BR112013004850B1 - uso de um antagonista do tgf-b na preparação de um medicamento para tratamento de infarto do miocárdio - Google Patents

Abstract

tratamento de infarto do miocárdio usando antagonistas tgf-beta. a presente invenção refere-se a um método de tratamento de um paciente que sofre de um infarte do miocárdio, particularmente infarte do miocárdio agudo, ou de reduzir a consequência adversa de um infarte do miocárdio em um paciente, compreendendo a administração de um antagonista do tgf-<225> para o paciente durante a fase aguda de infarto do miocárdio.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USO DE UM ANTAGONISTA DO TGF-Β NA PREPARAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA TRATAMENTO DE INFARTO DO MIOCÁRDIO. ANTECEDENTE DA TÉCNICA

Campo da Descrição [001] A presente invenção refere-se a métodos de redução de consequências adversas de infarte do miocárdio.

Descrição da Técnica Relacionada [002] Os problemas e as consequências para a saúde de doenças do coração são profundos. A doença do coração é a principal causa de morte para homens e mulheres nos Estados Unidos. (Kung HC, Hoyert DL, Xu J, Murphy SL Deaths : final data for 2005. National Vitas Statistics Reports 2008; 56 (10)). A cada 34 segundos uma pessoa morre de doença do coração nos Estados Unidos. Mais de 2.500 americanos morrem de doenças do coração a cada dia. Em 2005, 652.091 pessoas morreram de doença do coração (50,5 % de mulheres). Este foi de 27,1 % de todas as mortes nos Estados Unidos. A doença do coração é a principal causa de morte para os índios americanos e nativos do Alasca, negros, hispânicos e brancos. Para os asiáticos e das ilhas do Pacífico, o câncer é a principal causa de morte (representando

27,5 % de todas as mortes), as doenças do coração está bem perto do segundo lugar (25,0 %). (CDC. Deaths : leading causes for 2004. National Vitas Statistics Reports 2007 : ; 56 (5)). Quase 6 milhões de internações por ano (nos Estados Unidos) são devido a doença cardiovascular.

[003] Em 2009, a doença do coração é projetada para custar mais de 304,6 bilhões dólares, incluindo serviços de saúde, medicamentos e perda de produtividade. (Associação Americana do Coração : Heart Disease and Stroke Statistics - 2009 Update Dallas; AHA :. 2009 Comissão de Estatística e Subcomissão de Estatísticas de Der

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2/87 rame 15 de dezembro de 2008 ). No mundo, a doença coronária matou mais de 7,6 milhões de pessoas em 2005. (Organização Mundial da Saúde. The Global Burden of Disease : 2004 Update Genebra; OMS : 2008) Em 2003, aproximadamente, 37 % dos adultos relataram ter dois ou mais dos seis fatores de risco para doença do coração e acidente vascular cerebral (pressão arterial alta, colesterol elevado , diabetes, tabagismo, sedentarismo e obesidade). (Hayes DK, et al, Disparities in multiple risks for heart disease and storke, 2003 MMW, 2005; 54 : 113 a 116).

[004] O infarto do miocárdio (MI) é a morte do tecido do coração causada pela isquemia. O termo isquemia refere-se à deficiência de locais de fornecimento de sangue, geralmente produzido por meio da vasoconstrição ou obstáculos locais ao fluxo sanguíneo. A restauração do fluxo de sangue para um tecido ou órgão isquêmico anteriormente, tais como o coração é chamado de reperfusão.

[005] O infarte agudo do miocárdio (AMI), ou um ataque do coração, ocorre quando a isquemia miocárdica localizada causa o desenvolvimento de uma região definida de morte do tecido. AMI é mais frequentemente causado por meio da ruptura de uma lesão aterosclerótica em uma artéria coronária. Isto provoca a formação de um trombo que se coneta a artéria, impedindo-a do fornecimento de sangue para a região do coração que fornece.

[006] A isquemia grave e prolongada produz uma zona de necrose abrangendo toda a espessura da parede miocárdica. Tal infarto transmural geralmente provoca uma elevação do segmento ST. A isquemia menos severa e prolongada pode surgir quando a oclusão coronária é seguida por meio da reperfusão espontânea; uma artéria relacionada ao infarto não é completamente ocluída; a oclusão é completa, mas um suprimento de sangue existente colateral impede a isquemia completa, ou a demanda de oxigênio na zona afetada do mio

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3/87 cárdio é menor. Sob estas condições, a zona necrótica pode ser limitada principalmente ao subendocárdio, causando tipicamente elevação do segmento não-ST MI.

[007] Ambas as regiões infartadas e as regiões do miocárdio não afetadas sofrem de alterações progressivas por horas, dias e semanas após um evento isquêmico. Este processo de evolução de pós-infarto do miocárdio leva à ocorrência de alterações características previsíveis em momentos após o evento inicial. A isquemia aguda provoca uma perda imediata de contração do miocárdio comprometido, uma condição denominada hipocinesia. A necrose começa a desenvolverse a cerca de 15 a 30 min do subendocárdio após o início da isquemia aguda. A região necrótica cresce para fora para o epicárdio sobre as próximas 3 a 6 h, eventualmente abrangendo a parede do ventrículo inteiro. Nas extremidades do infarte, o miocárdio pode ser atordoado (reversivelmente danificado) e, eventualmente, recuperar se o fluxo sanguíneo for restaurado. A contração do miocárdio restantes viável aumenta o processo denominado hipercinesia.

[008] A progressão das alterações celulares, histológicas e brutas desenvolver dentro do infarto. As alterações na aparência macroscópica de tecido infartado não são evidentes por pelo menos 6 h após o início da morte das células. No entanto, a bioquímica celular e a ultraestrutura começam a apresentar anormalidades dentro de 20 min. O dano celular é progressivo, se tornando cada vez mais irreversível cada vez mais durante cerca de 12 h.

[009] Entre 4 e 12 h após a morte das células começar, o miocárdio infartado começa a sofrer necrose de coagulação, um processo caracterizado por meio do inchaço celular, a desagregação dos organelos e a desnaturação da proteína. Após cerca de 18 horas, os neutrófilas (linfócitos fagocíticos) conduzem ao infarto. Os seus números atingem um pico, após cerca de 5 dias, e depois passam a declinar.

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Após 3 a 4 dias, o tecido de granulação é exibido nas bordas da zona de infarte. Este é composto por macrófagos, fibroblastos (que estabelecem o tecido da cicatriz), e novos capilares. O miocárdio infartado é especialmente suave entre 4 e 7 dias, e é, portanto, maximamente propenso à ruptura. À medida que o tecido de granulação migra para dentro em direção ao centro do infarte durante várias semanas, o tecido necrótico é engolido e digerido pelos macrófagos. O tecido de granulação, depois, progressivamente amadurece, com o aumento de tecido conjuntivo (cicatricial) e perda de capilares. Após 2 a 3 meses, o infarto foi curado, deixando uma região sem contração dada parede ventricular, que é diluída, firme e cinza pálido.

[0010] As alterações morfológicas microscópicas evoluem ao longo do tempo da seguinte forma : fibras miocárdicas onduladas aparecem 1 a 3 horas após o início da isquemia. Um defeito com a coloração de tetrazólio ou corante fucsina básica aparece 2 a 3 horas após o início da isquemia. A necrose de coagulação, com perda de estrias transversais, bandas de contração, edema, hemorragia, e no início de infiltrado neutrofílico aparece 4 a 12 horas após o início da isquemia. A necrose de coagulação contínua, picnose dos núcleos, e as bandas de contração marginais são aparentes 18 a 24 horas após o início da isquemia. A perda total de núcleos e estrias com infiltração neutrofílica pesada aparece 24 a 72 horas após o início da isquemia. A infiltração de macrófagos e de células mononucleares, e, a resposta fibrovascular começa 3 a 7 dias após o início da isquemia. A resposta fibrovascular do tecido de granulação proeminente é aparente 10 a 21 dias após o início da isquemia. A fibrose é evidente sete semanas ou mais cedo, após um episódio isquêmico.

[0011] As complicações podem incluir : arritmias e defeitos de condução, extensão de infarto ou re-infarto, insuficiência cardíaca congestiva, choque cardiogênico, pericardite, trombose mural com

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5/87 possível embolização, ruptura de parede miocárdica com possível tamponamento, ruptura de músculo papilar com possível insuficiência valvular, e formação de aneurisma ventricular.

SUMÁRIO [0012] A presente invenção refere-se a um método para reduzir a consequência adversa do infarte do miocárdio em um paciente, compreendendo a administração de um antagonista do TGF-β para o paciente durante a fase aguda do infarte do miocárdio. Em algumas modalidades, o infarte do miocárdio é um infarte agudo do miocárdio. A administração do antagonista do TGF-β pode ser iniciada dentro de 120 horas após o início da isquemia miocárdica aguda. Em várias modalidades, a administração do antagonista do TGF-β é iniciada no prazo de cerca de 72 horas, dentro de aproximadamente 48 horas, dentro de aproximadamente 24 horas, ou no prazo de cerca de 12 horas após o início da isquemia miocárdica aguda. A administração do antagonista do TGF-β pode ser iniciada antes de macrófagos substancial e infiltração mononuclear de tecido afetado pela infarte do miocárdio. Em algumas modalidades, a administração do antagonista do TGF-β é iniciada durante um período caracterizado por meio da infiltração neutrofílica do tecido afetado pelo infarte do miocárdio. Em outras modalidades, a administração do antagonista do TGF-β é iniciado durante um período caracterizado por necrose do tecido afetado pelo infarte do miocárdio. Geralmente, o paciente pode ser um ser humano ou um mamífero não humano.

[0013] Em algumas modalidades, o antagonista do TGF-β pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em : (i) um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a uma ou mais isoformas de TGF-β, (ii) um receptor de TGF-β ou fragmento solúvel do mesmo, (iii) um fragmento de anticorpo ou anticorpo que se liga especificamente a um ou mais receptores de TGF-β, e (iv) um oligonuPetição 870190105384, de 18/10/2019, pág. 14/103

6/87 cleotídeo RNA interferente ou antisentido.

[0014] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de um composto que é capaz de, seletivamente, restaurar a função desejável de TGF-β ao paciente. Por exemplo, um composto capaz de, seletivamente, restaurar a função desejável de TGF-β pode ser um fármaco anti-inflamatório, ou um antagonista de TNF-α. Em algumas modalidades, o método pode incluir a administração de um inibidor de ACE para o paciente. O inibidor da ACE pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em benazepril, captopril, fosinopril, moexipril, perindopril, quinapril, transdolapril, lisinopril, enalapril e ramparil. Em outras modalidades, o método pode ainda compreender a administração de um antagonista do receptor da angiotensina II para o paciente. O antagonista do receptor de angiotensina II pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em eprosartan, telmisartan, losartan, irbesartan, olmesartan, candesartan, e valsartan.

[0015] O antagonista TGF-β pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a uma ou mais isoformas de TGF-β e podem neutralizar uma ou mais das TGF-β! TGF- β2 e TGFβ3 humanas. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender um domínio VH PET1073G12 (SEQ ID NO : 2), com um máximo de 5 mutações, ou uma porção de ligação ao antigênio do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende um domínio VH PET1074B9 (SEQ ID NO : 12) com até 5 mutações, ou uma porção de ligação ao antigênio do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende um domínio VH PET1287A10 (SEQ ID NO : 22) com até 5 mutações, ou uma porção de ligação ao antigênio do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende o domínio PET1073G12 VL (SEQ ID NO : 7), com um máximo de 5 mutações, ou uma porção de ligação ao antigênio do

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7/87 mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende o domínio PET1074B9 VL (SEQ ID NO : 17) com até 5 mutações, ou uma porção de ligação ao antigênio do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende o domínio VL PET1287A10 (SEQ ID NO : 27) com um máximo de 5 mutações, ou uma porção de ligação ao antigênio do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende o domínio VH 1073G12 PET (SEQ ID NO : 2), e o Domínio VL 1073G12 PET (SEQ ID NO : 7). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende o domínio VH PET 1074B9 (SEQ ID NO : 12) e o Domínio VL 1074B9 PET (SEQ ID NO : 17). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende o domínio VH 1287A10 PET (SEQ ID NO : 22) e o PET 1287A10 domínio VL (SEQ ID NO : 27). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende um conjunto de CDRs (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), em que o referido HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 15 e SEQ ID NO : 25. Em algumas modalidades, a HCDR1, HCDR2 e HCDR3 do domínio VH está dentro de uma estrutura de cadeia pesada da linha germinal. Em algumas modalidades, a HCDR1, HCDR2 e HCDR3 do domínio VH está dentro de uma estrutura que compreende até 12 mutações da sequência de aminoácido germinativa. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende um conjunto de CDRs (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que o referido LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 20 e SEQ ID NO : 30. Em algumas modalidades, a LCDR1, LCDR2 e LCDR3 estão dentro de uma estrutura de cadeia pesada da linha germinal. Em algumas modalidades, as LCDR1, LCDR2 e LCDR3 estão dentro de uma estrutura que comprePetição 870190105384, de 18/10/2019, pág. 16/103

8/87 ende até 5 mutações de sequência de aminoácido germinativa.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0016] A FIGURA 1 mostra uma redução na fibrose com a administração de 1D11-D3 e 1D11D-5 e 13C4.

[0017] A FIGURA 2 mostra o espessamento da parede anterior e o espessamento da parede posterior em uma análise ecocardiograma.

[0018] A FIGURA 3 mostra uma pontuação movimento regional de parede em uma análise ecocardiograma.

[0019] A FIGURA 4 mostra a redução na fibrose com a administração de 1D11 e 13C4.

[0020] A FIGURA 5 mostra espessamento da parede anterior e espessamento da parede posterior em uma análise ecocardiograma para grupos tratados 13C4-1D11-D0, D0, 13C4-D1, 1D11-D1, D5 e 13C4-1D11-D5.

[0021] A FIGURA 6 mostra uma pontuação movimento regional de parede em uma análise ecocardiograma para o veículo, grupos tratados 13C4 - D0, 1D11 - D0, 13C4 - D1, 1D11 - D1, D5 e 13C4 - 1D11 D5.

[0022] A FIGURA 7 mostra o volume da cicatriz VE, em comparação com os grupos tratados com veículo .

[0023] A A figura 8 mostra o número de células TUNEL positivas na área adjacente à cicatriz.

[0024] A FIGURA 9 mostra a fração de ejeção do ventrículo esquerdo (LVEF), medida a 4 semanas após a oclusão da artéria coronária / reperfusão da artéria coronária (CAO / CAR).

[0025] A figura 10 mostra a LVEF medida em 2 a 4 semanas após CAO / CAR.

[0026] A FIGURA 11 mostra tempo de relaxamento isovolumétrico LV.

[0027] A FIGURA 12 mostra o espessamento da parede regioPetição 870190105384, de 18/10/2019, pág. 17/103

9/87 nais, em comparação com veículo.

[0028] AFIGURA 13 mostra as encostas da relação pressãovolume LV-final diastólica.

[0029] A FIGURA 14 mostra a redução na fibrose do VE com a administração de 1D11, em doses de 1 e 5 mg / kg de duas formulações diferentes.

[0030] A FIGURA 15 mostra uma redução na fibrose com na área em risco com a administração de 1D11, em doses de 1 e 5 mg / kg de duas formulações diferentes.

[0031] A FIGURA 16 mostra um aumento de miocárdio na área em risco com a administração de 1D11, em doses de 1 e 5 mg / kg de duas formulações diferentes .

[0032] A FIGURA 17 mostra o resultado de movimento de parede regional, em uma análise de ecocardiograma para veículo, 13C4 e 1D11 de 1 e 5 mg / kg de ambas as formulações.

[0033] A FIGURA 18 mostra a dose dos níveis séricos dependente de 1D11 administração IV seguinte do anticorpo.

[0034] A FIGURA 19 mostra as reduções em osteopontina sérica com a administração de pós 1D11 I / R.

[0035] A FIGURA 20 mostra a indução de TGF-β 1 seguinte IR e dependente da dose mediada por meio da redução de 1D11 de TGF-β de uma sequência de I / R.

[0036] A FIGURA 21 mostra a indução de TGF-β 2 IR seguinte e dependente da dose mediada por meio da redução 1D11 de TGF-β 21 após I / R.

[0037] A figura 22 mostra a indução de TGF-β 3 seguinte IR e dependente da dose mediada por meio da redução 1D11 de TGF-b □ após I / R.

[0038] A figura 23 mostra a indução de colégeno 3 seguindo IR e dependente da dose mediada por meio da redução 1D11 de colágeno

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10/87 após I / R.

[0039] A figura 24 mostra a indução da endotelina-1 IR seguinte e dependente da dose mediada por meio da redução 1D11 de endotelina-1 na sequência de I / R.

[0040] A figura 25 mostra a indução de ativador de plaminogeno inibidor -1 IR seguinte e dependente da dose mediada por meio da redução 1D11 do ativador de plaminogeno do inibidor-1 após I / R.

[0041] A figura 26 mostra a indução de Snail1 IR seguinte e dependente da dose mediada por meio da redução 1D11 de Snail1 após I / R.

[0042] A figura 27 mostra a indução de Snail2 IR e dependente da dose mediada por meio da redução 1D11 de Snail2 após I / R.

[0043] A figura 28 mostra a indução de α-atina de músculo liso na sequência IR e dependente da dose mediada por meio da redução 1D11 de α-atina de músculo liso após I / R.

[0044] A figura 29 mostra a indução de IR na sequência de fibronectina e dependente da dose mediada por meio da redução 1D11 de fibronectina após I / R.

[0045] A figura 30 mostra o efeito da administração de 5 mg / kg 1D11 sobre a expressão da proteína Bax.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0046] Depois de um MI, ou ataque do coração, o coração começa a reparar em si mesmo. Este processo de reparo do coração pode ser separado em fases que se sobrepõem. A primeira fase é conhecida como a fase inflamatória. Após a fase inflamatória é a fase proliferativa. Por fim, a fase de maturação é a última fase de reparo do coração. (Bujak, M. e Frangogiannis, NG Cariovasc Res. 74 : 184 a 195 (2007)).

[0047] Imediatamente após um ataque de coração, a fase inflamatória é caracterizada por morte de cardiomiócitos, opor meio da indução de citocinas e quimiocinas, e um influxo de células inflamatórias

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11/87 para limpar o tecido morto. Durante a fase proliferativa, há supressão de mediadores inflamatórios, bem como um influxo de células que contribuem para a formação de fibras de tecido conjuntivo, fibroblastos e células endoteliais para a área infartada. Os fibroblastos secretam a matriz extra-celular. As células endoteliais contribuem para a formação de uma rede microvascular dentro do tecido conjuntivo em desenvolvimento solto fibroso, ou tecido de granulação. As células inflamatórias infiltradas, em seguida, começam a sofrer morte celular, ou o que é conhecido como apoptose. Finalmente, durante a fase de maturação do tecido de granulação, a fase proliferativa organiza e amadurece em uma cicatriz de tecido conectivo fibroso denso. Esta remodelação da resposta fibrótica no miocárdio pode ser prolongada. Em geral, a fase inflamatória ocorre a partir do tempo de infarte para 1 a 7 dias pós-MI. A fase proliferativa ocorre a partir de cerca de 5 a 14 dias pós-MI. Finalmente, a fase de maturação é iniciada a partir de aproximadamente 10 a 14 dias pós-MI e continua enquanto houver a remodelação cardíaca.

[0048] TGF-β é induzida no miocárdio infartado e participa de todas as fases de reparo pós-MI, que tem tentativas complicadas no que diz respeito a definir o papel desta citocina na reparação cardíaca. Dessa maneira, o papel exato do TGF-β no reparo do coração após um MI não foi bem compreendido. TGF-β é uma citocina multifuncional originalmente denominado pela sua capacidade de transformar os fibroblastos normais de células capazes de crescimento independente de ancoragem. Existem pelo menos cinco formas de TGF-β atualmente identificadas : TGF-β! TGF-βΣ, TGF-βδ, TGF^4 e TGF^5. É possível purificar esta família de TGF- βs de várias espécies incluindo os seres humanos, camundongos, macacos verdes, porcos, vacas, pintos, e rãs. É também possível purificar esta família de TGF-Ps a partir de fontes diversas, incluindo o corpo do osso, plaquetas ou placenta,

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12/87 para a sua produção em cultura de células recombinantes e para a determinação da sua atividade.

[0049] Em seres humanos, três isoformas, TGF-p1, TGF-p2 e TGF-βδ, são conhecidas. (números de adesão Suíços Prot P001137, P08112 e P10600 (respectivamente)). No seu estado biologicamente ativo, estes três isoformas são homodímeros de 25 kDa que compreendem dois 112 monômeros de aminoácidos ligados por meio de uma ponte de dissulfureto inter-cadeia. TGF^1 difere do TGF^2 por 27 aminoácidos, e a partir de TGF^3 por 22 aminoácidos. As diferenças são sobretudo as alterações de aminoácidos conservativas. A estrutura tridimensional do TGF-β tem sido determinada por meio da cristalografia de raios X e as regiões de ligação ao receptor foram definidas. Tanto TGF-Ps humana quanto TGF-ps de camundongo são semelhantes. O TGF^1 humano tem uma diferença de aminoácidos a partir de um camundongo TGF-βΕ TGF^2 Humana tem apenas uma diferença de três aminoácidos de TGF^2 de camundongo, e TGF^3 humana e de camundongo são idênticas.

[0050] O termo TGF-β ou fator de crescimento transformante beta- refere-se à família de moléculas que têm sido descrita ou ao comprimento total, a sequência de aminoácidos nativa de qualquer uma das isoformas TGF- β humanas. Estes incluem as formas latentes (latente de TGF-β) e complexo associado ou não associado de precursores e de TGF-β. Referência a tal TGF-β será entendido como uma referência a qualquer uma das formas actualmente identificadas, incluindo TGF-β^ TGF^2, TGF^3, TGF^4, e TGF^5 e as versões latentes dos mesmos, bem como para as espécies TGF-β humanas identificadas no futuro, incluindo polipeptídeos derivados da sequência de qualquer TGF-β conhecido e sendo pelo menos cerca de 75 %, de preferência pelo menos cerca de 80 %, mais preferivelmente pelo menos cerca de 85 %, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de

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13/87 %, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95 % de homologia com a sequência. Os termos específicos TGF-βΓ, TGF-p2, e TGF-β3, bem como TGF-β4 e TGF^, referem-se aos TGF-ps definidos na literatura (por exemplo, Derynck et al., Nature, supra, Seyedin et al., J. Biol. Chem., 262, supra, e DeMartin et al., supra). O termo TGF-β refere-se ao gene que codifica o TGF-β humano.

[0051] Os membros da família TGF-β são proteínas que têm nove resíduos cisteína na porção madura da molécula, partilham pelo menos 65 % de homologia com outras sequências TGF-β conhecidas na região madura, e pode competir para o mesmo receptor . Além disso, todos eles parecem ser codificados como um precursor maior que partilha uma região de elevada homologia, perto da extremidade terminal N e mostra conservação de três resíduos cisteína na porção do precursor que será mais tarde removida por meio do processamento. Os membros da família TGF-β também parecem ter um local de processamento de quatro ou cinco aminoácidos.

[0052] Um aumento no nível de atividade TGF-β está envolvido em um grande número de condições patológicas, incluindo, mas não limitado a, o seguinte : (i) a fibrose, formação de cicatrizes, e a adesão durante a cicatrização de feridas, (ii) doenças fibróticas do coração, pulmões, fígado, rins e, (iii) a aterosclerose e arteriosclerose, (iv) alguns tipos de câncer, incluindo o câncer da próstata, tumor neuroendócrino do sistema digestivo, o câncer do colo do útero, glioblastomas e câncer gástrico; (v) a angiopatia, vasculopatia, nefropatia, (vi) a esclerose sistémica, (vii) a infecção viral, tais como a hepatite C e HIV, e (viii) doenças imunológicas e inflamatórias e deficiências, tais como a artrite reumatóide.

[0053] Os estudos iniciais sobre o papel do TGF-β em dano do coração que indicam um papel protetor ocorre na primeira fase ou na fase inflamatórias de reparo cardíaco pós-MI. Nestes estudos iniciais,

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TGF-β foi administrado em modelos de lesão isquêmica do miocárdio dentro de algumas horas após a lesão isquêmica. Lefer mostrou em corações isolados de camundongos que a administração de TGF-β antes, ou imediatamente após a lesão isquêmica cardíaca reduziu o superóxido na circulação coronária, mantendo o relaxamento dependente do endotélio coronário, redução de lesão mediada por fator de necrose exógeno do tumor (TNF), e impediu a grave lesão cardíaca. (Lefer, et al. Science, 249 : 61, 1990). Lefer e colegas passaram a provar que a função endotelial TGF-β preservada, particularmente pela manutenção do derivado do endotélio fator de relaxamento (EDRF mas conhecida agora como o óxido nítrico ou NO) tem a formação pelo endotélio. (Lefer, AM Biochem Pharmacol 42 : 1323 a 1327, 1991). Outros estudos com cardiomiócitos isolados ou preparações de coração isolado mais elucidados mostram os mecanismos de cardioproteção de TGF-β mediada.

[0054] Keller et al. (Journal of Cardiovascular Pharmacology, 30 : 197 a 204, 1997) mostrou que, em modelos caninos do coraçãos I / R quando TGF-β foi administrado 30 minutos antes da isquemia / reperfusão, houve uma redução de 50 % no índice de proteína de vazamento (PLI) na zona de infarte imediatamente após a reperfusão, em comparação com controles não tratados. No entanto, qualquer melhoria na PLI foi observada 48 horas pós-reperfusão. Além disso, o TGF-β não melhorou o relaxamento dependente do endotélio em 1 hora ou 48 horas pós-reperfusão dos cães. Estes resultados sugerem que o TGF-β pode evitar o aumento da permeabilidade vascular coronária no início da reperfusão, mas ele pode não evitar posterior lesão vascular coronária. (Keller et al., J Cardiovasc Pharmcol. 30 : 197 a 204, 1997). [0055] Mais recentemente, o papel do TGF-β na reparação de MI foi investigado, utilizando antagonistas do receptor de TGF-β para interromper a sinalização TGF-β. em um estudo, Ikeuchi et al. (Cardio

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15/87 vascular Research, 64 : 526 a 35, 2004) bloqueou a sinalização TGF-β no momento de MI por meio da injeção intramuscular de um plasmídeo que codifica o domínio extracelular do receptor TGF-β tipo II ^IIR) em camundongos 7 dias antes da MI . Eles observaram um aumento da mortalidade durante as 24 horas após o IM, aumentam a inflamação, o aumento da dilatação do ventrículo esquerdo (VE) e disfunção contrátil apesar de nenhum aumento da dimensão do infarte, em comparação com camundongos não tratados. Para bloquear o TGF-β em um estágio posterior pós-infarto, os camundongos receberam injeções intramusculares de TβIIR em qualquer 0 dia ou no dia 7 após o IM. Quatro semanas após o IM, o tratamento TβIIR impediu dilatação LV, disfunção contrátil, hipertrofia dos cardiomiócitos e fibrose intersticial no infarto do miocárdio. TGF-β foi benéfico na fase inicial, mas os benefícios foram perdidos com a expressão sustentada, levando a remodelação do VE e insuficiência.

[0056] Em um outro estudo, Okada et al (Circulation, 11 : 2430 a 37, 2005), injetou por via intramuscular camundongos com um adenovírus que codifica um receptor solúvel TGF-β tipo II (Ad.CAGsTβRII) 3 dias pós-MI. Em camundongos tratados pós-MI, a sobrevivência foi significativamente melhorada. Isto foi acompanhado por meio da atenuação significativa da dilatação ventricular e da função cardíaca melhorada quatro semanas pós-MI. O tamanho MI não diferiu do controle, mas a espessura MI e circunferência foram menores nos animais tratados. Apoptose entre miofibroblastos da área de infarto foi menos frequente nos animais tratados. A administração de Ad.CAG-sTβRII às 4 semanas pós-MI foi ineficaz. Okada et al. considerou que uma janela crítica para a inibição de TGF-β ocorreu depois de três dias antes e quatro semanas. A injeção em seu estudo foi propositadamente feito em um momento em que se considerou que o tratamento não afetaria a morte isquêmica aguda de cardiomiócitos. Okada et al., acreditam

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16/87 que a inibição do TGF-β durante a fase aguda do MI é considerada prejudicial.

[0057] Após estes estudos, o antagonismo do TGF-β utilizando um anticorpo antagonista eficaz contra TGF-β 1, 2 e 3, foi investigado em reparação MI. Frantz et al (Pesquisa Básica em Cardiologia, 103 : 485 a 502, 2008) administrou o anticorpo antagonista do TGF-β ou um anticorpo de controle negativo, a camundongos, quer a partir de 7 dias antes da, ou 5 dias após a indução de MI por meio da ligadura da artéria coronária. Os anticorpos foram administrados a cada dois dias durante toda a duração de 8 semanas do estudo. A mortalidade foi significativamente maior nos grupos que receberam o anticorpo anti-TGF-β. Além disso, ambos os grupos de anticorpos anti-TGF-β tratados demonstrou a dilatação ventricular esquerda aumentada. Estes autores concluíram que o tratamento anti-TGF-β antes ou após a ligação da artéria coronária aumenta a mortalidade e piora a remodelação ventricular esquerda. Os autores sugerem que as diferenças na duração de antagonistas TGF-β e da concentração de antagonistas TGF-β podem ser responsáveis pela diferença nos resultados entre o estudo e os relatados por Ikeuchi et al (2004) e Okada et al (2005).

[0058] A presente invenção refere-se a um método de tratamento de um paciente que sofre de infarte do miocárdio, particularmente infarte agudo do miocárdio, ou de reduzir a consequência adversa do infarte do miocárdio em um paciente, compreendendo o método à administração de um antagonista do TGF-β para o paciente durante a fase aguda do infarto do miocárdio. A descoberta de que a administração do antagonista do TGF-β pode ser vantajosamente iniciada em uma altura inferior a 120 horas após o início da isquemia miocárdica aguda é surpreendente. Em alguns casos, os métodos descritos na presente invenção contemplam que a administração do antagonista do TGF-β pode ser iniciada dentro de cerca de 72 horas, dentro de apro

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17/87 ximadamente 48 horas, dentro de aproximadamente 24 horas, ou no prazo de cerca de 12 horas após o início da isquemia miocárdica aguda. Geralmente, nos métodos descritos na presente invenção, um antagonista do TGF-β é administrado durante a fase aguda da MI. A administração do antagonista do TGF-β pode ser iniciada antes de macrófagos substancial e da infiltração mononuclear de tecido afetado pela infarte do miocárdio. Em algumas modalidades, a administração do antagonista do TGF-β é iniciada durante um período caracterizado por meio da infiltração neutrofílica do tecido afetado pelo infarte do miocárdio. Em outras modalidades, a administração do antagonista do TGF-β é iniciada durante um período caracterizado por meio da necrose do tecido afetado pelo infarte do miocárdio.

[0059] O termo Tratamento refere-se tanto a tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio tratável, bem como aqueles nos quais o distúrbio é para ser prevenido. Tratamento pode ou pode não incluir uma cura completa ou a recuperação da função normal. O tratamento pode também incluir melhoria dos sintomas indesejáveis e / ou uma redução na consequências adversas de uma distúrbio. Um mamífero pode ser qualquer animal classificado como mamífero, incluindo os seres humanos, animais domésticos e de quintal e de zoológico, ou animais de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc, de preferência, o mamífero é um primata, tal como um macaco, ou seres humanos, por exemplo. A quantidade eficaz refere-se a uma quantidade de um fármaco eficaz para tratar uma doença ou distúrbio em um mamífero.

[0060] Apesar de certas funções de TGF-β poderem ser desejadas na fase inicial pós-MI, o antagonismo do TGF durante o período agudo e mais além pode resultar na remodelação e função cardíaca melhorada. No entanto, quando se deseja recuperar uma ou mais funções

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18/87 selecionadas de TGF-β, pode-se desejar co-administrar com um antagonista do TGF-β, outro composto que seja capaz de, seletivamente, restaurar a função desejável de TGF-β. Por exemplo, um composto capaz de, seletivamente, restaurar a função desejável de TGF-β pode ser um fármaco anti-inflamatóri, ou um antagonista de TNF-α. Também pode ser desejável a co-administração de um outro tratamento, por exemplo, o método pode incluir a administração de um inibidor de ACE para o paciente. O inibidor da ACE pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em benazepril, captopril, fosinopril, moexipril, perindopril, quinapril, transdolapril, lisinopril, enalapril e ramparil. Em outras modalidades, o método pode ainda compreender a administração de um antagonista do receptor da angiotensina II para o paciente. O antagonista do receptor de angiotensina II pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em eprosartan, telmisartan, losartan, irbesartan, olmesartan, candesartan, e valsartan.

[0061] Os anticorpos neutralizantes podem ser utilizados como antagonistas de TGF-β. Um anticorpo é uma imunoglobulina natural ou total ou parcialmente produzida sinteticamente. O termo cobre também qualquer polipeptídeo ou proteína que compreende um domínio de ligação ao antigênio de um anticorpo. Os fragmentos de anticorpo que compreendem um domínio de ligação ao antigênio são moléculas, tais como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd e diacorpos. O termo anticorpo é utilizado no sentido mais lato e abrange especificamente os anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada . Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigênico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes

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19/87 determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigênio. Em adição à sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que eles podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador monoclonal indica o carácter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não é para ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por meio do método do primeiro hibridoma descrito por Kohler et al., Nature, 256 : 495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, Patente dos EUA. 4.816.567). Os anticorpos monoclonais podem também ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al, Nature, 352 : 624 a 628 (1991) e Marks et al, J. Mol. Biol. Biol, 222 : 581 a 597 (1991), por exemplo.

[0062] Os Fragmentos de anticorpos compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferivelmente compreendendo a região de ligação ao antigênio ou variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem Fab, Fab ', F (ab') 2, e Fv; diacorpos, anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única, e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo (s). Os termos receptor Fc ou FcR são utilizados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa.

[0063] O termo variável utilizado no contexto de um anticorpo ou fragmento de anticorpo refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem de uma maneira extensiva na sequência entre os anticorpos e são utilizados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para o seu antigênio particular . No entanto, a variabilidade não está uniformemente distribuída ao longo dos domí

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20/87 nios variáveis dos anticorpos. Está concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis tanto na cadeia leve quanto os domínios de cadeia pesada variável. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas as regiões estruturais (FRs). Os domínios variáveis das cadeias pesadas nativas e leve compreendem cada um quatro FRs, em grande parte que adopta uma configuração de folha-β, ligadas por meio de três regiões hipervariáveis, que forma laços conectando e, em alguns casos, fazendo parte da estrutura de folha-β. A região hipervariável, refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antigênio. A região hipervariável compreende geralmente os resíduos de aminoácidos de uma região determinante de complementaridade ou CDR. A Região de estrutura ou FR são aqueles resíduos de resíduos do domínio variável que não os resíduos da região hipervariável tal como definidos na presente invenção.

[0064] Fv é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um antigênio completo de reconhecimento e de ligação ao antigênio local. Esta região consiste em um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em uma firme associação não-covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação ao antigênio na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação ao antigênio ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antigênio) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antigênio, embora com uma menor afinidade do que o local de ligação completo.

[0065] O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab ' diferem dos fragmentos Fab por meio da adição

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21/87 de alguns resíduos no terminal carbóxi da cadeia pesada de domínio CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação usada na presnte invenção para Fab ' em que o resíduo de cisteína (s) dos domínios constantes conterá pelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F (ab ') 2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos.

[0066] As cadeias leves de anticorpos a partir de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, denominados kapa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Os fragmentos de anticorpos Fv de cadeia única ou scFv compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica.

[0067] As formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, roedor) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nos quais os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador), tal como rato, camundongo, coelho , ou um primata não humano possuindo a especificidade, afinidade e capacidade. Em alguns casos, os resíduos da imunoglobulina humana da região de estrutura (FR) são substituídos pelos correspondentes resíduos não humanos. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender os resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo

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22/87 menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as voltas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. (Jones et al, Nature, 321 : 522 a 525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332 : 323 a 329 (1988), e Presta, Curr Op Struct Biol, 2 : 593 a 596 (1992).) [0068] A expressão anticorpo TGF-β refere-se a um anticorpo que se liga a qualquer uma das isoformas de TGF-β, de preferência, a ligação a qualquer TGF^1, TGF^2, ou TGF^3, ou a qualquer combinação dos mesmos, mais de preferência, pelo menos, TGF-βυ ou, pelo menos, TGF^2, e mais preferivelmente de TGF-βυ ou TGF^1 em conjunto com o TGF^2. Opcionalmente, o anticorpo pode ligar-se a, pelo menos, TGF^3.

[0069] Um anticorpo monoclonal neutralizante de camundongo que liga-se as isoformas TGF-βυ TGF^2 e TGF^3 é conhecido como 1D11 e está disponível de R & D Systems (MAB-Catalog No. 1835) de através da ATCC (N ° de Acesso HB 9849 ). Um anticorpo monoclonal de camundongo dirigido contra o TGF^1 humana também está disponível a partir de R & D Systems. Os anticorpos monoclonais neutralizantes de camundongo têm também sido gerados a partir de camundongos imunizados com peptídeos de TGF^1 humanos compreendendo os aminoácidos nas posições 48 a 60 (anticorpo reativo com TGF-βυ TGF^2 e TGF^3) e as posições de aminoácidos 86 a 101 (anticorpo específico para TGF-βν (Hoefer e Anderer, Cancer Immunol Immunother, 41 302 a 308 (1995)). GC1008 é um anticorpo monoclonal humanizado IgG4 que neutraliza todas as isoformas de TGF-β e é adequado para utilização terapêutica em seres humanos.

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23/87 [0070] 1D11 é um murino pan-específico de anticorpo anti-TGF-β camundongo que neutraliza o TGF-β^ TGF^2 e TGF^3 e TGF^1 e TGF^2 humana em uma grande variedade de ensaios in vitro (Patente dos EUA No. 5.571.714, R & D ficha do produto Sistema de MAB1835). Em modelos animais de fibrose, 1D11 tem se mostrado eficaz. No entanto, 1D11 é um anticorpo monoclonal de murino e pode ser inadequado para utilização terapêutica em seres humanos. Dessa maneira,em algumas modalidades, um anticorpo humano ou um anticorpo modificado que compreende elementos de sequências humanas podem ser desejados.

[0071] Em algumas modalidades, métodos de tratamento de MI podem compreender a administração de anticorpos contra TGF-β para tratar a fibrose aguda que está associada com a superprodução de TGF-β em doenças relacionadas a TGF-β. O corpo responde a lesão ou doença por meio dos tecidos de regeneração destruídos. Quando a lesão é prolongada ou extensa, o tecido destruído pode ser substituído por um tecido conjuntivo especializado fibrótico. A deposição de tecido fibrótico pode resultar em uma diminuição do tecido afetado ou na função dos órgãos no paciente. A administração de uma quantidade eficaz de anticorpo anti-TGF-β durante a fase aguda, pode reduzir o desenvolvimento subsequente de fibrose. Além disso, uma quantidade eficaz de anticorpo anti-TGF-β também pode ser administrada durante o período de pós-MI de recuperação que é tipicamente caracterizada por meio da fibrose uma vez que neutraliza a atividade biológica de TGF-β, reduzindo desse modo o desenvolvimento fibrótico.

[0072] Em algumas modalidades, o antagonista TGF-β pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em : (i) um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a uma ou mais isoformas de TGF-β, (ii) um receptor de TGF-β ou fragmento solúvel do mesmo, (iii) um fragmento de anticorpo ou anticorpo que se liga es

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24/87 pecificamente a um ou mais receptores de TGF-β, e (iv) um RNA ou interferente oligonucleotídeo anti-sentido. Os anticorpos Anti-TGF-β que se ligam especificamente e neutralizam a molécula TGF-β são particularmente úteis como antagonistas de TGF-β. Exemplos de tais anticorpos estão descritos na Publicação do Pedido de Patente EUA No. 2006/0251658. Os anticorpos Anti-TGF-β incluem anticorpos específicos para TGF-β, em particular TGF-β humana incluindo os anticorpos específicos que são dirigidos para o TGF-1, TGF β β-2 e TGF-β

3.

[0073] Como os anticorpos podem ser modificados de várias maneiras, a molécula de anticorpo deve ser interpretada como abrangendo qualquer anticorpo ou de uma substância que tem um local de ligação ao antigênio de um anticorpo com a especificidade requerida. Dessa maneira,este termo cobre os fragmentos de anticorpos e derivados, incluindo qualquer polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação ao antigênio, seja natural ou total ou parcialmente sintético. As moléculas quiméricas que compreendem um domínio de ligação ao antigênio de um anticorpo, ou equivalente, fundidas com outro polipeptídeo estão portanto incluídas. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricos estão descritas em EP-A-0120694 e EP-A-0125023, e uma grande quantidade de literatura subsequente. É por isso que, a menos que especificamente limitado, o termo anticorpo anti-TGF-β é amplamente usado na presente invenção para incluir anticorpos completos (por exemplo, IgG, tal como IgG1 ou IgG4), fragmentos de anticorpos (por exemplo, scFv, Fab, dAb), ou moléculas compreendendo um anticorpo anti-TGF-β local de ligação ao antigênio derivado de um anticorpo anti-TGF-β ou componentes dos mesmos.

[0074] Os antagonistas de TGF-β incluem os anticorpos anti-TGFβ monoclonais humanizados possuindo um ou mais resíduos de aminoácidos e introduzindo nele de uma fonte que é não humana. A hu

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25/87 manização pode ser realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al, Nature, 321 : 522 a 525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332 : 323 a 327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239 : 1534 a 1536 (1988)), por meio da substituição de sequências de regiões hipervariáveis por meio das sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos humanizados podem ser anticorpos quiméricos (por exemplo, tal como descrito na Patente dos EUA. 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído por meio da sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos da região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por meio dos resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores.

[0075] De acordo com o assim chamado método de melhor encaixe, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é pesquisada contra toda a biblioteca de domínio variável de sequências humanas conhecidas. A sequência humana que está mais próxima da do roedor é então aceita como a região estrutural humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al, J. Immunol, 151 : 2296 (1993); Chothia et al, J. Mol Biol, 196 : 901 (1987)). Outro método utiliza uma região estrutural particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al, Proc Natl Acad Sci EUA, 89 : 4285 (1992); Presta et al, J. Immunol, 151 : 2623 (1993)).

[0076] De preferência, os anticorpos humanizados conservam uma elevada afinidade para o antigênio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, os anticorpos humanizados podem ser preparados por meio de um processo que compreende a aná

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26/87 lise das sequências progenitoras e vários produtos humanizados conceptuais utilizando os modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Os modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão vulgarmente disponíveis e são familiares para aqueles que são versados na técnica. Os programas de computador estão disponíveis, que ilustram e apresentam prováveis estruturas tridimensionais conformacionais de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antigênio. Desta maneira, os resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir do receptor e das sequências de importação, de modo que a característica desejada do anticorpo, tal como afinidade aumentada para o (s) antigênio (s) alvo, seja alcançada. Em geral, os resíduos da região hipervariável estão diretamente e muito substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antigênio.

[0077] Os anticorpos anti-TGF-β compreendem, tipicamente, o anticorpo dos domínios VH e VL. Os domínios VH e VL são regiões determinantes de complementaridade, CDR, que podem ser compreendidos em diferentes regiões de estrutura, FR, para formar os domínios VH ou VL como seja o caso. Um local de ligação ao antigênio pode ser constituído por meio de um domínio de anticorpo VH e / ou um domínio VL ou por meio das porções de ligação ao antigênio dos mesmos. [0078] Um anticorpo anti-TGF-β pode compreender um conjunto HCDR, um conjunto LCDR, ou ambos, e / ou um anticorpo humano VH domínio, domínio VL, ou ambos.

[0079] Um conjunto de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 podem ter sequências selecionadas dos seguintes conjuntos :

HCDR1 SEQ ID NO : 3, HCDR2 SEQ ID NO : 4, HCDR3

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SEQ ID NO : 5 (referido na presente invenção como o conjunto de HCDRs PET1073G12);

HCDR1 SEQ ID NO : 13, HCDR2 SEQ ID NO : 14, HCDR3 SEQ ID NO : 15 (referido na presente invenção como o conjunto de HCDRs PET1074B9);

HCDR1 SEQ ID NO : 23, HCDR2 SEQ ID NO : 24, HCDR3 SEQ ID NO : 25 (referido na presente invenção como o conjunto de HCDRs PET1287A10).

[0080] Um conjunto de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 podem ter sequências selecionadas dos seguintes conjuntos :

LCDR1 SEQ ID NO : 8, LCDR2 SEQ ID NO : 9, LCDR3 SEQ ID NO : 10 (referido na presente invenção como o conjunto de LCDRs PET1073G12);

LCDR1 SEQ ID NO : 18, LCDR2 SEQ ID NO : 19, LCDR3 SEQ ID NO : 20 (referido na presente invenção como o conjunto de LCDRs PET1074B9);

LCDR1 SEQ ID NO : 28, LCDR2 SEQ ID NO : 29, LCDR3 SEQ ID NO : 30 (referido na presente invenção como o conjunto de LCDRs PET1287A10).

[0081] O conjunto de HCDRs PET1073G12 juntamente com o conjunto de PET1073G12 LCDRS é referido na presente invenção como o conjunto de CDRs PET1073G12. O conjunto de HCDRs PET1074B9 juntamente com o conjunto de PET1074B9 LCDRS é referido na presente invenção como o conjunto de CDRs PET1074B9. O conjunto de HCDRs PET1287A10 juntamente com o conjunto de PET1287A10 LCDRS é referido na presente invenção como o conjunto de CDRs PET1287A10. Um domínio VH compreendendo um conjunto de HCDRs como descrito na presente invenção pode compreender um domínio VL separadamente compreendendo um conjunto de LCDRs como descrito na presente invenção. De preferência um tal domínio

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VH está emparelhado com um tal domínio VL, e mais preferencialmente ainda os pares de domínios VH e VL são os mesmos que nos clones como definidos no presente documento.

[0082] Um domínio VH de um anticorpo anti-TGF-β pode conter um conjunto de HCDRs HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que o conjunto de HCDRs corresponde a que para PET1073G12, PET1074B9 PET1287A10 ou com uma ou duas substituições de aminoácidos.

[0083] Um anticorpo anti-TGF-β pode compreender um domínio VL que compreende um conjunto de LCDRs LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que o conjunto de CDRs corresponde a que para PET1073G12, PET1074B9 PET1287A10 ou com uma ou duas substituições de aminoácidos.

[0084] Seguindo o exemplo de química computacional na aplicação multivariadas das técnicas de análise de dados para a estrutura / propriedade- atividade (Wold, et al Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics--Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed. : B. Kowalski ), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holanda, 1984 (ISBN 90-277-1846-6)) relacionamentos quantitativos da propriedade de atividade de anticorpos podem ser derivados utilizando técnicas bem conhecidas, tais como matemáticos de regressão estatística, reconhecimento de padrões e classificação . (Norman et al, Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience, 3 ^a edição (abril de 1998) ISBN 0471170828; Abraham Kandel, Eric Backer Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR; (11 de maio de 1995), ISBN : 0133418847; Wojtek Krzanowski Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Estatística Ciência Série, n ° 22 (de papel)) Oxford University Press; (Dezembro de 2000), ISBN : . 0198507089; Ian H. Witten, Eibe Frank Data Mining Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (11 de outubro de 1999), ISBN : .. 1558605525; David GT

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Denison (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian Smith FM Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons, (Julho de 2002), ISBN : . 0471490369; Arup K. Ghose, Vellarkad N. Viswanadhan. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8). As propriedades dos anticorpos podem ser derivadas a partir de modelos empíricos e teóricos da sequência de anticorpo, das estruturas funcionais e tridimensionais (por exemplo, a análise de resíduos de contacto ou das propriedades físico-químicas calculadas) e estas propriedades podem ser consideradas isoladamente ou em combinação.

[0085] A análise de anticorpos de estrutura atómica conhecida elucidou as relações entre a sequência e a estrutura tridimensional de locais de ligação de anticorpos (Chothia C. et al Journal Molecular Biology (1992) 227, 799 a 817,. Al-Lazikani, et al . Journal Molecular Biology (1997) 273 (4), 927 a 948). Estas relações implicam que, excepto para a terceira região (loop) em domínios VH, os loops do local de ligação têm uma de um pequeno número de conformações da cadeia principal : estruturas canônicas. A estrutura canônica formada em um loop particular, tem sido mostrada para ser determinada pelo seu tamanho e pela presença de certos resíduos em locais chave tanto na malha quanto nas regiões estruturais (Chothia et al. E Al-Lazikani et al., Supra).

[0086] A relação estrutura-sequência pode ser utilizada para a previsão dos resíduos em um anticorpo de sequência conhecida, mas de uma estrutura tridimensional desconhecida, que são importantes na manutenção da estrutura tridimensional dos loops de CDR e, consequentemente, na manutenção da especificidade de ligação. Estas previsões podem ser confirmadas por meio da comparação das predições para a saída a partir de experiências de optimização de chumbo.

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Em uma abordagem estrutural, um modelo teórico pode ser criado de molécula de anticorpo (Chothia, et al. Science, 223,755 a 758 (1986)) usando qualquer pacote disponível livremente ou comercial, como WAM (Whitelegg, NRU e Rees, A. R Prot (2000). Eng., 12, 815 a 824). Uma proteína de pacote de software de visualização e de análise, tal como Insight II (Accelerys, Inc.) ou Deep View (Guex, N. e Peitsch, MC Eletrophoresis (1997) 18, 2714 a 2723), pode então ser utilizado para avaliar as substituições possíveis em cada posição no CDR e FR. Esta informação pode, então, ser usada para fazer com que as substituições possam ter um efeito mínimo sobre a atividade ou benéfica. As técnicas requeridas para fazer as substituições nas sequências de aminoácidos das CDRs, anticorpo VH ou domínios VL e anticorpos específicos geralmente estão disponíveis na técnica. As sequências variantes podem ser feitas, com substituições que podem ou não podem ser previstas para ter um efeito mínimo sobre a atividade ou benéfica.

[0087] Dessa maneira,um anticorpo anti-TGF-β pode compreender um conjunto definido de CDRs, em particular o conjunto de CDRs de PET1073G12, PET1074B9 e PET1287A10, e conjuntos de CDRs de PET1073G12, PET1074B9 PET1287A10 ou com uma ou duas substituições no interior da conjunto de CDRs. O conjunto relevante de CDRs é fornecido dentro de regiões de anticorpos de estrurtura ou estrutura de outras proteínas, por exemplo, fibronectina ou citocromo B. De preferência, as regiões de estrutura de anticorpo são empregadas. [0088] A cadeia pesada de um anticorpo anti-TGF-β pode utilizar um gene da família humana VH1. Em várias modalidades, a estrutura de cadeia pesada contém a sequência de aminoácidos 1 a 12, preferivelmente 3 a 12 e, mais preferivelmente 3 a 8 diferenças de aminoácidos, em comparação com a sequência de aminoácidos da linha germinal do gene humano da família VH1. Em algumas modalidades, a se

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31/87 quência de estrutura de cadeia pesada é a sequência da linha germinal. Em modalidades particularmente preferidas, a região de estrutura do anticorpo para a cadeia pesada pode ser humana DP-10 (VH 1-69) ou humana DP-88 (VH 1-e) a partir da família VH1. Algumas modalidades que utilizam um gene DP-10 humana tem um aminoácido nãogerminativo nos resíduos 27, 78 e 94. Em algumas modalidades, o resíduo 27 é tirosina, resíduo 78 é treonina e resíduo 94 é serina ou leucina. Em algumas modalidades, a cadeia leve utiliza um gene humano da família Vk3 com 1 a 5, 1 a 4, mais preferencialmente 1 a 3 diferenças de aminoácidos, em comparação com a sequência da linha germinal do aminoácido. Em algumas modalidades, a sequência de estrutura de cadeia leve de linha germinal humana é a sequência do gene da família Vk3. Em modalidades particularmente preferidas, a região de estrutura de cadeia leve humana pode ser DPK-22 (A27). Em algumas modalidades, resíduo 2 é um aminoácido da linha não - germinativa. Em algumas modalidades 2 é um resíduo de treonina.

[0089] Em uma modalidade altamente preferida, um domínio VH é fornecido com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 2, sendo este denominado domínio VH 1073G12 PET , ou SEQ ID NO : 12, sendo este denominado domínio VH 1074B9, PET ou SEQ ID NO : 22, sendo este denominado domínio VH 1287A10 PET .

[0090] Em algumas modalidades, um domínio VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 7, sendo este denominado Domínio VL 1073G12 PET ou SEQ ID NO : 17, sendo este denominado domínio VL 1074B9 PET , ou SEQ ID NO : 27, esta sendo chamado de domínio VL 1287A10 PET Um exemplo de anticorpo anti-TGF-β é composto pelo domínio VH 1073G12 PET, SEQ ID NO : 2, e o domínio VL 1073G12 PET, SEQ ID NO : 7. Um outro exemplo é constituído pelo domínio VH 1074B9 PET, SEQ ID NO : 12, e o domínio VL 1074B9 PET, SEQ ID NO : 17. Um outro exemplo é constituído

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32/87 pelo domínio VH 1287A10 PET, SEQ ID NO : 22, e o domínio VL 1287A10 PET, SEQ ID NO : 27. Estes ou qualquer outro local do anticorpo de TGF-β de ligação pode ser constituído em qualquer formato desejado anticorpo molécula, por exemplo, scFv, Fab, IgG1, IgG4, dAb, etc, como será discutido mais adiante neste documento. Outro exemplo é uma molécula de anticorpo que compreende a IgG4 PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 domínio VH, de preferência, também compreende o PET1073G12 correspondente, ou PET1074B9 PET1287A10 domínio VL.

[0091] Outro IgG4 ou outras moléculas de anticorpo que compreendem o PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 domínio VH e / ou o domínio PET1073G12, PET1074B9 PET1287A10 ou VL, são exemplos adicionais de moléculas de anticorpos são outros que compreendem o conjunto PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 de HCDRs dentro um anticorpo de domínio VH e / ou o conjunto de PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 de LCDRs dentro de um domínio VL do anticorpo.

[0092] Um anticorpo anti-TGF-β pode ser um anticorpo que se liga a todas as três isoformas de TGF-β humano. Tal anticorpo anti-TGF-β pode compreender o VH PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 e / ou o domínio VL, ou porções de ligação ao antigênio de tais domínios. Em algumas modalidades, um domínio VH de um dos acima é combinado com um domínio VL de um dos acima, para proporcionar um local de ligação ao antigênio. Por exemplo, o domínio VH PET1073G12 (SEQ ID NO : 2) pode ser combinado com o domínio VL PET1073G12 (SEQ ID NO : 7), de modo que um local de ligação ao antigênio é formado compreendendo tanto o VH PET1073G12 e domínios VL. Em uma outra modalidade, o domínio VH PET1074B9 (SEQ ID NO : 12) é combinado com o domínio VL PET1074B9 (SEQ ID NO : 17), de modo que um local de ligação ao antigênio é formado com

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33/87 preendendo tanto o VH PET1074B9 e domínios VL. Em uma outra modalidade, o domínio VH PET1287A10 (SEQ ID NO : 22) é combinado com o domínio VL PET1287A10 (SEQ ID NO : 27), de modo que um local de ligação ao antigênio é formado compreendendo tanto o VH PET1287A10 e domínios VL. Em outras modalidades, um PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 domínio VH está emparelhado com um domínio VL que não seja o VL PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 correspondente.

[0093] Da mesma forma, qualquer conjunto de HCDRs descritos na presente invenção pode ser fornecido em um domínio VH, que é utilizado como um anticorpo específico por si só ou em combinação com um domínio VL. Um domínio VH pode ser fornecido com um conjunto de HCDRs, tal como na presente invenção descrito, e se um tal domínio VH está emparelhado com um domio VL, em seguida, o domínio VL pode ser fornecido com um conjunto de LCDRs na presente invenção revelados. Um emparelhamento de um conjunto de HCDRs e um conjunto de LCDRs pode ser como na presente invenção descrito para os anticorpos PET1073G12, PET1074B9 e PET1287A10. As regiões de estrutura da VH e / ou os domínios VL da linha germinal podem ser estruturas. As regiões de estrurturas do domínio de cadeia pesada podem ser selecionadas a partir da família VH-1, e uma estrutura VH-1 preferida é DP-10 DP-88 ou estrutura. As regiões de estrutura de cadeia leve podem ser selecionadas de uma família Vk3, e uma estrutura preferida é tal DPK-22.

[0094] Um ou mais CDRs podem ser tomados a partir de um domínio VH ou VL da qual a sequência é descrita na presente invenção e incorporada em uma estrutura adequada. Isto é discutido mais adiante neste documento. O mesmo se aplica para outras CDR e conjuntos de CDR de anticorpos, tal como obtidos por meio dos métodos descritos na presente invenção.

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34/87 [0095] Um anticorpo VH de domínio, um anticorpo de domínio VL, um conjunto de HCDRs, um conjunto de LCDRs, um conjunto de CDRs, um ou mais HCDRs, por exemplo, um HCDR3 e / ou um ou mais de LCR, por exemplo, um LCDR3 , pode ser empregada em um antagonista do TGF-β.

[0096] As variantes dos domínios VH e VL e as CDRs, incluindo aquelas para as quais as sequências de aminoácidos são apresentadas na presente invenção, e que podem ser empregues no nível de anticorpos específicos para TGF-β podem ser obtidos por meio de métodos de alteração de sequência ou mutação e triagem.

[0097] O domínio variável de variantes de sequências de aminoácidos de quaisquer dos domínios VH e VL cujas sequências são especificamente descritas na presente invenção pode ser utilizado nos métodos descritos na presente invenção. As variantes particulares podem incluir uma ou mais alterações de sequência de aminoácidos (adição, deleção, substituição e / ou inserção de um resíduo de aminoácido), podendo ser inferior a cerca de 20 alterações, menos de cerca de 15 alterações, menos do que cerca de 10 ou menos do que alterações cerca de 5, 4, 3, 2 ou 1 alteração. As alterações podem ser feitas em uma ou mais regiões estrutura e / ou uma ou mais CDR.

[0098] Um anticorpo humano, humanizado, quimérico ou sintético específico, que compete ou compete cruzado para a ligação ao antigênio com qualquer anticorpo específico que se liga a ambos os antigênios e compreende um anticorpo específico de região de ligação ao antigênio, VH e / ou o domínio VL descritos na presente invenção, conjunto de CDRs ou HCDR3 descrito na presente invenção, ou de uma variante de qualquer um destes pode ser utilizado nos métodos descritos na presente invenção. A competição entre anticorpos pode ser facilmente ensaiada in vitro, por exemplo, ensaios de ELISA e / ou por meio da marcação de uma molécula repórter específica para um anti

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35/87 corpo que pode ser detectado na presença de outro (s) anticorpo (s) não marcados (s), para permitir a identificação de anticorpos específicos que se ligam o mesmo epitopo ou a um epitopo de sobreposição. A competição cruzada entre os anticorpos pode ser facilmente determinada por meio da execução do ensaio inversa, por exemplo, por inverter os pares marcados e não marcados para os anticorpos que bloqueiam a ligação identificada em ambas as direções.

[0099] Um anticorpo que compreende um local de ligação ao antigênio de um anticorpo, que compete ou compete cruzado com uma molécula de anticorpo PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, em particular PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 scFv e / ou IgG4 pode ser usado para antagonizar a TGF-β . Em várias modalidades, o anticorpo é um ser humano, um anticorpo humanizado, quimérico ou sintético. Em aspectos adicionais, um anticorpo pode ser utilizado compreendendo um local de ligação ao antigênio de um ser humano, o anticorpo humanizado, quimérico ou sintético que compete ou compete cruzada com um local de ligação ao antigênio descrito na presente invenção para a ligação a TGF-β, em que o local de ligação de antigênio do anticorpo humano, humanizado, quimérico ou sintético é composto de um domínio VH e um domínio VL, e em que os domínios VH e VL compreendem um conjunto de CDRs, como descrito na presente invenção .

[00100] Com base na informação descrita na presente invenção, estão disponíveis vários métodos na técnica para a tomada de anticorpos humanos, humanizados, quiméricos ou sintéticos contra TGF-β e que possam competir ou competir cruzado com uma molécula de anticorpo PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, um anticorpo molécula, com um conjunto PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 de CDRs, uma molécula de anticorpo com um conjunto de HCDRs PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, ou uma molécula de anti

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36/87 corpo com um conjunto de LCDRs PET1073G12, PET1074B9 PET1287A10 ou, para utilização como um antagonista do TGF-β.

[00101] Um ou mais anticorpos específicos capazes de se ligar TGF-β 1, TGF-β 2 e TGF-β 3, podem ser obtidos por meio de um método que inclui pôr em contacto uma biblioteca de anticorpos e TGF-β s, e selecionando um ou mais anticorpos específicos da biblioteca capazes de se ligar toda a referida TGF-β s. A biblioteca pode ser apresentada na superfície das partículas de bacteriófagos, cada partícula contendo ácido nucleico que codifica o anticorpo de domínio VH variável exibido na sua superfície e, opcionalmente, também um domínio VL apresentado se estiver presente. Após a selecção de anticorpos específicos capazes de se ligar ao antigênio e exibida à superfície de partículas de bacteriófago, o ácido nucleico pode ser tomado a partir de uma partícula exibindo um bacteriófago do referido anticorpo selecionado específico. Tal ácido nucleico pode ser utilizado na produção subsequente de um anticorpo específico ou um domínio variável de anticorpo VH (e, opcionalmente, um domínio variável de anticorpo VL) através de expressão a partir de um ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico a partir de uma tomada de partículas de bacteriófago que indica um referido anticorpo específico selecionado.

[00102] Um anticorpo de domínio VH com a sequência de aminoácidos de um domínio VH de um anticorpo que o referido anticorpo específico selecionado pode ser fornecido na forma isolada, como um anticorpo específico pode compreendendo um tal domínio VH. A capacidade para se ligarem todas as três isoformas de TGF-β pode ainda ser testada, também a capacidade para competir ou competir cruzado com PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 (por exemplo, em formato scFv e / ou formato de IgG, por exemplo, IgG4) para a ligação a todas as três isoformas humanas de TGF-β.

[00103] Um anticorpo para utilização como um antagonista do TGF

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37/87 β pode ligar TGF-β 1, TGF-β 2 e / ou TGF-β 3 com a afinidade de uma molécula de anticorpo PET1073G12, PET1074B9 PET1287A10 ou, por exemplo, scFv, ou de preferência IgG4, ou com uma afinidade que é maior do que uma das moléculas acima mencionadas. Um anticorpo útil pode neutralizar o TGF-β 1, TGF-β 2 e / ou TGF-β 3 com a potência de uma molécula de anticorpo PET1073G12, PET1074B9 PET1287A10 ou, por exemplo, scFv, ou de preferência PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 IgG4, ou com um potência que é maior do que uma das moléculas acima mencionadas.

[00104] Um anticorpo para utilização como um antagonista do TGFβ pode neutralizar ocorrem naturalmente TGF-β com a potência de uma molécula de anticorpo PET1073G12, PET1074B9 PET1287A10 ou, por exemplo, scFv, ou de preferência, IgG4, ou com uma potência que é maior do que uma das moléculas mencionadas acima. A afinidade de ligação e a potência de neutralização de diferentes anticorpos específicos pode ser comparada, em condições adequadas.

[00105] Um anticorpo para utilização como um antagonista do TGFβ inclui anticorpos humanos, humanizados, quiméricos ou sintéticos que podem neutralizar ocorrem naturalmente TGF-β com uma potência que é igual a ou maior do que a potência de um TGF-β antigênio local de ligação formada por PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 domínio VH e o domínio VL PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 correspondente.

[00106] Em adição às sequências de anticorpo, um anticorpo para o uso como um antagonista do TGF-β pode compreender outros aminoácidos, por exemplo, formando um peptídeo ou polipeptídeo, tal como um domínio dobrado, ou para conferir à molécula outra característica funcional além a capacidade de se ligar ao antigênio. Os anticorpos específicos podem transportar um marcador detectável, ou pode ser conjugado com uma toxina ou uma porção de direccionamento ou uma

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38/87 enzima (por exemplo, através de uma ligação peptidil ou lligante). [00107] Um anticorpo de ligação do antigênio compreende um local de ligação de antígeno. Um local de ligação ao antigênio pode também ser proporcionado por meio de arranjo de CDRs em estruturas de anticorpos não-protéicos, tais como a fibronectina ou o citocromo B, etc Koide et al, (1998), Journal of Molecular Biology, 284 : 1141 a 1151.; Nygren et al. (1997) Current Opinion in Estrutural Biology, vol. 7 : 463 a 469). Estruturas para engenharia de novos locais de ligação nas proteínas foram revistas em detalhe por Nygren et al., Supra. Estruturas de proteína para imitadores de anticorpos estão descritos em WO 00/34784, que descreve as proteínas (imitadores de anticorpos) que incluem um domínio de fibronectina de tipo III possuindo pelo menos uma laçada randomizado. Um estrutura adequado em que o enxerto de um ou mais CDRs, por exemplo, um conjunto de HCDRs, podem ser fornecidos por qualquer membro do domínio da superfamília de genes da imunoglobulina. A estrutura pode ser uma proteína humana ou não humana.

[00108] Uma vantagem de uma estrutura de proteína não-anticorpo é que pode proporcionar um local de ligação ao antigênio de uma região de estrutura conservada que é menor e / ou mais fácil de fabricar do que pelo menos algumas moléculas de anticorpos. O pequeno tamanho de um anticorpo podem conferir propriedades fisiológicas úteis, tais como a capacidade de penetrar nas células, penetrar profundamente nos tecidos ou atingir alvos dentro de outras estruturas, ou se ligar dentro de cavidades de proteínas do antigênio alvo.

[00109] Típicas são as proteínas que têm uma estrutura principal estável e um ou mais circuitos de variáveis, em que a sequência de aminoácidos do loop ou loops é especificamente ou aleatoriamente mutada para criar um local de ligação ao antigênio possuindo especificidade para ligação ao antigênio alvo. Tais proteínas incluem os domíPetição 870190105384, de 18/10/2019, pág. 47/103

39/87 nios de ligação de proteína IgG A de S. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina (por exemplo, 10 de fibronectina de tipo III de domínio) e lipocalinas. Outras abordagens incluem sintéticos (microcorpos Selecore GmbH), que se baseiam em ciclotides - pequenas proteínas que têm ligações de dissulfureto intra-molecular.

[00110] Em adição às sequências de anticorpos e / ou um local de ligação ao antigênio, um anticorpo pode compreender outros aminoácidos, por exemplo, formando um peptídeo ou polipeptídeo, tal como um domínio dobrado, ou para conferir à molécula outra característica funcional além a capacidade de se ligar ao antigênio. Os anticorpos podem transportar um marcador detectável, ou pode ser conjugado com uma toxina ou uma porção de direcionamento ou uma enzima (por exemplo, através de uma ligação peptidil ou ligante). Por exemplo, um anticorpo pode compreender um local catalítico (por exemplo, em um domínio de enzima), bem como um local de ligação ao antigênio, em que o local de ligação ao antigênio se liga ao antigênio e, dessa maneira,tem como alvo o local catalítico para o antigênio. O local catalítico pode inibir a função biológica do antigênio, por exemplo, por meio da clivagem.

[00111] Embora, como referido anteriormente na presente invenção, CDRs podem ser transportados por suportes, tais como fibronectina ou B citocromo (Haan & Maggos, 2004 BioCentury, 12 (5) : A1A6; Koide et al, supra; Nygren et al, supra), a estrutura para transportar uma CDR, ou um conjunto de CDRs será geralmente de um anticorpo ou sequência pesada cadeia leve ou porção substancial do mesmo, em que o conjunto de CDR ou CDRs está localizado em um local correspondente ao conjunto de CDR ou CDRs de domínios VH e VL de ocorrência natural de anticorpos variáveis codificados por meio dos genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas e locais de domínios variáveis de imunoglobulinas podem ser determinadas por

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40/87 meio da referência a Kabat, et al, 1987, e as suas atualizações, agora disponível na Internet (URL : . Immuno.bme.nwu.edu ou pesquisar Kabat usando qualquer motor de busca ).

[00112] É possível tomar os anticorpos monoclonais e outros e utilizar as técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que retêm a especificidade do anticorpo original. Tais técnicas podem envolver unir o DNA que codifica uma região variável da imunoglobulina para uma região constante, ou a introdução de regiões determinantes de complementaridade (CDRs), de um anticorpo para a região constante mais regiões de estrutura, de uma imunoglobulina diferente. Vide, por exemplo, EP-A184187, GB 2188638A ou EP-A-239400, e uma grande quantidade de literatura subsequente. Um hibridoma ou outra célula produtora de um anticorpo pode ser sujeito a mutação genética ou outras alterações, que podem ou não alterar a especificidade de ligação dos anticorpos produzidos.

[00113] Outras técnicas disponíveis na técnica de engenharia de anticorpos, foram possíveis isolar os anticorpos humanos e humanizados. Por exemplo, os hibridomas humanos pode ser feitos como descrito por Kontermann et al. (Kontermann R e Dubel Stefan; Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN : 3540413545). Phage display, uma outra técnica para estabelecer a geração de anticorpos foi descrita em pormenores em várias publicações, tais como Kontermann et al., Supra, e W0 92/01047 (discutido mais adiante). Os camundongos transgênicos em que os genes de anticorpo de camundongo são inativados e funcionalmente substituídos por meio dosgenes de anticorpos humanos, deixando intactos os outros componentes do sistema imunitário do camundongo, podem ser utilizados no que diz respeito ao isolamento de anticorpos humanos para antigênios humanos (Mendez et al., 1997). Os anticorpos huma

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41/87 nos, quer monoclonais ou policlonais, podem também ser feitos em outros animais transgênicos, tais como cabras, vacas, ovelhas, coelhos, etc [00114] As moléculas de anticorpos sintéticos criadas através de expressão de genes geradas por meio de oligonucleotídeos sintetizados e montados no interior de vetores de expressão adequados, por exemplo, como descrito por Knappik et al, supra, ou de Krebs et al, Journal of Immunological Methods 254 : 67 a 84 (2001), pode ser usado como antagonistas TGF-β.

[00115] Os fragmentos de um anticorpo completo podem desempenhar a função de antigênios de ligação. Exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab que consiste em VL, CL, VH e CH1 domínios, (ii) o fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CHL; (iii) o fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único anticorpo, (iv) o fragmento dAb (Ward, ES et al, Nature 341, 544 a 546 (1989), McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552 a 554 ), que consiste em um domínio VH e (v) regiões CDR isoladas; (vi) de fragmentos F (ab ') 2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados, (vii) moléculas Fv de cadeia simples (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados por meio de um ligante peptídico que permite que os dois domínios se associam para formar um local de ligação ao antigênio (Bird et al, Science, 242, 423 a 426, 1988, Huston et al, Proc Natl Acad Sci EUA 85, 5879 a 5883, 1998, (viii) dímeros biespecíficos Fv de cadeia simples (PCT/US92/09665) e (ix) fragmentos diacorpos, multivalentes ou multiespecíficos construídos por meio da fusão de genes (WO/13804); F. Holliger et al, Proc Natl. Acad. Sci. U.S. 90 6444 a 6448, 1993). Fv, scFv ou moléculas diacorpo podem ser estabilizadas por meio da incorporação de pontes de dissulfureto que ligam os domínios VH e VL (Y. Reiter et al., Nature Biotech, 14, 1239 a 1245, 1996). Os minicorpos que compreendem um

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42/87 scFv associados a um domínio CH3 podem também ser feitos (S. Hu et al., Cancer Res., 56, 3055 a 3061, 1996).

[00116] A dAb (anticorpo de domínio) é um pequeno fragmento de ligação ao antigênio de um anticorpo monomérico, isto é, a região variável de um anticorpo de cadeia pesada ou leve (Holt et al., 2003). VH dabs ocorrem naturalmente em camelídeos (por exemplo, camelo, lama) e podem ser produzidos por meio da imunização de um camelídeo com um antigênio alvo, o isolamento de células B específicas de antigênio-e genes dAb diretamente na clonagem de células B individuais. DABS são também produzida em cultura de células. Seu pequeno tamanho, solubilidade e estabilidade de temperatura torna-os particularmente úteis e fisiologicamente adequados para seleção e maturação de afinidade. Um anticorpo pode ser um compreendendo um dAb de domínio VH ou VL substancialmente tal como definido no presente documento, ou um domínio VH ou VL que compreende um conjunto de CDRs substancialmente como estabelecido na presente invenção.

[00117] Onde os anticorpos biespecíficos são para ser utilizados, estes podem ser anticorpos biespecíficos convencionais, que podem ser fabricados em uma variedade de formas (Holliger, P. e Winter G. Current Parecer Biotechnol. 4, 446 a 449 (1993)), por exemplo, preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos, ou podem ser quaisquer dos fragmentos de anticorpos biespecíficos mencionados acima. Exemplos de anticorpos biespecíficos incluem os da tecnologia BiTETM nos de ligação de dois anticorpos com especificidade diferente e podem ser usado diretamente ligados através de curtos peptídeos flexíveis. Isto combina dois anticorpos em uma única cadeia curta polipeptídica. Os diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região Fe, utilizando apenas domínios variáveis, reduzindo potencialmente os efeitos de reação anti-idiotípica.

[00118] Os diacorpos biespecíficos, ao contrário dos anticorpos

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43/87 completos biespecíficos, podem também ser particularmente úteis pois podem ser prontamente construídos e expressos em E. coli. Os diacorpos (e muitos outros polipeptídeos, tais como fragmentos de anticorpos) de especificidades de ligação apropriadas podem ser prontamente selecionados utilizando exibição de fagos (WO94/13804) a partir de bibliotecas. Se um dos braços do diacorpo é para ser mantido constante, por exemplo, com uma especificidade dirigida contra o TGF-β, em seguida, uma biblioteca pode ser feita quando o outro braço é variado e um anticorpo de especificidade apropriada selecionado. Os anticorpos completos biespecíficos podem ser preparados por meio da engenharia puxadores-em-buracos (CEB Ridgeway et al., Protein Eng., 9, 616 a 621, 1996).

[00119] Os anticorpos podem ser glicosilados, quer naturalmente quer por sistemas de várias células eucarióticas (por exemplo, CHO ou NS0 (ECACC 85110503), as células, ou podem ser (por exemplo, se produzido por expressão em uma célula procariótica) não glicosilado. A glicosilação pode também ser intencionalmente alterada, por exemplo, por meio da inibição da fucosilação, aumentando a atividade de ADCC do anticorpo resultante. Dessa maneira,os anticorpos podem ser expressos de modo a minimizar ou eliminar a fucosilação.

[00120] Em algumas modalidades, o CDR ou domínio VH ou VL irá ser idêntico ou muito semelhante para as regiões especificadas de que a sequência é estabelecida na presente invenção. É contemplado que a partir de 1 a 5, de preferência de 1 a 4, ou 1 ou 2, ou 3 ou 4, as substituições de aminoácidos podem ser feitas na CDR e / ou VH ou domínios VL. Os domínios VH ou VL e CDRs e conjuntos de CDRs, que são altamente semelhantes àqueles para os quais as sequências são dadas na presente invenção são abrangidos pelos aspectos, como sejam aqueles com sequências que são substancialmente como estabelecidas na presente invenção.

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44/87 [00121] A estrutura para transportar uma CDR, ou um conjunto de CDRs será geralmente de uma sequência do anticorpo de cadeia pesada ou de cadeia leve, ou porção substancial do mesmo, em que o conjunto de CDR ou CDRs está localizado em um local correspondente ao conjunto de CDR ou CDRs de domínios VH e VL de ocorrência natural de anticorpos variáveis codificadas pelos genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas e os locais dos domínios variáveis de imunoglobulina podem ser determinadas por referência a Kabat, EA et al., Sequences of Proteins of Immunological interesse. 4 ^a Edição. Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos estados Unidos. 1987, e suas atualizações, agora disponíveis na Internet (URL : immuno.bme.nwu.edu ou encontrar Kabat usando qualquer motor de busca). CDRs são definidos de acordo com Kabat et al. CDRs podem também ser efetuados por outros suportes, tais como fibronectina ou B. citocromo [00122] De preferência, a sequência de aminoácidos de CDR substancialmente como definida na presente invenção é transportada como uma CDR de um domínio variável humano, ou uma porção substancial da mesma. As sequências HCDR3 substancialmente como estabelecidas na presente invenção representam modalidades preferidas e é preferível que cada uma destas seja transportada como um HCDR3 de um domínio variável de cadeia pesada humana ou uma parte substancial da mesma.

[00123] Os domínios variáveis utilizados podem ser obtidos ou derivados a partir de qualquer linha germinal ou domínio variável humano rearranjado, ou pode ser um domínio variável de síntese com base em sequências de consenso ou domínios variáveis reais de humanos conhecidos. Uma sequência de CDR (por exemplo, CDR3) pode ser introduzida de um repertório de domínios variáveis que faltam um CDR (por exemplo, CDR3), utilizando tecnologia de DNA recombinante. As

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45/87 estruturas preferidas da linha germinal já foram identificadas na presente invenção.

[00124] Marks et al. (Bio / Technology, 1992, 10 : 779 a 783) descrevem os métodos para a produção de repertórios de domínios variáveis de anticorpos, em que os iniciadores de consenso dirigidos em ou adjacente à extremidade 5 ' da região de domínio variável são usados em conjunto com os iniciadores de consenso para a terceira região de estrutura de genes VH humanos com a finalidade de proporcionar um repertório de VK de domínios variáveis que faltam uma CDR2. Marks et al. descrevem ainda como este repertório pode ser combinado com uma CDR2 de um anticorpo particular. Utilizando as técnicas análogas, as sequências CDR3 derivadas podem ser embaralhadas com repertórios de domínios VH ou VL sem uma CDR3, e domínios embaralhados completos de VH ou VL em combinação com uma VL cognato ou domínio VH de fornecer anticorpos. O repertório pode, então, ser exibido em um sistema de hospedeiro adequado, tal como o sistema de apresentação de fagos de WO92 / 01047 ou de qualquer de um grande corpo de literatura subsequente, incluindo Kay, BK, Winter, J., e McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins : A Laboratory Manual, San Diego : Academic Press, de modo que os anticorpos adequados podem ser selecionados. Um repertório pode consistir em 104 membros individuais para cima, por exemplo, 106 a 108 ou 1010 membros. Outros sistemas hospedeiros apropriados incluem a exibição de levedura, visor bacteriano, visor T7, display ribossoma, display covalente e assim por diante.

[00125] O embaralhamento análogo ou as técnicas combinatórias são também descritos por Stemmer (Nature, 1994, 370 : 389 a 391), o qual descreve a técnica em relação a um gene β-latamase mas observa que a abordagem pode ser utilizada para a geração de anticorpos .

[00126] Uma outra alternativa é a de gerar novas regiões CDR de

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46/87 domínio VH ou VL usando a mutagênese aleatória de um ou mais VH selecionada e / ou genes de VL para gerar as mutações dentro do domínio inteiro variável. Tal técnica é descrita por Gram et al. Proc. Natl. Acad. Sei., EUA, 89 : 3576 a 3580), que utilizaram PCR propensa a erros. Em modalidades preferidas uma ou duas substituições de aminoácidos foram feitas dentro de um conjunto de HCDRs e / ou LCDRs. Outro método que pode ser utilizado para dirigir a mutagénese é a região CDR dos genes de VH ou VL. Tais técnicas são descritas por Barbas et al., (1994, Proc. Natl. Acad. Sei., EUA, 91 : 3809 a 3813) e Schier et al. J. Mol. Biol. 263 : 551 a 567). Dada a descrição na presente invenção fornecida, a pessoa que é versada na técnica será capaz de usar tais técnicas para a obtenção de anticorpos adicionais utilizando metodologia de rotina na técnica. O domínio VH PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 pode ser sujeito à mutação para fornecer um ou mais domínios VH variantes de sequências de aminoácidos que podem ser combinados com um ou mais domínios VL.

[00127] O domínio VH pode ter uma sequência da linha germinal, e em modalidades preferidas é DP-10 ou DP-88. A sequência do domínio VL pode ter uma sequência da linha germinal, e em modalidades preferidas é DPK-22. Um ou mais dos PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 HCDR1, HCDR2 e HCDR3, ou o conjunto PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 de HCDRs, podem ser empregues, e / ou um ou mais dos PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 LCDR1, LCDR2 e LCDR3, ou o PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 conjunto de LCDRs.

[00128] Uma parte substancial de um domínio variável de imunoglobulina compreende pelo menos as três regiões CDR, juntamente com as suas regiões de estrutura intervenientes. De preferência, a porção também incluirá pelo menos cerca de 50 % de qualquer uma ou de ambas as regiões de estrutura, primeiro e quarta, os 50 % sendo

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47/87 o C-terminal de 50 % da primeira região de estrutura e o N-terminal de 50 % do quarta região de estrutura. Os resíduos adicionais na extremidade N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles que não são normalmente associados com as regiões de domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, o constructo de anticorpos obtido por meio das técnicas de DNA recombinante, pode resultar na introdução de N- ou C-terminais codificados por meio dosligantes de resíduos introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação. Outras etapas de manipulação incluem a introdução de ligadores para unir os domínios variáveis de sequências de proteínas adicionais, incluindo as cadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou marcadores de proteína.

[00129] Os anticorpos que compreendem um par de domínios VH e VL são preferidos, os únicos domínios de ligação com base em ou VH ou VL sequências do domínio pode também ser utilizado. Sabe-se que os domínios de imunoglobulina individuais, especialmente os domínios de VH, são capazes de ligação de antigênios alvo, de uma forma específica. No caso de qualquer um dos domínios de ligação únicos específicos, estes domínios podem ser utilizados para o rastreio de domínios complementares capazes de formar um anticorpo de dois domínios capaz de se ligar as três isoformas de TGF-β humano.

[00130] Isto pode ser conseguido por meio de métodos de exibição em fagos de rastreio utilizando a chamada abordagem dupla hierárquica combinatória tal como descrito em WO92/01047, em que uma colônia individual, contendo um H ou L clone de cadeia é utilizado para infetar uma biblioteca completa de clones que codifica para a cadeia outro (L ou H) e o anticorpo de cadeia dupla resultante é selecionado de acordo com as técnicas de exibição em fagos, tais como os descritos em referência.

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48/87 [00131] Os anticorpos Anti-TGF-β podem ainda compreender as regiões constantes de anticorpos ou partes dos mesmos. Por exemplo, um domínio VL pode estar ligado na sua extremidade C-terminal para os domínios constantes de cadeia leve de anticorpo, incluindo Ck humano ou cadeias CÃ, de preferência, cadeias Ck. Da mesma forma, um anticorpo com base em um domínio VH pode ser ligado na sua extremidade C-terminal para a totalidade ou parte (por exemplo, um domínio CH1) de uma cadeia pesada de imunoglobulina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, por exemplo, IgG, IgA, IgE e IgM e qualquer uma das sub-classes de isotipos, particularmente IgG1 e IgG4. IgG4 é o preferido. IgG4 é preferível para algumas aplicações uma vez que não se liga complemento reduziu as funções efectoras. Onde a função efectora é desejada, é preferível IgG1. Função efectora pode também ser aumentada através da manipulação do estado de glicosilação do anticorpo, tal como por meio da redução do teor de fucose, por métodos que são conhecidos na arte. A cadeia pesada pode ou não ter um resíduo C-terminal de lisina. Qualquer variante ou outra região sintética constante que tem estas propriedades e estabiliza as regiões variáveis podem também ser usados em algumas modalidades.

[00132] As preparações heterogêneas dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigênio dos mesmos, podem ser úteis. Por exemplo, essas preparações podem ser misturas de anticorpos de comprimento completo com as cadeias pesada e anticorpos com cadeias pesadas que não possuem a lisina C-terminal, com vários graus de glicosilação, com derivados de aminoácidos, tais como a ciclização de um ácido glutâmico N-terminal de formam um resíduo de ácido piroglutâmico e / ou com formas desamidada da cadeia pesada e leve ou.

[00133] As composições compreendendo anticorpos TGF-β podem ser administradas a indivíduos em necessidade do mesmo, de prefe

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49/87 rência, em uma quantidade terapeuticamente eficaz, sendo esta suficiente para mostrar o benefício ao paciente. Tal benefício pode ser pelo menos melhoria de pelo menos um sintoma de uma doença particular ou doença. A quantidade real administrada, e a taxa e tempo de curso da administração, dependerão da natureza e da gravidade da doença a ser tratada. A prescrição do tratamento, por exemplo, as decisões sobre dosagem, etc, podem ser determinadas com base em pré-clínicos e clínicos, estudos de concepção do que está bem dentro do nível daquele que é versado na técnica.

[00134] Os anticorpos podem ser administrados por meio da injeção (por exemplo, subcutaneamente, intravenosamente, intracavidade (por exemplo, após a resseção do tumor), intralesional, intraperitoneal ou intramuscular), por inalação, ou por via tópica (por exemplo, intraocular, intranasal, retal, em feridas , na pele), ou por via oral. A via de administração pode ser determinada por meio das características físico-químicas do produto, por considerações especiais para a doença, por dose ou intervalo de dose ou pela exigência de optimizar a eficácia ou para minimizar os efeitos secundários.

[00135] Prevê-se que o tratamento com anti-TGF-β não necessita de ser restrito a administração por profissionais de saúde. Por conseguinte, a injeção subcutânea, que especialmente utiliza um dispositivo sem agulha pode ser apropriada.

[00136] A dose exata irá depender de um certo número de fatores, incluindo, a condição e história médica do paciente, a natureza precisa do anticorpo (por exemplo, anticorpo inteiro, fragmento ou diacorpo) e a natureza de qualquer marcador detectável ou outra molécula ligada ao anticorpo. Uma dose típica de anticorpo estará na gama de 100 ug a 1 g para aplicações sistémicas, e 1 ug a 1 mg por meio das aplicações tópicas. Tipicamente, o anticorpo será um anticorpo inteiro, de preferência o isotipo IgG4. Trata-se de uma dose para um único trata

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50/87 mento de um paciente adulto, que pode ser proporcionalmente ajustada para crianças e bebês, e também ajustado para formatos de anticorpos outras em proporção ao peso molecular e atividade. Os tratamentos podem ser repetidos no dia, duas vezes por semana, semanalmente, mensalmente ou de outro, a critério do médico.

[00137] Os anticorpos serão geralmente administrados sob a forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente em adição ao anticorpo. As composições farmacêuticas para utilização em métodos de tratamento de IM, podem compreender, em adição ao ingrediente ativo, um excipiente farmaceuticamente aceitável, veículo, tampão, estabilizante ou outros materiais bem conhecidos por aqueles que são versados na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir na eficácia do ingrediente ativo. Tais materiais podem incluir, por exemplo, todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores da absorção, e semelhantes, que são fisiologicamente compatíveis. Alguns exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são a água, fosfato, soro fisiológico tamponado, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, bem como as combinações dos mesmos. Em muitos casos, será preferível incluir os agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como o cloreto, manitol sorbitol, ou de sódio na composição. Exemplos adicionais de substâncias farmaceuticamente aceitáveis são agentes molhantes ou quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões, que aumentam a vida de prateleira ou a eficácia do anticorpo. A natureza precisa do veículo ou outro material dependerá da via de administração, que pode ser oral, tópica, por inalação ou por injeção, por exemplo, por via intravenosa. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é administrado por infusão intravenosa ou por injeção. Em uma

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51/87 outra modalidade preferida, o anticorpo é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea.

[00138] As composições farmacêuticas para administração oral podem estar na forma de comprimido, pó, cápsula ou líquido, por exemplo, com um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável. Um comprimido pode compreender um veículo sólido, tal como gelatina ou um adjuvante. As composições farmacêuticas líquidas compreendem geralmente um veículo líquido, tal como água, petróleo, animais ou óleos vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, dextrose ou solução de outro sacarídeo ou glicóis, tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol podem ser incluídos. O anticorpo (e outros ingredientes, se desejado) pode também ser envolvidos por uma cápsula de revestimento duro ou mole de gelatina, prensados em comprimidos, ou incorporados diretamente na dieta do sujeito. Para a administração terapêutica oral, o ingrediente ativo pode ser incorporado com excipientes e utilizado na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas, e similares. Para administrar um composto por outra que não a administração parenteral, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com, um material para prevenir a sua inativação.

[00139] Para a injeção intravenosa ou injeção no local da infecção, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que é isenta de pirogênios e tem pK apropriado, isotonicidade e estabilidade. Aqueles que são versados na técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotônicos, tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, e / ou injeção de Ringer com latato. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e / ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme necessário.

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52/87 [00140] Uma composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, simultaneamente ou sequencialmente, dependendo da condição a ser tratada.

[00141] Os anticorpos podem ser formulados em formas líquidas, semi-sólidas ou sólidas, tais como soluções liquidas (por exemplo, soluções injectáveis e para infusão), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo pretendido de aplicação, administração terapêutica, as propriedades físico-químicas da molécula e a via de entrega. As formulações podem incluir excipientes, ou combinações de excipientes, por exemplo : açúcares, aminoácidos e agentes tensoativos. As formulações líquidas podem incluir uma ampla gama de concentrações de anticorpos e de pH. As formulações sólidas podem ser produzidos por, por exemplo, pulverização de liofilização, secagem ou secagem por meio da tecnologia de fluido supercrítico.

[00142] As composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomas ou outra estrutura ordenada adequada para concentração de fármaco elevada. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o anticorpo na quantidade necessária, em um solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes acima enumerados, como necessário, seguido de esterilização por meio da filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários de entre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem por vácuo e liofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir

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53/87 de uma solução previamente esterilizada por filtração. A fluidez adequada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de tensioativos. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, monoestearato de sais e gelatina.

[00143] Em certas modalidades, o composto ativo das composições de anticorpos pode ser preparado com um veículo que irá proteger o anticorpo contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de entrega microencapsulados. Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser utilizados, tais como etileno-acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecido por aqueles que são versados na técnica. Videe, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (JR Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).

[00144] Em várias modalidades, outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração de um anticorpo anti-TGF-β. A administração combinada inclui a co-administração, utilizando as formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica, e a administração consecutiva em qualquer ordem, em que preferencialmente existe um período de tempo, enquanto os dois agentes (ou todos) simultaneamente ativos exercem as suas atividades biológicas.

[00145] Para a prevenção ou tratamento das consequências de infartes do miocárdio, a dose apropriada de um antagonista do TGF-β dependerá da condição do paciente, da gravidade e do curso do infarte, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos,

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54/87 terapia prévia, história clínica do paciente e a resposta ao anticorpo, e da discrição do médico assistente. O antagonista pode ser administrado ao paciente de uma só vez ou durante uma série de tratamentos de iniciação durante o dia 0 (por exemplo, dentro de cerca de 8, 12 ou 24 horas), dia 1, dia 2, dia 3, dia 4, dia 5 ou depois um evento isquêmico, de preferência, no dia 0, dia 3, e dia 5. Isto é, em algumas modalidades, a administração do antagonista do TGF-β é iniciado no prazo de cerca de 120 horas, a cerca de 96 horas, cerca de 72 horas, a cerca de 48 horas, dentro de aproximadamente 24 horas, a cerca de 12 horas ou mesmo dentro de cerca de 8 ou menos horas do início da isquemia miocárdica aguda. Dependendo do tipo e da gravidade da condição, a cerca de 5 mg / kg de anticorpo é uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua de pós-MI. Uma dosagem diária típica pode ser igual a 5 mg / kg ou menos, dependendo dos fatores acima mencionados. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. A dosagem preferida do anticorpo será de 5 mg / kg ou menos, administrado por via intravenosa. Dessa maneira, uma ou mais doses de cerca de 5 mg / kg ou menos (ou qualquer combinação dos mesmos) podem ser administradas ao paciente. Contudo, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio das técnicas e ensaios convencionais.

[00146] Os anticorpos anti-TGF-β são úteis para o tratamento de AMI, quando combinado com os antagonistas do sistema reninaangiotensina-aldosterona, incluindo, mas não limitados a : inibidores da renina, inibidores da enzima conversora (ECA), antagonistas dos receptores de Ang II (também conhecidos como bloqueadores de receptores de Ang II), e os antagonistas de aldosterona. Anticorpos anti

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TGF-β são também úteis para o tratamento de AMI, quando combinados com os antagonistas do sistema beta-adrenérgico, incluindo, mas não se limitam ao grupo que consiste em alprenolol, bucindolol, carteolol, carvedilal, labetalol, nadolol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, propranolol , sotalol, timolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, celiprolol, esmolol, metoprolol, nebivolol e. Além disso, os anticorpos anti-TGF-β são úteis para o tratamento de IAM, quando combinados com agentes lipídicos de gestão, incluindo mas não se limitando ao grupo das estatinas que consiste em lovastatina, pravastatina, sinvastatina, fluvastatina, atorvastatina, cerivastatina, resuvastatin, o grupo de sequestrantes de ácidos biliares que consiste em chlestiramina, celestipol, colesevalam, o grupo de ácidos consistindo em fíbrico o gemfibrozil, fenofibrato, clofibrato, o grupo incluindo o ácido nicotínico e Niaspan, o grupo incluindo o agente de redução do colesterol a ezetimiba e da combinação de ezetimiba e sinvastatina. Em um outro aspecto, o anticorpos anti-TGF-β são úteis para o tratamento de MAI, quando combinado com agentes antiplaquetários / anticoagulantes incluindo, mas não se limitando a aspirina, o grupo de inibidores do receptor de ADP que consistem de clopidogrel, prasugrel, ticagrelor, ticlopidina, e o anticoagulante varfarina.

[00147] As formulações terapêuticas de anticorpos utilizados no tratamento podem ser fornecidas em um recipiente disponível para o tratamento por via intravenosa. As formulações também podem ser preparadas para armazenamento misturando um anticorpo possuindo o grau desejado de pureza com opcionais farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes, incluindo, mas não se limitam àqueles em edição de Remington Pharmaceutical Sciences 16, Osol, A. Ed.. (1980) e na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos aceitáveis, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregues

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56/87 e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de otadecildimetilbenzilamônio, cloreto de hexametônio , cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetônio; fenol, butila ou álcool benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol, 3-pentanol, e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos), proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas, polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos, e outros hidratos de carbono incluindo glucose , manose, ou dextrinas, agentes quelantes, como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; formadores de sais de contra-íons, tais como sódio; complexos de metais, e / ou agentes tensoativos não iônicos.

[00148] A formulação pode também conter mais do que um composto ativo conforme necessário para a indicação particular a ser tratada. De preferência, os compostos com atividades complementares que não afetem adversamente uns aos outros. Alternativamente, ou adicionalmente, a composição pode ainda compreender uma citocina, um agente inibidor do crescimento, agente anti-hormonal, TGF-β orientada de fármacos, agente anti-angiogênico e / ou cardioprotetor. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.

[00149] O termo citocina é um termo genérico para proteínas liberadas por meio de uma população de células que actuam sobre outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas e hormonas polipeptídicas tradicionais. Incluemse entre as citoquinas estão a hormona do crescimento, tais como hormona do crescimento humana, N-metionil-hormona do crescimento

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57/87 humana, e hormona do crescimento bovina; hormona paratiróide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteicas, tais como hormona folículo-estimulante (FSH ), hormona estimulante da tiróide (TSH), e hormona luteinizante (LH), fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblastos; prolatina; lactogênio placentário; fator de necrose tumoral-α e β-; mulleriana substância inibidora; camundongo peptídeo associado a gonadotropina; inibina; ativina, fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO), fatores de crescimento dos nervos, tais como NGF-.β;. crescimento de plaquetas fator; insulin-like growth fator-I e-II; eritropoietina (EPO); osteoindutora fatores; interferões, tais como interferão-α, β e-γ; fatores estimuladores de colônias (CSFs), tais como macrófagos CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF) e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs), tais como IL-1, ^-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL -9, IL-10, IL-11, IL-12, um fator de necrose tumoral, tal como TNF-ou TNF-α β, e outros fatores polipeptídicos incluindo LIF e ligando kit (KL). Como na presente invenção utilizado, o termo citoquina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citoquinas de sequência nativa.

[00150] Um cardioprotetor é um composto ou composição que previne ou reduz a disfunção miocárdica (isto é, Cardiomiopatia e / ou insuficiência cardíaca congestiva) associada à administração de um fármaco, tal como um anticorpo anti-TGF-β, para uma paciente. O cardioprotetor pode, por exemplo, bloquear ou reduzir um efeito dos radicais livres mediados cardiotóxica e / ou prevenir ou reduzir o stress da lesão oxidativa.

[00151] Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por meio da polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelu

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58/87 lose ou microcápsulas de gelatina e poli-(metilmetacilato), respectivamente, em coloidais de entrega de fármacos de sistemas ( por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas são descritas em Remington 's edição Pharmaceutical Sciences 16, Osol, A. Ed.. (1980).

[00152] As preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação sustentados podem incluir matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o anticorpo, matrizes estas que estão na forma de artigos conformados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação controlada incluem, mas não estão limitados a, poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2-hidroxietilmetacrilato), ou poli (álcool vinílico)), polilatidos, copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L γ- glutamato, não degradável de acetato de etilenovinila, copolímeros degradáveis de ácido láctico de ácido glicólico, e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis.

[00153] Um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento do MI, como descrito acima, pode ser fornecido, geralmente compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre ou associado com o recipiente. A bula compreende as instruções normalmente incluídos nos pacotes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contra-indicações e / ou avisos sobre o uso de tais produtos terapêuticos.

[00154] Os recipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, garrafas, frascos, sacos de solução IV, vasos, seringas, etc Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que

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59/87 é eficaz para a inibição da sinalização de TGF-β e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um ingrediente ativo na composição pode ser um anticorpo anti-TGF-β. O rótulo ou bula pode indicar que a composição é utilizada para o tratamento de infarte do miocárdio, infarte agudo do miocárdio, ou a redução de uma consequência de infarte do miocárdio, Em uma modalidade, o rótulo ou bula indica que a composição que compreende o anticorpo pode ser administrada durante a fase aguda do infarte do miocárdio.

[00155] Além disso, o artigo de fabricação pode compreender um recipiente que compreende uma composição de um anticorpo antiTGF-β, e um agente terapêutico para além do anticorpo. O artigo de fabricação pode compreender adicionalmente um folheto informativo que indica que as primeira e segunda composições podem ser usadas em combinação para o tratamento de um infarte do miocárdio. Este agente terapêutico pode ser qualquer uma das terapias adjuntas descritos na secção anterior (por exemplo, um agente anti-angiogênico, um composto anti-hormonal, um cardioprotetor, e / ou um regulador da função imune em um mamífero, incluindo uma citoquina). Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender adicionalmente um recipiente (ou terceira), que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[00156] Por uma questão de conveniência, os anticorpos anti-TGFβ podem ser fornecidos em um kit, ou seja, uma combinação embalada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções.

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Além disso, outros aditivos podem ser incluídos, tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise). Em particular, os anticorpos podem ser fornecidos como pós secos, usualmente liofilizados, incluindo excipientes que em dissolução proporcionarão uma solução com a concentração apropriada.

[00157] Em adição aos métodos descritos no sumário e descrição detalhada acima, as modalidades que se seguem estão também entre os contemplados. Um método de tratamento de um paciente que sofre de infarte do miocárdio, infarte agudo do miocárdio ou para reduzir as consequências adversas de um infarte agudo do miocárdio em um paciente pode compreender a administração de um antagonista do TGFβ a um paciente durante a fase aguda do infarte do miocárdio. O antagonista do TGF-β pode ser selecionado a partir de um grupo que consiste em : um anticorpo ou proteína compreendendo um fragmento de anticorpo dirigido contra uma ou mais isoformas de TGF-β; um receptor de TGF-β; um anticorpo ou proteína compreendendo um fragmento de anticorpo dirigido contra um ou mais receptores de TGF-β; latência peptídeo associado; latente grande TGF-β, um proteoglicano de TGF-β inibição; somatostatina; manose-6-fosfato; manose-1-fosfato; prolatina; insulin-like growth fator II; IP-10 ; uma arg-gly-asp contendo peptídeo, uma planta, fungo, ou do extracto bacteriano, um anti-sentido ou interferindo oligonucleotídeo de ARN, e de uma proteína envolvida na sinalização de TGF-β.

[00158] Em modalidades preferidas, o antagonista de TGF-β é um anticorpo anti-TGF-β humanizado ou um fragmento de ligação ao antigênio ou local de um anticorpo anti-TGF-β. O antagonista do TGF-β pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo capaz de se ligar e neutralizar mais de uma isoforma de TGF-β. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal quimérico que compreende uma porção de ligação de TGF-β e uma parte restante, disse TGF-β porção de ligação

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61/87 compreendendo a porção de ligação ao antigênio do anticorpo monoclonal 1D11.16, e a porção remanescente derivado de um ou mais anticorpos humanos . Um anticorpo que é dirigido contra mais do que uma isoforma de TGF-β pode ser uma forma humana ou humanizada do anticorpo monoclonal 1D11.16, O antagonista do TGF-β pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo que neutraliza o TGF^1 , TGF- β2 e TGF- β3 humano [00159] A administração do antagonista do TGF-β pode ser iniciada dentro de cerca de 120, cerca de 80, cerca de 72, cerca de 48, ou cerca de 24 horas do início da isquemia miocárdica aguda. Em alguns casos, a administração do antagonista do TGF-β é iniciado no prazo de cerca de 12 horas após o início da isquemia miocárdica aguda. A administração do antagonista do TGF-β pode ser iniciada antes de macrófagos substancial e infiltração mononuclear de tecido afetado pela infarte do miocárdio. Em outros casos, a administração do antagonista do TGF-β é iniciado durante um período caracterizado por infiltração neutrofílica do tecido afetado pelo infarte do miocárdio. Além disso, em alguns casos, a administração do antagonista do TGF-β é iniciado durante um período caracterizado por necrose do tecido afetado pelo infarte do miocárdio.

[00160] O método pode também compreender a administração de um composto capaz de, seletivamente, restaurar a função desejável de TGF-β para um paciente com diagnóstico de um infarte agudo do miocárdio durante a fase aguda do infarte do miocárdio, por exemplo, um fármaco anti-inflamatório e / ou um antagonista de TNF-α. O método pode ser utilizado em medicina humana e veterinária, de modo que o paciente pode ser um ser humano ou um mamífero não humano.

[00161] Em relação ao antagonista do TGF-β, em algumas modalidades, o antagonista é um anticorpo que neutraliza o TGF^1 humano, TGF^2 e TGF^3, e compreende um domínio de ligação ao antigênio

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62/87 de um anticorpo, em que o referido antigênio domínio de ligação compreende um conjunto de CDRs HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que o referido domínio de ligação do antigênio utiliza um gene humano da família VH1 e em que o dito HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 15 e SEQ ID NO : 25. O gene da família humana VH1 pode ser um gene VH1-2 humana, que em alguns casos pode ser um DP-10 ou um gene DP-88. O domínio de ligação ao antigênio pode ainda compreender um conjunto de CDRs LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que o referido domínio de ligação do antigênio utiliza um gene humano da família Vk3 e em que o dito LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 20 e SEQ ID NO : 30. O HCDR3 e LCDR3 pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em : (a) SEQ ID NO : 5 e SEQ ID NO : 10, respectivamente, (b) SEQ ID NO : 15 e SEQ ID NO : 20, respectivamente, e (c ) SEQ ID NO : 25 e SEQ ID NO : 30, respectivamente.

[00162] Em algumas modalidades, o gene da família humana Vk3 pode ser um gene humano DPK22 VK. O HCDR1, HCDR2 e HCDR3 do domínio VH pode ser composto dentro de uma estrutura de cadeia pesada da linha germinal, ou HCDR1, HCDR2 e HCDR3 do domínio VH está dentro de uma estrutura que compreende até 12 mutações da sequência de aminoácido germinativa. O LCDR1, LCDR2 e LCDR3 do domínio VK podem ser compreendidos dentro de um estrutura de cadeia pesada da linha germinal. Em alguns casos, a LCDR1, LCDR2 e LCDR3 do domínio VK podem estar dentro de uma estrutura que compreende até 5 mutações de sequência de ácido germinal VK amino.

[00163] O antagonista do TGF-β pode ser um anticorpo que neutraliza o TGF^1 humano, TGF^2 e TGF^3, e compreende um domínio de ligação ao antigênio de um anticorpo, em que o referido domínio de

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63/87 ligação do antigênio utiliza um humano VH DP -10 gene VH humano ou uma PD-88 gene e compreende uma sequência de aminoácido FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos em SEQ ID NO : 31, o domínio de ligação ao antigênio pode utilizar um humano VH DP10 ou um gene VH humano DP- 88 do gene, e compreende um conjunto de CDRs HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que a referida HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 15 e SEQ ID NO : 25, e compreende ainda FR4 uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos em SEQ ID NO : 31. O domínio de ligação ao antigênio pode ainda utilizar um gene da família humana Vk3 e um gene Jk5 humano. Um domínio de ligação ao antigênio utilizando um gene da família humana Vk3 e um gene Jk5 humano pode compreender um conjunto de CDRs LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que o referido LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 20 e SEQ ID NO : 30.

[00164] Em algumas modalidades, o antagonista do TGF-β humano neutraliza o TGF-βυ TGF^2 e TGF^3, e compreende um domínio de ligação ao antigênio de um anticorpo, em que o referido domínio de ligação do antigênio é constituído por : (a) o HCDR1 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 3, HCDR2 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 4, HCDR3 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 5, (b) a HCDR1 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 13, HCDR2 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 14, HCDR3 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 15, ou (c) a HCDR1 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 23, HCDR2 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 24, HCDR3 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 25. O domínio de ligação ao antigênio pode também compreender um domínio VL do anticorpo. O domí

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64/87 nio de ligação ao antigênio pode compreender LCDRs selecionados a partir do grupo que consiste em : (a) a LCDR1 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 8, LCDR2 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 9, LCDR3 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 10, (b) a LCDR1 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 18, LCDR2 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 19, LCDR3 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 20, e (c) a LCDR1 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 28, LCDR2 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 29, LCDR3 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 30. Em alguns casos, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 do domínio VH podem ser compostos dentro de uma estrutura de cadeia pesada da linha germinal, por exemplo, um estrutura família humana VH1. O HCDR1, HCDR2 e HCDR3 do domínio VH da linha germinal podem estar dentro da cadeia pesada humana estrutura VH1 DP-10 ou DP-88. O LCDR1, LCDR2 e LCDR3 do domínio VL pode estar dentro de uma estrutura de cadeia leve de linha germinal. A estrutura da cadeia leve da linha germinal pode ser um estrutura família humana Vk3. O domínio de ligação ao antigênio pode ainda compreender um gene Jk5 humano. O gene humano da família Vk3 pode ser um gene DPK22 VK.

[00165] Em algumas variantes, o antagonista do TGF-β pode ser um anticorpo que compreende o domínio VH PET1073G12 (SEQ ID NO : 2), com até cinco mutações, ou uma porção de ligação ao antigênio do mesmo. O antagonista do TGF-β pode ser um anticorpo que compreende o domínio VH PET1074B9 (SEQ ID NO : 12) com até 5 mutações, ou uma porção de ligação ao antigênio do mesmo. O antagonista do TGF-β pode ser um anticorpo que compreende o domínio VH PET1287A10 (SEQ ID NO : 22) com até 5 mutações, ou uma porção de ligação ao antigênio do mesmo. O antagonista do TGF-β pode ser um anticorpo que compreende o domínio PET1073G12 VL (SEQ

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ID NO : 7), com um máximo de 5 mutações, ou uma porção de ligação ao antigênio do mesmo. O antagonista do TGF-β pode ser um anticorpo que compreende um domínio VL PET1074B9 (SEQ ID NO : 17) com até 5 mutações, ou uma porção de ligação ao antigênio do mesmo. O antagonista do TGF-β pode ser um anticorpo que compreende o domínio VL PET1287A10 (SEQ ID NO : 27) com um máximo de 5 mutações, ou uma porção de ligação ao antigênio do mesmo. O antagonista do TGF-β pode ser um anticorpo que compreende o PET 1073G12 domínio VH (SEQ ID NO : 2), e o Domínio VL 1073G12 PET (SEQ ID NO : 7). O antagonista do TGF-β pode ser um anticorpo que compreende o PET 1074B9 domínio VH (SEQ ID NO : 12) e o Domínio VL 1074B9 PET (SEQ ID NO : 17). Alternativamente, o antagonista do TGF-β pode ser um anticorpo que compreende o PET 1287A10 domínio VH (SEQ ID NO : 22) e o domínio VL PET 1287A10 (SEQ ID NO : 27). Outras variações, tal como descritas na presente invenção são também contempladas.

[00166] As SEQ ID NOs referem-se às sequências encontradas na listagem de sequências em anexo, que faz parte da presente invenção. Embora os métodos têm sido descritos em pormenores com referência a certas modalidades da mesma, será evidente para aquele que é versado na técnica que várias modificações podem ser feitas, e equivalentes utilizados, sem sair do âmbito da presente descrição ou as reivindicações que se seguem. Além disso, os seguintes exemplos são apresentados como ilustrações de aspectos dos métodos e não devem ser interpretados como limitativos.

EXEMPLO 1 - Purificação de Anticorpo [00167] Os anticorpos monoclonais 1D11 e GC 1008 foram purificados a partir de ascites ou sobrenadante de cultura por proteína ASepharose (Goding, J Immunol Meth (1976) 42, 17) (Pharmacia Fien Chemicals, Uppsala, Suécia). A ligação dos anticorpos monoclonais

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66/87 da subclasse gama (γ) uma subclasse e gama (γ) 4, 1D11 e GC 1008, a proteína A foram aumentadas por meio da adição de um tampão de ligação preparados comercialmente (BioRad, Richmond, Califórnia). Os anticorpos foram eluidos a partir da proteína A-Sepharose com 0,05 M de glicina-HCl mais NaCl a 0,15 M, mais de tampão (pH 2,3), dialisado durante a noite contra PBS e tampão de NaCl (pH 2,3), dialisado durante a noite contra PBS e armazenados a -20 graus Celsius. Os anticorpos da subclasse gama (γ) 1 e gama (γ) 4 purificados a partir dos sobrenadantes foram concentrados e parcialmente purificados por meio da precipitação com sulfato de amónio (50 % de saturação) antes da cromatografia de proteína A-.

EXEMPLO 2 - Efeito de um inibidor de TGF-β em um modelo de rato de reperfusão de isquemia cardíaca [00168] Ratos Lewis fêmeas de 12a 14 semanas de idade foram divididos em cinco grupos de tratamento. No dia 0 (D0), todos os animais foram submetidos a isquemia cardíaca, seguido por procedimento de reperfusão (I / R). A isquemia cardíaca foi criada por meio da ligação do temporariamente esquerdo da artéria coronária descendente anterior no ventrículo esquerdo do coração durante 60 minutos. A ligação foi então libertada para permitir que a reperfusão da parte isquêmica do coração. A partir de 3 ou 5 dias após I / R, 5 mg / kg de artigo 1D11 ou controle (controle negativo-13C4 anticorpo ou veículo) foram administrados por meio da injeção intravenosa (IV), e, em seguida, a cada terceiro dia readministrado até o dia 28.

[00169] A fim de analisar a área em risco (AAR), microesferas de 15 um de diâmetro marcadas com um fluorocromo amarelo foram injetadas no ventrículo esquerdo do coração, imediatamente antes de soltar a ligação temporária da artéria coronária esquerda descendente (D0). As microesferas foram distribuídas homogeneamente no sangue e alojadas nos capilares do coração e de outros órgãos e tecidos. A AAR

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67/87 no coração foi definida como a área do tecido do miocárdio, que não recebeu qualquer microesferas (ou do sangue), durante o período de ligação. No dia 28 o animal foi levemente anestesiados com isoflurano e da taxa de coração foi mantido em 350 +/- 50 bpm. Um ecocardiograma foi então realizado na vista do eixo longo a fim de avaliar regional e global da função cardíaca. No seguimento da análise de ecocardiografia, o animal foi submetido a eutanásia com uma sobredose de pentobarbital de sódio. O coração foi então excisado para análise histológica.

[00170] A AAR foi avaliada e, posteriormente atribuída uma pontuação qualitativa. Animais com pequeno AAR (<~ 20 % do VE) ou nenhum AAR foram removidos do estudo fibrose de análise cardiáca no VE foi avaliada histologicamente e com o peso do coração e expresso como uma porcentagem do peso de fibrose / peso total do VE. A função cardíaca regional foi então avaliada por meio de uma avaliação da espessura da parede anterior (AWT) e em relação ao espessamento da parede posterior (PWT) na área em risco. Espessamento da parede é a diferença na espessura da parede a sístole e a espessura da parede na diástole. A função global também foi avaliado por meio da avaliação da fração de ejeção (FE) e da fração de encurtamento (FS).

[00171] As observações clínicas visuais diárias foram normais durante todo o período de estudo. Na Figura 1, a administração 1D11 acentuadamente reduziu a porcentagem de fibrose no VE, em comparação com o veículo e o anticorpo de controle negativo, 13C4. Esta diminuição da fibrose ocorreu se o tratamento começou 1D11 3 dias após I / R (D3) [1D11-D3] ou 5 dias após I / R (D5) [1D11-D5]. O grupo que se iniciou o tratamento de 1D11 a D5 atingiu uma significância estatística (P <0,05) como quando comparada com o grupo de controle tratado com 13C4.

[00172] Os parâmetros da função cardíaca foram avaliados por

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68/87 meio da ecocardiografia, 4 semanas após I / R, como pode ser visto na Tabela 1. A fração de ejeção e fração de encurtamento representar a função cardíaca global. AWT, PWT e AWT / PWT (pontuação movimento regional de parede) representam a função cardíaca regional. No ratonormal, AWT é aproximadamente igual a, e pode ser maior do que, PWT. Segue-se, então, que a proporção de AWT / PWT, o que chamamos pontuação movimento regionais parede, num animal normal seria > 1. Na Tabela 1o grupo de animais normais mostrou maior do que AWT PWT, e contagem de movimento de parede regional, (AWT / PWT) de 1,7+/-0,2.

Tabela 1

Resultados de Ecocardiografia de 4 Semanas
	Veículo	1D11-D3	1D11 05	13C4	Normal
Fração de Ejeção (%)	61.3 ±3.4	57.1 ±2.9	59.9 ±3.8	66.3 ±2.7	83.9 ±0.7
Fração de Encurtamento (%)	27.7 ±2.0	24.9 ±1.7	27.1 ±2.3	30 9 ±2.0	45.9 ±0.7
AWTÍcm)	0.04 ±0.01	0.06 ±0.01	0.07 ±0 .13	0.07 ±0.01	0.12 ±0.004
PWT(cm)	0.097 ±0.01	0.08 ±0.01 +	0.07 ±0.01 +	0.1 ±0.01	0.09 ±0.004
AWT/PWT	0.51 ±0.2	0.91 ±0.20	1 .01 ±0.15	0.7 ±0.1	1.7 ±0.2

+ p<0.05 VS.13C4 [00173] Ao fim de 4 semanas após a I / R, a função cardíaca em todos os grupos que foram submetidos a I / R foi menos do que a observada no grupo de animais normais. AWT e PWT foram semelhantes nos grupos de 1D11-D3 e D5-1D11 (Tabela 1 e Figura 2) e contagens de movimento de parede regionais foram 0,91 ± 0,2 e 1,01 ±0,15 no grupo 1D11 1D11-D3 e D5-, respectivamente (Tabela 1 e Figura 3). Além disso, foi observado que as pontuações de movimento de parede regionais foram compatíveis com pequeno comprometimento da função regionais, em comparação com um valor normal do animal de > 1. Em contraste, AWT é marcadamente menor do que o PWT em 13C4negativo de controle e grupos de veículo (Tabela 1 e Figura 2) e contagens de movimento de parede regionais foram de 0,7 ± 0,1 e 0,51 ± 0,2 nos grupos de veículo e 13C4, respectivamente, compatível com significativa deficiência em comparação com os grupos tratados com

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1D11 e animais normais. Notavelmente, a relativa falta de comprometimento da função cardíaca regional nos grupos tratados com 1D11 era consistente com a redução na fibrose observados nestes grupos, em comparação com o veículo e os grupos de controle negativo do anticorpo 13C4.

[00174] Embora a função regional nos grupos tratados com 1D11 foi melhorada em comparação com o veículo e os grupos 13C4, fracção de ejecção e de encurtamento foram semelhantes entre os grupos. Isto é provavelmente atribuível a compensação em função do VE, que não estava infartada nos grupos 13C4 e veículo. O aumento do PWT, compatível com a hipertrofia, observados nestes grupos é consistente com esta interpretação, Este exemplo permitido para a avaliação de se a iniciação de TGF-β antagonismo em cada 3 dias ou 5 dias após I / R, iria resultar em fibrose reduzida o infarto e melhora a função cardíaca. Houve uma redução significativa na porcentagem de fibrose do VE em ambos os grupos tratados com 1D11 em relação ao veículo e os grupos tratados com 13C4. Enquanto o nível de fibrose em grupos 1D11-D3 e D5-1D11 foram semelhantes, o grupo 1D11-D5 atingiu significância estatística quando comparado com o controle negativo 13C4 grupo (p <0,05). Tem sido demonstrado em modelos de MI que o desenvolvimento de fibrose pós-MI está associada com regulação positiva do TGF-β, a sinalização de TGF-β através da via smad e TGF-β genes regulados. A administração de 1D11 no modelo de roedor cardíaca I / R embota a regulação positiva do TGF-β e TGF-β genes associados após I / R, incluindo colágeno 3 e fibronectina, que estão associados com fibrose. A redução observada na fibrose com administração está de acordo com 1D11 1D11 embotamento de fibrose mediada por TGF-β neste modelo.

[00175] A redução na fibrose nos grupos tratados com 1D11 correspondia com deficiências mínimas na função regional do coração, ao

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70/87 passo que o controle negativo, 13C4, e os grupos de veículos demonstram alterações marcadas em função regional. AWT, PWT, e trilhas sonoras regionais de parede, foram semelhantes em ambos 1D11-D3 e 1D11-5 grupos. Isto sugere que a redução na fibrose em 1D11 animais tratados resultou em poupar ou salvamento de miocárdio, que contribuiu para poupar da função cardíaca após MI regionais. Enquanto os grupos tratados 1D11 havia melhorado sua função regional, em comparação com os grupos 13C4 e veículo, a fração de ejeção e de encurtamento foram similares entre os grupos. Isto é consistente com a capacidade do coração para funcionalmente compensar a deficiência em função regional nos grupos 13C4 e veículo. O ponto final do estudo foi de 28 dias após I / R. É possível que a compensação entre os grupos 13C4 e veículo não seria mantido durante um longo prazo, neste modelo, e as diferenças na função global entre 1D11, 13C4 e animais tratados com veículo que se tornam aparentes sobre a longo prazo.

[00176] O antagonismo TGF-β mediado por 1D11 no início em qualquer dia 3 ou dia 5 após I / R, resultou em reduções na fibrose cardíaca que atingiram significância no grupo-D5 1D11. As reduções na fibrose correspondiam com função cardíaca melhorada regional, em comparação com os animais que receberam o anticorpo de controle negativo, 13C4, ou veículos, e sugeriu poupar ou salvaro o miocárdio em animais tratados com 1D11.

EXEMPLO 3 - Efeito do tempo de administração de um inibidor de TGF-β em um modelo de rato de reperfusão de isquemia cardíaca [00177] O efeito de diferentes horários de administração de 1D11, um anticorpo inibidor de TGF-β, sobre a fibrose miocárdica em um modelo de camundongo de isquemia cardíaca seguida de reperfusão (I / R) foi observado. A administração de 1D11 foi iniciada no dia 0, 1 ou 5 após cardíaca I / R. O efeito de uma redução na fibrose do miocárdio, resultou na melhoria da função cardíaca, como medida por

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71/87 meio da ecocardiografia.

[00178] Os ratos Lewis fêmeas de doze a catorze semanas de idade foram divididos em sete grupos de tratamento diferentes. Todos os animais foram submetidos a isquemia cardíaca, seguido por meio de um processo de reperfusão (I / R). Isquemia cardíaca foi criado por ligação de temporariamente a esquerda da artéria coronária descendente anterior no ventrículo esquerdo do coração durante 60 minutos. A ligação foi então libertado para permitir que a reperfusão da parte isquêmica do coração, Começando 0 (duas horas pós-reperfusão), 1 ou 5 dias após I / R, 5 artigo mg / kg de 1D11 ou controle (13C4negativo de anticorpo de controle ou veículo) foram administrados por injeção intravenosa (IV), e depois todos os dias readministrados 3 até ao dia 28, [00179] A fim de analisar a área em risco, as microesferas de 15 micron de diâmetro foram marcadas com um fluorocromo amarelo e foram então injetados no LV do coração. Isso foi feito imediatamente antes de liberar a ligadura temporária da artéria descendente coronária esquerda. As microesferas foram distribuídas homogeneamente no sangue e alojadas nos capilares do coração e de outros órgãos e tecidos. A AAR no coração foi definida como a área do tecido do miocárdio, que não recebeu qualquer microesferas (ou do sangue), durante o período de ligação.

[00180] No dia 28, o animal foi levemente anestesiado com isoflurano e da taxa de coração foi mantido em 350 +/- 50 bpm. O ecocardiograma foi, então, realizada na vista de eixo longo regional e global da função cardíaca. No seguimento da análise de ecocardiografia, o animal foi submetido a eutanásia com uma sobredose de pentobarbital de sódio. O coração foi então removido, pesado e, em seguida, processados para análise histológica. A AAR foi atribuída uma pontuação qualitativa. Animais com pequeno AAR (<~ 20 % do VE) ou nenhum

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AAR foram removidos a partir da análise de estudo [00181] A fibrose cardíaca no VE foi avaliada histologicamente e com o peso do coração e expressa como uma porcentagem do peso de fibrose / peso total do VE. A função cardíaca Regional foi avaliada por avaliação da espessura da parede anterior (AWT) em relação ao espessamento da parede posterior (PWT) na área em risco. Espessamento da parede é a diferença na espessura da parede a sístole e a espessura da parede na diástole. A função global foi avaliada através da fração de ejeção (FE) e fração de encurtamento (FS).

[00182] A administração 1D11 a partir de um ou outro ou 0 dias 5 dias reduziu significativamente a porcentagem de fibrose no VE, em comparação com o veículo e negativa-anticorpo de controle, 13C4 grupos tratados (Figura 4). Início da administração 1D11 em D1 mostrou uma tendência para a redução na fibrose como em comparação com 13C4 emparelhados ou de controle de veículo.

[00183] A Tabela 2 apresenta os parâmetros da função cardíaca que foram avaliados pela ecocardiografia em 4 semanas após I / R. A fração de ejeção e fração de encurtamento representar a função cardíaca global. AWT, PWT e AWT / PWT (pontuação movimento regional de parede) representam a função cardíaca regional. No roedor normal, AWT é aproximadamente igual a, e pode ser maior do que, PWT. Segue-se, então, que a proporção de AWT / PWT, o que chamamos pontuação movimento regionais parede, num animal normal seria > 1. Na tabela 2, o grupo de animais normais mostraram maior do que AWT PWT, e pontuação na mobilidade regional parede (AWT / PWT) de 1,7 +/- 0,2.

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Tabela 2

Resultados da Ecocardiografia de 4 Semanas

		EFna		FS f%)		AWTfcmJ		PWTfcmJ		AWT/PWT
Veículo		50.5±2.6		21.1 ±1.4		0 03 ± 0.01		0.06 ±0 01$		0.6 ±0.13+
1D11 - DO		51.2 ± 2.9		21.5 ±1.5		0.06 ±0.01’+		0 .04 ± 0.01’		1.38 ±0.2’
1D11- D1		52.3± 3.3		22.3±1.9		0.05 ±0.01’		0.07 ±0 01$		0.79 ± 0.1
1D11 - 05		59.2 ±2.7’		26.1 ±1.7’		0.06 ± 0.01’+		0.06 ±0.01		0.92 ±0.18
13C4 - DO		48.4 ±1.1		19.8 ±0.6		0 04 ± 0.01		0 06 ±0.01$		0.52±0.08
13C4 - Dl		53.0 ± 2.9		22.5 ±1.6		0.04 ± 0.01		0.06 ±0.01		0.58±0.19
13C4- D5		52.9 ± 2.3		22.3 ±1.2		0.04 ±0.01		0.08 ±0.01$		0.54±0.12
Normal		S3.Ô±0.7		45.9 ±0.7		O.12 ±0.004		0.09 ± 0.004		1.7 + 0.2

* p«0.05 vs. veículo. + p<0.05 vs. 13C4, $ p<0 05 awt vspwt [00184] Em quatro semanas após I / R, a função cardíaca em todos os grupos que foram submetidos a I / R foi menos do que a observada no grupo de animais normais. AWT e PWT foram semelhantes nos grupos de 1D11-D0, D3 e-1D11 1D11-D5 (Tabela 2 e Figura 5). Contagens de movimento de parede regional foram 1,38 ± 0,2, 0,79 ± 0,1 e 0,92 ± 0,18 no 1D11 1D11-D0, D1-D5 e 1D11-grupos, respectivamente (Tabela 2 e Figura 3). As contagens de movimento de parede regionais foram compatíveis com pequeno comprometimento da função regionais, em comparação com um valor normal do animal de > 1. Em contraste, AWT é marcadamente menor que nas PWT 13C4 negativo de controle e grupos de veículo (Tabela 2 e Figura 5). Contagens de movimento de parede regional de 0,52 ± 0,08, 0,58 ±0,19, 0,54 ±0,12 e 0,6 ± 0,13 em 13C4-13C4-D0, D1, 13C4-D5 e os grupos de veículo, respectivamente (Tabela 2 e Figura 6), e compatível com significativa deficiência em comparação com os grupos tratados com 1D11 e animais normais. A relativa falta de comprometimento da função cardíaca regional nos grupos tratados com 1D11 era consistente com a redução na fibrose observados nestes grupos, em comparação com o veículo e combinados grupos de controle negativo do anticorpo 13C4.

[00185] O grupo 1D11-D5 também mostrarou melhorias significativas nos parâmetros globais da função cardíaca com a fracção de ejecção e de encurtamento em comparação com o veículo de controle (Tabela 2), o que é consistente com a fibrose e regionais avaliações

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74/87 da função cardíaca. No entanto, os outros grupos tratados com 1D11 não demonstraram alterações na função global em comparação com o veículo e combinados 13C4 grupos. Redução de fibrose com relativa falta de comprometimento da função regional na 1D11 animais tratados sem melhorias significativas na função cardíaca global também foi observada em um estudo anterior e é provavelmente atribuível à compensação em função do VE que não foi infartados no 13C4 combinados e grupos de veículos o que torna difícil a detecção de alterações entre os grupos, neste ponto do tempo. O aumento do PWT, compatível com a hipertrofia, observado nestes grupos é consistente com esta interpretação.

[00186] Este exemplo comparou a bioatividade do anticorpo antiTGF-β, 1D11, começando em diferentes pontos de tempo de pósinfarte do miocárdio, em um modelo de camundongo de infarte do miocárdio, onde os animais foram submetidos a isquemia, seguido de reperfusão cardíaca. É possível que o TGF-β desempenha diversos papéis na resposta de reparação em D0, D1 e D5 a, e que o antagonismo do TGF-β iniciar a estes pontos de tempo diferentes resulta em uma resposta diferencial. O grupo 1D11-D1 mostrou tendências para a redução na fibrose e melhora na função cardíaca.

[00187] 1D11 mediada por antagonismo início TGF-β em cada dia

0, dia 1, dia 5 ou pós I / R resultou em reduções na fibrose cardíaca que atingiram significância no grupo 1D11-D0 e 1D11-D5, em comparação com veículo e combinando grupos de anticorpo 13C4 controle. Nos grupos de 1D11-D0 e 1D11-D5, as reduções na fibrose correspondia a uma melhora significativa no que diz respeito à função cardíaca regionais, em comparação com os animais que receberam o anticorpo de controle negativo, 13C4, ou de veículos, bem como melhorou significativamente a função global cardíaca, em comparação com o veículo de controle no grupo de 1D11-D5. Estes resultados sugerem

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75/87 poupador ou de salvamento do miocárdio nos animais tratados com 1D11.

EXEMPLO 4 - Efeitos do Inhibitor TGF - β, 1D11, em um modelo de roedor de remodelação do miocárdio após isquemia do miocárdio [00188] A administração de 1D11, um inibidor de TGF-β, reduziu o desenvolvimento de fibrose e, subsequentemente, a função cardíaca melhorada de uma forma dose-dependente. No Dia 0, a artéria coronária esquerda ascendente foi ligada durante 60 minutos (a oclusão da artéria coronária ou CAO) e, em seguida, libertado para permitir a reperfusão (reperfusão da artéria coronária ou CAR). No dia 5, o veículo, 1D11 e 13C4 (anticorpo de controle) foram administrados por meio de IV e continua a cada três dias até ao sacrifício no dia 28 (4 semana). O ecocardiograma foi realizado em 2 semanas e 4 semanas após CAR, a fim de determinar a função ventricular esquerda. 4 semanas após o CAR, um procedimento cirúrgico foi realizado terminais para medir diretamente a função do VE usando pressão-volume (PV) de hemodinâmica. Um teste de estresse com dobutamina também foi realizado. Depois de completar todos os procedimentos acima, os camundongos foram sacrificados, e os tecidos do miocárdio de zonas isquêmicas e não-isquêmica foram coletados para a análise patológica. Um subgrupo de nove camundongos foi utilizado para a avaliação do tamanho do infarte e foi sacrificado durante os sete dias após CAO / CAR. Os corações foram perfundidos e coradas em seguida. A área em tamanho de risco de infarto foi medida e comparada entre o veículo e 1D11 (25 mg / kg) os grupos.

[00189] Os resultados deste exemplo indicam que o 1D11 significativamente reduziu ovolume de cicatriz do ventrículo esquerdo para a dose 5mg/kg, em comparação com veículo. Curiosamente, a dose de 25 mg / kg, o volume do VE cicatriz foi aumentado em comparação com os controles (Figura 6). A análise histológica demonstrou uma re

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76/87 dução significativa da apoptose na área adjacente à cicatriz, com 1D11 na dose de 5 mg / kg. Houve um aumento da apoptose no grupo que recebeu 25 mg / kg de 1D11 (Figura 7). Não foram observadas diferenças na fibrose intersticial subepicárdica na área adjacente à cicatriz entre todos os grupos (dados não apresentados).

[00190] A fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE), uma medida da função sistólica global, foi relatada na semana 2 e semana 4 (Figura 8). FEVE nas 4 semanas foram significativamente melhoradas com 1D11 na dose de 5mg/kg, em comparação com animais tratados com veículo. No entanto, o tratamento com 1D11 a 25 mg / kg conduziu a uma diminuição significativa da EF. Isto é consistente com os dados de volume de cicatriz apresentados na Figura 6. A partir de 2 semanas a 4 semanas, verificou-se uma melhoria significativa na porcentagem de alteração na FEVE no grupo 1D11 5 mg / kg (Figura 9).

[00191] O tempo de relaxamento isovolumétrico LV (TRIV), uma medida da função diastólica, também foi significativamente melhorada no grupo 1D11 5 mg / kg, em comparação ao grupo controle ea dose elevada de 1D11. Houve aparente normalização da função diastólica, em comparação com os animais sham (Figura 10). A motilidade regional mostrada como uma porcentagem de espessamento da parede anterior, demonstrou uma melhoria significativa no grupo 1D11 5 mg / kg, em comparação com grupo tratado com veículo (Figura 11).

[00192] O final das relações do ventrículo esquerdo de volume diastólico de pressão, uma medida da função diastólica avaliada por hemodinâmica PV, demonstrou uma melhoria significativa no grupo 5mg/kg 1D11 onde os dados são comparáveis com os animais sham (Figura 12). O teste de stress com dobutamina indicou que uma tendência para a melhoria no grupo 1D11 5 mg / kg (dados não mostrados) existe.

[00193] A dose mais baixa (5 mg / kg) de 1D11 demonstrou efeitos

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77/87 salutares claros e significativos. Em primeiro lugar, o volume do VE cicatriz menos 4 semanas foi menor, o que indica que houve menos danos residual do infarte. Em segundo lugar, verificou-se a apoptose significativamente menor na área adjacente à cicatriz, em comparação com os outros grupos. Terceiro, a função do VE avaliada pela fração de ejeção foi significativamente maior nesse grupo do que os outros grupos indicando o melhor salvamento da função do VE. Finalmente, este grupo foi o único a demonstrar uma melhoria entre um dois quatro semanas da fração de ejeção. A inclinação da diastólica final do VE relação pressão-volume em 4 semanas era o mais baixo nesse grupo indicando reduzida rigidez e função LV LV melhorada diastólica. Isto confirmou os resultados IVRT, uma medida ecocardiográfica da função diastólica, que mostrou que este grupo foi o único a demonstrar a preservação da função diastólica, 4 semanas. O teste de estresse com dobutamina mostrou uma tendência de melhora da função cardíaca, embora as questões inerentes à anestesia e cateterismo contribuem para a variabilidade e menos dependência desses dados, em oposição aos dados de eco, os experimentos de anticorpos controle não mostraram muita diferença de veículo camundongos tratados.

[00194] Por outro lado, a elevada dose de 1D11 demonstrou efeitos adversos. A cicatriz de menos 4 semanas, foi maior do que os outros grupos, incluindo o grupo tratado com veículo. Havia mais apoptose na área adjacente. Quando a função ventricular esquerda foi avaliada pela fracção de ejecção LV, foi menor do que todos os outros grupos de 4 semanas. Dessa maneira,TGF-p antagonismo, utilizando 1D11 na dose de 5 mg / kg, era eficaz na prevenção dos efeitos adversos de infarte do miocárdio pode ser notada a seguir no camundongo. As reduções significativas do volume do VE cicatriz e apoptose foram consistentes com as melhorias na pressão arterial sistólica e diastólica cardíaca neste modelo. No entanto, a dose mais elevada do fármaco

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78/87 provocou os efeitos adversos sobre parâmetros histológicos e funcionais.

EXEMPLO 5 - Efeitos do Inhibitor TGF- β, 1D11, na preservação do miocárdio em um modelo de roedor de isquemia do miocárdio seguida por reperfusão [00195] A administração de 1D11, um inibidor de TGF-β, fibrose reduzida, preservada miocárdio e função cardíaca melhorada em duas doses diferentes. No Dia 0, a artéria coronária esquerda ascendente foi ligada durante 60 minutos e, em seguida, libertado para permitir a reperfusão (I / R). No dia 5, as duas doses diferentes (1 ou 5 mg / kg) de uma quer de duas formulações diferentes de 1D11 (primeira e segunda formulações), veículo, e 13C4 (anticorpo negativo de controle) foram administrados por meio de IV e continuou a cada 3 dias até o dia 28.

[00196] A fim de analisar a área em risco, microesferas de 15 micron de diâmetro que foram marcados com um fluorocromo amarelo foram injetadas no LV do coração. Isso foi feito imediatamente antes de liberar a ligadura temporária da artéria descendente coronária esquerda. As microesferas foram distribuídas homogeneamente no sangue e alojadas nos capilares do coração e de outros órgãos e tecidos. A AAR no coração foi definida como a área do tecido do miocárdio, que não recebeu qualquer microesferas (ou do sangue), durante o período de ligação.

[00197] No dia 28, o animal foi levemente anestesiado com isoflurano e da taxa de coração foi mantido em 350 +/- 50 bpm. O ecocardiograma foi, então, realizada na vista do eixo longo para a função cardíaca regional. No seguimento da análise de ecocardiografia, o animal foi submetido a eutanásia com uma sobredose de pentobarbital de sódio. O coração foi então removido, pesado e, em seguida, processados para análise histológica. A AAR foi avaliada morfometricamente

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79/87 em cortes de coração e utilizando o peso do coração e expressa como uma porcentagem da APA peso / peso total do VE. Animais com pequeno AAR (<20 %) ou não AAR foram removidos a partir da análise do estudo.

[00198] A fibrose cardíaca no VE foi avaliada histologicamente e com o peso do coração e expressa como uma porcentagem do peso de fibrose / peso total do VE. Função cardíaca Regional foi avaliada por avaliação da espessura da parede anterior (AWT) em relação ao espessamento da parede posterior (PWT) na área em risco. O espessamento da parede é a diferença na espessura da parede a sístole e a espessura da parede na diástole.

[00199] Os resultados deste exemplo demonstram que, 4 semanas após I / R, 1D11 às 1 e 5 mg / kg doses das duas diferentes formulações reduziram significativamente a porcentagem de fibrose no VE, em comparação com os controles de veículo e 13C4 ( Figura 14). Além disso, ambas as doses 1D11 de ambas as formulações reduziram significativamente a porcentagem de fibrose no AAR, em comparação com os controles de veículo e 13C4 (Figura 15). É importante notar que ambas as doses de ambas as formulações 1D11 aumentaram significativamente a porcentagem de miocárdio na AAR, em comparação com os controles (Figura 16). Este resultado indica que o tratamento 1D11 após I / R, não só reduziu a fibrose, mas também preservou miocárdio na AAR.

[00200] Ao fim de 4 semanas após a I / R, a função cardíaca expressa como pontuação regionais movimento da parede (AWT / PWT) mostrou menor comprometimento em todos os grupos tratados com 1D11 (1 e 5 mg / kg de ambas as formulações de doses), em comparação com o 13C4 e veículos de controle (Figura 17).

[00201] Este exemplo avaliou a bioatividade do anticorpo antagonista do TGF-β, 1D11, em duas doses (1 e 5 mg / kg) e a partir de duas

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80/87 formulações diferentes, iniciada 5 dias após a isquemia do miocárdio seguida por reperfusão. Ambos os 1 e 5 mg / kg 1D11 doses de ambas as formulações reduziram significativamente a fibrose e, mais importante, miocárdio preservado no AAR, em comparação com os controles negativos. Consistente com estas melhorias, a função cardíaca regional foi também melhorada quando comparada com os controles negativos.

EXEMPLO 6 - Efeito de inibidor TGF-β, 1D11, sobre a expressão cardíaca de TGF-β e genes relacionados em um modelo de roedor de isquemia do miocárdio seguida por reperfusão [00202] A administração de 1D11, um inibidor de TGF-β, reduziu a expressão de genes do coraçãos TGF-β e afins, de acordo com os seus efeitos sobre a remodelação do miocárdio, a preservação do miocárdio e função miocárdica, como observado nos exemplos anteriores. No Dia 0, a artéria coronária esquerda ascendente foi ligada durante 60 minutos e, em seguida, libertada para permitir a reperfusão (I / R). No dia 3, as duas doses diferentes (5 ou 50 mg / kg) de 1D11 foram administrados via IV e continuou a cada 3 dias até que o dia 7 ou no dia 12 para os animais que receberam 5 mg / kg 1D11, ou até ao dia 12 para os animais que recebeu 50 mg / kg 1D11. Outro grupo de animais que foram submetidos a I / R não recebeu qualquer tratamento.

[00203] Dependendo do grupo de estudo, de cada 7 dias ou 12 dias o animal foi sacrificado por uma overdose de pentobarbital de sódio. O sangue foi recolhido para um tubo separador de soro e o soro colhido para análise de níveis de 1D11 e osteopontina (um biomarcador potencial de soro de efeitos sobre a redução da fibrose 1D11), utilizando 1D11 ou osteopontina ELISAs, respectivamente. O coração foi então removido, os átrios direito e ventricled aparado, e o ventrículo esquerdo seccionado longitudinalmente através do centro da área de risco

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81/87 (na área do coração que não receberam sangue durante a ligação da artéria coronária esquerda ascendente). Uma metade do ventrículo foi rapidamente congelada para análise da expressão do gene TGF-β e relacionada por meio da reação em cadeia da polimerase transcriptase reversa (RT-PCR). Para a análise de RT-PCR desta porção do ventrículo foi ainda subdividido em uma porção apical, que inclui a área em risco, e uma parte da base que não foi sujeito a isquemia. A outra metade do ventrículo foi fixado em formalina, para análise posterior. Um grupo de camundongos normais foi sacrificado com uma overdose de pentobarbital de sódio e submetida a recolha de soro e coração como descrito acima.

[00204] Os animais que receberam 1D11 1D11 demonstrado no seu soro, enquanto o grupo I / R que não receberam 1D11 1D11 não tinha detectáveis nos seus soros (Figura 18). Nos animais que receberam 5 mg / kg 1D11, os animais sacrificados no dia 7 apresentaram maiores 1D11 níveis séricos do que a observada nos animais sacrificados no dia 12. Este foi antecipado já que os animais sacrificados no dia 7 teve seus soros colhidos um dia após a sua última dose de 1D11 enquanto que animais sacrificados no dia 12 tinha seus soros coletadas três dias após a sua última dose de 1D11. O nível sérico 1D11 em animais que receberam a dose de 50 mg / kg e 1D11 foram sacrificados no dia 12 foi aproximadamente 1,5 vezes maior do que os animais que receberam 5 mg / kg e 1D11 foram sacrificados no mesmo dia. A falta de proporcionalidade dos níveis séricos de 1D11, em comparação com a dose pode ser atribuível a uma depuração mais rápida de 1D11 em animais que receberam a dose mais elevada (50 mg / kg) de 1D11. Estes dados indicam que a administração IV de resultados 1D11 em dose-dependentes níveis de 1D11 em circulação e, presumivelmente, de exposição, 1D11 para o coração.

[00205] A osteopontina é um potencial marcador de soro 1D11 me

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82/87 diada por meio da modulação da fibrose cardíaca em I / R. Os níveis séricos de osteopontina foi semelhante em animais normais, Animais I / R que não receberam qualquer tratamento e foram sacrificados no dia 12, e I / R, os animais que receberam duas 5 mg / kg e doses de 1D11 foram sacrificados no dia 7 (Figura 19 ). Houve tendências de diminuição dos níveis de osteopontina em Animais I / R que receberam quer três 5 mg / kg doses 1D11 e foram sacrificados no dia 12, três ou 50 mg / kg e doses de 1D11 foram sacrificados no dia 12.

[00206] A expressão de genes TGF-β e afins foi analisada por RTPCR na porção apical do ventrículo esquerdo, o qual incluía a área de risco e da porção basal do VE, que não foi sujeito a isquemia. Na porção basal do VE os níveis de expressão de todos os genes avaliados foram semelhantes aos observados em animais normais. O restante das descrições de expressão de genes do coraçãos foca alterações observadas na porção apical do ventrículo.

[00207] A expressão do coração de todas as isoformas de TGF-β, TGF-β 1, TGF-β 2 e TGF-β 3, foi elevada em Animais I / R que não receberam qualquer tratamento e foram sacrificados no dia 12. Em comparação com animais normais de expressão de TGF-β 1, TGF-β 2 e TGF-β 3 foram aumentadas aproximadamente 2,3 vezes, 5 vezes, e de 6 vezes, respectivamente (Figuras 20 a 22). A administração de 1D11 a 5 mg / kg reduziu a expressão de TGF-β 1, TGF-β 2 e TGF-β 3 (Figuras 20 a 22). Os animais que receberam três 5 mg / kg e doses de 1D11 foram sacrificados no dia 12 tinham uma maior redução na expressão de TGF-β 1 e TGF-β 2 em comparação com os animais que receberam 2 doses e foram sacrificados no dia 7 (Figuras 20 , 21). Houve reduções semelhantes da expressão de TGF-β 3 em animais que receberam duas ou três de 5 mg / kg doses de 1D11 (Figura 22). Os animais que receberam três 50 mg / kg doses 1D11 e foram sacrificados no dia 12 também mostrou redução na expressão de todas as

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83/87 três isoformas TGF-β. No entanto, as reduções de TGF-β 1 e TGF-β 2 de expressão foram um pouco menos robusto do que o observado nos animais que receberam 2 doses de 5 mg / kg e 1D11 foram sacrificados no dia 7 (Figuras 19-21). Estes resultados demonstram a supressão dependente da dose da expressão de todas as isoformas de TGFβ por 1D11. Curiosamente, a dose mais elevada 1D11 (50 mg / kg) pareceu resultar em menor supressão de expressão de TGF-β em comparação com a dose de 5 mg / kg.

[00208] O colágeno é um componente importante da fibrose e a sua expressão é conhecida por ser regulada por TGF-β. Expressão do coração de colágeno 3 foi elevada a cerca de 14 vezes em Animais I / R que não receberam qualquer tratamento, em comparação com animais normais. A administração de 5 mg / kg reduziu o 1D11 expressão de colágeno 3, onde os animais que receberam 3 doses de 1D11 tiveram maior redução na expressão do colágeno 3 em comparação com os animais que receberam 2 doses de 1D11 (Figura 23). Os animais que receberam 50 mg / kg 1D11 também demonstrou uma redução no colágeno 3 expressão, que foi comparável à observada em animais que receberam duas doses de 5 mg / kg 1D11. Consistente com a redução 1D11 mediada na fibrose cardíaca após I / R, houve um 1D11 mediada por meio da redução dependente da dose na expressão do colágeno cardíaca 3. Semelhante ao 1D11 de supressão mediada da expressão de TGF-β, a dose mais elevada 1D11 (50 mg / kg) pareceu resultar em menor supressão de colágeno 3 em relação à dose de 5 mg / kg.

[00209] A endotelina-1 (ET-1) é potente vasoconstritor cuja expressão é regulada por TGF-β. A expressão cardiáca de ET-1 foi aumentada aproximadamente 5,5 vezes em Animais I / R que não receberam qualquer tratamento, em comparação com animais normais. A administração de 5 mg / kg reduziu a expressão 1D11 de ET-1 em que os animais que receberam 3 doses de 1D11 tiveram maior redução na

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84/87 expressão de ET-1 em comparação com os animais que receberam 2 doses de 1D11 (Figura 24). Três de 5 mg / kg 1D11 doses quase normalizada ET-1. Os animais que receberam 50 mg / kg 1D11 também demonstrou uma redução na expressão de ET-1, que foi comparável à observada em animais que receberam duas 5 mg / kg doses 1D11. 1D11 mediada por inibição da expressão de ET-1 após I / R, pode contribuir para melhorar a perfusão do miocárdio lesionado e contribuir para a preservação do miocárdio e remodelação reduzida após I / R. É interessante notar que os 50 mg / kg 1D11 parece ter resultado em menos de supressão da expressão de ET-1 em comparação com a dose de 5 mg / kg.

[00210] O ativador do Plasminogênio do inibidor-1 (PAI-1) é o principal inibidor de tecido ativador do plasminogênio tipo e é regulada por TGF-β. Níveis elevados de PAI-1 tem sido associados com o aumento de aterotrombose e doença vascular. A expressão cardíaca de PAI-1 aumentou cerca de 6 vezes em animais I / R que não receberam qualquer tratamento, em comparação com animais normais. A administração de 5 mg / kg reduziu o 1D11 expressão de PAI-1 em que os animais que receberam 3 doses de 1D11 teve uma redução muito maior em expressão de PAI-1, em comparação com os animais que receberam 2 doses de 1D11 (Figura 25). Os animais que receberam 50 mg / kg mostrou uma redução marginal 1D11 na expressão de PAI-1. É provável que a redução 1D11 mediada por expressão de PAI-1 após I / R, contribuíram para as melhorias na remodelação e preservação do miocárdio. A 50 mg / kg de dose 1D11 pareceu ter um efeito muito menos robusto na redução do PAI-1 em comparação com a expressão de dose de 5 mg / kg.

[00211] Recentemente, tem sido reconhecido que endotelialmesenquimal transição podem contribuir para a fibrose cardíaca. Os fatores de transcrição Snail1 e Snail2 (Slug) estão envolvidos na tran

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85/87 sição endotelial-mesenquimal e estes fatores de transcrição são induzidas por TGF-β. A expressão de Snail1 e Snail2 cardíaca foram aumentadas aproximadamente 4 vezes e 3 vezes, respectivamente, em animais I / R que não receberam nenhum tratamento, em comparação com animais normais. A administração de 5 mg / kg reduziu o 1D11 expressão de ambos Snail1 e Snail2 em que os animais que receberam 3 doses de 1D11 teve uma redução muito maior em Snail1 e Snail2 expressão, em comparação com os animais que receberam 2 doses de 1D11 (Figura 26 e 27). Três de 5 mg / kg doses de 1D11 expressão aparentemente normalizada Snail2. Animais que receberam 50 mg / kg 1D11 também demonstrou redução nos Snail1 Snail2 e de expressão que foi comparável à observada em animais que receberam duas doses de 5 mg / kg 1D11. Aumento da expressão de Snail1 e Snail2 após I / R sugerem fortemente que a transição endotelialmesenquimal está contribuindo para a fibrose cardíaca na resposta de reparação para I / R. As reduções 1D11 mediadas em expressão de Snail1 e Snail2 após I / R, é provável um mecanismo de contribuir para a redução observada na fibrose cardíaca e melhora na remodelação. Curiosamente, a 50 mg / kg de dose 1D11 pareceu ter um efeito menos robusto na redução da expressão Snail1 e Snail2 em comparação com a dose de 5 mg / kg.

[00212] Um marcador de células mesenquimais que é observado em atina de músculo liso da transição mesenquimal (α-SMA). A expressão cardíaca α-SMA foi elevada a cerca de 4 vezes em animais I / R que não receberam qualquer tratamento, em comparação com animais normais. A administração de 5 mg / kg reduziu a expressão 1D11 de α SMA-se os animais que receberam 3 doses de 1D11 teve uma redução muito maior da expressão de α-SMA, em comparação com os animais que receberam 2 doses de 1D11 (Figura 28). Os animais que receberam 50 mg / kg de redução 1D11 também demonstrada em ex

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86/87 pressãode α-SMA, que foi comparável à observada em animais que receberam duas doses de 5 mg / kg 1D11. Consistente com a redução 1D11 mediada em Snail1 Snail e 2 após I / R, 1D11 bna redução da expressão de α-SMA. A 50 mg / kg de dose 1D11 pareceu ter um efeito menos robusto na redução da expressão de α-SMA, em comparação com a dose de 5 mg / kg.

[00213] A fibronectina é considerada como um marcador da transição epitelial-mesenquimal e provavelmente é um marcador de transição endotelial-mesenquimal. A expressão de Fibronectina do coração aumentou cerca de 16 vezes em animais I / R que não receberam qualquer tratamento, em comparação com animais normais. A administração de 5 mg / kg reduziu a expressão de fibronectina 1D11 em que os animais que receberam 3 doses de 1D11 apresentaram expressão de fibronectina muito maior em termos de redução, em comparação com os animais que receberam 2 doses de 1D11 (Figura 29). Os animais que receberam 50 mg / kg 1D11 também demonstraram uma redução na expressão de fibronectina, que foi comparável à observada em animais que receberam duas 5 mg / kg doses 1D11. A redução 1D11 mediada por fibronectina era compatível com as reduções 1D11 medicamentosos nos marcadores endoteliais-mesenquimais de transição Snail1, Snail2 e α-SMA. A dose de 50 mg / kg 1D11 pareceu ter um efeito menos robusto na redução da expressão de fibronectina, em comparação com a dose de 5 mg / kg.

[00214] A apoptose contribui para a perda de miócitos do coraçãos durante a remodelação cardíaca. Bax é um bem reconhecido gene pró-apoptótico e da expressão cardíaca Bax foi aumentada aproximadamente 1,8 vezes em Animais I / R que não receberam qualquer tratamento, em comparação com animais normais. A administração de 5 mg / kg reduziu o 1D11 expressão de Bax em que os animais que receberam 3 doses de 1D11 tiveram uma redução maior expressão do

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Bax, em comparação com os animais que receberam 2 doses de 1D11 (Figura 30). Devido a limitações de amostragem corações provenientes de animais que receberam 50 mg / kg não 1D11 foram analisadas para expressão do Bax. A redução mediada por 1D11 na expressão do Bax é consistente com observações nos exemplos anteriores em que houve redução da apoptose em corações de Animais I / R que receberam 5 mg / kg 1D11, e houve um aumento de preservação do miocárdio em Animais I / R que receberam uma e 5 mg / kg 1D11.

[00215] Os resultados descritos neste exemplo demonstram que a administração IV de um antagonista TGF-β (por exemplo, um anticorpo anti-TGF-β anticorpo) resulta em dose-dependente dos níveis circulantes de 1D11 e presumivelmente da exposição, para o coração. Nível sérico de osteopontina pode ser um marcador de 1D11 mediada redução da fibrose cardíaca. Genes TGF-β e similares são induzidos em I / R e são condutores da fibrose cardíaca e remodelação que ocorre após I / R. A administração do anticorpo antagonista do TGF-β, 1D11, após I / R medeia a redução na expressão destes genes que proporciona um mecanismo para a redução na fibrose cardíaca, a preservação do miocárdio, as melhorias na remodelação e melhorias na função cardíaca que foram observados com o tratamento 1D11. Os resultados também demonstraram que os genes envolvidos na transição do endotélio mesenquimal foram induzidos após I / R e que a transição do endotélio mesenquimais podem contribuir para a fibrose cardíaca após I / R. Para o melhor conhecimento, esta é uma nova descoberta. O tratamento 1D11 após I / R reprimiu esses genes e modulou para baixo qualquer contribuição de transição do endotélio mesenquimal para a fibrose cardíaca após I / R. Curiosamente, a dose de 5 mg / kg 1D11 aparentemente resultou em reduções mais consistentes na expressão de genes TGF-β e seguintes I / R similares, quando em comparação com a dose de 50 mg / kg 1D11.

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uso de um antagonista do TGF-β, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar um infarto do miocárdio em um paciente dentro de 72 horas após o início da isquemia do miocárdio, em que o antagonista do TGF-β é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a uma ou mais isoformas do TGF-β e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende o domínio VH PET1073G 12 (SEQ ID NO: 2) e o domínio VL PET1073G 12 (SEQ ID NO: 7).
2. 2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente é um mamífero humano ou não humano.
3. 3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o medicamento preserva o miocárdio.
4. 4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo neutraliza TGF^1, TGF^2 e TGF^3 humano.
5. 5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o medicamento é formulado para fornecer uma dose de 1 mg por quilograma de massa corporal do paciente.
6. 6. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o medicamento é formulado para fornecer uma dose de 5 mg por quilograma de massa corporal do paciente.
7. 7. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda um fármaco antiinflamatório.
8. 8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda um antagonista de TNF-α.
9. 9. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo

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   2/2 fato de que o medicamento compreende ainda um inibidor de ACE.
10. 10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ACE é selecionado dentre o grupo que consiste em benazepril, captopril, fosinopril, moexipril, perindopril, quinapril, transdolapril, lisinopril, enalapril e ramipril.
11. 11. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda um antagonista do receptor da angiotensina II.
12. 12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o antagonista do receptor da angiotensina II é selecionado dentre o grupo que consiste em eprosartan, telmisartan, losartan, irbesartan, olmesartan, candesartan e valsartan.
13. 13. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda um antagonista betaadrenérgico.
14. 14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o antagonista beta-adrenérgico é selecionado dentre o grupo que consiste em alprenolol, bucindolol, carteolol, carvedilol, labetalol, nadolol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, propranolol, sotalol, timolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, celiprolol, esmolol, metoprolol e nebivolol.