractos celulares crudos de diferentes cepas naturales y cepas isogénicas con eliminaciones mds1 utilizando el anticuerpos Tau-5 para detectar la expresión de tau natural humana o tau P301L humana (panel A) y las proteínas de fusión GFP-tau natural o GFP-tau P301L (panel B). La expresión de las fusiones con GFP se analizaron posteriormente mediante microscopía de fluorescencia (panel B).

Figura 2

Mapeo de fosforilación. El ensayo del mapa de fosforilación se realizó en extractos crudos derivados de la cepa natural, la cepa isogénica con eliminación mds1 y la cepa isogénica con eliminación pho85 que expresan tau natural humana o tau P301L humana. Parte A: cepas de la base genética W303-1A. Parte B: cepas de la base genética BY4741.

Se utilizaron diferentes anticuerpos tal como se indica: Tau-5 como anticuerpo "pan"-tau independiente de la fosforilación para visualizar la cantidad total de proteína tau transferida, AT-8 y AD2 como anticuerpos que reconocen diferentes epítopos de tau fosforilados, y tau-1 como anticuerpo que reconoce epítopos de tau no fosforilados.

Figura 3

Efecto de la sobreexpresión de PP2A en la fosforilación de tau. Análisis de transferencia Western de la cepa natural W303-1A o la misma cepa que sobreexpresa la proteína fosfatasa Pph21. Se realizó la inmunodetección utilizando el anticuerpo Tau-5 independiente de la fosforilación o el anticuerpo que reconoce epítopos de Tau-1 no fosforilados tal como se ha indicado.

Figura 4

Análisis de complementación de GSK3. La GSK3-beta humana se expresó en una cepa de levadura con eliminación mds1 para demostrar la complementación funcional para la fosforilación de tau. La fosforilación de tau natural y tau P301L se controló en la cepa natural W303-1A, la cepa con eliminación mds1 y la cepa con eliminación mds1 que expresa GSK3-beta humana. El análisis de transferencia Western se realizó sobre extractos de células crudas utilizando el anticuerpo AD2 cuya inmunorreactividad depende de la fosforilación de los epítopos Ser-396 y Ser-404. La inmunodetección con Tau-5 sirvió como control.

Figura 5

Validación del modelo de levadura para estudiar las cascadas de transducción de señal con la fosforilación de tau como marcador. La fosforilación de las proteínas heterólogas humanas expresadas, tau natural y tau P301L, se controló en diferentes cepas deficientes de quinasas que previamente se demostró que operaban en cascadas de transducción de señales interconectadas en S. Cerevisiae. Los paneles superiores muestran el mapeo de la fosforilación en la cepa W303-1A con eliminación sch9, los paneles centrales para la cepa W303-1A con eliminación yak1 y los paneles inferiores para la cepa con eliminación de las diferentes subunidades Tpk de PKA. Las correspondientes actividades quinasa homólogas humanas se indican entre paréntesis. La inmunodetección se realizó utilizando los anticuerpos AD2, Tau-5 y Tau-1.

Figura 6

Efecto de la expresión heteróloga de la proteína tau humana en procesos fisiológicos en levadura. Panel A: El efecto en la expresión de tau en la diferenciación de pseudohifal tras la limitación de nitrógeno se controló en la cepa \Sigma1278. Como control para la diferenciación pseudohifal completa, en el dibujo de la izquierda se incluye la cepa transformada con el plásmido vacío. El efecto inhibidor de la expresión de tau-P301L o la expresión de tau natural se visualizan respectivamente en el dibujo central y de la derecha, respectivamente. Paneles B y C: Efecto de la expresión de tau natural y tau P301L en la sensibilidad al benomilo de la cepa natural BY4741 (panel B), la cepa isogénica con eliminación mds1 (panel B) y la cepa isogénica con eliminaciones pho85 (B y C). El panel B muestra las curvas de crecimiento (DO 600 nm) en cultivos líquidos en presencia de 40 microgramos de benomilo tal como se mide con la terminal de trabajo BIOSCREEN C. El Panel C muestra la placa de ensayo para el crecimiento de diluciones en serie de las cepas con eliminación pho85 transformadas con, de izquierda a derecha, el plásmido vacío, tau-P301L o tau natural. Las concentraciones finales de benomilo en las placas son las que se indican.

Figura 7

Ensayo de solubilidad de la proteína heteróloga humana expresada tau en S. Cerevisiae. Los extractos de proteína obtenidos secuencialmente de la cepa BY4741 natural y la cepa isogénica con eliminación mds1 que expresan tau natural o la cepa con eliminación pho85 que expresa tau natural o tau P3041L, tal como se indica, se analizaron mediante análisis de transferencia Western utilizando el anticuerpo Tau-5. Se indican las bandas y contienen muestras del sobrenadante o el gránulo obtenido de la posterior extracción en tampón de reensamblaje con alto contenido en sal (RAB), tampón de ensayo de inmunoprecipitación (RIPA) que contiene detergente o ácido fórmico al 70% (FA).

\vskip1.000000\baselineskip

Terminología y definiciones

Para los objetivos de la presente invención, se definen a continuación los siguientes términos.

El término "líneas celulares" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a líneas celulares eucariotas preferiblemente en forma de una línea celular que es adecuada para el cultivo continuo, ya sea en suspensión o unido a un portador adecuado y es una célula recombinante que puede obtenerse mediante manipulación de células utilizando técnicas convencionales de tecnología de ADN recombinante.

El término "célula de levadura" se utiliza en la presente invención para mencionar hongos unicelulares de la phylum Ascomycota que se reproducen por fisión o germinación y son capaces de fermentar carbohidratos en alcohol y dióxido de carbono. Las células de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae son preferidas para la manipulación para incorporar secuencias de ADN según la presente invención. Dichas células no expresan normalmente una proteína tau, pero son capaces de expresar la proteína tau humana mediante la introducción de una secuencia de ADN que codifica tau humana bajo el control de secuencias de ADN reguladoras apropiadas. La secuencia de ADN resultante se considera una secuencia de ADN "recombinante" o un "transgén".

El término "levadura manipulada" se utiliza en la presente invención para mencionar células de levadura que tienen un transgén o una secuencia de ácidos nucleicos no endógena (es decir, heteróloga) presentes como elemento extracromosómico que se integran de manera estable en el ADN de su línea germinal (es decir, en el ADN genómico). El ácido nucleico heterólogo se introduce en la línea germinal de dicha levadura manipulada mediante manipulación genética.

El término "secuencia de ADN introducida" se utiliza en la presente invención para indicar una secuencia de ADN que ha sido introducida en una célula y que puede ser o no incorporada al genoma. La secuencia de ADN puede ser una secuencia que no es endógena al tipo de célula escogido, que es endógena pero no se expresa normalmente por la célula o que es endógena y se expresa normalmente pero de la cual se desea la sobreexpresión. La secuencia de ADN se puede introducir mediante cualquier técnica de transfección adecuada incluyendo electroporación, precipitación con fosfato cálcico, lipofección u otras conocidas por los expertos en la materia. La secuencia puede haberse introducido directamente en la célula o puede haberse introducido en una generación más temprana de la célula.

El término "transgén" significa cualquier trozo de ADN que se puede insertar en una célula y preferiblemente forma parte del genoma del organismo resultante (es decir, integrado de manera estable o como elemento extracromosómico estable). Dicho transgén incluye genes que son parcial o completamente heterólogos (es decir, exógenos), así como genes homólogos a genes endógenos del organismo. Incluido en esta definición está un transgén creado mediante la disposición de una secuencia de ARN que se transcribe de manera inversa en ADN y, a continuación, se incorpora en el genoma, o un agente o molécula antisentido.

Los términos "tau", "proteína tau" o "tau-proteína" se refieren a un (poli)péptido o proteína específica asociada con el ensamblaje, estabilidad o mejora de la polimerización de microtúbulos. La proteína tau existe en hasta 6 isoformas diferentes en el cerebro adulto, mientras que sólo 1 isoforma se expresa en cerebro fetal, pero todas se generan a partir de un único gen en el cromosoma 17 humano mediante ayuste ("splicing") alternativo de ARNm. La característica más sorprendente de la proteína tau, tal como se deduce de la clonación molecular, es un tramo de 31 ó 32 aminoácidos, que aparecen en la parte del extremo carboxi de la molécula, que se puede repetir 3 ó 4 veces. Se genera una diversidad adicional mediante 29 ó 58 inserciones largas de aminoácidos en la parte N-terminal de las moléculas tau (Billingsley y Kincaid, 1997).

En circunstancias normales, la proteína tau impulsa el ensamblaje de los microtúbulos y la estabilidad en el compartimento axonal de neuronas. EL dominio de unión a los microtúbulos en la proteína tau se localiza en la región de repetición de tau (255-381) y está modulada por regiones adyacentes: la cola carboxi terminal (382-414) y la región rica en prolina (143-254). La estabilidad y agrupamiento de los microtúbulos están mediados por una cremallera hidrofóbica corta en la cola carboxi terminal de tau. Tanto el ensamblaje como la estabilidad están regulados por el corte y empalme alternativo de ARNm y la fosforilación.

En un cerebro adulto normal, la proteína tau contiene de 2 a 3 moles de fosfato por mol de proteína tau, mientras que la fosforilación de sitios diferentes en tau normal sigue diferentes perfiles de desarrollo (Brion, 1998). Las variantes de proteína tau anormales de 60, 64 y 68 kDa se han detectado exclusivamente en áreas del cerebro que muestran cambios neurofibrilares y placas seniles (Delacourte et al., 1999). El comportamiento electroforético anormal de tau es debido a la fosforilación, ya que los sitios de fosfatasa alcalina se han detectado en PHF-tau en las posiciones 46, 231, 235, 263 y 396. En cuatro de estos sitios, el residuo fosforilado va seguido de un residuo de prolina, indicando que una quinasa dirigida a prolina está implicada en algunas de las fosforilaciones anormales de tau. Además de estos sitios, hay presentes otros diez en htau40, dos de los cuales también están fosforilados de forma anormal tal como se indica mediante la reactividad del anticuerpo.

La detección de PHF-tau en extractos de cerebro es a través de anticuerpos o a través de cambios en el peso molecular o la movilidad electroforética. La fosforilación anormal de tau en la enfermedad de Alzheimer es debido a un deslazamiento en el equilibrio fosfatasa/quinasa. Varias quinasas in vitro pueden fosforilar tau: quinasas cdc2 y cdk5, quinasas MAP, glicógeno sintasa quinasas (GSK3), entre otras. Las fosfatasas están en general menos estudiadas en el cerebro y apenas en la enfermedad de Alzheimer y sólo se ha observado que la fosfatasa 2A sea capaz in vitro de desfosforilar los sitios de tau fosforilados de forma anormal.

El término "gen de tau" significa un gen de tau, una variante alélica, un minigén, un homólogo de los mismos o un gen, que codifican para htau40, para la proteína tau, un isómero de tau u homólogos funcionales de los mismos o por los menos una parte de los mismos.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "minigén" se refiere a una construcción génica heteróloga en al que uno o más segmentos no esenciales de un gen son eliminados con respecto al gen natural. Habitualmente, los segmentos eliminados son secuencias intrónicas de por lo menos aproximadamente 100 pares de bases hasta varias kilobases, y pueden abarcar varias decenas de kilobases o más. El aislamiento y manipulación de grandes construcciones de reconocimiento (es decir, mayores a aproximadamente 50 kilobases) es frecuentemente difícil y puede reducir la eficacia de la transferencia de la construcción de reconocimiento a una célula huésped. De este modo, frecuentemente es deseable reducir el tamaño de una construcción de reconocimiento mediante la eliminación de una o más partes no esenciales del gen. Habitualmente, pueden eliminarse las secuencias intrónicas que no comprenden elementos reguladores esenciales. Frecuentemente, Si los sitios de restricción adecuados están unidos a una secuencia intrónica no esencial de una secuencia génica clonada, se puede producir una eliminación de la secuencia intrónica mediante: (1) digestión del ADN clonado con las enzimas de restricción apropiadas, (2) separación de los fragmentos de restricción (por ejemplo, mediante electroforesis), (3) aislamiento de los fragmentos de restricción que comprenden los exones esenciales y elementos reguladores, y (4) unión de los fragmentos de restricción aislados para formar un minigén en el que los exones están en el mismo orden lineal que están presentes en la copia de la línea germinal del gen natural. Procedimientos alternativos para producir un minigén serán evidentes para los expertos en la materia (por ejemplo, unión de clones genómicos parciales, que comprenden exones esenciales pero que carecen de partes de la secuencia intrónica). Más habitualmente, los segmentos génicos que comprenden un minigén se dispondrán en el mismo orden lineal que están presentes en el gen de la línea germinal, aunque sin embargo, éste no siempre será el caso. Algunos elementos reguladores deseados (por ejemplo, potenciadores, silenciadores) pueden ser relativamente insensibles a la posición, de manera que el elemento regulador actuará correctamente incluso si está situado de manera diferente en un minigén que en el correspondiente gen de la línea germinal. Por ejemplo, un potenciador se puede localizar a una distancia diferente de un promotor, en una orientación diferente, y/o en un orden lineal diferente. Por ejemplo, un potenciador que está situado en 3' respecto al promotor en la configuración de la línea germinal podría estar situado en 5' con respecto al promotor en un minigén. De manera similar, algunos genes pueden tener exones, que están cortados y empalmados alternativamente, a nivel de ARN, y, de este modo, un minigén puede tener menos exones y/o exones en un orden lineal diferente que el correspondiente gen de la línea germinal y todavía codificar un producto génico funcional. Un ADNc que codifica un producto génico también se puede utilizar para construir un minigén. Sin embargo, dado que es frecuentemente deseable que el minigén heterólogo se exprese de manera similar al gen afín natural no humano, la transcripción de un minigén de ADNc está impulsada por un promotor del gen unido y un potenciador del gen natural. Frecuentemente, dicho minigén puede comprender una secuencia reguladora transcripcional (por ejemplo, un promotor y/o potenciador) que confiere una transcripción específica de neurona o transcripción específica de SNC de las secuencias codificantes de la alfa-sinucleína del minigén.

El término "agente" tal como se utiliza en la presente invención indica un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto fabricado a partir de material biológico tal como bacterias, plantas, hongos o células o tejidos animales (particularmente mamíferos).

Tal como se utiliza en la presente invención, "isoforma tau", "isoforma de la proteína tau" se refieren a un (poli)péptido o proteína que es codificada por lo menos un exón del gen de tau.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a líneas celulares de levadura manipuladas que expresan la proteína tau, preferiblemente la proteína tau humana, o isómeros funcionales u homólogos de la misma, a las proteínas producidas mediante estas líneas celulares, al patrón de fosforilación de tau en estas líneas celulares y a sus aplicaciones y, además, describe un procedimiento para cribar fármacos para la terapia de enfermedades neurodegenerativas o más particularmente de la demencia del tipo Alzheimer o de la demencia frontotemporal con Parkinsonismo y para el diagnóstico de esta demencia mediante fármacos que se unen específicamente a dichas proteínas tau o que afectan a la fosforilación de las proteínas tau. De este modo, proporciona la solución para una necesidad deseada desde hace tiempo. De estas demencias con aparición en la edad adulta, la enfermedad de Alzheimer (AD) es la forma más común. En la actualidad, no hay disponible una prueba bioquímica fiable para el diagnóstico antemortem de la AD. La enfermedad por lo tanto se diagnostica clínicamente en base a la exclusión de otras formas de demencia. El diagnóstico se puede confirmar neuropatológicamente mediante la demostración de grandes cantidades de placas neuríticas (seniles) y ovillos neurofibrilares (NFT) en regiones concretas del cerebro, es decir, el hipocampo, subiculum y córtex
entorrinal.

Los ovillos neurofibrilares consisten en filamentos helicoidales apareados (PHF) y la proteína tau asociada a microtúbulos es el componente proteína principal de los PHF y de este modo de NFT (Brion., 1998; Delacourte, 1999). El dominio de unión a los microtúbulos de tau está estrechamente asociado con el núcleo de PHF, mientras que los péptidos tau pueden representar sólo una pequeña parte del componente principal de PHF.

Además, las nuevas líneas celulares de levaduras manipuladas de la presente invención se caracterizan en que producen específicamente tau natural anormalmente fosforilada de la cual el estado de fosforilación está confinado a una región específica particular de las moléculas tau, o tau recombinante no fosforilada que mediante el tratamiento con quinasas dirigidas a prolina pueden provocar la fosforilación de, entre otros, sitios Ser-Pro o Thr-Pro tal como se especifica. Las quinasas dirigidas a prolina tales como MAP quinasas, cdc2 quinasas, glicógeno sintasa quinasas y cdk5 quinasas se pueden purificar a partir de varias fuentes, tales como cepas de levadura manipuladas genéticamente o se pueden presentar en extractos de cerebro. La fosforilación de tau mediante estas quinasas es nula o ha disminuido ampliamente cuando una o más de las siguientes serinas/treoninas han mutado a un aminoácido tal como Ala: T153, T175, T181, S199, S202, T205, T212, T217, T231, S235 (Billingsley y Kincaid, 1997).

Consecuentemente, la relación estructura-función de dichas proteínas tau mutantes fosforiladas se puede caracterizar y dichas líneas celulares de levadura se utilizarán para definir in vivo el efecto sobre un número de procesos biológicos específicos, tales como la formación de haces mitóticos, de pseudohifas, puntos de cicatrización, el tamaño celular, el crecimiento celular en condiciones definidas, respuesta a señales externas, agente o compuesto. Los procesos biológicos también son materia de la presente invención y se definen en las líneas celulares de levadura manipuladas en que la producción de proteínas tau humanas específicas y de proteínas quinasas humanas específicas da lugar a la fosforilación anormal de proteína tau y de su interferencia con estructuras microtubulares y con el resultante transporte y funciones anormales mediadas por la proteína tau, tal como se ha especificado anteriormente, para finalmente dar lugar a inclusiones fibrilares anormales y agregados, caracterizados por fosfo-epítopos a los que se hace referencia como "epítopos mayúscula PHF-tau" como en el cerebro de pacientes que padecen de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías y demencias (Heutink, 2000).

La expresión "proteína tau fosforilada de manera anormal específica" corresponde al hecho de que las líneas celulares de levadura manipuladas de la invención PUEDEN producir isoformas tau fosforiladas de manera anormal que están definidas por compuestos específicos tales como, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, sin reaccionar o reaccionando de forma cruzada con proteínas tau normales como están presentes en las células, en el cerebro o en CSF.

La expresión "forma un complejo específico" significa que las isoformas de la proteína tau fosforiladas de la presente invención en las cepas de levadura manipuladas como el sistema biológico de la invención, se presentan como productos de peso molecular más elevado en condiciones tal como se describen o mencionan en una de las siguientes técnicas:

Un factor muy posible que podría estar implicado en la enfermedad de Alzheimer es la hiperfosforilación de tau. Esto puede estar causado por la actividad en equilibrio perturbada de quinasas y fosfatasas, las cuales regulan el estado de fosforilación de tau. Las quinasas implicadas directamente en la fosforilación de tau se han identificado in vitro mediante la incubación de quinasas candidatas con tau recombinante producido en bacterias y han revelado quinasas activadas por mitógenos (MAP-quinasas) y glicógeno sintasa quinasa-3\beta), cdk5 quinasa con cualquiera de sus subunidades activantes (p70, p39, p35, p29, p25, ...) y otras quinasas dirigidas a prolina no identificadas que son capaces de fosforilar tau en epítopos tal como se encuentran en PHF-tau (para revisiones véase Billingsley y Kincaid, 1997, Mandelkow y Mandelkow, 1988; Delacourte, 1999). Evidentemente éstas no son las únicas quinasas candidatas que fosforilar tau in vivo.

\newpage

Estas quinasas habitualmente están implicadas en mecanismos de señalización y requieren la activación mediante algún otro mecanismo, generalmente también la fosforilación o la desfosforilación, pero eventualmente la división proteolítica.

Los mecanismos mediante los cuales se controla la actividad de GSK-3\beta es mediante la fosforilación en residuos de tirosina, serina y/o treonina mediante proteína quinasa C (PKC). Las MAP quinasas se activan mediante la fosforilación de residuos de tirosina y treonina por una MAP quinasa (MEK) que es autofosforilada sobre los residuos de serina y treonina por MEK quinasa o quinasas, posiblemente idénticas o relacionadas con los proto-oncogenes cRaf-1 o mos, o con los genes Stell y Byr2. Estas quinasas pueden estar implicadas entonces de manera indirecta en el control de la fosforilación de tau y, de este modo, se utilizan en la presente invención para identificar quinasas candidatas y mecanismos.

El modelado de la hiperfosforilación de tau de tipo PHF de la enfermedad de Alzheimer se puede conseguir por tanto mediante manipulaciones genéticas utilizando las quinasas implicadas directa o indirectamente en la fosforilación de tau. Los inventores observaron que la eliminación o introducción de GSK-3\beta de células de levadura cultivadas o en las mismas, que fueron manipuladas y eran capaces de expresar tau humana, era particularmente eficaz para conseguir la hiperfosforilación de tau al igual que en el cerebro de los pacientes de Alzheimer y en el cerebro de ratones transgénicos dobles (tau x GSK-3B).

Por consiguiente, en una realización de la presente invención, la quinasa que modula directa o indirectamente la fosforilación de la proteína tau formadora de microtúbulos es preferiblemente la glicógeno sintasa quinasa-3B.

Los procedimientos para cribar potenciales agentes terapéuticos utilizando líneas celulares están bien establecidos y son conocidos por los expertos en la materia, ya que los modelos basados en células se utilizan generalmente como procedimientos de cribado de fase más inicial que implican inmunoensayos o características morfológicas celulares. En una realización de la presente invención se pueden utilizar ejemplos de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales contra epítopos de tau fosforilados y no fosforilados para los cuales los expertos en la materia conocen muchos ejemplos. Por ejemplo, los anticuerpos Tau-1 y tau-5 son anticuerpos monoclonales de ratón que reaccionan con tau normal pero no con PHF-tau, mientras que AT8, AT100, AT180, AT270, PHF1, MC1, SMI31, SMI34, SMI310, ALZ-50, entre otros, son anticuerpos monoclonales de ratón que reconocen PHF-tau pero no reaccionan con tau normal en cerebro humano normal.

El cribado se puede llevar a cabo tal como se indica a continuación: las células recombinantes de la presente invención se incuban con un factor terapéutico potencial para un tiempo específico en condiciones específicas y, a continuación, las células se incuban con anticuerpos específicos después de lo cual se mide el grado de unión como índice del estado de hiperfosforilación de tau. Los fármacos candidatos eficaces disminuirán la hiperfosforilación de tau. Preferiblemente, el ensayo de cribado se realiza mediante ELISA, ya que éstos se pueden realizar rápidamente y a gran escala utilizando placas de microtitulación y aparatos (semi)automáticos.

Pr consiguiente, la presente solicitud también describe un kit para el ensayo de cribado que comprende:

i) células de levadura manipuladas

ii) un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, capaz de unirse selectivamente a tau fosforilada. Alternativamente, la presente solicitud también describe un ensayo de cribado que comprende además:

iii) un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, capaz de unirse selectivamente a tau no fosforilada (normal).

De manera ventajosa el ensayo de cribado es un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima.

Las líneas celulares recombinantes de la presente invención también pueden utilizarse como modelos para otros trastornos neurodegenerativos en los que existe la evidencia de fosforilación anormal de proteínas citoesqueléticas; estas condiciones incluyen la demencia frontotemporal, la demencia vascular, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la demencia senil del tipo de los cuerpos de Lewy (SDLT) y la apoplejía.

Por consiguiente, las líneas celulares recombinantes de la presente invención se puede utilizar para el estudio de dichas condiciones y el cribado de agentes terapéuticos para dichas condiciones.

La invención utiliza la introducción y expresión de tau y tau quinasas en células que normalmente no expresan tau, es decir células de levadura. Las células se manipulan para expresar tau mediante la introducción de su ADNc bajo el control de una secuencia de promotor de control específica, generalmente utilizando un vector clonador, por ejemplo, plásmido. Estos métodos y procedimientos son conocidos por los expertos en la materia.

El ADNc de GSK-3\beta humano se utiliza preferiblemente en la producción de construcciones como una modificación del gen natural. Para esto se utilizó la mutagénesis dirigida de sitio para sustituir el residuo de serina en el codón 9 por un residuo de alanina en GSK-3\beta, para evitar la regulación negativa de su actividad mediante la fosforilación en la serina 9 que es conocida por los técnicos en la materia por ser una señal de inactivación normal.

Ejemplos Metodologías generales utilizadas en la presente invención

Cepas de levadura con eliminaciones: Se realizaron eliminaciones genómicas de genes específicos en la cepa W303-1A de S. cerevisiae (Thomas, B.J. y Rothstein, R.J., Cell 1989; 56: 619-630), la cepa BY4741 (Brachmann et al., Yeast 1998; 14: 115-132) o la cepa \Sigma1278b (Kron, S.J. Trends Microbiol. 1997; 5: 450-454) tal como se indica. Se obtuvieron mediante interrupción génica dirigida con productos de PCR tal como se ha descrito anteriormente (Brachmann et al., Yeast 1998; 14: 115-132) utilizando los oligonucleótidos indicados en la Tabla 1 y utilizando los vectores pRS como plantillas para marcadores seleccionables auxotróficos. Las eliminaciones se comprobaron mediante análisis de transferencia Southern (Sambrook et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edn. 1989; Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press) o mediante análisis con PCR. Las cepas ASY62 y ASY63 con eliminación PKA fueron proporcionadas muy amablemente por S. Garrett y se han descrito previamente (Smith A. et al., EMBO J., 1998; 17: 3556-3564).

Construcciones de expresión de ADNc: Se transformaron tau natural humana y tau P301-L mutante en levadura como construcciones recombinantes que contenían el promotor de la triosa fosfato isomerasa (TPI) (Alber T, Kawasaki G., J Mol Appl Genet 1982;1:419-434), permitiendo que se expresaran de manera constitutiva los ADNc de tau. Para este objetivo, el ADNc de tau natural 2N/4R, el ADNc de tau-P301L 2N/4R o los correspondientes cassetes GFP que contenían los ADNc de tau fusionados dentro del marco de lectura a la secuencia codificante de GFP, se unieron en los sitios EcoRI-Xho1 del vector lanzadera de levadura/E. coli pJW212 que es un derivado de pYX212 (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, Reino unido). La clonación de los insertos de ADNc se confirmaron mediante el análisis de secuencia utilizando un procedimiento basado en el análisis de secuencia didesoxi estándar (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977;74: 5463-5467). Los plásmidos resultantes para la expresión de tau se transformaron en las cepas de levadura adecuadas según el protocolo descrito por Gietz R.D. y Schiestl R.H. (Methods in Molecular and Cellular Biology 1995;5: 255-269). Las células transformadas se pusieron en placas con un medio que contenía glucosa sin uracilo (SD-ura) tal como se especifica por Sherman et al. (Methods in Yeast Genetics. 1986; Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press). El vector de expresión de ADNc para GSK3\beta humana se derivó de pKT10-GSK3\beta (Andoh et al., Mol. Cell. Biol. 2000; 20:6712-6720). Este plásmido se cortó con BsmI, se obtuvieron extremos romos con T4 ADN polimerasa y se unió con un fragmento PvuII-EcoRV que contenía el gen KanM de pUG6 (Güldener U. et al., Nucleic Acids Res. 1996; 24: 2519-2524). Para seleccionar los transformantes que contienen este plásmido de expresión de ADNc para huGSK3\beta, se pusieron en placas YPD las células suplementadas con kanamicina a una concentración final de 150 \mug por ml.

Sobreexpresión de PP2A: El plásmido de sobreexpresión de PP2A contiene el gen de levadura PPH21 fusionado al promotor de PGK y el terminador de PGK en pGKJW2. Para esta construcción, el gen PPH21 se amplificó con cebadores que introdujeron un SmaI en el extremo 5' y un BamHI en el extremo 3' de la secuencia codificante. A continuación, el producto PCR se digirió con SmaI y BamHI, se purificó y se unió en los sitios de restricción SmaI y Bg/II de pGKJW2. El plásmido pGKJW2 se obtuvo mediante la clonación de un fragmento HindIII de 1,8 kb de pMA91 que contiene el promotor de PGK, un sitio de clonación Bg/II y el terminador de PGK (Mellor et al., Gene 1983; 24: 1-14) en el sitio HindIII de YEpLAC181 (Gietz R.D. y Supino A., gene 1988; 74: 527-534). A continuación, se extrajo el sitio de clonación múltiple original pUC19 de YEpLAC181 mediante un doble digesto EcoRI-SalI seguido de tratamiento con T4 polimerasa y unión. Posteriormente, se introdujo un nuevo cassette de clonación múltiple que contenía los sitios de restricción para BamHI, SmaI, EcoRI y Bg/II entre el promotor y el terminador de PGK mediante la inserción de un enlazador sintético en el sitio Bg/II. Dado que pGKJW2 contiene el gen LEU2, se seleccionaron los transformantes sobre un medio mínimo que contenía glucosa sin leucina (SD-leu).

Cultivo de levaduras: Las células de levadura se cultivaron en medio YEP (2% (p/v) de bactopeptona, 2% (p/v) de extracto de levadura) o en el medio selectivo apropiado con el fin de mantener los plásmidos en cepas transformadas. Los medios se suplementaron con un glucosa al 4% (p/v) (YPD o SD) a menos que se especifique lo contrario. Para el crecimiento pseudohifal, las célula se pusieron en placas con medio con limitación de nitrógeno (1 mM de asparagina, 0,17% (p/v) de bases nitrogenadas de la levadura sin aminoácidos y sin NH_{4}SO_{4}, 2% (p/v) de glucosa y 1,5% (p/v) de agar). Las células se desarrollaron a 30ºC o 25ºC durante periodos de tiempo diferentes según se especifica.

Ensayos de resistencia a benomilo: Para ensayos de resistencia a benomilo (1-butilcarbamoil-2-benzimidazolcarbamato de metilo), las células se desarrollaron en YPD suplementado con 5 a 60 \mug de benomilo tal como se indica. El crecimiento se controló mediante el placado de diluciones en serie o mediante la medición de DO600 en una Terminal de trabajo Bioscreen C Microbiology (Termo Labsystems, Helsinki, Finlandia) según las especificaciones de los fabricantes.

Preparación de extractos crudos para transferencia Western: Se inocularon células de levadura a una densidad de DO600 de 0,2 en 5 ml de medio selectivo y se desarrollaron durante 16 horas a 30ºC. Se transfirió un mililitro del cultivo a un tubo de microcentrífuga y se enfrió en hielo. Las células se recogieron rápidamente mediante centrifugación en una microcentrífuga enfriada (4ºC) a velocidad máxima durante 15 segundos y el gránulo se resuspendió en 50 \mul de tampón de muestra SDS-PAGE estándar precalentado (95ºC). La mezcla se puso a ebullición durante 15 minutos con el fin de desnaturalizar e inactivar todas las proteinasas y fosfatasas y, a continuación, se procesó mediante análisis de transferencia Western tal como se describe a continuación.

Pruebas de solubilidad de tau: La solubilidad de proteína tau se determinó mediante extracción secuencial de células de levadura (desarrolladas en SD-ura hasta una DO600 de 2) con un tampón de reensamblaje con alto contenido en sal (RAB: 1 M de sacarosa, 0,1 M de MES pH 7,0; 0,1 mM de EGTA, 0,56 mM de MgSO_{4}) suplementado con una mezcla de inhibidores de proteasas (COMPLETE, Roche Diagnostics GMBH), tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación que contiene detergente (RIPA: 50 mM de Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, desoxicolato sódico al 0,5% (p/v), SDS al 0,1% (p/v), nonidet P40 al 1% (v/v) y ácido fórmico al 70% tal como se ha descrito previamente (Ishihara T. et al., Neuron, 1999; 24: 751-762). Las células de levadura se rompieron en tampón de reensamblamiento con partículas de vidrio mediante agitación vigorosa y las suspensiones celulares se centrifugaron a 50.000xg. Las muestras de los sobrenadantes y los gránulos se recogieron después de cada extracción consecutiva y se almacenaron para el análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos Tau-5.

Transferencia Western: Las mezclas de proteínas desnaturalizadas y reducidas se separaron mediante SDS-PAGE tal como se realiza en condiciones reductoras sobre geles de gradiente lineal del 4-20% o sobre geles homogéneos de 8% ó 12% (Novex, San Diego, CA). Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron electroforéticamente a filtros de nitro-celulosa (Hybond-C, Amersham, Reino Unido) o a filtros PVDF (ABI, San Francisco, CA). Los filtros se bloquearon mediante incubación durante 1 hora en PBS con Tween 20 al 0,05% (v/v) y leche seca descremada al 55 (p/v) (tampón de bloqueo). A continuación, los filtros se incubaron durante toda la noche con un anticuerpo monoclonal específico o un antisuero policlonal específico diluidos de manera apropiada en el mismo tampón de bloqueo. A continuación, los filtros se lavaron tres veces en Tween-PBS y se trataron durante 1,5 horas a temperatura ambiente con IgG anti-ratón de conejo marcada con peroxidasa de rábano picante (Dakopatts, Dinamarca) diluida 1/3000 en tampón de bloqueo. Después de tres lavados en Tween-PBS, se aplicó durante 1,5 horas a temperatura ambiente el complejo estreptavidina-peroxidasa de rábano picante biotinilada (Amersham), diluido 1/250 en tampón de bloqueo. A continuación, los filtros se lavaron tres veces en Tween-PBS y una vez en PBS. A continuación, los filtros se incubaron en PBS que contenía diaminobencidina al 0,05% (p/v) y peróxido de hidrógeno al 0,03% (v/v) hasta que se desarrolló la tinción en la base.

Debería estar claro que la formación de un complejo inmunológico entre los anticuerpos monoclonales y el antígeno no está limitada a las condiciones exactas descritas anteriormente, sino que todas las técnicas que respetan las propiedades inmunoquímicas de la unión del anticuerpo y el antígeno producirán una formación similar de un complejo inmunológico.

Los fosfo-epítopos tienen de 4 a 8 aminoácidos de largo y según esta realización de la presente invención, también se pueden definir químicamente en solución o en fase sólida según cualquiera de las técnicas bien conocidas en el sector y en comparación con péptidos fosforilados tal como se preparan según las técnicas también conocidas en el sector.

La detección del anticuerpo monoclonal unido inmunológicamente se puede conseguir mediante tecnología convencional conocida y comprendida en la técnica, con un segundo anticuerpo que transporta él mismo un marcador o un grupo químico o físico como marcador.

Anticuerpos monoclonales: Se utilizó el anticuerpo monoclonal Tau-5 (Pharmingen, San Diego, CA) que se dirige contra un epítopo en una proteína humana que se expresa de manera constitutiva en todas las isoformas de tau humanas e independiente de la fosforilación (anticuerpo "pan"-tau). El anticuerpo monoclonal AT-120 (Innogenetics, Ghent, Bélgica) reconoce un epítopo especial que está situado inmediatamente al extremo c-terminal de T-231. La reacción con la proteína tau no es dependiente de la fosforilación en la transferencia western, mientras que en la inmunohistoquímica en cerebro humano, el AT-120 sólo reacciona con los filamentos helicoidales apareados (PHF) en los ovillos neurofibrilares (NFT) en cerebro con AD. Los anticuerpos monoclonales AT-8 (Innogenetics, Ghent, Bélgica) y AT-2 (donación de B. Pau, Lille, Francia) se utilizaron para detectar epítopos específicos sobre la proteína tau cuando se fosforila. Los epítopos de estos anticuerpos monoclonales comprenden Ser(P)-199 y Ser(P)-202 para AT8 y Ser(P)-396 y Ser(P)-404 para AD2. De manera similar, el anticuerpo monoclonal AT180 ((Innogenetics, Ghent, Bélgica) reconoce la proteína tau fosforilada en Thr-181 y Thr-231. Además, se utilizó el anticuerpo monoclonal Tau-1 (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) ya que su especificidad es complementaria a la de AT8, es decir, Tau-1 reconoce el mismo epítopo que comprende Ser-199 y Ser-202, pero sólo cuando estos residuos no están fosforilados.

Microscopía: Las células de levadura desarrolladas en un medio con limitación de nitrógeno inductor de dichos hifas se rascaron de la placa, se mezclaron con agua y se colocaron sobre un portaobjetos de vidrio. Se desarrollaron las células transformadas con GFP hasta una DO600 de 3 en SD-ura y se depositaron 3 \mul de cultivo en portaobjetos de vidrio. Las imágenes se procesaron con un microscopio láser ZEISS-axioplan bajo un objetivo de inmersión en aceite de 100x.

Ejemplo 1 Expresión de proteína tau humana en Saccharomyces cerevisiae: La proteína tau humana se fosforila cuando se expresa en levadura

Para demostrar que la proteína tau humana, tanto natural como mutante P301L, se pueden expresar en levadura, se realizó una transferencia Western sobre extractos crudos de las cepas naturales transformadas W303-1A y BY4741 y cepas isogénicas mds1 que carecen de uno de los genes de la levadura que codifican una quinasa homóloga a la tau-quinasa humana GSK-3\beta. Para la detección, se utilizaron los anticuerpos monoclonales Tau-5 que es el anticuerpo "pan"-tau independiente de la fosforilación. Las líneas celulares W303-1A-HuTau-natural y W303-1A-mds1-HuTau-natural se han depositado para la patente (depósito IDA) en la Colección Coordinada Belga de Microorganismos - BCCM Colección IHEM y recibieron los números respectivos, IHEM 19160 e IHEM 19161.

Resultados: Tal como se muestra en la figura 1, se obtuvo una expresión considerable de tau natural humana y tau-P301L mutante humana en cepas de levadura, donde se mantiene su inmunorreactividad como en cerebro humano o en cerebro de ratón transgénico, o en sistemas de expresión de mamíferos. Este resultado sigue siendo cierto no sólo en las cepas de levadura naturales, sino también en las cepas con eliminación mds1\Delta. Además, la movilidad electroforética de las proteínas tau naturales inmunorreactivas es más lenta en las cepas naturales cuando se compara con las cepas mds1\Delta, lo cual es indicativo de una diferencia en la fosforilación. Esta diferencia en la movilidad entre las cepas no es obvia cuando se expresa el mutante tau-P301L, lo cual sugiere que la mutación P301L es la proteína tau puede interferir con su fosforilación. Además, tal como se muestra en la figura 1B, la proteína humana tau también se puede expresar como producto de fusión de GFP funcional sin pérdida de inmunorreactividad.

El resultado de la presente invención demuestra el hallazgo sorprendente de que en un sistema celular eucariota microbiano se puede analizar el efecto de las mutaciones de tau en su fosforilación. La combinación de estos hallazgos sorprendentes constituyen los primeros ensayos exitosos necesarios que validan todo el enfoque y la estrategia experimental para analizar la proteína tau, su fosforilación y las consecuencias de las mutaciones, en un sistema celular menos complejo que es modificable genéticamente de manera sencilla. El objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema experimental completamente novedoso para tratar la importancia de las mutaciones en tau y las cascadas de transducción de señales que son responsables de la hiperfosforilación de la proteína tau y conducen a la misma.

Ejemplo 2 Expresión de proteína tau humana en Saccharomyces cerevisiae: La proteína tau humana se fosforila en levadura en los mismos fosfo-epítopos que en el cerebro de los pacientes de Alzheimer

Para confirmar si la proteína tau heteróloga expresada se modifica después de la traducción mediante fosforilación en levadura, se realizó un estudio más elaborado del mapeo de la fosforilación sobre extractos crudos obtenidos a partir de las cepas naturales W303-1A y BY4741 transformadas y su isogénica mds1\Delta (que carece de uno de los genes de levadura que codifica una quinasa homóloga a la tau-quinasa GSK-3\beta humana) y cepas pho85\Delta (la última siendo deficiente en una quinasa que es homóloga a la segunda tau-quinasa conocida, es decir, cdk5). Como anticuerpos monoclonales se utilizaron AT-8 y AD-2 que reconocen sólo epítopos fosforilados y Tau-1 que detecta epítopos no fosforilados.

Resultados: La inmunorreacción positiva con todos los diferentes anticuerpos fue evidente en todos los experimentos realizados. Algunas diferencias en la intensidad en las diferentes combinaciones indicaron una extensión diferente de fosforilación tal como muestra en las transferencias western representativas mostradas (figura 2).

La reactividad con AT-8 es evidente cuando se expresa la tau humana natural o mutante y, además, aparecía independiente de la base genética de la cepa de levadura (figura 2). En combinación con la inmunorreactividad débil del anticuerpo monoclonal Tau-1, reconociendo el mismo epítopo cuando no está fosforilado, estos resultados indican que el mecanismo o mecanismos que conducen al fosfo-epítopo definido por el anticuerpo AT-8 no son plenamente activos o no están plenamente representados en las cepas de levadura estudiadas aquí. Esto abre varias posibilidades interesantes para diferentes estrategias experimentales, es decir, complementación genética, variables externas, condiciones de cultivo,... para establecer este mecanismo o mecanismos y definirlos en términos moleculares.

La comparación de la inmunorreactividad con el anticuerpo AT-180 en la cepa natural y mds1\Delta demuestra la implicación de Msd1, por ejemplo uno de los homólogos de GSK-3\beta humana en levadura, en el control de la fosforilación de treonina-231, el residuo fosforilado que está comprendido en el fosfo-epítopo definido por AT-180 (datos no mostrados).

El resultado más llamativo fue la reacción del anticuerpo monoclonal AD-2 que estaba ausente en la cepa mds1\Delta, pero no en la cepa pho85\Delta, por ejemplo el homólogo de cdk5 humano (figura 2). Este resultado demostró que la Mds1 quinasa de levadura es directamente responsable de la fosforilación de los residuos de serina-396 y serina-404 en proteína tau humana. Esto es una excelente corroboración de los hallazgos de los inventores en el cerebro de ratones transgénicos con GSK-3\beta, en el que el epítopo de AD-2 estaba implicado en el rescate de la axonopatía causada por la sobreexpresión de la proteína tau (Spittaels et al., J. Biol. Chem. 2000; 275: 41340-41349.). Este interesante hallazgo abre de nuevo varias posibilidades experimentales para la complementación funcional tal como se demuestra a continuación.

Combinados, estos resultados constituyen la evidencia necesaria de que la expresión heteróloga de la proteína tau humana en levadura da lugar a la fosforilación en los fosfo-epítopos específicos que también se encuentran en el cerebro de los pacientes de Alzheimer. Por lo tanto, la expresión heteróloga de proteína tau humana en levadura proporciona un sistema que produce o recapitula algunos o todos los fosfo-epítopos específicos que se cree hipotéticamente que son importantes en la formación de ovillos neurofibrilares y, por tanto, causan la tauopatía y contribuyen a la patología de enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer. Además, algunos de los resultados proporcionan indicaciones para sistemas experimentales completamente novedosos para dirigir los mecanismos de cascada de la transducción de señal que son responsables de la hiperfosforilación de la proteína tau en los epítopos específicos y conducen a la misma.

Ejemplo 3 Expresión de proteína tau humana en Saccharomyces cerevisiae: La proteína tau humana heteróloga expresada está menos fosforilada en cepas de proteína que sobreexpresan la proteína fosfatasa PP2A

Para ilustrar que la proteína tau heteróloga expresada es un sustrato para proteína fosfatasas en levadura, se controló la fosforilación de tau en una cepa natural y en una cepa natural con la sobreexpresión de PPH21, uno de los genes de levadura que codifican la fosfatasa PP2A.

Resultados: Tal como se muestra en la figura 3, la sobreexpresión de PPH21 y, por tanto, la mayor actividad de PP2A, aumentó la inmunorreactividad de la proteína tau para el anticuerpo TAU-1 que reconoce epítopos no fosforilados.

En concordancia con lo que se ha sugerido en base a los datos in vitro con extractos de mamíferos, los datos demuestran que la proteína tau se desfosforila in vivo cuando la actividad de PP2A aumenta en levadura. Este resultado sorprendente demuestra de nuevo que la levadura puede funcionar como estudio modelo para identificar compuestos novedosos implicados en la desfosforilación de la proteína tau.

Ejemplo 4 Expresión de proteína tau humana en Saccharomyces cerevisiae: Complementación funcional: las quinasas de levadura reconocen los mismos sitios de fosforilación en proteína tau que sus homólogas humanas

Para averiguar si las quinasas de levadura se pueden complementar funcionalmente por y reconocen los mismos fosfo-epítopos in vivo que sus quinasas humanas homólogas, se sobreexpresó la GSK-3\beta humana en la cepa mds1\Delta (que carece de uno de los genes de levadura que codifican una quinasa homóloga a la tau-quinasa humana GSK-3\beta) y se controló la fosforilación de tau en extractos crudos utilizando el anticuerpo monoclonal AD2.

Resultados: Tal como se muestra en la figura 4, la inmunorreactividad de la proteína tau humana a AD2 se restaura en la cepa mds1\Delta cuando se coexpresa la GSK-3\beta humana. Esto demuestra que tanto las quinasas GSK-3\beta endógenas como las quinasas GSK-3\beta expresadas heterólogas fosforilan los fosfo-epítopos de AD2, es decir, Ser-396 y
Ser-404.

Estos resultados proporcionan evidencia de la complementación funcional entre los componentes de transducción de señal de levadura y humanos y confirmar que estas proteínas divergentes en su evolución mantenían un grado elevado de especificidad de sustrato.

Ejemplo 5 Expresión de proteína tau humana en Saccharomyces cerevisiae: La levadura como modelo para elucidar los mecanismos de transducción de señal que controlan la (hiper)fosforilación de la proteína tau

Para estudiar las cascadas de transducción de señales que controlan la fosforilación de tau, se controló la fosforilación de la proteína tau humana en cepas deficientes de diferentes actividades quinasa, es decir, PKA, Sch9 y Yak1. Los inventores y otros anteriores han demostrado previamente que estas quinasas operan en mecanismos interconectados inducidos por nutrientes en levadura (Thevelein J.M., yeast, 1994; 10: 1753-1790; Crauwels et al., Microbiol., 1997; 143: 2627-2637; Hartley, A.D. et al., Genetics, 1994; 136: 465-474). No existen datos disponibles de que sus homólogos humanos, resp. PKA, PKB/Akt1 y DYRK-1, fosforilen directamente la proteína tau in vivo, pero varios grupos de investigación describieron su implicación en la (hiper)fosforilación de tau y la neurodegeneración basada en resultados in vitro (Bilingsley M.L. y Kincaid, R.L. Biochem. J. 1997; 323: 577-591; Woods, Y.L. et al., Biochem. J. 2001; 355: 609-615).

Resultados: La fuerte inmunorreactividad con el anticuerpo monoclonal Tau-1 observada tras el análisis de transferencia Western de los extractos crudos obtenidos a partir de las diferentes cepas con eliminación de quinasas que expresan tau, confirma que estas quinasas cumplen una función en el proceso de fosforilación de tau en levadura (figura 5).

De particular interés es la diferencia en la fosforilación de tau natural y tau mutante P301L en la cepa sin actividad PKA (tpk1\Delta tpk2\Delta tpk3\Delta msn2\Delta msn4\Delta) y la cepa que expresa sólo una de las tres subunidades catalíticas de PKA, es decir, TPK3 (tpk1\Delta tpk2\Delta TPK3 msn2\Delta msn4\Delta). La fuerte inmunorreactividad observada en el primero se anula completamente por la presencia de Tpk3 para tau-P301L, pero sólo se reduce parcialmente para tau natural. Esto confirma la interferencia de las mutaciones de tau en el proceso de fosforilación (comparar con ejemplo 1). Además, la reducción limitada de la inmunorreactividad a Tau-1 de tau natural en la cepa TPK3 ilustra que Tpk3 sólo puede mediar una fosforilación parcial de Ser-199 y Ser-202 y que se requiere la actividad completa de PKA para una fosforilación completa. Estos hallazgos demuestran que las cepas de levadura manipuladas se pueden utilizar como modelo para estudiar la cascada de transducción de señales que controla la fosforilación de tau.

Conclusiones: Estos resultados proporcionan los primeros datos in vivo para la contribución de PKA, Sch9 (PKB/
Akt) y Yak1 (DYRK-1) en el control de la fosforilación de tau. No se puede concluir que esto implique una fosforilación directa, es decir, que estas quinasas reconozcan a tau como sustrato, pero se puede llegar a ello mediante análisis de epistasis adicional. Dado que las tres quinasas de levadura se pueden complementar funcionalmente por sus respectivos homólogos de mamíferos tal como los presentes inventores y otros han descrito (Geyskens, I. et al., Nato Sci. Ser., 2000; 316: 117-126; Yan, B. et al., Yeast, 2001; 18(S1): S273; Zhang, Z. et al., Mol. Biol. Cell, 2001; 12: 699-710), estos resultados demuestran que las cepas de levadura manipuladas que expresan tau pueden servir como modelos in vivo para descifrar los mecanismos de transducción de señales y para identificar componentes novedosos que controlan la fosforilación de tau.

Ejemplo 6 Expresión de proteína tau humana en Saccharomyces cerevisiae: La expresión heteróloga de proteína tau humana afecta a los procesos fisiológicos en levadura permitiendo el desarrollo de procedimientos de cribado de alto rendimiento

Para investigar cómo la sobreexpresión heteróloga de proteína tau humana en levadura afectaba a procesos fisiológicos específicos, se controló la formación de pseudohifas y la sensibilidad al fungicida antimitótico benomilo. Bajo condiciones de crecimiento limitativas, tales como el crecimiento en fuentes con poco nitrógeno, ciertas cepas de levadura experimentan una transición dimórfica a una forma de crecimiento de apariencia filamentosa a la que se hace referencia como diferenciación pseudohifal. Esto no sólo requiere cambios en el patrón de germinación y la adhesión celular, sino también en la elongación celular y, por tanto, la alteración del citoesqueleto de microfilamentos (Gancedo, J.M., Ferns microbiol. Rev., 2001; 25: 107-123; Winsor B y Schiebel E, Yeast, 1997, 1997; 13: 399-434). El benomilo, como el nocodazol, es un agente desestabilizador de microtúbulos e inhibidor de la polimerización de microtúbulos (Hoyt M.A., Cell, 1991; 66: 507-517; Carminat J.L., Stearns, T., J. Cell Biology, 1997; 138: 629-641).

Resultados del crecimiento pseudohifal: La cepa natural de levadura \Sigma1278b se transformó con tau natural, o tau-P301L mutante o un plásmido vacío y se desarrolló durante 4 días en condiciones de nitrógeno limitado para inducir la diferenciación pseudohifal. Tal como se muestra en la figura 6A, la expresión de proteína tau natural humana interfería considerablemente o incluso evitaba la formación de pseudohifas en estas condiciones, mientras que tau-P301L mutante inhibía la formación de pseudohifas en un grado menor que la tau natural.

Resultados de la sensibilidad a benomilo: Cuando se desarrollaron cepas BY4741 de levadura en medio YPD suplementado con benomilo, se pudieron observar diferencias en la sensibilidad dependientes de la eliminación presente y de si se expresaba tau natural o tau P301L mutante. Tal como se muestra en las curvas de crecimiento en la figura 6B, la cepa natural es menos resistente a 40 \mug/ml de benomilo cuando se expresa tau natural. En la cepa mds1\Delta (que carece de uno de los genes de levadura que codifica una quinasa homóloga a la tau-quinasa GSK-3\beta humana), tanto tau natural como tau P301L mutante mejoraron la resistencia, mientras que en la cepa pho85\Delta (deficiente en una quinasa que es homóloga a la segunda tau-quinasa conocida, es decir, cdk5), se observó que aumentó la resistencia sólo con la expresión de tau P301L mutante. Con la cepa pho85\Delta, este efecto también se obtuvo cuando las células se pusieron en placas con medio YPD que contenía benomilo. Con concentraciones tan bajas como 10 \mug/ml de benomilo, se observó que el crecimiento mejoró para la cepa pho85\Delta transformada con tau P301L mutante (figura 6C). Estos resultados demuestran que también en levadura la tau heteróloga expresada interfiere con la función de los
microtúbulos.

Conclusión: Estos resultados demuestran claramente que la sobreexpresión heteróloga de la proteína tau humana afecta a procesos fisiológicos específicos medibles en levadura. Dado que las diferencias en los fenotipos dependen de la expresión de tau natural o tau P301L mutante y en las actividades de las proteínas quinasas presentes en las cepas, los datos constituyen una evidencia que apoya el uso de levadura manipulada para cribados de alto rendimiento de compuestos que afectan a varias propiedades, incluyendo la fosforilación de tau y la interacción de los microtúbulos de tau.

Ejemplo 7 Expresión de proteína tau humana en Saccharomyces cerevisiae: Ensayo de solubilidad de la proteína tau humana heteróloga expresada en levadura

Para analizar la solubilidad de la proteína tau humana heteróloga expresada, se realizaron tal como se describe extracciones secuenciales de células de levadura (desarrolladas en SD-ura hasta una DO600 de 2) con un tampón de reensamblaje con alto contenido en sal (RAB), tampón de ensayo de inmunoprecipitación (RIPA) que contenía detergente y ácido fórmico al 70% (FA). Para la detección se utilizó el anticuerpo monoclonal Tau-5.

Resultados: Tal como se muestra en la figura 7, la tau natural y la tau P301L mutante están presentes predominantemente como proteínas insolubles en las cepas de levadura ensayadas. Las proteínas tau sólo se podían solubilizar parcialmente en tampón RAB y RIP. Con ácido fórmico al 70%, una pequeña fracción permanecía insoluble en la cepa BY4741 natural y la cepa isogénica mds1\Delta, pero no en la cepa mutante pho85\Delta. En esta última, la tau natural y la tau P301L mutante eran detectables en el sobrenadante, pero no en el gránulo sólido.

Se puede concluir que tau se haya predominantemente como una proteína insoluble en levadura, lo cual indica que también en este organismo tau forma agregados y que la agregación depende del estado de fosforilación de la proteína tau. Por lo tanto, la levadura puede ser válida como modelo para estudiar el autoensamblaje de tau y para elucidar la formación de filamentos helicoidales apareados. Además, dicho modelo de levadura ofrece la oportunidad de utilizar tau para impulsar la agregación de un marcador seleccionable y como tal desarrollar una estrategia de cribado de alto rendimiento para componentes que interfieren específicamente con la agregación de tau.

Mientras la agregación de Tau es bastante laboriosa de controlar, las proteínas de fusión de Tau con proteínas enzimáticamente activas parecen mostrar la misma agregación dependiente de la fosforilación y, en este caso, la agregación coincide con la eliminación de la correspondiente actividad enzimática de la célula. Esto queda demostrado por la proteína de fusión de Tau y el producto génico de resistencia a Kanamicina, que es soluble en la cepa mds1\Delta (que carece de uno de los genes de levadura que codifica una quinasa homóloga a la tau-quinasa GSK-3\beta humana), pero está presente en una forma agregada en la base natural. De forma concomitante con esta observación, las cepas que expresan la fusión kanr-Tau en una base natural son sensibles a kanamicina, mientras que las cepas que expresan fusiones kanr-Tau en la base mds1 son resistentes a kanamicina. Cualquier compuesto que inhibe Mds1 evita la fosforilación de la fusión kanr-Tau y, por tanto, da lugar a la resistencia a kanamicina. Por lo tanto, los compuestos que inducen el crecimiento de células naturales que expresan la fusión kanr-Tau en un medio que contiene kanamicina son inhibidores candidatos de Mds1. La sustitución de Mds1 por su homóloga humana GSK-3\beta hace que este ensayo de cribado sea específico para inhibidores de GSK-3\beta humana.

Los compuestos que provocan la solubilización de la fusión kanr-Tau a través de un mecanismo diferente de la inhibición de GSK3, también producirán una lectura positiva en este ensayo. Estos solubilizadores de Tau independientes de GSK3 es probable que representen nuevas clases interesantes de compuestos (terapéuticos) activos contra tauopatías. Dado que el control de la expresión de Tau durante el crecimiento reveló que la expresión de Tau ocurría sólo después de 5-10 horas de crecimiento, los compuestos que invierten la agregación de Tau, así como los compuestos que evitan la agregación de Tau, se pueden identificar dependiendo del tiempo de administración del compuesto a los cultivos de levadura. Los cultivos se pueden desarrollar en placas de microtitulación y la administración de compuestos y el control del crecimiento (densidad óptica a 600 nm) se pueden automatizar totalmente, permitiendo el escalado del procedimiento y el cribado de bibliotecas químicas.

El principio del procedimiento descrito también se puede aplicar a cepas que expresan fusiones de tau con cualquier otro informador, tal como URA3, que tiene la ventaja que Ura3 funcional da lugar a un crecimiento en un medio sin uracilo, pero con toxicidad en un medio que contiene FOA, permitiendo una estrategia y cribado complementarios.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias a la solicitud

Billingsley ML, Kincaid RL., Biochem J 1997; 323:577-591

Brion JP, Eur. Neurol., 1998, 40: 130-140.

Delacourte A Dement Geriatr Cogn Disord, 1999, 10: 75-79

DEWACHTER I., MOECHARS D., VAN DORPE J., SPITTAELS K., TESSEUR I., VAN DEN HAUTE C. y VAN LEUVEN F., Experimental Gerontology, 35, 831-841, 2000

Hardy J., Duff K, Hardy KG, Perez-Tur J, Hutton M, Nat Neurosci, 1998, 1: 355-358

Heutink P., Hum. Molec. Genet., 2000, 9: 979-986.

Mandelkow EM and Mandelkow E, 1998, Trends Cell-Biol., 8: 425-427.

Sambrook, J. y Russel DW, 2001 "Molecular Cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY

Selkoe, D. (2000) Neurol Clin., 18: 903-922

Spittaels, K., Van den Haute, C., Van Dorpe, J., Vandezande, K., Laenen, I., Geerts, H., Mercken, M., Sciot, R., Van Lommel, A., Loos, R., Van Leuven, F., Am. J. Pathol., (1999) 155:2153-2165

Spittaels K, Van den Haute C, Van Dorpe J, Geerts H, Mercken M, Bruynseels K, Lasrado R, Vandezande K, Laenen I, Boon T, Van Lint J, Vandenheede J, Moechars D, Loos R, Van Leuven F., J. Biol Chem 2000, 275: 41340-41349.

Tesseur I., Van Dorpe J., Spittaels K., Van den Haute C., Moechars. D, Van Leuven F., Am. J. Pathol., 2000, 156, 951-964

Tesseur, I., Van Dorpe, J., Bruynseels, K., Bronfman, F., Sciot, R., Van Lommel, A. y Van Leuven, F., Am. J. Pathol., 2000, 157, 1495-1510.

Van Dorpe, J., Smeijers, L., Dewachter, I., Nuynens, D., Spittaels, K., Van Den Haute, C., Mercken, M., Moechars, D., Laenen, I., Kuiperi, C., Bruynseels, K., Tesseur, I., Loos, R., Vanderstichele, H., Checler, F., Sciot, R. y Van Leuven, F. Am. J. Pathol., 2000, 157, 1283-1298.

VAN LEUVEN F., Progress in Neurobiology, 61, 305-312, 2000

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Secuencias de oligonucleótidos utilizadas para eliminar genes específicos en S. cerevisiae. Las secuencias en negrita indican la complementariedad con el plásmido pRS

1

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos que no son patentes citados en la descripción

\bulletTHOMAS, B.J.; ROTHSTEIN, R.J. Cell, 1989, vol. 56, 619-630 [0045]

\bulletBRACHMANN et al. Yeast, 1998, vol. 14, 115-132 [0045] [0045]

\bulletKRON, S.J. Trends Microbiol., 1997, vol. 5, 450-454 [0045]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989

\bulletSMITH A. et al. EMBO J., 1998, vol. 17, 3556-3564 [0045]

\bulletALBER T; KAWASAKI G. J Mol Appl Genet, 1982, vol. 1, 419-434 [0046]

\bulletSANGER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, vol. 74, 5463-5467 [0046]

\bulletGIETZ R.D.; SCHIESTL R.H. Methods in Molecular and Cellular Biology, 1995, vol. 5, 255-269 [0046]

\bulletSHERMAN et al. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986 [0046]

\bulletANDOH et al. Mol. Cell. Biol., 2000, vol. 20, 6712-6720 [0046]

\bulletGÜLDENER U. et al. Nucleic Acids Res., 1996, vol. 24, 2519-2524 [0046]

\bulletMELLOR et al. Gene, 1983, vol. 24, 1-14 [0047]

\bulletGIETZ R.D.; SUGINO A. gene, 1988, vol. 74, 527-534 [0047]

\bulletISHIHARA T. et al. Neuron, 1999, vol. 24, 751-762 [0051]

\bulletSPITTAELS et al. J. Biol Chem, 2000, vol. 275, 41340-41349 [0063]

\bulletTHEVELEIN J.M. Yeast, 1994, vol. 10, 1753-1790 [0070]

\bulletCRAUWELS et al. Microbiol, 1997, vol. 143, 2627-2637 [0070]

\bulletHARTLEY, A.D. et al. Genetics, 1994, vol. 136, 465-474 [0070]

\bulletBILINGSLEY M.L.; KINCAID, R.L. Biochem. J., 1997, vol. 323, 577-591 [0070]

\bulletWOODS, Y.L. et al. Biochem. J., 2001, vol. 355, 609-615 [0070]

\bulletGEYSKENS, I. et al. Nato Sci. Ser., 2000, vol. 316, 117-126 [0072]

\bulletYAN, B. et al. Yeast, 2001, vol. 18 (S1), S273 [0072]

\bulletZHANG, Z. et al. Mol. Biol. Cell, 2001, vol. 12, 699-710 [0072]

\bulletGANCEDO, J.M. Ferns microbiol. Rev., 2001, vol. 25, 107-123 [0073]

\bulletWINSOR B; SCHIEBEL E. Yeast, 1997, vol. 13, 399-434 [0073]

\bulletHOYT M.A. Cell, 1991, vol. 66, 507-517 [0073]

\bulletCARMINAT J.L.; STEARNS, T. J. Cell Biololgy, 1997, vol. 138, 629-641 [0073]

\bulletBILLINGSLEYML; KINCAID RL. Biochem J, 1997, vol. 323, 577-591 [0083]

\bulletBRION JP. Eur. Neurol., 1998, vol. 40, 130-140 [0083]

\bulletDelacourte A Dement Geriatr Cogn Disord, 1999, vol. 10, 75-79 [0083]

\bulletDEWACHTER I.; MOECHARS D.; VAN DORPE J.; SPITTAELS K.; TESSEUR I.; VAN DEN HAUTE C.; VAN LEUVEN F. Experimental Gerontology, 2000, vol. 35, 831-841 [0083]

\bulletHARDY J.; DUFF K; HARDY KG; PEREZ-TUR J; HUTTON M. Nat Neurosci, 1998, vol. 1, 355-358 [0083]

\bulletHEUTINK P. Hum. Molec. Genet., 2000, vol. 9, 979-986 [0083]

\bulletMANDELKOW EM; MANDELKOW E. Trends Cell-Biol., 1998, vol. 8, 425-427 [0083]

\bulletSAMBROOK, J.; RUSSEL DW. Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 [0083]

\bulletSELKOE, D. Neurol Clin., 2000, vol. 18, 903-922 [0083]

\bulletSPITTAELS, K.; VAN DEN HAUTE, C.; VAN DORPE, J.; VANDEZANDE, K.; LAENEN, I.; GEERTS, H.; MERCKEN, M.; SCIOT, R.; VAN LOMMEL, A.; LOOS, R. Am. J. Pathol., 1999, vol. 155, 2153-2165 [0083]

\bulletSPITTAELSK; VAN DEN HAUTEC; VANDORPE J; GEERTS H; MERCKEN M; BRUYNSEELS K; LASRADO R; VANDEZANDE K; LAENEN I; BOON T. J. Biol Chem, 2000, vol. 275, 41340-41349 [0083]

\bulletTESSEUR I.; VAN DORPE J.; SPITTAELS K.; VAN DEN HAUTE C.; MOECHARS. D; VAN LEUVENF. Am.J. Pathol., 2000, vol. 156, 951-964 [0083]

\bulletTESSEUR, I.; VAN DORPE, J.; BRUYNSEELS, K.; BRONFMAN, F.; SCIOT, R.; VAN LOMMEL, A.; VAN LEUVEN, F. Am. J. Pathol., 2000, vol. 157, 1495-1510 [0083]

\bullet VAN DORPE, J.; SMEIJERS, L.; DEWACHTER, I.; NUYNENS, D.; SPITTAELS, K.; VAN DEN HAUTE, C.; MERCKEN, M.; MOECHARS, D.; LAENEN, I.; KUIPERI, C. Am. J. Pathol., 2000, vol. 157, 1283-1298 [0083]

\bullet VAN LEUVEN F. Progress in Neurobiology, 2000, vol. 61, 305-312 [0083]

Claims (37)

1. Levadura microbiana manipulada, que comprende una secuencia de nucleótidos introducida o una variante alélica, un minigén, un gen sintético o un homólogo de los mismos que codifican para tau.

2. Levadura microbiana manipulada según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos de mamífero introducida o una variante alélica, un minigén o un homólogo de los mismos que codifican para tau.

3. Levadura microbiana manipulada según la reivindicación 1 ó 2, en la que tau es una proteína tau natural, una isoforma de la proteína tau, una proteína tau mutante u homólogos funcionales de las mismas.

4. Levadura microbiana manipulada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que las proteínas quinasas endógenas de levadura muestran fosforilación de dicha tau o una proteína fosfatasa endógena de levadura modula la fosforilación de dicha tau.

5. Levadura microbiana manipulada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una secuencia de ADN introducida que comprende un promotor, integrado correctamente para dirigir la expresión de una quinasa o fosfatasa de levadura que modula la fosforilación de dicha tau.

6. Levadura microbiana manipulada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una secuencia de ADN introducida que codifica una quinasa o fosfatasa humana o de mamífero que modula la fosforilación de dicha tau, bajo el control de una secuencia promotora.

7. Levadura microbiana manipulada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además una o más de las siguientes:

- una secuencia de ADN introducida que comprende un promotor, integrado correctamente para dirigir la expresión de una glicógeno sintasa quinasa-3beta de levadura o una proteína homóloga de levadura, que modula la fosforilación de dicha tau.

- una secuencia de ADN introducida que codifica una glicógeno sintasa quinasa-3beta o una proteína homóloga de levadura, que modula la fosforilación de dicha tau, bajo el control de una secuencia promotora.

- una secuencia de ADN introducida que comprende un promotor, integrado correctamente para dirigir la expresión de una cdk5 de levadura o una proteína homóloga, que modula la fosforilación de dicha tau.

- una secuencia de ADN introducida que codifica una cdk5 o una proteína homóloga, que modula la fosforilación de dicha tau, bajo el control de una secuencia promotora.

8. Levadura microbiana manipulada según la reivindicación 7, en la que dicha levadura microbiana cuando se cultiva muestra fosforilación, hiperfosforilación o desfosforilación de dicha tau.

9. Levadura microbiana manipulada según la reivindicación 8, que comprende por lo menos una quinasa adicional que puede modular la fosforilación de tau, seleccionada del grupo no limitante de quinasas que consisten en AGC quinasa, una quinasa activada por mitógeno, una glicógeno sintasa quinasa, una quinasa cdk5, una quinasa cdc2, otra quinasa dirigida a prolina del cerebro, una quinasa MEK, una quinasa RAS y una quinasa GEF o una proteína homóloga con una función de proteína quinasa o por lo menos una fosfatasa adicional que puede modular la fosforilación de tau, seleccionada del grupo no limitante de proteínas que consisten en fosfatasas PP1, fosfatasas PP2A o fosfatasas del tipo PP2A, fosfatasas PP2B, fosfatasas PP2C u otras proteínas con una función de proteína fosfatasa.

10. Levadura microbiana manipulada según las reivindicaciones 1 9, caracterizada porque dicha levadura ha sido modulada para tener mecanismos modificados de cascadas de transducción de señales de levadura.

11. Levadura microbiana manipulada según la reivindicación 10, en la que dicha modulación da lugar a un mutante por eliminación de una quinasa o fosfatasa endógena de levadura.

12. Levadura microbiana manipulada según la reivindicación 11, caracterizada porque dicha modulación corresponde a la eliminación obtenida en los mutantes por eliminación MDS1\Delta, PHO85\Delta, SCH9\Delta o YAK1\Delta.

13. Levadura microbiana manipulada según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 12, en la que dicha tau se expresa utilizando un promotor constitutivo.

14. Levadura microbiana manipulada según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 12, en la que tau se expresa utilizando un promotor inducible.

15. Levadura microbiana manipulada según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 14, en la que la secuencia de nucleótidos que codifica tau está fusionada a una señal de secreción.

16. Levadura microbiana manipulada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicha secuencia de nucleótidos o variante alélica, minigén, gen sintético u homólogo de los mismos que codifican para tau está acoplada en el marco de lectura a una proteína informadora y está correctamente integrada para permitir la expresión o sobreexpresión de una proteína de fusión proteína informadora-tau.

17. Levadura microbiana manipulada según la reivindicación 16, en la que tau impulsa la precipitación de la proteína de fusión tau-proteína informadora y de este modo inhibe o cambia la función biológica de la proteína informadora.

18. Levadura microbiana manipulada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que dicha levadura microbiana manipulada se transforma con una biblioteca de ADNc de expresión de levadura, donde dicho ADNc deriva de tejidos humanos y/o de mamíferos, incluyendo tejidos del cerebro y donde se controla el efecto de dicho ADNc sobre la función de tau y/o la fosforilación y bioquímica de tau.

19. Levadura microbiana manipulada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, donde dicha levadura está modificada adicionalmente genética o químicamente para facilitar la captación de agentes, compuestos o señales químicas.

20. Levadura microbiana manipulada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que es del orden de los Saccharomycetales, preferiblemente Saccharomyces cerevisiae.

21. Levadura microbiana manipulada según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 20, donde dicha levadura produce tau natural, isoformas de tau o mutantes de tau con un estado de fosforilación adecuado para la purificación y/o producción de la misma.

22. Uso de la levadura microbiana manipulada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 como modelo para la tauopatía.

23. Uso de la levadura microbiana manipulada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para el modelado in vivo de la bioquímica de tau.

24. Uso de la levadura microbiana manipulada según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 21, como modelo para trastornos neurodegenerativos, en el que la fosforilación y/o función de tau aberrantes es una característica de dichos trastornos neurodegenerativos, preferiblemente la enfermedad de Alzheimer o la demencia frontotemporal con enfermedad de Parkinson.

25. Procedimiento de cribado de una serie de agentes, compuestos o señales químicas que directa o indirectamente afectan a la fosforilación, función o solubilidad de tau, que comprende a) el cultivo, crecimiento o suspensión de la levadura microbiana manipulada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 en un medio apropiado, b) la adición de un compuesto o señal química de prueba a dicha levadura microbiana manipulada o su medio, c) la medición de la extensión en la que afecta dicha fosforilación, función y/o solubilidad de tau.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha levadura microbiana manipulada ha sido modificada genética o químicamente para facilitar la captación de agentes, compuestos o señales químicas que directa o indirectamente afectan a la fosforilación, función y/o solubilidad de tau.

27. Procedimiento según las reivindicaciones 25 ó 26, que comprende además la comparación del efecto de dichos agentes, compuestos o señales químicas sobre dicha levadura microbiana manipulada según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 21, con el efecto de los mismos sobre la levadura microbiana manipulada que es deficiente en la expresión de dicha tau o que es deficiente en la expresión de una proteína quinasa que modula la fosforilación de dicha tau.

28. Procedimiento según las reivindicaciones 25 a 27, que comprende además la comparación del efecto de dichos agentes, compuestos o señales químicas sobre dicha levadura microbiana manipulada según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 21, con el efecto de los mismos sobre la levadura microbiana manipulada que es deficiente en la expresión de dicha tau o que es deficiente en la expresión de una proteína fosfatasa que modula la fosforilación de dicha tau.

29. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, que comprende además el uso de anticuerpos, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, o un Fab del mismo capaz de unirse selectivamente a tau fosforilada o no fosforilada.

30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, para el cribado de una serie de agentes, compuestos o señales químicas que se unen a y modulan la actividad de las quinasas y fosfatasas que modulan la fosforilación de dicha tau.

31. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, para el cribado de una serie de agentes, compuestos o señales químicas por la unión a cualquiera de las proteínas quinasas del grupo que consiste en AGC quinasa, una quinasa activada por mitógeno, una glicógeno sintasa quinasa, una quinasa cdk5, una quinasa cdc2, otra quinasa dirigida a prolina del cerebro, una quinasa MEK, una quinasa RAS y una quinasa GEF o una proteína homóloga con una función de proteína quinasa, y por la modulación de la actividad de cualquiera de las mismas, o para el cribado de una serie de agentes, compuestos o señales químicas por la unión a cualquiera de las proteínas fosfatasas del grupo que consiste en fosfatasas PP1, fosfatasas PP2A o fosfatasas del tipo PP2A, fosfatasas PP2B, fosfatasas PP2C u otras proteínas con una función de proteína fosfatasa, y por la modulación de la actividad de cualquiera de las mismas.

32. Procedimiento de cribado de una serie de agentes, compuestos o señales químicas por su actividad que modulan directa o indirectamente la fosforilación, función o solubilidad de tau, que comprende a) el cultivo, crecimiento o suspensión de la levadura microbiana manipulada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 en un medio apropiado, b) la adición de un compuesto o señal química de prueba a dicha levadura microbiana manipulada o su medio, c) la detección o cuantificación de un proceso biológico o morfogenético celular específico en la levadura resultante de dicha modulación.

33. Procedimiento según la reivindicación 32, en la que dichos procesos biológicos o morfogenéticos celulares específicos comprenden la formación de haces mitóticos, la formación de pseudohifas, la formación de puntos de cicatrización, el tamaño celular, metabolismo celular, supervivencia celular o crecimiento celular en condiciones definidas.

34. Procedimiento para identificar un antagonista que se une y modula la actividad de una quinasa endógena de levadura que modula la fosforilación de dicha tau utilizando el procedimiento de cribado según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33.

35. Procedimiento para identificar la relación estructura-función de proteínas tau mutantes fosforiladas, en el que el procedimiento implica a) el cultivo, crecimiento o suspensión de la levadura microbiana manipulada según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque expresa una proteína tau mutante y una proteína quinasa en un medio apropiado, b) el cultivo, crecimiento o suspensión de la levadura microbiana manipulada según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque expresa dicha proteína tau mutante pero es defectuosa en un gen que codifica para una proteína quinasa en un medio adecuado, c) la comparación de procesos biológicos específicos de dicha quinasa eficaz y la levadura microbiana manipulada defectuosa en la quinasa.

36. Procedimiento para identificar la relación estructura-función de proteínas tau mutantes fosforiladas, en el que el procedimiento implica a) el cultivo, crecimiento o suspensión de la levadura microbiana manipulada según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque expresa una proteína tau mutante y una proteína fosfatasa en un medio apropiado, b) el cultivo, crecimiento o suspensión de la levadura microbiana manipulada según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque expresa dicha proteína tau mutante pero es defectuosa en un gen que codifica para una proteína fosfatasa en un medio adecuado, c) la comparación de procesos biológicos específicos de dicha fosfatasa eficaz y la levadura microbiana manipulada defectuosa en la fosfatasa.

37. Uso según la reivindicación 23, en el que dicha bioquímica de tau se refiere a la agregación de tau y/o la interacción de microtúbulos de tau.